JPH05308992A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH05308992A JPH05308992A JP4105920A JP10592092A JPH05308992A JP H05308992 A JPH05308992 A JP H05308992A JP 4105920 A JP4105920 A JP 4105920A JP 10592092 A JP10592092 A JP 10592092A JP H05308992 A JPH05308992 A JP H05308992A
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- monoclonal antibody
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】ロイシンエンケファリンに対するモノクローナ
ル抗体の提供。 【構成】ロイシンエンケファリン（ＬＥＫ）に対するモ
ノクローナル抗体ＲＩＰＴ３６及びＲＩＰＴ７４並びに
同抗体を産出するハイブリドーマ細胞。 【効果】常に均一な抗ＬＥＫモノクローナル抗体を必要
十分量得ることができ、得られたモノクローナル抗体を
用いて、生体試料等に存在するＬＥＫを極めて特異的に
種々の方法により分析することができ、診断医療分野等
に応用される。
ル抗体の提供。 【構成】ロイシンエンケファリン（ＬＥＫ）に対するモ
ノクローナル抗体ＲＩＰＴ３６及びＲＩＰＴ７４並びに
同抗体を産出するハイブリドーマ細胞。 【効果】常に均一な抗ＬＥＫモノクローナル抗体を必要
十分量得ることができ、得られたモノクローナル抗体を
用いて、生体試料等に存在するＬＥＫを極めて特異的に
種々の方法により分析することができ、診断医療分野等
に応用される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ロイシンエンケファリ
ンに対するモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞
に関するものである。本発明の産業上の利用分野として
は、臨床検査及び医薬品製造の分野が挙げられる。
ンに対するモノクローナル抗体及びそれを産生する細胞
に関するものである。本発明の産業上の利用分野として
は、臨床検査及び医薬品製造の分野が挙げられる。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在する微量生理活性物質を特
異的に検出し定量する方法として、抗原‐抗体反応にお
ける免疫学的分子認識特性と放射性同位元素の放射能又
は酵素活性の高感度検出による定量特性を組み合わせた
放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が知られている。免疫測定法は血清など試料中の測
定対象物質を高感度かつ比較的容易に定量できることか
ら、測定対象物質の数が年々増加の一途をたどってお
り、臨床検査など医療福祉の分野において一つの産業を
形成しつつあるがこれら免疫測定法を行う場合、測定対
象となる抗原を特異的に認識する抗体が必要となる。
異的に検出し定量する方法として、抗原‐抗体反応にお
ける免疫学的分子認識特性と放射性同位元素の放射能又
は酵素活性の高感度検出による定量特性を組み合わせた
放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が知られている。免疫測定法は血清など試料中の測
定対象物質を高感度かつ比較的容易に定量できることか
ら、測定対象物質の数が年々増加の一途をたどってお
り、臨床検査など医療福祉の分野において一つの産業を
形成しつつあるがこれら免疫測定法を行う場合、測定対
象となる抗原を特異的に認識する抗体が必要となる。
【０００３】従来、抗体を作成する場合、実験動物に抗
原を何回か注射して免疫感作を行い目的抗原を特異的に
認識する抗体が産生されているかどうか検査し、高感度
に抗原と特異的に結合する抗体ができたときに、実験動
物より血清を採取し、抗体を得る。このようにして得ら
れる抗体はポリクローナル抗体と呼ばれ、抗原の認識結
合部位及び親和力がそれぞれ異なる抗体タンパク質の混
合物で、同じ抗原に対する抗体でも血清を採取する動物
の個体差、種差及び血清採取日の違い等により抗体の性
質は異なってくる。
原を何回か注射して免疫感作を行い目的抗原を特異的に
認識する抗体が産生されているかどうか検査し、高感度
に抗原と特異的に結合する抗体ができたときに、実験動
物より血清を採取し、抗体を得る。このようにして得ら
れる抗体はポリクローナル抗体と呼ばれ、抗原の認識結
合部位及び親和力がそれぞれ異なる抗体タンパク質の混
合物で、同じ抗原に対する抗体でも血清を採取する動物
の個体差、種差及び血清採取日の違い等により抗体の性
質は異なってくる。
【０００４】これに対し、最近均一な抗体タンパク質い
わゆるモノクローナル抗体を得るための技術が開発され
たが、このモノクローナル抗体は、１個のＢ細胞又は１
個の細胞より分裂によって生じた均一な細胞集団によっ
て産生された抗体であり、抗原分子の特定の抗原決定基
のみを認識するものである。これは、また、抗体の特異
性のみならず、クラス、サブクラス、親和力などの性質
も全く均一な抗体の集団である。したがって、モノクロ
ーナル抗体の有効性は、抗体の均一性に求めることがで
き、この性質を利用することにより各種の免疫測定を行
うときに、抗体の不均一性に由来する種々の障害を原理
的に取り除くことができるという特徴を有する。
わゆるモノクローナル抗体を得るための技術が開発され
たが、このモノクローナル抗体は、１個のＢ細胞又は１
個の細胞より分裂によって生じた均一な細胞集団によっ
て産生された抗体であり、抗原分子の特定の抗原決定基
のみを認識するものである。これは、また、抗体の特異
性のみならず、クラス、サブクラス、親和力などの性質
も全く均一な抗体の集団である。したがって、モノクロ
ーナル抗体の有効性は、抗体の均一性に求めることがで
き、この性質を利用することにより各種の免疫測定を行
うときに、抗体の不均一性に由来する種々の障害を原理
的に取り除くことができるという特徴を有する。
【０００５】測定対象生理活性分子に対するモノクロー
ナル抗体を調製するためには、実験動物を測定対象抗原
で免疫感作し、特異的抗体を産生するようになった動物
から脾臓細胞を取り出し、これを骨髄種細胞などの試験
管内で培養できる細胞と融合した細胞（ハイブリドー
マ）をつくり、スクリーニングして目的のモノクローナ
ル抗体をつくるハイブリドーマを選び出し、得られたハ
イブリドーマを利用して、目的のモノクローナル抗体を
得る。
ナル抗体を調製するためには、実験動物を測定対象抗原
で免疫感作し、特異的抗体を産生するようになった動物
から脾臓細胞を取り出し、これを骨髄種細胞などの試験
管内で培養できる細胞と融合した細胞（ハイブリドー
マ）をつくり、スクリーニングして目的のモノクローナ
ル抗体をつくるハイブリドーマを選び出し、得られたハ
イブリドーマを利用して、目的のモノクローナル抗体を
得る。
【０００６】ところで、ロイシンエンケファリンに対す
るモノクローナル抗体を作成する場合、種々の問題点が
挙げられている。第１はロイシンエンケファリンがアミ
ノ酸残基５個からなる分子量５５６の低分子量ペプチド
であるため抗原活性が極めて低いことである。そのため
一般には、ロイシンエンケファリンをウシ血清アルブミ
ン等の高分子担体に化学結合させ、抗原活性を高めた複
合体を調製し、それを用いた免疫感作が行われなければ
ならない。低分子量ペプチドの高分子担体への結合に
は、グルタルアルデヒドなどの２価性架橋試薬が用いら
れるが、架橋反応の効率が低い。さらに架橋反応の原理
が、本質的にペプチドのアミノ酸残基側鎖のアミノ基も
しくはカルボキシル基への化学修飾反応であり、高分子
担体に結合したペプチドの構造は目的ペプチドそれ自身
の構造と異なること、すなわち、架橋反応により修飾さ
れるアミノ酸側鎖の構造がもとのペプチドの側鎖が修飾
されている構造をとることが原理的に避けられない大き
な問題として挙げられる。
るモノクローナル抗体を作成する場合、種々の問題点が
挙げられている。第１はロイシンエンケファリンがアミ
ノ酸残基５個からなる分子量５５６の低分子量ペプチド
であるため抗原活性が極めて低いことである。そのため
一般には、ロイシンエンケファリンをウシ血清アルブミ
ン等の高分子担体に化学結合させ、抗原活性を高めた複
合体を調製し、それを用いた免疫感作が行われなければ
ならない。低分子量ペプチドの高分子担体への結合に
は、グルタルアルデヒドなどの２価性架橋試薬が用いら
れるが、架橋反応の効率が低い。さらに架橋反応の原理
が、本質的にペプチドのアミノ酸残基側鎖のアミノ基も
しくはカルボキシル基への化学修飾反応であり、高分子
担体に結合したペプチドの構造は目的ペプチドそれ自身
の構造と異なること、すなわち、架橋反応により修飾さ
れるアミノ酸側鎖の構造がもとのペプチドの側鎖が修飾
されている構造をとることが原理的に避けられない大き
な問題として挙げられる。
【０００７】第２に、目的のモノクローナル抗体を得る
ために必要な血清中及び培養液中の目的抗体存在有無を
評価するスクリーニングが煩雑なことである。特に、実
験動物への免疫感作時には高分子担体に対しても多くの
種類の抗体が作られることから目的ペプチドに対するモ
ノクローナル抗体の産生をスクリーニングする場合は、
免疫感作に用いられたペプチド結合の高分子複合体を用
いることができず、２種類の異なった抗原を準備しなけ
ればならないという問題がある。
ために必要な血清中及び培養液中の目的抗体存在有無を
評価するスクリーニングが煩雑なことである。特に、実
験動物への免疫感作時には高分子担体に対しても多くの
種類の抗体が作られることから目的ペプチドに対するモ
ノクローナル抗体の産生をスクリーニングする場合は、
免疫感作に用いられたペプチド結合の高分子複合体を用
いることができず、２種類の異なった抗原を準備しなけ
ればならないという問題がある。
【０００８】第３に、抗体作成の対象としているロイシ
ンエンケファリンはＴｙｒ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐
Ｌｅｕというアミノ酸配列を有する生理活性ペプチドで
あるが、生体内にはアミノ末端側に同様なアミノ酸配列
をもつ生理活性ペプチドがいくつか存在しているため、
ロイシンエンケファリンのみを特異的に認識し結合でき
る抗体を得るためには、ロイシンエンケファリンのカル
ボキシ末端近傍の構造を特に認識できる抗体を産生して
いるハイブリドーマ及び抗体を作成することが必要とな
る。
ンエンケファリンはＴｙｒ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐
Ｌｅｕというアミノ酸配列を有する生理活性ペプチドで
あるが、生体内にはアミノ末端側に同様なアミノ酸配列
をもつ生理活性ペプチドがいくつか存在しているため、
ロイシンエンケファリンのみを特異的に認識し結合でき
る抗体を得るためには、ロイシンエンケファリンのカル
ボキシ末端近傍の構造を特に認識できる抗体を産生して
いるハイブリドーマ及び抗体を作成することが必要とな
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記したよ
うな従来のロイシンエンケファリンに対するモノクロー
ナル抗体がもつ問題点を解決し、臨床検査及び医薬品製
造に容易に利用しうる新規モノクローナル抗体を提供す
るすることを目的としてなされたものである。
うな従来のロイシンエンケファリンに対するモノクロー
ナル抗体がもつ問題点を解決し、臨床検査及び医薬品製
造に容易に利用しうる新規モノクローナル抗体を提供す
るすることを目的としてなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ロイシン
エンケファリンに対するモノクローナル抗体に関して鋭
意研究を行い、既に枯草菌及び大腸菌の２種類のＤＨＦ
Ｒを用いて、それぞれのカルボキシ末端に異種ペプチド
を結合した融合タンパク質の発現生産技術を利用し、す
なわち、ロイシンエンケファリンのカルボキシ末端側を
より特異的に認識する抗体を産生する実験動物を得るた
めに、まず枯草菌のＤＨＦＲのカルボキシ末端側にロイ
シンエンケファリンのアミノ末端が連結した融合タンパ
ク質を大腸菌などの宿主で大量に発現させて精製純化
し、実験動物に免疫感作を行うことにより、その目的を
達成しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を
なすに至った。
エンケファリンに対するモノクローナル抗体に関して鋭
意研究を行い、既に枯草菌及び大腸菌の２種類のＤＨＦ
Ｒを用いて、それぞれのカルボキシ末端に異種ペプチド
を結合した融合タンパク質の発現生産技術を利用し、す
なわち、ロイシンエンケファリンのカルボキシ末端側を
より特異的に認識する抗体を産生する実験動物を得るた
めに、まず枯草菌のＤＨＦＲのカルボキシ末端側にロイ
シンエンケファリンのアミノ末端が連結した融合タンパ
ク質を大腸菌などの宿主で大量に発現させて精製純化
し、実験動物に免疫感作を行うことにより、その目的を
達成しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を
なすに至った。
【００１１】すなわち、本発明者は、ロイシンエンケフ
ァリン（以下ＬＥＫと略す）を特異的に認識結合できる
機能を有するモノクローナル抗体ＲＩＰＴ３６、モノク
ローナル抗体ＲＩＰＴ７４及びこれらを産生するハイブ
リドーマ細胞を提供するものである。
ァリン（以下ＬＥＫと略す）を特異的に認識結合できる
機能を有するモノクローナル抗体ＲＩＰＴ３６、モノク
ローナル抗体ＲＩＰＴ７４及びこれらを産生するハイブ
リドーマ細胞を提供するものである。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体を産生する２
種のハイブリドーマ細胞は、（１）遺伝子工学的手段を
用いた目的ペプチドをカルボキシ末端側に有するＤＨＦ
Ｒ融合タンパク質の作成、（２）目的融合タンパク質の
宿主菌からの精製分離、及び（３）高度精製した目的融
合タンパク質を用いた動物の免疫感作、（４）免疫感作
動物の脾臓より調製した脾臓細胞と骨髄腫細胞との細胞
融合によるハイブリドーマの作成、及び（５）目的のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択分
離、により得ることができる。これらのハイブリドーマ
細胞はそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１６号及
びＦＥＲＭ ＢＰ−３８１７号として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。
種のハイブリドーマ細胞は、（１）遺伝子工学的手段を
用いた目的ペプチドをカルボキシ末端側に有するＤＨＦ
Ｒ融合タンパク質の作成、（２）目的融合タンパク質の
宿主菌からの精製分離、及び（３）高度精製した目的融
合タンパク質を用いた動物の免疫感作、（４）免疫感作
動物の脾臓より調製した脾臓細胞と骨髄腫細胞との細胞
融合によるハイブリドーマの作成、及び（５）目的のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択分
離、により得ることができる。これらのハイブリドーマ
細胞はそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８１６号及
びＦＥＲＭ ＢＰ−３８１７号として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。
【００１３】また、本発明のモノクローナル抗体の作成
は、（１）本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの成長増殖、（２）細胞培養液中での大量培養ない
し実験動物腹腔内での大量培養、（３）細胞培養液ない
し腹水などの体液からの精製純化、により得ることがで
きる。
は、（１）本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの成長増殖、（２）細胞培養液中での大量培養ない
し実験動物腹腔内での大量培養、（３）細胞培養液ない
し腹水などの体液からの精製純化、により得ることがで
きる。
【００１４】目的ペプチドをカルボキシ末端側に有する
ＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子工学的手段による作成
方法（ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１１，３１
−３６，１９９２ ）及び目的融合タンパク質の宿主菌
からの精製分離方法は、本発明者らによって既に開発さ
れており（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１１，３
７−４５，１９９２）、その方法に従うことにより、高
度精製した目的融合タンパク質を入手することができ
る。なお、ＤＨＦＲとの融合タンパク質の作成方法は、
枯草菌及び大腸菌由来のＤＨＦＲを用いた方法について
公知であるが、各種生物由来のＤＨＦＲを用いた場合も
可能であることを容易に類推することができることか
ら、本発明は、ＤＨＦＲの起源に限定されない。
ＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子工学的手段による作成
方法（ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１１，３１
−３６，１９９２ ）及び目的融合タンパク質の宿主菌
からの精製分離方法は、本発明者らによって既に開発さ
れており（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１１，３
７−４５，１９９２）、その方法に従うことにより、高
度精製した目的融合タンパク質を入手することができ
る。なお、ＤＨＦＲとの融合タンパク質の作成方法は、
枯草菌及び大腸菌由来のＤＨＦＲを用いた方法について
公知であるが、各種生物由来のＤＨＦＲを用いた場合も
可能であることを容易に類推することができることか
ら、本発明は、ＤＨＦＲの起源に限定されない。
【００１５】高度精製した融合タンパク質を用いた免疫
動物の免疫感作は、通常に行われる免疫感作の方法を用
いて行うことができ、免疫感作の方法によって限定され
ない。すなわち、融合タンパク質をアジュバンドと混合
し、日をおいて数回に分けて注射した後、採血し、血液
中から産生された抗体を検出することにより行うことが
できる。
動物の免疫感作は、通常に行われる免疫感作の方法を用
いて行うことができ、免疫感作の方法によって限定され
ない。すなわち、融合タンパク質をアジュバンドと混合
し、日をおいて数回に分けて注射した後、採血し、血液
中から産生された抗体を検出することにより行うことが
できる。
【００１６】免疫感作は、枯草菌由来のＤＨＦＲのカル
ボキシ末端にＬＥＫを連結させた融合タンパク質（ｂｓ
ＤＨＦＲ‐ＬＥＫ）を調製し、これを免疫感作用実験動
物として用いたＢＡＬＢ／ｃメスマウスにｂｓＤＨＦＲ
‐ＬＥＫを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように生理食
塩水で希釈した後、等容量の完全フロイントアジュバン
ド（１回目）もしくは不完全フロイントアジュバンド
（２及び３回目）と混合し、マウス腹腔内に３週間ごと
３回投与することにより行った。最終注射後１４日目に
は有効な抗体産生が観察される。
ボキシ末端にＬＥＫを連結させた融合タンパク質（ｂｓ
ＤＨＦＲ‐ＬＥＫ）を調製し、これを免疫感作用実験動
物として用いたＢＡＬＢ／ｃメスマウスにｂｓＤＨＦＲ
‐ＬＥＫを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように生理食
塩水で希釈した後、等容量の完全フロイントアジュバン
ド（１回目）もしくは不完全フロイントアジュバンド
（２及び３回目）と混合し、マウス腹腔内に３週間ごと
３回投与することにより行った。最終注射後１４日目に
は有効な抗体産生が観察される。
【００１７】抗体産生は、マウス尾静脈から採血し、血
清を分離し、これを固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により力価を測定することにより行うことができる。
清を分離し、これを固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により力価を測定することにより行うことができる。
【００１８】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこの例で用いている方法又はタンパク
質のみに限定されるものではない。
するが、本発明はこの例で用いている方法又はタンパク
質のみに限定されるものではない。
【００１９】製造例 大腸菌由来のＤＨＦＲのカルボキシ末端にＬＥＫを連結
させた融合タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥＫ）を調製
し、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５で１‐１
０μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。これをＥＬＩＳＡ用の
市販の９６穴マイクロプレートにウェル当り５０μｌず
つ分注し、２時間以上４℃で静置し、ウェルに吸着させ
る。水で３回洗浄後０．５％ＢＳＡ‐０．０２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ‐０．１５Ｍ ＮａＣｌ‐１０ｍＭ リン酸緩衝
液ｐＨ７．５（ＢＥＰＢＳ）でウェルを満たし１時間以
上室温で静置する。続いて０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
‐０．１５Ｍ ＮａＣｌ‐１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ
７．５（ＴＰＢＳ）と水で３回ずつプレートを洗浄した
後よく水を切って、−２０℃で使用直前まで保存する。
測定する血清を１ウェル当り５０μｌずつタンパク質固
定化９６穴マイクロプレートに分注し、１時間室温で反
応後ＴＰＢＳと水で３回ずつ洗浄した後、５０μｌずつ
４００倍に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０‐ＢＥＰＢＳ
（ＴＢＰＢＳ）で希釈した西洋わさびペルオキシターゼ
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体溶液を分注した。
続いて１時間室温で静置後同様にプレートを洗浄しよく
水を切った後、５０μｌずつ各ウェルに０．２５ｍｇ／
ｍｌ ＡＢＴＳ（２，２′‐アジノ‐ビス（３‐エチル
ベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸）‐０．００２５％
Ｈ2Ｏ2‐０．１Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を加
え発色反応を行った。反応は、０．５％のＳＤＳ水溶液
１５０μｌを加えることで停止させ、４０５ｎｍの吸収
増加をコロナ社のマイクロプレートリーダーで測定し、
プレートに残存しているマウスガンマグロブリンを定量
した。この方法により、ＬＥＫに対する抗体のみを検出
でき、ＬＥＫ部分に対して動物が免疫感作されているか
を知ることができる。
させた融合タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥＫ）を調製
し、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５で１‐１
０μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。これをＥＬＩＳＡ用の
市販の９６穴マイクロプレートにウェル当り５０μｌず
つ分注し、２時間以上４℃で静置し、ウェルに吸着させ
る。水で３回洗浄後０．５％ＢＳＡ‐０．０２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ‐０．１５Ｍ ＮａＣｌ‐１０ｍＭ リン酸緩衝
液ｐＨ７．５（ＢＥＰＢＳ）でウェルを満たし１時間以
上室温で静置する。続いて０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
‐０．１５Ｍ ＮａＣｌ‐１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ
７．５（ＴＰＢＳ）と水で３回ずつプレートを洗浄した
後よく水を切って、−２０℃で使用直前まで保存する。
測定する血清を１ウェル当り５０μｌずつタンパク質固
定化９６穴マイクロプレートに分注し、１時間室温で反
応後ＴＰＢＳと水で３回ずつ洗浄した後、５０μｌずつ
４００倍に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０‐ＢＥＰＢＳ
（ＴＢＰＢＳ）で希釈した西洋わさびペルオキシターゼ
標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体溶液を分注した。
続いて１時間室温で静置後同様にプレートを洗浄しよく
水を切った後、５０μｌずつ各ウェルに０．２５ｍｇ／
ｍｌ ＡＢＴＳ（２，２′‐アジノ‐ビス（３‐エチル
ベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸）‐０．００２５％
Ｈ2Ｏ2‐０．１Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を加
え発色反応を行った。反応は、０．５％のＳＤＳ水溶液
１５０μｌを加えることで停止させ、４０５ｎｍの吸収
増加をコロナ社のマイクロプレートリーダーで測定し、
プレートに残存しているマウスガンマグロブリンを定量
した。この方法により、ＬＥＫに対する抗体のみを検出
でき、ＬＥＫ部分に対して動物が免疫感作されているか
を知ることができる。
【００２０】ハイブリドーマの作成は、細胞融合はコー
ラー及びミルステインの方法に従って行うことができ
る。実施例では、３回目の免疫感作を行ったマウスのう
ちＥＬＩＳＡで抗ＬＥＫ活性が強く検出された１匹につ
いて３回目の感作後３週間目に尾静脈内に１７μｇのＤ
ＨＦＲ‐ＬＥＫを含む生理食塩水０．１ｍｌを注射し免
疫系を刺激した後４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は
分散化した脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ｘ６３・Ａｇ８
・６５３株とを５：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ‐
ＲＰＭＩ １ｍｌ中で細胞融合を行った。融合後細胞分
散液は６９５個のウェルに１００μｌずつ分注しＲＰＭ
Ｉ‐ＨＡＴ‐１５％ＦＣＳ培地でハイブリドーマの選択
を行った。ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行
った。
ラー及びミルステインの方法に従って行うことができ
る。実施例では、３回目の免疫感作を行ったマウスのう
ちＥＬＩＳＡで抗ＬＥＫ活性が強く検出された１匹につ
いて３回目の感作後３週間目に尾静脈内に１７μｇのＤ
ＨＦＲ‐ＬＥＫを含む生理食塩水０．１ｍｌを注射し免
疫系を刺激した後４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は
分散化した脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ｘ６３・Ａｇ８
・６５３株とを５：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ‐
ＲＰＭＩ １ｍｌ中で細胞融合を行った。融合後細胞分
散液は６９５個のウェルに１００μｌずつ分注しＲＰＭ
Ｉ‐ＨＡＴ‐１５％ＦＣＳ培地でハイブリドーマの選択
を行った。ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行
った。
【００２１】クローニングしたハイブリドーマがＬＥＫ
に対する抗体を産生しているか否かについては、大腸菌
由来のＤＨＦＲのカルボキシ末端にＬＥＫを連結させた
融合タンパク質を固定化した上記ＥＬＩＳＡに準じて行
った。大腸菌由来のＤＨＦＲのカルボキシ末端にＬＥＫ
を連結させた融合タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥＫ）
をウェルに吸着させ、３回洗浄後、測定するものとし
て、ハイブリドーマの細胞培養液を用いた。
に対する抗体を産生しているか否かについては、大腸菌
由来のＤＨＦＲのカルボキシ末端にＬＥＫを連結させた
融合タンパク質を固定化した上記ＥＬＩＳＡに準じて行
った。大腸菌由来のＤＨＦＲのカルボキシ末端にＬＥＫ
を連結させた融合タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥＫ）
をウェルに吸着させ、３回洗浄後、測定するものとし
て、ハイブリドーマの細胞培養液を用いた。
【００２２】モノクロナール抗体のグロブリンクラス同
定に用いたＥＬＩＳＡは、ザイメッド社の免疫グロブリ
ンクラス同定用抗体キットを用い処方に従って行った。
また、抗ＬＥＫモノクロナール抗体のＬＥＫ認識部位を
調べるために行った各種ペプチドに対する免疫交差活性
測定のためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ｅｃＤ
ＨＦＲ‐ＬＥＫ融合タンパク質１００μｇ／ｍｌで固定
化処理したマイクロプレートの各ウェルに、２０μｇ／
ｍｌの抗ＬＥＫモノクロナール抗体５０μｌとＴＢＰＢ
Ｓで段階希釈した濃度のペプチド溶液５０μｌを分注
し、２時間室温で反応後、ＴＰＢＳと水でプレート洗浄
を行い、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体溶液を用い前述のごとくプレートに
残存した抗ＬＥＫモノクローナル抗体量を発色定量し
た。最終的に２種類のＬＥＫに対するモノクローナル抗
体が得られ、本発明の方法が有効であることが確かめら
れた。
定に用いたＥＬＩＳＡは、ザイメッド社の免疫グロブリ
ンクラス同定用抗体キットを用い処方に従って行った。
また、抗ＬＥＫモノクロナール抗体のＬＥＫ認識部位を
調べるために行った各種ペプチドに対する免疫交差活性
測定のためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ｅｃＤ
ＨＦＲ‐ＬＥＫ融合タンパク質１００μｇ／ｍｌで固定
化処理したマイクロプレートの各ウェルに、２０μｇ／
ｍｌの抗ＬＥＫモノクロナール抗体５０μｌとＴＢＰＢ
Ｓで段階希釈した濃度のペプチド溶液５０μｌを分注
し、２時間室温で反応後、ＴＰＢＳと水でプレート洗浄
を行い、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体溶液を用い前述のごとくプレートに
残存した抗ＬＥＫモノクローナル抗体量を発色定量し
た。最終的に２種類のＬＥＫに対するモノクローナル抗
体が得られ、本発明の方法が有効であることが確かめら
れた。
【００２３】抗ＬＥＫモノクローナル抗体の精製純化
は、抗ＬＥＫモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
大量細胞培養液ないし腹水より公知の手法により精製純
化され、本発明の抗体が必要に応じ十分量得られること
が確かめられた。
は、抗ＬＥＫモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
大量細胞培養液ないし腹水より公知の手法により精製純
化され、本発明の抗体が必要に応じ十分量得られること
が確かめられた。
【００２４】実施例 （Ａ） ＤＨＦＲ‐ＬＥＫ融合タンパク質の免疫感作；
マウス１匹当りＤＨＦＲ‐ＬＥＫ５０μｇ投与群３匹と
１０μｇ投与群３匹の３回免疫感作後のＥＬＩＳＡの結
果を図１及び図２に示した。ＤＨＦＲ‐ＬＥＫをプレー
トに固定化して行ったＥＬＩＳＡでは血清中の抗体価に
両群の差はみられなかったが、ＬＥＫをＢＳＡにグルタ
ルアルデヒド法で結合させて調製したＢＳＡ‐ＬＥＫに
対しては５０μｇ投与群のマウス２匹の血清にのみＬＥ
Ｋ結合活性の存在が認められた。このことは、ＤＨＦＲ
‐ＬＥＫの３回投与により抗ＬＥＫ抗体を発現させるた
めにはＤＨＦＲ‐ＬＥＫ５０μｇ（ＬＥＫ含量：約１．
４μｇ）をマウスに投与すれば、ＤＨＦＲ１分子に１分
子のＬＥＫが結合した融合タンパク質でもＬＥＫに対す
る抗体の産生を惹起できること及びＤＨＦＲはカルボキ
シル末端に遺伝子操作で元来抗原活性のない低分子量ペ
プチドを結合させることにより抗原性を付与できる有用
な担体であることを示している。
マウス１匹当りＤＨＦＲ‐ＬＥＫ５０μｇ投与群３匹と
１０μｇ投与群３匹の３回免疫感作後のＥＬＩＳＡの結
果を図１及び図２に示した。ＤＨＦＲ‐ＬＥＫをプレー
トに固定化して行ったＥＬＩＳＡでは血清中の抗体価に
両群の差はみられなかったが、ＬＥＫをＢＳＡにグルタ
ルアルデヒド法で結合させて調製したＢＳＡ‐ＬＥＫに
対しては５０μｇ投与群のマウス２匹の血清にのみＬＥ
Ｋ結合活性の存在が認められた。このことは、ＤＨＦＲ
‐ＬＥＫの３回投与により抗ＬＥＫ抗体を発現させるた
めにはＤＨＦＲ‐ＬＥＫ５０μｇ（ＬＥＫ含量：約１．
４μｇ）をマウスに投与すれば、ＤＨＦＲ１分子に１分
子のＬＥＫが結合した融合タンパク質でもＬＥＫに対す
る抗体の産生を惹起できること及びＤＨＦＲはカルボキ
シル末端に遺伝子操作で元来抗原活性のない低分子量ペ
プチドを結合させることにより抗原性を付与できる有用
な担体であることを示している。
【００２５】（Ｂ） 抗ＬＥＫ抗体産生ハイブリドーマ
の作成；３回目の免疫感作を行ったマウスのうちＥＬＩ
ＳＡで抗ＬＥＫ活性が強く検出された１匹について、３
回目の感作後３週間目に尾静脈内に１７μｇのｂｃＤＨ
ＦＲ‐ＬＥＫを含む生理食塩水０．１ｍｌを注射し免疫
系を刺激した後４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は分
散化した脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ｘ６３・Ａｇ８・
６５３株とを５：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ‐Ｒ
ＰＭＩ １ｍｌ中で細胞融合を行った。融合後細胞分散
液は６９５個のウェルに１００μｌずつ分注し、ＲＰＭ
Ｉ‐ＨＡＴ‐１５％ＦＣＳ培地でハイブリドーマの選択
を行った。ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行
った。６９５個のウェルに分散させた細胞分散液より、
ＨＡＴ選択により１４６個のウェルでハイブリドーマに
よるコロニーの形成が観察された。ｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥ
Ｋを９６穴マイクロプレートに固定化して行ったＥＬＩ
ＳＡの結果１４６個のウェルのうち１１個のウェルの培
養液にｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥＫ結合活性が認められた。こ
れらのウェルについてクローニングを行いハイブリドー
マを純化して得た１０株について、ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥ
Ｋでプレートを固定化して行ったＥＬＩＳＡにより３株
（Ｎｏ．３６，Ｎｏ．７４，Ｎｏ．１１３）がＬＥＫに
対して抗体結合活性を有していることが判明した。
の作成；３回目の免疫感作を行ったマウスのうちＥＬＩ
ＳＡで抗ＬＥＫ活性が強く検出された１匹について、３
回目の感作後３週間目に尾静脈内に１７μｇのｂｃＤＨ
ＦＲ‐ＬＥＫを含む生理食塩水０．１ｍｌを注射し免疫
系を刺激した後４日目に脾臓を摘出した。細胞融合は分
散化した脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ｘ６３・Ａｇ８・
６５３株とを５：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ‐Ｒ
ＰＭＩ １ｍｌ中で細胞融合を行った。融合後細胞分散
液は６９５個のウェルに１００μｌずつ分注し、ＲＰＭ
Ｉ‐ＨＡＴ‐１５％ＦＣＳ培地でハイブリドーマの選択
を行った。ハイブリドーマのクローニングは希釈法で行
った。６９５個のウェルに分散させた細胞分散液より、
ＨＡＴ選択により１４６個のウェルでハイブリドーマに
よるコロニーの形成が観察された。ｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥ
Ｋを９６穴マイクロプレートに固定化して行ったＥＬＩ
ＳＡの結果１４６個のウェルのうち１１個のウェルの培
養液にｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥＫ結合活性が認められた。こ
れらのウェルについてクローニングを行いハイブリドー
マを純化して得た１０株について、ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥ
Ｋでプレートを固定化して行ったＥＬＩＳＡにより３株
（Ｎｏ．３６，Ｎｏ．７４，Ｎｏ．１１３）がＬＥＫに
対して抗体結合活性を有していることが判明した。
【００２６】（Ｃ） モノクローナル抗体のサブクラス
の同定；ｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥＫ結合活性が認められた１
０株（ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥＫとの結合活性を示した３株
を含む）について、産生しているガンマグロブィンクラ
ス同定のために、ＥＬＩＳＡで判別した。この結果を表
１に示す。この表から明らかなように、１０株のうち７
株がＩｇＧ1ｋタイプであり、残り３株がＩｇＭを産生
している。
の同定；ｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥＫ結合活性が認められた１
０株（ｅｃＤＨＦＲ‐ＬＥＫとの結合活性を示した３株
を含む）について、産生しているガンマグロブィンクラ
ス同定のために、ＥＬＩＳＡで判別した。この結果を表
１に示す。この表から明らかなように、１０株のうち７
株がＩｇＧ1ｋタイプであり、残り３株がＩｇＭを産生
している。
【００２７】
【表１】 注）ＮＴ 試験なし。 ＢＧ バックグラウンド。
【００２８】（Ｄ） ＲＩＰＴ−３６及び−７４抗体の
免疫交差活性；ＬＥＫに対するモノクローナル抗体の免
疫交差性を調べるため表２に示したペプチド及びタンパ
ク質についてＥＬＩＳＡを行った。
免疫交差活性；ＬＥＫに対するモノクローナル抗体の免
疫交差性を調べるため表２に示したペプチド及びタンパ
ク質についてＥＬＩＳＡを行った。
【００２９】
【表２】
【００３０】ＲＩＰＴ−３６及び−７４抗体は、図３な
いし図６に示すようにＬＥＫに対し１０-7Ｍから１０-4
Ｍの濃度範囲で用量反応曲線を示し、ＩＣ50はそれぞれ
３．７４×１０-6Ｍ及び４．６６×１０-6Ｍであった。
このことはｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥＫを用いた定量用ＥＬＩ
ＳＡの可能性を示唆している。両抗体の主要なＬＥＫ認
識部位は、両抗体がロイシンの代わりにメチオニンをカ
ルボキシル末端に持つＭＥＫに対して弱い免疫交差活性
を示した一方、ＬＥＫ‐ＮＨ2やアミノ酸末端側にＬＥ
Ｋのアミノ酸配列を有するα‐ｎｅｏｅｎｄｒｏｐｈｉ
ｎに対して全く交差活性を示さなかったことから、カル
ボキシル末端側にあるロイシン残基の側鎖部分及びカル
ボキシル基であることを示している（図３、図５）。ま
た、両抗体はＤ‐，Ｌ‐ロイシン及びＤ‐Ａｌａ2，Ｄ
‐Ｌｅｕ5‐ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎに対しても交差活性
を示さなかったことは、ロイシン残基の不斉性を認識し
ているとともにＬＥＫの他の部位にも認識部位が存在し
ていることを示唆している。このことは１位のチロシン
残基をスルホン化したＴｙｒ（ｓｕｌ）1‐ｅｎｋｅｐ
ｈａｌｉｎに対する交差活性が両抗体で異なっていたこ
とからも支持される。さらに、大腸菌ＤＨＦＲ‐ＬＥＫ
に対して免疫交差活性を示した反面、免疫感作用に用い
た枯草菌ＤＨＦＲとは反応しなかったことから、両抗体
は枯草菌ＤＨＦＲ‐ＬＥＫのＬＥＫ部分、特にカルボキ
シル末端近傍を特異的に認識している抗体であることが
明らかになった（図４，図６）。
いし図６に示すようにＬＥＫに対し１０-7Ｍから１０-4
Ｍの濃度範囲で用量反応曲線を示し、ＩＣ50はそれぞれ
３．７４×１０-6Ｍ及び４．６６×１０-6Ｍであった。
このことはｂｓＤＨＦＲ‐ＬＥＫを用いた定量用ＥＬＩ
ＳＡの可能性を示唆している。両抗体の主要なＬＥＫ認
識部位は、両抗体がロイシンの代わりにメチオニンをカ
ルボキシル末端に持つＭＥＫに対して弱い免疫交差活性
を示した一方、ＬＥＫ‐ＮＨ2やアミノ酸末端側にＬＥ
Ｋのアミノ酸配列を有するα‐ｎｅｏｅｎｄｒｏｐｈｉ
ｎに対して全く交差活性を示さなかったことから、カル
ボキシル末端側にあるロイシン残基の側鎖部分及びカル
ボキシル基であることを示している（図３、図５）。ま
た、両抗体はＤ‐，Ｌ‐ロイシン及びＤ‐Ａｌａ2，Ｄ
‐Ｌｅｕ5‐ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎに対しても交差活性
を示さなかったことは、ロイシン残基の不斉性を認識し
ているとともにＬＥＫの他の部位にも認識部位が存在し
ていることを示唆している。このことは１位のチロシン
残基をスルホン化したＴｙｒ（ｓｕｌ）1‐ｅｎｋｅｐ
ｈａｌｉｎに対する交差活性が両抗体で異なっていたこ
とからも支持される。さらに、大腸菌ＤＨＦＲ‐ＬＥＫ
に対して免疫交差活性を示した反面、免疫感作用に用い
た枯草菌ＤＨＦＲとは反応しなかったことから、両抗体
は枯草菌ＤＨＦＲ‐ＬＥＫのＬＥＫ部分、特にカルボキ
シル末端近傍を特異的に認識している抗体であることが
明らかになった（図４，図６）。
【００３１】
【発明の効果】本発明のハイブリドーマを用いれば、常
に均一な抗ＬＥＫモノクローナル抗体を必要十分量得る
ことができ、得られたモノクローナル抗体を用いて、生
体試料等に存在するＬＥＫを極めて特異的に種々の方法
により分析することができ、診断医療分野等において貢
献することが大である。
に均一な抗ＬＥＫモノクローナル抗体を必要十分量得る
ことができ、得られたモノクローナル抗体を用いて、生
体試料等に存在するＬＥＫを極めて特異的に種々の方法
により分析することができ、診断医療分野等において貢
献することが大である。
【図１】 本発明の実施例における融合タンパク質の免
疫感作を示す固相酵素免疫測定グラフ。
疫感作を示す固相酵素免疫測定グラフ。
【図２】 上記とは異なる投与量における固相酵素免疫
測定グラフ。
測定グラフ。
【図３】 ＲＩＰＴ３６抗体の用量反応曲線を示すグラ
フ。
フ。
【図４】 ＲＩＰＴ７４抗体の用量反応曲線を示すグラ
フ。
フ。
【図５】 ＲＩＰＴ３６抗体の図３と異なった条件下で
の用量反応曲線を示すグラフ。
の用量反応曲線を示すグラフ。
【図６】 ＲＩＰＴ７４抗体の図４とは異なった条件下
での用量反応曲線を示すグラフ。
での用量反応曲線を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7804−4Ｂ
Claims (4)
- 【請求項１】 ロイシンエンケファリンに対するモノク
ローナル抗体ＲＩＰＴ３６。 - 【請求項２】 ロイシンエンケファリンに対するモノク
ローナル抗体ＲＩＰＴ３６を産生するハイブリドーマ細
胞。 - 【請求項３】 ロイシンエンケファリンに対するモノク
ローナル抗体ＲＩＰＴ７４。 - 【請求項４】 ロイシンエンケファリンに対するモノク
ローナル抗体ＲＩＰＴ７４を産生するハイブリドーマ細
胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4105920A JPH05308992A (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4105920A JPH05308992A (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05308992A true JPH05308992A (ja) | 1993-11-22 |
Family
ID=14420305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4105920A Pending JPH05308992A (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05308992A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537430A (ja) * | 2004-05-13 | 2007-12-20 | ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・アクティエンゲゼルシャフト | 医療診断におけるエンケファリンの前駆体および／またはその断片の使用 |
-
1992
- 1992-03-31 JP JP4105920A patent/JPH05308992A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN=1983 * |
| J NEUROSCI METHODS=1990 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537430A (ja) * | 2004-05-13 | 2007-12-20 | ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・アクティエンゲゼルシャフト | 医療診断におけるエンケファリンの前駆体および／またはその断片の使用 |
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