PT85830B

PT85830B - Processo para a preparacao de novos anticorpos monoclonais contra interferao omega (ifn-omega) e para a purificacao bem como para a analise de ifn-omega

Info

Publication number: PT85830B
Application number: PT85830A
Authority: PT
Inventors: Guenther Adolf
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1986-10-01
Filing date: 1987-09-30
Publication date: 1990-07-31
Also published as: IE872625L; AU7921787A; DD269165A5; FI874273A; IL84040A; DK513687A; NO874107D0; GR3006846T3; IE59836B1; NO173831B; EP0262571A2; PT85830A; JPS63105673A; NZ222006A; ATE83262T1; ZA877354B; DE3783002D1; NO173831C; DK513687D0; FI92716B

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de EOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em D-65C7 Ingelheim am Rhein, República Federal Alemã, (inventor: Mag Dr. GÚnther Adolf, residente na AÚs tria) para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS ANTICORPOS RONOCLONAIS CONTRA INTERFERAO ÓMEGA (IFN-ÓMEGA) E PARA A PURIFICAÇÃO BEM COMO PARA A ANÃLISE DE IFN-ÓMEGA¹¹ .

MEMÓRIA DESCRITIVA

Em Nucleic Acids Res. 13., 4739-4749 (1985) foram descritos novos interferães de tipo I, os quais diferem essencialmente na sua estrutura e nas suas propriedades antigéncas dos interferães <x e β até agora conhecidos. Esta nova classe de interferães foi em consequência desiganada por IFN-Ómega.

Além disso foi possível aperfeiçoar acentuadamente a purificação do IFN-ómega por de meio de novos anticorpos monoclonais descritos no pedido da Patebte Europeia (EP-A) -0 236 920, publicado em 16 de Setembro de 1987 por exemplo, os novos anticorpos monoclonais OMG-2.. Estes anticorpos apresentam, no entanto, especificidade tanto para IFN-* como para IFN-ómega. Por meio dos anticorpos descritos neste pedido de patente não foi possível, no entanto, estabelecer um método de análise imunológico para análise do IFN-ómega, porque a fracção dos anticorpos es-

peclficos do IFN-ómega na imunoglobulina policlonal que foi utilizada para revestimento, era demasiado reduzida. Para além disso um ensaio deste tipo não seria especifico para IFN-ómega, porque tal como foi mencionado acima, tanto os anticorpos monoclonais como também os policlonais reconheceriam o IFN-*.

As análises quantitativa e qualitativa do IFN-ómega tinham, por consequência, até agora de ser levadas a cabo exclusivamente por meio de ensaios biológicos, como por exemplo a medição da actividade antiviral. Estes métodos de análise são em geral muito sensiveis, mas são ao mesmo tempo demorados e trabalhosos, bem como de baixa precisão. 0 estabelecimento de análises imunológicas, por exemplo duma análise do tipo ELISA ou IRMA, por meio dos quais é possivei uma determinação do IFN-ómega simples, rápida e exacta, era por consequência inimaginável. Uma vez que o IFN-ómega se apresenta em solução sob a forma de monómero são necessários porém para de estabelecimento dum ensaio semelhante pelo menos dois anticorpos, os quais podem reconhecer diferentes epitopos da molécula do IFN, não sendo contudo necessário anticorpos monoclonais embora apresentem numerosas vantagens em comparação com anti-soros .

Surpreendentemente foi agora descoberto que o problema mencionado poderá ser remediado por meio dos novos anticorpos monoclonais. Os anticorpos preparados de acordo com a presente invenção são especificos para o IFN-ómega e as análises imunológicas preparadas cora a sua ajuda permitem a análise qualitativa e quantitativa de IFN-ómega, não reagindo, no entanto, a outros interferões humanos como o IFN-α, o IFN-/3 ou o iFN-gama.

objecto da presente invenção compreende assim processos para a preparação de novos anticorpos monoclonais, os quais reagem especificamente com interferão humano do tipo IFN—ómega, mas não, contudo com outros interferões humanos, e processos para a purificação de IFN-ómega e para a detecção de IFN-ómega mediante o uso des-

tes anticorpos, por exemplo, por meio de análises imunológicas nas quais estes anticorpos podem ser utilizados para a detecção especifica de interferoes humanos do tipo IFN-ómega, sendo possivel adicionalmente utilizar anticorpos policlonais.

De acordo com a presente invenção procedeu-se para a preparação dos anticorpos indicados como se indica a seguir:

As linhas de células de hibridomas produtoras de anticorpos necessárias obtém-se através de fusão de células de baço (ver Kohler e Milstein em Nature 256, 495-497 (1975)) dos correspondentes animais de experiência imunizados, por exemplo, células de baço de rato, com células de mieloma, as quais de preferência não produzem elas próprias quaisquer anticorpos, por exemplo, com células de mieloma da linha p3X63Ag8.653 (ver Kearney et al. em J. Immunol. 123 1548 (1979)). Este processo é cons tituido fundamentalmente por se injectar um rato ou outro animal apropriado com um imunogênio. Em seguida fundem-se as células do baço retiradas dos ratos imunizados, cujo· soro contém anticorpos contra o imunogênio injectado, com células de mieloma. Obtêm-se células hibridas, as quais são- qualificadas de hibridomas, que se reproduzem in vitro.

A população do hibridoma é analisada e manipulada, de tal modo que se separam clones isolados, dos quais cada um se separa uma única espécie de anticorpos especifica para antigênios. Cada uma destas espécies de anticorpos individuais obtidas deste modo é o produto de uma única célula B do animal imunizado, a qual foi gerada como reacção a uma estrutura imunogénica especifica da substância imunogénica. Se se introduzir uma substância imunogénica num hospedeiro vivo, o sistema imunitário do hospedeiro reage com formação de anticorpos contra todos os sítios da substância imunogénica reconhecíveis. Este efeito, nomeadamente a formação de anticorpos que combatem contra o intruso, consiste, portanto, na formação de anticorpos de diferentes afinidades e especifici-

dades perante a substância imunogénica.

Uma vez gue a análise imunométrica de dois sítios depende da formação de uma sandwich anticorpo: an tigénio: anticorpo, são escolhidos em geral dois anticorpos monoclonais diferentes, que não se estorvem um ao outro na ligação ao antigénio.

No caso presente, os animais de experiência foram pré-imunizados com IFN-ómega ou com um interferão híbrido composto por uma parte de IFN-ómega 1 e de uma par te de IFN-oÇ de preferência com IFN-ómega 1 ou com IFN-óme ga 1/(X2, e em seguida foram novamente imunizados com um IFN-ómega, de preferência com IFN-ómega 1.

Na fusão de células que se segue foram obtidas culturas de hibridomas, as quais foram de seguida sujeitas a uma selecção para se identificarem os clones que produzem anticorpos dirigidos contra IFN-ómega. Para isso foram utilizados ensaios biológicos preferidos, por exemplo, ensaios que possam provar a neutralização da actividade biológica de um IFN-ómega, por exemplo, o da actividade antiviral, através dos anticorpos formadas.

Das cinco culturas obtidas deste modo, as quais foram denominadas por OMG-4, OMG-5, OMG-6, QMG-7 e OMG-8 e que demonstraram uma redução constante da actividade antiviral do IFN-ómega, foram seleccionados os clones OMG-4, OMG-5 e GMG-7 para produção de anticorpos.

Para isso as linhas de hibridomas escolhidos podem, ser cultivadas in vitro ou in vivo, sendo no entanto preferida a cultura in vivo.

Células dos clones escolhidos foram inoculadas em ratos Balb/c tratados com pristano ou com adjuvan te de Freund incompleto (ver por exemplo Muller et al, em J. Immunol. Methods 87, 193-196 (1986)). Após 7 a 8 dias foi recolhido o líquido ascítico e os anticorpos obtidos a partir deste foram purificados ou isolados por meio de precipitação com. sulfato de amónio seguida de cromatografia de afinidade ou de outros métodos conhecidos da literatura.

Naturalmente o anticorpo pretendido pode de modo análogo ser isolado ou purificado a partir de um sobrenadante duma cultura de células in vitro corresponden te.

Como já foi anteriormente mencionado, os novos anticorpos preparados de acordo com a presente inven ção podem ser utilizados para purificação e para análise de IFN-ómega, de preferência de IFN-ómega 1.

Quando o anticorpo obtido de acordo com. o processo da presente invenção for empregado para se obter um IFN-ómega de alta pureza, utiliza-se de preferência ligado a um suporte biológico inactivo através de uma ligação covalente. A ligação covalente do anticorpo realiza-se num suporte activo apropriado, de preferência à base de dextra no, por exemplo, em Sepharose activada com CNBr ou Sepharose activada com CH da firma Pharmacia, Uppsala. Para se obter uma alta pureza foi bombeada uma solução dos interferÕes ómega 1 a purificar, a qual foi obtida de modo conveniente, ou de acordo com o procedimento descrito em EP-A-0 170 204 ou de acordo com a presente invenção, com ajuda dos novos plasmideos descritos em EP-A-0 236 920, a pH básico fraco, por exemplo com um pH de 7 a 8, de preferência, no entanto, com um pH de 7,5, sobre um suporte de afinidade de anticorpos assim preparados, lavado tanto tem po a pH 7,5 quanto necessário para que o eluido fique isen to de proteínas e em seguida elui-se o interferão ligado em meio ácido, por exemplo por meio de ácido cítrico G,1 molar em etilenoglicol a 25%. As fracções contendo proteínas assim obtidas são, em seguida, cromatografadas num per mutador de catiões fortemente ácido, per exemplo o permutador de catiões iíono-S de firma Pharmacia. Nesta operação o interferão humano do eluido foi imediatamente absorvido na coluna do permutador de catiões e eluido em seguida com ajuda de um gradiente de NaCl.

Quando de analise qualitativamente ou qua ntitativamente um interferão ómega, por exemplo IFN-ómega 1 como antigene por meio dos novos anticorpos, é possível

utilizar para esse efeito as técnicas de análise imunológi ca usuais.

As técnicas baseiam-se na formação de um complexo entre a substância antigénica a determina e um ou mais anticorpos# podendo uma parte ou várias partes do complexo ser marcadas tornando—se deste modo possível a análise qualitativa e/ou quantitativa do antigene após a eliminação do antigene ou do anticorpo marcado do comple xo.

No caso de uma técnica de análise imunoló gica competitiva# a substância antigénica numa amostra de líquido a analisar fica em. competição com uma quantidade conhecida de um antigene marcado para uma quantidade limitada em sítios de ligação em anticorpos. Assim a quantidade do antigene marcado ligado ao anticorpo é inversamente proporcional à quantidade do antigene na amostra.

Em métodos imunométricos utilizam-se pelo contrário anticorpos marcados. Numa análise deste tipo a quantidade do anticorpo marcado ligado com o complexo é proporcional à quantidade da substância antigénica contida na amostra líquida.

As análises imunométricas são apropriadas principalmente# para análise de antigenes polivalentes# isto é# de substâncias antigénicas# que possuem a capaci dade de formar um complexo com dois ou mais anticorpos simultâneamente. Nestas análises é utilizada vulgarmente uma quantidade dum anticorpo não marcado ligado a um suporte que é insolúvel no líquido a analisar e uma quantidade de um anticorpo solúvel# que contém uma marcação# de modo que a análise qualitativa e/ou quantitativa da quantidade do complexo ternário# que se formou entre o anticorpo da fase sólida# o antigene e o anticorpo marcado, se torne possi vel.

Para esse fim o anticorpo combinado na fase sólida é posto em contacto normalmente# em primeiro lugar com a amostra a analisar com a finalidade de extrair o antigene da amostra através da formação de um complexo

binário fase sólida-anticorpo: antigene. Após um pericdo de incubação apropriado# o suporte sólido é lavado# para remover o resto da amostra líquida# incluindo antigene não convertido# caso existente# e posto em contacto em seguida com uma solução que contém uma quantidade conhecida do anticorpo marcado.

Após um segundo período de incubação# no qual se deixa que os anticorpos marcados formem um complexo com o “antigene# que está ligado ao suporte sólido através do anticorpo não marcado, o suporte sólido é lavado uma segunda vez# de modo a remover o anticorpo marcado não transformado. Verificou-se# através duma simples análise de Sim-Não no suporte sólido lavado se existe antigénio na amostra a analisar. A quantidade do anticorpo mar cado detectado foi comparada com uma amostra de controle negativa isenta de antigene. A análise de anticorpos mar cados em quantidades que são consideravelmente superiores aos níveis de fundo# por comparação com um controle negativo# revela então a presença do antigene suspeitado. São possíveis análises quantitativas por comparação das determinações efectuadas com anticorpos marcados com amostras calibradas contendo quantidades conhecidas do antigene. Esta técnica da análise foi frequentemente designada como um ensaio de dois sítios ou ensaio de Sandwich porque o antigene se ligou a dois anticorpos em locais diferentes da sua superfície.

Nas análises anteriormente descritas são de considerar# por exemplo: como suporte um dos suportes usuais# como vidro# polistireno, polipropileno# polietileno# dextrano# nylon# amilase# celulose natural ou quimicamente modificada# poliacrilamida# agarose ou magnetite e como marcador enzimas# radioisótopos# quelatos metálicos ou compostos fluorescentes# quimioluminescentes ou bioluminescentes.

São de referir como enzimas, por exemplo# malato-de-hidrogenase, nuclease de estafilococos# delta-57

-esteroideisomerase,o- -glicerina-fosfatode-hidrogenase, triosefosfatoisomerase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, asparaginase, glucoseoxidase,^-galactosídase, ri bonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato-de-hidroge nase, glucoamilase ou acetilcolinesterase, como radioisótopos ³h, ¹²⁵i, ¹²⁷I, ^²p, ³⁵S e ¹⁴C, como compostos fluorescentes isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftal deido ou fluorescamina, como compostos quimioluminescentes luminol, isoluminol, um ester aromático de acridinio, imidazol, um sal de acridinio ou um éster do ácido oxálico e como compostos bioluminescentes luciferina, luciferase ou eqorina.

Além disso, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser acoplado com um hapteno de peso molecular baixo como biotina, dinitrofenilo, piridoxal ou fluorescamina. Estes haptenos podem em seguida ser reconhe eidos através duma reacção especifica adicional, por exemplo, a biotina por meio de avidina ou a fluorescamina por meio de um anticorpo anti-hapteno.

Além disso a actividade duma enzima utili zada como marcador pode ser empregada para reforço dos sinais a medir.

É especialmente preferido, no entanto, o emprego de peroxidase de rábano como marcador, visto que esta enzima pode reagir com. numerosos substratos. Além disso é relativamente pequena e pode ser muito facilmente combinada com um anticorpo, por exemplo, por meio do método de periodato.

Para análise qualitativa ou quantitativa dum interferão-ómega, de preferência de IFN-ómega 1, interessa, no entanto, de preferência, caso o IFN-ómega esteja marcado por meio dum isótopo radioactivo, o ensaio radioimunológico (RIA) competitivo no qual se empregam especi almente anticorpos policlonais ou soro de anticorpos, o ensaio radioimunométrico (IRMA), caso o anticorpo esteja

marcado radioactivamente, e o enzym-lynked immunosorbent assay (ELISA), caso o anticorpo esteja marcado com uma en zima.

De acordo com a presente invenção, o IFN-ómega, de preferência o IFN-ómega 1, é analisado qualitativa ou quantitativamente num líquido a analisar da maneira que se segue:

a) Através do contacto de uma amostra a analisar com um suporte, ao qual está ligado um anticorpo policlonal ou monoclonal contra o IFN-ómega a determinar, e

b) Medição da formação de complexos binários formados de acordo com a) sob formação de um comple xo ternário entre um anticorpo monoclonal marcado e o complexo binário formado de acordo com a)

Os interferões indispensáveis à realização da presente invenção são objecto da patente europeia EP-A-0 170 204 e os anticorpos monoclonais não descritos na presente invenção, por exemplo do anticorpo OMG-2, são objecto da patente europeia EP-A-0 236 920, o mesmo sendo válido para os interferães híbridos empregados na imunização. Os anticorpos polidonais empregados são obtidos através de procedimentos conhecidos da literatura.

Os exemplos que se seguem destinam-se a ilustrar a presente invenção mais em pormenor, sem contudo reduzir o respectivo âmbito:

Exemplo 1

Preparação de anticorpos monoclonais específicos para IFN-ómega

a) Imunização

Um rato fêmea Ealb/c de cerca de oito semanas de idade foi imunizado com um interferão hibrido

IFN-ómega 1/Λ2 altamente purificado (Pureza) 95%) da manei ra que se segue:

l^â Imunização: 200 g de adjuvante de Freund completo_zintraperitonealmente.

2â imunização: 200 g de adjuvante de Freund complete# intraperitonealmente 5 semanas após a 1§ imunização.

Oito meses após a segunda imunização o ra to foi de novo imunizado com 70 ,Χ/g de IFN-ómega 1 purificado (Pureza > 90%) (adjuvante incompleto# intraperitonealmente) · Doze dias mais tarde colheu-se uma amostra de soro. Os ensaios de neutralização mostraram que o soro do rato apresenta a partir deste momento um titulo relativamente elevado de anticorpos de neutralização contra o IFN— -ómega 1 (neutralização completa com diluição do soro até 1000 vezes, neutralização parcial com diluição até 10 0G0 vezes). O ensaio de neutralização foi levado a cabo de acordo com a seguinte técnica: misturam-se 100 >CL de uma diluição da amostra de soro em meio de cultura de células com 100ML duma solução de IFN-ómega 1 (100 unidades anti virais/mL) e incuba-se durante 90 minutos a 37^0. Foi determinada em seguida a actividade antiviral da amostra em ensaios biológicos (células de carcinoma de pulmão A549# virus da encefalomiocardite).

Cinco semanas depois da terceira imunização o rato foi mais uma vez injectado com 7og de IFN-ómega 1 purificado (pureza > 90%) sem adjuvante.

b) Preparação e selecção de hibridomas

A preparação de hibridomas é levada a cabo segundo o método desenvolvido originalmente por Kohler e Milstein (Nature 256# 495 (1975)) por meio da utilização das linhas de células não segregantes P3X63Ag8.553 (Kearney et al.# J. Immunol. 123# 1548 (1979)). Para esse fim procedeu-se da seguinte maneira:

Quatro dias após a última imunização (ver acima) foi retirado o baço do rato; as células foram libertadas por meios mecânicos dos tecidos de ligação, suspensas em meio de cultura de células (meio RPMI 1640 com

adição de Penicilina B sólida (100 unidades/ml) e sulfato de estreptomicina (50 unidades/ml)) e isoladas por meio de centrifugação (centrifugadora Beckmann TJ-6, 10 minutos a 1000 rpm). Foram do mesmo modo isoladas 2x10 células de mieloma (cultivadas em meio de cultura de células como ací ma, com adição de 10% de soro fetal de vitela) por meio de centrifugação e lavadas uma vez cora meio de cultura de células isento de soro. Finalmente as células de baço e as células de mieloma foram ressuspensas em meio de cultura de células isento de soro, as suspensões foram reunidas e novamente foram centrifugadas. 0 sobrenadante foi removido, as células foram suspensas em 3 ml de meio da fusão (45 % de meio RPMI 1640, 50% de polietilenoglicol 4000, 5% de dimetilsulfóxido) e foram agitadas cuidadosamente durante 90 segundos e deixados repousar durante mais 60 segundos. Foram então adicionados goto a gota 3 ml de meio de cultura isento de soro durante 90 segundos, a suspensão foi deixada em repouso durante 60 segundos e em seguida foram, adicionados gota a gota mais 6 ml de meio de cultura isento de soro durante 90 segundos. Finalmente foram adicionados 12 ml de meio de cultura com 10% de soro de feto de vitela sob agitação contínua vagarosa, deixou-se repousar IG minutos e depois preencheu-se o volume a 50 ml com meio de cultira de células com 10% de soro de feto de vitela. As células foram isoladas por meio de centrifugação e suspensas em 400 ml de meio de cultura de células com adição de 20% de soro de feto de vitela bem como de hipotaxina (10“^ m), aminopterina (4 x 10 m) e timidina (1,6 x 10 M), designado seguidamente por meio HAT. Para esta suspensão foram ainda adicionados macrófagos peritoneais de rato Balb/c (cerca de 50 000/ml); a suspensão foi finalmente pipetada para placas de cultura de células (48 alvéolos por placa; 0,5 ml por alvéolo). As placas foram incubadas a 37²C (95% de ar, 5% de C0₂, vapor de água ao ponto de saturação). Após 3 dias foi adicionado a cada cultura 0,5 ml de meio HAT. Do total de 800 culturas, cerca de 300 mostraram após * duas a três semanas crescimento de células de hibridoma. A ¹¹

selecção que se segue foi levada a cabo do seguinte modo:

Os sobrenadantes de pelo menos 10 a 20 % das culturas de hibridomas foram misturados com igual volume de uma solução de HuIFN-ómega 1 (20 unidades antivirais/ml), foram incubadas durante 90 minutos a 372C e em seguida foi verificada a sua actividade antiviral. Todas as culturas foram verificadas pelo menos duas vezes com uma distância de uma semana. Cinco das culturas designadas seguidamente por OMG-4, 0MG-5, OMG-6, OMG-7 e OMG-8, mostraram em todas as experiências uma redução consistente da actividade antiviral. Todas as culturas foram clonadas por meio de diluição limitante e os clones foram novamente experimentados conforme o procedimento de actividade neutralizada descrito. De cada cultura foram reunidos de 3 a 5 clones positivos. Para produção de anticorpos in vivo foram inoculadas intraperitonealmente 3 a 10 x 10 células de cada uma das culturas de hibridomas em ratos Balb/c, nos quais tinha sido injectado intraperitonealmente 0,5 ml de adjuvante de Freund incompleto com dois ou três dias de antecedência ou 0,5 ml de pristano mas com sete a dez dias de antecedência. Após sete a 21 dias foi colhido o líquido ascitico formado. 0 anticorpo obtido foi enriquecido através de precipitação com 50 % de sulfato de amónio e cromatografia de afinidade sobre proteina A ligada ao suporte com. métodos conhecidos até uma pureza superior a 90 %. Foram, obtidos em todos os hibridomas cerca de 2 a 5 mg de anticorpos puros por ml de líquido ascitico.

c) Caracterização dos anticorpos 0I1G-4, 0MG-5 e 0MG-7

Todos os anticorpos apresentaram na elec— troforese em poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio em condições não redutoras bera como na cromatografia líquida de alta pressão de permeação em gel uma reacção idêntica à duma proteina marcada com IgG e são, portanto, do tipo IgG. Num teste de neutralização, no qual foi verificada a inibição da actividade antiviral de interferÕes (ver acima) todos os anticorpos neutralizaram, a uma concentração de

100 yg/ml/ a actividade do IFN-ómega 1 mas não a do IFN-K2c, do IFN-^ ou do IFN-gama. Estes 3 clones foram depositados ao abrigo do tratado de Budapeste na European Collection of Animal Cell CultureS/ PHCS Center for Applied Microbiology and Research/ Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG_Z Reino UnidO/ em 14 de Agosto de 1987 sob os números ECACC-87O814O1 (OMG-4), 87081402 (OMG-5) e 87081403 (OMG-7).

Exemplo 2

Ensaio imunológico por enzimas (ELISA) para IFN-ómega 1

Os anticorpos OMG-5 e 0MG-7 foram ligados por meio de ligação covalente a peroxidase de rábano de acordo com métodos conhecidos (ver, por exemplo, VJilson Μ. B. e Nakane Ρ. K., em Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Editor W. Knapp et al», págs. 215-224; Elsevier 1978). Para esse fim procedeu-se como se segue:

Ligaram-se 2mg de peroxidase de rábano em água com 0,2 ml de periodato de sódio 100 mM e agitou-se durante 40 minutos à temperatura ambiente, dialisou-se contra 2 x 500 ml de acetato de sódio 1 mM a pH 4,4 dum dia para o outro a 4^SC; em seguida o pH da solução foi ajustado com cerca de NaHCO^ 0,1 M de pH 9,5 a um pH de cerca de 9. A esta solução foi adicionada uma solução do anticorpo monoclonal (OMG—5, 2 ml com 1,6 mg/ml ou OMG-7, 1,5 ml com 4,7 mg/ml, em ambos os casos em NaHCO^ 10 mM, pH 9,5) e em seguida agitou-se durante duas horas à temperatura ambiente. Adicionaram-se 100 1 duma solução de

NaBH^ (4 mg/ml em água) e a solução foi incubada em banho de gelo durante mais duas horas; em seguida adicionaram-se gota a gota 3 ml duma solução saturada fria de sulfato de amónio e incubou-se durante uma hora em banho de gelo.

precipitado de conjugado de peroxidase-imunoglobulina obtido foi separado por centrifugação, foi dissolvido em ml de solução isótonica de cloreto de sódio tamponizada

com fosfato a pH 7,4 e foi estabilizado por adição de 1 ml duma solução de albumina de soro de vitela (10 mg/ml em solução de cloreto de sódio tamponizada com posfato). A solução foi congelada a -7Q2C.

As análises imunológicas de acordo com a técnica de sandwich por enzima em fase sólida para IFNómega 1 foram levados a efeito de acordo com procedimentos geralmente conhecidos (ver, por exemplo, Berthold, W., Merk, W. e Adolf, G.R., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 35, 364-369 (1985)). Fara esse fim foram colocados para revestimento das placas de microtitulação para análise de ELISA os anticorpos monoclonais OMG-2, ONG-5 ou OKG-7 numa concentração de 10/«g/ml em carbonato de sódio 0,1 M de pH 9,5 (100 Al por alvéolo) e as piscas foram incubadas ou durante uma hora à temperatura ambiente ou dum dia para o outro entre 4 e S^C. A solução de anticorpos foi removida, os alvéolos foram lavados com 200 A1 de água e cheios com 100 Al duma solução de albumina de soro de vitela (5 mg/ml) em solução isotónica de cloreto de sódio tamponizada com fosfato de pH 7,4 (seguidamente designada por PSB/BSA). Em seguida foram adicionados 1C0A1 duma solução de IFN-ómegal numa concentração de 20 ng/ml a cada alvéolo, misturou-se e prepara-se uma série de diluição por meio de transferências em série de 100 z*l de cada vez. Finalmente adicionaram-se a todos os alvéolos 50 A1 duma solução de conjugado de enzima-anticorpo (0MG-5/peroxidase ou QMG-7/peroxidase, solução de base (ver acima) 1:1C 000 diluida em PBS/BSA) e as placas foram incubadas durante 3 horas à temperatura ambiente. Em seguida a solução foi removida, os alvéolos foram lavados três vezes com água e cheios com 100 A1 de solução de substrato cada um (orto-fenilenodiamina, 3 mg/ml e perborato de sódio, 1 mg/ml em citrato de cálcio 0,067 i>í a pH 5). Após 30 minutos de incubação à temperatura ambien te pipetaram—se para cada alvéolo 100Al de cálcio sulfúri co 4 N; em seguida mediu-se a densidade óptica a 492 nm num fotómetro de vários canais (aparelho leitor para ELISA).

A partir de todas as combinaçêes heteró14

Iogas de anticorpo de revestimento e de conjugado peroxidase-anticorpo foram obtidas variações de absorção em função das doses. As figuras 1,2, e 3 mostram as curvas obtidas .

Para revestimento também é possível utilizar uma imunoglogulina de coelho anti-IFN-ómegal numa concentração de 10 ug/ml obtida através de dupla imunização dum coelho com IFN-ómegal e purificação parcial do soro por precipitação com silfato de amónio a 50% (ver figura 4)

A especificidade da análise de ELIo^ efectuada por meio do anticorpo Dp.G-2 (ver EP-A-0 236 920) e do anticorpo OMG-7 ligado a peroxidase (ver figura 2) para IFN-ómega foi comprovada por aplicação de preparações de outros interferções humanos numa larga gama de concentrações. Para esse fim utilizaram-se os seguintes interferões:

Interferao	Origem		Gama de concentrações
IFN- 1	Recombinante	(E.coli)	2ng - 50 ug/ml
IFN- 2c	Recombinante	(E.coli)	2ng - 50 ug/ml
IFN- B	Recombinante	(E.coli)	3xlO²-l,25xlO⁶ U/ml
IFN- F	Recombinante	(e.coli)	1,4x1o¹- 3,5x10⁵ U/ml
IFN-	Fibroplastos	induzidos
	com poli (I:C)	8xlC²-2xlO⁶ U/ml
IFN-gama	Recombinante	(E.coli)	2ng - 50 ug/ml

Neste caso a uma sensibilidade de 100 pg/ ml para IFN-ómegal bão se observou qualquer sinal significativo com qualquer dos preparados em todas as concentrações. A. análise ELISA pode assim ser aplicado não só para quantificação De IFN-ómegal recombinante como também, por exemplo, para determinação da porção de IFN-ómegal em interferão de leucócitos ou outros preparados de interferões obtidos a partir de culturas de células.

Exemplo 3

Ensaio imunorradiométrico (Ilh-A) para I N-ómegal

anticorpo OMG -7 foi marcado com um isótopo radioactivo por um método conhecido em si por meio de

3 /2,3 - H/ propionato de N-succinimidilo ( H-NSP), sociedade Amersham International, Inglaterra; 110 Ci/mMol). Para este fim foi levado à secura sob vácuo 1 MCi da solução de 3

H-NSP num recipiente para amostras siliconado. Em seguida foram pipetados 50 ug duma solução do anticorpo monoclonal 0MG-7 (4,7 mg/ml) para uma solução de cloreto de sódio tamponizada a pH 7,4 tendo-se adicionado 3 ul de tampão de borato 1 M a pH 8,5, Após 24 horas a 4 2c o excesso de H-NSP ) foi fixado com 20 ul de glicina 1 M em Tampão de borato;

diluido com 250 ul de tampão de fosfato de potássio 50 mM de pH 7,4 com Na Cl 150 mM e 5 mg/ml de albumina de soro de vitela e separado do anticoepo marcado por meio duma coluna de Sephadex G 50 M (0,5 X 20 cm). C anticorpo apresenta uma actividade especifica de cerca de 10 Ci/g de pro teina.

Para realização do ensaio foram revestidas com o anticorpo OMG-2 (10 ug/ml em carbonato de sódio 0,1 M pH 9,5; 1 Hora à temperatura ambiente pequenas esferas de polistireno corroídas (diâmetro 6,5 mm; sociedade Northumbria Biologicals, Inglaterra). As esferas foram incuba das em PBS/ESA (ver exemplo 2) durante 1 hora e em seguida lavadas duas vezes cada vez com 250 ul de água. As esferas foram incubadas em tubos de ensaio apropriados com 200 ul em cada tubo de uma solução de IFN-ómega 1 em concentrações crescentes em PBS/ESA durante 3 horas a 4- C e em seguida lavados 3 vezes com 250 ul de água. Em seguida adicionaram-se a cada 200 ul de uma solução de anticorpo marcado (100 ug/ml em PES/BSA, por tubo cerca de 27 OCO impulsos/minuto) e incubado durante 20 horas a 42 C. Em seguida as esferas foram lavadas três vezes com 20 ul de água, foram transferidas para tubos de polipropileno e a respectiva radioactividade ligada foi medida após adiçao de 4 ml de preparação de cintilação num contador de cin* tilação em líquido. A Figura 5 mostra a radioactividade . ligada em função da concentração de interferões.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã -

Processo para a preparação de anticorpos monoclonais do tipo IgC que neutralizam a actividade dum interferao ómega mas não a dos IFN-y3 , IEN-Y” nem dum interferãoot caracterizado por se preparar e subclonar uma linha de células de hibridomas produtora dum anticorpo contra IgC por fusão celular e se isolar após o crescimento dag células os anticorpos de IgC com especificidade anti-interferao ómega.

- 2^ -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os anticorpos monoclonais obtidos neutralizarem apenas a actividade do IFN-ómega 1.

- 3â -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os anticorpos monoclonais obtidos serem formados por meio de clones OMG-4, OMG-5 e OMG-7 os quais foram depositados sob os números de ECACC 87081401, 87081402 e 87081403, e neutralizarem a actividade a actividade do IFN-ómega 1 a uma concentração de 100 ug/ml mas não a dos IFN-tf 2c, IFN-β ou IFN-f .

- 4â -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se usarem para fusão celular células de micloma e células de baço dum animal de ensaio, o qual tinha sido pré-imunizado por IFN-ómega ou por um interferao híbrido constituído por uma fracção de IFN-ómega a uma fracção IFN-K. e em seguida imunizado uma segunda vez com IFN-ómega.

- 5- -

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a segunda imunização ser levada a efeito com IFN-ómega 1 ou com IFN-ómega /2.

-6â -

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a segunda imunização ser levada a efeito com IFN-ómega 1»

-7â -

Processo de acordo com a reivindicação 4_tcaracterizado por as células de baço usadas serem provenientes de ratos Balb/c.

-8â -

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por as células de mieloma usstdas da linha P3X63Ag8.653.

_ gâ Processo para a preparação dum anticorpo monoclonal marcado, caracterizado por se ligar a um marcador apropiado um anticorpo monoclonal obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3·

-loa -

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a marcação ser levada a efeito por meio dum isótopo radioactivo.

-llâ -

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a marcação ser levada a efeito por meio duma enzima.

-12â -

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a marcação ser levada a efeito por meio dum composto fluorescente.

-13â Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a marcação ser levada a efeito por meio dum composto quimioluminescente.

- 14 â -

Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a marcação ser levada a efeito por meio dum composto bioluminescente,

- 15§ -

Processo para a preparação dum suporte de afinidade de anticorpos apropriado para a purificação dos interferÕes ómega, caracterizado por se ligar por meio duma ligação covalente um anticorpo monoclonal obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1,2 ou 3 a um suporte activado apropriado.

- 16§ -

Processo para a purificação dum interferao ómega, caracterizado porse ligar IFN-ómega a um suporte de afinidade de anticorpos obtido de acordo com a reivindicação 15 e em seguida se eluir.

- 17â -

Processo para a detecção de IFN-ómega, caI racterizado por se incubar uma amostra com um anticorpo obtido de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 14 e por se registar a reacção do anticorpo com IFN-ómega.

- 18a —

Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por se utilizar um anticorpo monoclonal obti do de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 ou 9 a 14, contido num'Kit’.

- 19â -

Processo para a preparação dum conjunto para detecção ou para determinação quantitativa de IFN-óme • ga, caracterizado por se ligar a uma fase sólida.

* a) um anticorpo monoclonal ou policlonal contra IFN-ómega.

b) sendo o complexo binário formado determinado em seguida por meio dum anticorpo monoclonal obtido de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 14.

- 20ã -

Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o anticorpo utilizado em a) ser um anticorpo de acordo com o descrito no pedido de Patente Europe ia EP-A-0 236 920.

- 21â -

Processo para a detecção ou para a determi nação quantitativa de IFN-ómega, caracterizado por

a) incubar-se uma amostra com um anticorpo monoclonal ou policlonal contra IFN-ómega ligado a um suporte.

b) tratar-se a amostra assim obtida com um anticorpo obtido de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 14 e

c) determinar o conteúdo do nticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 14 ligado conforme descrito.

- 22â -

Processo de análise imunológica de acordo com qualquer das reivindicações 17,18 ou 19 caracterizado por se reconhecer IFN-ómega 1 mas não IFN dos tipos , J2> ou Y .

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 1 de Outubro de 1986, sob o ns p 36 33 323.9.

Lisboa# 3C de Setembro de 1987

RESUMO ¹¹ PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS ANTICORPOS aONOCLONAIS CONTRA INTERFERAO ÓMEGA (IFN-ÓMEGA) E PARA A PURIFICAÇÃO BEM COMO PARA A ANÃLISE DE IFN-ÓMEGAÍ

A invenção refere-se a um processo para a preparação de anticorpos monoclonais do tipo IgC que neutralizam a actividade dum interferão ómega mas não a dos IFN- ¢), IFN- /nem dum interferão =< que compreende preparar-se e subclonar uma linha de células de hibridomas produtora dum anticorpo contra IgC por fusão celular e se isolar após o crescimento das células os anticorpos de IgC com especificidade anti-interferão ómega.

FIG. 7

Anàhse de ELISA para IFN ómega-1 pevesH menFo: AnFicorpo monoclonal O MG-2

Conjugado de peroxidase : AnFtcorpo monoclonal OMG-S

Densidade ópFica (492nm)

FIG. 2

Análise de ELISA para IFN-ómega 7.

Revestimento ; Anticorpo monoc tonal OMG-2

Conjugado de peroxidase: ^Ar>ticorpo monoclonal OMG-7

Densidade óptica (492 nm)

FIG. 3

Anáhse d? ELISA para IFN-ómrga 1

Reveslirnenlo: Anlicorpo monoclonal OMG-5

Conjugado dr prroxl das?: An ncorpo monoclonal OMG-7 (Uju g6í) ooi-ido jpopisuj a

FIG.4

Anáhse de ELISA para Ifn ómega 1

ReveshimenFo: imunoglobulina de coelho anl-i-lFN o'mega-1

Conjugado de peroxldase t Anl-icorpo monoclonal OMG-7