JP2622260B2 - Ｉｆｎ−オメガに対する新規モノクローナル抗体、その製造方法、及びｉｆｎ−オメガの精製及び検出におけるその使用 - Google Patents

Ｉｆｎ−オメガに対する新規モノクローナル抗体、その製造方法、及びｉｆｎ−オメガの精製及び検出におけるその使用

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Description

【発明の詳細な説明】 Nucleic Acid Res.13,4739−4749（1985）にこれまで
に知られたα−及びβ−インターフェロンと構造及び抗
原の性質において実質的に異なる新しいＩ型インターフ
ェロンについての記述がある。この新しい種類のインタ
ーフェロンはIFN−オメガと名づけられた。
1987年９月16日に発行されたEP−Ａ−0236920の主題
は新規モノクローナル抗体、例えば新規モノクローナル
抗体OMG−２を用いて、IFN−オメガの精製を実質的に改
良することを可能にした。しかしながら、これらの抗体
はIFN−αとIFN−オメガの両方に特異性を示す。しかし
ながら塗布（Coating）のために用いられるポリクロー
ナル免疫グロブリン中のIFN−オメガ特異的抗体の比率
はあまりにも小さいので、この出願に記述する抗体を用
いてIFN−オメガを検出する免疫測定法を確立すること
は可能ではなかった。さらに、上述のごとく、ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体の双方ともIFN−αを
も認識するので、かかる方法はIFN−オメガに特異的で
ない。
従って現在までIFN−オメガの検出及び定量はもっぱ
ら生物学的方法、例えば抗ウイルス活性の測定によって
行われてきた。これらの方法は一般に非常に鋭敏である
が、時間がかかり、煩雑でかつ正確性に欠ける。従って
IFN−オメガを簡単、迅速かつ正確に測定することがで
きる、エライサ法やIRMA法のような免疫測定法の確立が
望まれていた。IFN−オメガは溶液中、モノマー形態で
存在するので、この種のテストはIFN分子の異なったエ
ピトープを認識できる少なくとも２種の抗体を必要とす
る。モノクローナル抗体は必須ではないが、抗血清に比
し多くの利点を有している。
今や驚くべきことに、上記問題点を新規モノクローナ
ル抗体によって解決できることが見い出された。本発明
によって製造される抗体はIFN−オメガに特異的であ
り、従ってこれらの抗体を用いる免疫測定によってIFN
−オメガの検出及び定量が可能となるが、IFN−α、IFN
−β及びIFN−γのような他のヒトインターフェロンは
影響されない。
従って本発明はIFN−オメガ型のヒトインターフェロ
ンと特異的に反応するが他のヒトインターフェロンとは
反応しない新規モノクローナル抗体、それらの製造方
法、及びIFN−オメガの精製や例えば免疫測定による検
出におけるそれらの使用に関する。これらの使用におい
てこれらの抗体はIFN−オメガ型のヒトインターフェロ
ンを特異的に検出することができるが、ポリクローナル
抗体も付加的に使用することができる。
本発明によれば以下の手順により上記抗体を製造す
る。
必要とされる抗体産生ハイブリドーマ細胞系は適当に
免疫化したマウス等の実験動物の脾細胞〔Ｋhler and
Milstein,Nature 256,495−497（1975）参照〕と好ま
しくはそれ自身ではいかなる抗体をも産生しないミエロ
ーマ細胞、例えばP3×63Ag8.653系のミエローマ細胞〔K
earney et al.,J.Immunol.123,1548（1979）参照〕との
細胞融合によって得られる。このプロセスは基本的には
マウスや他の適当な動物に免疫原を注入することよりな
る。ついでその血清が注入された免疫原の抗体を含有す
る、免疫化されたマウスから脾細胞を取り出し、ミエロ
ーマ細胞と融合させる。ハイブリドーマと呼ばれる雑種
細胞が得られ、ついでこれをインビトロで増殖させる。
ハイブリドーマの集団を分析し、操作して個々のクロー
ンを単離する。それぞれから単一の抗原に特異的な抗体
種が分離される。このようにして得られる個々の抗体は
免疫化された動物の単一のＢ細胞の産物であり、免疫原
性物質の特定の免疫原性構造との反応の結果生産され
る。かくのごとく、免疫原性物質が生存宿主中に導入さ
れると、宿主の免疫系が反応して免疫原性物質上のすべ
ての検出部位に対し抗体を形成する。この効果、すなわ
ち侵入者に対する防御としての抗体の形成は抗体の生産
において免疫原性物質に対する親和性及び特異性を変化
させることよりなり立っている。
２部位免疫測定法は抗体：抗原：抗体サンドイッチの
形成に基づいているので、抗原への結合の間お互いに妨
害しない２つの異なったモノクローナル抗体を一般的に
選択する。
本発明においては実験動物を予めIFN−オメガ、又は
一方がIFN−オメガで他方がIFN−α、好ましくはIFN−
オメガ１、又はIFN−オメガ1/α２で免疫化し、ついでI
FN−オメガ好ましくはIFN−オメガ１で再び免疫化す
る。
引き続いての細胞融合において、ハイブリドーマ培養
物を得る、ついでIFN−オメガの抗体を産生するクロー
ンを同定するためにスクリーニングにかける。このため
に好ましくは、生産された抗体による生物活性テスト、
例えばIFN−オメガの生物活性例えば抗ウイルス活性を
中和するようなテストを用いる。
得られる、OMG−４、OMG−５、OMG−６、OMG−７及び
OMG−８と名づけられ、一貫してIFN−オメガ１の抗ウイ
ルス活性の減少を示す５つの培養物中、OMG−４、OMG−
５及びOMG−７クローンを抗体生産用に選択した。
選んだハイブリドーマ細胞系はインビトロ又はインビ
ボで培養することができるが、インビボ培養の方が好ま
しい。
選ばれたクローンの細胞を、予めプリスタン又は不完
全フロインドアジュバント〔例えばMiiller et al.,J.I
mmunol.Method.87,193−196（1986）参照〕で予め処理
したBal b/cマウスに接種する。７−18日後腹水（ascit
es fluid）を採集し、生成した抗体を硫酸アンモニウム
による沈殿化及び引き続いてのアフィニティークロマト
グラフィーもしくは文献既知の他の手法で濃縮又は単離
する。
目的とする抗体は又適当なインビトロ培養における細
胞培養物上清から同様にして単離又は濃縮することがで
きる。
すでに前記したごとく、本発明によってこのようにし
て調製した新規抗体はIFN−オメガ、好ましくはIFN−オ
メガ１の精製及び検出に用いることができる。
本発明によって得られる抗体をIFN−オメガの超精製
（ultra−purification）に用いる場合は、生物学的に
不活性な担体に共有結合させることが好ましい。抗体は
適当に活性化された、好ましくはデキストランをベース
にした担体、例えばMessrs.Pharmacia of Uppsalaによ
って製造されたCNBr−活性化セファロースもしくは活性
化されたCH−セファロースに共有結合させる。超精製に
ついては、精製すべきオメガインターフェロンの溶液で
あって、EP−Ａ−0170204に記述された方法によって又
はEP−Ａ−0236920に記述の新規プラスミドを用いる発
明によって手頃に得られるオメガインターフェロン溶液
を、わずかに塩基性のpH、例えばpH7〜８、好ましくはp
H7.5で上記のごとくして得た抗体結合担体（an antibod
y affinity carrier）上にポンプで送り、ついで溶出液
中にタンパク質がなくなるまでpH7.5で洗浄し、つづい
て結合したインターフェロンを酸性下、例えば25％エチ
レングリコール中の0.1Mクエン酸を用いて溶出する。得
られたタンパク含有画分を強酸性カチオン交換体、例え
ばPharmacia製カチオン交換体Mono−Ｓを用いるクロマ
トグラフィーに処する。この溶出液中のヒトインターフ
ェロンを直ちにカチオン交換体カラムに吸収させ、NaCl
勾配で溶出する。
新規抗体を抗原としてのオメガインターフェロン例え
ばIFN−オメガ１の検出又は定量に用いる場合には、既
成の免疫測定技術を用いることができる。これらの技術
は測定すべき抗原物質と１以上の抗体の複合体の生成に
基づいており、これらの技術においては複合体の１もし
くはいくつかの部分を標識して、複合体を標識した抗原
もしくは抗体を分離除去した後、抗原を検出及び／又は
定量することができるようにすることができる。
競合的免疫測定技術の場合には、測定すべき液体試料
中の抗原性物質は制限量の抗体結合部位について既知量
の標識した抗原と競合関係にある。ゆえに抗体に結合し
た標識抗原の量は試料中の抗原量に反比例の関係にあ
る。
他方イムノメトリック法は標識抗体を用いる。この種
のアッセイでは複合体に結合した標識抗体の量は液体試
料中に含有される抗原物質の量に比例する。
イムノメトリック法は多価抗原、すなわち同時に２以
上の抗体と複合体を形成し得る抗原性物質の検出に特に
好適である。この種のアッセイは代表的には測定すべき
液に不溶の、固体担体に結合させた大量の非標識抗体と
標識した大量の可溶性抗体とを用い、結果として固相抗
体、抗原及び標識抗体より形成された３成分よりなる複
合体を検出及び／又は定量することが可能である。この
方法においては通常まず固相結合抗体を測定すべき試料
と接触させて、試料から抗原を抽出し、２成分よりなる
固相抗体・抗原複合体を形成させる。適当なインキュベ
ーション期間の後、固体担体を洗浄して存在するいずれ
かの未反応抗原をはじめとする、液体プローブ（prob
e）の残渣を除去し、ついで既知量の標準抗体を含有す
る溶液と接触させる。
標識抗体が、非標識抗体によって固体担体に結合され
た抗原と複合体を形成する、第２のインキュベーション
期間の後、固体担体を何秒間か洗浄して（washed a sec
ond time）未反応標識抗体を除去する。問題の試料中に
抗原があるかどうかを決定するための単純なYES/NOアッ
セイにおいては、洗浄した固体担体を測定する。検出さ
れた、標識抗体量を抗原を含有しない陰性のコントロー
ル試料のそれと比較する。陰性のコントロールによって
示される背景水準よりかなり高い量の標識抗体の検出は
疑われた抗原の存在を示す。定量的検出は既知量の抗原
を含有するキャリブレーテドプローブ（calibrated pro
bes）を用いて得られる、標識抗体の測定と比較するこ
とによって可能である。この種のアッセイはしばしば
「２部位」もしくは「サンドイッチ」アッセイと呼ばれ
る、というのは抗原がその表面の異なった部位に結合す
る２つの抗体を有するからである。
上記アッセイにおいて抗体は通常の担体でよく、例え
ばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然もしく
は化学修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロー
ス又は磁鉄鉱を包含する。
又、マーカーは酵素、放射性同位元素、金属キレー
ト、けい光化合物、化学発光化合物又は生物発光化合物
を包含する。
酵素の例はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌ
クレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、α
−グリセロールホスフエートデヒドロゲナーゼ、トリオ
ースホスフエートイソメラーゼ、西洋わさびパーオキシ
ターゼ（horseradish paoxidase）、アルカリホスファ
ターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフエートデヒド
ロゲナーゼ、グルコアミラーゼ又はアセチルコリンエス
テラーゼを包含する。
用いられる放射性同位元素は3H,125I,127I,32P′ 35S
及び14Cである。
けい光化合物はイソチオシアン酸フルオレセイン、ロ
ーダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフ
ィコシアニン、Ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−phthaldehy
de）又はフルオレサミンを包含する。
化学発光化合物はルミノール、イソルミノール、芳香
族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニ
ウム塩又は修酸エステルを包含する。
生物発光化合物はルシフエリン、ルシフェラーゼ及び
エクオリン（aequorin）を包含する。
さらに本発明による抗体はビオチン、ジニトロフエニ
ル、ピリドキサール又はフルオレサミンのごとき低分子
ハプテンと結合していてもよい。これらのハプテンはさ
らなる特異的反応によって認識される。例えばビオチン
はアビジンの助けによって、フルオレサミンは特異的抗
ハプテン抗体の助力によって認識される。
さらにマーカーとして用いる酵素の活性は測定される
信号を強めるのに用いることができる。
しかしながら、西洋わさびパーオキシダーゼをマーカ
ーとして用いるのが特に好ましい、というのはこの酵素
は多くの基質と反応できるからである。さらに西洋わさ
びパーオキシダーゼは比較的小さく、例えば過ヨウ素酸
法によって容易に抗体に結合させることができる。
しかしながら、オメガインターフェロン、好ましくは
IFN−オメガ１を検出もしくは定量するための好ましい
方法は、IFN−オメガを放射性標識する場合は、ポリク
ローナル抗体もしくは抗血清を用いる競合的ラジオイム
ノアッセイ（RIA）であり：抗体を放射性標識する場合
は特にイムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）であ
り；抗体を酵素で標識する場合は酵素結合抗体免疫吸着
アッセイ（ELISA）である。
本発明によれば、IFN−オメガ、好ましくはIFN−オメ
ガ１はテスト液中で下記のようにして検出もしくは定量
される： ａ） 測定すべき試料を、測定すべきIFN−オメガに対
するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を結合
させた担体と接触させ、 ｂ） ａ）で生成した２部分よりなる複合体の形成を、
標識モノクローナル抗体とａ）で生成した２部分複合体
よりなる３部分複合体の形成によって測定する。
本発明の実施に必要とされるオメガインターフェロン
はEP−Ａ−0170204の主題であり、本発明に記述されて
いないモノクローナル抗体、例えば抗体OMG−２のモノ
クローナル抗体はEP−Ａ−0236920の主題である。同じ
ことが免疫化に使用する雑種インターフェロンについて
も適用される。用いるポリクローナル抗体は文献既知の
方法を用いて得ることができる。
以下の実施例は本発明を、制限することなく、例示す
ることを意図するものである。
実施例 １ IFN−オメガに特異的なモノクローナル抗体の製造 ａ） 免疫化 約８週分の雌性Bal b/cマウスを高度に精製した（純
度＞95％）雑種インターフェロン（hybrid interfero
n）であるIFN−オメガ１α２を用いて以下のごとく免疫
化した。
第１回目の免疫化：完全フロインドアジュバント中の20
0mcg、腹腔内ルート 第２回目の免疫化：完全フロインドアジュバント中の20
0mcg、腹腔内ルート、第１回目免疫化の５週間後、 第
２回目の免疫化の８ケ月後、マウスを再び精製IFN−オ
メガ（純度＞90％）70mcg（不完全アジュバント、腹腔
内ルート）で免疫化した。12日後血清試料をとった。中
和テストはマウス血清が今やIFN−オメガに対する抗体
を中和するのに比較的高い力価を含有している（血清の
1000倍希釈までで全中和、10,000倍希釈で部分中和）こ
とを示した。中和テストは次のようにして行った：細胞
培養培地中の血清試料の希釈液100mclをIFN−オメガ１
溶液（100抗ウイルス単位1ml）100mclと混合し、37℃で
90分インキュベートした。試料の抗ウイルス活性を生物
テスト（A 549肺ガン細胞、脳心筋炎ウイルス）により
調べた。第３回目の免疫化の５週間後、マウスにさらに
精製IFN−オメガ１（純度＞90％）70mcgをアジュバント
なしに注射した。
ｂ） ハイブリドーマの生産及びスクリーニング Ｋhler及びMilstein〔Nature256,459（1975）〕に
よって最初に開発された方法に従って、非分泌細胞系P3
×63Ag8.653〔Kearney et al.,J.Immunol.123,1548〔19
79）〕を用いてハイブリドーマを生産した。以下の手順
を用いた。
最後の免疫化（上記参照）後４日目にマウスの脾臓を
切り離し、脾臓細胞を結合組織から機械的に取り出し、
細胞培養培地〔ペニシリンＧナトリウム（100units/m
l）及び硫酸ストレプトマイシン（50units/ml）を添加
したRPMI1640培地〕に懸濁し、遠心分離（Beckmann TJ
−６遠心分離機、1000rpm、10分）によって回収した。
２×108個のミエローマ細胞（10％ウシ胎児血清を添加
した上記細胞培養培地中で培養した）も遠心分離によっ
て回収し、血清非含有培養培地で１回洗浄した。最後
に、脾細胞及びミエローマ細胞を血清非含有培養培地に
再懸濁し、懸濁液を合し、再遠心分離した。上清を除去
し、細胞を融合用培地（45％RPMI 1640培地、50％ポリ
エチレングリコール4000、５％ジメチルスルホキシド）
に懸濁し、90秒間注意深く振盪し、さらに60秒間静置し
た。ついで血清非含有培養培地3mlを90秒かけて滴下
し、懸濁液を60秒静置し、ついでさらに血清非含有培養
培地6mlを90秒かけて滴下した。最後に10％ウシ胎児血
清を含有する培養培地12mlを絶えず攪拌しながら徐々に
添加し、10分静置し、混合物を10％ウシ胎児血清を含有
する培養培地を用いて50mlとした。細胞を遠心分離によ
って集め、20％ウシ胎児血清、ヒポキサンチン（10
-4M）、アミノプテリン（４×10-7M）及びチミジン（1.
6×10-5M）を添加した細胞培養培地（以後HAT培地と称
する）400mlに懸濁した。さらに、Bal b/cマウスからの
腹膜マクロファージを懸濁液に加え（約50,000/ml）、
懸濁液を細胞培養平板にピペットで移した（48wells/pl
ate、0.5ml/well）。平板を37℃（95％空気、５％CO2、
飽和水蒸気）でインキュベートした。３日後にHAT培地
0.5mlを各培養物に加えた。作製した全部で800の培養物
中、約300の培養物が２〜３週間後何らかのハイブリド
ーマ細胞の増殖を示した。つづいてのスクリーニングは
以下のようにして行った。
少なくとも10〜20％コンフルエントなハイブリドーマ
培養物（すなわち、少なくとも培養皿表面の約10〜20％
が隣接した細胞すなわち相互に密接した細胞によって被
われているハイブリドーマ培養物）の培養上清を等量の
HuIFN−オメガ１溶液（20抗ウイルス単位/ml）と混合
し、37℃で90分インキュベートし、ついでそれらの抗ウ
イルス活性をテストした。すべての培養物は１週間の間
隔で少なくとも２回テストした。以下OMG−４、OMG−
５、OMG−６、OMG−７及びOMG−８と称する５つの培養
物がすべてのテストにおいて抗ウイルス活性の減少を一
貫して示した。これらの培養物をすべて限界希釈（limi
ting dilution:ピペットで平均的に培養皿に移したとき
に、各培養皿に１個の細胞だけが移されるような程度ま
で希釈すること）によってクローン化し、クローンの中
和活性を上述の方法を用いて再びテストした。各培養物
から、３〜５の陽性クローンをプールした（were poole
d）。抗体をインビボで生産させるために、各ハイブリ
ドーマ培養物から３〜10×106細胞を、２もしくは３日
前にフロインドアジュバントを又は７〜10日前にプリス
タン0.5mlを腹腔内注射したBal b/cマウスに腹腔内ルー
トにより接種した。７〜21日後に生成した腹水を回収
し、含有される抗体を、50％硫酸アンモニウムによる沈
殿化及び既知の手法による担体結合タンパクＡを用いる
アフィニティクロマトグラフィーによって90％以上の純
度（a purity of over 90％）に濃縮した。すべてのハ
イブリドーマにおいて、腹水1mlあたり約２〜5mgの純粋
な抗体が得られた。
ｃ） 抗体OMG−４、OMG−５及びOMG−７の性格づけ 非還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミド電気泳動泳びゲル透過高圧液体クロマトグラフ
ィー（gel permeation high pressure liquid chromato
graphy）で検査した結果、すべての抗体はIgGマーカー
タンパクの保持特性と同じ保持特性を示し、従ってIgG
型である。インターフェロンの抗ウイルス活性を調べた
中和テスト（上記参照）ですべての抗体は100mcg/mlの
濃度でIFN−オメガ１の活性を中和したが、IFN−α2c、
IFN−β又はIFN−γの活性は中和しなかった。
これら３種のクローンはブダペスト条約に従って1987
年８月４日にECACC−ファイル番号（ECACC−file numbe
rs）87 081401（OMG−４）、87 081402（OMG−５）及び
87 081403の下にEuropean Callection of Animal Cell
Cultures,PHLS Center for Applied Microbiology and
Research,Porton Down,Salisburg,Wiltshire SP4OJG,Un
ited Kingdomに寄託した。
実施例 ２ IFN−オメガ１の酵素免疫測定 抗体OMG−５及びOMG−７を既知の手法（例えばWilson
M.B.and Nakane P.K.,Immunoflucrescence and Relate
d Staining Techniques,W.knappら発行、215−224頁;El
seuier1978）を用いて西洋わさびパーオキシダーゼに共
有結合させた。用いた方法は以下の通りであった。
水中の西洋わさびパーオキシダーゼ2mgを100mM過ヨウ
素酸ナトリウム0.2mlと混合し、周囲温度で40分振盪
し、1mM酢酸ナトリウム（pH4.4）２×500mlに対して40
℃で一夜透析した。ついで溶液を0.1M NaHCO3、pH9.5を
用いてpH約９に調整した。モノクローナル抗体の溶液
（10mM NaHCO3、pH9.5中OMG−５の場合1.6mg/mlを2ml、
OMG−７の場合4.7mg/mlを1.5ml）をこの溶液に加え、混
合物を周囲温度で２時間振盪した。NaBH4溶液（水中4mg
/ml）100mclを加え、溶液を氷浴中でさらに２時間イン
キュベートした。ついで冷飽和硫酸アンモニウム溶液3m
lを滴下し、混合物を氷浴中で１時間インキュベートし
た。生成したパーオキシダーゼ−免疫グロブリン複合体
を遠心分離によって集め、リン酸塩緩衝等張食塩溶液
（phosphate−buffered isotonic soline solution）pH
7.4 1mlに溶解し、リン酸塩緩衝食塩溶液（phosphate−
buffered saline solution）中のウシ血清アルブミン
（10mg/ml）溶液1mlを添加して安定化した。溶液を−70
℃で凍結した。
IFN−オメガ１についての固相サンドイッチ酵素免疫
測定は一般に知られた方法を用いて行った〔例えばBert
hold,W.,Merk,W.and Adolf,G.R.,Arzneim.−Forschung.
/Drug Res.35,364−369（1985）参照〕。微量力価エラ
イサ試験板（the microtitre ELISA testplates）に塗
布するために、モノクローナル抗体OMG−２、OMG−５又
はOMG−７を0.1M炭酸ナトリウムpH9.5中10mcg/mlの濃度
で用い（100mcl/well）、平板を周囲温度で１時間か、
４−８℃で一夜インキュベートした。抗体溶液を除去
し、穴（wells）をそれぞれ水200mclで洗浄し、リン酸
塩緩衝等張食塩溶液pH7.4中のウシ血清アルブミン（5mg
/ml）の溶液（以下PBS/BSAと称する）100mclをみたし
た。ついで20ng/mlの濃度のIFN−オメガ１溶液100mclを
加え混合し、ついでその溶液100mclを連続的に移すこと
によって一連の希釈液をつくった。最後に抗体−酵素複
合体溶液〔OMG−5/パーオキシダーゼ又はOMG−7/パーオ
キシダーゼ、PBS/BSA中原溶液（上記参照）1:10,000希
釈〕50mclをすべての穴に加え、平板を周囲温度で３時
間インキュベートした。ついで溶液を除去し、穴を水で
３回洗浄し、それぞれ基質溶液（0.067Mクエン酸カリウ
ムpH5中ｏ−フエニレンジアミン3mg/ml、及び過ホウ酸
ナトリウム1mg/ml）100mclでみたした。周囲温度で30分
インキュベート後、4N硫酸100mclをピペットで各穴に入
れ、ついで492nmでの光学濃度を多重チャネル光度計
（エライサ読取り装置）で測定した。
吸収の用量依存変化が塗布抗体と抗体−パーオキシダ
ーゼ複合体のすべての異種組合せについてなされた。第
1,2及び３図は得られた曲線を示す。
塗布はウサギをIFN−オメガ１で２回免疫化し、50％
硫酸アンモニウムで沈殿させることによって血清から部
分精製したウサギ抗IFN−オメガ１免疫グロブリンを10m
cg/mlの濃度で用いて行うこともできる（第４図）。
抗体OMG−２（EP−Ａ−0236920）及びパーオキシダー
ゼ結合抗体OMG−７から構成した。IFN−オメガのための
エライサ（第２図参照）の特異性を非常に広い範囲に亘
る濃度での他のヒトインターフェロン標品に適用するこ
とによってテストした。以下のインターフェロンを用い
た。
IFN−オメガ１について100pg/mlの感度でいかなる濃
度でのいずれの標品についても臨界的な信号はみられな
かった。エライサは従って組換えIFN−オメガ１の定量
のみならず、例えば細胞培養物から得られる白血球イン
ターフェロンや他のインターフェロン標品中のIFN−オ
メガ１の比率を決定するためにも用いることができる。
実施例 ３ IFN−オメガ１のイムノラジオメトリックアッセイ（IRM
A） 抗体OMG−７をＮ−サクシンイミジル〔2,3−3H〕プロ
ピオネート（3H−NSP、Amersham International,Englan
d製、110Ci/mmol）を用いて既知手法により放射性標識
した。3H−NSP溶液1mCiを浸硅した（siliconised）試験
容器中で真空乾燥した。ついで緩衝化した食塩溶液pH7.
4中のモノクローナル抗体OMG−７（4.7mg/ml）の溶液50
mcgをピペットで入れ、ついで1Mホウ酸緩衝液pH8.5 3mc
lを加えた。４℃で24時間放置後、過剰の3H−NSPをホウ
酸緩衝液中の1Mグリシン20mclで捕獲し、150mM NaCl及
び5mg/mlウシ血清アルブミンを添加した50mMリン酸カリ
ウム緩衝液pH7.4 250mclで希釈し、セファデックスG50M
カラム（0.5×20cm）により標識抗体から分離した。こ
の抗体は約10Ci/gタンパクの比活性を示した。
本テストを行うために、食刻したポリスチレンペレッ
ト（直径6.5mm、Northumbria Biologicals of England
製）に抗体OMG−２を塗布した（0.1M炭酸ナトリウムpH
9.5中10mcg/ml;周囲温度で１時間）。ついでペレットを
PBS/BSA（実施例２参照）中で１時間インキュベート
し、水250mclで２回洗浄した。ペレットを適当な試験管
中PBS/BSA中増加させた濃度（concentrations）のIFN−
オメガ１の溶液200mclを用い４℃で３時間インキュベー
トし、水250mclで３回洗浄した。ついで標識抗体溶液20
0mclバッチ（batches）（PBS/BSA中100ng/ml、試験管あ
たり１分間に約27,000カウント）を加え、得られる混合
物を４℃で20時間インキュベートした。ついでペレット
を水20mclで３回洗浄し、ポリプロピレン試験管に移
し、結合放射能をシンチレーションカクテル4mlを添加
後液体シンチレーションカウンターで測定した。第５図
はインターフェロン濃度の関数としての結合放射能を示
す。
【図面の簡単な説明】
第１図は塗布層としてモノクローナル抗体OMG−２、パ
ーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗体OMG−５
を用いる、IFN−オメガ１のエライサ試験の結果を示
す。 第２図は塗布層としてモノクローナル抗体OMG−２、パ
ーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗体OMG−７
を用いる、IFN−オメガ１のエライサ試験の結果を示
す。 第３図は塗布層としてモノクローナル抗体OMG−５、パ
ーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗体OMG−７
を用いる、IFN−オメガ１のエライサ試験の結果を示
す。 第４図は塗布層としてウサギ抗IFN−オメガ１免疫グロ
ブリン、パーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗
体OMG−７を用いる、IFN−オメガ１のエライサ試験の結
果を示す。 第５図は放射性標識用抗体としてモノクローナル抗体OM
G−７を用いる、IFN−オメガ１のイムノラジオメトリッ
クアッセイの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】IgG型のモノクローナル抗体であって、オ
    メガインターフェロンの活性は中和するが、IFN−β、I
    FN−ガンマ又はα−インターフェロン類の活性を中和し
    ないことを特徴とするモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】IFN−オメガ１の活性のみを中和する特許
    請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】寄託番号ECACC No.87 081401、No.87 0814
    02及びNo.87 081403であるクローンOMG−４、OMG−５及
    びOMG−７によって生産され、100mcg/mlの濃度でIFN−
    オメガ１の活性を中和するがIFN−α2c、IFN−β又はIF
    N−ガンマの活性を中和しない特許請求の範囲第１又は
    ２項記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】標識された特許請求の範囲第１、２又は３
    項記載のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】標識化を放射性同位元素を用いて行う特許
    請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】標識化を酵素を用いて行う特許請求の範囲
    第４項記載のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】標識化をけい光化合物を用いて行う特許請
    求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体。
  8. 【請求項８】標識化を化学発光化合物を用いて行う特許
    請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体。
  9. 【請求項９】標識化を生物発光化合物を用いて行う特許
    請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗体。
  10. 【請求項１０】IgG型のモノクローナル抗体であって、
    オメガインターフェロンの活性は中和するが、IFN−
    β、IFN−ガンマ又はα−インターフェロン類の活性を
    中和しないことを特徴とするモノクローナル抗体を製造
    する方法であって、IgG抗体を生産するハイブリドーマ
    細胞系を細胞融合及びサブクローニングによって製造
    し、これを増殖させた後、抗オメガインターフェロン特
    異性を有するIgG抗体を単離することを特徴とする方
    法。
  11. 【請求項１１】細胞融合を行うためにミエローマ細胞
    と、予めIFN−オメガ又は一部IFN−オメガ、一部IFN−
    αよりなる雑種インターフェロンで免疫化し、引き続い
    てIFN−オメガで再免疫化した実験動物からの脾細胞と
    を用いる特許請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】予備免疫化をIFN−オメガ１又はIFN−オ
    メガ1/α２を用いて行う特許請求の範囲第11項記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】第２の免疫化をIFN−オメガ１を用いて
    行う特許請求の範囲第11項記載の方法。
  14. 【請求項１４】用いる脾細胞がBal b/cマウスからの脾
    細胞である特許請求の範囲第11項記載の方法。
  15. 【請求項１５】用いるミエローマ細胞がP3×63Ag 8.653
    系のミエローマ細胞である特許請求の範囲第11項記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】モノクローナル抗体に適当なマーカーを
    結合して標識された抗体を製造することを特徴とする特
    許請求の範囲第10項記載の方法。
  17. 【請求項１７】IgG型のモノクローナル抗体であって、
    オメガインターフェロンの活性は中和するが、IFN−
    β、IFN−ガンマ又はα−インターフェロン類の活性を
    中和しないことを特徴とするモノクローナル抗体を、適
    当な活性化担体に共有結合させたことを特徴とする、オ
    メガインターフェロンを精製するのに適した抗体結合担
    体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0310940B1 (en) * 1987-09-30 1994-11-23 Fujirebio Kabushiki Kaisha Analytical element for enzyme immunoassays
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CN103173282A (zh) * 2004-06-16 2013-06-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对叶绿素进行酶促脱色的组合物和方法
EP2536435B1 (en) * 2010-02-18 2017-11-15 Janssen Biotech, Inc. Monkey homolog of human interferon omega
EP2970461A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Janssen Biotech Inc INTERFERON ALPHA AND OMEGA ANTIBODY ANTAGONISTS
TWI713453B (zh) * 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI77877C (fi) * 1979-04-20 1989-05-10 Technobiotic Ltd Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein.
DE3306060A1 (de) * 1983-02-22 1984-08-23 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Neue immunglobulin-produzierende hybridzellinien, deren verwendung und verfahren zu deren herstellung
DE3584198D1 (de) * 1984-08-01 1991-10-31 Boehringer Ingelheim Int Neue genetische sequenzen, die durch sie codierten interferon-peptide vom typ i und diese sie produzierende organismen.
DE3574145D1 (en) * 1984-08-27 1989-12-14 Genentech Inc Novel, distinct family of human leukocyte interferons, compositions containing them, methods for their production, and dna and transfected hosts therefor
DE3607835A1 (de) * 1986-03-10 1987-09-24 Boehringer Ingelheim Int Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung

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