CN108752480B - 一种免疫原组合物、其制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种免疫原组合物，它包括如下组分：多肽与载体的偶联物和所述的多肽，还提供了制备这种免疫原组合物的方法，包括如下步骤：将多肽与载体的偶联物和所述的多肽按照质量比为：1:5‑5:1混合后，质量比优选为1:1，加入生理盐水将免疫原组合物的混合物稀释到2倍最终浓度，得稀释混合液，再加入与稀释混合液等体积的所述的免疫佐剂稀释至最终浓度，制备得到免疫原组合物；本发明还提供了采用这种免疫原组合物得到的单克隆抗体，最后得出，使用本发明中的免疫原组合物对动物进行免疫，免疫后的动物的血清效价得到了显著的提高，大大的增加了单克隆抗体中杂交瘤细胞的阳性率，减少了人力以及物力资源的浪费。
Description
技术领域
本发明属于动物免疫领域，具体涉及制备单克隆抗体领域。
背景技术
杂交瘤技术自1975年建立以来，在现代医学检验，治疗等领域发挥了极为重要的作用。该技术是通过在体外把小鼠骨髓瘤细胞和浆细胞进行融合，筛选出分泌特定抗体的杂交瘤细胞，该细胞同时具有骨髓瘤细胞的永生性和浆细胞持续分泌特定抗体的能力，能在体外进行培养并生产抗体。尽管多年来杂交瘤制备技术不断发展，但传统的单克隆抗体制备过程仍旧繁琐。融合后的杂交瘤细胞筛选通量较大，每块96孔板对应取细胞上清进行ELISA筛查，再进行细胞的多轮克隆化和扩大培养。工作量的多少在很大程度上由产生阳性杂交瘤的多少决定，而阳性杂交瘤的产生依赖于分泌特异性抗体的浆细胞的多少。若前期筛查过程阳性杂交瘤细胞过少，会造成以下几点影响：①为了选出更多的阳性杂交瘤，需要增加更多的铺板板数及融合次数，导致浪费过多的培养耗材及试剂，特别是胎牛血清等高成本试剂；②更多的铺板板数和融合次数以及冗长的ELISA筛查过程导致更多的人力物力消耗；③拖长单克隆抗体的制备周期；所以增加浆细胞的产生就显得尤为重要，但是传统的免疫方式均采用佐剂与抗原混合后进行小鼠免疫，促进淋巴细胞的活化，募集及相互接触，达到增强免疫效果，提高机体免疫应答的抗体滴度，常用的佐剂有弗氏佐剂，RIBI 佐剂，氢氧化铝佐剂等，但在实际应用中发现，传统的免疫方式中采用的免疫原并不能满足所有抗原的免疫及单克隆抗体的制备，所以开发一种新的免疫原来提高抗体的滴度就显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种免疫原组合物，所述的组合物包含如下组分：多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽。
进一步的，所述的多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽的质量比为：1:5-5:1。
进一步的，所述的多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽的质量比为1:1。
进一步的，所述的载体为蛋白质、多肽聚合物和大分子聚合物中的一种。
进一步的，所述的载体为蛋白质。
进一步的，所述的免疫原组合物还包括溶剂与免疫佐剂，所述免疫佐剂的体积等于所述偶联物、所述多肽以及所述溶剂这三种物质体积之和。
进一步的，所述溶剂为生理盐水。
本发明还提供了一种制备上诉免疫原组合物的方法，其方法如下：将多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽按照质量比为：1:5-5:1混合后，质量比优选为1:1，加入生理盐水将免疫原组合物的混合物稀释到2倍最终浓度，得稀释混合液，再加入与稀释混合液等体积的所述的免疫佐剂稀释至最终浓度，制备得到免疫原组合物。
本发明还提供了采用所述免疫原组合物对动物进行免疫的方法，这种方法中包括了向动物注射所述免疫原组合物这一步骤。
本发明还提供了所述免疫原组合物在制备单克隆抗体中的用途。
进一步的，所述的单克隆抗体为抗NT-proBNP单克隆抗体。
进一步的，得到所述抗NT-ptoBNP单克隆抗体，采用的免疫原组合物为NT-proBNP-肽和NT-proBNP-肽与载体结合所形成的偶联物。
进一步的，所述的NT-proBNP-肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步的，所述的单克隆抗体为抗CTNI单克隆抗体；
进一步的，得到所述抗CTNI单克隆抗体，采用的免疫原组合物为CTNI-肽和CTNI-肽与载体结合所形成的偶联物。
进一步的，所述的CTNI-肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
本发明中的最终浓度对于不同的项目，也就是对于制备不同单克隆抗体来说，其中制备免疫原组合物方法中的最终浓度是不一样的，本发明中对于制备抗NT-proBNP单克隆抗体来说，其中制备免疫原组合物方法中的最终浓度设定为1mg/mL，对于制备抗CTNI单克隆抗体来说，其中制备免疫原组合物方法中的最终浓度也设定为1mg/mL。
本发明中的载体为蛋白质、多肽聚合物和大分子聚合物中的一种，而不限于其中的任何一种，其中蛋白质为牛血清蛋白、人血清蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白中的一种或者多种，其中的多肽聚合物为人工合成的载体，其中的大分子聚合物包括羧甲基纤维素和聚乙烯吡咯等，本发明中采用的载体优选为蛋白质。
本发明中的免疫佐剂为化合物和生物制剂中的一种，而不限于其中的任何一种，其中的化合物包括氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80和弗式佐剂等，其中的生物制剂包括细胞因子、热休克蛋白、卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖和类脂A等。
使用本发明中的免疫原组合物能够制备任何的单克隆抗体，不限于制备本发明实施例中提到的抗NT-proBNP单克隆抗体与抗CTNI单克隆抗体，制备NT-proBNP单克隆抗体不限于使用本发明中氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的NT-proBNP-肽，也可以使用针对 NT-proBNP不同表位的肽段；同理，制备CTNI单克隆抗体不限于使用本发明中氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的CTNI-肽，也可以使用针对CTNI不同表位的肽段。
本发明中的动物免疫方法为常规的动物免疫方法。
多肽与抗原的偶联方法：
1、带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的抗原，可直接与载体连接，连接方式有碳二亚胺法、戊二醛法、缓和酸酐法和过碘酸氧化法；
2、无羟基和氨基的抗原，需要用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羟基的衍生物才能与载体连接，常采用琥珀酸酐法、O-(羟甲基)羟胺法、一氯醋钠法和重氮的对氨基苯甲酸法。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：使用本发明中的免疫原组合物对动物进行免疫，免疫后的动物的血清效价得到了显著的提高，大大的增加了杂交瘤细胞的阳性率，为最后得到高效价的单克隆抗体奠定了良好的基础，减少了人力以及物力资源的浪费。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明的有益效果通过如下实施例进行说明：
实施例1抗NT-proBNP单克隆抗体的制备
一、免疫原组合物中NT-proBNP-肽-BSA与NT-proBNP-肽质量比的确定
1、按NT-proBNP-肽-BSA与NT-proBNP-肽质量比分别为1:10,1:5,1:2；1:1；2:1；5:1； 10:1；15:1制备混合免疫原组合物的混合物，再加入生理盐水将免疫原组合物的混合物稀释到2倍最终浓度，得稀释混合液，再加入与稀释混合液等体积的所述的免疫佐剂稀释至最终浓度，制备得到免疫原组合物。(其中的最终浓度为1mg/mL)
2、取免疫原组合物注射免疫小鼠
对小鼠进行背部多点注射，每组分配三只小鼠，100μL/只。
3、测定免疫小鼠的血清效价
a、包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将NT-proBNP稀释至蛋白质含量为5μg/ml。在每个酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
b、加样：尾血按1:1000,1:3000,1:9000……稀释，加稀释完成的尾血0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
c、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml.37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
d、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
e、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
f、结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。实验结果见下表1
4、取脾细胞与骨髓瘤细胞融合
无菌条件下摘取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，同时收获sp2/0，清洗后对两种细胞分别计数，最终按1:1比例混合均匀，进行常规PEG融合，按10万细胞/孔进行铺板培养。
5、融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞并测定其阳性率
包被：NT-proBNP-肽-OVA按5μg/ml，100μl/孔加至酶标板内，4℃过夜；
一抗：洗板3次，取细胞上清，(50μl上清+50μl稀释液)/孔，37℃孵育60min；
二抗：洗板3次，将羊抗鼠酶标二抗，稀释至工作浓度，100μl/孔加样，37℃孵育40min；
显色：洗板3次，加入显色液100μl/孔，显色充分后，加终止液终止，50μl/孔，读取OD值。实验结果见下表1。
表1三只小鼠血清效价以及采用此血清中的B细胞得到的杂交瘤细胞阳性率
结论：从上表1中得出，从血清效价以及阳性孔数占比率两者结合起来分析，当NT-proBNP-肽-BSA与NT-proBNP-肽的质量比在1:5-5:1之间时，该免疫原组合物是适用的，并且效果是比较好的，当NT-proBNP-肽-BSA与NT-proBNP-肽的质量比为1:1时，其效果是最好的。
二、以NT-proBNP-肽-BSA与NT-proBNP-肽质量比为1:1作为免疫原制备单克隆抗体
S1、免疫原组合物(关于NT-proBNP)的制备
1、NT-proBNP-肽的合成：委托吉尔生化(上海)有限公司合成。
2、NT-proBNP-肽-BSA的制备
将NT-proBNP-肽与BSA按比例加入适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1-2h，置室温24h，再进行透析即可。
3、免疫原组合物的制备
S1、取137μL浓度为4.0mg/mL的NT-proBNP-肽-BSA与275μL浓度为2.0mg/mL 的NT-proBNP-肽，将二者混合，在混合液中加入138μL生理盐水，混合，得稀释混合液，再在稀释混合液中加入550μL弗氏佐剂完成乳化，对于首次免疫，前述的弗式佐剂为弗式完全佐剂，对于加强免疫，前述的弗式佐剂为弗式不完全佐剂。
S2、取免疫原组合物注射免疫小鼠：
将S1中得到的乳化后的免疫原组合物对小鼠进行背部皮下多点注射，共计10只，100 μL/只；
S3、测定免疫小鼠的血清效价
其操作步骤与实施例1中一、3中的步骤一致。其实验结果见下表2。
S4、取脾细胞与骨髓瘤细胞融合
其操作步骤与实施例1中一、4中的步骤一致。
S5、融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞并测定其阳性率
其操作步骤与实施例1中一、5中的步骤一致。其实验结果见下表2。
S6、用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％。
S7、采用小鼠体内诱生腹水法制备NT-proBNP-肽单克隆抗体
将筛选出来的细胞株进行数量扩增，数量足够时把细胞重悬至1640基础培养基中，调整细胞浓度为5×106个/mL，注射至已接受石蜡预刺激的小鼠腹腔内，0.5mL/只，观察并收取腹水。
S8、NT-proBNP-肽单克隆抗体的效价的测定
包被：NT-proBNP-肽-OVA按5μg/ml，100μl/孔加至酶标板内，4℃过夜；
一抗：洗板，抗体稀释至1ug/mL(记作1:1000)，3倍倍比稀释，37℃孵育60min；
二抗：洗板，将羊抗鼠酶标二抗，适当稀释后，100μl/孔加样，37℃孵育40min；
显色：洗板，加入显色液100μl/孔，显色充分后，加终止液终止，50μl/孔，读取 OD值。其实验结果见下表3。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于：步骤S1中，抗原是使用单独的NT-proBNP-肽-BSA，其余相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于：在步骤S1中，抗原是使用单独的NT-proBNP-肽，其余相同。
实施例1、对比例1与对比例2中的实验结果
1、小鼠血清效价实验结果
表2小鼠血清(NT-ProBNP)效价
实验结果分析：从实施例1中的实验结果看出，有50％的小鼠的血清效价达到了1×106级别，从对比例1中的实验结果看出，30％的小鼠的血清效价达到了1×105级别，从对比例2中的实验结果看出，只有10％的小鼠的血清效价只达到了1×104级别，由此而看，采用本发明的免疫原组合物对小鼠进行免疫得到的小鼠血清效价明显提高，单独采用免疫原组合物中的任意一种都达不到如此的效果。
2、经过筛选后，测的的杂交瘤细胞阳性率的实验结果
表3杂交瘤细胞阳性率结果
| 铺板板数 | 阳性孔数 | 阳性孔数率 | |
| 实施例1 | 54 | 1036 | 20.0％ |
| 对比例1 | 48 | 623 | 13.5％ |
| 对比例2 | 23 | 47 | 2.1％ |
实验结果分析：从上表3中看出，采用本发明中的免疫原对动物进行免疫后得到的得到的B细胞更容易与骨髓瘤细胞进行融合，并且融合的成功率越高，其中实施例1中的阳性孔数是对比例1的阳性孔数的1.7倍，实施例1中的阳性孔数是对比例2的阳性孔数的 22倍。
3、单克隆抗体的效价的实验结果
表4单克隆抗体(NT-ProBNP)效价实验结果
实验结果分析：从上表4中看出，采用本发明中的免疫原组合物来对小鼠进行免疫后，得到的相应的单克隆抗体的效价为1×106级别，远远高于单独采用免疫原组合物中的任意一种免疫原对小鼠进行免疫后得到的单克隆抗体的效价(分别为1×105和1×104)，并且其有效的单克隆抗体的柱数的总量也远远高于对比例中的方法得到的单克隆抗体的株树的总量。
实施例2抗CTNI单克隆抗体的制备
一、免疫原组合物中CTNI-肽-BSA与CTNI-肽质量比的确定
1、按CTNI-肽-BSA与CTNI-肽质量比分别为1:10,1:5,1:2；1:1；2:1；5:1；10:1；15:1制备混合免疫原组合物的混合物，再加入生理盐水将免疫原组合物的混合物稀释到2倍最终浓度，得稀释混合液，再加入与稀释混合液等体积的所述的免疫佐剂稀释至最终浓度，制备得到免疫原组合物。(其中的最终浓度为1mg/mL)
2、取免疫原组合物组合物注射免疫小鼠
3、测定小鼠血清效价，其过程与实施例1中的过程一致。
4、取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，其过程与实施例1中的过程一致。
5、融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞并测定其阳性率，其过程与实施例1中的过程一致，其实验结果见下表5。
表5三只小鼠血清效价以及采用此血清中的B细胞得到的杂交瘤细胞阳性率
结论：从上表5 中得出，从血清小家以及阳性孔数率占比率两者结合起来分析，当CTNI-肽-BSA与CTNI-肽的质量比在1:5-5:1之间时，该免疫原组合物是有效的，并且效果是比较好的。当CTNI-肽-BSA与CTNI-肽的质量比为1:1时，其效果是最好的。
二、以CTNI-肽-BSA与CTNI-肽质量比为1:1作为免疫原制备单克隆抗体
S1、免疫原组合物(关于CTNI)的制备
1、CTNI-肽的合成：委托吉尔生化(上海)有限公司合成。
2、CTNI-肽-BSA的制备
将NT-proBNP-肽与BSA按比例加入适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1-2h，置室温24h，再进行透析即可。
3、免疫原组合物的制备
取110μL浓度为5.0mg/mL的CTNI-肽-BSA与220μL浓度为2.5mg/mL的CTNI- 肽，将二者混合，在混合液中加入220μL生理盐水，混合，得稀释混合液，再在稀释混合液中加入550μL弗氏佐剂完成乳化，首轮免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂。
S2、取免疫原组合物注射免疫小鼠：
将S1中步骤3中得到的乳化后的抗原对小鼠进行背部皮下多点注射，共计10只，100 μL/只；
S3、测定免疫小鼠的血清效价
其操作步骤与实施例2中一、3中的步骤一致。
S4、取脾细胞与骨髓瘤细胞融合
其操作步骤与实施例2中一、4中的步骤一致。
S5、融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞并测定其阳性率
其操作步骤与实施2中1、5中的步骤一致。其实验结果见下表6。
S6、用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％。
S7、采用小鼠体内诱生腹水法制备CTNI-肽单克隆抗体
将筛选出来的细胞株进行数量扩增，数量足够时把细胞重悬至1640基础培养基中，调整细胞浓度为5×106个/mL，注射至已接受石蜡预刺激的小鼠腹腔内，0.5mL/只，观察并收取腹水。
S8、CTNI-肽单克隆抗体的效价的测定
包被：NT-proBNP-肽-OVA按5μg/ml，100μl/孔加至酶标板内，4℃过夜；
一抗：洗板，抗体稀释至1ug/mL(记作1:1000)，3倍倍比稀释，37℃孵育60min；
二抗：洗板，将羊抗鼠酶标二抗，稀释后，100μl/孔加样，37℃孵育40min；
显色：洗板，加入显色液100μl/孔，显色充分后，加终止液终止，50μl/孔，读取 OD值。其实验结果见下表3。
对比例3
对比例3与实施例2的区别在于：步骤S1中，抗原是使用单独的CTNI-肽-BSA，其余相同。
对比例4
对比例4与实施例2的区别在于：在步骤S1中，抗原是使用单独的CTNI-肽，其余相同。
实施例2、对比例3与对比例4中的实验结果
1、小鼠血清效价实验结果
表6小鼠血清(CTNI)效价
实验结果分析：从实施例2中的实验结果看出，有70％的小鼠的血清效价达到了1×105级别，从对比例3中的实验结果看出，90％的小鼠的血清效价达到了1×104级别，从对比例4中的实验结果看出，只有10％的小鼠的血清效价只达到了1×104级别，由此而看，采用本发明的免疫原组合物对小鼠进行免疫得到的小鼠血清效价明显提高，单独采用免疫原组合物中的任意一种都达不到如此的效果。
2、经过筛选后，测的杂交瘤细胞阳性率的实验结果
表7杂交瘤细胞阳性率结果
| 铺板板数 | 阳性孔数 | 阳性孔数率 | |
| 实施例2 | 44 | 1574 | 37.3％ |
| 对比例3 | 32 | 863 | 28.1％ |
| 对比例4 | 28 | 74 | 2.8％ |
实验结果分析：从上表7中看出，其中实施例2中的阳性孔数是对比例3的阳性孔数的1.8倍，实施例2中的阳性孔数是对比例4的阳性孔数的21倍，由此得出采用本发明中的免疫原对动物进行免疫后得到的得到的B细胞更容易与骨髓瘤细胞进行融合，并且融合的成功率越高。
3、单克隆抗体的效价的实验结果
表8单克隆抗体(CTNI)效价实验结果
实验结果分析：从上表8中看出，采用本发明中的免疫原组合物来对小鼠进行免疫后，得到的相应的单克隆抗体的效价为1×106级别，远远高于单独采用免疫原组合物中的任意一种免疫原对小鼠进行免疫后得到的单克隆抗体的效价(分别为1×105和低于1×104级别)，并且其有效的单克隆抗体的株数的总量也远远高于对比例中的方法得到的单克隆抗体的株树的总量,由此得出采用相同的实验途径以及材料，采用本发明的免疫原得到有效并且质量更高的抗体越多，这无形中就减少了人力以及物力资源的浪费。
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 一种免疫原组合物、其制备方法及其用途
<130> 2018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln
1 5 10 15
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys
1 5 10 15
Leu Gln Leu Lys
20
Claims (8)
1.一种免疫原组合物，其特征在于：它包含如下组分：多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽，所述的多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽的质量比为：1:5-5:1，所述多肽为NT-proBNP-肽或CTNI-肽，所述NT-proBNP-肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的CTNI-肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽的质量比为1:1。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的载体为蛋白质、多肽聚合物和大分子聚合物中的一种。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述的蛋白质为牛血清蛋白、人血清蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白中的一种或者多种。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的组合物还包括溶剂与免疫佐剂，所述免疫佐剂的体积等于所述偶联物、所述多肽以及所述溶剂这三种物质体积之和。
6.一种制备如权利要求1-5任意一项所述的组合物的方法，其特征在于：将多肽与载体结合所形成的偶联物和所述的多肽按照质量比为：1:5-5:1混合后，加入生理盐水将免疫原组合物的混合物稀释到2倍最终浓度，得稀释混合液，再加入与稀释混合液等体积的所述的免疫佐剂稀释至最终浓度，制备得到免疫原组合物。
7.权利要求1-5任意一项所述的组合物在制备抗NT-proBNP单克隆抗体或抗CTNI单克隆抗体中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于：得到所述抗NT-proBNP单克隆抗体，采用的免疫原组合物为NT-proBNP-肽和NTproBNP-肽与载体结合所形成的偶联物；得到所述抗CTNI单克隆抗体，采用的免疫原组合物为CTNI-肽和CTNI-肽与载体结合所形成的偶联物。
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