JPS60156383A - 膣トリコモナス決定因子に対して向けられたモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリツド細胞系統 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　
ｖａｇｉｎａ−１１ｓ）に対して特異的なモノクローナ
ル抗体に関する。より詳しくは、本発明は、腟トリコモ
ナス抗原決定因子に対して特異的なモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ及びそれらの診断アッセイに
おける用途に関するものである。

トリコモナス症は、腟トリコモナスにより引きおこされ
る尿生殖路の慢性病である。それは、あらゆる性的に伝
染される病気の中で最も普通のものであり、米国及び世
界中における感染した個人の間において相当に経済的及
び感情的負担を与えるものである。女性において、トリ
コモナス腟炎は腟上皮の炎症、悪臭を有する分泌物及び
組繊細胞病理により特徴付けられる。殆んどの男性は無
症候であり、この病気の臨床像は議論の予地のあるとこ
ろである。しかしながら尿道炎、前立腺炎、亀頭包皮炎
その他の病気の症状の発現が感染した男性において記録
されている。

現在のトリコモナス症の臨床的診断はたいくつであり、
時間がかかり、極めて不適切なものであり、寄生虫の顕
微鏡検出に基づ（ものである。これらの診断における制
限は、米国及び世界の地方における健康クリニックの既
に制限された医学事情を更に悪化させるものである。こ
の様に、症候性並びに無症候性患者のスクリーニング及
びおそら（は病気の進行を監視するための感度のよい正
確なアッセイの発展などの関連した問題に近づくための
基礎研究が必要である。又、潜在的な痘苗原候補者を明
らかにするための術策の発展も同様に重要であり必要で
ある。

更に、主たる性的に伝染される病気としてのトリコモナ
ス症の脱出は、可能性のある菌力因子の解明に向けられ
た研究を必要としている。腟トリコモナスの表面の特性
化は未だ達成されていない。

更に、通常の完投学的方法の使用は、特異的菌力決定因
子或いは抗原を同定することに失敗している。

従って、腟トリコモナス抗原に対するモノクローナル抗
体を提供することは極めて望ましいことである。その様
な抗体は、ヒトにおけるトリコモナス症病の鑑別的診断
、引き続くワクチンとしての使用のための特異的免疫原
の精製並びに菌力を有する腟トリコモナスの免疫原成分
の構造及び機能の研究に重要であろう。

抗体は、通常骨髄の１３’ｌＪン）８球に由来するリン
パ細胞により合成される。抗体特異性の大きな多様性は
多くの共通の構造的特徴を有するイムノグロブリン分子
により達成される。異質の結合特異性の個々の抗体分子
はそれらの詳細なアミノ酸配列において異り、同一の特
異性の抗体でさえも、通常は実質的には類似の配列では
あるが、異ったアミノ酸配列を有するイムノグロブリン
の混合物である。本発明において「抗体」及び「イムノ
グロブリン」という用語は互換性を有するものとして使
用される。

個々のリンパ球は単一アミノ酸配列のイムノグロブリン
を産生する。リンパ球を直接に培養してそれらの特異的
抗体を産生することは不可能である。しかしながら、コ
ーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）等はＮａｔｕｒｅ２５６：４．
９５（１９７５）において、体細胞融合、特にリン・ξ
球とミエローマ細胞間の融合方法が培養液内で生育し、
特異的抗体を産生ずるハイブリッド細胞をもたらすこと
を示した。ミエローマ細胞はりンノ七球の腫瘍細胞であ
り、それは細胞株の種類に応じてしばしば抗体を自ら産
生ずるものであり、更に、幾つかの「非−産生」株も知
られている。

リンノｅ球及びミエローマ細胞の体細胞融合から生ずる
ハイブリッドは、本発明及び一般的に当該技術において
「ハイシリドーマ」細胞と称されている。典型的な融合
操作において、選ばれた抗原に対して免疫化された動物
からの肺臓リンパ球がミエローマ細胞と融合される。得
られたノ＼イゾリドーマを次いで一連の別々の培養チュ
ーブ或いはマイクロタイタープレートウェル中に分散さ
せ、目的抗体を産生する培養物のスクリーニングを行う
。陽性の培養物を更に希釈して単一細胞から生するコロ
ニー（クローン）を得る。これらのクローンは再び目的
抗体全産生ずるためにスクリーニングを行う。クローン
化されたノ・イブリドーマにより産生される抗体を本発
明及び当該技術においては「モノクローナル」と称する
。

モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原の
みに向けられたものである。更に、同−抗原上の異った
組の決定因子に向けられた異った抗体を典型的に含む通
常の抗体標本とは対照的に。

モノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対しての
み向けられたものである。モノクローナル抗体は、抗原
−抗体結合を使用する診断及び分析アッセイ法の選択性
及び特異性を改良するために有用なものである。モノク
ローナル抗体の第２の利点は、それらがその他のイムノ
グロブリンにより汚染されることなくノ・イブリドーマ
培養により純粋な形態で合成されるという事実により与
えられるものである。モノクローナル抗体は、培養され
たハイブリドーマ細胞の上澄液或いはノ翫イブリドーマ
細胞をマウスの腹腔内接種により誘発された腹水から調
製することができる。

本発明に従えば、腟トリコモナス生物の各種抗原に対し
て高度に特異的且つ均質なモノクローナル抗体を作り出
し、且つ分泌する連続ノ・イブリドーマ細胞系統が確立
される。即ち、腟トリコモナス膜蛋白質抗原、膜表面露
出蛋白質抗原及び見かげ分子量２７０．０００．２３０
．０００．６５，０００或いは３５　、０００　を有す
るある種の膜蛋白質抗原に対して特異性を有するモノク
ローナル抗体を分泌するノ・イブリドーマ細胞系統が製
造される。

腟トリコモナスに対して特異的なモノクローナル抗体を
示すスクリーニングされた３４個のノーイブリッドクロ
ーンのうち、８個のハイブリッド系統をＡＴＣＣ（メリ
ーランド州、ロックビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）に１
ハイブリツド細胞５ｂＢ６、Ｃ２０（Ａ３　）　（ＡＴ
ＣＣコード−）！Ｂ８３７９）、細胞Ｆ２ＦＥ１０（１
２）　（コードＨＢ８３８０）　、細胞５ｂＢ６、Ｃ２
４（２４）　（コードＨＢ８３８１）　、細胞５ｂＢ６
、Ｃ２４（２３）　（コードＨＢ８３８２）　、細胞Ｄ
Ｍ９　（コードＨＢ８３８３）、細胞ＤＭ９２（コード
ＨＢ８３８４）　、細胞Ｆ２ＦＥ１０（Ｃ５５）　（コ
ードＨＢ８３８５）　、及び細胞ＤＭ８６（コードＨＢ
８３８６）として寄託した。

更に、本発明によるモノクローナル抗体は、トリコモナ
ス感染症の免疫学的アッセイに有用な診断試薬を提供す
るものである。

以下の説明は本発明の好ましい実施態様に従うものであ
り、この出願時点における本発明者に知られた最良の態
様を表わすものである。

本発明のハイブリッド細胞系統及びモノクローナル抗体
を発生させる方法に従えば、異った免疫化方法及び以下
に素描するヒトに対して病原性の腟トリコモナスの異っ
た抗原標本を用いて、抗体生成のために試験動物を刺戟
させる。例えば、試験動物の免疫化は、ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの後半身に生きた生物体を皮下接種して行なうか、
或いは、膜物質又は、腟トリコモナスを表わす全蛋白質
のゲル電気泳動を行ない免役化用の重要なアクリルアミ
ド画分を採取することにより得られた蛋白質−アクリル
アミド標本のいずれかを腹腔内注射することにより行わ
れる。全ての場合において、本発明者は、好ましい実施
態様をマウスの、寄生虫物質の不均質な組成物による免
疫化に向け、それにより抗原決足因子の複合配列を提供
した。

宿主動物の免疫化のルート及びスケジュールは、抗体刺
戟及び産生の確立された通常の技術に従う。

本発明者はマウスを試験モデルとして使用したがヒト或
いはそれからの抗体産生細胞を含む任意の哺乳動物を操
作してハイブリッド細胞系統の製造の基礎に役立たせる
ことができる。

免疫化後、免疫リンパ細胞をミエローマ、ゾラスマ細胞
腫或いはハイシリドーマ細胞（以下、集合的にミエロー
マ細胞と称する）と融合させ、培養及び無限に継代培養
することのできるハイブリッド細胞系統を発生させ、多
量のモノクローナル抗体を製造することができる。

本発明の目的のために、融合に選択される免疫リンＡ？
細胞は、免疫化動物からのリン、６節組織或いは肺臓組
織のいずれかから採取されたリン・ぞ球及びそれらの正
常な分化子孫である。本発明において、免疫肺臓細胞は
、マウス系統に関して一層濃縮された便利な抗体産生細
胞の源を提供するので、これらを使用することが好まし
い。ミエローマ細胞は融合ハイブリッドの連続的増殖の
基礎を与える。ミエローマ細胞は、骨髄に対して選択性
を示すプラスマ細胞由来の腫瘍細胞である。プラスマ細
胞腫はプラスマ細胞由来の新生物細胞である。特に、イ
ムノグロブリンを分泌しないリンフ球ハイブリドーマ細
胞を使用することが好ましい。

リン・９球ハイブリドーマ細胞はミエローマ或いはゾラ
スマ細胞膝と正常の分化リン、ｏ細胞との融合により発
生する細胞である。ミエローマ、プラスマ細胞腫及びハ
イブリドーマはイムノグロブリン合成が無いように選択
することができる。

ミエローマ及び免疫化抗体産生細胞が得られる特別の動
物の種類は、一つの種類の細胞を他の種類のものと融合
することが可能であるので特に重要ではない。しかしな
がら、免疫化抗体産生細胞及びミエローマの源は同一種
のものから得られたものであることが好ましい。

一般的に、使用される融合技術は、コーラ−等［Ｋｏｈ
］ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　６：１１−１９　（１９７６）〕及びケネント
等（Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｌｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｅＨｖｂｒｉｄｏｎＩａ（：ｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉ
ｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｖ　８１　：　７７−９１（１９７８）　
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　］に示された方法に従う。融合は一
般的に生育培地中のミエローマ細胞に抗体産生細胞の懸
濁液を添加して達成し、遠心分離してペレットを形成さ
せる。

融合ハイブリッドは次いで腟トリコモナス表面抗原に特
異的な抗体産生についてスクリーニングが行われる。好
ましい実施例に従って得られた膜−特異性モノクローナ
ル抗体は、脂質、糖蛋白質及び蛋白質抗原決定因子など
を含む線膜の各種抗原成分に対して個々の特異性を有す
る抗体を含む。

腟トリコモナス膜抗原に対して特異的な抗体を分泌する
ハイシリドーマを培養して安定な遺伝暗号を有する連続
細胞系統を確立する。これらの細胞系統は、液体窒素下
での凍結及び貯蔵を含む多くの従来の方法の任意のもの
によって貯蔵及び保存することができる。凍結された細
胞系統は再生され、腟トリコモナス抗原に対して特異的
なモノクローナル抗体の合成及び分泌を再開して無限に
培養することができる。分泌された抗体は組織培養上澄
液から通常の沈澱、イオン交換、アフイニテイクロマト
グラフイなどにより回収される。回収された抗体は凍結
乾燥され、余り活性を損失することな（少な（とも数週
間は冷凍下に貯蔵することができる。

以下の具体例は本発明の特別な実施態様を例示するため
に提供されるものであるが、これらは本発明を限定する
趣旨のものではない。

Ａ、抗原の調製 長期生育単離物及び新鮮な単離物と交差反応性のモノク
ローナル抗体の生成のために使用されたヒトに対して病
原性の腟トリコモナスの臨床単離物は株２８６であった
（前記Ａｌｄｅｒｅｔｅ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

■器間、：ｊ９：１０４１−１０４７．１９８３　）。

モノクローナル抗体のアッセイに使用されたその他の株
としては、ＡＴＣＣ（メリーランド州、ロックビル）か
ら購入した長期生育培養物の株ＪＨ３１ＡＪびジョンホ
プキンス大学（メリーランド州、？ルチモア）のマイケ
ル・スペンス氏（Ｍｉｃｈａｅｌ　５ｐｅｎｃｅ　）か
ら得られた新鮮な単離物が含まれる。腟トリコモナスは
、１０％熱不活性化ウマ血清（Ｋａｎｓａｓ　Ｃ１ｔｙ
　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、カンサス州、レ
ネクサ）を補給したＤｉａｍｏｎｄ　）リゾチカーゼ（
ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、
メリーランド州、コツキースピル）酵母エキス−マルト
ース（ＴＹＭ）　−培地（ｐ）１６．２　）中において
生育された。生物体は常法に従って、改良されたＮｅｕ
ｂａｕｅｒ計数室を用いて決定された２、５Ｘ１０〜５
Ｘ１０”／ｍｌ密度まで生育された。対数増殖期の自動
寄生虫のみを利用した。全ての腟トリコモナス株の保存
培養物は１（）チジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；　
ＡＴＣＣ）を含有するＴＹＭ−血清培地中において液体
窒素中に保存した。全ての株はこれらの研究を通して、
マウスにおける９〜１２日後−皮下接種後の病相進展に
より証拠付けられたように伝染性を保有した。

１、免疫化に使用された抗原 ａ、従来の研究（Ａｌｄｅｒｅｔｅ、　Ｉｎｆｅｃｔ、
Ｉｍｍｕｎ　、３９　：性の膜蛋白質に向けられた抗体
形成をもたらしたということを示していた。生きた生物
体で対抗された動物からの肺臓リンパ球が所望とされた
研究に対しては、病原性トリコモナートは１×１０６を
表わす対数増殖期まで生育された。ｍｌ寄生虫当りの生
物体は次いで無菌リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で二度洗
浄され、最終的に０．０５％寒天を有するｎχ−血清中
０．５　ｍｌ　容積当り５Ｘ１０６の密度に再懸濁され
た。二回目の注射は（次の段落において示される如＜　
）　ＴＹＭ−血清培地中の生物体を用いて行われ、その
後ＰＢＳ中に懸濁された腟トリコモナスを用いた三回目
の注射が行われた。

ｂ、蛋白質−アクリルアミド標本を用いた免疫化につい
ては、従来説明された条件及び試薬（Ｐｅｔｅｒ−ｓｏ
ｎ及びＡｌｄｅｒｅｔｅ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｔｍｍｕｎ
、　３７：７５５．１９８２；Ａｌｄｅｒｅｔｅ、　Ｉ
ｎｆｅｃｔ、　Ｔｒｎｍｕｎ、３９：１０４１．１９８
３；Ａｌｄｅｒｅｔｅ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、
４０：２８４．１９８３　）を用いて全トリクロル酢酸
（ＴＣＡ　）−沈澱蛋白質の平板ゲルドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。物
質が負荷された加のレーンの一つからの蛋白質帯域を、
アクリルアミドゲルのＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｕｌｌｉ
ａｎｔブルー染色により可視化し、５０，０００〜７０
．０００に対応する電気泳動移動度を有する蛋白質を切
り取った。このゲルを凍結乾燥１−１粉砕し、無菌蒸留
水中に再懸濁し、これが以下に累描する免役化に使用さ
れた蛋白質−アクリルアミド抗原標本であった。０．７
５ｍｍの厚さの１４Ｘ１６ｃｍ平板アクリルアミドゲル
上の二つの電気泳動試験からの抗原は、好ましい生活規
制を通じて二部のマウスの免疫化に対して十分な物質を
与えた。この抗原は蒸留水に再懸濁された際に最終的に
３Ｔｒ（ｌの容量を与え、この物質の１　ｒｎｅを等容
量のフロイントの完全アジュバントと混合し、残りの２
ｍ１ＶをフロインＰの不完全アジュバントと混合した。

Ｃ１腟トリコモナスの粗製プラスマ膜を２×１０８個の
細胞から生成した。これらの生物体をＰＢＳ中で三回洗
浄後、生物体を１０　ｍＭ　ＭｇＣ１２及び０．５■／
ｒｒＬｌコンカナバリンＡを含有するＰＢＳ中に再懸濁
した。生物体を＃巣し、更にＰＢＳ　−１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２で二回洗浄した。ペレット化したトリコモナーＰ
をＩＯＮの１Ｍグリセロール中に再懸濁し、２ｍＭフェ
ニルメチルースルホニルフルオライｙ　（ＰＭＳＦ）及
び１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有する１０ｍＭ）リス−塩
酸塩緩衝液（トリーｘ　−ＨＣｔ　）　（ｐＨ７，５）
　１２ｍ１中に注入した。１０分間インキュベーション
後、細胞を更にテフロン乳’ｔｔｌ　Ｄｏｕｎｃｅホモ
ジナイザー（２０ストローク）を用いて均質化し、細胞
溶解を、ＺｅｉｓｓＩＭ３０顕微鏡上で暗視野及び位相
光学を用いた細胞標本の検査により確認した。このホモ
ジネートを次いで４ｍｌの０．５８Ｍスクロース上の８
ｍ１．の０，５Ｍマンニトールよりなる二段階勾配上に
重層した。

この勾配を３０分間２５０　ｘｇ　で遠心分離し、得ら
れたペレットが免疫化処方に使用された粗製膜であった
。粗製膜物質の電気泳動分析は、膜トリコモナス膜上に
存在するものとして従来同定されていた免疫原性蛋白質
及び糖蛋白質の存在を確認した（　Ａｌｄｅｒｅｔｅ　
Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ■ｕｎ、４０：２８４．１９８３　
）。

蛋白質の値は、Ｈｒａｄｆｏｒｄの方法により決定した
（　Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　７２：２４８．１９７６　）。

Ｂ、ハイブリドーマ生成に対する免疫化スケジュール免
疫肺臓細胞を発生するために用いられた抗原に応じて異
った免疫化処方が使用された。この実施態様において例
示されるモノクローナル抗体は三つの別々のハイブリッ
ド化実験からのものであり、各々上記抗原を表わすもの
である。各ハイブリッド化には二部のマウスからの肺臓
細胞が用いられた。これらの研究のためには、６〜８週
令のＢＡＬＢ／ＣＪ雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州、パーハーバ−）が用い
られた。

１、生きた生物体 マウスの後半身に注射箇所当り５×１０６以上の生物体
を含有する０・５ｍｌの皮下注射によりマウスの感染を
行った。第二回目のブースター接種は四日目に行い、最
終対抗は加日目に与えられた。肺臓細胞は、生きた生物
体による最後の接種後３日目に免疫化マウスからハイブ
リドーマ産生に使用するために無菌的に取り出された。

この規制方式では、比色分析（ＥＬＩＳＡ　）　及び放
射線免疫沈降−電気泳動（ＲＩＰ　）分析法により検定
された扁力価の血清抗体水準の産生が可能となった。

２、　蛋白質−アクリルアミド及び粗製膜抗原二部のマ
ウスの各々はフロイントの完全アジュバント中の蛋白質
−アクリルアミド抗原による最初の腹腔内注射を受け、
その後１４４日目び四日目にフロイントの不完全アジュ
バント中の蛋白質−アクリルアミドの二回の引続くブー
スター注射を受けた。

同様に、二部のマウスの各々は粗製膜（２■蛋白質／ｍ
１３）及びフロイントの完全アジュバントの１＝１混合
物の１ｍｌの腹腔内注射を与えられた。

又、最初の注射後１４４日目び公日目にフロイントの不
完全アジュバント中の同一の蛋白質割合の二回のブース
ター接種が腹腔内的に与えられた。谷マウスからの肺臓
は、抗原の最終注射後３日目に免疫化されたマウスから
ハイプリドーマ産生に使用するために取り出された。

Ｃ，ハイシリｒ−マの構成 ハイブリドーマは、免疫化されたマウスからの肺臓細胞
とネズミのＳＰ２１０−Ａｇ　１４ハイブリドーマ細胞
（以下５Ｐ２１０と称する）とをオーイ及びヘルゼンパ
ーグ［Ｏｆ　ａｎｄ　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　ＩｎＴ
ｎｕｎｏｇｌｏｈｕｌｉｎ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　）Ｉ
ｙｂｒｊｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ、　’　５ｅｌｅｃ
ｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ“収録（ＲｌＢ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ及
びＳ０Ｍ、　Ｓｈｉｉｇｉ編３５１〜３７１頁、Ｗ、Ｈ
，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄＣｏ、、　１９８０年、Ｓａ
ｎ　Ｆｒａ’ｎｃｉｓｃｏ）　：ｌ　の修正方法を用い
て融合することにより産生された。適当な細胞系統は、
Ｄｕｋｅ大字のニド・ヘイズ氏（ＦＡＨａｙｅｓ　）よ
り得られ、それらは元々ジュールマン等〔Ｓｃｈｕｌｍ
ａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７６：２６９
−２７０（１９７８）　）により示されたようなもので
ある。この５Ｐ２１０ハイブリドーマ細胞系統は、ＢＡ
ＬＢ／ｃ牌臓細胞と肺臓ローマ細胞系統Ｘ　６３−　Ａ
ｇ　８　とのハイブリッドとして形成されたＳＰ２／Ｈ
ＧＬＫ由来のハイブリッド細胞系統である。この細胞系
統は、イムノグロブリン鎖を合成せず、酵素ヒポキサン
テングアニンホスホリゼシルートランスフエラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）を欠き、８−アザグアニンに対して耐性を有
し、Ｌｉ　ｔｔｌｅｆ　１ｅｌｄのヒポギザンチンーア
ミノゾテリンーチミジン（ＨＡＴ　）選択培地の存在下
において死滅する。５Ｐ２１０細胞は、１５％（容量／
容量）の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）、２ｍＭＬ−グ
ルタミン及び５０単位／ｒｎｔ：のペニシリン及び５０
　ｇ　／　ｍｌｌストレプトマイシンを補給されたＤｕ
ｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇ　ｌｅ培地（ＤＭＥＭ　）　
（λ４ｉｃｒｏｂｉｏｌｏ−ｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ　、メリーランＰ州、ウォーカースピル）中で
生育された。ＨＧＰＲＴ−陽性の復帰突然変異体が細胞
培養液中に存在しないことを確認するだめに、Ｓ　！１
０細胞はハイブリッド化実験に使用する直前に８−アザ
グアニン（２０μｇ／ｒｎｌ）を含有するこの培地中で
生育された。

肺臓を、免疫化マウスから無菌的に取り出し、鉗子を用
いてゆつ（りほぐしてＤＭＥＭ−１ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ緩
衝液（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ　）　中の単一細胞懸濁液を調製した。５Ｐ２
１０細胞は、対数増殖期において収穫し、両方の細胞タ
イプは８℃において２７０　Ｘｇ　にて１０分間遠心分
離して採取し、ＤＭＥＭで三回洗浄した。全細胞数はＮ
ｅｕｂａｕｅｒ血球計数器を用いて決定され、生存率は
トリパンブルー排除試験により測定した。

はぼ１０　個の肺臓細胞を、生きた５Ｐ２１０細胞当り
７個の生きた肺臓細胞の割合で５０ｍ１の円錐管中で混
ぜ合せ、得られた細胞懸濁液を２７０　ｘｇ　にて１０
分間遠心分離することによりペレット中に集めた。上澄
培地を除去し、細胞ペレットを含有する管を３７℃の水
浴中に１分間置いた。この細胞ペレットに、１〜２ＸＩ
Ｏ”個の肺臓細胞当り１．ＯｍｌずつのＤＭＥＭ中のポ
リエチレングリコ−ｐｖ　（ＰＥＧ１０００　；　ＡＴ
ＣＣ）の温かい（３７℃）　５０チ（重量／容量）訝液
を１分間に亘ってゆっくり撹拌しながら添加した。この
懸濁液を更に１分間攪拌した。次いで、１ｍ６（１〜２
×１０　個の肺臓細胞当り）のＤＭＥＭを更に１分間に
亘って添加し、この工程をもう一度繰り返した。最後に
、２０％のウシ胎児血清（ハイブリドーマ生育の試験を
行われたもの、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ
５ｏｃｉａｔｅｓ　）　を含む７　ｍｌ　（，１−２×
１０８個の肺臓細胞当り）のＤＭＥＭを２〜３分間に亘
って添加した。これらの細胞を次いで４００×ｇで１０
分間遠心分離し、細胞をＨＹ培地（Ｋｅｎｎｅ−ｔｔ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＭｉｃｒ
ｏｂｊｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　
Ｖｏｌ、　８１．　ｐｐ１７７−９１（１９７８）　Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）
　中にｍ６当り２〜４×１０６個に再懸濁し、９６−ウ
ェルプレート（Ｃｏ５ｔａｒ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ、＝ニ
ージャージ州パインランド）の各ウェル内に２〜４×１
０　個の細胞を含有する□□□μｍｆつに分配し、これ
らを次いで７％ＣＯ２雰囲気を含有する湿潤化されたイ
ンキュベーター内で３７°Ｃにおいてインキュベートし
た。

１日目に］、、１ｔｔｌｅｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、５
ｃｉｅｎｃｅ　１４５ニア０９−７１０（１９６４）に
記載されたＬｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄのＨＡＴ選択培地の
二倍濃度の５０μｍずつを各ウェルに添加した。４日目
に更に５０μｌずつのＨＡＴを各ウェルに添加した。

未融合５Ｐ２１０　ＩＩＩ胞はＨＡＴ中において２４〜
４８時間以内に死滅した。ＨＡＴ培地中における細胞生
育はハイブリッド化の成功を示すものである。ＨＡＴ中
に選択されたハイブリッドクローンは通常６日目までに
観察された。６日目後全てのウェルに１．６刈０−４Ｍ
ヒポキサンチン及び３Ｘ１０−６Ｍグリシンを含有する
ＨＹ培地よりなる（ＨＴ）−グリシン培地を供給した。

成長クローンを含有するウェルを分析して腟トリコモナ
ス表面抗原に向けられたモノクローナル抗体を検出し、
上澄液が寄生虫に対する抗体について陽性である細胞を
これらの個々のウェルからムーウエルの組織培養プレー
ト（Ｃｏ５ｔｅｒ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　）のそれぞれの
ウェルに移した。ハイブリッドクローンはＢＹ培地中に
おいて供給細胞層なしに維持し、逐次拡大してＴ７５（
７５０ｍ２フラスコ；　Ｃｏ５ｔｅｒ　）中で生育させ
、細胞系統を９０チウシ胎児血清（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏ−ｃｉａｔｅｓ　）　−１０％
　ＤＭＳＯ（ＡＴＣＣ）内で液体窒素中において凍結さ
せた。

腟トリコモナス膜抗原に対するモノクローナル抗体の存
在についてのハイブリッドクローン培養上澄液のスクリ
ーニングはＥＬＩＳＡ技術を用いて行われた。対数増殖
期における生きたトリコモナスをＰＢＳ中において良く
洗浄し、１，２５Ｘ１０　個の生物体を有する５０μｌ
を個々のＩｍｍｕｌｏｎ　ｎス）　ＩＪツブウェル（ｒ
）ｙｎａｔｅｃｈ　、ヴアージニア州、アレキサンドリ
ア）に植え付けた。これらの細胞は３７℃で乾燥し、そ
の後１００チエタノールで固定した。抗原−被罹ウエル
は６ケ月間に亘り安定であり、使用されるまで４℃で貯
蔵された。

抗原−被覆ウェルをｐＨ７，２のリン酸緩衝塩水（ＰＢ
Ｓ　）で三回洗浄した。１％（重量／容量）ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ　（３００μｌ）
を室温において各マイクロタイターウェル中において１
時間インキュベートし、プラスチックウェル内に非特異
的蛋白質結合部位を飽和させた。この溶液を次いで吸引
により除去し、ウェルをＰＢＳで三回洗浄し、１００μ
ｌ　のハイブリッドクローン培養上澄液をウェルに添加
し、マイクロタイタープレートを３７℃で１２０分間イ
ンキュベートした。陽性の対照ウェルは、その肺臓がハ
イブリッド化に用いられた同一のマウスから得られたマ
ウスの血清を含有していた。

次いで上澄液を吸引により除去し、マイクロタイターウ
ェルを五目ＰＢＳで洗浄し、ボラ−等の方法（Ｖｏｌｌ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｕｌｌ、ＷＨＯ５３：５５−
６５．１９７６）に従いＰＢＳ中において５００分の１
に希釈されたアルカリ性ホスファターゼ−結合ヤギ抗−
マウスイムノグロブリンを各マイクロタイターウェル中
ニ２００μｌの最終容量まで添加した。これらのマイク
ロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベートし
、その後結合抗血清を吸引により除去し、ウェルを五目
ＰＢＳで洗浄し、各ウェルに３００μｌの酵素基質〔ｐ
−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ　）　；　
１　ｍＭのＭｇＣ１２を含有する１０％（容量／容量）
ジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８）中１　ｍｇ　
／ｍｅ　〕を添加した。加分後に各ウェル中の溶液の吸
光度をＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏ　−ＥＬＩＳＡ読
み取り器（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　％　メリーランド州、ア
レキサンドリア）を用いて４０５　ｎｍ　において分光
光度法により決定した。抗原のない対照ウェルにおいて
得られた背景水準の吸光度よりも少なくとも二倍大きい
吸光度を有するマイクロタイターウェルを腟トリコモナ
ス膜抗原に対する抗体の存在について陽性と評価した。

約５００個のスクリーニングされたノｈイブリッドクロ
ーンのうち四個の安定なハイブリッドが腟トリコモナス
抗原決定因子に対して活性の抗体を示した。検出された
ハイブリッドの一覧表を表１に示す。

アイソタイプ分析 腟トリコモナスに対する抗体について陽性の培養物につ
いて次にウサギ抗−マウスサブクラス抗体試薬及び標準
ＥＬＩＳＡ用ペルオキシダーゼ−結合アフイニテイ精製
ヤギ抗−ウサギＩｇＧ　（Ｈ＆Ｌ　）を用いる標準的免
疫学的アッセイ（マウスイムノグロブリンサブタイプ同
定キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｎ〜ｍｎｎｈｅｉｍ　Ｂ
ｊｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、インディアナ州、インディ
アナロセリス）を使用してマウスの抗体アイソタイプを
同定するための試験を行った。

サブタイプ化のために、５０μｌのノ・イブリドーマ上
澄液を、非特異性部位をＢＳＡで被覆後に上記の如き腟
トリコモナスの全細胞抗原でインキュベートした。３７
℃で２時間後ウェルをＰＢＳで四回洗浄した。次いで各
々サブクラスの特異的イムノグロブリン５０μｌを二重
のウェルに添加した。正常のウサギ血清が陰性対照とし
て使用された。更に２時間インキュベーションし、ＰＢ
Ｓで四回洗浄後間μｌのペルオキシダーゼ−標識化ヤギ
抗−ウサギＩｇＱ抗体を各ウェルに添加した。反応を艶
分間行わせ、ウェルを更に四回ＰＢＳで洗浄した。最後
に、１００μｍ　の新たに調製したベルオキシダーゼ試
薬を各ウェルに添加し、反応を３０分後に停止させた。

色をｒ）ｖｎａｔｅｃｌ１分光光度計を４１５　ｎｍ　
で使用して走査した。各ハイブリッドのアイソタイプ分
析は表１に掲げる。

ＥＬＩ　ＳＡ試験において陽性と評価されたハイブリッ
ドクローンからの培養上澄液を放射線免疫沈澱法（Ａｌ
ｄｅｒｅｔｅ、　Ｉ’ｎｆｅｃｔ、　Ｉｒｒｒｎｕｎ、
　３９：１０４１．１９８３及びＡｌｄｅｒｅｔｅ、　
Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、４０：２８４．１９８３　
）によりトリコモナスの膜蛋白質に対するモノクローナ
ル抗体の存在について分析を行った。

腟トリコモナスの膜蛋白質は、Ａｌｄｅｒｅｔｅ、　Ｉ
ｎｆｅ−ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、４０：２８４．１９８３
の方法により放射性ヨウ素標識を行った。放射性ヨウ素
標識化された細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、ペレット化
された生物体を１　ｍＭ　ＰＭＳＦ　（Ｓｉｇｍａ　）
を含有するＺＯＯμｍのＮＥＴ　（１５０ｍＭ　ＮａＣ
１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　）リス−塩酸塩、ｐ
Ｈ７，２）緩衝液で再懸濁し、３７℃の水浴中に１０分
分間−た。次いで１０％の両性イオン３−１２（Ｚ３−
１２）洗剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｒｅｈｒｉｎｇゆ
っくり均質化させた。更に２００μｍ　のＮＥＴ緩衝液
を追加し、洗剤抽出物をＲｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　５０．
１　口’ターを用いて５係スクロースベツド上で１００
，０００×ｇにおいて３０分間遠心分離を行った。最初
の放射活性の８０係を越える放射活性が上澄液中に通常
通りに回収された。

抗体と混合する前に、Ｚ３−１２抽出物を１００μｌの
１０％（容量／容量）　Ｆｏｒｍａｌｉｎ＝固定された
蛋白質Ａ−株保有Ｓ。ウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　）
で予備吸着させ、非特異的結合蛋白質を除去した。次い
で１００μｍ　の吸着可溶化トリコモナス蛋白質を刃μ
ｌのハイプリドーマ上澄液と混合し、４℃で一晩インキ
ュベートさせた。最後に１００μｌ　の１０％（容量／
容量）固定蛋白質入−保有Ｓ、アウレウスを添加し、イ
ンキュベーションを室温で更に２時間継続した。この蛋
白質入−保有Ｓ、アウレウスー吸着免投複合体を次いで
１０，０００　Ｘ　ｇ　で４分間沈降サセ、ＮＥＴ　−
０，０５＄Ｚ　３−１２緩衝液中で五目洗浄した。放射
線標識化抗原−抗体複合体を次〜・で緩衝液を溶解する
電気泳動内で可俗化させた。

試料を懸濁させ、３分間沸騰し、蛋白質Ａ−株保有Ｓ。

ウレウス細胞を遠心分離により除去した。

畜生虫蛋白質抗原を官有する上澄液を最終的に８ＤＳポ
リアクリルアミド平板ゲル上に負荷させた。

電気泳動は分献に記載されている通りに行（・（Ａｌｄ
ｅｒｅｔｅ　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３９：１０
４１．１９８３　）、ゲルを固定し、フルオログラフィ
ー用に加工した。

蛋白質Ａ−株保有Ｓ。ウレウス細胞を使用前に逐次ＮＥ
Ｔ緩衝液中の０，５％Ｚ３−１２及び０．０５　％Ｚ３
−１２中で洗浄した。これらの研究にお（・て使用され
たホルムアルデヒド−固足蛋白質Ａ−保有Ｓ、アウレウ
ス生物体は随所に記載されて（・る方法に従って生育さ
ね調製された（　Ａｌｄｅｒｅｔｅ及びＲａｓｅｍａｎ
、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｏｎ、２６：］、０４８、１’
９７９　）　、　Ｉ司（蕉に重要なのは、放射性ヨウ素
標識化された生物体を用いて得られたものと同一の分子
量を有するＣ　Ｓ）　メチオニンで生合成され放射標識
化されたトリコモナス蛋白質の免疫沈澱であった。従っ
て、これらの抗原は寄生虫由来の膜蛋白質である。

／ 表１　腟トリコモナス膜蛋白質抗原に対するモノクロＡ
　Ｆ２ＦＥ１０　、　（Ｃ５５）　７／７　＋　−Ａ　
、Ｆ２ＦＥ１０．（１８）　７／７　＋　−Ａ　５ｂＢ
６　、Ｃ２４、（２４）　７／７　＋　＋Ａ　５ｂＢ６
　、Ｃ２４、（２３）　７／７　＋　−１−Ａ　５ｂＢ
６　、Ｃ２０（Ａ３）　７／７　＋　＋Ａ　Ｆ１１Ｄ３
．ＣＩＯ７／７　＋　−Ｂ　０Ｍ９　７／７　＋　＋ Ｂ　ＤＭ８６　７／７　＋　＋ Ｂ　ＤＭ９２　７／７　＋　＋ Ｃアクリル６５．１　７／７　＋　− Ｃアクリル６５，５　７／７　＋　− Ｃアクリル６５　、７　７７７　＋　−Ｃアクリル６５
　、１１　７．／７　＋　−Ｃアクリル６５，１５　７
／７　＋　−Ｃアクリル６５，２０　７ｆｌ　−ト　−
Ｃアクリル６５，２１　７／７　＋　−Ｃアクリル６５
，２２　７／７　＋　−Ｃアクリル６５，２３　７／７
　＋　−−ナル抗体 −Ｉ−＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．λ ＋＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１＋λ ＋　＋　＋　２７０Ｋ　ＩｇＧ２ａ、に＋＋　＋　６５
Ｋ　ＩｇＧ２ａ、に ＋　＋＋２３０Ｋ　ＩｇＧ２ａ、に ＋　−＋−−３５Ｋ　ＩｇＭ、に ＋　〜ト　＋　２７０Ｋ　ＩｇＧ１　、に＋　＋　＋　
２７０Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋　＋　＋　２７０Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＭ ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１ ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．λ ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋　→−＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１ 十　＋　＋　６５Ｋ　ｒｇＧ１ ＋　十　＋　６５Ｋ　ＩｇＣｙｌ、に 表１　（続き） Ｃアクリル６５，２４　７／７　＋ Ｃアクリル６５，２５　７／７　＋　〜Ｃアクリル６５
，２６　７／７　＋　’　−Ｃアクリル６５，２９　７
／７　＋　−Ｃアクリル６５，３５　７ｆｌ　−１，−
Ｃアクリル６５．３６　７７１　＋　−Ｃアクリル６５
　、３８　７７’７　、、ｌＣアクリル６５，４０　７
／７　＋　−Ｃアクリル６５，４１　７／７　→　−Ｃ
アクリル６５．４７　７７１　＋　−膜　抗　原　イム
ノグロブ ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ２ａ、に ＋　＋　＋　６５Ｋ　’ＩｇＧ１．に ＋　＋＋　６５Ｋ　ＩｇＧ２ａ、λ ＋　＋　＋　６５Ｋ　− ＋　＋　＋　６５Ｋ　ｒｇＧｌ、に −ｌ−＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋　−ト　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１　、に＋　＋　＋　６
５Ｋ　ＩｇＧ１．に ＋　＋　＋　６５Ｋ　ＩｇＧ１．に １　融合タイプ：Ａ、Ｂ及びＣはそれぞれ本発明で説明
した生きた生物体、膜標本或いは蛋白質−アクリルアミ
ド抗原で免疫化されたマウスからの肺臓細胞の融合から
得られたハイブリドーマ細胞を指す。

２　ＥＬＩＳＡにより決定された２つの長期間生育培養
物及び５つの新鮮単離物を表わす７つの菌株の７つにお
いて検出された反応性。

３　生育及び増殖の際に流し出された腟トリコモナス分
子の結合のためにポリビニルクロライドマイクロタイタ
ープレート上において吸引分子として腹水モノクローナ
ル抗体を使用したＥＬＩＳＡ反応性。

４　生きた寄生虫でインキュベートされたモノクローナ
ル抗体を用いるフルオレッセインインチオシアネート（
ＦＩＴＣ）　間接イムノフルオレッセンス。

異った抗原を用いた三つの代表的ハイブリッド化実験か
ら得られた総計四個のモノクローナル抗体（表１参照）
は、従来化きた寄生虫で感染されたマウスにおいて高度
に免疫原性であることが示された（　Ａｌｄｅｒｅｔｅ
　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、３４：１０４１．１９
８３　）腟トリコモナス膜蛋白質に向けられたものであ
ることが示された。これらのモノクローナル抗体の１種
以上により見かけ分子量２７０　、０００（２７０Ｋ）
、２３０に１６５Ｋ及び３５Ｋ　を有する四つの異った
腟トリコモナス膜蛋白質が認識された。６５Ｋ及び３５
にの蛋白質は、全ＴＣＡ−沈澱蛋白質物質のゲルプロフ
ィール中に定量的に支配的であるのに対し、これらの分
子の全ては粗製膜標本中に定量的に富んでいるものであ
る。

モノクローナル抗体５ｂＢ６Ｃ２４（２４）、ＤＭ９、
ＤＭＩＯ及びＤＭ８９は分子量２７０にの高度に免疫原
性膜蛋白質に対して特異的であった。モノクローナル抗
体５ｂＢ６Ｃ２０（Ａ３）は２３０Ｋ　ｉ白質に向けら
れたものであった。モノクローナル抗体Ｆ２ＦＥ１０（
Ｃ５５）、Ｆ２ＦＥ１０（１８）、５ｂＢ６Ｃ２４（２
３）及び融合タイプＣからの１９個のモノクローナルは
大きさが６５にの膜蛋白質に向けられたものであった。

ＴＣＡ−沈澱トリコモナス蛋白質の６５に蛋白質バンド
は二次元の電気泳動分析に基づいて３０個までの蛋白質
で構成されていることに注意することが重要である。そ
れぞれのモノクローナル抗体と反応性の等電点電気泳動
で分離可能な６５に蛋白質の正確な正体は未知である。

しかしながら、６５に分子量蛋白質の王たる免疫原は表
１に掲げたモノクローナル（融合タイツＣ）と反応性で
あることが予想される。

の分析 腟トリコモナス膜蛋白質に対して向けられたものである
ことが示された表１に掲げたあ個のモノクローナル抗体
を、可溶化膜蛋白質を抗原として使用する放射性免疫沈
降アッセイにおいて同定した。これらのモノクローナル
抗体のいずれかが、これらの外部膜蛋白質の細胞表面−
露出部分に向けられたものであるかどうかを決定するた
めに、間接イムノフルオレッセンスアッセイにおいてハ
イブリッｒクローン上澄液を使用した。完全細胞を有す
るハイブリッドクローン培養上澄液の吸着は、２００〜
５００μｌ　のハイブリッドクローン培養上澄液を１×
１０　の完全な、洗浄されたトリコモナートで３７℃に
おいて加分間インキュベートすることにより達成された
。融合′ＡＩからの３個のモノクローナル抗体Ｆ１１Ｄ
３Ｃ１０、Ｆ２ＦＥ１０（Ｃ５５）及びＦ２ＦＥ１０（
１８）のみ、及び融合′ＣＩからの全てのモノクローナ
ル抗体は蛍光顕微鏡観察によっては検出することができ
なかった。残りのモノクローナル抗体は寄生虫の強い蛍
光により容易に検出され、従って細胞表面露出蛋白抗原
を認識することを示すものである。これらの抗体により
認識される蛋白質は、高度に免疫原性の膜抗原であり、
これらの抗体による認識に必須のエピトープは生きた可
動生物体上に露出されている。

抗原決定因子の株分布 これらのモノクローナル抗体によって認識される抗原決
定因子が免疫化腟トリコモナス株に独特のものであるか
或いはこの抗原決定因子がその他の病原性ヒトトリコモ
ナス株にも見出されるものであるかを決定することは興
味深いことであった。

従って、二部間に亘って集められた腟トリコモナスの六
つの異った臨床単離物（株２８６、ＪＨ３１Ａ。

ＪＨＨ２Ｈ，ＪＨＨＲ，ＪＨＨＥＬ及びＪＨＨＷ）　を
モノクローナル抗体により認識された抗原決定因子の存
在について検査した。膜蛋白質に向けられたモノクロー
ナル抗体活性を検出するために使用された標準的ＥＬＩ
ＳＡアッセイにおいて各培養上澄液の少量（２００μｌ
）部分を使用した。表１に記載された全てのモノクロー
ナル抗体は、免疫化試薬として使用された同類の株２８
６と同一程度に全ての株を検出した。重要なことは、株
２８６及びＪＨ３１Ａはｉｎ　ｖｉｔｒｏで数年間培養
されたものであり、従って、長期生育培養物を表わすの
に対し、他の菌株は本発明者の実験室において試験前３
〜４日以内に生育された新鮮な単離物であった。

Ｅ、）ＩＪコモナス腟膣炎免役診断 本発明において説明されたバイブＩＪ　ｂ’−−マ細胞
系統及びそれから産生されるモノクローナル抗体は、感
染した個人の腟のスワブにおける腟トリコモナス抗原の
検出に有用である。それらは又、そのまま、他の病因に
より引きおこされる同様な徴候からのトリコモナス腟炎
の区別のための免疫診断試験の開発に有望である。

例１ 上記放射性免疫沈降−電気泳動技術により抗体によって
ＨＲされた四つの膜蛋白質の代表的なものである一組の
モノクローナル抗体について四人の異った感染した個人
からのスワブにおけるトリコモナス抗原の検出について
の評価を行った。これらのモノクローナル抗体試験試薬
は次の各々のハイブリツＰクローンから得られたもので
あった：Ｆ２ＦＥ１０（Ｃ５５）、Ｆ２ＦＥ１０（Ｃ１
８）、５ｂＢ６Ｃ２０（Ａ３）及び５ｂＢ６、Ｃ２４（
２４）。

感染したヒトからの腟の物質よりなる診断試験試料は、
無菌のネジキャンプの付された１５　Ｘ　１２５市チユ
ーブ内におかれた綿棒上に提供され、Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏ
ｐｋｉｎｓ太学のミカエルスペンス（Ｍｉ　ｃｈａｅ　
１Ｓｐｅｎｃｅ　）博士から受け取ったものであった。

本発明者の実験室に到着時にこれらのスワブを１ｍＭＰ
ＭＳ　Ｆを有する１ｍｌの無菌ＰＢＳ中に浸漬し、渦巻
き状に攪拌した。可静性物質を粒状破片から１０．００
０’　ｘ　ｇ　で１０分間の遠心分離により清澄化させ
、水溶性の寄生虫物質を含有すると思われる上澄液を使
用するまで一７０℃に凍結した。ペレットを０．０５％
の両性３−１２洗剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｅｈ
ｒ−ｉｎｇ、Ｉｎｃ、カリフォルニア州う・ジョン）中
に溶解し、遠心分離により再清澄化し、及び洗剤可溶性
物質全又使用するまで凍結（−７０℃）した。

腟トリコモナス蛋白質のモノクローナル抗体試薬による
検出は、ダラー（Ｖｏｌｌｅｒ　）の方法（上記説明）
によりマイクロタイターウェルプレートに吸引分子とし
て吸着した腹水から得られたそれぞれの抗体を用いたＥ
ＬＩＳＡにより達成された。１マイクログラム（１μｇ
）の腹水蛋白質をポリ塩化ビニル製のＩｎＴｎｕｎｌｏ
ｎ　ｎマイクロタイターン°レー）　（Ｔ）ｙｎａｔｅ
ｃｈ　）の個々のウェルに添加し、インキュベーション
を３７℃で一晩継続した。ＥＬＩＳＡに使用する前に非
特異的結合部位を前記と同様にしテＰＢＳ　−ＢＳＡを
用いた２時間のインキュベーションにより阻止した。個
々のウェルに１００μｌ　の水性或いは洗剤−可溶性感
染ヒトスワブ物質を添加し、プレートを３７℃に２時間
置いた。プレートを次いでＰＢＳで三回洗浄し、関μｍ
の株２８６に対するポリクローナルウサギ抗血清を添加
した。更に３７℃テロ０分間インキュベーション後ウェ
ル’！ｒ　ＰＢＳで三回洗浄し、アルカリホスファター
ゼヤギ抗−ウサギ抗体を添加した。３７℃で６０分間イ
ンキュベーション後、ウェルを再び五目ＰＢＳで洗浄し
、基質を添加し、及びウェルを３７℃において更に６０
分間インキュベートした。Ｄｙｎａｔｅｃｈ製マイクロ
タイターウェル走査計を用いて４０５　ｎｍ　の色を記
録した。対照物質は同様の標本及びトリコモナス症の履
歴を有さない正常の個人或いは異った病因の膣炎の個人
から得られたスワブよりなるものであった。

四つの試験モノクローナル抗体タイプの各々は試料の感
染物質の各々と陽性に反応した。試験モツクローナル抗
体タイプのいずれも未感染個人からの対照試料物質とは
有意に反応しなかった。

例２ 感染した個人の体液内の腟トリコモナス膜蛋白質を検出
するための代表的モノクローナル抗体の効率を試験する
別の方法が行われた。対照及び感染志願者女性の腟に１
０ｍ１３の無菌ＰＢＳを注入することにより得られた５
〜７ｍｇの腟洗浄液をＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓ　医学
校のマイケルスベンス氏から得た。

この洗伊液を遠心分離により清澄化し、上澄液を凍結乾
燥により濃縮した。この物質を炭酸緩衝液（Ｖｏｌｌｅ
ｒ　）を用いて５００μｌ　容量に再浴解し、５０μｌ
のアリコートをマイクロタイターウェルプレート（Ｉｒ
ｒ＋ｍｕｌｏｎ　ｎ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）の個々のウ
ェルに入れた。腟トリコモナス２８６に対するポリクロ
ーナルマウス抗血清（５０μｍ　）及び個々のモノクロ
ーナル抗体Ｆ２ＦＥ１０（Ｃ５５）　；　Ｆ２ＦＥ１０
（Ｃ１８）　；　５ｂＢ６Ｃ２０（Ａ３）及び５ｂＢ６
Ｃ２４（２４）の各々を次いで濃縮腟洗浄物質で被覆さ
れた各々のウェルに添加した。

６０分間のインキュベーション後、ウェルを五目ＰＢＳ
で洗浄し、アルカリホスファターゼヤギ抗−マウス抗体
を各ウェルに添加した。３７℃で６０分間インキュベー
ション後プレートを洗浄し、基質を添加した。反応性は
Ｉ）ｙｎａｔｅｃｈ分光光度走査計を用いて４０５　ｎ
ｍ　で記録した。四つの試験されたモノクローナル抗体
タイプの各々は感染個人から取り出された洗浄試料の各
々と反応性を示した。これらのモノクローナル抗体はそ
のいずれも未感染個人からの洗浄試料とは有意程度に反
応しなかった。

例３ 成功したハイブリドーマから発生した全てのモノクロー
ナル抗体について試験をヒトの物質を用いて広範に評価
することができなかったので生育及び増殖の際に流出し
た腟トリコモナス膜蛋白質を検出するこれらのモノクロ
ーナル抗体の能力を評価した。全てのトリコモナス株は
対数増殖期の際に膜蛋白質を流出するのでこれらの膜蛋
白質は体液（腟洗浄液、粘膜、スワブ）中に存在するも
のと思われる。従って、ＥＬＩＳＡ　を使用してモノク
ローナル抗体により検出される寄生虫抗原を測定した。

腹水からのモノクローナル抗体（１μｐＸ）全前記の如
くマイクロタイタープレートウェル（Ｔｍｍｕｌｎｎ　
ＩＩ　、　Ｔ）ｙｎａｔｅｃｈ　）上に吸着させ、対数
増殖期のウェルからの１００μｍ　の培養上澄液を各ウ
ェルに添加した。全てのウェルは非特異的結合部位を被
覆するためにＰＢＳ　−ＢＳＡで予備処理された。

３７℃で２時間後、株２８６に対するウサギ抗−血清を
添加し、ウェルを３７°Ｃのインキュベーターに６０分
分間−た。ウェルを次いで再びＰＢＳで洗浄し、アルカ
リホスファターゼヤギ抗−マウスを添加して３７℃で６
０分間インキュベートさせた。ウェルをＰＢＳで洗浄後
基質を添加し、陽性反応を示す色を４０５　ｎｍ　にお
いて記録した。対照例はＭ、ニューモニアエ（Ｍ、ｐｎ
ｏｕｍｏｎｉａｅ　）の蛋白質抗原並びに正常ウサギ血
清に対して発生されたモノクローナル抗体よりなるもの
であった。又、検出物質の寄生主脈を示すために無菌の
非−接種培地を使用した。

モノクローナル抗体タイプの各々に対する結果を表１に
示す（流出Ａｇとの反応）。

Ｆ、有用性 本発明において説明されたハイブリドーマ細胞系統及び
それから産生されるモノクローナル抗体は、腟トリコモ
ナス生物により示される特異的抗原及び免疫原性成分の
精製及び特性化に有用である。更に、ある与えられたハ
イブリドーマ系統から産生されるモノクローナル抗体は
抗原認識において均質であり、従って、引続くアフイニ
テイクロマトグラフイベースのトリコモナス膜抗原の精
製に有用である。

更に、腟トリコモナスの同一膜抗原の１以上の抗原決定
因子に向けられた異ったモノクローナル抗体の利用可能
性は膜成分の構造及び機能の研究に有用である。同様に
、これらの同一のモノクローナル抗体は、病原性微生物
の細胞表面構造に対する抗体応答のイディオタイプ分析
に価値のあるものである。

最後に、選ばれた腟トリコモナス膜抗原、特に細胞表面
−露出膜蛋白質に向けられたモノクローナル抗体の利用
可能性は、これらの蛋白質の痘苗原としての潜在能力に
ついての研究を容易にする。

以上の説明は、説明及び例示の目的のために特別の実施
態様に向けられたものである。しかしながら、当業者に
は説明された実施態様の調製方法及び実施方法において
本発明の本質から離れることなく多くの修正及び変更が
なされ得ることが明らかであろう。

例えば、ハイブリドーマ細胞系統をヒトミエローマ細胞
と腟トリコモナスの膜抗原に感作させたヒト９７７３球
を融合させて発生させることも可能である。

もう一つの例として、モノクローナル抗体ハこれらのハ
イブリッド化実験に用いられた株２８６以外の個々の腟
トリコモナス株に対して特異的なものを発生させること
も可能である。又、ハイブリドーマ細胞は別のルート及
び方法により免疫化されたマウスの分化したリンパ細胞
から構成することが可能である。同様に、他のマウス株
を使用して本発明において説明した目的に適当な同様の
一連のモノクローナル抗体を作り出すハイシリドーマ細
胞を生成することも可能である。更に、モノクローナル
抗体は膜の蛋白質成分に対するもののみに限られる必要
はない。トリコモナートにのみ見出される膜糖蛋白質の
炭水化物部分或いは独特の脂質に対する抗体を産生ずる
ハイシリドーマを本発明の方法に従って発生させること
ができる。

その様な抗体は、腟トリコモナスの膜の同−或いはその
他の分子の精製、単離及び構造決定に有用であろう。示
された実施態様のこれら及びその他の修正及び用途並び
に本発明のその他の実施態様は当業者に明らかであろう
。従って、本発明者の意図は、冒頭の特許請求の範囲に
全ての均等な修正及び変容を本発明の範囲に含ませるこ
とである。

出願人代理人　猪　股　清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、腟トリコモナス（Ｔｒｊｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇ
   ｉｎａｌｉｓ）の抗原決定因子に対するモノクローナル
   抗体を産生ずる連続ハイブリッド細胞系統から本質的に
   成る組成物であって、該細胞系統がミエローマ細胞及び
   腟トリコモナス抗原に対して免疫化されたリン・ξ球と
   の融合として形成されていることを特徴とする組成物。 ２、ハイブリッド細胞系統が、マウスミエローマ細胞に
   融合された、腟トリコモナス抗原に対して免役化された
   マウスリン、ｅ球の細胞ノーイブリッドである、特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ３、連続ハイブリッド細胞系統が、マウスミエローマ細
   胞に融合された、腟トリコモナス抗原に対して免疫化さ
   れたＢＡＬＢ／ｃマウス免疫牌臓細胞の細胞ハイブリッ
   ドである、特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ４、ハイブリッド細胞系統が、５Ｐ２１０ハイブリドー
   マ細胞に融合された、腟トリコモナス抗原に対して免疫
   化されたマウスリンノソ球の細胞ノ・イブリッドである
   、特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、ハイブリッド細胞系統が、ハイプリドーマクロー・
   ンＡＴＣＣ寄託物ＨＢ８３７９、ＨＢ８３８０、ＨＢ８
   ３８１、ＨＢ８３８２、ＨＢ８３８３、ＨＢ８３８４、
   ＨＢ８３８５或いはＨＢ８３８６から本質的に成る、特
   許請求の範囲第１項記載の組成物。 ６、腟トリコモナス抗原が膜蛋白質抗原である、特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ７、腟トリコモナス抗原が細胞表面露出蛋白質抗原であ
   る、特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ８、腟トリコモナス抗原が見かけ分子量２７０．０００
   、２３０．０００．６５，０００或いは３５．０００を
   有する膜蛋白質抗原である、特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 ９腟トリコモナス抗原が見かけ分子量６５，０００を有
   する膜蛋白質抗原である、特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。 １０、腟トリコモナスの抗原決定因子に対して特異的な
   モノクローナル抗体から本質的になる組成物。 １１、モノクローナル抗体が、腟トリコモナスの膜蛋白
   質抗原に対して特異的である、特許請求の範囲第１０項
   記載の組成物。 １２、モノクローナル抗体が、腟トリコモナスの細胞表
   面露出蛋白質抗原に対して特異的である、特許請求の範
   囲第１０項記載の組成物。 １３、モノクローナル抗体が、見かけ分子量２７０゜０
   ００．２３０．０００．６５．０００又は３５，０００
   を有する膜蛋白質抗原に対して特異的である、特許請求
   の範囲第１０項記載の組成物。 １４、モノクローナル抗体が、見かけ分子量６５，００
   ０を有する膜蛋白質抗原に対して特異的である、特許請
   求の範囲第１０項記載の組成物。 １５、モノクローナル抗体が、ハイブリドーマクローン
   ＡＴＣＣ寄託物ＨＢ８３７９、ＨＢ８３８０．　ＨＢ８
   ３８１、ＨＢ８３８２、ＨＢ８３８３、ＨＢ８３８４、
   ＨＢ８３８５或いはＨＢ８３８６から産生される、特許
   請求の範囲第１０項記載の組成物。 １６、宿主における腟トリコモナス感染を診断する方法
   において、 宿主からの生理学的試料を、腟トリコモナスの抗原決定
   因子に対して特異的なモノクローナル抗体を含む組成物
   と接触させ、 該生理学的試料の抗原物質とモノクローナル抗体間の免
   疫学的結合反応性を測定する、ことを特徴とする方法。 １７、生理学的試料が腟洗浄物質である、特許請求の範
   囲第１６項記載の方法。 １８、生理学的試料が肺組織試料である、特許請求の範
   囲第１６項記載の方法。 １９、モノクローナル抗体が、腟トリコモナスの膜蛋白
   質抗原に対して特異的である、特許請求の範囲第１６項
   記載の方法。 加、モノクローナル抗体力瓢腟トリコモナスの細胞表面
   露出蛋白質抗原に対して特異的である、特許請求の範囲
   第１６項記載の方法。 ２１、モノクローナル抗体が、見かけ分子量２７０゜０
   ００．２３０　、０００．６５．０００或いは３５　、
   ０００を有する膜蛋白質抗原に対して特異的である、特
   許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２２、モノクローナル抗体が、見かけ分子量６５，００
   ０を有する膜蛋白質抗原に対して特異的である、゛　特
   許請求の範囲第１６項記載の方法。