JPH05339289A - Ｍｒｓａ ｐｂｐ２′及びｍｒｓａ感染の検出方法並びにそのための合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）
及びＭＲＳＡ ＰＢＰ２′（メチシリン耐性黄色ブドウ
球菌ペニシリン結合タンパク２′）、あるいはＭＲＳＡ
抗体の検出、測定を簡便に行う方法を提供し、ヒトおよ
び動物のＭＲＳＡ感染の簡便かつ特異的な測定並びに診
断をなしうる方法を提供する。 【構成】 ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′の合成ペプチド、例え
ば、 Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
−Ｙ または、次式 Ｘ′−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ で表わされるペプチド、それらペプチド配列中に少なく
とも１個のアミノ酸残基を付加したもの、あるいはそれ
らのペプチド中のアミノ酸配列の一部からなるもの。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＭＲＳＡ（メチシリン
耐性黄色ブドウ球菌）に対する抗体と免疫化学的に反応
する合成ペプチドに関するものであり、特にＭＲＳＡ
ＰＢＰ２′（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ペニシリン
結合タンパク２′）に対する抗体と免疫化学的に反応す
る合成ペプチドに関するものである。この合成ペプチド
は人間を含む動物においてＭＲＳＡに対する抗体産生を
誘発する免疫原としても使用でき、本発明は当該合成ペ
プチドを含有するＭＲＳＡ抗体産生誘発組成物及びＭＲ
ＳＡ抗体産生誘発方法に関するものである。本発明はま
た、当該合成ペプチドあるいは該合成ペプチドにより作
製されたポリクローナルあるいはモノクローナル抗体、
及びその抗体により作製された菌由来ＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′を利用する、ＭＲＳＡ及びＭＲＳＡ ＰＢＰ２′
（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ペニシリン結合タンパ
ク２′）、あるいはＭＲＳＡ抗体の検出、測定に関する
ものであり、ヒト及び動物のＭＲＳＡ感染を知る手段の
提供に関するものである。

【０００２】本発明は、被検検体中のＭＲＳＡ又はＭＲ
ＳＡ抗体の検出、あるいはＭＲＳＡ感染症診断剤に用い
る検出キットに関する。本発明はさらに、当該合成ペプ
チドを免疫原として作製された抗体を用いてアフィニテ
ィー クロマトグラフィーによりＭＲＳＡ溶菌菌液ある
いは培養液よりＭＲＳＡ ＰＢＰ２′を精製する方法、
及び該精製により得られたＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に関す
るものである。本発明は、またＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に
特異的に結合するモノクローナル抗体及びその作製法に
関するものでもある。

【０００３】

【技術的背景】メチシリンに抵抗性を有する黄色ブドウ
球菌の報告は１９６０年代初頭になされている（Ｊｅｖ
ｏｎｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．１９６１）。Ｍ
ＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）はメチシリン
を含むペニシリン系薬剤及びセフェム系薬剤を中心とす
るベータラクタム剤に耐性を示す黄色ブドウ球菌のこと
であり、ＭＲＳＡは、又、ベータラクタム剤以外の多く
の抗菌剤及び抗生物質に耐性であることから多剤耐性菌
として知られている。ＭＲＳＡの分離例が増加するにつ
れ、ＭＲＳＡは重大な院内感染菌として注目されるよう
になった（Ｂｅｎｎｅｒ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ Ｋａｙｓ
ｅｒ，Ｆ．Ｈ．Ｌａｎｃｅｔ １９６８，Ｋｌｉｍｅ
ｋ，ＪＪ．ｅｔ ａｌ Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９７
６）。黄色ブドウ球菌はその感染者及び感染動物におい
て皮膚炎、肺炎、臓器不全等の疾病を誘起し、時にその
症状は重篤なものとなり、感染者及び感染動物を死にい
たらしめることもある。ＭＲＳＡは疾病の治療に用いら
れる多くの抗菌剤及び抗生物質に耐性であり多くの薬剤
が無効であるため、ＭＲＳＡ感染症の治療は難しく、治
療の第一歩は疾病がＭＲＳＡ感染によるものであるか否
かを一刻も早く知ることであると言える。したがって、
ＭＲＳＡ感染症であることが判明した時点でＭＲＳＡに
有効であるとされる適切な抗菌剤及び抗生物質を選択、
投与することが必要である。また、黄色ブドウ球菌はヒ
トを含む動物の体表部を中心に広く分布し、ヒトにおい
ては特に鼻腔、鼻前部、咽頭部に認められ、疾病患者の
みならず健常者の多くが保菌している。ＭＲＳＡもまた
同様であり、ＭＲＳＡを保菌していない者のＭＲＳＡ保
菌者との接触はＭＲＳＡ感染にいたる可能性があり、特
に医療従事者のＭＲＳＡ保菌者は患者への重大な感染源
となり得ることから早期に清浄化に努め、さらに定期的
なスクリーニングを行ない、適切に対処することが必要
である。したがって疾病患者においては治療効果上の理
由からＭＲＳＡの有無を知ることが重要であり、健常者
においては自己管理とともに、社会上のＭＲＳＡ感染の
リスクを減少させる目的でその感染の有無を知ることが
重要である。

【０００４】ＭＲＳＡの薬剤耐性機構については多くの
研究がなされている。メチシリン、クロキサシリン、セ
ファロチン等ベータラクタム剤はＤ−ａｌａｎｉｎｅ
ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅおよびｐｅｐｔｉｄ
ｏｇｌｙｃａｎ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅなどの
細菌細胞壁の合成に必須な酵素に結合する。これにより
酵素は不活化され細胞壁の合成はなされなくなり細菌は
死滅する（Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｔｒｏ
ｍｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１９８３）。これらの酵素はペニシリン結合タンパ
ク（ＰＢＰ）と呼ばれ、黄色ブドウ球菌では４種類また
は５種類の異なった分子量のものが知られている；分子
量７９，０００−８７，０００（ＰＢＰ１）、７３，０
００−８０，０００（ＰＢＰ２）、７０，０００−７
５，０００（ＰＢＰ３）、７０，０００（ＰＢＰ３′）
および、４１，０００−４６，０００（ＰＢＰ４）（Ｇ
ｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ．１９８６，Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏ
ｕ，Ｎ．Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｆ．Ｙ．，Ａｎｔｉｍ
ｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８
０，Ｗｙｋｅ，Ａ．Ｗ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ．Ｌｅｔｔ．１９８４）。ＰＢＰの数及び分子量の差
異は各研究室で使用している菌株の差異と言うよりは、
ゲル電気泳動条件の違いによるものであろうと考えられ
ている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、一般の感受
性黄色ブドウ球菌の産生するＰＢＰに加えてベータラク
タム剤との親和力の低い分子量７４，０００−７８，０
００のＰＢＰを産生していることが明らかとなった（Ｂ
ｒｏｗｎ，Ｄ．Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，
Ｐ．Ｅ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８０，Ｇｅｏｒｇ
ｏｐａｐａｄａｋｏｕ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．１
９８２，Ｈａｙｅｓ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｌｅｔｔ．１９８１）。このＰＢ
Ｐは、ＰＢＰ２′、ＰＢＰ２ａあるいはＭＲＳＡ ＰＢ
Ｐと呼ばれ、ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅとしての機
能を有し薬剤との親和力が低いために感受性黄色ブドウ
球菌が死滅する濃度のベータラクタム剤存在下において
も飽和されずにその活性を保持し、細胞壁を合成する
（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄ
ｓ，Ｐ．Ｅ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８０，Ｈａｒ
ｔｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｔｏｍａｓｚ，Ａ．，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４）。その結果、薬剤
存在下においてもＭＲＳＡは増殖を繰り返し種々の疾病
を引き起こす。ＰＢＰ２′以外にもＭＲＳＡ特異的な因
子についての研究が進められ、他のいくつかの因子が提
示されているが、現在までのところ耐性化の最も重要な
因子はＰＢＰ２′であるとされている（Ｍｕｒａｋａｍ
ｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｔｏｍａｓｚ，Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．１９８９）。なお、メチシリンはベータラク
タマーゼ（ベータラクタム剤分解酵素）で不活化されな
い半合成ベータラクタム剤である。

【０００５】ＰＢＰ２′をコードする遺伝子（ｍｅｃ遺
伝子）の存在位置については、ブドウ球菌菌体染色体上
にあることが知られ（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｗ
ｅｅｎｅｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９
７０，Ｋａｙｓｅｒ，Ｆ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１
９７２，Ｓｔｉｆｆｌｅｒ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９７３，Ｓｊｏｅｓｔｒｏ
ｅｍ，Ｊ．−Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１９７５）、その染色体マップ上の位置が決定され
た（Ｋｕｈｌ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．１９７８）。さらにはｍｅｃ遺伝子を含む染
色体の制限酵素切断部位も明らかとされ（Ｂｅｃｋ，
Ｗ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
９８６，Ｕｂｕｋａｔａ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｍ
ｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９
８９）、ベクターへのｍｅｃ遺伝子のクローニングがな
されるに至った（Ｂｅｃｋ，Ｗ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８６，Ｍａｔｓｕｈａｓ
ｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
９８６）。Ｓｏｎｇ，Ｍ．Ｄ．ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ １９８７）はｍｅｃ遺伝子を含む４Ｋｂの制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩフラクションの塩基配列を明らかと
し、ｍｅｃ遺伝子のプロモーター及び上流域はプラスミ
ド性のスタフィロコッカスペニシリナーゼをコードする
遺伝子のそれと類似していることが示された。同時に、
ＰＢＰ２′の構成ペプチドが６７０アミノ酸からなるこ
とが判明した。

【０００６】コアグラーゼ陰性ブドウ球菌においてもメ
チシリン耐性であり同様にＰＢＰ２′を産生する株が報
告され（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８２，
Ｕｂｕｋａｔａ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８
５）、ｍｅｃ遺伝子が決定因子となっていることが報告
された（Ｔｅｓｃｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍ
ｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９
８８，Ｕｂｕｋａｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１
９９０）。したがって、ＰＢＰ２′およびｍｅｃ遺伝子
は広くブドウ球菌におけるメチシリン等抗菌剤及び抗生
物質に対する耐性の因子の１つとなっていると考えられ
ている。

【０００７】

【従来の技術】被検検体中のＭＲＳＡ抗原を検出する方
法として、現在大きく３方法が考えられる。薬剤感受性
試験による方法、抗原抗体反応によりＭＲＳＡ特異抗原
（主にＰＢＰ２′）を知る方法、およびサザーンブロテ
ィング法あるいはＰＣＲ法によるＭＲＳＡ特異的遺伝因
子（主にｍｅｃ遺伝子）を検出する方法、である。ＭＲ
ＳＡに特異的とされるＰＢＰ２′を精製する一般的手法
として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる方法が行われている。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、目的物質と分子量が非常
に近似する物質がある場合、目的物質の精製度は不十分
になることが多い。ＭＲＳＡにおいてはＰＢＰ２′を目
的物質とした場合、ＰＢＰ２が非常に近似している分子
量を有する事は周知である。また、ＳＤＳによるタンパ
ク質の変性が起こることにより、本来の目的を達しえな
い可能性がある。さらには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精
製は手技が面倒であること、一回に行いえる量が小さい
ことから、一定量の回収には多数回の操作を必要とする
という欠点がある。等電点電気泳動においても同様に等
電点の近似する物質を分離精製するのは困難である。

【０００８】薬剤感受性試験はディスク拡散法、微量液
体希釈法あるいは自動機器を用いる法によりＭＩＣ（最
小発育阻止濃度）を決定し菌がＭＲＳＡか否かを判定す
る。この方法においては菌を培地で培養することが必要
となるが、接種菌量、培地のｐＨ、ＮａＣｌ濃度、ショ
糖濃度、培養温度、培養時間あるいは菌がすでにベータ
ラクタム剤に接しているか否かにより菌の感受性が異な
ることが知られている（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．，
ａｎｄ Ｈａｃｋｂａｒｔｈ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８
７，Ｈａｒｔｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｔｏｍａｓ
ｚ，Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４）。すな
わち、ＰＢＰ２′は４２℃以上あるいはｐＨ５．２以下
で失活する。したがって、この方法は必ずしも扱い易い
方法でない。さらにはディスク拡散法においては、用い
る市販ディスクにより判定が不鮮明であることがある
（渡辺、検査と技術 １９８８、菅野、臨床泌尿器科１
９９０）。アメリカのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔ
ｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＮＣＣＬＳ）や日本化学療
法学会では、感受性測定用培地として２％の食塩を添加
したＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈを用
い、３５℃、２４時間培養でのオキサシリンに対するＭ
ＩＣが４μｇ／ｍｌ以上の黄色ブドウ球菌株をＭＲＳＡ
としている。

【０００９】サザーンブロティング法によるＭＲＳＡ特
異的遺伝因子（主にｍｅｃ遺伝子）を検出する方法は近
年大いにその研究が行なわれている。サザーンブロッテ
ィング法のプローブとして合成オリゴヌクレオチド（Ｈ
ｉｒａｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｉｃｒｏ
ｂｉａｌ．，Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｄｈｒ．１９９
０）、組み換え体の制限酵素切断断片（Ｂｅｃｈ，Ｗ．
Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８
６）をラジオアイソトープにより標識して用いている。
このプロープを菌体ＤＮＡとハイブリダイズさせ、ｍｅ
ｃ遺伝子の存在を知ることにより、ＭＲＳＡを検出でき
るとされている。しかし、ｍｅｃ遺伝子を有しながら薬
剤耐性を示さない、つまりＰＢＰ２′を産生していない
と思われる菌株の存在が報告され、その検査結果の取扱
いには十分な注意が必要とされる。ＰＣＲ法はサザーン
ブロティング法と同様にＭＲＳＡ特異的遺伝因子（主に
ｍｅｃ遺伝子）を検出するものであるが、遺伝子の増幅
を行なえるため、より高感度の検出が期待されている
（南出ら．第６回日本環境感染症学会総会、１９９
１）。ただし、ＰＢＰ２′を産生せず、薬剤耐性を示さ
ない菌株をも陽性と判定してしまう欠点を克服するには
至っていない。

【００１０】抗原抗体反応によりＭＲＳＡ特異抗原（主
にＰＢＰ２′）を知る方法に関して、Ｏ’Ｈａｒａ，
Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐ．Ｂ．（ＦＥ
ＢＳＬｅｔｔ，１９８７）はＰＢＰ２′を含むＭＲＳＡ
部分精製抗原を用いてウサギを免疫し得られたポリクロ
ーナル抗体によりＰＢＰ２′を検出できることを示し
た。しかしこの抗体はＰＢＰ２′以外の抗原に対する抗
体をも含むものであったため、この抗体は一旦感受性黄
色ブドウ球菌による吸収処理をして使用する必要があっ
た。引き続いてＯ’Ｈａｒａら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９８９）は同様の抗原を免疫原
とし、マウスに免疫し、その脾細胞とマウスミエローマ
細胞とを融合させハイブリドーマを作製し、２種類のモ
ノクローナル抗体、１／２３５（イソタイプＩｇＧ２
ａ），２／４０１．４３（イソタイプＩｇＧ１）を得て
いるが、彼らはその抗体をウエスタンブロティング法に
用いているのみである。しかしながら、ウエスタンブロ
ティング法は日常検査法としては簡便なものではなく、
簡易な検査様式に適用できる抗体等の開発が望まれる。

【００１１】

【発明が解決すべき問題点】本発明はこのような状況下
になされたものでありＭＲＳＡおよびＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′の検出、測定を簡便に行う方法、あるいはＭＲＳＡ
感染抗体の検出、測定を行う手法を提供し、ヒトおよび
動物のＭＲＳＡ感染の簡便かつ特異的な測定並びに診断
をなしうる方法を提供することを目的としている。本発
明は、その手段として、ＭＲＳＡに対する抗体と免疫化
学的に反応する合成ペプチド、特にＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′に対する抗体と免疫化学的に反応する合成ペプチド
あるいは合成ペプチドにより作製された抗体、及びその
抗体により作製された菌由来ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′を利
用する、簡便かつ特異的なＭＲＳＡの検出、測定方法お
よびＭＲＳＡ ＰＢＰ２′の測定方法を提供するもので
ある。本発明はＭＲＳＡ検出に非常に優れた特異性を有
するＭＲＳＡ関連新規合成ペプチド、あるいはＭＲＳＡ
溶菌菌液等のＭＲＳＡ含有液より抽出・精製されたＭＲ
ＳＡ ＰＢＰ２′を提供することをも目的としている。
また本発明はこの新規合成ペプチド、あるいは精製され
たＭＲＳＡ ＰＢＰ２′を直接使用したＭＲＳＡ抗体検
出方法を提供することも目的としている。本発明は、被
検検体中のＭＲＳＡ又はＭＲＳＡ抗体の検出、あるいは
ＭＲＳＡ感染症診断剤に用いる検出キットにも関する。
本発明はさらに、当該合成ペプチドを免疫原として作製
された抗体を用いてアフィニティー クロマトグラフィ
ーによりＭＲＳＡ溶菌菌液あるいは培養液よりＭＲＳＡ
ＰＢＰ２′を精製する方法、及び該精製により得られ
たＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に関するものでもある。

【００１２】さらに本発明はこの新規合成ペプチド、あ
るいは精製されたＭＲＳＡ ＰＢＰ２′を含有するＭＲ
ＳＡ抗体産生誘発組成物とこれを使用した抗体産生誘発
方法を提供することにも関する。本発明はまた、この新
規合成ペプチド、あるいは精製されたＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′を含有する抗体産生誘発組成物により産生された抗
体、特にモノクローナル抗体を用いるＭＲＳＡ抗原検出
方法を提供することも目的としている。本発明は、また
ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に特異的に結合するモノクローナ
ル抗体及びその作製法に関するものでもある。さらに、
本発明の合成ペプチド及びそれを用いて産生された抗体
はＭＲＳＡ感染症の治療薬ないしは予防薬としても有用
と期待されている。

【００１３】

【発明の構成】本発明は、式： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
−Ｙ （式中、Ｘは、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−、または、
そのペプチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から
除いた基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なく
とも１個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わし、Ｙ
は、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、またはそのペ
プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＣ末端側から除いた
基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす。）

【００１４】または、次式： Ｘ′−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （式中、Ｘ′はＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−、または、そのペ
プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から除いた
基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす）で表わされ
るペプチド、それらペプチド配列中に少なくとも１個の
アミノ酸残基を付加したもの、あるいはそれらのペプチ
ド中のアミノ酸配列の一部からなり且つＭＲＳＡ ＰＢ
Ｐ２′（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ペニシリン結合
タンパク２′）に対する抗体と免疫学的に反応しうるペ
プチドに関する。

【００１５】上記本発明のペプチドは、ＭＲＳＡ抗原と
して利用されることができ、合成により得られたもので
ある。本発明に従えば、該ペプチドは６７０個のアミノ
酸配列からなるＭＲＳＡ ＰＢＰ２′（Ｓｏｎｇ，Ｍ．
Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８
７）のうちの、ＭＲＳＡを表現する抗原として特に適し
た配列のペプチドに相当するとすることができる。

【００１６】特に具体的な配列としては、該ＭＲＳＡ
ＰＢＰ２′の３８２番目のチロシン残基よりＣ末端側４
１３番目のメチオニン残基までの３２残基のうちのいず
れかの配列を全部又は一部有するもの及び４１３番目の
メチオニン残基よりＣ末端側４４３番目のチロシン残基
までの３１残基のうちのいずれかの配列を全部又は一部
有するものあるいはそのうちの任意の残基を少なくとも
１個を他のアミノ酸残基に変えたものがあげられる。

【００１７】特に好ましいものとしては下記の構造を有
するペプチドがＭＲＳＡ抗原としてあげれらる。 １） で示されるアミノ酸配列を有するペプチド。 ２） で示されるアミノ酸配列を有するペプチド。

【００１８】

【００１９】

【００２０】これらのペプチドは一般に知られているＢ
ｏｃ化学、またはＦｍｏｃ化学の方法により合成し得る
が、その他ペプチド合成法として知られた種々の方法で
合成することができる。たとえばマニュアルによる固相
合成もしくは市販の自動ペプチド合成装置を使用して合
成できる。これらのペプチドはその一部（例えば７残基
程度）であっても抗原性を有する。さらには、ペプチド
をキャリアタンパクへの結合のため、あるいはペプチド
への標識体の結合のため、その末端あるいは一部をシス
ティン、チロシン等で置換することができる。

【００２１】この他、本発明の思想に従って、さらに Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，Ｐｒｏ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ，Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ，Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ，Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ，Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ，あるいはＧｌｎ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ で表わされるペプチド、それらペプチド配列中に少なく
とも１個のアミノ酸残基を付加したもの、及びそれらペ
プチド配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を他のア
ミノ酸に置き換えたもの又はそのペプチド配列のうちの
少なくとも一部を有し、最大で３２個のアミノ酸残基か
らなり且つＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に対する抗体と免疫学
的に反応しうるペプチドからなる群から選ばれたペプチ
ドも提供される。これらペプチドも、前記ペプチドと同
様にして利用され且つ合成されることができよう。さら
にこれらペプチドは、前記ペプチドと同様の改変などを
行なうことができよう。

【００２２】これらペプチドのうち特に好ましいものと
しては Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，Ｐｒｏ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ，Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ，Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ，Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ，Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，あるいはＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ のものがあげられる。

【００２３】本発明のペプチドは、試料中のＭＲＳＡ抗
体を検出しようとする場合、有用である。本発明の合成
ペプチドは、そのペプチドと被検検体中のＭＲＳＡ抗体
との間で免疫学的複合体（抗原抗体結合物）が形成せし
め得る条件下に被検検体と接触させることができる。こ
うして、抗原抗体結合物が形成されれば、それは被検検
体中にＭＲＳＡ抗体が存在することを示すこととなり、
適当な手段によりこうした変化を検出、測定できる。

【００２４】このような方法としては、例えば、ラジオ
イムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イム
ノアッセイに代表される免疫学的測定法のほか、濁度
法、凝集法あるいはウエスタンブロティング法など、抗
原抗体反応を利用するあらゆる方法を用いることができ
る。

【００２５】本発明のペプチドを用いた場合、ラジオイ
ムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイなどのより簡
便な方法を用いることができる。本発明の合成ペプチド
はアッセイ方法に応じて公知の標識物で標識できる。合
成ペプチドはラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、発
色色素基質、ビオチン、アビジン、金コロイド、磁性粒
子などにより標識できる。例えばラジオアイソトープ
^１２５ＩはクロラミンＴ法等により抗原性を損なわずに
標識できる。また合成ペプチドはすでに知られた手段に
より各種の支持体に結合することができる。この際、合
成ペプチドは化学的修飾を加えることもできる。ここで
用いることのできる支持体としては例えば、ポリスチレ
ンやポリビニル製のマイクロタイタープレート、ガラス
管やガラスビーズ、ゼラチンビーズ、ラテックスビー
ズ、また、紙、セルロース、セルロース誘導体やシリカ
のようなクロマトグラフィ用支持体があげられる。

【００２６】本発明の合成ペプチドは動物に投与された
場合、抗体を産生させることができ抗体産生誘発剤とし
て有用である。すなわち、抗原としての合成ペプチド
を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キイホールリンペッ
トヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）
などのキャリアタンパクにサクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ＳＭＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ）などの架橋
剤を介して結合させ、次にこの合成ペプチド−キャリア
タンパク結合物を用い、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ等の動物を免疫して本発明の合成ペプチドに対する抗
体を得る。また、この合成ペプチドはキャリアタンパク
なしでペプチドのみを動物に免疫し、所望の抗体を作製
することもできる。さらには、合成ペプチドあるいは合
成ペプチドーキャリアタンパク結合物はフロイントコン
プリートアジュバント、水酸化アルミニウムゲル等と混
合、乳化して抗体産生誘発組成物とすることもできる。

【００２７】抗体産生誘発方法は常法にしたがい、組成
物を動物に非経口的に投与することによりなすことがで
きる。この時、細菌感染を防ぐために投与部位はアルコ
ール等で十分消毒することが好ましい。また本発明のペ
プチドは、それを通常の手法により、動物を免疫し、次
に免疫された動物から牌臓細胞をとり出し、次に通常の
細胞融合の手法で、モノクローナル抗体を作製するのに
用いることができる。細胞融合法としては、ＨＶＪ法
や、ＰＥＧ法、電気的融合法等が用いられる。本発明の
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株を培養用
フラスコ内や大量培養用バイオリアクター中で、無血清
あるいは血清を含む一般的な動物細胞用培地で培養した
培養上清、またはプリスタン（２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカン）を前投与したマウス等の動物
に接種し、生体内培養することによって得た生体浸出液
から精製することができる。

【００２８】本発明の合成ペプチドで動物を免疫して作
製されたＭＲＳＡ抗体あるいは抗ＭＲＳＡモノクローナ
ル抗体を用いて、ＭＲＳＡ菌体及びＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′、それらの部分抗原を検出する方法が提供される。
特に、本発明の抗ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′モノクローナル
抗体を用いて、ＭＲＳＡ菌体及びＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′、それらの部分抗原を検出する方法が提供される。
この場合、該抗体は、ＭＲＳＡ抗体と試料中のＭＲＳＡ
菌体あるいは、ＭＲＳＡ部分抗原との間で免疫学的複合
体（抗原抗体結合物）を形成し得る条件下で、試料と接
触させるのが望ましい。こうして、抗原抗体結合物が形
成されるのであれば、それは試料中にＭＲＳＡ抗原が存
在することとなり、適当な手段によりそれが検出、測定
される。このような検出方法としては、例えばラジオイ
ムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイに代表される
免疫学的測定法のほか、濁度法、凝集法あるいはウエス
タンブロティング法など、抗原抗体反応を利用するあら
ゆる方法を用いることができる。

【００２９】この抗体はアッセイ方法に応じて公知の標
識物で標識できる。抗体はラジオアイソトープ、蛍光色
素、酵素、発色色素基質、ビオチン、アビジン、金コロ
イド、磁性粒子などにより標識できる。例えばラジオア
イソトープ^１２５ＩはクロラミンＴ法等により抗体活性
を損なわずに標識できる。また抗体はすでに知られた手
段により各種の支持体に結合することができる。この
際、抗体の化学的修飾を必要とする場合もある。このよ
うな支持体としては例えば、ポリスチレンやポリビニル
製のマイクロタイタープレート、ガラス管やガラスビー
ズ、ゼラチンビーズ、ラテックスピーズ、また、紙、セ
ルロース、セルロース誘導体やシリカのようなクロマト
グラフィ用支持体も用いることができる。

【００３０】本発明の合成ペプチドで動物を免疫して作
製されたＭＲＳＡ抗体は、ＭＲＳＡ溶菌菌液等のＭＲＳ
Ａ含有液からＭＲＳＡ ＰＢＰ２′を抽出・精製する目
的にも使用することができる。ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′の
精製は、ＭＲＳＡ抗体をカップリングさせたゲルを用い
てアフィニティー クロマトグラフィーにより行うこと
ができる。

【００３１】

【実施例】本発明は以下の実施例によって詳細に説明さ
れるが、このような実施例によって本発明の範囲は何等
限定されるものではない。 〔実施例１〕本発明における合成ペプチドの合成方法を
次に例示する。下記構造のペプチドを、アプライドバイ
オシステムズ社製モデル４３１Ａ自動合成装置を使用し
て合成した。なお、試薬については市販されて容易に入
手できるもの例えば、アプライドバイオシステムズ社製
Ｆｍｏｃアミノ酸及びカップリング剤を使用した。

【００３２】 で示されるアミノ酸配列を有する合成ペプチド。

【００３３】 で示されるアミノ酸配列を有する合成ペプチド。

【００３４】各ペプチドは、０．１５ｍｍｏｌスケール
で固相法による合成を行なって、得られたペプチドレジ
ンを一般的な方法、例えば無水フッ化水素処理により脱
保護およびレジンよりの切り出しを行ない粗ペプチドを
得た。上記ｂ）のペプチドの場合、５６ｍｇを得た。こ
れらの粗ペプチド４０ｍｇは逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。上記ｂ）
のペプチドは白色羽毛状の粉末（７ｍｇ）として得ら
れ、また上記ａ）のペプチドは白色羽毛状の粉末として
得られた。図１に合成ペプチドａ）の、図２に合成ペプ
チドｂ）のＲＰ−ＨＰＬＣパターンを示す。

【００３５】〔実施例２〕本例は実施例１で合成して得
られた合成ペプチドを使用してＭＲＳＡ抗体を検出する
方法のＥＩＡ法での方法を例に示したものである。 １）合成ペプチド固相化ＥＩＡマイクロプレートの作製 合成ペプチドを０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に
て１０μｇ／ｍｌ濃度に溶解する。９６穴マイクロプレ
ート（フロウ社製）の各穴に、このペプチド溶解液を
０．１ｍｌずつ分注し、ペプチドが穴に十分に結合する
よう室温にて一夜インキュベートした後、ペプチド溶液
を除去し各穴を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエ
チレン−ソルビタンモノラウリル酸）加ＰＢＳ（リン酸
緩衝生理食塩水）の洗浄液で３回洗浄する。次に５％牛
血清アルブミン、１％カゼイン加ＰＢＳを各穴に０．１
ｍｌずつ分注し、３７℃、１時間インキュベートし、穴
の非結合部位をブロックする。さらに洗浄を行なった
後、このマイクロプレートを使用に供した。調整された
ペプチド固相化マイクロプレートは、−２０℃に保存す
ることによりペプチドの抗原性を損なうことなく数カ月
間保存することができる。

【００３６】２）アッセイ法 上記のように作製されたマイクロプレートを用いてＥＩ
Ａを行なった。ＭＲＳＡ菌体より抽出し、精製した抗原
を免疫したウサギ血清試料を５％牛血清アルブミン加Ｐ
ＢＳで１００倍に希釈し各穴に０．０５ｍｌ滴下して、
３７℃、１時間インキュベートした（陰性対照試料に
は、非免疫ウサギの血清を同様に希釈して用いた）。洗
浄後、酵素標識二次抗体としてホースラデイッシュパー
オキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清（カペル社
製）を５％牛血清アルブミン加ＰＢＳで１：１０００に
希釈し、各穴に０．０５ｍｌ加え、３７℃、１時間反応
させる。洗浄後、基質としてｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）を過酸化水素水存在下（２０ｍｇのＯＰＤ，
１０μｇの３５％過酸化水素水をｐＨ５．０の０．１Ｍ
クエン酸緩衝液５０ｍｌに溶解）に０．１ｍｌ加える。
室温に１５分間静置するとホースラディッシュパーオキ
シダーゼの働きにより基質が分解され発色する。１Ｎ硫
酸を各穴０．０５ｍｌ加えると酵素反応が阻止され発色
がそれ以上進行しなくなる。この発色を吸光度測定装置
の４９２ｎｍで測定した。その結果、本合成ペプチドは
ＭＲＳＡ免疫ウサギ血清と反応することがわかった（第
１表）。

【００３７】

【表１】

【００３８】同様に以下のペプチド６′〜１３′を用い
て測定した結果を示す。 配列番号６のペプチドのアミノ酸１の前にＣｙｓを付し
た２５アミノ酸からなるペプチド（６′） 配列番号７のペプチドのアミノ酸１の前にＣｙｓを付し
た２１アミノ酸からなるペプチド（７′） 配列番号８のペプチドのアミノ酸１のＭｅｔを除きＣｙ
ｓを付した２２アミノ酸からなるペプチド（８′） 配列番号９のペプチドのアミノ酸１の前にＣｙｓを付し
た２２アミノ酸からなるペプチド（９′） 配列番号１０のペプチドのアミノ酸１のＭｅｔを除きＣ
ｙｓを付した２２アミノ酸からなるペプチド（１０′） 配列番号１１のペプチドのアミノ酸１のＭｅｔを除きＣ
ｙｓを付した２７アミノ酸からなるペプチド（１１′） 配列番号１２のペプチドのアミノ酸１の前にＣｙｓを付
した２４アミノ酸からなるペプチド（１２′） 配列番号１３のペプチドのアミノ酸２０の後ろにＣｙｓ
を付した２１アミノ酸からなるペプチド（１３′）

【００３９】

【表２】

【００４０】〔実施例３〕本例は実施例１と同様にして
合成された各合成ペプチドを用いてＭＲＳＡに対して特
異性を有する抗体の作製法を示したものである。 １）合成ペプチドーキャリアタンパク結合物の作製 実施例１に従い、ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′のペプチドの４
１３番目のメチオニンをシスティンに置換した合成ペプ
チドａ）およびＰＢＰ２′ペプチドの４１３番目のメチ
オニンをシスティンに置換した合成ペプチドｂ）を下記
の通り、合成した。

【００４１】 で示されるアミノ酸配列を有する合成ペプチド（白色羽
毛状粉末）。

【００４２】 で示されるアミノ酸配列を有する合成ペプチド（白色羽
毛状粉末）。

【００４３】ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、クリスタル
シグマ社製）を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５００μｌに溶解した液に、架橋剤であるサクシニミジ
ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ピアス社製）２．５４ｍ
ｇのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００μｌ溶液を
添加し室温で３０分間反応させた。この混合液をＰＤ−
１０ Ｇ２５セファデックスカラム（ファルマシア社
製）でゲル濾過により遊離の架橋剤を除去した後、上記
合成ペプチド１７ｍｇ（ａ）、ｂ）各々について）の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ溶液を
添加し、室温で３時間反応させた。その後、反応混合液
をゲル濾過により分離し合成ペプチドーキャリア結合物
を得た。本実施例のこの合成ペプチドａ），ｂ）をキャ
リアタンパクに結合させたものを、それぞれ、ａ）−Ｂ
ＳＡ，ｂ）−ＢＳＡとした。

【００４４】２）抗体の作製 上記より得られたａ）−ＢＳＡ，ｂ）−ＢＳＡそれぞれ
合成ペプチド量に換算して２５μｇ／ｍｌの溶液１ｍｌ
をフロイントコンプリートアジュバントの等量と混合し
て乳化し、この乳化混合物を６週令の雌ウサギ（日本白
色種）に２週間に１回、計５回、数カ所に皮下投与し
た。最終投与から１週間後に、このようにして免疫され
たウサギの心臓から注射器を用いて採血し、抗血清を得
た。

【００４５】３）抗体活性の測定 得られた抗血清と、ＭＲＳＡとの抗原抗体反応性を、次
のようなＥＩＡで検討した。細菌培養培地にて、３７
℃、一夜振とう培養したＭＲＳＡ菌株を遠心して集菌
し、１００ｍ１の培地から集菌された菌当り２ｍｇのタ
ンパク質溶解酵素であるリゾスタフィン（シグマ社製）
を加えることにより溶菌しＭＲＳＡ溶菌菌体とした。

【００４６】ＭＲＳＡ溶菌菌体を０．１Ｍ 炭酸緩衝液
（ｐＨ９・６）にて１０μｇ／ｍｌ濃度に溶解する。９
６穴マイクロプレート（フロウ社製）の各穴に、この溶
菌菌体溶解液を０．１ｍｌずつ分注し、溶菌菌体が穴に
十分に結合するよう室温にて一夜培養した後、溶菌菌体
溶液を除去し各穴を０．１％ＴＷｅｅｎ２０（ポリオキ
シエチレン−ソルビタンモノラウリル酸）加ＰＢＳ（リ
ン酸緩衝生理食塩水）の洗浄液で３回洗浄する。次に５
％牛血清アルブミン、１％カゼイン加ＰＢＳを各穴に
０．１ｍｌずつ分注し、３７℃、１時間培養し、穴の非
結合部位をブロックすることによりＥＩＡアッセイ中に
生じる抗体の非特異的結合が最小限になるようにした。
さらに洗浄を行なった後、このマイクロプレートを使用
に供した。

【００４７】前記２）のウサギ血清を５％ウシ血清アル
ブミンと５％ウシ血清グロブリン加ＰＢＳで３０、１０
０、３００、１０００、３０００、１００００倍に希釈
した溶液を各穴に０．０５ｍｌずつ加え３７℃、１時間
静置した（陰性対照試料には、非免疫ウサギの血清を同
様に希釈して用いた）。次に、各穴を洗浄液で洗浄し、
酵素標識二次抗体としてホースラディッシュパーオキシ
ダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清（カペル社製）溶液
を各穴に０．０５ｍｌずつ分注し３７℃、１時間静置し
た。これを洗浄後、ＯＰＤ溶液を０．１ｍｌずつ分注
し、室温で１５分間反応後１Ｎ硫酸を０．１ｍｌずつ分
注してホースラディッシュパーオキシダーゼの反応を停
止し、このマイクロプレート各穴の４９２ｎｍにおける
吸光度を吸光度測定装置を用いて測定した。その結果、
本合成ペプチドを免疫原に用いて作製された抗体はＭＲ
ＳＡと抗原抗体反応することがわかった（図３）。

【００４８】〔実施例４〕本例は実施例３の２）で得ら
れたウサギ免疫血清を用いてＭＲＳＡを検出する方法を
ＲＩＡサンドイッチ法での例により示したものである。 １）免疫血清からのＭＲＳＡ特異抗体の精製 ＣＮＢｒ−ＳｅＰｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシア社
製）ゲルに常法にしたがい実施例３で得られた合成ペプ
チドａ）をカップリングさせる。ゲルを０．０５Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄後、カラムに移し、実施例
３の２）で得られた血清をペリスタポンプで循環させな
がら４℃にて一夜置き、ゲルにカップリングした該合成
ペプチドと免疫血清中のＭＲＳＡ特異抗体とを反応させ
た。ゲルを洗浄し、非吸着の血清成分を洗い流した後、
１Ｍ酢酸溶液を加え、ＭＲＳＡ特異抗体ａ）を溶出し
た。溶出された抗体はＫ_２ＨＰＯ_４溶液で中和した後、
実施例２の２）に述べられた方法にてその抗体活性が損
なわれていないことを確認した。実施例３で得た合成ペ
プチドｂ）についても同様に行ない、ＭＲＳＡ特異抗体
ｂ）を得た。

【００４９】２）ＲＩＡ反応ビーズの作製 反応支持体として直径６．２５ｍｍポリスチレン製球状
ビーズ（市販品）を用いた。ビーズ１個あたり０．１５
ＭＮａＣｌ加０．０５Ｍリン酸緩衝液０．１６ｍｌに５
μｇの上記精製抗体ｂ）を加え、ビーズ固相化用溶液と
し、ビーズを抗体で固相化する。これを緩衝液で洗浄し
た後、ＲＩＡ抗体ビーズとした。

【００５０】３）ＲＩＡトレーサー（^１２５Ｉ標識抗
体）の作製 放射性同位体ヨウ素はタンパク質のチロシン残基の芳香
環側鎖に置換できて安定な化合物となり有効なトレーサ
ーを与える。上記精製抗体ａ）のヨウ素化を公知のクロ
ラミンＴ法により行なった。すなわち、抗体ａ）と「
^１２５Ｉ」ヨウ化ナトリウムとクロラミンＴの溶液を混
合し、十数秒後、還元剤の二亜硫酸ナトリウムを加える
ことで反応を終了する。ヨウ素化された抗体ａ）はセフ
ァデックスＧ−２５（ＰＤ１０カラム、ファルマシア社
製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、遊離
のヨウ素を除く。これを３％牛血清アルブミン、１％牛
血清グロブリン加ＰＢＳにて希釈調整し、トレーサーと
した。

【００５１】４）アッセイ法 上記のように作製された抗体ビーズ及びトレーサーを用
いてＲＩＡサンドイッチ法を行なった。細菌培養培地に
て、３７℃、一夜振とう培養したＭＲＳＡ菌株を遠心し
て集菌し、タンパク質溶解酵素であるリゾスタフィン
（シグマ社製）を１００ｍｌの培地から集菌された菌当
り２ｍｇ加えることにより溶菌しＭＲＳＡ溶菌菌体とし
た。

【００５２】ＭＲＳＡ溶菌菌体を、１％牛血清アルブミ
ン、１％牛血清グロブリン加ＰＢＳを希釈液とし、３０
０、１００、３０、１０、３、１、０．３μｇ／ｍｌの
溶菌菌体溶液を得た（対照試料として、一般の感受性黄
色ブドウ球菌溶菌菌体（ＭＳＳＡ溶菌菌体）を同様に希
釈して用いた）。６０穴反応トレイ（市販品）の各穴に
溶菌菌体溶液０．１ｍｌ、緩衝液０．２ｍｌを加え、さ
らに抗体ビーズ１個をいれる。室温にて一夜インキキュ
ベートし、ビーズに固相化されたイムノグロブリンとＭ
ＲＳＡ抗原とを十分に反応させた後、生理食塩水でビー
ズを３回洗浄する。次にトレーサー０．２ｍｌを加え、
ビーズに捕獲されたＭＲＳＡ抗原と^１２５Ｉ標識イムノ
グロブリンとを反応させるため、室温で４時間インキュ
ベートした。その後、生理食塩水で３回洗浄し、ビーズ
を測定用試験管に移し、放射線測定装置アロカＶ（アロ
カ社製）を用いて測定した（図４）。

【００５３】〔実施例５〕本例は合成ペプチドを標識抗
原として用いてＭＲＳＡを検出する方法をＲＩＡ競合法
での例により示したものである。 １）ＲＩＡトレーサー（^１２５Ｉ標識合成ペプチド）の
作製 実施例３で得た合成ペプチドａ）と「^１２５Ｉ」ヨウ化
ナトリウムとクロラミンＴの溶液を混合し、十数秒後、
還元剤の二亜硫酸ナトリウムを加えることで反応を終了
する。ヨウ素化された該合成ペプチドａ）はセファデッ
クスＧ−２５（ＰＤ１０カラム、ファルマシア社製）を
用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、遊離のヨウ
素を除く。これを３％牛血清アルブミン、１％牛血清グ
ロブリン化ＰＢＳにて希釈調整し、トレーサーとした。

【００５４】２）アッセイ法 上記のように作製されたトレーサーを用いてＲＩＡ競合
法を行なった。細菌培養培地にて、３７℃、一夜振とう
培養したＭＲＳＡ菌株を遠心して集菌し、タンパク質溶
解酵素であるリゾスタフィン（シグマ社製）を１００ｍ
ｌの培地から集菌された菌当り２ｍｇ加えることにより
溶菌しＭＲＳＡ溶菌菌体とした。

【００５５】ＭＲＳＡ溶菌菌体を、０．１％牛血清アル
ブミン、０．１％アジ化ナトリウム加０．１Ｍほう酸緩
衝液で溶解し、１０００，３００，１００，３０，１
０，３，１μｇ／ｍｌの溶菌菌体溶液を得た（対照試料
として、一般のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌溶菌菌
体（ＭＳＳＡ溶菌菌体）を同様に希釈して用いた）。試
験管に溶菌菌体溶液、トレーサー、１０％牛血清グロブ
リン溶液、前記のほう酸緩衝液、及び実施例４の１）の
精製抗体ａ）のほう酸緩衝液溶解液の各々を０．１ｍｌ
ずつ加え、かくはんした後、室温に一夜放置した。その
後、２５％ポリエチレングリコール６０００溶液１．０
ｍｌを加えかくはんし、さらに遠心を行ない、抗原抗体
結合物、グロブリン、及び精製抗体を沈澱させる。遊離
のトレーサーを含む遠心上清を除去した後、沈澱を放射
線測定装置アロカＶ（アロカ社製）を用いて測定した。
この際、溶菌菌体溶液がＭＲＳＡ菌体溶液であり、さら
にはＭＲＳＡ菌体量の増加に従い精製抗体との結合量が
増加する。従って、逆にトレーサーと精製抗体との結合
量は減少し、ＭＲＳＡ菌体量の増加にともない、沈澱の
測定放射線量は減少する。その結果、本合成ペプチドは
標識抗原として有用であり、また、本法はＭＲＳＡを有
効に検出することがわかった（図５）。

【００５６】〔実施例６〕本例は、実施例１で示した方
法により、７アミノ酸及び１２アミノ酸から構成される
ペプチドを作製し、これらのペプチドがＭＲＳＡ抗体を
検出することから、ペプチドがＭＲＳＡ特異的な抗原を
提供していることをＥＩＡでの方法を例に示したもので
ある。 １）７アミノ酸及び１２アミノ酸から構成されるペプチ
ドの合成 ａ） Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｌｅ ｂ） Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ 実施例１で示した方法により、上記ａ），ｂ）のペプチ
ドを合成した。なお、ペプチドａ）は実施例１のａ）に
示すペプチドの一部を構成する６アミノ酸のＮ端にＴｙ
ｒが結合した７アミノ酸からなるものであり、ペプチド
ｂ）は実施例１のａ）に示すペプチドの一部を構成する
１２アミノ酸からなるものである。 ２）ＥＩＡの方法 実施例２の１）に示した方法により、上記ａ），ｂ）の
合成ペプチドの固相化ＥＩＡマイクロプレートを作製し
た。さらに実施例２の２）に準じＥＩＡを行った。

【００５７】ＭＲＳＡ精製抗原を免疫したウサギ血清試
料を５％牛血清アルブミン加ＰＢＳで３０，１００，３
００，１０００倍に希釈し各穴に０．０５ｍｌ滴下し
て、３７℃、１時間インキュベートした（陰性対照試料
には、非免疫ウサギの血清を同様にして希釈して用い
た）。洗浄後、酵素標識二次抗体としてホースラディッ
シュパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清（カ
ペル社製）を５％牛血清アルブミン加ＰＢＳで１：１０
００に希釈し、各穴に０．０５ｍｌ加え、３７℃、１時
間反応させる。洗浄後、基質としてｏ−フェニレンジア
ミン（ＯＰＤ）を過酸化水素水存在下（２０ｍｇのＯＰ
Ｄ、１０μｇの３５％過酸化水素水をｐＨ５．０の０．
１Ｍクエン酸緩衝液５０ｍｌに溶解）に加える。室温に
１５分間静置するとホースラディッシュパーオキシダー
ゼの働きにより基質が分解され発色する。１Ｎ硫酸を各
穴０．０５ｍｌ加えると酸素反応が阻止され発色がそれ
以上進行しなくなる。この発色を吸光度測定装置の４９
２ｎｍで測定した。その結果、本合成ペプチドはＭＲＳ
Ａ免疫ウサギ血清と反応することがわかった（図６、図
７）。よって、７アミノ酸及び１２アミノ酸から構成さ
れる本ペプチドがＭＲＳＡに特異的な抗原を提供してい
ることが明らかとなった。

【００５８】〔実施例７〕本例はＭＲＳＡ測定検体液を
得る方法として、リゾスタフィンに替えて尿素を用いる
方法を示したものである。細菌培養培地にて、３７℃、
一夜振盪培養したＭＲＳＡ菌株を遠心して集菌し、細菌
培養液にて希釈し、さらに８Ｍ尿素溶液にて１０倍に希
釈し、１×１０^８、１×１０^７、１×１０^６、１×１０
^５、および１×１０^４菌数／ｍｌの菌液を得た。対照と
して尿素溶液を用いず０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）にて希釈した菌液を同様に作製した。作製された菌
液を実施例４に示した方法に従いＲＩＡ法により測定し
た（図８）。

【００５９】〔実施例８〕本例は実施例４の１）で得ら
れたＭＲＳＡ特異抗体を感作したヒツジ赤血球を用い
て、赤血球凝集法によりＭＲＳＡを検出する方法を示し
たものである。固定化ヒツジ赤血球（シグマ社製）を
０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で３回遠心洗浄
し、再度同じ緩衝液に分散させ、固形分０．５％とした
懸濁液に合成ペプチドａ）に対する抗体の溶液を最終濃
度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温で１時間
攪拌することによりヒツジ赤血球に抗体を結合させた。
この混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し未結合
の抗体を除去した後、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．２）に再分散させて抗体感作赤血球を調製した。細
菌培養培地にてＭＲＳＡを３７℃で一夜培養し、ＭＲＳ
Ａ培養液を得た。対照としてＭＳＳＡを同様に培養し
た。

【００６０】得られた菌液を用いてマイクロタイター法
により赤血球凝集反応を行った。すなわち、マイクロタ
イタープレートの各穴にＰＨ７．２のリン酸緩衝液を２
５μｌずつ分注し、ダイリューターを用いてＭＲＳＡ培
養液およびＭＳＳＡ培養液を２倍段階希釈した。段階希
釈した各ウエルに上記の感作赤血球を２５μｌずつ分注
し、ミキサーで３０秒間振盪し室温で１時間静置した
後、結果を目視により判定した（第３表）。

【００６１】

【表３】

【００６２】〔実施例９〕本例は実施例４の１）で得ら
れた精製抗体を用いて菌体よりＭＲＳＡに特異的なタン
パクであるＰＢＰ２′を精製する方法を示したものであ
る。ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシア
社製）ゲル０．６ｇに常法に従いＭＲＳＡ特異抗体３ｍ
ｇをカップリングさせた。ゲルを０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）で平衡化した後、平衡化したゲルに５
０ｍｇ（乾量）のＭＲＳＡのリゾスタフィン溶菌菌液を
冷所にて一夜反応させた。ゲルを５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４）１００ｍｌにて十分に洗浄し非吸着
の菌体成分を洗い流した後、２．５Ｍ塩化マグネシウム
溶液（ｐＨ６．０）を加えＰＢＰ２′を溶出した。溶出
液は０．５ｍｌずつ採取し、２８０ｎｍにおける吸光度
の高いフラクションをプールした。プールした溶出液を
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて一夜透析し塩
化マグネシウムを除いた後、乾燥し、精製ＰＢＰ２′の
０．８ｍｇを獲得した（図９）。

【００６３】〔実施例１０〕本例は実施例１と同様にし
て合成された各合成ペプチドを用いてＭＲＳＡ ＰＢＰ
２′に対するモノクローナル抗体の作製法を示したもの
である。 １）ハイブリドーマの作製 実施例３−１）で得られたａ）−ＢＳＡの合成ペプチド
量に換算して２５μｇを０．１ｍｌの生理食塩水に溶解
してから、フロイントコンプリートアジュバントの等量
と混合して乳化し、この乳化混合物を７週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウス（雌）に２週間間隔で、計７回、皮下に注射
して免疫を行った。最終回の免疫後に、実施例１で得ら
れた合成ペプチドａ）の２５μｇを０．５ｍｌの生理食
塩水に溶解したものをマウスの腹腔内に投与した。この
マウスの牌細胞を３日後に摘出し、マウスミエローマ細
胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１：Ｐ３Ｕ１）とポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて細胞融合させ
た。この融合細胞をＨＡＴ培地で選択後、培養上清の抗
ＰＢＰ２′抗体活性を、実施例９で得られた菌体由来Ｐ
ＢＰ２′抗原をホースラディシュパーオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰＯ）で標識したＰＢＰ２′−ＨＲＰＯを用いて調
べ、更に限界希釈法を用いてクローニングを行い、抗Ｐ
ＢＰ２′モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ＤＭ
２−１２、ＤＭ２−１３、ＤＭ２−３９、ＤＭ２−４
０、ＤＭ２−４５）を確立した。

【００６４】同様に、ＭＲＳＡ菌体由来ＰＢＰ２′に対
するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（ＤＭ４−
１１、ＤＭ４−１７、ＤＭ４−２０、ＤＭ４−２６、Ｄ
Ｍ４−３２）、及び合成ペプチドｂ）に対するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ（ＤＭ３−１、ＤＭ３−
１９、ＤＭ３−２６）を確立した。上記ハイブリドーマ
細胞は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
おり、以下の受託番号がそれぞれに付与されている。 ＤＭ２−１２；微工研菌寄第１３２４０号 ＤＭ４−１７；微工研菌寄第１３２４２号 ＤＭ３−１ ；微工研条寄第４０６５号 ＤＭ３−１９；微工研菌寄第１３２４１号 ２）モノクローナル抗体の作製 確立した抗ＰＢＰ２′モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを１５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有のＤＭＥＭ
培地（ＦＬＯＷ社）で大量培養した。その細胞をプリス
タン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン）処理したＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）に細胞数とし
て、５．０×１０^６個を腹腔内に投与した。２週間後
に、抗体含有腹水を採取した。腹水を４５％硫安で塩析
したものをモノクローナル抗体とした。

【００６５】〔実施例１１〕本例は実施例１０において
得られたモノクローナル抗体が、ＭＲＳＡ抗原特異的で
あり、ＭＳＳＡに対して交差反応しないことをＥＩＡ法
により確認したものである。 １）ＥＩＡ用抗原固相化プレートの作製 ＭＲＳＡのリゾスタフィン（シグマ社製）溶菌菌体を
０．１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に１０μｇ／ｍｌ
濃度となるように溶解した。９６穴マイクロプレート
（フロウ社製）の各穴に、この溶菌菌体溶解液を０．１
ｍｌずつ分注し、室温で一晩静置し、溶菌菌体をプレー
トの各穴に結合させた。次いで溶菌菌体溶液を除去し、
各穴を洗浄後、ブロッキング溶液（５％牛血清アルブミ
ン含有ＰＢＳ）を各穴に分注し、３７℃で１時間インキ
ュベートした。インキュベート後、さらにプレートを洗
浄し、ＥＩＡ用抗原固相化プレートとした。同様にして
ＭＳＳＡ溶菌菌体を固相化したプレートも作製した。

【００６６】２）アッセイ法 実施例１０において確立し得られたモノクローナル抗体
を、前記１）のＥＩＡ用抗原固相化プレートの各穴に
０．０５ｍｌずつ加え、３７℃で１時間インキュベート
した。インキュベート後、各穴を３回洗浄し、ＨＲＰＯ
標識抗マウスＩｇＧヤギ血清（カペル社製）溶液を各穴
に０．０５ｍｌずつ分注し、１時間反応させた。各穴を
４回洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）溶液を
各穴に０．１ｍｌずつ分注し、室温で１５分間反応させ
た。次いで１Ｎ硫酸を０．０５ｍ１ずつ分注し酵素反応
を停止させ、このマイクロプレートの各穴の４９２ｎｍ
における吸光度を測定した。その結果、実施例１０で作
製されたモノクローナル抗体は、ＭＲＳＡと抗原抗体反
応するが、ＭＳＳＡとは反応しないＭＲＳＡ特異的な抗
体であることが確認された（第４表〜第６表）。

【００６７】

【表４】

【００６８】

【表５】

【００６９】

【表６】

【００７０】〔実施例１２〕本例は実施例１０において
得られたモノクローナル抗体を用いて、ＭＲＳＡを検出
する方法を、ＲＩＡサンドイッチ法での例により示した
ものである。 １）ＲＩＡ反応ビーズの作製 反応支持体として直径６．２５ｍｍのポリスチレン製球
状ビーズ（市販品）を用いた。４５％硫安により塩析し
たモノクローナル抗体ＤＭ３−１を、０．１５ＭＮａＣ
１加０．０５Ｍリン酸緩衝液にビーズ１個あたり５μｇ
となるように溶解し、ビーズ固相化用溶液として、ビー
ズを抗体で固相化した。これを緩衝液で洗浄した後、Ｒ
ＩＡ用ビーズとした。

【００７１】２）ＲＩＡトレーサー（^１２５Ｉ標識抗
体）の作製 トレーサーは以下の４種のモノクローナル抗体について
作製した。ＤＭ２−１２（抗−合成ペプチドａ）抗
体）、ＤＭ３−１、ＤＭ３−１９１（抗−合成ペプチド
ｂ）抗体）、ＤＭ４−１７（抗−ＭＲＳＡ菌体由来ＰＢ
Ｐ２′抗体）。ヨウ素標識は公知のクロラミンＴ法によ
り行なった。すなわち、標識用抗体と「^１２５Ｉ」ヨウ
化ナトリウムとクロラミンＴの溶液を混合し、十数秒
後、還元剤の二亜硫酸ナトリウムを加えることにより反
応を停止させる。ヨウ素化されたモノクローナル抗体は
セファデックスＧ−２５（ＰＤ１０カラム、ファルマシ
ア社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、
遊離のヨウ素を除いた。これを３％牛血清アルブミン、
１％牛血清グロブリン加ＰＢＳにて希釈調整したもの
を、トレーサーとして用いた。

【００７２】４）ＲＩＡサンドイッチアッセイ法 上記のように作製された抗体ビーズ及びトレーサーを用
いてＲＩＡサンドイッチ法を行なった。細菌培養培地に
て、３７℃、一夜振とう培養したＭＲＳＡ菌株を遠心し
て集菌した。これにリゾスタフィン（シグマ社製）を、
１００ｍｌの培地から集菌された菌体当り２ｍｇ加える
ことにより溶菌し、ＭＲＳＡ溶菌菌体とした。このＭＲ
ＳＡ溶菌菌体を、希釈液として１％牛血清アルブミン、
１％牛血清グロブリンを含むＰＢＳを用いて、３００、
１００、３０、１０、３、１、０．３菌数／ｍｌに希釈
した。また、対照試料としてＭＳＳＡ溶菌菌体を同様に
希釈して用いた。市販の６０穴反応トレイの各穴に溶菌
菌体溶液０．１ｍｌ、緩衝液０．２ｍｌを加え、さらに
抗体ビーズ１個をいれて、室温で一晩インキュベートし
た。インキュベート後、ビーズを生理食塩水で３回洗浄
し、次いでトレーサー０．２ｍｌを加え、室温で４時間
インキュベートした後、生理食塩水で３回洗浄した。ビ
ーズを測定用試験管に移し、放射線測定装置アロカＶ
（アロカ社製）を用いてビーズの放射線量を測定した
（図１０）。

【００７３】

【発明の効果】本発明によるＭＲＳＡの検出、測定方法
は、ＭＲＳＡに特異的な合成ペプチドあるいは合成ペプ
チドにより作製された抗体、及びその抗体により作製さ
れた菌由来ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′を用いることから、Ｍ
ＲＳＡを特異的かつ高感度に検出でき、ヒト及び動物の
ＭＲＳＡ感染を知る簡便な手法になる。本発明による合
成ペプチドはその構造が明らかであり、他の不純のタン
パク質を含んでいないため、免疫原としての使用に適し
ており、それを用いて得られた抗血清は、ＭＲＳＡと特
異的に反応し、免疫原として有用である。さらに、本発
明による合成ペプチドは、試料中の微量なＭＲＳＡ抗体
の測定に際し、ＥＩＡ，ＲＩＡなどのイムノアッセイに
用いる抗原として使用できる。一方、本発明による抗体
は、その抗原特異性が明らかであり、ＭＲＳＡの検出、
試料中の微量なＭＲＳＡ部分抗原の測定に際し、ＥＩ
Ａ，ＲＩＡなどのイムノアッセイに用いる抗体として利
用できる。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号４ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号５ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号６ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号７ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号８ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号９ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号１１ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号１２ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：１４ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：１５ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ペプチド 配列

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得た合成ペプチドａ）のＲＰ−ＨＰ
ＬＣパターン。

【図２】実施例１で得た合成ペプチドｂ）のＲＰ−ＨＰ
ＬＣパターン。

【図３】実施例３で得られた合成ペプチドを用いて得ら
れた抗体の反応性を示す。

【図４】ウサギ免疫血清を用いたＲＩＡサンドイッチ法
の結果を示す。

【図５】合成ペプチドを標識抗原としたＲＩＡ競合法の
結果を示す。

【図６】実施例６で得た合成ペプチドａ）を固相化して
ＥＩＡ測定を行なった結果を示す。

【図７】実施例６で得た合成ペプチドｂ）を固相化して
ＥＩＡ測定を行なった結果を示す。

【図８】実施例７による尿素で希釈した菌液のＲＩＡ法
の結果を示す。

【図９】実施例９で得たＭＲＳＡ特異抗体カップリング
ゲルでのＰＢＰ２′の溶出パターン。

【図１０】実施例１２で得た各種モノクローナル抗体用
いたＲＩＡサンドイッチアッセイ法の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｅ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ Ｒ 9284−4Ｃ 39/40 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式： Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
   −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，Ｐｒｏ−
   Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｕ，Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
   Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ，Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
   ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
   −Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ，Ｍ
   ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
   ｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
   Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ，Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
   ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
   −Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
   Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｉ
   ｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，あるいはＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ で表わされるペプチド、それらペプチド配列中に少なく
   とも１個のアミノ酸残基を付加したもの、それらペプチ
   ド配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を他のアミノ
   酸に置き換えたもの又はそのペプチド配列のうちの少な
   くとも一部を有し、最大で３２個のアミノ酸残基からな
   り且つＭＲＳＡ ＰＢＰ２′（メチシリン耐性黄色ブド
   ウ球菌ペニシリン結合タンパク２′）に対する抗体と免
   疫学的に反応しうるペプチドからなる群から選ばれたペ
   プチド、次式： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
   −Ｙ （式中、Ｘは、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
   ｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
   Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−、または、
   そのペプチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から
   除いた基あるいは、それらの鎖のアミノ酸残基の少なく
   とも１個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わし、Ｙ
   は、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、またはそのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＣ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす。）または、
   次式： Ｘ′−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
   −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （式中、Ｘ′はＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−、または、そのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす）で表わされ
   るペプチド、それらペプチド配列中に少なくとも１個の
   アミノ酸残基を付加したもの、あるいはそれらのペプチ
   ド中のアミノ酸配列の一部からなり且つＭＲＳＡ ＰＢ
   Ｐ２′に対する抗体と免疫学的に反応しうるペプチド及
   び／又は該ペプチドに対する抗体を使用することを特徴
   とするＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）ある
   いはその破壊物の検出方法。
2. 【請求項２】 次式： Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
   −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，Ｐｒｏ−
   Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｕ，Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
   Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ，Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
   ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
   −Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ，Ｍ
   ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
   ｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
   Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ，Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
   ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
   −Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
   Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｉ
   ｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，あるいはＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ で表わされるペプチド、それらペプチド配列中に少なく
   とも１個のアミノ酸残基を付加したもの、それらペプチ
   ド配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を他のアミノ
   酸に置き換えたもの又はそのペプチド配列のうちの少な
   くとも一部を有し、最大で３２個のアミノ酸残基からな
   り且つＭＲＳＡ ＰＢＰ２′（メチシリン耐性黄色ブド
   ウ球菌ペニシリン結合タンパク２′）に対する抗体と免
   疫学的に反応しうるペプチドからなる群から選ばれたペ
   プチド、次式： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
   −Ｙ （式中、Ｘは、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
   ｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
   Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−、または、
   そのペプチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から
   除いた基あるいは、それらの鎖のアミノ酸残基の少なく
   とも１個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わし、Ｙ
   は、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、またはそのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＣ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす。）または、
   次式： Ｘ′−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
   −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （式中、Ｘ′はＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−、または、そのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす）で表わされ
   るペプチド、それらペプチド配列中に少なくとも１個の
   アミノ酸残基を付加したもの、あるいはそれらのペプチ
   ド中のアミノ酸配列の一部からなり且つＭＲＳＡ ＰＢ
   Ｐ２′に対する抗体と免疫学的に反応しうるペプチド及
   び／又は該ペプチドに対する抗体を使用することを特徴
   とする被検検体中のＭＲＳＡ抗体を検出する方法。
3. 【請求項３】 該ペプチドが、アミノ酸残基のうちの少
   なくとも１個をシステインまたはチロシンで置き換えた
   ものあるいはアミノ酸残基として少なくとも１個のシス
   テインまたはチロシンを付加したものである請求項１又
   は２のうちのいずれかに記載の方法。
4. 【請求項４】 次式： Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
   −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，Ｐｒｏ−
   Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｕ，Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
   Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ，Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
   ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
   −Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ，Ｍ
   ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
   ｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
   Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ，Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
   ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
   −Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
   Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｉ
   ｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，あるいはＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ で表わされるペプチド、それらペプチド配列中に少なく
   とも１個のアミノ酸残基を付加したもの、それらペプチ
   ド配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を他のアミノ
   酸に置き換えたもの又はそのペプチド配列のうちの少な
   くとも一部を有し、最大で３２個のアミノ酸残基からな
   り且つＭＲＳＡ ＰＢＰ２′（メチシリン耐性黄色ブド
   ウ球菌ペニシリン結合タンパク２′）に対する抗体と免
   疫学的に反応しうるペプチドからなる群から選ばれたペ
   プチド、次式： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
   −Ｙ （式中、Ｘは、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
   ｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
   Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−、または、
   そのペプチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から
   除いた基あるいは、それらの鎖のアミノ酸残基の少なく
   とも１個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わし、Ｙ
   は、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、またはそのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＣ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす。）または、
   次式： Ｘ′−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
   −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （式中、Ｘ′はＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−、または、そのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす）で表わされ
   るペプチド、それらペプチド配列中に少なくとも１個の
   アミノ酸残基を付加したもの、あるいはそれらのペプチ
   ド中のアミノ酸配列の一部からなり且つＭＲＳＡ ＰＢ
   Ｐ２′に対する抗体と免疫学的に反応しうるペプチドに
   対する抗体を結合したゲルにＭＲＳＡ培養液あるいはＭ
   ＲＳＡ溶菌菌液を作用させた後、前記ゲルの抗体に結合
   した菌体成分を溶出するアフィニティー クロマトグラ
   フィーにより精製することを特徴とするＭＲＳＡ ＰＢ
   Ｐ２′抗原。
5. 【請求項５】 該ペプチドが、アミノ酸残基のうちの少
   なくとも１個をシステインまたはチロシンで置き換えた
   ものあるいはアミノ酸残基として少なくとも１個のシス
   テインまたはチロシンを付加したものである請求項４に
   記載のＭＲＳＡ ＰＢＰ２′抗原。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のＭＲＳＡ ＰＢＰ２′
   を使用することを特徴とするＭＲＳＡの検出方法。
7. 【請求項７】 請求項４に記載のＭＲＳＡ ＰＢＰ２′
   を使用することを特徴とする被検検体中のＭＲＳＡ抗体
   を検出する方法。
8. 【請求項８】 次式： Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌ
   ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
   −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ，Ｐｒｏ−
   Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｕ，Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
   Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ，Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
   ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
   −Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ，Ｍ
   ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
   ｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
   −Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
   Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ，Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔ
   ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙ
   ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
   −Ａｓｎ一Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
   Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｐｒｏ−Ｉ
   ｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−
   Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，あるいはＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
   ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ で表わされるペプチド、それらペプチド配列中に少なく
   とも１個のアミノ酸残基を付加したもの、それらペプチ
   ド配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を他のアミノ
   酸に置き換えたもの又はそのペプチド配列のうちの少な
   くとも一部を有し、最大で３２個のアミノ酸残基からな
   り且つＭＲＳＡ ＰＢＰ２′（メチシリン耐性黄色ブド
   ウ球菌ペニシリン結合タンパク２′）に対する抗体と免
   疫学的に反応しうるペプチドからなる群から選ばれたペ
   プチド、次式： Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
   −Ｙ （式中、Ｘは、Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
   ｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
   Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−、または、
   そのペプチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から
   除いた基あるいは、それらの鎖のアミノ酸残基の少なく
   とも１個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わし、Ｙ
   は、−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、またはそのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＣ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす。）または、
   次式： Ｘ′−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
   −Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （式中、Ｘ′はＭｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
   −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−、または、そのペ
   プチド鎖から任意の数のアミノ酸をＮ末端側から除いた
   基、あるいはそれらの鎖のアミノ酸残基の少なくとも１
   個を他のアミノ酸に置き換えた基を表わす）で表わされ
   るペプチド、それらペプチド配列中に少なくとも１個の
   アミノ酸残基を付加したもの、あるいはそれらのペプチ
   ド中のアミノ酸配列の一部からなり且つＭＲＳＡ ＰＢ
   Ｐ２′に対する抗体と免疫学的に反応しうるペプチド。
9. 【請求項９】 該ペプチドが、アミノ酸残基のうちの少
   なくとも１個をシステインまたはチロシンで置き換えた
   ものあるいはアミノ酸残基として少なくとも１個のシス
   テインまたはチロシンを付加したものである請求項８に
   記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 ＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に特異的に結合
    することを特徴とするモノクローナルあるいはポリクロ
    ーナル抗体。
11. 【請求項１１】 請求項８または９項に記載のペプチド
    を免疫原として得られたものである請求項１０に記載の
    抗体。
12. 【請求項１２】 請求項４に記載のＭＲＳＡ ＰＢＰ
    ２′を免疫原として得られたＭＲＳＡ ＰＢＰ２′に特
    異的に結合するものである請求項１０に記載の抗体。
13. 【請求項１３】 モノクローナル抗体が、ＤＭ２−１
    ２、ＤＭ２−１３、ＤＭ２−３９、ＤＭ２−４０、ＤＭ
    ２−４５、ＤＭ４−１１、ＤＭ４−１７、ＤＭ４−２
    ０、ＤＭ４−２６、ＤＭ４−３２、ＤＭ３−１、ＤＭ３
    −１９およびＤＭ３−２６である請求項１０に記載の抗
    体。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の抗体を使用する請
    求項１に記載の方法。