JPS63296695A - モノクロナール抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロコラーゲンペプチド（Ｉ［ＩＷ）はコラーゲンのア
ミン末端プロペプチド（ＩＩＩ型）であり、このものは
プロコラーゲン（ＩＩＩ型）分子の分泌後に細胞外で分
解される。ヨーロッパ特許第４９４０号に記載されるよ
うに、体液中におけるこのプロコラーゲンペプチドの濃
度は放射線免疫学的測定法により測定されうる。このペ
プチドの血清濃度を知ることにより例えば肝臓の繊維形
成性障害の活性度について判定を下すことができる（　
Ｒｏｈｄｅ　Ｈ，氏他、ｒＥｕｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、
　Ｉｎｖ−ｅｓｔ、Ｊ　９．４５１〜４５９（１９７９
））。

しかしながら血清およびその他の体液中におけるプロコ
ラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）はこれまでに記載された
方法では正確で選択的に測定することができない。何故
なら、これらの方法で用いられるポリクローナル抗体は
、一部はプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）の分解生
成物である血清中の種々の抗原と比較的低くかつ異なる
親和性を以って反応するからである（Ｎｉｅｍｅｌａ。

０、氏他、ｒｃｌｉｎ、　ＣｈｉＩｌ、　ＡｃｔａＪ　
　１２４．３９〜４４（１９８２））。それにより血清
希釈曲線および他の体液の希釈曲線が純粋なプロコラー
ゲンペプチド（ＩＩＩ型）を用いて作成された標準曲線
に対して平行とならず、それゆえそれぞれの未知の検体
についてその抗゛原濃度を希釈曲線上５０％インターセ
プトにより測定するためには、抗原含量を数種の希釈度
で測定する必要がある。

ヨーロッパ特許出願第０．０８９．００８号記載の方法
を用いて、完全無傷のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ
型）およびその分解生成物ＣｏＱ　ｌに対しほぼ等しい
親和性を有する抗体を使用することにより前記技術的問
題が解決されうる。この方法により完全無傷のおよび分
解されたプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）が−緒に
測定されるが、しかしこのことにより診断結果が不正確
となる。

何故なら正常集団と患者集団とが大いに重なり合う可能
性があるからである。

今、驚くべきことに、体液中に存在するプロコラーゲン
ペプチド（ＩＩＩ型）の分解生成物と反応しないモノク
ローナル抗体が見出された。このモノクローナル抗体を
用いることにより、アミノ末端プロコラーゲンペプチド
（ＩＩＩ型）をその分解生成物を同時に捕捉することな
く免疫学的に測定することができ、そしてこの測定法は
血清希釈曲線、他の体液の希釈曲線および標準曲線が完
全に平行となる点で優れている。

それゆえ本発明は、 （１）完全無傷のプロコラーゲン（ＤＩりおよびｐＮ−
コラーゲン（Ｃ−末端プロペプチドが欠失したプロコラ
ーゲン）（ピーク４ａ）、完全無傷のアミノ末端プロコ
ラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）（ピーク５ａ）ならびに
ＣｏＱ　１およびアミノ末端プロコラーゲンペプチド（
Ｉｌｌ！りのＣｏＱ’　１と同じ分子量を有する分解生
成物（ピーク６ａ）に対する第３図に示される反応パタ
ーンを有するモノクローナル抗体、（２）ミエローマ細
胞系統の細胞と、予めプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ
型）を用いて免疫した動物のリンパ球とを融合させるこ
とにより形成され、前記（１）項記載の抗体を産生ずる
ものであるハイブリドーマ細胞系統、（３）前記（１）
項記載の抗体の製法、（４）前記（１）項記載の抗体を
用いるプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）の定量的な
免疫学的測定法、および （５）診断上受容されうる賦形剤と混合した、前記（１
）”Ｊ記載のモノクローナル抗体の有効量からなる、体
液中のプロコラーゲンペプチド（ＩＮり量を測定するた
めの診断用組成物、に関する。

以下に本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に説
明する。

モノクローナル抗体を調製するには、動物好ましくは例
えばマウス、ラット、ウサギ、モルモットのような誓歯
類を、ヨーロッパ特許第４９４０号記載の方法に従い単
離されたプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）を用いア
ジュバントの存在下に免疫することができる。マウス、
特にＳＪＬ系統のマウスが用いられるのが特に好ましい
。

例えば４〜８週間隔でブースター注射を反復することに
より免疫応答が強められる。放射線免疫学的結合アッセ
イで抗体濃度を測定することにより免疫化の成果を検査
する（ＲｏＴｉｍｐｌおよびり、　Ｒ３５ｔｅｌｉ、　
ｒｌｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅ
ｘＬ−ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘＪ　Ｈ，Ｆ
ｕｒｔｈｍａｙｒ編、Ｌ　１９９（１９８２））。リン
パ球をミエローマ細胞系統と融合させる数日前に動物を
アジュバントなしのプロコラーゲンペプチド＜ｍｕ＞で
処置する。動物のリンパ球を取得しそして同じく前記し
た動物種に由来しうるがしかし好ましくはマウスに由来
するミエローマ細胞系統、特に細胞系統Ｐ３Ｘ６３ＡＧ
８．６５３と融合させる。リンパ球を同じ種のミエロー
マ細胞系統と融合させるのが好ましい。融合および細胞
クローンの培養は当業者に知られた方法で行われ、細胞
培養上澄み液中の特異的な抗体濃度を免疫学的結合アッ
セイにより測定する。融合により生ずる細胞クローンか
ら免疫学的方法に使用するのに適するクローンを選択す
る。プロコラーゲンペプチド（ＩＩ［Ｗ）に対するＳＪ
Ｌ系統のマウスのリンパ球をマウスミエローマ細胞系統
Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３と融合させることにより調製
される細胞系統を用いて操作するのが特に好ましい。こ
の細胞系統はＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｍ　
ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕｌ’ｔｕｒｅｓ　
（ＥＣＡＣＣ）ＰＨＬＳ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＲｅｓ
ｅａｒｃｈ、　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓ
ｂｕｒｙ、　５Ｐ４０ＪＧ（英国内）、に寄託番号８７
０４２３０８の下に寄託されている。

本発明によるモノクローナル抗体はイムノグロブリン群
、好ましくはＩｇＧｓｌｇＡおよび１ｇＭクラスのタン
パク質に属する。ＩｇＧクラスの抗体特にＩｇＧ　２ｂ
サブクラスの抗体が用いられるのが特に好ましい。それ
ゆえ本発明による抗体は特に驚くべきものである、何故
なら、抗原に対するその親和性がポリクローナル抗体の
親和性より大きいからである。通常はこの反対のことが
見られる。血清中に存在する抗原をゲルが過クロマトグ
ラフィーによりそれらの分子量に従って分別しそしてク
ロマトグラフィーから得られる７ラクシヨンをラジオイ
ムノアッセイに用いると、細胞系統ＥＣＡＣＣ８７０４
２３０８から得られるモノクローナル抗体ＰＩ［［Ｐ２
９６によりモノクローナル抗体の性質が明らかとなる。

その際、ポリクローナル抗体を用いる分析では一緒に検
出され、分解生成物Ｃｏαｌの分子量を有する抗原７ラ
クシヨンは本発明によるモノクローナル抗体によっては
検出されないことが示される。Ｍ３図はモノクローナル
抗体が示すヒト血清のゲルが過クロマトグラフィーの溶
離プロフィルをポリクローナル抗体が示す溶離プロフィ
ルと比較して示す。ビーク４／４ａは完全無傷のプロコ
ラーゲン（ＩＩＩ型）およびｐＮ−コラーゲン（Ｉ［Ｉ
ｆｉ）に相当する（Ｒｏｈｄｅ　Ｈ，氏他、ｒＥｕｒ、
　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ１３５．１９７（１９８３
））。ビーク５１５ａは完全無傷のアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチド（ＩＩＩ型）（ｐｍｐ）に相当し、一方
ビーク６／６ａはＣｏ１２１ならびにアミノ末端プロコ
ラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）のＣｏＱ　１と同じ分子
量を有する分解生成物に相当する（ＲｏｈｄｅＨ０氏他
、ｒＥｕｒ、Ｊ、Ｂｉ−ｏｃｈｅｍ、Ｊ１３５＋　１９
７（１９８３））。

相当するフラクション中における物質の濃度はプロコラ
ーゲンペプチド（ＩＩＩ型）標準曲線を用いて測定され
うる。

本発明による抗体の調製にとって抗原の適当な入手原を
確保することが重要である。すでに述べたように、好ま
しくはヨーロッパ特許第４９４０号記載の方法に従い、
組織または病的な体液をコラ−ゲナーゼで分解し、反応
溶液からプロコラーゲンペプチドを分離しそしてクロマ
トグラフィー法および／または免疫吸着法の組み合わせ
により精製してヒトまたは動物の高度精製プロコラーゲ
ンペプチド（ＩＩＩ型）を単離する。

本発明によるモノクローナル抗体はラジオイムノアッセ
イのすべての種類を含む種々の免疫学的方法、例えば場
合によりクロラミンＴまたはポルトン−ハンター（Ｂｏ
ｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬で標識後の逐次的な飽和
分析または平衡分析（Ｆｅｌｂｅｒ、ｒＭｅｔｈ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ａｎａｌ、Ｊ　２２．１（１９７４）
および５ｈｅｌｌａｙ氏他、ｒｃｌｉｎ、　Ｃｈｅｍ、
Ｊ　　１９．　１４６（１９７５））ならびに他の競合
的および非競合的結合アッセイ例えば蛍光イムノアッセ
イ、エンザイムイムノアツセイ、化学ルミネセンスイム
ノアッセイまたは免疫放射線測定アッセイ（ｒＲＭＡ）
を含めたその他のイムノアッセイに使用されうる。それ
ゆえこのモノクローナル抗体は組織および体液中のプロ
コラーゲンペプチド＜ｍｕ）の単離および特性化のため
ならびに定量的測定のための免疫学的方法に使用されう
る。当業者に知られた方法に従い、プロコラーゲンペプ
チド（ＩＩＩ型）を含有する液体試料を溶液中または固
形担体上の本発明によるモノクローナル抗体と反応させ
そして形成された抗原−抗体一復金物によりプロコラー
ゲンペプチド（ＩＩＩ型）の量を測定する。その場合プ
ロコラーゲンペプチドＣＩ［［Ｗ）がプロコラーゲン（
ＩＩＩ型）のアミン末端となお結合しているか否かは全
く意味をもたない。免疫学的測定をこれまで妨害してい
たプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）の分解生成物、
特にＣｏＱ　ｌは本発明による抗体によっては捕捉され
ない。

以下の実施例により本発明の詳細な説明する。

％の記載は別に断りなければ重量によるものとする。

実施例　ｌ プロコラーゲンペプチド（Ｉ［［ＷＸＰＩ［ＩＰ）の調
製プロコラーゲン（ＩＩＩ型）に３７℃でコラ−ゲナー
ゼを作用させることによりプロコラーゲンペプチド（Ｉ
ＩＩ型）を調製する。その間ペプチドは何ら変性性物質
には露出されない。

比較的大量のペプチドを調製するには、改良法が用いら
れる。コラ−ゲナーゼを作用させるまでのすべての工程
は冷却室中で行われる。可溶化に用いられる種々のＮａ
ＣＱ溶液は０．０５Ｍ　ｌ−リス−ＨＣＱ（ｐＨ７，４
）、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、ナトリウムアジド（２００
ｍｇ／ｍ１２）およびグロテアーゼ阻害剤フェニルメチ
ルスルホニルフルオライド（３μｇ／　ｍｆｆ）および
ｐ−クロロメルクリベンゾエート（３μ９／　＋ｍｆｆ
）を含有する。

ウシ胎児の皮膚（３ｋｇ＞をＩ　Ｍ　ＮａＣｄ　１Ｏｆ
ｆ中でホモジナイズしそして２日間抽出する。抽出溶液
に最終濃度２．５Ｍとなるまで固形ＮａＣ４を添加する
ことにより溶解コラーゲンを沈澱させる。−夜撹拌した
のち遠心分離（１８００ｘ　ｇ、２０分）することによ
り沈澱を集め、２−５Ｍ　　ＮａＣＱを用いて２回洗い
、そして０．５Ｍ　　ＮａＣＲ１０α中で一夜撹拌する
ことにより再び溶解させる。少量の不溶物質を遠心分離
により除去する。コラーゲン（Ｉ［ＩＷ）およびプロコ
ラーゲン（ＩＩＩ型）のかくして得られた混合物を１．
６Ｍ　　ＮａＣ４を用いて沈澱させる。

この沈澱を０．０５Ｍ　トリス−ＨＣＱ　（ｐＨ８，０
）　２Ｑ中に懸濁させそして０．０２Ｍ　　ＣａＣＱ２
を添加したのち５０°Ｃで２０分間加熱し、次に湿った
沈澱１ａ当たり１５００Ｕの細菌性コラ−ゲナーゼ（Ｃ
ＬＳＰＡ、　Ｗｏｒｔ−ｈｉｎｇｔｏｎ１米国）と３７
℃で３時間インキュベートする。コラ−ゲナーゼを作用
させたのち生成した沈澱を遠心分離により除去しそして
溶液を０゜００５Ｍトリス−ＨＣＱ（ｐＨ８）、６．８
Ｍ尿素で透析し、そして同じ緩衝液で平衡となしたＤＥ
ＡＥセルロースカラム（５，０Ｘ３０ｃｍ）に加える。

カラムに結合したタンパク質をＮａＣＱ溶液を用いその
濃度を０〜０．３Ｍまで上昇させながら洗い出す。合計
溶出量は２ａである。カラムから流出した溶液を２３６
ｎｍでの吸収およびプロコラーゲン（ＩＩＩ型）のアミ
ノ末端セグメントに対して特異的な抗体を用いてその抗
原活性について検査する。通常、カラムから溶離される
最後のピークがプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）を
含有する。このペプチドを蒸留水で透析することにより
脱塩しそして凍結乾燥する。それ以上の精製はｌ　Ｍ　
ＣａＣＱ、２．０．０５Ｍ　トリス−’ｔｌＧＱ　（ｐ
Ｈ７，５）を用いて平衡化したアガロースＡ　１．５Ｍ
を含有するカラム（２Ｘ　１２０ｃｍ）上で行われる。

実施例　２ ハイブリドーマの生成 ＳＪＬ系統のマウスを完全プロインドアジュバントの存
在下に実施例１により得られたプロコラーゲンペプチド
（ＩＩＩ型）５μ９を用いて筋肉内免疫する。４週間後
および３力月後に５μグのプロコラーゲンペプチド（Ｉ
ＩＩ型）を不完全フロインドアジュバントの存在下にさ
らに筋肉内注射することにより免疫反応を強化させる。

融合の３日前にさらに５０μσのプロコラーゲンペプチ
ド（ＩＩＩ型）を腹腔的注射することにより免疫応答を
強化させる。

融合させるには動物を殺しモして肺臓細胞を単離する。

ポリエチレングリコールの存在下にこの肺臓細胞をミエ
ローマ細胞系統　Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３と融合させ
る。融合混合物をヒポキサンチン−アミノプテリン−チ
ミジン培地中で２週間培養することにより肺臓細胞ｘ　
Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３ハイブリツドを選択する。安
定した細胞系統を得るには得られた細胞クローンを数回
サブクローンする。形成された細胞コロニーを放射線免
疫学的結合アッセイにおいて抗体産生について検査する
。モノクローナル抗体ＰＩＩＩＰ２９６を産生する細胞
系統はＥＣＡＣＣに寄託番号８７０４２３０８の下に寄
託されている。

実施例　３ 放射線免疫結合アッセイ 細胞培養上澄み液、あるいは例えばマウスの腹腔中で細
胞を培養した後の腹水のような他の試料３００μαを１
２６　ｊを用いて放射性標識したプロコラーゲンペプチ
ド■型溶液（タンパクｆｆｌｎｇ／１００μα、ヨーロ
ッパ特許第４９４０号実施例１記載のようにして調製）
１００μＱと一夜インキユベーションする。形成された
抗原−抗体一複金物は羊または他の種の抗マウスＩｇＧ
血清を添加することにより沈澱させる。遠心分離および
上澄み液をデカンテーションしたのち沈澱した放射能の
量をγ−シンチレーション分光計で測定する。

実施例　４ ラジオイムノアッセイ 分析すべき検体またはプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ
型）標準物０．２ｍＱを標識された抗原の量に関して限
定されＩ；量のＰＩ［ＩＰ２９６（緩衝液０．１１中）
および１２″Ｉで標識されたプロコラーゲンペプチド（
ＩＩＩ型）０．１＋ｍＱ　（タンパク質１ｎｇ含有）と
４℃で一夜インキユベーションする。

次に１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　６０００
）の存在下に羊の予め検査された量の抗マウスＩｇＧ血
清と１時間インキュベーションする。沈澱した抗原−抗
体複合物を遠心分離（１５００ｘ　ｌ？）　Ｌそしてデ
カンテーションしたのち放射能をγ−シンチレーション
分光計で測定する。

種々の濃度のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）を含
有する標準物を用いて作成した標準曲線と比較すること
により未知溶液中のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型
）の濃度が測定されうる。

第１ａ図はＰＩＩ［Ｐ２９６を用いた場合の、そして第
１ｂ図は比較物としてヨーロッパ特許第４９４０号記載
の方法に従いポリクローナル抗体を用いた場合の標準曲
線（１）および血清希釈曲線（２）を示す。

実施例　５ ＰＩＩ［Ｐ２９６の放射性標識化 ｐＨ７，４の０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中のモノクローナ
ルＰＩＩＩＰ　２９６　０．２１１１９を含有する溶液
０．２ｍｆｆをポリスチレン試験管（１２Ｘ　５５＋ｘ
ｍ）中に入れそしてｐＨ７，４の０．５Ｍ燐酸塩緩衝液
１０μＱで緩衝した１　００ＭＢｑのＮａ１２１１溶液
を加える。これに２０μりのクロラミンＴの水溶液５０
μαを添加したのち１分間混合する。次にナトリウムジ
サルファイト２０μ９の水溶液５０μＱを添加すること
により沃素化反応を停止させる。

次に未反応のＮａｌ！Ｊをアニオン交換体でのクロマト
グラフィーにより１′！標識されたＰＩＩＩＰ２９６か
ら除去する。精製されたｌ！８１−標識抗体を含有する
クロマトグラフィーフラクションをｐＨ８，０の０．０
５１Ｊ　　トリス−ＨＣｆｆ緩衝液Ｉｆｆ中ノ２０ｇノ
ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および１４．６ｇのＮａ　
＊　ＥＤＴＡからなる溶液を用いて、標識された抗体の
濃度が２００μｇ／Ｉ２となるまで希釈する。

実施例　６ 試験管の抗体による被覆 ポリスチレン試験管（１２Ｘ　７５１１１１１１）に抗
体を固定させるために各試験管中にｐＨ６、４の０．０
１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液ｌＱ当たり４ｍｇのモノクロ
ーナルＰＩＩ［Ｐ　２９６を含有する溶液３００μａを
加え室温で一夜インキユベーションする。次に抗体溶液
を吸引により除去する。ｐＨ７，５の０．０５Ｍ　トリ
ス−サイトレート緩衝液中の牛血清アルブミンの１％溶
液５００μαを各試験管に加え室温で一夜インキユベー
ションする。次にこの溶液を吸引により除去する。抗体
で被覆された試験管をシリカゲルで乾燥する。

実施例　７ 免疫放射線測定アッセイ 分析すべき検体０．１ｍＱまたはプロコラーゲン（ＩＩ
Ｉ型）標準物０．１ｍＭを、予め１．２μｉのモノクロ
ーナルＰＩＩＩＰ２９６で被覆したポリスチレン試Ｍｌ
ｒ中で燐酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）０．１ｍＱを添加
して室温で２時間インキュベーションする。

次に試験管を１ｍＱずつのＰＢＳで２回洗いそしてデカ
ンテーションする。この試験管に■″Ｉで標識したモノ
クローナルＰｍＰｍ抗体２００μＱ（抗体４０ｎｇを含
有）を加え室温で２時間インキュベーションする。ＰＢ
ＳｌｍＱずつで２回洗い、デカンテーションしたのち試
験管壁に結合した抗体−抗ＢＩ　　ｒ２Ｊ−抗体複合物
の放射能をシンチレーシ１ヨン測定装置で計測する。

種々の濃度のプロコラーゲンペプチド（ＩＩＩ型）を含
有する標準物を用いて作成した標準曲線と比較すること
により未知検体溶液中のプロコラーゲンペプチド（ＩＩ
Ｉ型）の濃度が計算されうる。

第２図は放射線免疫測定アッセイの標準曲線を示す（Ｂ
／Ｔは結合抗体／総抗体を意味する）。

実施例　９ ヒト血清中におけるＰＩ［ＩＰ２９６と反応する抗原の
分子量分布の測定 非イオン界面活性剤例えばポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート（ツイーン２ｏ）０．０４％を含有す
る燐酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で平衡となし、た
、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと架橋したア
リルデキストラン（Ｓｅｐｈ−ａｃｒｙｌｏ　Ｓ　３０
０カラム（１，６Ｘ　１３０ｃｍ））でのゲルが過クロ
マトグラフィーにより血清ＬｍＱを３．３ｍＱずつのフ
ラクションに分別する。この７ラクシヨンの０　、２ｍ
Ｑずつを実施例４記載のラジオイムノアッセイに用いる
。第３図はＰＩＩ［Ｐ２９６を用いて測定された抗原の
溶離プロフィルをポリクローナル抗体を用いて測定され
た抗原のプロフィルに比較して示す。

第３図において ピーク４／４ａはｐＮ−コラーゲンおよび完全無傷のア
ミン末端プロコラーゲン（ＩＩＩ型）に相当する。

ピーク５１５ａはアミノ末端プロコラーゲンペプチド（
ＩＩＩを）　−（ｐｍｐ）に相当する。

ピーク６／６ａはＣｏＱ　１およびアミノ末端プロコラ
ーゲンペプチド（ＩＩＩ型）のＣｏＱ　ｌと同じ分子量
を有する分解生成物に相当する。

関連するフラクション中の物質濃度はプロコラーゲンペ
プチド（ＩＩＩ型）標準曲線を用いて測定されうる。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はＰＩＩ［Ｐ２９６を用いた場合の、そして第
１ｂ図は比較物としてヨーロッパ特許第４９４０号記載
の方法に従いポリクローナル抗体を用いた場合の標準曲
線（１）および血清希釈曲線（２）を示す。 第２図は放射線免疫測定アッセイの標準曲線を示す（Ｂ
／Ｔは結合抗体／総抗体を意味する）第３図はＰＩ［Ｉ
Ｐ２９６を用いて測定された抗原の溶離プロフィルをポ
リクローナル抗体を用いて測定された抗原のプロフィル
に比較して示す。 ｎｇ　Ｐ−１ｎ−Ｐ／ｍ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）完全無傷のプロコラーゲン（III型）およびｐＮ−
   コラーゲン（Ｃ−末端プロペプチドが欠失したプロコラ
   ーゲン、ピーク４ａ）、完全無傷のアミノ末端プロコラ
   ーゲンペプチド （III型）（ピーク５ａ）ならびにｃｏｌ１およびアミ
   ノ末端プロコラーゲンペプチド（III型）のｃｏｌ１と
   同じ分子量を有する分解生成物（ピーク６ａ）に対する
   第３図に示される反応パターンを有するモノクローナル
   抗体。 ２）アミノ末端プロコラーゲンペプチド（III型）のエ
   ピトープでありかつＣｏｌ１中には存在しないエピトー
   プに対して特異的に反応する請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体。 ３）ＩｇＧクラスに属するものである請求項１または２
   記載のモノクローナル抗体。 ４）ミエローマ系統の細胞と、予めプロコラーゲンペプ
   チド（III型）を用いて免疫した動物のリンパ球とを融
   合させることにより形成されたハイブリドーマにより産
   生されることからなる請求項１〜３のいずれかに記載の
   モノクローナル抗体。 ５）ハイブリドーマ細胞系統ＥＣＡＣＣ８７０４２３０
   ８から得られるモノクローナル抗体ＰIIIＰ２９６。 ６）ミエローマ細胞系統の細胞と、予めプロコラーゲン
   ペプチド（III型）を用いて免疫した動物のリンパ球・
   細胞とを融合させることにより形成され、請求項１〜５
   のいずれかに記載の抗体を産生するものであるハイブリ
   ドーマ細胞系統。 ７）ハイブリドーマ細胞系統ＥＣＡＣＣ８７０４２３０
   ８。 ８）アミノ末端プロコラーゲンペプチド（III型）に対
   するモノクローナル抗体を調製するにあたり、 ａ）動物をアミノ末端プロコラーゲンペプチド（III型
   ）を用いて免疫し、 ｂ）リンパ球を単離しそしてミエローマ細胞と融合させ
   、 ｃ）請求項１〜５のいずれかに記載の性質を有する抗体
   が存在するハイブリッドを選択 してクローンさせ、そして ｄ）前記クローンから抗体を取得する、 ことからなる方法。 ９）工程ｄ）を実施するのにハイブリドーマ細胞系統Ｅ
   ＣＡＣＣ８７０４２３０８が用いられることからなる請
   求項８記載の方法。 １０）プロコラーゲンペプチド（III型）を抗体を用い
   て定量的に免疫学的に測定するに当たり、ａ）アミノ末
   端プロコラーゲンペプチド（III型）またはプロコラー
   ゲン（III型）を含有 する液体試料を請求項１〜５のいずれかに 記載のモノクローナル抗体と反応させそし て ｂ）形成された抗原−抗体複合物によりアミノ末端プロ
   コラーゲンペプチド（III型）ま たはプロコラーゲンの量を測定する、 ことからなる方法。 １１）診断上受容されうる賦形剤と混合した、請求項１
   〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体の有効量を
   含有することからなる、体液中のプロコラーゲンペプチ
   ド（III型）量を測定するための診断用組成物。