JPH06100599A - 扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法 - Google Patents
扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法Info
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- JPH06100599A JPH06100599A JP3107693A JP3107693A JPH06100599A JP H06100599 A JPH06100599 A JP H06100599A JP 3107693 A JP3107693 A JP 3107693A JP 3107693 A JP3107693 A JP 3107693A JP H06100599 A JPH06100599 A JP H06100599A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡便な方法で多数の検体を処理できるような
子宮頸癌の診断方法、子宮頸癌の治癒率の向上のために
も病状の変化を正確に反映するパラメーターの開発並び
にそのパラメーターを用いた子宮頸癌の診断方法の開
発。 【構成】 ヒト子宮頸部癌、肺癌、食道癌などの偏平上
皮癌組織あるいはそれらの転移巣より新規な偏平上皮癌
関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣ
Ｃ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ
Ａｇ５、ＳＣＣＡｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａ
ｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａ
ｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳ
ＣＣ Ａｇ１４を抽出、精製して、それを免疫原として
利用して免疫してヒト以外の動物からの抗血清あるいは
該免疫された動物より得られた抗体産生細胞と永代培養
しうる細胞とを細胞融合し、次にハイブリドーマ細胞か
らモノクローナル抗体としてＳＣＣ Ａｇ類に対する特
異抗体を得、さらにそれを用いて偏平上皮癌関連抗原の
免疫学的測定用試薬並びに測定法が提供される。
子宮頸癌の診断方法、子宮頸癌の治癒率の向上のために
も病状の変化を正確に反映するパラメーターの開発並び
にそのパラメーターを用いた子宮頸癌の診断方法の開
発。 【構成】 ヒト子宮頸部癌、肺癌、食道癌などの偏平上
皮癌組織あるいはそれらの転移巣より新規な偏平上皮癌
関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣ
Ｃ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ
Ａｇ５、ＳＣＣＡｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａ
ｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａ
ｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳ
ＣＣ Ａｇ１４を抽出、精製して、それを免疫原として
利用して免疫してヒト以外の動物からの抗血清あるいは
該免疫された動物より得られた抗体産生細胞と永代培養
しうる細胞とを細胞融合し、次にハイブリドーマ細胞か
らモノクローナル抗体としてＳＣＣ Ａｇ類に対する特
異抗体を得、さらにそれを用いて偏平上皮癌関連抗原の
免疫学的測定用試薬並びに測定法が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は扁平上皮癌関連抗原に共
通した抗原及びその免疫学的利用法に関する。さらに詳
しくは、本発明は新規な扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａ
ｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ
Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣ Ａ
ｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ
９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａ
ｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４（以
下単に「ＳＣＣ Ａｇ類」ともいう）に関し、更にはそ
の抗原を用いての生体試料中の扁平上皮癌関連抗原、特
には扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類の免疫学的測定
法を提供することに関する。この免疫学的測定は定量的
あるいは定性的に行いえるものである。これら扁平上皮
癌関連抗原の分離精製法及びこの扁平上皮癌関連抗原に
対する抗体などの免疫学的利用法にも関連したものであ
る。
通した抗原及びその免疫学的利用法に関する。さらに詳
しくは、本発明は新規な扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａ
ｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ
Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣＡｇ５、ＳＣＣ Ａ
ｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ
９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａ
ｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４（以
下単に「ＳＣＣ Ａｇ類」ともいう）に関し、更にはそ
の抗原を用いての生体試料中の扁平上皮癌関連抗原、特
には扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類の免疫学的測定
法を提供することに関する。この免疫学的測定は定量的
あるいは定性的に行いえるものである。これら扁平上皮
癌関連抗原の分離精製法及びこの扁平上皮癌関連抗原に
対する抗体などの免疫学的利用法にも関連したものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】子宮に発生する悪性腫瘍の殆どは、子宮
頸癌であり、組織学的に分類すると子宮頸癌の大部分が
扁平上皮癌であり、腺癌、類腺癌は５％程度しか認めら
れないと言われている。子宮頸癌は早期においては大多
数が自覚的に無症状であり、早期の子宮頸癌は癌検診の
際に偶然発見される程度である。現在、子宮頸癌検診に
はスメア細胞を用いた細胞診が利用されているが、羞恥
心によって受診にためらいがあったり、細胞診に用いる
鏡検枚数に限界があり確実な結果を得られない等の問題
があり、その癌の早期での発見には多くの問題が残って
いる。更に子宮頸癌はその病変が骨盤腔の奥で進行する
ため、病状の正確な把握は臨床的に困難な場合が多い。
従って簡便な方法で多数の検体を処理できるような子宮
頸癌の診断方法の開発が望まれていた。また子宮頸癌の
治癒率の向上のためにも病状の変化を正確に反映するパ
ラメーターの開発並びにそのパラメーターを用いた子宮
頸癌の診断方法の開発が望まれていた。一方、悪性腫瘍
の診断、管理に腫瘍マーカーを利用する試みが盛んにお
こなわれており、例えば癌胎児性蛋白（Ｃａｒｃｉｎｏ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）やα−
フェトプロテイン（α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＦ
Ｐ）などが臨床的に広く用いられていることから、子宮
頸癌についてもこのような試みが求められている。
頸癌であり、組織学的に分類すると子宮頸癌の大部分が
扁平上皮癌であり、腺癌、類腺癌は５％程度しか認めら
れないと言われている。子宮頸癌は早期においては大多
数が自覚的に無症状であり、早期の子宮頸癌は癌検診の
際に偶然発見される程度である。現在、子宮頸癌検診に
はスメア細胞を用いた細胞診が利用されているが、羞恥
心によって受診にためらいがあったり、細胞診に用いる
鏡検枚数に限界があり確実な結果を得られない等の問題
があり、その癌の早期での発見には多くの問題が残って
いる。更に子宮頸癌はその病変が骨盤腔の奥で進行する
ため、病状の正確な把握は臨床的に困難な場合が多い。
従って簡便な方法で多数の検体を処理できるような子宮
頸癌の診断方法の開発が望まれていた。また子宮頸癌の
治癒率の向上のためにも病状の変化を正確に反映するパ
ラメーターの開発並びにそのパラメーターを用いた子宮
頸癌の診断方法の開発が望まれていた。一方、悪性腫瘍
の診断、管理に腫瘍マーカーを利用する試みが盛んにお
こなわれており、例えば癌胎児性蛋白（Ｃａｒｃｉｎｏ
ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）やα−
フェトプロテイン（α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＦ
Ｐ）などが臨床的に広く用いられていることから、子宮
頸癌についてもこのような試みが求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、すでに
扁平上皮癌関連抗原に関連してＴＡ−４を見出している
が、これは混合物であると同時に夾雑物を含むものであ
る。さらに、そのうちの扁平上皮癌関連抗原は物質とし
て精製がされていないため、それを用いての扁平上皮癌
関連抗原測定系は重量単位を用いることができず、ユニ
ット（Ｕｎｉｔ）単位を用いており、アッセイ系として
も未完成の状態である。さらに、それを用いての特異抗
体の作製には問題があり、こうして得られた抗体はそれ
を用いての扁平上皮癌関連抗原測定系への適用には問題
がある。こうして得られた測定系は、感度が不十分であ
り、扁平上皮癌患者におけるその出現率が低いものであ
り、臨床的に利用するには不十分であった。本発明は、
扁平上皮癌組織あるいはそれらの転移巣より新規な扁平
上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ
１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ
７、ＳＣＣＡｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１
０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａ
ｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４の１４種の蛋白質である
扁平上皮癌関連抗原を単一物質として分離精製すること
に成功し、上記ＴＡ−４の欠点を克服するものである。
扁平上皮癌関連抗原に関連してＴＡ−４を見出している
が、これは混合物であると同時に夾雑物を含むものであ
る。さらに、そのうちの扁平上皮癌関連抗原は物質とし
て精製がされていないため、それを用いての扁平上皮癌
関連抗原測定系は重量単位を用いることができず、ユニ
ット（Ｕｎｉｔ）単位を用いており、アッセイ系として
も未完成の状態である。さらに、それを用いての特異抗
体の作製には問題があり、こうして得られた抗体はそれ
を用いての扁平上皮癌関連抗原測定系への適用には問題
がある。こうして得られた測定系は、感度が不十分であ
り、扁平上皮癌患者におけるその出現率が低いものであ
り、臨床的に利用するには不十分であった。本発明は、
扁平上皮癌組織あるいはそれらの転移巣より新規な扁平
上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ
１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ
７、ＳＣＣＡｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１
０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａ
ｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４の１４種の蛋白質である
扁平上皮癌関連抗原を単一物質として分離精製すること
に成功し、上記ＴＡ−４の欠点を克服するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、子宮頸部癌、
肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいはそれらの転
移巣より新規な扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すな
わちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ
３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣＡｇ６、
ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、Ｓ
ＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１
２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４を抽出、
精製して、さらにそれを利用してＳＣＣ Ａｇ類に対す
る特異抗体を提供すると共にそれら扁平上皮癌関連抗原
ＳＣＣ Ａｇ類をアフィニティークロマトグラフィーに
より効率よく分離精製することにある。これらのＳＣＣ
Ａｇ類は、扁平上皮癌組織並びに血液中に存在する扁
平上皮癌関連抗原であり、共通の抗原活性（以下「ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗原活性」ともいう）を有する。さらにＳＣ
Ｃ Ａｇ類は、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリ
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定した
とき、約４５，０００の分子量を示す蛋白質であり、そ
れぞれ次の表に示されるような等電点を示す。
肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいはそれらの転
移巣より新規な扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すな
わちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ
３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣＡｇ６、
ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、Ｓ
ＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１
２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４を抽出、
精製して、さらにそれを利用してＳＣＣ Ａｇ類に対す
る特異抗体を提供すると共にそれら扁平上皮癌関連抗原
ＳＣＣ Ａｇ類をアフィニティークロマトグラフィーに
より効率よく分離精製することにある。これらのＳＣＣ
Ａｇ類は、扁平上皮癌組織並びに血液中に存在する扁
平上皮癌関連抗原であり、共通の抗原活性（以下「ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗原活性」ともいう）を有する。さらにＳＣ
Ｃ Ａｇ類は、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリ
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定した
とき、約４５，０００の分子量を示す蛋白質であり、そ
れぞれ次の表に示されるような等電点を示す。
【０００５】
【表５】
【０００６】扁平上皮癌関連抗原を開示した従来例の一
つとして特開昭５９−２１２４３６号公報があるが、そ
こに記載された蛋白質は１６５，０００〜２４０，００
０の分子量を有する成分二種類、１２０，０００〜１５
０，０００の分子量を有する成分一種類、及び７０，０
００〜８０，０００の分子量を有する成分一種類の合計
四種類の成分を抗原物質として含んでいる混合物である
のに対して、本発明の扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ
類はすべて約４５，０００の分子量を示す単一物質であ
る蛋白質であり、上記従来のものとは分子量が異なるの
みならず両者の間で交差反応性は見られず、免疫学的に
も異なる新規な物質である。本発明の目的の一つは、子
宮頸部癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいは
それらの転移巣より先ず新規な扁平上皮癌関連抗原ＳＣ
Ｃ Ａｇ１を抽出、精製して、こうして得られた精製Ｓ
ＣＣ Ａｇ１を用いてそれに対する特異抗体を得ること
にもある。ＳＣＣ Ａｇ１の抽出、精製は、子宮頸部
癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいはそれら
の転移巣をホモゲナイズして得た蛋白抽出液を硫安塩析
し、次にセファデックスＧ−１００によりゲル濾過し、
次いでＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラ
フィーにかけ、塩濃度勾配溶出して、続いてＣＭ−セフ
ァロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度
勾配溶出し余分な蛋白を除去したのち、さらにセファデ
ックスＧ−１００によりゲル濾過して達成される。
つとして特開昭５９−２１２４３６号公報があるが、そ
こに記載された蛋白質は１６５，０００〜２４０，００
０の分子量を有する成分二種類、１２０，０００〜１５
０，０００の分子量を有する成分一種類、及び７０，０
００〜８０，０００の分子量を有する成分一種類の合計
四種類の成分を抗原物質として含んでいる混合物である
のに対して、本発明の扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ
類はすべて約４５，０００の分子量を示す単一物質であ
る蛋白質であり、上記従来のものとは分子量が異なるの
みならず両者の間で交差反応性は見られず、免疫学的に
も異なる新規な物質である。本発明の目的の一つは、子
宮頸部癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいは
それらの転移巣より先ず新規な扁平上皮癌関連抗原ＳＣ
Ｃ Ａｇ１を抽出、精製して、こうして得られた精製Ｓ
ＣＣ Ａｇ１を用いてそれに対する特異抗体を得ること
にもある。ＳＣＣ Ａｇ１の抽出、精製は、子宮頸部
癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいはそれら
の転移巣をホモゲナイズして得た蛋白抽出液を硫安塩析
し、次にセファデックスＧ−１００によりゲル濾過し、
次いでＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラ
フィーにかけ、塩濃度勾配溶出して、続いてＣＭ−セフ
ァロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度
勾配溶出し余分な蛋白を除去したのち、さらにセファデ
ックスＧ−１００によりゲル濾過して達成される。
【０００７】本発明の他の目的は、ＳＣＣ Ａｇ１と共
通の抗原性を示す扁平上皮癌関連抗原類をも抽出、精製
して、こうして得られた精製ＳＣＣ Ａｇ類抗原を用い
てそれに対する特異抗体を得ることにもある。ＳＣＣ
Ａｇ１と共通の抗原性を示す扁平上皮癌関連抗原類の抽
出、精製は、子宮頸部癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮
癌組織あるいはそれらの転移巣をホモゲナイズして得た
蛋白抽出液を硫安塩析し、次にセファデックスＧ−１０
０によりゲル濾過し、次いでセファロース４Ｂに抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体を結合させたアフィニテイークロマトグ
ラフィーにかけ、未反応成分を洗浄・除去したのち、グ
リシン−塩酸緩衝液（ｐＨ＝３〜４）にて抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体と特異的に結合したＳＣＣ Ａｇ１抗原活性を
示す扁平上皮癌関連抗原蛋白質を解離・回収し、次にこ
うして得られた蛋白質をさらにＤＥＡＥ−セファロース
イオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配溶出
して精製し、さらにこうして精製された蛋白質は等電点
電気泳動（ＩＥＦ）法により１４の成分に分けることに
よりなされ、この１４の成分がそれぞれＳＣＣ Ａｇ
１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ
７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１
０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａ
ｇ１３、及びＳＣＣＡｇ１４と命名した単一の扁平上皮
癌関連抗原蛋白質である。
通の抗原性を示す扁平上皮癌関連抗原類をも抽出、精製
して、こうして得られた精製ＳＣＣ Ａｇ類抗原を用い
てそれに対する特異抗体を得ることにもある。ＳＣＣ
Ａｇ１と共通の抗原性を示す扁平上皮癌関連抗原類の抽
出、精製は、子宮頸部癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮
癌組織あるいはそれらの転移巣をホモゲナイズして得た
蛋白抽出液を硫安塩析し、次にセファデックスＧ−１０
０によりゲル濾過し、次いでセファロース４Ｂに抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体を結合させたアフィニテイークロマトグ
ラフィーにかけ、未反応成分を洗浄・除去したのち、グ
リシン−塩酸緩衝液（ｐＨ＝３〜４）にて抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体と特異的に結合したＳＣＣ Ａｇ１抗原活性を
示す扁平上皮癌関連抗原蛋白質を解離・回収し、次にこ
うして得られた蛋白質をさらにＤＥＡＥ−セファロース
イオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配溶出
して精製し、さらにこうして精製された蛋白質は等電点
電気泳動（ＩＥＦ）法により１４の成分に分けることに
よりなされ、この１４の成分がそれぞれＳＣＣ Ａｇ
１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ
７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１
０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａ
ｇ１３、及びＳＣＣＡｇ１４と命名した単一の扁平上皮
癌関連抗原蛋白質である。
【０００８】このＳＣＣ Ａｇ類は、扁平上皮癌組織中
に高濃度に存在するが、同じ子宮頸部由来でも腺癌や未
分化癌組織中には殆ど検出されない。他方、子宮頸部の
扁平上皮癌に限らず、他の臓器由来の扁平上皮癌におい
てもＳＣＣ Ａｇ類の存在が確認されている。さらにま
た、ＳＣＣ Ａｇ類は扁平上皮癌の患者の血液中に高濃
度に出現するので、従来の形態学的検査に替わり免疫学
的方法による扁平上皮癌の診断、予後推定、病状管理な
どに利用することができる。すなわち、本発明の他の目
的は、免疫学的方法による扁平上皮癌の診断、予後推
定、病状管理を目的とした試薬、特には放射性同位元
素、酵素あるいは蛍光物質等の標識剤で標識したＳＣＣ
Ａｇ類またはＳＣＣ Ａｇ類に対する抗体を提供する
と共に、それら試薬を用い、生体試料中の扁平上皮癌関
連抗原、特には扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類の免
疫学的測定法を提供する。この免疫学的測定は定量的あ
るいは定性的に行いえるものである。本発明にしたがえ
ば、ヒト子宮頸部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織あ
るいはそれらの転移巣の抽出物あるいはそれらから得ら
れる組織蛋白を含有する溶液を下記の諸段階、すなわち
（ａ）硫安塩析し（ｂ）得られる硫安分画をセファデッ
クスＧ−１００によりゲル濾過し、次いで（ｃ）ＤＥＡ
Ｅ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーにか
け、塩濃度勾配溶出し、続いて（ｄ）ＣＭ−セファロー
スイオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配溶
出し、さらに（ｅ）セファデックスＧ−１００によりゲ
ル濾過することを特徴とするナトリウムドデシルサルフ
ェート−ポリアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
法で測定したとき、約４５，０００の分子量を示し、等
電点電気泳動（ＩＥＦ）法で約６．６２の等電点を示
し、かつ下記のアミノ酸組成（精度：±１０％）
に高濃度に存在するが、同じ子宮頸部由来でも腺癌や未
分化癌組織中には殆ど検出されない。他方、子宮頸部の
扁平上皮癌に限らず、他の臓器由来の扁平上皮癌におい
てもＳＣＣ Ａｇ類の存在が確認されている。さらにま
た、ＳＣＣ Ａｇ類は扁平上皮癌の患者の血液中に高濃
度に出現するので、従来の形態学的検査に替わり免疫学
的方法による扁平上皮癌の診断、予後推定、病状管理な
どに利用することができる。すなわち、本発明の他の目
的は、免疫学的方法による扁平上皮癌の診断、予後推
定、病状管理を目的とした試薬、特には放射性同位元
素、酵素あるいは蛍光物質等の標識剤で標識したＳＣＣ
Ａｇ類またはＳＣＣ Ａｇ類に対する抗体を提供する
と共に、それら試薬を用い、生体試料中の扁平上皮癌関
連抗原、特には扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類の免
疫学的測定法を提供する。この免疫学的測定は定量的あ
るいは定性的に行いえるものである。本発明にしたがえ
ば、ヒト子宮頸部癌、肺癌、食道癌の扁平上皮癌組織あ
るいはそれらの転移巣の抽出物あるいはそれらから得ら
れる組織蛋白を含有する溶液を下記の諸段階、すなわち
（ａ）硫安塩析し（ｂ）得られる硫安分画をセファデッ
クスＧ−１００によりゲル濾過し、次いで（ｃ）ＤＥＡ
Ｅ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーにか
け、塩濃度勾配溶出し、続いて（ｄ）ＣＭ−セファロー
スイオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配溶
出し、さらに（ｅ）セファデックスＧ−１００によりゲ
ル濾過することを特徴とするナトリウムドデシルサルフ
ェート−ポリアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
法で測定したとき、約４５，０００の分子量を示し、等
電点電気泳動（ＩＥＦ）法で約６．６２の等電点を示
し、かつ下記のアミノ酸組成（精度：±１０％）
【表６】 を有し、免疫学的に抗原性を有する蛋白質である精製扁
平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ１または該扁平上皮癌関連
抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原性を示しかつＳＤＳ−
ＰＡＧＥで測定したとき、約４５，０００の分子量を示
し、ＩＥＦで下記の等電点
平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ１または該扁平上皮癌関連
抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原性を示しかつＳＤＳ−
ＰＡＧＥで測定したとき、約４５，０００の分子量を示
し、ＩＥＦで下記の等電点
【表７】 を有する蛋白質である精製扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ
Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａ
ｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣＡｇ
８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ
１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、あるいは
ＳＣＣ Ａｇ１４の分離精製方法も提供される。本発明
にしたがえば、さらにまたヒト子宮頸部癌、肺癌、食道
癌の扁平上皮癌組織あるいはそれらの転移巣の抽出物あ
るいはそれらから得られる組織蛋白を含有する溶液を下
記の諸段階、すなわち（ａ）硫安塩析し（ｂ）得られる
硫安分画をセファデックスＧ−１００によりゲル濾過
し、次いで（ｃ）セファロース４Ｂに抗ＳＣＣ Ａｇ１
抗体を結合させたアフィニテイークロマトグラフィーに
かけ、未反応成分を洗浄・除去したのち、グリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ＝３〜４）にて抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体と
特異的に結合したＳＣＣ Ａｇ１抗原活性を示す扁平上
皮癌関連抗原蛋白質を解離・回収し、（ｄ）次にこうし
て得られた蛋白質をさらにＤＥＡＥ−セファロースイオ
ン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配溶出し、
（ｅ）さらにこうして精製された蛋白質は等電点電気泳
動（ＩＥＦ）法により１４の成分に分けることことを特
徴とするナトリウムドデシルサルフェート−ポリアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定したとき、
約４５，０００の分子量を示し、等電点電気泳動（ＩＥ
Ｆ）法で約６．６２の等電点を示し、かつ下記のアミノ
酸組成（精度：±１０％）
Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａ
ｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣＡｇ
８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ
１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、あるいは
ＳＣＣ Ａｇ１４の分離精製方法も提供される。本発明
にしたがえば、さらにまたヒト子宮頸部癌、肺癌、食道
癌の扁平上皮癌組織あるいはそれらの転移巣の抽出物あ
るいはそれらから得られる組織蛋白を含有する溶液を下
記の諸段階、すなわち（ａ）硫安塩析し（ｂ）得られる
硫安分画をセファデックスＧ−１００によりゲル濾過
し、次いで（ｃ）セファロース４Ｂに抗ＳＣＣ Ａｇ１
抗体を結合させたアフィニテイークロマトグラフィーに
かけ、未反応成分を洗浄・除去したのち、グリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ＝３〜４）にて抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体と
特異的に結合したＳＣＣ Ａｇ１抗原活性を示す扁平上
皮癌関連抗原蛋白質を解離・回収し、（ｄ）次にこうし
て得られた蛋白質をさらにＤＥＡＥ−セファロースイオ
ン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配溶出し、
（ｅ）さらにこうして精製された蛋白質は等電点電気泳
動（ＩＥＦ）法により１４の成分に分けることことを特
徴とするナトリウムドデシルサルフェート−ポリアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定したとき、
約４５，０００の分子量を示し、等電点電気泳動（ＩＥ
Ｆ）法で約６．６２の等電点を示し、かつ下記のアミノ
酸組成（精度：±１０％）
【表８】 を有し、免疫学的に抗原性を有する蛋白質である精製扁
平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ１または該扁平上皮癌関連
抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原性を示しかつＳＤＳ−
ＰＡＧＥで測定したとき、約４５，０００の分子量を示
し、ＩＥＦで下記の等電点
平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ１または該扁平上皮癌関連
抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原性を示しかつＳＤＳ−
ＰＡＧＥで測定したとき、約４５，０００の分子量を示
し、ＩＥＦで下記の等電点
【表９】 を有する蛋白質である精製扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ
Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａ
ｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣＡｇ
８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ
１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、あるいは
ＳＣＣ Ａｇ１４の分離精製方法も提供されることが理
解されよう。以下、ＳＣＣ Ａｇ１を例にとり、本発明
をさらに詳しく説明する。ＳＣＣＡｇ１は、等電点が約
６．６２、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定
したときの分子量が、約４５，０００の蛋白質で、扁平
上皮癌組織並びに血中に存在する扁平上皮癌関連抗原で
ある。そのアミノ酸組成（精度：±１０％）は次の表に
示す通りである。
Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａ
ｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣＡｇ
８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ
１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、あるいは
ＳＣＣ Ａｇ１４の分離精製方法も提供されることが理
解されよう。以下、ＳＣＣ Ａｇ１を例にとり、本発明
をさらに詳しく説明する。ＳＣＣＡｇ１は、等電点が約
６．６２、ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定
したときの分子量が、約４５，０００の蛋白質で、扁平
上皮癌組織並びに血中に存在する扁平上皮癌関連抗原で
ある。そのアミノ酸組成（精度：±１０％）は次の表に
示す通りである。
【０００９】
【表１０】
【００１０】本発明にしたがった扁平上皮癌関連抗原に
共通した抗原に対する抗体、さらに詳しくは、新規な扁
平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ
１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣＡｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、
ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、
ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１
３、及びＳＣＣ Ａｇ１４（以下単に「ＳＣＣ Ａｇ
類」ともいう）に対する特異抗体は、上記のようにして
得られた免疫学的に抗原性を有する蛋白質である精製扁
平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１を用いて既知の方法に
より作製することができる。すなわち精製扁平上皮癌関
連抗原ＳＣＣ Ａｇ１をヒト以外の動物、例えばウサ
ギ、マウス、ヤギ、ニワトリ、ウマなどに免疫し、免疫
化された動物より血清を得、こうしてＳＣＣ Ａｇ１に
対する抗血清を得ることができる。また、ＳＣＣ Ａｇ
１で免疫化されたマウスあるいはラットの脾細胞とマウ
スあるいはラットのミエローマ細胞とを細胞融合し、次
に得られた抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体産生細胞（ハイブリド
ーマ）から扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１に対する
モノクローナル抗体を得ることもできる。本発明にした
がった扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原
性に対する抗体は、以上のようにして得られるほか、各
精製扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ類を用いて同様にし
て得られる。
共通した抗原に対する抗体、さらに詳しくは、新規な扁
平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ類すなわちＳＣＣ Ａｇ
１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣＡｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、
ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、
ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１
３、及びＳＣＣ Ａｇ１４（以下単に「ＳＣＣ Ａｇ
類」ともいう）に対する特異抗体は、上記のようにして
得られた免疫学的に抗原性を有する蛋白質である精製扁
平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１を用いて既知の方法に
より作製することができる。すなわち精製扁平上皮癌関
連抗原ＳＣＣ Ａｇ１をヒト以外の動物、例えばウサ
ギ、マウス、ヤギ、ニワトリ、ウマなどに免疫し、免疫
化された動物より血清を得、こうしてＳＣＣ Ａｇ１に
対する抗血清を得ることができる。また、ＳＣＣ Ａｇ
１で免疫化されたマウスあるいはラットの脾細胞とマウ
スあるいはラットのミエローマ細胞とを細胞融合し、次
に得られた抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体産生細胞（ハイブリド
ーマ）から扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１に対する
モノクローナル抗体を得ることもできる。本発明にした
がった扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原
性に対する抗体は、以上のようにして得られるほか、各
精製扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ類を用いて同様にし
て得られる。
【００１１】本発明の標識ＳＣＣ Ａｇ１及び本発明に
したがった標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を作製するための
標識剤によるＳＣＣ Ａｇ１及び抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体
の標識は、当該分野において通常用いられている方法に
より行うことができる。本発明の生体試料中の扁平上皮
癌関連抗原、特には扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ類の
定量的あるいは定性的な免疫学的測定は、次に示すよう
な種々の方法により達成することができる。 （１） 体液検体中のＳＣＣ Ａｇ１を既知量の標識Ｓ
ＣＣ Ａｇ１と混合したのち、両者を一定量の抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体に対して競合反応させたのち、抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体と結合した標識ＳＣＣ Ａｇ１（Ｂ）と、結
合していない標識ＳＣＣ Ａｇ１（Ｆ）とを適当な方法
で分離（Ｂ・Ｆ分離）し、それらの分画の一方または両
方の標識剤の活性を測定し、予め既知量のＳＣＣ Ａｇ
１において同様にして得られた標準曲線より、体液検体
中のＳＣＣ Ａｇ１量を求める方法（競合法）。Ｂ・Ｆ
分離は、ＰＥＧ法、二抗体法、固相法などの既知の方法
により行うことができる。 （２） 体液検体中のＳＣＣ Ａｇ１を、抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を固相に結合させた不溶化抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体に抗原抗体反応により結合させ、次いで標識抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体を結合させることにより、〔不溶化抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体〕−〔ＳＣＣ Ａｇ１〕−〔標識抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体〕複合物を形成させ、不溶化抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体にＳＣＣ Ａｇ１を介して結合した標識抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１抗体の標識剤の活性を測定し、予め既知量
のＳＣＣ Ａｇ１において同様にして得られた標準曲線
より、体液検体中のＳＣＣ Ａｇ１量を求める方法（サ
ンドイッチ法）。
したがった標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を作製するための
標識剤によるＳＣＣ Ａｇ１及び抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体
の標識は、当該分野において通常用いられている方法に
より行うことができる。本発明の生体試料中の扁平上皮
癌関連抗原、特には扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣＡｇ類の
定量的あるいは定性的な免疫学的測定は、次に示すよう
な種々の方法により達成することができる。 （１） 体液検体中のＳＣＣ Ａｇ１を既知量の標識Ｓ
ＣＣ Ａｇ１と混合したのち、両者を一定量の抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体に対して競合反応させたのち、抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体と結合した標識ＳＣＣ Ａｇ１（Ｂ）と、結
合していない標識ＳＣＣ Ａｇ１（Ｆ）とを適当な方法
で分離（Ｂ・Ｆ分離）し、それらの分画の一方または両
方の標識剤の活性を測定し、予め既知量のＳＣＣ Ａｇ
１において同様にして得られた標準曲線より、体液検体
中のＳＣＣ Ａｇ１量を求める方法（競合法）。Ｂ・Ｆ
分離は、ＰＥＧ法、二抗体法、固相法などの既知の方法
により行うことができる。 （２） 体液検体中のＳＣＣ Ａｇ１を、抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を固相に結合させた不溶化抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体に抗原抗体反応により結合させ、次いで標識抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体を結合させることにより、〔不溶化抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体〕−〔ＳＣＣ Ａｇ１〕−〔標識抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体〕複合物を形成させ、不溶化抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体にＳＣＣ Ａｇ１を介して結合した標識抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１抗体の標識剤の活性を測定し、予め既知量
のＳＣＣ Ａｇ１において同様にして得られた標準曲線
より、体液検体中のＳＣＣ Ａｇ１量を求める方法（サ
ンドイッチ法）。
【００１２】（３） さらに、ＳＣＣ Ａｇ１と、抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１抗体との抗原抗体反応により免疫複合体と
なった場合に、標識ＳＣＣ Ａｇ１上の標識剤の活性が
減衰あるいは増強することを利用し、Ｂ・Ｆ分離を必要
としない方法（均一イムノアッセイ）。 （４） また、組織中またはスメア細胞中のＳＣＣ Ａ
ｇ１を測定する方法として、組織標本またはスメア細胞
標本に標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を反応させ、結合した
標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体の標識剤の活性を観察、測定
する方法（直接法）。 （５） 組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を反応させ、さらにこれに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体に対する抗体を標識剤で標識した標識抗ＩｇＧ抗体を
反応させ、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を介して組織中または
スメア細胞中のＳＣＣ Ａｇ１と結合した標識抗ＩｇＧ
抗体の標識剤の活性を観察、測定する方法（間接法）。 （６） 組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を反応させ、次いでこれに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体に対する抗体（抗ＩｇＧ抗体）を反応させ、さらに酵
素及び該酵素に対する抗体（免疫動物が抗ＳＣＣ Ａｇ
１抗体と同種のもの）との結合物を反応させて得られた
複合物中の酵素活性を測定する方法（ＰＡＰ法）。 （７） 組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を反応させ、次いでこれにビオチン標識した標
識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体に対する抗体（抗ＩｇＧ抗体）
を反応させ、さらにビオチン化酵素とアビジンの結合物
とを反応させて得られた複合物中の酵素活性を測定する
方法（ＡＢＣ法）。 標識剤としては、放射性同位元素、酵素あるいは蛍光物
質等を用いることができる。生体試料としては、血清、
血漿、尿あるいは組織、スメア細胞などあげることがで
きる。
ＣＣ Ａｇ１抗体との抗原抗体反応により免疫複合体と
なった場合に、標識ＳＣＣ Ａｇ１上の標識剤の活性が
減衰あるいは増強することを利用し、Ｂ・Ｆ分離を必要
としない方法（均一イムノアッセイ）。 （４） また、組織中またはスメア細胞中のＳＣＣ Ａ
ｇ１を測定する方法として、組織標本またはスメア細胞
標本に標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を反応させ、結合した
標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体の標識剤の活性を観察、測定
する方法（直接法）。 （５） 組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を反応させ、さらにこれに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体に対する抗体を標識剤で標識した標識抗ＩｇＧ抗体を
反応させ、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を介して組織中または
スメア細胞中のＳＣＣ Ａｇ１と結合した標識抗ＩｇＧ
抗体の標識剤の活性を観察、測定する方法（間接法）。 （６） 組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を反応させ、次いでこれに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体に対する抗体（抗ＩｇＧ抗体）を反応させ、さらに酵
素及び該酵素に対する抗体（免疫動物が抗ＳＣＣ Ａｇ
１抗体と同種のもの）との結合物を反応させて得られた
複合物中の酵素活性を測定する方法（ＰＡＰ法）。 （７） 組織標本またはスメア細胞標本に抗ＳＣＣ Ａ
ｇ１抗体を反応させ、次いでこれにビオチン標識した標
識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体に対する抗体（抗ＩｇＧ抗体）
を反応させ、さらにビオチン化酵素とアビジンの結合物
とを反応させて得られた複合物中の酵素活性を測定する
方法（ＡＢＣ法）。 標識剤としては、放射性同位元素、酵素あるいは蛍光物
質等を用いることができる。生体試料としては、血清、
血漿、尿あるいは組織、スメア細胞などあげることがで
きる。
【００１３】本発明の方法により血中のＳＣＣ Ａｇ１
を測定した結果、子宮頸部扁平上皮癌患者の血中のＳＣ
Ｃ Ａｇ１値は高値を示した。他の臓器由来の扁平上皮
癌においても高値を示すものが認められた。一方、子宮
頸部腺癌をはじめ婦人科良性疾患患者および正常婦人に
おける血中のＳＣＣ Ａｇ１値は低値を示した。従っ
て、本発明による生体試料中のＳＣＣ Ａｇ１の測定
は、子宮頸部扁平上皮癌の診断を簡便に行うことを可能
にするものであり、さらに子宮頸部扁平上皮癌の経過観
察、治療効果の判定に極めて有用である。また肺癌、食
道癌の扁平上皮癌の診断、経過観察、治療効果の判定に
も有用である。他のＳＣＣ Ａｇ類、すなわちＳＣＣ
Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａ
ｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａｇ
８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ
１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳＣ
Ｃ Ａｇ１４についても同様の結果を得ることができ
る。
を測定した結果、子宮頸部扁平上皮癌患者の血中のＳＣ
Ｃ Ａｇ１値は高値を示した。他の臓器由来の扁平上皮
癌においても高値を示すものが認められた。一方、子宮
頸部腺癌をはじめ婦人科良性疾患患者および正常婦人に
おける血中のＳＣＣ Ａｇ１値は低値を示した。従っ
て、本発明による生体試料中のＳＣＣ Ａｇ１の測定
は、子宮頸部扁平上皮癌の診断を簡便に行うことを可能
にするものであり、さらに子宮頸部扁平上皮癌の経過観
察、治療効果の判定に極めて有用である。また肺癌、食
道癌の扁平上皮癌の診断、経過観察、治療効果の判定に
も有用である。他のＳＣＣ Ａｇ類、すなわちＳＣＣ
Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ Ａ
ｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ Ａｇ
８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ Ａｇ
１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及びＳＣ
Ｃ Ａｇ１４についても同様の結果を得ることができ
る。
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに具体的に説
明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるも
のではない。
明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるも
のではない。
【００１４】実施例１． ＳＣＣ Ａｇ１ （１） ＳＣＣ Ａｇ１の精製 子宮頸部扁平上皮癌肝転移組織４５０ｇを細切、ホモゲ
ナイズして得た蛋白抽出液に硫安を加え、５０％飽和と
し、塩析する。遠心分離して回収した上清にさらに硫安
を加え、９０％飽和とし、塩析する。遠心分離して沈殿
を回収する。この沈殿をリン酸緩衝液に対して透析し、
遠心分離して得た上清を濾過し、この分画を硫安分画と
して得た。硫安分画を１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水溶液
（ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−１００
の５×９０ｃｍのカラムによりゲル濾過し溶出した第２
番目のピーク（図１、矢印で示す）を採取し、５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）にて透析した後、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファロースの４．５×２５ｃｍのカラムのイオ
ン交換クロマトグラフィーにかけ、０〜０．２塩化ナト
リウムの塩濃度勾配溶出し、なだらかな第５番目のピー
ク（図２、矢印で示す）を採取し、５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて透析した後、５０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＣＭ−
セファロースの１．０×２５．５ｃｍのカラムにかけ、
０〜１．０塩化ナトリウムの塩濃度勾配溶出し、得られ
た最初の大きなピーク（図３、矢印で示す）を採取し、
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液および１４０ｍＭ塩化
ナトリウム（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックス
Ｇ−１００の１．６×８．８ｃｍのカラムを用いてゲル
濾過し、溶出した第２番目のピーク（図４、矢印で示
す）を回収して、純化されたＳＣＣ Ａｇ１分画を得
た。
ナイズして得た蛋白抽出液に硫安を加え、５０％飽和と
し、塩析する。遠心分離して回収した上清にさらに硫安
を加え、９０％飽和とし、塩析する。遠心分離して沈殿
を回収する。この沈殿をリン酸緩衝液に対して透析し、
遠心分離して得た上清を濾過し、この分画を硫安分画と
して得た。硫安分画を１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水溶液
（ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−１００
の５×９０ｃｍのカラムによりゲル濾過し溶出した第２
番目のピーク（図１、矢印で示す）を採取し、５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）にて透析した後、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファロースの４．５×２５ｃｍのカラムのイオ
ン交換クロマトグラフィーにかけ、０〜０．２塩化ナト
リウムの塩濃度勾配溶出し、なだらかな第５番目のピー
ク（図２、矢印で示す）を採取し、５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５．５）にて透析した後、５０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＣＭ−
セファロースの１．０×２５．５ｃｍのカラムにかけ、
０〜１．０塩化ナトリウムの塩濃度勾配溶出し、得られ
た最初の大きなピーク（図３、矢印で示す）を採取し、
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液および１４０ｍＭ塩化
ナトリウム（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックス
Ｇ−１００の１．６×８．８ｃｍのカラムを用いてゲル
濾過し、溶出した第２番目のピーク（図４、矢印で示
す）を回収して、純化されたＳＣＣ Ａｇ１分画を得
た。
【００１５】（２） ＳＣＣ Ａｇ１分画の等電点電気
泳動（ＩＥＦ） 上記工程（１）で子宮頸部癌組織から純化されたＳＣＣ
Ａｇ１分画の等電点電気泳動を行った。ゲルは５％ポ
リアクリルアミドゲル、６．３％キャリアアンフォライ
トｐＨ３．５〜９．５（異なる等電点を持つ数種の化合
物の混合物で、電気を流すことによりゲル中にｐＨ３．
５〜９．５のｐＨ勾配を作製する）を用いた。電極溶液
は陽極：０．０２５Ｍアスパラギン酸、０．０２５Ｍグ
ルタミン酸、陰極：２．０Ｍエチレンジアミン、０．０
２５Ｍアルギニン、０．０２５Ｍリジンを用いた。泳動
条件は、１０Ｗ、１時間泳動、更に２０００Ｖで１時間
泳動した。 （３） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるＳＣＣ Ａｇ１の分
子量の算出 上記工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１と５％メルカ
プトエタノール、２％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含
む６２．５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）とを
１：１の割合で混合し、９５℃３分間処理したものをサ
ンプルとした。ゲルは、０．１％ＳＤＳを含むポリアク
リルアミドスラブゲルで、上層が濃縮ゲル（３．９％ポ
リアクリルアミド、０．１２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８））、下層が分離ゲル（１０％ポリアクリルア
ミド、０．３７５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８））
である。電極溶液は、０．１％ＳＤＳを含む２０ｍＭト
リス／グリシンである。サンプルを濃縮ゲルの上端に作
製したウェルに入れ、上を陰極、下を陽極として電気泳
動を行った。濃縮ゲル中をサンプルが通過しているとき
は、１５ｍＡで、分離ゲルに入ってからは２０ｍＡに上
げた。この時ウマチトクロームＣ（分子量１２，４００
ダルトン）の１、２、３、４および６量体を同様に処理
し、分子量マーカとして別のウェルに入れ、サンプルと
同時に泳動する。泳動終了後、０．２５％コマジーＲ２
５０、９．２％酢酸、５０％メタノール中で１時間ゆる
やかに振とうし、ついで染色し、蛋白質のバンド以外
は、９．２％酢酸、５０％メタノール中で振とうしなが
ら脱色した。分子量マーカの各成分のＲｆ値（蛋白質の
移動距離／泳動距離）を求め、こうして求めたＲｆ値を
横軸に、各成分の分子量を縦軸（対数）にして回帰曲線
を作製した。またＳＣＣ Ａｇ１のＲｆ値を求め、回帰
曲線からその分子量を求めると、約４５，０００ダルト
ンであった（図１０）。本実験を８回繰り返した。その
うち６回は約４５，０００ダルトンであることを示し、
他はそれぞれ４５，５００ダルトンおよび４５，２００
ダルトンであった。誤差範囲は０．４％であることか
ら、ＳＣＣ Ａｇ１の分子量は約４５，０００ダルトン
であるとした。
泳動（ＩＥＦ） 上記工程（１）で子宮頸部癌組織から純化されたＳＣＣ
Ａｇ１分画の等電点電気泳動を行った。ゲルは５％ポ
リアクリルアミドゲル、６．３％キャリアアンフォライ
トｐＨ３．５〜９．５（異なる等電点を持つ数種の化合
物の混合物で、電気を流すことによりゲル中にｐＨ３．
５〜９．５のｐＨ勾配を作製する）を用いた。電極溶液
は陽極：０．０２５Ｍアスパラギン酸、０．０２５Ｍグ
ルタミン酸、陰極：２．０Ｍエチレンジアミン、０．０
２５Ｍアルギニン、０．０２５Ｍリジンを用いた。泳動
条件は、１０Ｗ、１時間泳動、更に２０００Ｖで１時間
泳動した。 （３） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるＳＣＣ Ａｇ１の分
子量の算出 上記工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１と５％メルカ
プトエタノール、２％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含
む６２．５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）とを
１：１の割合で混合し、９５℃３分間処理したものをサ
ンプルとした。ゲルは、０．１％ＳＤＳを含むポリアク
リルアミドスラブゲルで、上層が濃縮ゲル（３．９％ポ
リアクリルアミド、０．１２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８））、下層が分離ゲル（１０％ポリアクリルア
ミド、０．３７５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８））
である。電極溶液は、０．１％ＳＤＳを含む２０ｍＭト
リス／グリシンである。サンプルを濃縮ゲルの上端に作
製したウェルに入れ、上を陰極、下を陽極として電気泳
動を行った。濃縮ゲル中をサンプルが通過しているとき
は、１５ｍＡで、分離ゲルに入ってからは２０ｍＡに上
げた。この時ウマチトクロームＣ（分子量１２，４００
ダルトン）の１、２、３、４および６量体を同様に処理
し、分子量マーカとして別のウェルに入れ、サンプルと
同時に泳動する。泳動終了後、０．２５％コマジーＲ２
５０、９．２％酢酸、５０％メタノール中で１時間ゆる
やかに振とうし、ついで染色し、蛋白質のバンド以外
は、９．２％酢酸、５０％メタノール中で振とうしなが
ら脱色した。分子量マーカの各成分のＲｆ値（蛋白質の
移動距離／泳動距離）を求め、こうして求めたＲｆ値を
横軸に、各成分の分子量を縦軸（対数）にして回帰曲線
を作製した。またＳＣＣ Ａｇ１のＲｆ値を求め、回帰
曲線からその分子量を求めると、約４５，０００ダルト
ンであった（図１０）。本実験を８回繰り返した。その
うち６回は約４５，０００ダルトンであることを示し、
他はそれぞれ４５，５００ダルトンおよび４５，２００
ダルトンであった。誤差範囲は０．４％であることか
ら、ＳＣＣ Ａｇ１の分子量は約４５，０００ダルトン
であるとした。
【００１６】実施例２． 各ＳＣＣ Ａｇの精製 （１） セファロース４Ｂに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を結
合させたアフィニテイーゲルの調製 ３ｍｌのセファロース４Ｂに１５ｍｌの０．３ｇのＢｒ
ＣＮを含有する溶液を加え、１ＮＮａＯＨ溶液を加えて
ｐＨを１０．５〜１１．０に維持する。ゲルの活性化後
すぐに処理したゲルを１５０ｍｌの冷０．１ＭＮａＨＣ
Ｏ３溶液で良く洗浄する。実施例３で得られた抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体８．４ｍｇ／６ｍｌ ０．１ＭＮａＨＣＯ
３溶液を活性化されたセファロース４Ｂに混合し、４℃
で一晩攪拌して結合させた。ゲルをブッフナー濾過器上
で１５０ｍｌの０．１ＭＮａＨＣＯ３溶液および７５ｍ
ｌの０．９％ＮａＣｌ溶液で良く洗浄する。次にゲルを
３ｍｌの８Ｍ尿素溶液中に懸濁し、ブッフナー濾過器上
で１５０ｍｌの８Ｍ尿素溶液および１５０ｍｌの０．９
％ＮａＣｌ溶液で良く洗浄する。こうして得られた抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１抗体をゲル１ｍｌ当たり２．８ｍｌ含有す
るアフィニテイーゲルをカラム（０．７×７．８ｃｍ、
ベッド容量３ｍｌ）に詰めた。 （２） セファロース４Ｂに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を結
合させたアフィニテイークロマトグラフィーによるＳＣ
Ｃ Ａｇ類の精製 子宮頸部扁平上皮癌肝転移組織３２０ｇを細切、ホモゲ
ナイズして得た蛋白抽出液に硫安を加え、５０％飽和と
し、塩析する。遠心分離して回収した上清にさらに硫安
を加え、９０％飽和とし、塩析する。遠心分離して沈殿
を回収する。この沈殿をリン酸緩衝液に対して透析し、
遠心分離して得た上清を濾過し、この分画を硫安分画と
して得た。硫安分画を１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水溶液
（ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−１００
の５×９０ｃｍのカラムによりゲル濾過し、溶出した第
２番目のピークを採取し、該分画をセファロース４Ｂに
抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を結合させたアフィニテイークロ
マトグラフィーに１１ｍｌ／ｈｒの流速でかけ、リン酸
緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ液、ｐＨ７．４）の４０ｍｌ／
ｈｒの流速で洗浄し、次に９ｍｌの１ＭＮａＣｌ溶液で
洗浄し、２８０ｎｍの吸光度を測定し０．０１以下にな
ったら、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）
を４０ｍｌ／ｈｒの流速で流し抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体と
特異的に結合した成分を解離させ、回収した（図５、矢
印で示す）。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）
にて透析したのち、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．３）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースの１×３
０ｃｍのカラムのイオン交換クロマトグラフィーにか
け、０〜０．２Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度勾配溶出し、
さらにこうして精製された蛋白質は等電点電気泳動（Ｉ
ＥＦ）法により１４の成分に分けられ、それぞれＳＣＣ
Ａｇ１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ
Ａｇ４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａ
ｇ７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ
１０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ
Ａｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４とされた。
合させたアフィニテイーゲルの調製 ３ｍｌのセファロース４Ｂに１５ｍｌの０．３ｇのＢｒ
ＣＮを含有する溶液を加え、１ＮＮａＯＨ溶液を加えて
ｐＨを１０．５〜１１．０に維持する。ゲルの活性化後
すぐに処理したゲルを１５０ｍｌの冷０．１ＭＮａＨＣ
Ｏ３溶液で良く洗浄する。実施例３で得られた抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体８．４ｍｇ／６ｍｌ ０．１ＭＮａＨＣＯ
３溶液を活性化されたセファロース４Ｂに混合し、４℃
で一晩攪拌して結合させた。ゲルをブッフナー濾過器上
で１５０ｍｌの０．１ＭＮａＨＣＯ３溶液および７５ｍ
ｌの０．９％ＮａＣｌ溶液で良く洗浄する。次にゲルを
３ｍｌの８Ｍ尿素溶液中に懸濁し、ブッフナー濾過器上
で１５０ｍｌの８Ｍ尿素溶液および１５０ｍｌの０．９
％ＮａＣｌ溶液で良く洗浄する。こうして得られた抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１抗体をゲル１ｍｌ当たり２．８ｍｌ含有す
るアフィニテイーゲルをカラム（０．７×７．８ｃｍ、
ベッド容量３ｍｌ）に詰めた。 （２） セファロース４Ｂに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を結
合させたアフィニテイークロマトグラフィーによるＳＣ
Ｃ Ａｇ類の精製 子宮頸部扁平上皮癌肝転移組織３２０ｇを細切、ホモゲ
ナイズして得た蛋白抽出液に硫安を加え、５０％飽和と
し、塩析する。遠心分離して回収した上清にさらに硫安
を加え、９０％飽和とし、塩析する。遠心分離して沈殿
を回収する。この沈殿をリン酸緩衝液に対して透析し、
遠心分離して得た上清を濾過し、この分画を硫安分画と
して得た。硫安分画を１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水溶液
（ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−１００
の５×９０ｃｍのカラムによりゲル濾過し、溶出した第
２番目のピークを採取し、該分画をセファロース４Ｂに
抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を結合させたアフィニテイークロ
マトグラフィーに１１ｍｌ／ｈｒの流速でかけ、リン酸
緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ液、ｐＨ７．４）の４０ｍｌ／
ｈｒの流速で洗浄し、次に９ｍｌの１ＭＮａＣｌ溶液で
洗浄し、２８０ｎｍの吸光度を測定し０．０１以下にな
ったら、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）
を４０ｍｌ／ｈｒの流速で流し抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体と
特異的に結合した成分を解離させ、回収した（図５、矢
印で示す）。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）
にて透析したのち、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．３）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースの１×３
０ｃｍのカラムのイオン交換クロマトグラフィーにか
け、０〜０．２Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度勾配溶出し、
さらにこうして精製された蛋白質は等電点電気泳動（Ｉ
ＥＦ）法により１４の成分に分けられ、それぞれＳＣＣ
Ａｇ１、ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ
Ａｇ４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａ
ｇ７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ
１０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ
Ａｇ１３、及びＳＣＣ Ａｇ１４とされた。
【００１７】（３） ＳＣＣ Ａｇ類の等電点電気泳動
（ＩＥＦ） 上記工程（２）で子宮頸部癌組織から純化され、ＤＥＡ
Ｅ−セファロースのイオン交換クロマトグラフイー精製
された蛋白質は、等電点電気泳動にかけられた。ゲル
は、５％ポリアクリルアミドゲルおよび６．３％キャリ
アアンフォライトｐＨ３．５〜９．５を用いた。電極溶
液は陽極：０．０２５Ｍアスパラギン酸、０．０２５Ｍ
グルタミン酸、陰極：２．０Ｍエチレンジアミン、０．
０２５Ｍアルギニン、０．０２５Ｍリジンを用いた。泳
動条件は、１０Ｗで１時間泳動、更に２０００Ｖで１時
間泳動した。この時、等電点３．５０〜９．３０の１１
種の蛋白質の混合物をマーカとして同時に泳動した。泳
動後、マーカの部分のゲルをナイフで切り取り、３５％
エタノール、１０％トリクロロ酢酸、３．５％５−スル
ホサリチル酸中で５分間インキュベートし、ゲル中から
キャリアアンフォライトを除き、次に３５％エタノー
ル、１０％酢酸中で５分間インキュベートし、ゲルから
トリクロロ酢酸と５−スルホサリチル酸を除いた。次に
０．５％コマジーブルーＲ２５０（蛋白質を染色す
る）、３５％エタノール、１０％酢酸中で５分間染色
し、次に３５％エタノール、１０％酢酸中で１０分間イ
ンキュベートし、蛋白質のバンド以外の染色された部分
の脱色をした。この脱色操作を蛋白質のバンド以外の部
分が透明になるまで行ったのち、１％グリセロール、３
５％エタノール、１０％酢酸中で５分間インキュベート
した。最後にゲルをガラス板上に置き、室温で一晩放置
し、乾燥させた。サンプルを泳動した部分のゲルは、１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） 上、下にガラス板を置き、その上に約３００ｇの重りを
のせて、４℃一晩放置した。これにより垂直方向にゲル
からニトロセルロース膜上にサンプルの蛋白質バンドが
転写された。転写されたニトロセルロース膜を、５００
倍に希釈した抗ＳＣＣ Ａｇ１血清（家兎の抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体含有抗血清）中で１時間インキュベートし、
次にＨＲＰＯ標識化抗家兎ＩｇＧ抗体中で２時間インキ
ュベートし、更に１０．５ｍｇ／ｍｌ４−クロロ−１−
ナフトール（ＨＲＰＯの基質）、０．０１５％Ｈ
２Ｏ２、１６．７％メタノールを含む２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．３）、０．５ＭＮａＣｌ溶液中で約
１０分間反応させた。抗血清を介してニトロセルロース
膜上に転写されたＳＣＣ Ａｇ類と結合したＨＲＰＯ標
識化抗家兎ＩｇＧ抗体のバンドが十分現れたところで、
ニトロセルロース膜を精製水で洗浄した。ＳＣＣ Ａｇ
類のバンドは１４種類、すなわちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣ
Ｃ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ
Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ
Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ
Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及び
ＳＣＣ Ａｇ１４が確認された（図１２）。前期マーカ
の各泳動距離を横軸に、各マーカの等電点を縦軸にして
プロットし、ｐＨの回帰曲線を作製した。この回帰曲線
とニトロセルロース膜上に転写され、抗血清を用いて検
出された各ＳＣＣ Ａｇ類のバンドの泳動距離から１４
種類のＳＣＣ Ａｇ１〜１４の等電点を求めると、ＳＣ
Ｃ Ａｇ１：６．６２、ＳＣＣ Ａｇ２：６．５５、Ｓ
ＣＣ Ａｇ３：６．４５、ＳＣＣ Ａｇ４：６．４５、
ＳＣＣ Ａｇ５：６．２３、ＳＣＣ Ａｇ６：６．１
５、ＳＣＣ Ａｇ７：５．９０、ＳＣＣ Ａｇ８：５．
８２、ＳＣＣ Ａｇ９：５．７０、ＳＣＣ Ａｇ１０：
５．６４、ＳＣＣ Ａｇ１１：５．６０、ＳＣＣ Ａｇ
１２：５．５５、ＳＣＣ Ａｇ１３：５．５０、及びＳ
ＣＣ Ａｇ１４：５．４４であった（図１３）。各ＳＣ
Ｃ Ａｇ類はそのゲルから分離されて得られる。 （４） ＳＣＣ Ａｇ類のグリコシダーゼ処理 等電点６．５５を有するＳＣＣ Ａｇ２を例にとりシア
リダーゼで処理し、ＰＡＧＥでの移動度に変化があるか
ないかを調べた。蛋白質結合糖で、その等電点に関与が
あると考えられるのはシアル酸であるから、シアリダー
ゼで処理し、ＰＡＧＥでの移動度に変化があるかないか
によりＳＣＣ Ａｇ２に蛋白質結合糖シアル酸が存在す
るか否かをみた。シアリダーゼ処理は、蛋白質からシア
ル酸が存在すればそのすべてのシアル酸を遊離させる条
件を用いて行った。ＳＣＣ Ａｇ２：シアリダーゼ＝１
０：１とし、３７℃で４時間処理した。シアリダーゼが
働いていることを確認するため、シアル酸を５〜１０分
子含むチロキシン結合グロブリンをコントロールとして
用いて同様にシアリダーゼ処理を行った。次にシアリダ
ーゼ処理前後のサンプルの比較をＰＡＧＥで行った。ゲ
ルは、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた。泳動
条件は、濃縮ゲル（２．５％ポリアクリルアミド、８０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．７））１５ｍＡで、分
離ゲル（７．５％ポリアクリルアミド、３７５ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９））２０ｍＡで行った。泳動
後の染色及び脱色はＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様にして行っ
た。結果、ＳＣＣ Ａｇ２ではシアリダーゼ処理の前後
で泳動距離に変化はなかった。コントロールとして用い
たチロキシン結合グロブリンでは、シアリダーゼ処理の
後、当電点が高くなり、泳動距離が短くなっておりシア
ル酸が遊離していることが認められる（図１４）。ＳＣ
Ｃ Ａｇ２の糖含有量は、０．３％以下であると認めら
れる。同様な結果は、他のＳＣＣ Ａｇ類についても得
られた。
（ＩＥＦ） 上記工程（２）で子宮頸部癌組織から純化され、ＤＥＡ
Ｅ−セファロースのイオン交換クロマトグラフイー精製
された蛋白質は、等電点電気泳動にかけられた。ゲル
は、５％ポリアクリルアミドゲルおよび６．３％キャリ
アアンフォライトｐＨ３．５〜９．５を用いた。電極溶
液は陽極：０．０２５Ｍアスパラギン酸、０．０２５Ｍ
グルタミン酸、陰極：２．０Ｍエチレンジアミン、０．
０２５Ｍアルギニン、０．０２５Ｍリジンを用いた。泳
動条件は、１０Ｗで１時間泳動、更に２０００Ｖで１時
間泳動した。この時、等電点３．５０〜９．３０の１１
種の蛋白質の混合物をマーカとして同時に泳動した。泳
動後、マーカの部分のゲルをナイフで切り取り、３５％
エタノール、１０％トリクロロ酢酸、３．５％５−スル
ホサリチル酸中で５分間インキュベートし、ゲル中から
キャリアアンフォライトを除き、次に３５％エタノー
ル、１０％酢酸中で５分間インキュベートし、ゲルから
トリクロロ酢酸と５−スルホサリチル酸を除いた。次に
０．５％コマジーブルーＲ２５０（蛋白質を染色す
る）、３５％エタノール、１０％酢酸中で５分間染色
し、次に３５％エタノール、１０％酢酸中で１０分間イ
ンキュベートし、蛋白質のバンド以外の染色された部分
の脱色をした。この脱色操作を蛋白質のバンド以外の部
分が透明になるまで行ったのち、１％グリセロール、３
５％エタノール、１０％酢酸中で５分間インキュベート
した。最後にゲルをガラス板上に置き、室温で一晩放置
し、乾燥させた。サンプルを泳動した部分のゲルは、１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） 上、下にガラス板を置き、その上に約３００ｇの重りを
のせて、４℃一晩放置した。これにより垂直方向にゲル
からニトロセルロース膜上にサンプルの蛋白質バンドが
転写された。転写されたニトロセルロース膜を、５００
倍に希釈した抗ＳＣＣ Ａｇ１血清（家兎の抗ＳＣＣ
Ａｇ１抗体含有抗血清）中で１時間インキュベートし、
次にＨＲＰＯ標識化抗家兎ＩｇＧ抗体中で２時間インキ
ュベートし、更に１０．５ｍｇ／ｍｌ４−クロロ−１−
ナフトール（ＨＲＰＯの基質）、０．０１５％Ｈ
２Ｏ２、１６．７％メタノールを含む２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．３）、０．５ＭＮａＣｌ溶液中で約
１０分間反応させた。抗血清を介してニトロセルロース
膜上に転写されたＳＣＣ Ａｇ類と結合したＨＲＰＯ標
識化抗家兎ＩｇＧ抗体のバンドが十分現れたところで、
ニトロセルロース膜を精製水で洗浄した。ＳＣＣ Ａｇ
類のバンドは１４種類、すなわちＳＣＣ Ａｇ１、ＳＣ
Ｃ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣ Ａｇ４、ＳＣＣ
Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ７、ＳＣＣ
Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１０、ＳＣＣ
Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａｇ１３、及び
ＳＣＣ Ａｇ１４が確認された（図１２）。前期マーカ
の各泳動距離を横軸に、各マーカの等電点を縦軸にして
プロットし、ｐＨの回帰曲線を作製した。この回帰曲線
とニトロセルロース膜上に転写され、抗血清を用いて検
出された各ＳＣＣ Ａｇ類のバンドの泳動距離から１４
種類のＳＣＣ Ａｇ１〜１４の等電点を求めると、ＳＣ
Ｃ Ａｇ１：６．６２、ＳＣＣ Ａｇ２：６．５５、Ｓ
ＣＣ Ａｇ３：６．４５、ＳＣＣ Ａｇ４：６．４５、
ＳＣＣ Ａｇ５：６．２３、ＳＣＣ Ａｇ６：６．１
５、ＳＣＣ Ａｇ７：５．９０、ＳＣＣ Ａｇ８：５．
８２、ＳＣＣ Ａｇ９：５．７０、ＳＣＣ Ａｇ１０：
５．６４、ＳＣＣ Ａｇ１１：５．６０、ＳＣＣ Ａｇ
１２：５．５５、ＳＣＣ Ａｇ１３：５．５０、及びＳ
ＣＣ Ａｇ１４：５．４４であった（図１３）。各ＳＣ
Ｃ Ａｇ類はそのゲルから分離されて得られる。 （４） ＳＣＣ Ａｇ類のグリコシダーゼ処理 等電点６．５５を有するＳＣＣ Ａｇ２を例にとりシア
リダーゼで処理し、ＰＡＧＥでの移動度に変化があるか
ないかを調べた。蛋白質結合糖で、その等電点に関与が
あると考えられるのはシアル酸であるから、シアリダー
ゼで処理し、ＰＡＧＥでの移動度に変化があるかないか
によりＳＣＣ Ａｇ２に蛋白質結合糖シアル酸が存在す
るか否かをみた。シアリダーゼ処理は、蛋白質からシア
ル酸が存在すればそのすべてのシアル酸を遊離させる条
件を用いて行った。ＳＣＣ Ａｇ２：シアリダーゼ＝１
０：１とし、３７℃で４時間処理した。シアリダーゼが
働いていることを確認するため、シアル酸を５〜１０分
子含むチロキシン結合グロブリンをコントロールとして
用いて同様にシアリダーゼ処理を行った。次にシアリダ
ーゼ処理前後のサンプルの比較をＰＡＧＥで行った。ゲ
ルは、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた。泳動
条件は、濃縮ゲル（２．５％ポリアクリルアミド、８０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．７））１５ｍＡで、分
離ゲル（７．５％ポリアクリルアミド、３７５ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９））２０ｍＡで行った。泳動
後の染色及び脱色はＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様にして行っ
た。結果、ＳＣＣ Ａｇ２ではシアリダーゼ処理の前後
で泳動距離に変化はなかった。コントロールとして用い
たチロキシン結合グロブリンでは、シアリダーゼ処理の
後、当電点が高くなり、泳動距離が短くなっておりシア
ル酸が遊離していることが認められる（図１４）。ＳＣ
Ｃ Ａｇ２の糖含有量は、０．３％以下であると認めら
れる。同様な結果は、他のＳＣＣ Ａｇ類についても得
られた。
【００１８】実施例３． 抗血清の作製 実施例１の工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１溶液
０．３ｍｌに生理食塩水１９．６ｍｌを加えた後、フロ
イント・コンプリートアジュバント２０ｍｌと共にエマ
ルジョンを作製した。このエマルジョン４ｍｌを家兎に
皮内注射した。５回免疫後、１０日目に全採血した。得
られた血清を、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗血清とした。このも
のは実施例１の工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１に
対して特異的に反応する抗血清であった。
０．３ｍｌに生理食塩水１９．６ｍｌを加えた後、フロ
イント・コンプリートアジュバント２０ｍｌと共にエマ
ルジョンを作製した。このエマルジョン４ｍｌを家兎に
皮内注射した。５回免疫後、１０日目に全採血した。得
られた血清を、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗血清とした。このも
のは実施例１の工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１に
対して特異的に反応する抗血清であった。
【００１９】実施例４． 扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ
Ａｇ１に対するモノクローナル抗体の作製 実施例１の工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１溶液
０．２ｍｌ（５０μｇ）にフロイント・コンプリートア
ジュバント０．２ｍｌを加えた後、エマルジョンを調製
した。このエマルジョン０．４ｍｌをＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの腹腔に投与した。一ヵ月後ＳＣＣ Ａｇ１溶液０．
２ｍｌ（５０μｇ含有）を尾静脈より静注した。３日後
屠殺し、脾臓を摘出し、得られた脾細胞１×１０８個と
マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１株）２×１０７個とを
ＰＥＧ５０％存在下で細胞融合を行った。９６ウェルプ
レート１０枚に各０．１５ｍｌの融合細胞を播き、ＨＡ
Ｔ培地で２週間培養した後、培養上清中の抗体の検定を
行った。抗体陽性ウェルより限界希釈法によりクローニ
ングを行い、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体産生細胞（ハイブリ
ドーマ）株を選別した。得られたモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ細胞株１×１０７個を、予めプリスタ
ンを投与してあるＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に接種し、
２週間後に腹水を採取し、抗ＳＣＣ Ａｇ１モノクロー
ナル抗体を得た。こうして得られたモノクローナル抗体
はＳＣＣ Ａｇ類に認められる複数のエピトープに対し
てそれぞれ共通した認識活性及び異なった認識活性を有
しており、例えば等電点６．６２のＳＣＣ Ａｇ１には
Ａ〜Ｇのエピトープの存在が、等電点６．５５〜６．０
のＳＣＣ Ａｇ類混合物で主な成分が等電点６．５５の
ものにはＡ〜１のエピトープの存在が、そして等電点
６．２〜５．４４のＳＣＣＡｇ類混合物で主な成分が等
電点５．６０のものにはＡ〜Ｊのエピトープの存在がモ
ノクローナル抗体を用いて推定され、また例えばモノク
ローナル抗体Ｆ１Ｈ３、Ｆ１Ｈ４及びＦ１Ｈ９はエピト
ープＡを認識し、モノクローナル抗体Ｆ２Ｈ６及びＦ２
Ｈ７はエピトープＥを認識し、モノクローナル抗体Ｆ２
Ｈ８、Ｆ４Ｈ７、Ｆ４Ｈ２１及びＦ４Ｈ３１ はエピト
ープＦを認識し、モノクローナル抗体Ｆ３Ｈ１７はエピ
トープＪを認識することが認められた。
Ａｇ１に対するモノクローナル抗体の作製 実施例１の工程（１）で得られたＳＣＣ Ａｇ１溶液
０．２ｍｌ（５０μｇ）にフロイント・コンプリートア
ジュバント０．２ｍｌを加えた後、エマルジョンを調製
した。このエマルジョン０．４ｍｌをＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの腹腔に投与した。一ヵ月後ＳＣＣ Ａｇ１溶液０．
２ｍｌ（５０μｇ含有）を尾静脈より静注した。３日後
屠殺し、脾臓を摘出し、得られた脾細胞１×１０８個と
マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１株）２×１０７個とを
ＰＥＧ５０％存在下で細胞融合を行った。９６ウェルプ
レート１０枚に各０．１５ｍｌの融合細胞を播き、ＨＡ
Ｔ培地で２週間培養した後、培養上清中の抗体の検定を
行った。抗体陽性ウェルより限界希釈法によりクローニ
ングを行い、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体産生細胞（ハイブリ
ドーマ）株を選別した。得られたモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ細胞株１×１０７個を、予めプリスタ
ンを投与してあるＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に接種し、
２週間後に腹水を採取し、抗ＳＣＣ Ａｇ１モノクロー
ナル抗体を得た。こうして得られたモノクローナル抗体
はＳＣＣ Ａｇ類に認められる複数のエピトープに対し
てそれぞれ共通した認識活性及び異なった認識活性を有
しており、例えば等電点６．６２のＳＣＣ Ａｇ１には
Ａ〜Ｇのエピトープの存在が、等電点６．５５〜６．０
のＳＣＣ Ａｇ類混合物で主な成分が等電点６．５５の
ものにはＡ〜１のエピトープの存在が、そして等電点
６．２〜５．４４のＳＣＣＡｇ類混合物で主な成分が等
電点５．６０のものにはＡ〜Ｊのエピトープの存在がモ
ノクローナル抗体を用いて推定され、また例えばモノク
ローナル抗体Ｆ１Ｈ３、Ｆ１Ｈ４及びＦ１Ｈ９はエピト
ープＡを認識し、モノクローナル抗体Ｆ２Ｈ６及びＦ２
Ｈ７はエピトープＥを認識し、モノクローナル抗体Ｆ２
Ｈ８、Ｆ４Ｈ７、Ｆ４Ｈ２１及びＦ４Ｈ３１ はエピト
ープＦを認識し、モノクローナル抗体Ｆ３Ｈ１７はエピ
トープＪを認識することが認められた。
【００２０】実施例５．抗−家兎γ−グロブリン抗体
（第２抗体）の作製 家兎γ−グロブリン１ｍｇを生理食塩水２ｍｌに溶か
し、フロイント．コンプリートアジュバント２ｍｌを加
え、エマルジョンを作製した。このエマルジョンを２週
間間隔でヤギに５回注射した。最後の注射の２週間後
に、全採血した。得られた血清を、抗−家兎γ−グロブ
リン（ＩｇＧ）血清とした。
（第２抗体）の作製 家兎γ−グロブリン１ｍｇを生理食塩水２ｍｌに溶か
し、フロイント．コンプリートアジュバント２ｍｌを加
え、エマルジョンを作製した。このエマルジョンを２週
間間隔でヤギに５回注射した。最後の注射の２週間後
に、全採血した。得られた血清を、抗−家兎γ−グロブ
リン（ＩｇＧ）血清とした。
【００２１】実施例６．ＳＣＣ Ａｇ１の１２５Ｉによ
る標識 Ｎａ１２５Ｉ ２０μｌ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）２５μｌに、実施例１の工程（１）で得られた
ＳＣＣ Ａｇ１溶液２０μｌ（０．５μｇ／ｍｌ）を加
え、さらにクロラミンＴ（１ｍｇ／ｍｌ）２５μｌを加
えた。約１５秒攪拌の後、約１０秒間静置し、メタ重亜
硫酸ナトリウム（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加えて反
応を停止した。これに沃化カリウム（５０ｍｇ／ｍｌ）
２５μｌ、ブルーデキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ）２５
μｌ、０．５％ウシ血清アルブミン液５０μｌを加え、
セファデックスＧ−２５によるゲル濾過で遊離の１２５
Ｉを除去し、１２５Ｉ標識ＳＣＣ Ａｇ１を得た。
る標識 Ｎａ１２５Ｉ ２０μｌ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）２５μｌに、実施例１の工程（１）で得られた
ＳＣＣ Ａｇ１溶液２０μｌ（０．５μｇ／ｍｌ）を加
え、さらにクロラミンＴ（１ｍｇ／ｍｌ）２５μｌを加
えた。約１５秒攪拌の後、約１０秒間静置し、メタ重亜
硫酸ナトリウム（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加えて反
応を停止した。これに沃化カリウム（５０ｍｇ／ｍｌ）
２５μｌ、ブルーデキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ）２５
μｌ、０．５％ウシ血清アルブミン液５０μｌを加え、
セファデックスＧ−２５によるゲル濾過で遊離の１２５
Ｉを除去し、１２５Ｉ標識ＳＣＣ Ａｇ１を得た。
【００２２】実施例７．ＳＣＣ Ａｇ１のラジオイムノ
アッセイ（二抗体法） ＳＣＣ Ａｇ１標準液１００μｌと血清検体１００μｌ
はそれぞれ別々の試験管に入れる。試験管に１２５Ｉ標
識ＳＣＣ Ａｇ１液２００μｌを加える。さらに抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体液１００μｌを加え、混和し、１０〜３
０℃で２０〜３０時間インキュベートする。インキュベ
ション終了後、試験管に抗−家兎γ−グロブリン抗体
（第２抗体）液０．５ｍｌを加え、サンプルミキサーで
５〜１０秒間攪拌し、反応液を十分に混和する。１０〜
３０℃で１０分間インキュベートした後、３，０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離する。遠心分離後、上清をデカ
ンテーションにて除去し、沈殿物の放射能量を測定す
る。標準ＳＣＣ Ａｇ１液の測定により得られた値より
作成された標準曲線（図６）より、検体中のＳＣＣ Ａ
ｇ１の量を読み取る。
アッセイ（二抗体法） ＳＣＣ Ａｇ１標準液１００μｌと血清検体１００μｌ
はそれぞれ別々の試験管に入れる。試験管に１２５Ｉ標
識ＳＣＣ Ａｇ１液２００μｌを加える。さらに抗ＳＣ
Ｃ Ａｇ１抗体液１００μｌを加え、混和し、１０〜３
０℃で２０〜３０時間インキュベートする。インキュベ
ション終了後、試験管に抗−家兎γ−グロブリン抗体
（第２抗体）液０．５ｍｌを加え、サンプルミキサーで
５〜１０秒間攪拌し、反応液を十分に混和する。１０〜
３０℃で１０分間インキュベートした後、３，０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離する。遠心分離後、上清をデカ
ンテーションにて除去し、沈殿物の放射能量を測定す
る。標準ＳＣＣ Ａｇ１液の測定により得られた値より
作成された標準曲線（図６）より、検体中のＳＣＣ Ａ
ｇ１の量を読み取る。
【００２３】実施例８．抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体のＨＲＰ
による標識 ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇ
を０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．１）１ｍ
ｌに溶解した後、１％１−フルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン（ＦＤＮＢ）のエタノール溶液０．１ｍｌを加
え、室温で１時間反応させた。さらに０．０６Ｍ過ヨウ
素酸ナトリウム液１ｍｌを加え、室温で３０分間反応さ
せた後、０．１６Ｍエチレングリコール１ｍｌを加え、
室温で１時間反応させた。次に、０．０１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対して４℃で一夜透析した
のち、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体５ｍｇを加え、室温で２時
間反応させた。さらに水素化硼素ナトリウム５ｍｇを加
え、４℃で一夜放置し、０．０１Ｍリン酸塩緩衝塩化ナ
トリウム液に対して４℃で一夜透析したのち、セファデ
ックスＧ−２００によるゲル濾過をして、ＨＲＰ標識抗
ＳＣＣ Ａｇ１抗体を得た。
による標識 ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）５ｍｇ
を０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．１）１ｍ
ｌに溶解した後、１％１−フルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン（ＦＤＮＢ）のエタノール溶液０．１ｍｌを加
え、室温で１時間反応させた。さらに０．０６Ｍ過ヨウ
素酸ナトリウム液１ｍｌを加え、室温で３０分間反応さ
せた後、０．１６Ｍエチレングリコール１ｍｌを加え、
室温で１時間反応させた。次に、０．０１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対して４℃で一夜透析した
のち、抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体５ｍｇを加え、室温で２時
間反応させた。さらに水素化硼素ナトリウム５ｍｇを加
え、４℃で一夜放置し、０．０１Ｍリン酸塩緩衝塩化ナ
トリウム液に対して４℃で一夜透析したのち、セファデ
ックスＧ−２００によるゲル濾過をして、ＨＲＰ標識抗
ＳＣＣ Ａｇ１抗体を得た。
【００２４】実施例９．ＳＣＣ Ａｇ１のエンザイムイ
ムノアッセイ（サンドイッチ法） ＳＣＣ Ａｇ１標準液１００μｌと血清検体１００μｌ
はそれぞれ別々の試験管に入れる。試験管に０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液（０．５％ＢＳＡを含む）１００μ１を入れ
る。この試験管に抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体結合ビーズ１個
を入れ、室温にて３時間インキュベート後、反応液を除
去する。ビーズを生理食塩水にて洗浄後、ＨＲＰ標識抗
ＳＣＣ Ａｇ１抗体液２００μｌを加え、室温にて３時
間インキュベートする。反応液を除去し、ビーズを生理
食塩水にて洗浄後、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩
液３００μｌを加え、室温にて１０分間インキュベート
する。インキュベション終了後、１Ｎ硫酸１ｍｌを加え
酵素反応を停止させ、蒸留水をブランクとし、波長４９
２ｎｍで吸光度を測定する。標準ＳＣＣ Ａｇ１液の測
定により得られた値より作成された標準曲線（図７）よ
り、検体中のＳＣＣ Ａｇ１の量を読み取る。
ムノアッセイ（サンドイッチ法） ＳＣＣ Ａｇ１標準液１００μｌと血清検体１００μｌ
はそれぞれ別々の試験管に入れる。試験管に０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液（０．５％ＢＳＡを含む）１００μ１を入れ
る。この試験管に抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体結合ビーズ１個
を入れ、室温にて３時間インキュベート後、反応液を除
去する。ビーズを生理食塩水にて洗浄後、ＨＲＰ標識抗
ＳＣＣ Ａｇ１抗体液２００μｌを加え、室温にて３時
間インキュベートする。反応液を除去し、ビーズを生理
食塩水にて洗浄後、オルトフェニレンジアミン二塩酸塩
液３００μｌを加え、室温にて１０分間インキュベート
する。インキュベション終了後、１Ｎ硫酸１ｍｌを加え
酵素反応を停止させ、蒸留水をブランクとし、波長４９
２ｎｍで吸光度を測定する。標準ＳＣＣ Ａｇ１液の測
定により得られた値より作成された標準曲線（図７）よ
り、検体中のＳＣＣ Ａｇ１の量を読み取る。
【００２５】実施例１０．抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体の
１２５Ｉによる標識 シリコン処理した試験管に、１ｍＣｉのＮａ１２５Ｉ
２０μｌ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５μ
ｌを加える。抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体液５０μｌを加え、
さらにクロラミンＴ（３ｍｇ／ｍｌ）２５μｌを加え
た。約２０〜３０秒間良く振って反応させた後、メタ重
亜硫酸ナトリウム（３ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加えて
反応を停止した。これに沃化カリウム（５０ｍｇ／ｍ
ｌ）２５μｌ、ウシ血清アルブミン（５％）１００μｌ
を加え、セファデックスＧ−２５によるゲル濾過で遊離
の１２５Ｉを除去し、１２５Ｉ標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体を得た。
１２５Ｉによる標識 シリコン処理した試験管に、１ｍＣｉのＮａ１２５Ｉ
２０μｌ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５μ
ｌを加える。抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体液５０μｌを加え、
さらにクロラミンＴ（３ｍｇ／ｍｌ）２５μｌを加え
た。約２０〜３０秒間良く振って反応させた後、メタ重
亜硫酸ナトリウム（３ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加えて
反応を停止した。これに沃化カリウム（５０ｍｇ／ｍ
ｌ）２５μｌ、ウシ血清アルブミン（５％）１００μｌ
を加え、セファデックスＧ−２５によるゲル濾過で遊離
の１２５Ｉを除去し、１２５Ｉ標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体を得た。
【００２６】実施例１１．ＳＣＣ Ａｇ１のラジオイム
ノアッセイ（サンドイッチ法） ＳＣＣ Ａｇ１標準液１００μｌと血清検体１００μｌ
はそれぞれ別々の試験管に入れる。試験管に０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液（０．５％ＢＳＡを含む）１００μｌを入れ
る。この試験管に抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体結合ビーズ１個
を入れ、室温にて３時間インキュベート後、反応液を除
去する。ビーズを生理食塩水にて３回洗浄後、１２５Ｉ
標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体液２００μｌを加え、室温に
て３時間インキュベートする。反応液を除去し、ビーズ
を生理食塩水にて３回洗浄後、ビーズをカウント用試験
管に移して放射能量を測定する。標準ＳＣＣ Ａｇ１液
の測定により得られた値より作成された標準曲線（図
８）より、検体中のＳＣＣ Ａｇ１の量を読み取る。ま
た、抗ＳＣＣ Ａｇ１モノクローナル抗体を用いた測定
キットの場合、そのアッセイ感度はより優れたものであ
り、例えば０．０７ｎｇ／ｍｌ〜０．１２ｎｇ／ｍｌの
範囲にあった。
ノアッセイ（サンドイッチ法） ＳＣＣ Ａｇ１標準液１００μｌと血清検体１００μｌ
はそれぞれ別々の試験管に入れる。試験管に０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液（０．５％ＢＳＡを含む）１００μｌを入れ
る。この試験管に抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体結合ビーズ１個
を入れ、室温にて３時間インキュベート後、反応液を除
去する。ビーズを生理食塩水にて３回洗浄後、１２５Ｉ
標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体液２００μｌを加え、室温に
て３時間インキュベートする。反応液を除去し、ビーズ
を生理食塩水にて３回洗浄後、ビーズをカウント用試験
管に移して放射能量を測定する。標準ＳＣＣ Ａｇ１液
の測定により得られた値より作成された標準曲線（図
８）より、検体中のＳＣＣ Ａｇ１の量を読み取る。ま
た、抗ＳＣＣ Ａｇ１モノクローナル抗体を用いた測定
キットの場合、そのアッセイ感度はより優れたものであ
り、例えば０．０７ｎｇ／ｍｌ〜０．１２ｎｇ／ｍｌの
範囲にあった。
【００２７】実施例１２．組織中のＳＣＣ Ａｇ１の測
定（直接法） スライドガラス上に固定された標本に、ＨＲＰ標識抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１家兎抗体液を１滴（約２０μｌ）滴下し、
ガラスキャピラリーを使って十分に攪拌した。室温にて
２０分間反応させた後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ液）
で洗浄し、さらに５分間づつ液を換えて、３回ＰＢＳ液
中に浸し、未反応のＨＲＰ標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体を除
去した。対照試験としてＨＲＰ標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体のかわりにＨＲＰ標識正常家兎血清を用いて同様の操
作を行い非特異的な反応の有無を確認した。抗原抗体反
応を終えたスライドガラスを３，３′−ジアミノベンチ
ジン・過酸化水素発色液（ＤＡＢ・Ｈ２Ｏ２溶液）中に
浸し、室温にて１０分間反応させた後、４℃に冷却した
ＰＢＳ液中に移して反応を停止させＰＢＳ液で数回洗浄
した。洗浄したスライドガラスをエタノール系列（７０
％〜１００％）で脱水し、キシロールにて透徹した後、
封入剤（カナダバルサム）にて封入処理し、光学顕微鏡
にて検鏡した。
定（直接法） スライドガラス上に固定された標本に、ＨＲＰ標識抗Ｓ
ＣＣ Ａｇ１家兎抗体液を１滴（約２０μｌ）滴下し、
ガラスキャピラリーを使って十分に攪拌した。室温にて
２０分間反応させた後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ液）
で洗浄し、さらに５分間づつ液を換えて、３回ＰＢＳ液
中に浸し、未反応のＨＲＰ標識抗ＳＣＣＡｇ１抗体を除
去した。対照試験としてＨＲＰ標識抗ＳＣＣ Ａｇ１抗
体のかわりにＨＲＰ標識正常家兎血清を用いて同様の操
作を行い非特異的な反応の有無を確認した。抗原抗体反
応を終えたスライドガラスを３，３′−ジアミノベンチ
ジン・過酸化水素発色液（ＤＡＢ・Ｈ２Ｏ２溶液）中に
浸し、室温にて１０分間反応させた後、４℃に冷却した
ＰＢＳ液中に移して反応を停止させＰＢＳ液で数回洗浄
した。洗浄したスライドガラスをエタノール系列（７０
％〜１００％）で脱水し、キシロールにて透徹した後、
封入剤（カナダバルサム）にて封入処理し、光学顕微鏡
にて検鏡した。
【００２８】実施例１３．組織中のＳＣＣ Ａｇ１の測
定（間接法） スライドガラス上に固定された標本に、抗ＳＣＣ Ａｇ
１家兎抗体液を１滴（約２０μｌ）滴下し、ガラスキャ
ピラリーを使って十分に攪拌した。室温にて２０分間反
応させた後、ＰＢＳ液で洗浄し、さらに５分間づつ３回
液を換えてＰＢＳ液中に浸し、未反応の抗ＳＣＣ Ａｇ
１抗体を除去した。余分なＰＢＳ液を拭い取りＨＲＰ標
識抗家兎ＩｇＧ山羊抗体液を１滴（約２０μｌ）滴下
し、ガラスキャピラリーを使って十分に攪拌し、室温に
て２０分間反応させた後、ＰＢＳ液で洗浄し、さらに５
分間づつ３回液を換えてＰＢＳ液中に浸し、未反応のＨ
ＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ山羊抗体を除去した。対照試験と
して抗ＳＣＣ Ａｇ１家兎抗体液のかわりに正常家兎血
清を用いて同様の操作を行い非特異的な反応の有無を確
認した。洗浄したスライドガラスをエタノール系列（７
０％〜１００％）で脱水し、キシロールにて透徹した
後、封入剤（カナダバルサム）にて封入処理し、光学顕
微鏡にて検鏡した。健常人及び種々の疾患患者における
血中のＳＣＣ Ａｇ１を測定した結果を図９に示した。
図９からも明らかなように子宮頸部の扁平上皮癌におい
て、ほとんどの検体が高値を示したのに対して、良性・
悪性を問わず他の疾患及び健常人においては血清ＳＣＣ
Ａｇ１は低値であった。
定（間接法） スライドガラス上に固定された標本に、抗ＳＣＣ Ａｇ
１家兎抗体液を１滴（約２０μｌ）滴下し、ガラスキャ
ピラリーを使って十分に攪拌した。室温にて２０分間反
応させた後、ＰＢＳ液で洗浄し、さらに５分間づつ３回
液を換えてＰＢＳ液中に浸し、未反応の抗ＳＣＣ Ａｇ
１抗体を除去した。余分なＰＢＳ液を拭い取りＨＲＰ標
識抗家兎ＩｇＧ山羊抗体液を１滴（約２０μｌ）滴下
し、ガラスキャピラリーを使って十分に攪拌し、室温に
て２０分間反応させた後、ＰＢＳ液で洗浄し、さらに５
分間づつ３回液を換えてＰＢＳ液中に浸し、未反応のＨ
ＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ山羊抗体を除去した。対照試験と
して抗ＳＣＣ Ａｇ１家兎抗体液のかわりに正常家兎血
清を用いて同様の操作を行い非特異的な反応の有無を確
認した。洗浄したスライドガラスをエタノール系列（７
０％〜１００％）で脱水し、キシロールにて透徹した
後、封入剤（カナダバルサム）にて封入処理し、光学顕
微鏡にて検鏡した。健常人及び種々の疾患患者における
血中のＳＣＣ Ａｇ１を測定した結果を図９に示した。
図９からも明らかなように子宮頸部の扁平上皮癌におい
て、ほとんどの検体が高値を示したのに対して、良性・
悪性を問わず他の疾患及び健常人においては血清ＳＣＣ
Ａｇ１は低値であった。
【図１】ＳＣＣ Ａｇ類の精製における硫安分画のセフ
ァデックスＧ−１００によるゲル濾過のチャートを示す
ものであり、第２番目のピーク中にＳＣＣ Ａｇ類が含
有されている。
ァデックスＧ−１００によるゲル濾過のチャートを示す
ものであり、第２番目のピーク中にＳＣＣ Ａｇ類が含
有されている。
【図２】ＳＣＣ Ａｇ１の精製におけるＤＥＡＥセファ
ロースイオン交換クロマトグラフィーのチャートを示す
ものであり、ＳＣＣ Ａｇ１はなだらかな第５番目のピ
ーク中に含有されている。
ロースイオン交換クロマトグラフィーのチャートを示す
ものであり、ＳＣＣ Ａｇ１はなだらかな第５番目のピ
ーク中に含有されている。
【図３】ＳＣＣ Ａｇ１の精製におけるＣＭ−セファロ
ースイオン交換クロマトグラフィーのチャートを示すも
のである。
ースイオン交換クロマトグラフィーのチャートを示すも
のである。
【図４】ＳＣＣ Ａｇ１の精製の最終段階におけるセフ
ァデックスＧ−１００によるゲル濾過のチャートを示す
ものである。
ァデックスＧ−１００によるゲル濾過のチャートを示す
ものである。
【図５】セファロース４Ｂに抗ＳＣＣ Ａｇ１抗体を結
合させたアフィニテイークロマトグラフィーのチャート
を示すものである。
合させたアフィニテイークロマトグラフィーのチャート
を示すものである。
【図６】ラジオイムノアッセイ（二抗体法）によるＳＣ
Ｃ Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。
Ｃ Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。
【図７】エンザイムイムノアッセイ（サンドイッチ法）
によるＳＣＣ Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。
によるＳＣＣ Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。
【図８】ラジオイムノアッセイ（サンドイッチ法）によ
るＳＣＣ Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。
るＳＣＣ Ａｇ１の測定に用いた標準曲線である。
【図９】ラジオイムノアッセイ（二抗体法）により測定
した種々の疾患患者における血中のＳＣＣ Ａｇ１値を
示している。
した種々の疾患患者における血中のＳＣＣ Ａｇ１値を
示している。
【図１０】ＳＣＣ Ａｇ１及び分子量マーカ（ウマチト
クロームＣの１、２、３、４および６量体）のＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果を示す。
クロームＣの１、２、３、４および６量体）のＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１】ＳＣＣ Ａｇ１の分子量測定に用いた回帰曲
線を示す。
線を示す。
【図１２】ＳＣＣ Ａｇ類及び等電点３．５０〜９．３
０の１１種の蛋白質のＩＥＦの結果を示す。
０の１１種の蛋白質のＩＥＦの結果を示す。
【図１３】ＳＣＣ Ａｇ類の等電点測定に用いたＩＥＦ
の回帰曲線を示す。
の回帰曲線を示す。
【図１４】ＳＣＣ Ａｇ２及びチロキシン結合グロブリ
ンのシアリダーゼ処理並びに未処理物のＰＡＧＥの結果
を示す。
ンのシアリダーゼ処理並びに未処理物のＰＡＧＥの結果
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ (72)発明者 池田 勲夫 千葉県松戸市高柳1588−37 (72)発明者 倉田 邦夫 千葉県松戸市常盤平双葉町９−１
Claims (2)
- 【請求項１】 ナトリウムドデシルサルフェート−ポリ
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定した
とき、約４５，０００の分子量を示し、等電点電気泳動
（ＩＥＦ）法で約６．６２の等電点を示し、かつ下記の
アミノ酸組成（精度：±１０％） 【表１】 を有し、免疫学的に抗原性を有する蛋白質であり、ヒト
扁平上皮癌組織あるいはその転移巣から抽出・単離せし
められた精製扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１または
該扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原性を
示しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約４５，０
００の分子量を示し、ＩＥＦで下記の等電点 【表２】 を有する蛋白質であり、ヒト扁平上皮癌組織あるいはそ
の転移巣から抽出・単離せしめられた精製扁平上皮癌関
連抗原ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣＡｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ
７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１
０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａ
ｇ１３、あるいはＳＣＣ Ａｇ１４。 - 【請求項２】 ナトリウムドデシルサルフェート−ポリ
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法で測定した
とき、約４５，０００の分子量を示し、等電点電気泳動
（ＩＥＦ）法で約６．６２の等電点を示し、かつ下記の
アミノ酸組成（精度：±１０％） 【表３】 を有し、免疫学的に抗原性を有する蛋白質であり、ヒト
扁平上皮癌組織あるいはその転移巣から抽出・単離せし
められた精製扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１または
該扁平上皮癌関連抗原ＳＣＣ Ａｇ１と共通の抗原性を
示しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約４５，０
００の分子量を示し、ＩＥＦで下記の等電点 【表４】 を有する蛋白質であり、ヒト扁平上皮癌組織あるいはそ
の転移巣から抽出・単離せしめられた精製扁平上皮癌関
連抗原ＳＣＣ Ａｇ２、ＳＣＣ Ａｇ３、ＳＣＣＡｇ
４、ＳＣＣ Ａｇ５、ＳＣＣ Ａｇ６、ＳＣＣ Ａｇ
７、ＳＣＣ Ａｇ８、ＳＣＣ Ａｇ９、ＳＣＣ Ａｇ１
０、ＳＣＣ Ａｇ１１、ＳＣＣ Ａｇ１２、ＳＣＣ Ａ
ｇ１３、あるいはＳＣＣ Ａｇ１４、またはその扁平上
皮癌関連抗原を標識剤で標識した標識抗原からなること
を特徴とする扁平上皮癌関連抗原の免疫学的測定用試
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3107693A JPH0699480B2 (ja) | 1993-01-08 | 1993-01-08 | 扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3107693A JPH0699480B2 (ja) | 1993-01-08 | 1993-01-08 | 扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22273085A Division JPS6284100A (ja) | 1985-10-08 | 1985-10-08 | 扁平上皮癌関連抗原に対する抗体及びその免疫学的利用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06100599A true JPH06100599A (ja) | 1994-04-12 |
| JPH0699480B2 JPH0699480B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=12321349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3107693A Expired - Lifetime JPH0699480B2 (ja) | 1993-01-08 | 1993-01-08 | 扁平上皮癌関連抗原及びその免疫学的利用方法 |
Country Status (1)
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-
1993
- 1993-01-08 JP JP3107693A patent/JPH0699480B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0699480B2 (ja) | 1994-12-07 |
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