JPS63105673A - Ｉｆｎ−オメガに対する新規モノクローナル抗体、その製造方法、及びｉｆｎ−オメガの精製及び検出におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１３．４７３
９−４７４９　　（１９８５）にこれまでに知られたα
−及びβ−インターフェロンと構造及び抗原の性質にお
いて実質的に異な、る新しい■型インターフェロンにつ
いての記述がある。この新しい種類のインターフェロン
はＴＰＮ−オメガと名づけられた。

１９８７年９月１６日に発行されたＥＰ−Ａ−０２３６
９２０の主題は新規モノクローナル抗体、例えば新規モ
ノクローナル抗体ＯＭＧ−２を用いて、ＩＦＮ−オメガ
の精製を実質的に改良することを可能にした。しかしな
がら、これらの抗体はＩＦＮ−αとＩＦＮ−オメガの両
方に特異性を示す。しかしながら塗布（Ｃｏａｔｉｎｇ
）のために用いられるポリクローナル免疫グロブリン中
のＩ　ＦＮ−オメガ特異的抗体の比率はあまりにも小さ
いので、この出願に記述する抗体を用いてＩＦＮ−オメ
ガを検出する免疫測定法を確立することは可能ではなか
った。さらに、上述のごとく、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体の双方ともＩ　ＦＮ−αをも認識する
ので、かかる方法はＩＦＮ−オメガに特異的でない。

従って現在までＩＦＮ−オメガの検出及び定量はもっば
ら生物学的方法、例えは抗ウィルス活性の測定によって
行われてきた。これらの方法は一般に非常に鋭敏である
が、時間がかかり、煩雑でかつ正確性に欠ける。従って
ＩＦＮ−オメガを簡単、迅速かつ正確に測定することが
できる、エライサ法やＩ　ＲＭＡ法のような免疫測定法
の確立が望まれていた。ＩＦＮ−オメガは溶液中、モノ
マー形態で存在するので、この種のテストはＩＦＮ分子
の異なったエピトープを認識できる少なくとも２種の抗
体を必要とする。モノクローナル抗体は必須ではないが
、抗血清に比し多くの利点を有している。

今や驚くべきことに、上記問題点を新規モノクローナル
抗体によって解決できることが見い出された。本発明に
よって製造される抗体はＩ　ＦＮ−オメガに特異的であ
り、従ってこれらの抗体を用いる免疫測定によってＩＦ
Ｎ−オメガの検出及び定量が可能となるが、ＩＦＮ−α
、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γのような他のヒトインター
フェロンは影響されない。

従って本発明はＩＦＮ−オメガ型のヒトインターフェロ
ンと特異的に反応するが他のヒトインターフェロンとは
反応しない新規モノクローナル抗体、それらの製造方法
、及びＩＦＮ−オメガの精製や例えば免疫測定による検
出におけるそれらの使用に関する。これらの使用におい
てこれらの抗体はＩＦＮ−オメガ型のヒトインターフェ
ロンを特異的に検出することができるが、ポリクローナ
ル抗体も付加的に使用することができる。

本発明によれば以下の手順により上記抗体を製造する。

必要とされる抗体産生ハイブリドーマ細胞系は適当に免
疫化したマウス等の実験動物の脾細胞（Ｋｏｈｌｅｒ　
ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　、　Ｎａｔｕｒｅ２５６　
、　４９５−４９７　（１９７５）参照〕と好ましくは
それ自身ではいかなる抗体をも産生じないミエローマ細
胞、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３系のミエローマ細
胞（Ｋｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　１２３　、１５４８（１９７９）参照〕との細
胞融合によって得られる。このプロセスは基本的にはマ
ウスや他の適当な動物に免疫原を注入することよりなる
。ついでその血清が注入された免疫原の抗体を含有する
、免疫化されたマウスから脾細胞を取り出し、ミエロー
マ細胞と融合させる。ハイブリドーマと呼ばれる雑種細
胞が得られ、ついでこれをインビトロで増殖させる。ハ
イブリドーマの集団を分析し、操作して個々のクローン
を単離する。それぞれから単一の抗原に特異的な抗体種
が分離される。このようにして得られる個々の抗体は免
疫化された動物の単一のＢ細胞の産物であり、免疫原性
物質の特定の免疫原性構造との反応の結果生産される。

かくのごとく、免疫原性物質が生存宿主中に導入される
と、宿主の免疫系が反応して免疫原性物質上のすべての
検出部位に対し抗体を形成する。この効果、すなわち侵
入者に対する防御としての抗体の形成は抗体の生産にお
いて免疫原性物質に対する親和性及び特異性を変化させ
ることよりなり立っている。

２部位免疫測定法は抗体：抗原：抗体サンドイッチの形
成に基づいているので、抗原への結合の問お互いに妨害
しない２つの異なったモノクローナル抗体を一般的に選
択する。

本発明においては実験動物を予めＩＦＮ−オメガ、又は
一方がＩＦＮ−オメガで他方がＩＦＮ−α、好ましくは
ＩＦＮ−オメガ１、又は■ＦＮ−オメガ１／α２で免疫
化し、ついでＩＦＮ−オメガ好ましくはＩＦＮ−オメガ
１で再び免疫化する。

引き続いての細胞融合において、ハイブリドーマ培養物
を得る、ついでＩＦＮ−オメガの抗体を産生ずるクロー
ンを同定するためにスクリーニングにかける。このため
に好ましくは、生産された抗体による生物活性テスト、
例えばＩＦＮ−オメガの生物活性例えば抗ウィルス活性
を中和するようなテストを用いる。

得られる、ＯＭＧ−４、ＯＭＧ−５、ＯＭＧ−６、ｏＭ
ｃ−７及び○ＭＧ−８と名づけられ、−貫してＩＦＮ−
オメガ１の抗ウィルス活性の減少を示す５つの培養物中
、ＯＭＧ−４、ＯＭＧ−５及びＯＭＧ−７クローンを抗
体生産用に選択した。

選んだハイブリドーマ細胞系はインビトロ又はインビボ
で培養することができるが、インビボ培養の方が好まし
い。

選ばれたクローンの細胞を、予めブリスタン又は不完全
フロインドアジュバント〔例えばＭｉｉｌｌｅｒ　ｅｔ
　ａｌｌＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ、　　
８７＋１９３−１９６　（１９８６）参照〕で予め処理
したＢａｌ　ｂ／ｃマウスに接種する。７−１８日後腹
水（ａｓｃｉｔｅｓ　ｆｌｕｉｄ　）を採集し、生成し
た抗体を硫酸アンモニウムによる沈殿化及び引き続いて
のアフィニティークロマトグラフィーもしくは文献既知
の他の手法で濃縮又は単離する。

目的とする抗体は又適当なインビトロ培養における細胞
培養物上清から同様にして単離又は濃縮することができ
る。

すでに前記したごとく、本発明によってこのようにして
調製した新規抗体はＩＦＮ−オメガ、好ましくはＩＦＮ
−オメガ１の精製及び検出に用いることができる。

本発明によって得られる抗体をＩＦＮ−オメガの超精製
（ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に用いる場
合は、生物学的に不活性な担体に共有結合させることが
好ましい。抗体は適当に活性化された、好ましくはデキ
ストランをベースにした担体、例えばＭｅｓｓｒｓ、　
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｏｆ　［Ｉｐｐｓａｌａによって
製造されたＣＮＢ、−活性化セファロースもしくは活性
化されたＣＨ−セファロースに共有結合させる。超精１
については、精製すべきオメガインターフェロンの溶液
であって、Ｂ　Ｐ　−Ａ　−０１７０２０４に記述され
た方法によって又はＥ　Ｐ　−Ａ−０２３６９２０に記
述の新規プラスミドを用いる発明によって手頃に得られ
るオメガインターフェロン溶液を、わずかに塩基性のｐ
Ｈ１例えばｐ１１７〜８．好ましくはｐｌ＋７．５で上
記のごとくして得た抗体結合担体（ａｎａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｒｒｉｅｒ　）上にポンプ
で送り１ついで溶出液中にタンパク質がなくなるまでｐ
ｌ＋７．５で洗浄し、つづいて結合したインターフェロ
ンを酸性下、例えば２５％エチレングリコール中の０．
１Ｍクエン酸を用いて溶出する。得られたタンパク含有
画分を強酸性カチオン交換体、例えばＰｈａｒｍａｃｉ
ａ製カチオン交換体Ｍｏｎｏ−３を用いるクロマトグラ
フィーに処する。この溶出液中のヒトインターフェロン
を直ちにカチオン交換体カラムに吸収させ、ＮａＣβ勾
配で溶出する。

新規抗体を抗原としてのオメガインターフェロン例えば
ＩＦＮ−オメガ１の検出又は定量に用いる場合には、既
成の免疫測定技術を用いることができる。これらの技術
は測定すべき抗原物質と１以上の抗体の複合体の生成に
基づいており、これらの技術においては複合体の１もし
くはいくつかの部分を標識して、複合体を標識した抗原
もしくは抗体を分離除去した後、抗原を検出及び／又は
定量することができるようにすることができる。

競合的免疫測定技術の場合には、測定すべき液体試料中
の抗原性物質は制限量の抗体結合部位について既知量の
標識した抗原と競合関係にある。

ゆえに抗体に結合した標識抗原の量は試料中の抗原量に
反比例の関係にある。

他方イムノメトリック法は標識抗体を用いる。

この種のアッセイでは複合体に結合した標識抗体の量は
液体試料中に含有される抗原物質の量に比例する。

イムノメトリック法は多価抗原、すなわち同時に２以上
の抗体と複合体を形成し得る抗原性物質の検出に特に好
適である。この種のアッセイは代表的には測定すべき液
に不溶の、固体担体に結合させた大量の非標識抗体と標
識した大量の可溶性抗体とを用い、結果として固相抗体
、抗原及び標識抗体より形成された３成分よりなる複合
体を検出及び／又は定量することが可能である。この方
法においては通常まず同相結合抗体を測定すべき試料と
接触させて、試料から抗原を抽出し、２成分よりなる固
相抗体・抗原複合体を形成さ−Ｕる。

適当なインキュベーション期間の後、固体担体を洗浄し
て存在するいずれかの未反応抗原をはじめとする、液体
プローブ（ｐｒｏｂｅ）　　の残渣を除去し、ついで既
知量の標準抗体を含有する溶液と接触させる。

標識抗体が、非標識抗体によって固体担体に結合された
抗原と複合体を形成する、第２）インキュベーション期
間の後、固体担体を何秒間か洗浄して（ｗａｓｈｅｄ　
ａ　５ｅｃｏｎｄ　ｔｉｍｅ　）未反応標識抗体を除去
する。問題の試料中に抗原があるかどうかを決定するた
めの単純なＹＥＳ　／ＮＯアッセイにおいては、洗浄し
た固体担体を測定する。検出された、標識抗体量を抗原
を含有しない陰性のコントロール試料のそれと比較する
。陰性のコントロールによって示される背景水準よりか
なり高い量の標識抗体の検出は疑われた抗原の存在を示
す。定量的検出は既知量の抗原を含有するキヤリプレー
テドプローブ（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ　ｐｒｏｂｅｓ　
）を用いて得られる、標識抗体の測定と比較することに
よって可能である。この種のアッセイはしばしば「２部
位」もしくは「サンドイッチ」アッセイと呼ばれる、と
いうのは抗原がその表面の異なった部位に結合する２つ
の抗体を有するからである。

上記アッセイにおいて担体は通常の担体でよく、例えば
ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ リエチレン ーゼ、天然もしくは化学修飾セルロース、ポリアクリル
アミド、アガロース又は磁鉄鉱を包含する。

又、マーカーは酵素、放射性同位元素、金属キレート、
けい光化合物、化学発光化合物又は生物発光化合物を包
含する。

酵素の例はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌク
レアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、α−
グリセロールポスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオー
スボスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーオキシタ
ーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄ　ｉｓｈｐ（１４）ｘｉｄａｓ
ｅ　）　、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ
、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース
−６−ボスフニートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラー
ゼ又はアセチルコリンエステラーゼを包含する。

用いられる放射性同位元素はＪ■，Ｉ２５ｒ。

＋２７　１　、′３Ｚｐ・３５３及び１４ｃである。

けい光化合物はイソヂオシアン酸フルオレセイン、ロー
ダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィ
コシアニン、Ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌ
ｄｅｈｙｄｅ）又はフルオレサミンを包含する。

化学発光化合物はルミノール、イソルミノール、芳香族
アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウ
ム塩又は修酸エステルを包含する。

生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエ
クオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）を包含する。

さらに本発明による抗体はビオチン、ジニトロフェニル
、ピリドキサール又はフルオレサミンのごとき低分子ハ
プテンと結合していてもよい。これらのハプテンはさら
なる特異的反応によって認識される。例えばビオチンは
アビジンの助けによって、フルオレサミンは特異的抗ハ
プテン抗体の助力によって認識される。

さらにマーカーとして用いる酵素の活性は測定される信
号を強めるのに用いることができる。

しかしながら、西洋わさびパーオキシダーゼをマーカー
として用いるのが特に好ましい、というのはこの酵素は
多くの基質と反応できるからである。さらに西洋わさび
パーオキシダーゼは仕較的小さく、例えば過ヨウ素酸法
によって容易に抗体に結合させることができる。

しかしながら、オメガインターフェロン、好ましくはＩ
ＦＮ−オメガ１を検出もしくは定量するための好ましい
方法は、ＩＦＮ−オメガを放射性標識する場合は、ポリ
クローナル抗体もしくは抗血清を用いる競合的ラジオイ
ムノアッセイ　（Ｒ１＾）であり：抗体を放射性標識す
る場合は特にイムノラジオメトリックアッセイ　（ＩＲ
ＭＡ）であり；抗体を酵素で標識する場合は酵素結合抗
体免疫吸着アッセイ　（ＥＴ、ｌ５Ａ）である。

本発明によれば、ＩＦＮ−オメガ、好ましくはＩＦＮ−
オメガｌはテスト液中で下記のようにして検出もしくは
定量される： ａ）測定すべき試料を、測定すべきＩＦＮ−オメガに対
するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を結合
させた担体と接触させ、ｂ）　　ａ）で生成した２部分
よりなる複合体の形成を、標識モノクローナル抗体とａ
）で生成した２部分？１　合体ｃＫ　’Ｊ　１１６３　
ｓ７ｆｇ百汁ＵＪＪしＩ＾〜仇−ノー四定する。

本発明の実施に必要とされるオメガインターフェロンは
Ｅ　Ｐ　−Ａ−０１７０２０４の主題であり、本発明に
記述されていないモノクローナル抗体、例えば抗体ＯＭ
Ｇ−２）モノクローナル抗体はＥＰ−Ａ−０２３６９２
０の主題である。同じことが免疫化に使用する雑種イン
ターフェロンについても適用される。用いるポリクロー
ナル抗体は文献既知の方法を用いて得ることができる。

以下の実施例は本発明を、制限することなく、例示する
ことを意図するものである。

実施例　Ｉ ＩＦＮ−オメガに特異的なモノクローナル抗体の製造 ａ）免疫化 約８週分の雌性Ｂａｌ　ｂ／ｃマウスを高度に精製した
く純度〉９５％）雑種インターフェロン（ｈｙｂｒｉｄ
　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　）であるＩＦＮ−オメガ１α
２を用いて以下のごとく免疫化した。

第１回目の免疫化：完全フロインドアシュパンｉ・中の
２００１１１ｏｇ、腹腔内 ルート 第２回目の気疫化：完全ソロインドアジュバント中の２
００ｍｃｇ、腹腔内 ルート、第１回目免疫化の ５週間後 第２回目の免疫化の８ケ月後、マウスを再び精製１ＦＮ
−オメガ（純度＞　９０　％）　７０ｍｃｇ（不完全ア
ジュバント、腹腔内ルート）で免疫化した。１２日後車
清試料をとった。中和テストはマウス血清が今やＩＦＮ
−オメガに対する抗体を中和するのに比較的高い力価を
含有している（血清の１０００倍希釈までで全中和、１
０，０００倍希釈で部分中和）ことを示した。中和テス
トは次のようにして行った：細胞培養培地中の血清試料
の希釈液１００ｍｃｊ！をＩＦＮ−オメガ１溶液（１０
０抗ウイルス単位１　ｙｎｌ）１００ｍｃｊ！と混合し
、３７℃で９０分インキュベートした。

試料の抗ウィルス活性を生物テス）（Ａ５４９肺ガン細
胞、脳心筋炎ウィルス）により調べた。

第３回目の免疫化の５週間後、マウスにさらに精製ＩＦ
Ｎ−オメガ１　（純度＞９０％）７０ｍｃｇをアジュバ
ントなしに注射した。

ｂ）　ハイブリドーマの生産及びスクリーニングに：ｈ
　Ｉｅｒ　　及びＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ２
５６．　４５９（１９７５））によって最初に開発され
た方法に従って、非分泌細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３（Ｋｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏ＋、　１２３　、１５４８（１９７９））を用いてハ
イブリドーマを生産した。以下の手順を用いた。

最後の免疫化（上記参照）後４日目にマウスの肺臓を切
り離し、肺臓細胞を結合組織から機械的に取り出し、細
胞培養培地〔ペニシリンＧナトリウム（１００ｕｎｊｔ
ｓ　／　＋ｄ）及び硫酸ストレプトマイシン（５０ｕｎ
ｔｔｓ　／　ｍｌ）を添加したＲＰＭ１１６４０培地〕
に懸濁し、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　　Ｔ　Ｊ　−
６遠心分離機、１０００ｒｐｍ。

１０分）によって回収した。２Ｘ１０”個のミエローマ
細胞（１０％ウシ胎児血清を添加した上記細胞培養培地
中で培養した）も遠心分離によって回収し、血清非含有
培養培地で１回洗浄した。最後に、脾細胞及びミエロー
マ細胞を血清非含有培養培地に再懸濁し、懸濁液を合し
、再遠心分離した。上清を除去し、細胞を融合用培地（
４５％ＲＰＭＩ　　１６４０培地、５０％ポリエチレン
グリコール４０００．５％ジメチルスルホキシド）に懸
濁し、９０秒間注意深く振盪し、さらに６０秒間静置し
た。ついで血清非含有培養培地３ｍｌを９０秒かけて滴
下し、懸濁液を６０秒静置し、ついでさらに血清非含有
培養培地６７を９０秒かけて滴下した。最後に１０％ウ
シ胎児血清を含有する培養培地１２ｍｅを絶えず撹拌し
ながら徐々に添加し、１０分静置し、混合物を１０％ウ
シ胎児血清を含有する培養培地を用いて５Ｑｍｆｆとし
た。細胞を遠心分ｇｉ１４によって集め、２０％ウシ胎
児１ｒｌｌ　ｚ？？　、ヒボキサンチン（１０−’Ｍ＞
　、アミノプテリン（４Ｘ　１０−７Ｍ）及びチミジン
（１，６Ｘ　１０−５Ｍ）を添加した細胞培養培地（以
後ＨＡＴ培地と称する）４００−に懸濁した。さらに、
Ｂａｌ　ｂ／ｃマウスからの腹膜マクロファージを懸濁
液に加え（約５０．０００／ｍｌ）　、懸濁液を細胞培
養平板にピペットで移した（　４８１ｙｅｌｌｓ／ｐｌ
ａｔｅ　、　０．５　ｍｆ／ｗｅｌ＋）。

平板を３７℃（９５％空気、５％ｃｏ２２）飽和水蒸気
）でインキュベートした。３日後にＨＡＴ培地０．５−
を各培養物に加えた。作製した全部で８００の培養物中
、約３００の培養物が２〜３週間後何らかのハイブリド
ーマ細胞の増殖を示した。つづいてのスクリーニングは
以下のようにして行った。

少なくとも１０〜２０％コンフルエントなハイブリドー
マ培養物（すなわち、少なくとも培養皿表面の約１０〜
２０％が隣接した細胞すなわち相互に密接した細胞によ
って被われているハイブリドーマ培養物）の培養上滑を
等量の１１ｕｌＦＮ−オメガ１溶液（２０抗ウィルス単
位／−）と混合し、３７℃で９０分インキュベートし、
ついでそれらの抗ウィルス活性をテスト７Ｉ した。すべての培養物は１週間の間隔で少なくとも２回
テストした。以下ＯＭＧ−４、ＯＭＧ−５、ＯＭＧ−６
、ＯＭ（，７及びＯＭＧ−８と称する５つの培養物がす
べてのテスＩ・において抗ウィルス活性の減少を一貫し
て示した。これらの培養物をすべて限界希釈（ｌｉｍｉ
ｔｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎ　：ピペットで平均的に培養
皿に移したときに、各培養皿に１個の細胞だけが移され
るような程度まで希釈すること）によってクローン化し
、クローンの中和活性を上述の方法を用いて再びテスト
した。各培養物から、３〜５の陽性クローンをプールし
た（ｗｅｒｅ　ｐｏｏｌｅｄ）。抗体をインビボで生産
させるために、各ハイブリドーマ培養物から３〜ｌ０Ｘ
ＩＯ６細胞を、２もしくは３日前にフロインドアジュバ
ントを又は７〜１０日前にブリスタン０．５ｍｌを腹腔
的注射したＢａｌ　ｂ／ｃマウスに腹腔内ルートにより
接種した。７〜２１日後に生成した腹水を回収し、含有
される抗体を、５０％硫酸アンモニウムによる沈殿化及
び既知の手法による担体結合タンバクＡを用いるアフィ
ニティクロマトグラフィーによって９０％以上の純度（
ａ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆｏｖｅｒ　９０％）に濃縮した
。すべてのハイブリドーマにおいて、腹水１ｍｌ’あた
り約２〜５ｍｇの純粋な抗体が得られた。

Ｃ）　抗体ＯＭＧ−４、ＯＭＧ−５及びＯＭＧ−７の性
格づけ 非還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド電気泳動及びゲル透過高圧液体クロ７トグラ７４
−　（ｇｅｌ　ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈｐｒｅ
ｓｓｕｒｅ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ　）で検査した結果、すべての抗体はＩｇＧマーカ
ータンパクの保持特性と同じ保持特性を示し、従ってＩ
ｇＧ型である。インターフェロンの抗ウィルス活性を調
べた中和テスト（上記参照）ですべての抗体は１００ｍ
ｃｇ　／ｍａｌの濃度でＩＦＮ−オメガ１の活性を中和
したが、ＩＦＮ−ａ２ｃ、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γの
活性は中和しなかった。

これら３種のクローンはブダペスト条約に従って１９８
７年８月４日にＥＣＡＣＣ−ファイル番号（ＥＣＡＣＣ
−ｆｉｌｅ　　ｎｕｍｂｅｒｓ　）　８７０８１４０１
　　（ＯＭＧ−４）　　、８７　０８１４０２（ＯＭＣ
，−５）及び８７　０８１４０３の下にＩＥｕｒｏｐｅ
ａｎ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　
Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　、　Ｐ　ＨＬ　５Ｃｅｎ
ｔｅｒ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａ−ｒｃｈ　、　Ｐｏｒｔｏ
ｎ　Ｄｏｗｎ　、Ｓａｌｉｓｂｕｒｇ　、　Ｗｉｌｔｓ
ｈｉｒｅＳＰ４０Ｊ　Ｇ、　Ｕ旧ｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏ
ｍに寄託した。

実施例　２ ＩＦＮ−オメガ１の酵素免疫測定 抗体ＯＭＧ−５及びＯＭＧ−７を既知の手法（例えばＷ
ｉｌｓｏｎ　Ｍ、Ｂ、ａｎｄ　Ｎａｋａｎｅ　Ｐ、　Ｋ
、。

Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｃｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ
１ａｔｅｄ　ＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　
、　Ｗ、　　ｋｎａｐｐ　ら発行、２１５−２２４頁；
　Ｂ１５ｅｕｉｅｒ　１９７８　）を用いて西洋わさび
パーオキシダーゼに共有結合させた。用いた方法は以下
の通りであった。

水中の西洋わさびパーオキシダーゼ２ｍｇを１００ｍＭ
過ヨウ素酸ナトリウム０．２ｍｅと混合し、周囲温度で
４０分振盪し、１ｍＭ酢酸す）　ＩＪウム（ｐ１４４．
４）２Ｘ５００−に対して４０℃で一夜透析した。つい
で溶液を０．１　Ｍ　　ＮａＨＣＯｓ　、ｐＨ９，５を
用いてｐ■約９に調整した。モノクローナル抗体の溶液
（１０ｍＭ　　ＮａＨＣ０３、ｐＨ９，５中ＯＭＧ−５
の場合１．６ｍｇ／−を２−１Ｏ２−１Ｏの場合４．７
ｍｇ／−を１．５ｍ）をこの溶液に加え、混合物を周囲
温度で２時間振盪した。ＮａＢＨａ溶液（水中４ｔａｇ
／ｍｌ＞　　１００ｍｃＡを加え、溶液を水浴中でさら
に２時間インキュベートした。ついで冷飽和硫酸アンモ
ニウム溶液３−を滴下し、混合物を水浴中で１時間イン
キュベートした。生成したパーオキシダーゼ−免疫グロ
ブリン複合体を遠心分離によって集め、リン酸塩緩衝等
張食塩溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　
１ｓｏｔｏｎｉｃ　５ｏｌｉｎｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）
ｐＨ７，４１艷に溶解し、リン酸塩緩衝食塩溶液（ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ　５
ｏｌｕｔｉｏｎ）中のウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／
＋ｄ）溶液１ｄを添加して安定化した。溶液を一７０℃
で凍結した。

ＩＦＮ−オメガ１についての固相サンドイッチ酵素免疫
測定は一般に知られた方法を用いて行った〔例えばＢｅ
ｒｔｈｏｌｄ　、　Ｗ、、　Ｍｅｒｋ　、　Ｈ，ａｎｄ
　Ａｄｏｌｆ。

Ｇ、　Ｒ，、Ａｒｚｎｅｉｍ、−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、
／Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ、　　３５　　＋３６４−３６９　
（１９８５）参照〕。微量力価エライサ試験板（ｔｈｅ
　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｒｅ　　ＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａｔｅｓｔ
　　　　・ｐｌａｔｅｓ　）に塗布するために、モノク
ローナル抗体ＯＭＧ−２２）ＯＭＧ−５又はＯＭＧ−７
を０．１　Ｍ炭酸ナトリウムｐｌ＋９．５中１０ｍｃｇ
　／ｍｌの濃度で用い（１００ｍｃｊ！／ｗｅｌｌ）　
、平板を周囲温度で１時間か、４−８℃で一夜インキユ
ベートした。抗体溶液を除去し、穴（ｗｅｌｌｓ　）を
それぞれ水２００ＩＩｌＣＩ！で洗浄し、リン酸塩緩衝
等張索塩溶？ｆｌｐＨ７，４中のウシ血清アルブミン（
５ｍｇ／ｍｆｆ）の溶液（以下ＰＢＳ／ＢＳＡと称する
）１００ｍｃｊ＋をのたした。

ついで２０ｎｚ／ｍｌ！の濃度のＩＦＮ−オメガ１溶液
１００ｎ＋ｃｊ！を加え混合し、ついでその溶液１００
ｍｃＪ！を連続的に移すことによって一連の希釈液をつ
くった。最後に抗体−酵素複合体溶液（ＯＭＧ−５／パ
ーオキシダーゼ又はＯＭＧ−７／パーオキシダーゼ、Ｐ
ＢＳ／＋３３Ａ中原溶液（上記参照”）　　１　：　１
０，０００希釈）５０ｍｃ７！をすべての穴に加え、平
板を周囲温度で３時間インキュベ−トした。ついで溶液
を除去し、穴を水で３回洗浄し、それぞれ基質溶液（０
，０６７Ｍクエン酸カリウムｐＨ５中Ｏ−フェニレンジ
アミン３ｍｇ／ｍｌ、及び過ホウ酸ナトリウム１　ｍｇ
／　ｄ）　　１００　ｍｃ　ｊ２でみたした。周囲温度
で３０分インキュベート後、４Ｎ硫酸１００ｍｃｊ！を
ピペットで各穴に入れ、ついで４９２ｎｍでの光学濃度
を多重チャネル光度計（エライサ読取り装置）で測定し
た。

吸収の用量依存変化が塗布抗体と抗体−パーオキシダー
ゼ複合体のすべての異種組合せについてなされた。第１
．２及び３図は得られた曲線を示す。

塗布はウサギをＩＦＮ−オメガ１で２回免疫化し、５０
％硫酸アンモニウムで沈殿させることによって血清から
部分精製したウサギ抗ＩＦＮ−オメガ１免疫グロブリン
を１０ｍｃｇ　／−の濃度で用いて行うこともできる（
第４図）。

抗体ＯＭＧ−２（ＥＰ−Ａ−０２３６９２０）及びパー
オキシダーゼ結合抗体ＯＭＧ−７から構成した。

ＩＦＮ−オメガのためのエライザ（第２図参照）の特異
性を非常に広い範囲に亘る濃度での他のヒトインターフ
ェロン標品に適用することによってテストした。以下の
インターフェロンを用いた。

インターフェロン　　起　　源　　　　　　　濃度範囲
Ｉ　ＦＮ−αｌ　　　　組換え体（Ｅ、コリ（ｃｏｌｉ
））　　２　ｎｇ−５０ｍｃｇ　／　ｍ１ＩＦＮ−ｏｔ
ｚｃ　　　組換え体（Ｅ、コｉハ　　　　　２　ｎｇ−
５０ｍｃｇ　／　ｍｌ。

ＩＦＮ−αＢ　　　組換え体（Ｅ、コリ）　　　　　３
　　ｘ１０２−１．２５ｘｌＯＪ／−ＩＦＮ−αＦ　　
　組換え体（Ｅ、コリ）　　　　　　１．４　ｘｌｏ’
−３，５ｘｌｏ’　Ｅ／−ＩＦＮ−β　　　　ポリ（ｈ
Ｃ）によって誘導　　８　　Ｘｌ０２−Ｚ　　ｘｌＱ６
　Ｍ／ｍＨされた繊維芽細胞 ＩＦＮ−ガンマ　　組換え体（Ｅ、コ１ハ　　　　２　
ｎｇ−５０ｍｃｇ　／　ｙｎ１ＩＦＮ−オメガ１につい
て１００　ｐｇ／　ｍｌの感度でいかなる濃度でのいず
れの標品についても臨界的な信号はみられなかった。エ
ライザは従って組換えＩＦＮ−オメガ１の定量のみなら
ず、例えば細胞培養物から得られる白血球インターフェ
ロンや他のインターフェロン標品中のＩＦＮ−オメガ１
の比率を決定するためにも用いることができる。

実施例　３ ＩＦＮ−オメガ１のイムノラジオメトリックアッセイ　
（ＩＲＭＡ） 抗体ＯＭＧ−７をＮ−−リ“クシンイミジルＣ２，３−
３Ｔ−１）プＩ：１ビオネート（ＩＴ　−Ｎ　Ｓ　Ｐ、
Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｌＩ
ｎｇｌａｎｄ製、１］ＯＣ４／ｍｍｏｌ　）を用いて既
知手法により放射性標識した。″Ｈ−ＮＳＰ熔液１ｍＣ
１を浸硅した（ｓｉｌｉｃ−ｏｎｉｓｅｄ　）試験容器
中で真空乾燥した。ついで緩衝化した食塩溶液ｐｌ＋７
．，４中のモノクにｒ−リ゛ル抗体ＯＭＧ　−７（４，
１ｔｔｇ／ｍＲ＞の溶液５Ｑｍｃ（Ｈをピペットで入れ
、ついで１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ’ｉ１．　、”ｌ　　３
ｍｃｌを加えた。４℃で２４時間放置後、過剰の３Ｈ−
ＮＳＰをホウ酸緩衝液中のＩＭグリシン２０ｍｃＪで捕
獲し、１５０ｍＭ　　ＮａＣ４及び５ｍｇ／　ｍｅウシ
血清アルブミンを添加した５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液ｐＨ７，４２５０ｍｃｊ！で希釈し、セファデックス
Ｇ５０Ｍカラム（０，５Ｘ２０ｃｍ）により標識抗体か
ら分離した。この抗体は約１０Ｃｉ／ｇタンパクの比活
性を示した。

本テストを行うために、食刻したポリスチレンペレット
（直径５．５１ｍ、Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓｏｆ　　Ｅｎｇｌａｎｄ製）に抗体ＯＭ
Ｇ−２を塗布した（０．１Ｍ炭酸ナトリウムｐｌ＋９．
５中１０ｍｃｇ　／ｍｅ　；周囲温度で１時間）。つい
でペレットを　ＰＢＳ／ＢＳＡ　（実施例２参照）中で
１時間インキュベートし、水２５０ｍｃ７！で２回洗浄
した。ペレットを適当な試験管中ＰＢＳ／ＢＳＡ中増加
させた濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）のＩＦＮ
−オメガ１の溶液２００ｍｃｊ＋を用い４℃で３時間イ
ンキュベートし、水２５０ｍｃ／で３回洗浄した。つい
で標識抗体溶液２００ｍｃｊｌ＜、、チ（ｂａｔｃｈｅ
ｓ）　（Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｂ　Ｓ　Ａ中１１００ｎ／ｍ
ｆｆ１、試験管あたり１分間に約２７，０００カウント
）を加え、得られる混合物を４℃で２０時間インキュベ
ー１−　した。ついでペレットを水２０ｍｃＩ！、で３
回洗浄し、ポリプロピレン試験管に移し、結合放射能を
シンデレージョンカクテル４ｍｌを添加移液体シンチレ
ーションカウンターで測定した。第５図はインターフェ
ロン濃度の関数としての結合放射能を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は塗布層としてモノクローナル抗体ＯＭＧ−２２
）パーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗体ＯＭ
Ｇ−５を用いる、ＩＦＮ−オメガ１のエライサ試験の結
果を示す。 第２図は塗布層としてモノクローナル抗体ＯＭＧ−２２
）パーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗体ＯＭ
Ｇ−７を用いる、ＩＦＮ−オメガ１のエライサ試験の結
果を示す。 第３図は塗布層としてモノクローナル抗体ＯＭＧ−５、
パーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル抗体ＯＭＧ
−７を用いる、ＩＦＮ−オメガ１のエライサ試験の結果
を示す。 第４図は塗布層としてウサギ抗ＩＦＮ−オメガ１免疫グ
ロブリン、パーオキシダーゼ複合体用にモノクローナル
抗体ＯＭＧ−７を用いる、ＩＦＮ−オメガ１のエライサ
試験の結果を示す。 第５図は放射性標識用抗体としてモノクローナル抗体Ｏ
ＭＧ−７を用いる、ＩＦＮ−オメガ１のイムノラジオメ
トリックアッセイの結果を示す。 第１図 ＩＦＮ−オメｊｆ１につし）でのエジイサ滓布：モノク
ローナルＩへ体○ＭＧ−２■／ｍＱ 第２図 ＩＦＮ−λメが１についてのエラ４サ ８慶佑　モノクローナル手元Ｋ　ＯＭＧ−２第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）インビトロ及びインビボでの培養に供されるハイ
   ブリドーマ細胞系であって、 ＩＦＮ−オメガ又は一部ＩＦＮ−オメガと一部ＩＦＮ−
   αよりなる雑種インターフェロンで免疫化し、ついで再
   びＩＦＮ−オメガで免疫化した実験動物から得られる脾
   細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られ、Ｉ
   ＦＮ−オメガに対する抗体を産生することを特徴とする
   ハイブリドーマ細胞系。 （２）最初の免疫化をＩＦＮ−オメガ１又はＩＦＮ−オ
   メガ１／α２を用いて行う特許請求の範囲第１項記載の
   ハイブリドーマ細胞系。 （３）第２の免疫化をＩＦＮ−オメガ１を用いて行う特
   許請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞系。 （４）用いる脾細胞がＢａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞
   である特許請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞
   系。 （５）用いるミエローマ細胞がＰ３×６３Ａｇ８．６５
   ３系のミエローマ細胞である特許請求の範囲第１項記載
   のハイブリドーマ細胞系。 （６）ＯＭＧ−４（寄託番号ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ．８７０
   ８１４０１、ＯＭＧ−５（寄託番号ＥＣＡＣＣ−Ｎｏ． ８７　０８１４０２）及びＯＭＧ−７（寄託番号ＥＣＡ
   ＣＣ−Ｎｏ．８７　０８１４０３）である特許請求の範
   囲第５項記載のハイブリドーマ細胞系。 （７）ＩｇＧ型のモノクローナル抗体であって、オメガ
   インターフェロンの活性は中和するが、 ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ガンマ又はα−インターフェロン
   類の活性を中和しないことを特徴とするモノクローナル
   抗体。 （８）ＩＦＮ−オメガ１の活性のみを中和する特許請求
   の範囲第７項記載のモノクローナル抗体。 （９）寄託番号ＥＣＡＣＣ　ＮＯｓ．ＯＭＧ−４、ＯＭ
   Ｇ−５及びＯＭＧ−７であるクローン ＯＭＧ−４、ＯＭＧ−５及びＯＭＧ−７によって生産さ
   れ、１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度でＩＦＮ−オメガ１の活
   性を中和するがＩＦＮ−α２ｃ、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ
   −ガンマの活性を中和しない特許請求の範囲第７又は８
   項記載のモノクローナル抗体。 （１０）標識された特許請求の範囲第７、８又は９項記
   載のモノクローナル抗体。 （１１）標識化を放射性同位元素を用いて行う特許請求
   の範囲第１０項記載のモノクローナル抗体。 （１２）標識化を酵素を用いて行う特許請求の範囲第１
   ０項記載のモノクローナル抗体。 （１３）標識化をけい光化合物を用いて行う特許請求の
   範囲第１０項記載のモノクローナル抗体。 （１４）標識化を化学発光化合物を用いて行う特許請求
   の範囲第１０項記載のモノクローナル抗体。 （１５）標識化を生物発光化合物を用いて行う特許請求
   の範囲第１０項記載のモノクローナル抗体。 （１６）特許請求の範囲第７、８又は９項記載のモノク
   ローナル抗体を製造する方法であって、ＩｇＧ抗体を生
   産するハイブリドーマ細胞系を細胞融合及びサブクロー
   ニングによって製造し、これを増殖させた後抗オメガイ
   ンターフェロン特異性を有するＩｇＧ抗体を単離するこ
   とを特徴とする方法。 （１７）細胞融合を行うためにミエローマ細胞と、予め
   ＩＦＮ−オメガ又は一部ＩＦＮ−オメガ、一部ＩＦＮ−
   αよりなる雑種インターフェロンで免疫化し、引き続い
   てＩＦＮ−オメガで再免疫化した実験動物からの脾細胞
   とを用いる特許請求の範囲第１６項記載の方法。 （１８）予備免疫化をＩＦＮ−オメガ１又はＩＦＮ−オ
   メガ１／α２を用いて行う特許請求の範囲第１７項記載
   の方法。 （１９）第２の免疫化をＩＦＮ−オメガ１を用いて行う
   特許請求の範囲第１７項記載の方法。 （２）用いる脾細胞がＢａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞
   である特許請求の範囲第１７項記載の方法。 （２１）用いるミエローマ細胞がＰ３×６３Ａｇ８．６
   ５３系のミエローマ細胞である特許請求の範囲第１７項
   記載の方法。 （２２）特許請求の範囲第１０〜１５項のいずれか１項
   記載のモノクローナル抗体を製造する方法であって、特
   許請求の範囲第７、８又は９項記載のモノクローナル抗
   体を適当なマーカーと組み合わせることを特徴とする方
   法。 （２３）特許請求の範囲第７、８又は９項記載の新規モ
   ノクローナル抗体のオメガインターフェロン精製のため
   の使用。 （２４）オメガインターフェロンを精製するのに適した
   抗体結合担体であって、特許請求の範囲第７、８又は９
   項記載のモノクローナル抗体を適当な活性化担体に共有
   結合させたことを特徴とする抗体結合担体。 （２５）特許請求の範囲第２４項記載の抗体親和担体を
   製造する方法であって、特許請求の範囲第７、８又は９
   項記載のモノクローナル抗体を適当な活性化担体に共有
   結合させたことを特徴とする方法。 （２６）オメガインターフェロンを精製する方法であっ
   て、ＩＦＮ−オメガを特許請求の範囲第２４項記載の抗
   体結合担体に結合させることを特徴とする方法。 （２７）特許請求の範囲第７、８又は９項記載の新規モ
   ノクローナル抗体及び特許請求の範囲第１０〜１５項の
   いずれか１項記載のその標識化した誘導体のＩＦＮ−オ
   メガ検出のための使用。 （２８）ＩＦＮ−オメガの検出に適したキットであって
   、特許請求の範囲第１０〜１５項のいずれか１項記載の
   モノクローナル抗体を含有することを特徴とするキット
   。 （２９）ＩＦＮ−オメガを検出する方法であって、試料
   を特許請求の範囲第１０〜１５項のいずれか１項記載の
   抗体とインキュベートし、抗体とＩＦＮ−オメガとの反
   応を記録することを特徴とする方法。 （３０）ＩＦＮ−オメガの検出又は定量に適したキット
   であって、ａ）ＩＦＮ−オメガに対するモノクローナル
   抗体もしくはポリクローナル抗体が結合した固相を含有
   し、ｂ）生成した２部分よりなる複合体を特許請求の範
   囲第１０〜１５項のいずれか１項記載のモノクローナル
   抗体を用いて測定することを特徴とするキット。 （３１）特許請求の範囲第２９項記載のＩＦＮ−オメガ
   の検出に適したキットであって、ＥＰ−Ａ−０２３６９
   ２０に記述の抗体を用いることを特徴とするキット。 （３２）ＩＦＮ−オメガを検出又は定量する方法であっ
   て、ａ）試料を、担体に結合させたＩＦＮ−オメガのモ
   ノクローナルもしくはポリクローナル抗体とインキュベ
   ートし、ｂ）得られる試料を特許請求の範囲第１０〜１
   ５項のいずれか１項記載の抗体と混合し、ｃ）結合した
   特許請求の範囲第１０〜１５項のいずれか１項記載の抗
   体の量を測定することを特徴とする方法。 （３３）特許請求の範囲第２８、３０又は３１項記載の
   免疫測定法であって、ＩＦＮ−オメガ１のみを認識し、
   α、βもしくはガンマ型のＩＦＮを認識しないことを特
   徴とする免疫測定法。