NO173831B - Nye monoklonale antistoffer mot ifn-omega, hybridomer tilfremstilling derav og anvendelse for rensing samt paavisning eller kvantitativ bestemmelse av ifn-omega, og sett forbruk ved paavisningen - Google Patents

Description

I Nucleic Acids Res. 13., 4739-4749 (1985) beskrives nye type I-interferoner som adskiller seg vesentlig i sine strukturer og sine antigenegenskaper fra de tidligere kjente a- og f3-interferoner. Denne nye interferon-klasse ble derfor kalt IFN-omega .

Videre kunne man ved hjelp av de nye beskrevne monoklonale antistoffer som er beskrevet i EP-A-0.236.920, som ble publisert 16. september 1987, f.eks. den nye monoklonale antistoff OMG-2, vesentlig forbedre rensingen av IFN-omega. Disse antistoffer viser likevel spesifitet både for IFN-a og for IFN-omega. Med hjelp av de antistoffer som beskrives i denne søknaden kunne likevel ingen immunologisk måling etableres for påvisning av IFN-omega, da andelen av IFN-omega-spesifikke antistoffer i det polyklonale immunoglobulin som ble anvendt for beskiktingen var altfor liten. Dertil ville en slik prøve ikke være spesifikk for IFN-omega, da, som allerede nevnt ovenfor, både de polyklonale og de monoklonale antistoffene også ville erkjenne IFN-a.

Påvisningen av kvantifiseringen av IFN-omega måtte derfor hittil utelukkende utføres ved hjelp av biologiske prøver, såsom f.eks. målingen av antivirusaktivitet. Disse påvisningsmetoder er generelt meget ømfintlige, men tids- og arbeidskrevende samt lite presise. Oppstillingen av en immunol o^-i sk måling, f.eks. av en prøve av typen ELISA eller IRMA, med hvis hjelp en enkel, rask og nøyaktig bestemmelse av IFN-omega er mulig, var derfor ønskelig. Da IFN-omega foreligger som monomer i løsning, er imidlertid minst to antistoffer nødvendig for å stille opp en slik under-søkelse, som kunne erkjenne forskjellige epitoper av IFN-moleky-let, hvorunder monoklonale antistoffer riktignok ikke er nødven-dig, men har tallrike fordeler i forhold til antisera.

Overraskende ble det nå funnet at de nevnte problemer kunne oppheves ved hjelp av nye monoklonale antistoffer. Antistoffene ifølge oppfinnelsen er spesifikke for IFN-omega; immunologiske bestemmelser frembragt med hjelp av dem muliggjør påvisningen og kvantifiseringen av IFN-omega, men reagerer ikke på andre humane interf eroner, såsom IFN-a, IFN-/3 eller IFN-gamma.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er derfor nye monoklonale antistoffer for anvendelse in vitro som reagerer spesifikt med humaninterferon av typen IFN-omega, men ikke med andre humaninterferoner, og hybridomcellelinjer som produserer dem, deres anvendelse for rensning av IFN-omega og for påvisning av IFN-omega in vitro, f.eks. ved hjelp av immunologiske målinger, hvori disse antistoffer kan anvendes for spesifikk påvisning av humaninterferon av typen IFN-omega, hvorunder i tillegg også polyklonale antistoffer kunne anvendes, og et sett egnet for ovennevnte påvisning av IFN-omega.

Man går frem som følger ved fremstillingen av de nevnte antistoffer: De nødvendige antistoff-produserende hybridomcellelinjer får man ved cellefusjon av miltceller (se Kohler og Milstein i Nature 256, 495-497 (1975)) fra tilsvarende immuniserte forsøks-dyr, f.eks. fra musemiltceller, med myelonceller, som fortrinnsvis selv ikke produser noen antistoffer, f.eks. med myelonceller av linjen P3X63Ag8.653 (se Kearney et al. i J. Immunol. 123, 1548

(1979)). Denne fremgangsmåten består prinsippielt i at man injiserer en mus eller et annet egnet dyr med et immunogen. Så fusjoneres de miltceller fra de immuniserte mus hvis sera inneholder antistoffer mot det injiserte immunogen med myelonceller. Man får hybridceller som kalles hybridoma, som reproduse-rer seg in vitro. Populasjonen av hybridoma analyseres og manipuleres, slik at man isolerer enkelte kloner, fra hvilke hver enkelt utskiller en eneste, antigen-spesifikk antistofftype. Hver individuell antistofftype som oppnås på denne måten er produktet av en enkelt B-celle fra det immuniserte dyr, som ble frembragt som reaksjon på en spesifikk immunogen struktur hos den immunogene substans. Innføres altså en immunogen substans i en levende vert, reagerer immunsystemet til verten med dannelse av antistoffer mot alle erkjennbare steder på den immunogene substans. Denne effekten, nemlig dannelsen av antistoffer i forsvarskampen mot inntrengeren, består således i dannelsen av antistoffer med forskjellige affiniteter og spesifiteter for den immunogene substans. Da den to-setes-immunometriske måling bygger på dannelsen av en antistoff:antigen:antistoff-sandwich, utvelges i alminne-lighet to forskjellige monoklonale antistoffer, som ikke gjen-sidig hindrer hverandre ved bindingen til antigenet. I det foreliggende tilfelle forimmuniseres forsøksdyrene med et IFN-omega eller et hybridinterferon bestående av en del IFN-omegal og en del IFN-a, fortrinnsvis med IFN-omegal eller med IFN-omegal/a2, og immuniseres deretter igjen med en IFN-omega, fortrinnsvis med IFN-omegal. Ved den etterfølgende cellefusjon oppnås hybridomkulturer som deretter underkastes et utvalg for å identifisere de kloner som produserer antistoffet rettet mot IFN-omega. For dette benyttes fortrinnsvis biologiske prøver, f.eks. prøver som kan underbygge nøytraliseringen av de biologiske aktivitetene til et IFN-omega, f.eks. den antivirale aktiviteten med de fremstilte antistoffer. Fra de fem således erholdte kulturer, som kaltes OMG-4, OMG-5, OMG-6, OMG-7 og OMG-8, og vedvarende viser en reduksjon av antivirusaktiviteten til IFN-omegal, utvalgtes klonene OMG-4, OMG-5 og OMG-7 for antistoffproduksjon. For dette formål kan de utvalgte hybridomcellelinjer dyrkes in vitro eller in vivo, hvorunder in vivo-kulturen imidlertid er foretrukket: Celler av utvalgte kloner inokuleres i Balb/c-mus forbe-handlet med pristan eller ufullstendig Freunds adjuvans (se f.eks. Muller et al. i J. Immunol. Methods 87, 193-196 (1986)). Etter 7-18 dager samles bukvatersotvæsken, og fra denne anrikes, henholdsvis isoleres de dannede antistoffer ved hjelp av ammo-niumsulfatfelling og etterfølgende affinitetskromatografi eller med andre metoder kjent fra litteraturen. Selvfølgelig kan de ønskede antistoffer isoleres, henholdsvis anrikes analogt fra en cellekultursupernatant fra en tilsvarende in vitro-kultur. De oppnådde monoklonale antistoffer er særpreget ved at de i en konsenterasjon på 100 ^g/ml nøytraliserer aktiviteten til IFN-omega, men ikke til IFN-a2c, IFN-/3 eller IFN-"Y, og eventuelt er merkede. Som allerede innledningsvis nevnt, kan et således fremstilt nytt antistoff anvendes for rensing og for påvisning av IFN-omega, fortrinnsvis av IFN-omegal.Skal antistoffene som er fremstilt anvendes for sterk rensing av et IFN-omega, bindes dette fortrinnsvis kovalent til en biologisk inaktiv bærer. Den kovalente bindingen til antistoffet skjer herunder på en tilsvarende aktivert bærer, fortrinnsvis på dekstran-basis, f.eks. til CNBr-aktivert Sepharose eller CH-aktivert Sepharose fra firmaet Pharmacia, Uppsala. For sterk rensing blir en løsning av omegal-interferonet som skal renses, som hensiktsmessig er fremstilt enten ifølge fremgangsmåten beskrevet i EP-A-0.170.204 eller ifølge oppfinnelsen ved hjelp av de nye plasmider som er beskrevet i EP-A-0•236.920 pumpet ved svakt basisk pH, f.eks. ved en pH 7-8, fortrinnsvis imidlertid ved en pH 7,5, gjennom en således fremstilt antistoff-affinitetsbærer, vasket så lenge ved pH 7,5 at eluatet blir proteinfritt, og deretter elueres det bundne inter f eron i det sure området, f. eks. ved hjelp av 0,1 molar sitronsyre i 25%-ig etylenglykol. De således erholdte proteinholdige fraksjoner kromatograferes deretter over en sterkt sur kationbytter, f.eks. kationbytteren Mono-S fra firmaet Pharmacia. Herunder absorberes humaninterferonet i det ovennevnte eluat straks av kationbyttersøylen og elueres så ved hjelp av en NaCl-gradient. Skal et omega-a-interferon, f.eks. IFN-omegal ved hjelp av de nye antistoffer som antigen påvises, henholdsvis bestemmes kvantitativt, står de brukbare immunologiske måleteknikker for dette til rådighet. Teknikkene er basert på dannelsen av et kompleks mellom den "antigene11 substansen som skal bestemmes og et eller fle e antistoffer, hvori en del eller flere deler av komplekset kan være merket, hvorved så påvisningen og/eller den kvantitative bestemmelsen av "antigenet" etter separasjon fra det komplekse merkede "antigenet" eller antistoffet blir mulig. I tilfelle en konkurrerende immunologisk måleteknikk ligger den "antigene" substansen i en væskeprøve som skal undersøkes i konkurranse med en kjent mengde av et merket "antigen" for en begrenset mengde antistoffbindingssteder. Derfor er mengden av det merkede "antigenet" som er bundet til antistoffene omvendt proporsjonal med mengden av "antigenet" i prøven. Immunometriske metoder anvender derimot merkede antistoffer. Ved en slik bestemmelse er mengden av det merkede antistoffet som er bundet til komplekset proporsjonalt med mengden av den "antigene" substansen som foreligger i væskeprøven. Immunometriske bestemmelser er spesielt egnet for påvisning av polyvalente "antigener", dvs. "antigene" substanser som er istand til å danne et kompleks samtidig med to eller flere antistoffer. Ved slike bestemmelser anvendes typisk en mengde av et ikke-merket antistoff bundet til en fast bærer, som er uløselig i væsken som skal undersøkes, og en mengde av et løselig antistoff som inneholder en merking, slik at påvisningen og/eller en kvantitativ bestemmelse av mengden av det ternære kompleks som dannes mellom fastfase-antistoffet, "antigenet" og det merkede

antistoff blir mulig.

I den anledning bringes normalt først antistoffet som er bundet til den faste fase i kontakt med prøven som skal under-søkes for å ekstrahere "antigenet" fra prøven ved dannelse av et binært fastfase-antistoff:antigen-kompleks. Etter en egnet inkubasjonstid vaskes den faste bæreren for å fjerne resten av væskeprøven innbefattet ikke-omsatt "antigen", hvis sådant er tilstede, og bringes så i kontakt med en løsning som inneholder en kjent mengde av det merkede antistoff.

Etter en andre inkubasjonsperiode, ved hvilken man lar det merkede antistoff danne et kompleks med "antigenet", som er bundet til den faste bærer gjennom det ikke-merkede antistoffet, vaskes den faste fasen en andre gang for å fjerne ikke-omsatt merket antistoff. I en enkel "ja-nei"-bestemmelse for å avgjøre om antigenet er tilsteds i prøver, som skal undersøkes, unaersøkes den vaskede faste bærer. Mengden av det påviste merkede antistoff sammenlignes med mengden av en negativ kontrollprøve som er fri for "antigenet". Påvisningen av merket antistoff i mengder som ligger betydelig over bakgrunnsnivået, som angis gjennom en negativ kontroll, viser så nærværet av det mistenkte antigen. Kvantitative påvisninger er mulig, idet man sammenligner målin-gene av merkede antistoffer som man får med kalibrerte prøver inneholdende kjente mengder av "antigenet". - Denne form for målinger kalles ofte en "to-steds<M-> eller "sandwich"-måling, fordi antigenet har bundet to antistoffer til forskjellige steder av overflaten sin.

Ved de foran beskrevne bestemmelser kommer f.eks. vanlige bærere såsom glass, polystyren, polypropylen, polyetylen, dekstran, nylon, amylase, naturlig eller kjemisk endret cellu-lose, polyakrylamider, agarose eller magnetit i betraktning som bærer, og som markør enzymer, radioaktive isotoper, metallgelater eller fluorescerende, kjemiluminescerende og bioluminescerende forbindelser.

Som enzymer nevnes f.eks. malatdehydrogenase, stafylokok-kalnuklease, delta-5-steroidisomerase, a-glyserolfosfatdehydro-genase, triosefosfatisomerase, pepperrot-peroksidase, alkalisk fdsfatase, asparaginase, glukoseoksidase, /3-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glukose-6-fosfatdehydrogenase, glukoamylase eller acetylkjolinesterase,

som radioaktive isotoper <3>H, 125I, 127I, 3<2>P, 35S og "c,

som fluorescerende forbindelse fluorescin-isotiocyanat, rodamin, fykoerytrin, fykocyanin, allofykocyanin, o-ftaldehyd eller fluorescamin,

som kjemiluminescerende forbindelser luminol, isoluminol, en aromatisk akridiniumester, imidazol, et akridiniumsalt eller en oksalsyreester og

som bioluminescerende forbindelser lusiferin, lusiferase eller ekvorin.

Videre kan et antistoff ifølge oppfinnelsen knyttes til et lavmolekylært hapten såsom biotin, dinitrofenyl, pyridoksal eller fluorescamin. Disse haptener kan så erkjennes ved en videre spesifikk reaksjon, f.eks. biotin ved hjelp av avidin eller fluorescamin ved hjelp av et spesifikt antihapten-antistoff.

Videre kan aktiviteten til et enzym som er benyttet som markør anvendes for å forsterke signalet som skal måles.

Spesielt foretrekkes imidlertid anvendelsen av pepperrot-peroksidase som markør, da dette enzymet kan reagere med tallrike substrater. Dessuten er det relativt lite og kan meget lett knyttes til et antistoff, f.eks. ved hjelp av perjodatmetoden.

For påvisning eller for kvantitativ bestemmelse av et omega-interferon, fortrinnsvis av IFN-omegal, kommer likevel fortrinnsvis, hvis IFN-omega er radioaktivt merket, den kompeti-tive radioaktive immunologiske måling (RIA), ved hvilken spe-sielle polyklonale antistoffer, henholdsvis antistoffsera anvendes, den immunoradiometriske måling (IRMA) hvis antistoffene er radioaktivt merket, og den "enzymbundede immunosorbsjonsmåling<n >(ELISA), hvis antistoffene er merket med et enzym, i betraktning.

Ifølge oppfinnelsen påvises IFN-omega, fortrinnsvis imidlertid IFN-omegal, i en væske som skal undersøkes, henholdsvis bestemmes kvantitativt, som følger: a) Ved kontakt av en prøve som skal undersøkes med en bærer, hvortil et polyklonalt eller monoklonalt antistoff mot det IFN-omega som skal bestemmes er bundet, og b) måling av dannelsen av det ifølge a) dannede binære kompleks under utforming av et ternært kompleks mellom et merket

monoklonalt antistoff og det ifølge a) dannede binære kompleks.

De nødvendige omega-interferoner for gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse er gjenstand for EP-A-0.170.204 , henholdsvis de monoklonale antistoffer som ikke er beskrevet i den foreliggende oppfinnelse, f.eks. antistoffet OMG-2 er gjenstand for EP-A-0.236.92 0, det samme gjelder for hybridinter-feronene som anvendes for immuniseringen. De anvendte polyklonale antistoffer får man ved fremgangsmåter som er kjent fra litteraturen.

De følgende eksempler skal belyse oppfinnelsen nærmere uten imidlertid i innskrenke denne:

Eksempel 1

Fremstilling av monoklonale antistoffer som er spesifikke for IFN- omega

a) Immunisering

En ca. 8 uker gammel Balb/c-hunnmus ble immunisert med

sterkt renset (renhet > 95%) hybridinterferon TFN-omega/a2 som følger:

1. Immuniser ing: 200 jxg i fullstendig Freunds adjuvans, intraperitonealt 2. Immunisering: 200 fig i fullstendig Freunds adjuvans, intreperitonealt, 5 uker etter den første immunisering. 8 måneder etter den andre immuniseringen ble musene injisert videre med 70 fig renset IFN-omegal (renhet > 90%)

(ufullstendig adjuvans, intraperitonealt). 12 dager senere ble en serumprøve tatt ut. Nøytraliseringsforsøk viste at musens serum nå hadde relativt store mengder av nøyatraliserende antistoffer mot IFN-omegal (fullstendig nøytralisering ved opptil 1000 gangers fortynning av serumet, delvis nøytralisering ved 10 000 gangers fortynning). Nøytraliseringsforsøket ble utført som følger: 100 ^1 av en fortynning av serumprøven i cellekulturmedium ble inkubert med 100 /j1 av en løsning av IFN-omegal (100 antivirusenheter/ml) og inkubert 90 minutter ved 37°C. Så ble

antivirusaktiviteten til prøvene undersøkt i biologiske forsøk (A549 lungekarzinom-celler, ensefalomyocarditis-virus). 5 uker etter den tredje immuniseringen ble musene igjen injisert med 70 nq renset IFN-omegal (renhet > 90%) uten adjuvans.

b) Fremstilling og utplukking av hybridomer

Fremstillingen av hybridomer foregikk etter den metoden som

opprinnelig ble utviklet av Kohler og Milstein (Nature 256. 495

(1975)) under anvendelse av den ikke-sezernerende cellelinje P3X63Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, 1548 (1979)). Man gikk da frem som følger: 4 dager etter den siste immunisering (se ovenfor) ble milten tatt ut av musen; miltcellene ble løst fra vevsforbindel-sen mekanisk, oppslemmet i cellekulturmedium (RPMI 1640 medium med tilsetning av natrium-penicillin G (100 enheter/ml) og streptomycinsulfat (50 enheter/ml) og samlet ved sentrifugering (Beckmann TJ-6 sentrifuge, 10 minutter ved 1000 omdr./min.). 2 x 10<8> myelomceller (dyrket i cellekulturmedium som ovenfor med tilsetning av 10% kalvefosterserum) ble likeledes samlet ved sentrifugering og vasket 1 gang med serumfritt cellekulturmedium. Miltceller av myelomceller ble tilslutt gjenoppslemmet til serumfritt cellekulturmedium, suspensjonene slått sammen og sentrifugert på nytt. Supernatanten ble fjernet, cellene ble oppslemmet i 3 ml fusjonsmedium (45% RPMI 1640.medium, 50% polyetylenglykol 4000, 5% dimetylsulfoksid) og rystet forsiktig i 90 sekunder, fikk så stå videre i 60 sekunder. 3 ml serumfritt kulturmedium ble nå tilsatt dråpevis over 9 0 sekunder, suspensjonen fikk stå 60 sekunder, deretter ble ytterligere 6 ml serumfritt kulturmedium tilsatt dråpevis over 9 0 sekunder. Til slutt ble 12 ml kulturmedium med 10% kalvefosterserum tilsatt langsomt under stadig røring, fikk stå 10 minutter og ble så fylt opp til 50 ml med cellekulturmedium med 10% kalvefosterserum. Cellene ble samlet ved sentrifugering, oppslemmet i 400 ml cellekulturmedium med tilsetning av 2 0% kalvefosterserum samt av hypoksantin (10"*M) , aminopterin (4 x 10-<7>M) og tymidin (1,6 x 10"5M) , i det følgende kalt HAT-medium. Denne suspensjonen ble videre tilsatt peritoneale makrofager fra Balb/c-mus (ca. 50 000/ml); suspensjo nen ble tilslutt pipettert i cellekulturplater (48 fordypninger pr. plate; 0,5 ml pr. fordypning). Platene ble satt ved 37°C (95% luft, 5% C02, vanndampmetning). Etter 3 dager ble hver kultur tilsatt 0,5 ml HAT-medium. Av de tilsammen 800 igangsatte kulturer viste etter 2-3 uker ca. 3 00 kulturer vekst av hybridom-celler. Den etterfølgende utplukking ble foretatt som følger: Kultursupernatanter av minst 10-20% konfluente hybridon-kulturer ble blandet med like volumdeler av en løsning av HuIFN-omegal (20 antivirusenheter/ml), inkubert 90 minutter ved 37°C og så undersøkt med hensyn på sin antivirusaktivitet. Alle kulturer ble prøvet minst to ganger med avstander på en uke hver gang. Fem av kulturene, i det følgende kalt OMG-4, OMG-5, OMG-6, OMG-7 OG OMG-8 viste i alle forsøk vedvarende en reduksjon av antivirusaktiviteten. Alle kulturer ble klonet ved begrensende fortynning, klonene ble prøvet på nytt i den beskrevne metode med hensyn til nøytraliserende aktivitet. Fra hver kultur ble 3-5 positive kloner slått sammen. For antistoffproduksjon in vivo ble fra hver av hybridomkulturene 3-10xl0<6> celler inokulert intreperitonealt i Balb/c-mus, i hvilke det 2-3 dager forut var blitt injisert 0,5 ml ufullstendig Freunds adjuvans eller ogvå 7-10 dager forut 0,5 ml tristan. Etter 7-21 dager ble den dannede bukvatersotvæske tatt ut, antistoffene deri ble anriket ved utfelling med 50% ammoniumsulfat og affinitetskromatografi over bærerbundet protein A etter kjente metoder til over 90% renhet. Pr. ml bukvatersotvæske fikk man ved alle hybridomer ca. 2-5 mg rene antistoffer.

c) Karakterisering av antistoffene OMG- 4, OMG- 5 OG OMG- 7

Alle antistoffer viste i natriumdodecylsulfat-polyakryl-amid-elektroforesen under ikke-reduserende betingelser samt i gelgjennomstrengnings-høytrykksvæskekromatografi et retensjons-forhold som var identisk med et IgG-markørprotein og er således av IgG-typen. I et nøytraliseringsforsøk hvori hemningen av antivirusvirkningen til interferoner ble prøvet (se ovenfor), nøytraliserte alle antistoffer ved en konsentrasjon på 100 /Ltg/ml aktiviteten til IFN-omegal, men ikke til IFN-a2c, IFN-/3 eller IFN-gamma. Disse 3 kloner ble deponert ifølge Budapest-konvensjo-nen hos European Collection of Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom, den 14. august 1987 under ECACC-nummerne 87081401 (OMG-4), 87081402 (OMG-5) og 87081403 (OMG-7).

Eksempel 2

Enzymimmunologiske bestemmelser ( ELISA) for IFN- omegal Antistoffene OMG-5 og OMG-7 ble bundet etter kjente metoder (se f.eks. Wilson M.B. og Nakane P.K., i Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Herausgeber W. Knapp et al., S. 215-224; Elsevier 1978) kovalent til pepperrot-peroksidase. Derunder gikk man frem som følger: 2 mg pepperrot-peroksidase i vann ble blandet med 0,2 ml 100 mM natriumperjodat og rystet 40 minutter ved romtemperatur, dialysert med 2 x 500 ml 1 mM natriumacetat pH 4,4 natten over ved 4°C; deretter ble løsningen innstilt med 0,1 M NaHC03 pH 9,5 på en pH på ca. 9. Denne løsningen ble tilsatt en løsning av monoklonale antistiffer OMG-5, 2 ml med 1,6 mg/ml eller OMG-7; 1,5 ml med 4,7 mg/ml, i 10 mM NaHC03 pH 9,5) og rystet 2 timer ved romtemperatur. 100 /il av en løsning av NaBHA (4 mg/ml vann) ble tilsatt, og løsningen ble inkubert 2 timer til i isbad; så ble 3 ml kald metten ammoniumsulfatløsning dryppet til og inkubert 1 time i isbad. Den dannede felling av peroksidase-immunoglobulin-konjugat ble samlet ved sentrifugering, oppløst i 1 ml fosfatbufret isoton koksaltløsning pH 7,4 og stabilisert ved tilsetning av 1 ml løsning kvegserumalbumin (10 mg/ml i fosfatbufret koksaltløsning). Løsningen ble nedfrosset ved -70°C.

Fastfase-sandwich-enzymimmunologiske bestemmelser for IFN-omegal ble utført etter alminnelig kjente fremgangsmåter (se f.eks. Berthold, W., Merk, W. og Adolf, G.R., Arzneim.-Forschung./Drug Res. 35, 364-369 (1985)). Derunder anvendtes for belegg av mikrotiter-ELISA-forsøksplatene de monoklonale antistoffer monoklonale antistoffer 0MG-2, OMG-5 eller OMG-7 i en konsentrasjon på 10 /ig/ml i 0,1 M natriumkarbonat pH 9,5 (100/il pr. fordypning) og platene ble enten inkubert 1 time ved romtemperatur eller natten over ved 4-8°C. Antistoffløsningen ble fjernet, fordypningene ble vasket med 2 00 /ul vann hver og med 100 /il av en løsning av kvegserumalbumin (5 mg/ml) i fosfatbufret, isoton koksaltløsning pH 7,4 (i det følgende kalt PBS/BSA). Så ble 100/il av en løsning av IFN-omegal tilsatt i en konsentrasjon på 20 ng/ml, gjennomblandet og en fortynningsrekke fremstilt ved seriemessig overføring av hver gang 100/il. Til slutt ble alle fordypninger tilsatt 50 /il av en løsning av antistoff-enzym-konjugatet (0MG-5/peroksidase eller OMG-7/peroksidase, stammeløs-ning (se ovenfor) fortynnet 1:10 000 i PBS/BSA), og platene ble inkubert 3 timer ved romtemperatur. Så ble løsningen fjernet, fordypningene vasket tre ganger med vann og fylt hver med 100 /il substratløsning (ortofenylendiamin, 3 mg/ml og natriumperborat, 1 mg/ml i 0,067 M kaliumsitrat pH 5). Etter 30 minutters inkube-ring ved romtemperatur pipettertes til hver fordypning 100 /il 4 N svovelsyre; så ble den optiske tetthet målt ved 492 nm i et flerkanals fotometer (ELISA-leseapparat).

Med alle heterologe kombinasjoner av belegg-antistoffer og antistoff-peroksidase-konjugat ble doseavhengige absorpsjons-forandringer tilstrebet. Fig. 1, 2 og 3 viser kurvene man fikk.

Til belegg kunne også et kanin-anti-IFN-omegal-immunoglobulin oppnådd ved to gangers immunisering av en kanin med IFN-omegal og partiell rensning fra serumet ved utfelling med 50% ammoniumsulfat anvendes i en konsentrasjon på 10 /ig/ml (se fig. 4) .

Spesifiteten til denne ELISA som bygger på antistoffet OMG-2 (se EP-A-0.23 6.920) og peroksidasebundet antistoff OMG-7 (se fig. 2) for IFN-omega ble prøvet, idet preparater av andre humaninterferoner ble påført i et meget bredt konsentrasjons-område. Følgende interferoner ble derunder anvendt:

Derunder observertes ved en sensitivitet på 100 pg/ml for IFN-omegal uten noen av preparatene uten noen konsentrasjon et signifikant signal. ELISA kan derfor ikke bare anvendes for kvantifisering av rekombinant IFN-omegal, men også f.eks. for bestemmelse av andelen av IFN-omegal i leukosytinterferon eller andre interferonpreparater som stammer fra cellekulturer.

Eksempel 3

Immunradiometrisk bestemmelse ( IRMA) for IFN- omegal Antistoffet OMG-7 ble radioaktivt merket etter en i og for seg kjent metode med hjelp av N-succinimidyl[2,3-<3>H]propionat (<3>H-NSP, firma Amersham International, England; 110 Ci/mMol). Herunder ble 1 mCi av løsningen av <3->H-NSP i en silikonisert prøvebeholder inndampet til tørrhet i vakuum. Deretter ble 50 ug av en løsning av det monoklonale antistoff OMG-7 (4,7 mg/ml) pipettert til i en bufret koksaltløsning pH 7,4 og 3 /il 1 M boratbuffer pH 8,5 tilsatt. Etter 24 timer ved 4°C ble overskud-det av <3>H-NSP med 20 /il 1 M glycin i boratbuffer, fortynnet med 250 /il 50 mM kaliumf osf atbuf f er pH 7,4, med 150 mM NaCla og 5 mg/ml kvegserumalbumin og separert over en Sephadex G 50 M-søyle (0,5 x 20 cm) av merkede antistoffer. Antistoffene viste en spesifikk aktivitet på ca. 10 Ci/g protein.

For å gjennomføre forsøket ble etsede polystyrenkuler (diameter 6,5 mm; firma Northumbria Biologicals, England) belagt med antistoffet OMG-2 (10 /ig/ml i 0,1 M natriumkarbonat pH 9,5; 1 time ved romtemperatur). Kulene ble inkubert i PBS/BSA (se eksempel 2) en time og deretter vasket to ganger med 250 /il vann hver gang. Kulene ble inkubert i egnede eprokuvetter med 200 /il i hver av en løsning av IFN-omegal i økende konsentrasjoner i PBS/BSA 3 timer ved 4°C og vasket tre ganger med 250 /il vann. Så ble 2 00 /il av en løsning av det merkede antistoff (100 ng/ml PBS/BSA; pr. rør ca. 27 000 impulser/minutt) tilsatt og inkubert 20 timer ved 4°C. Deretter ble kulene vasket tre ganger med 20 /il vann, overført til polypropylenrør og den bundne radioaktivitet målt etter tilsetning av 4 ml szintillatorcoctail i væskeszintil-lasjonstelleren. Fig. 5 viser den bundede radioaktiviteten som funksjon av interferonkonsentrasjonen.

Claims (9)

1. Hybridomcellelinjer som kan dyrkes in vitro eller in vivo, fremstilt ved cellefusjon av miltceller fra et forsøksdyr som er immunisert med et IFN-omega eller med et hybridinterferon, bestående av én del IFN-omega og én del IFN-a, hvilket dyr deretter igjen var immunisert med et IFN-omega, med myelomceller, karakterisert ved at disse produserer antistoffer som nøytraliserer aktiviteten til et IFN-omega, men ikke til IFN-/3, IFN-"y eller et a-interferon.

2. Hybridomcellelinjer ifølge krav 1, karakterisert ved at den første immunisering ble foretatt med IFN-omegal eller IFN-omegal/a2 og den andre immunisering med IFN-omegal, og som miltceller anvendes sådanne fra Balb/c-mus og som myelomceller sådanne av linjen P3X63Ag8.653 .

3. Hybridomcellelinjer ifølge kravene 1 og 2, karakterisert ved at de har betegnelsen OMG-4 (deponert under ECACC-nummer 87081401), OMG-5 (deponert under ECACC-nummer 87081402) og OMG-7 (deponert under ECACC-nummer 87081403).

4. Monoklonale antistoffer mot IFN-omega av IgG-typen for anvendelse in vitro, karakterisert ved at disse i en konsentrasjon på 100 /xg/ml nøytraliserer aktiviteten til IFN-omega, men ikke til IFN-a2c, IFN-/3 eller IFN-7, og eventuelt er merkede.

5. Monoklonale antistoffer ifølge krav 4, karakterisert ved at disse er dannet med klonene OMG-4, OMG-5 og OMG-7, som er deponert under ECACC-nummerne 87081401, 87081402 og 87081403.

6. Anvendelse av de nye monoklonale antistoffer ifølge krav ■ # W I 4 eller 5, eventuelt bundet kovalent til en egnet aktivert bærer, for rensing, påvisning eller kvantitativ bestemmelse av omega-interferoner in vitro.

7. Anvendelse ifølge krav 6 ved påvisning av IFN-omega in vitro, hvori en prøve inkuberes med et antistoff ifølge krav 4 eller 5, og reaksjonen av antistoff med IFN-omega registreres.

8. Anvendelse ifølge krav 6 eller 7 ved påvisning eller ved kvantitativ bestemmelse av IFN-omega in vitro, hvori en prøve a) inkuberes med et monoklonalt eller polyklonalt antistoff mot IFN-omega, som er bundet til en bærer, b) den således erholdte prøve blandes med et antistoff ifølge krav 4 og 5, og c) innholdet av det således bundede antistoff ifølge krav 4 og 5 registreres eller bestemmes.

9. Sett egnet for påvisning av IFN-omega, men som ikke erkjenner I FN av typene a, ( 3 eller 7, karakterisert ved at dette inneholder et monoklonalt antistoff ifølge kravene 4 og 5, eventuelt i form av en fast fase, hvortil a) et monoklonalt eller polyklonalt antistoff mot IFN-u er bundet, og b) det dannede binære kompleks bestemmes ved hjelp av et monoklonalt antistoff ifølge krav 4.