JPS5929622A - モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途Info
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- JPS5929622A JPS5929622A JP13884882A JP13884882A JPS5929622A JP S5929622 A JPS5929622 A JP S5929622A JP 13884882 A JP13884882 A JP 13884882A JP 13884882 A JP13884882 A JP 13884882A JP S5929622 A JPS5929622 A JP S5929622A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔ｌ〕発明の背景
１、技術分野
本発明は、シュードモナス・エルギノーザに対するモノ
クローナル抗体、その製造法およびその用途、すなわち
具体的にはシュードモナス・エルギノーサ感染診断薬な
いし画分類用試薬およびシュードモナス・エルギノーサ
感染治療剤、に関する。
クローナル抗体、その製造法およびその用途、すなわち
具体的にはシュードモナス・エルギノーサ感染診断薬な
いし画分類用試薬およびシュードモナス・エルギノーサ
感染治療剤、に関する。
シュードモナス・エルギノーザ（以下、緑膿菌というこ
とがある）は、本来病原性の低い菌として知られていた
ものである。しかし、最近は、抗生物質の投与による菌
交代性増殖の結果として、所謂日和見感染が増加しつつ
ある。また、この菌は本来弱毒性であるところから、こ
の菌による感染患者のほとんどが他の基本的疾患、たと
えば癌あるいは適役抑制剤による治療を要するもの、に
罹患している者、熱傷患者、新生児等に多いのも特徴と
されている。
とがある）は、本来病原性の低い菌として知られていた
ものである。しかし、最近は、抗生物質の投与による菌
交代性増殖の結果として、所謂日和見感染が増加しつつ
ある。また、この菌は本来弱毒性であるところから、こ
の菌による感染患者のほとんどが他の基本的疾患、たと
えば癌あるいは適役抑制剤による治療を要するもの、に
罹患している者、熱傷患者、新生児等に多いのも特徴と
されている。
緑膿菌感染症は、現在のところ最も治療の困難な感染症
の一つとされているものである。この感染症が治療困難
であるのは、緑膿菌が従来からの各種の抗生物質に耐性
を示すようになっているうえ、近年開発されてきた緑膿
菌にある程度の効果を示す薬剤に対しても耐性となり易
いからである。
の一つとされているものである。この感染症が治療困難
であるのは、緑膿菌が従来からの各種の抗生物質に耐性
を示すようになっているうえ、近年開発されてきた緑膿
菌にある程度の効果を示す薬剤に対しても耐性となり易
いからである。
ところで、菌の感染ケ受けた場合に感染菌が伺であるか
を早期に知ることは、その後の治療にとって極めて重要
なことである。この考え方は従来から存在し、多（の抗
血清による診断がなされてきた。しかしながら、従来の
抗血清はその調製手段の当然の帰結として多数のクロー
ンの産生ずる特異性の異なった抗体の混合物、すなわち
ポリクローナル抗体、であったので、一定の品質のもの
をつくることが困難であること、非特異的反応全抑制す
るために多くの操作が必要であること、その他の多くの
問題点が指摘されている。
を早期に知ることは、その後の治療にとって極めて重要
なことである。この考え方は従来から存在し、多（の抗
血清による診断がなされてきた。しかしながら、従来の
抗血清はその調製手段の当然の帰結として多数のクロー
ンの産生ずる特異性の異なった抗体の混合物、すなわち
ポリクローナル抗体、であったので、一定の品質のもの
をつくることが困難であること、非特異的反応全抑制す
るために多くの操作が必要であること、その他の多くの
問題点が指摘されている。
（３）
〔■〕発明の概要
１、要旨
本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、緑膿
菌に対するモノクローナル抗体をつくり、それを使用す
ることによってこの目的を達成しようとするものである
。
菌に対するモノクローナル抗体をつくり、それを使用す
ることによってこの目的を達成しようとするものである
。
従って、本発明によるシュードモナス・エルギノーザに
対するモノクローナル抗体は、シュードモナス・エルギ
ノーザに対する抗体を産生ずる細胞とミエローマ細胞と
のハイシリドーマに産生させた、シュードモナス・エル
ギノーザに対して特異的に反応する、ものである。
対するモノクローナル抗体は、シュードモナス・エルギ
ノーザに対する抗体を産生ずる細胞とミエローマ細胞と
のハイシリドーマに産生させた、シュードモナス・エル
ギノーザに対して特異的に反応する、ものである。
このシュードモナス拳エルギノーサに対する抗体は、本
発明に従って、シュードモナス・エルギノーザに対する
抗体を産生ずる細胞とミエローマ細胞とを細胞融合に付
して両細胞間のハイブリドーマを形成させ、このハイブ
リドーマを増殖させて、それが産生するシュードモナス
・エルギノーザに対する抗体を取得すること、によって
製造される。
発明に従って、シュードモナス・エルギノーザに対する
抗体を産生ずる細胞とミエローマ細胞とを細胞融合に付
して両細胞間のハイブリドーマを形成させ、このハイブ
リドーマを増殖させて、それが産生するシュードモナス
・エルギノーザに対する抗体を取得すること、によって
製造される。
（４）
本発明は、また、この抗体の用途に関するものである。
すなわち、本発明によるシュードモナス・エルギノーサ
感染症診断用またはシュードモナス・エルギノーサ分類
用の試薬は、シュードモナス・エルギノーザに対するモ
ノクローナル抗体を少なくとも一種含む、ものである。
感染症診断用またはシュードモナス・エルギノーサ分類
用の試薬は、シュードモナス・エルギノーザに対するモ
ノクローナル抗体を少なくとも一種含む、ものである。
また、本発明によるシュードモナス・エルギノーサ感染
症治療剤は、シュードモナス・エルギノーザに対するモ
ノクローナル抗体を少なくとも一種含む、ものである。
症治療剤は、シュードモナス・エルギノーザに対するモ
ノクローナル抗体を少なくとも一種含む、ものである。
２、効果
本発明によるモノクローナル抗体によれば、前記のポリ
クローナル抗体に認められた諸問題が解決される。
クローナル抗体に認められた諸問題が解決される。
本発明で興味あることは、このモノクローナル抗体がグ
ロブリンとして主としてＩｇＭのタイプとして得られる
ということである。その結果、従来のモノクローナル抗
体に認められた凝集反応や沈降反応等のポリクローナル
抗体で用いられる手法が使用できないという問題全件な
わずに極めて短時間に菌との抗原−抗体反応を検知する
ことができる。なお、本発明抗体はＩｇＧのタイプとし
ても得られるがこのタイプの抗体は樹脂エマルジョンの
樹脂粒子に吸着させるなとして速やかな凝集全行なわせ
ることができる。
ロブリンとして主としてＩｇＭのタイプとして得られる
ということである。その結果、従来のモノクローナル抗
体に認められた凝集反応や沈降反応等のポリクローナル
抗体で用いられる手法が使用できないという問題全件な
わずに極めて短時間に菌との抗原−抗体反応を検知する
ことができる。なお、本発明抗体はＩｇＧのタイプとし
ても得られるがこのタイプの抗体は樹脂エマルジョンの
樹脂粒子に吸着させるなとして速やかな凝集全行なわせ
ることができる。
緑膿菌の分類同定に関しては現在でも多くの議論のある
ところであって、研究者間でも緑膿菌の血清型による分
類が異なっていて、混乱が生じている。このような状況
となっているのは、ポリクローナル抗体を用いているこ
とに由来する動物の個体差、抗血清の吸収操作の条件の
差、等があって、研究対象が統一化ないし共通化されて
いないことが大きな原因であると考えられる。
ところであって、研究者間でも緑膿菌の血清型による分
類が異なっていて、混乱が生じている。このような状況
となっているのは、ポリクローナル抗体を用いているこ
とに由来する動物の個体差、抗血清の吸収操作の条件の
差、等があって、研究対象が統一化ないし共通化されて
いないことが大きな原因であると考えられる。
本発明では、対象緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主催の型
別検討委員会の決定（１９７５年）による血清学的分類
に従うものとし、この分類に基くＡ−Ｍ群に属する菌株
を使用している。
別検討委員会の決定（１９７５年）による血清学的分類
に従うものとし、この分類に基くＡ−Ｍ群に属する菌株
を使用している。
Ａ−Ｍ群に属する緑膿菌の菌株のいくつかは東京大学医
科学研究所（東京都文京区）に保存されており、第三者
に自由に分譲される。
科学研究所（東京都文京区）に保存されており、第三者
に自由に分譲される。
東京大学医科学研究所に保存されている緑膿菌の菌株を
示せば、下記の通りである。なお、参考のため、重量ら
の分類も併記した。
示せば、下記の通りである。なお、参考のため、重量ら
の分類も併記した。
第１表
ＩＩＤ １００１ Ａ ｌｌＩＤ １
００２ Ｂ ２ＩＩＤ １００７
／／ ７ＩＩＤ １０１３ ＩＩ
１３ＩＩＤ ５００４ ｕ
１６ＩＩＩ） １０２１ Ｃ３ ＩＩＤ １００４ Ｄ ４ＩＩＤ１．
１３０ Ｆ 、 ５ＩＩＤ １００６
Ｆ ６ＩＩＤ １０２０ Ｇ
８ＩＩＤ １００９ Ｈ９ ＩＩＤ １０１０ Ｉ １０ＩＩＤ
１０１１ Ｊ １１１ＩＤ １０１２
Ｋ １２ＩＩＤ ５１４１
Ｌ １４ＩＩＤ ５０１８ Ｍ
１５ＩＩＤ １０１５ ＩＩ
１７（７） なお、本発明では緑膿菌の分類として型別検討委員会の
決定による血清学的分類を最良のものと判断してそれに
従っているが、そのＡ−Ｍ群という分類は現在の時点で
の指標であるから、将来において新しい分類基準が提案
ないし採択される可能性がある。特に、本発明によるモ
ノクローナル抗体を用いて分類同定を行なっていけば、
現在の分類基準では律しえない菌株が生じて（ることは
想像にかたくない。従って、本発明は対象菌株に関して
上記Ａ−Ｍ群に属するものあるいはこの分類基準に従っ
て分類しうるもの、の各に限定されるものではない。
００２ Ｂ ２ＩＩＤ １００７
／／ ７ＩＩＤ １０１３ ＩＩ
１３ＩＩＤ ５００４ ｕ
１６ＩＩＩ） １０２１ Ｃ３ ＩＩＤ １００４ Ｄ ４ＩＩＤ１．
１３０ Ｆ 、 ５ＩＩＤ １００６
Ｆ ６ＩＩＤ １０２０ Ｇ
８ＩＩＤ １００９ Ｈ９ ＩＩＤ １０１０ Ｉ １０ＩＩＤ
１０１１ Ｊ １１１ＩＤ １０１２
Ｋ １２ＩＩＤ ５１４１
Ｌ １４ＩＩＤ ５０１８ Ｍ
１５ＩＩＤ １０１５ ＩＩ
１７（７） なお、本発明では緑膿菌の分類として型別検討委員会の
決定による血清学的分類を最良のものと判断してそれに
従っているが、そのＡ−Ｍ群という分類は現在の時点で
の指標であるから、将来において新しい分類基準が提案
ないし採択される可能性がある。特に、本発明によるモ
ノクローナル抗体を用いて分類同定を行なっていけば、
現在の分類基準では律しえない菌株が生じて（ることは
想像にかたくない。従って、本発明は対象菌株に関して
上記Ａ−Ｍ群に属するものあるいはこの分類基準に従っ
て分類しうるもの、の各に限定されるものではない。
２、モノクローナル抗体の製造
本発明による緑膿菌に対するモノクローナル抗体は、細
胞融合法によってつくられる。
胞融合法によってつくられる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の作製は、一般に
、（１）細胞融合用抗体産生細胞の調製、（２）細胞融
合／ハイブリドーマの作製、（３）所望ハイブリドーマ
のスクリーニングおよびクローニング（および保存）、
ならびに（４）ハイブリドーマの増殖に（８） よる所望モノクローナル抗体の産生、からなる。
、（１）細胞融合用抗体産生細胞の調製、（２）細胞融
合／ハイブリドーマの作製、（３）所望ハイブリドーマ
のスクリーニングおよびクローニング（および保存）、
ならびに（４）ハイブリドーマの増殖に（８） よる所望モノクローナル抗体の産生、からなる。
これらの単位工程、また従ってその結合からなるモノク
ローナル抗体製造法、は公知であって、本発明でも抗原
である菌が緑膿菌であることに基く改変がありうること
を留保してこの公知の方法を利用することができる。な
お、ハイブリドーマの作製およびモノクローナル抗体の
製造の一般的解説として、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、 ３９．２８５〜３０８（１９８０）
’ｔ’参照することができる。
ローナル抗体製造法、は公知であって、本発明でも抗原
である菌が緑膿菌であることに基く改変がありうること
を留保してこの公知の方法を利用することができる。な
お、ハイブリドーマの作製およびモノクローナル抗体の
製造の一般的解説として、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、 ３９．２８５〜３０８（１９８０）
’ｔ’参照することができる。
本発明によるモノクローナル抗体の製造法の一例を具体
的に示せば、下記の通りである。
的に示せば、下記の通りである。
１）細胞融合用抗体産生細胞の調製
緑膿菌Ａ−Ｍ群に属する菌株全それぞれ培養し、好まし
くは弱ないし無毒化（たとえば、ホルマリン処理）した
のち、洗滌菌体また菌体のリポ多糖体や菌体膜成分等を
ホスト動物、たとえばマウス、特にＢＡ、ＬＢ ／ Ｃ
マウス、に腹腔内投与または皮下投与（たとえば、を中
、四肢のつげ根等）する。
くは弱ないし無毒化（たとえば、ホルマリン処理）した
のち、洗滌菌体また菌体のリポ多糖体や菌体膜成分等を
ホスト動物、たとえばマウス、特にＢＡ、ＬＢ ／ Ｃ
マウス、に腹腔内投与または皮下投与（たとえば、を中
、四肢のつげ根等）する。
投与後、２週間程度以上経過してから、同−菌を再度投
与して追加免疫ないし追感作を行ない、必要に応じて追
加免疫をさらに行なう。追加免疫は静脈注射によること
が多い。
与して追加免疫ないし追感作を行ない、必要に応じて追
加免疫をさらに行なう。追加免疫は静脈注射によること
が多い。
最終免疫後７２時間経過してから肺臓を摘出して、抗体
産生細胞（リンノ臂球）を得る。
産生細胞（リンノ臂球）を得る。
２）細胞融合／ハイブリドーマの作製
予じめ培養しておいたミエローマ（骨髄腫）細胞、たと
えばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８ ［Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ８ｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ、、
４１．７８１−７９１ （１９７６） ）、Ｘ６３−
Ａｇ８−６．５，３ 、その他、と前記肺細胞とを１：
１〜１：１０程度の比率で混合し、適当な細胞融合用培
地たとえば約４０チポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
（分子量１ 、０００〜６ 、０００程度）、および約
１５チジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ｅ含むＲＰ
ＭＩ−１６４１培地（たとえば日永）を加えて、公知の
方法ＣＪ、Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ３
９．２８５−３０８（１９８０）］で両細胞を融合させ
てハイシリドーマを形成させ、培地をハイブリドーマの
みの生育に適したものに代えていってハイブリドーマの
みの培養物を得る。
えばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８ ［Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ８ｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ、、
４１．７８１−７９１ （１９７６） ）、Ｘ６３−
Ａｇ８−６．５，３ 、その他、と前記肺細胞とを１：
１〜１：１０程度の比率で混合し、適当な細胞融合用培
地たとえば約４０チポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
（分子量１ 、０００〜６ 、０００程度）、および約
１５チジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ｅ含むＲＰ
ＭＩ−１６４１培地（たとえば日永）を加えて、公知の
方法ＣＪ、Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ３
９．２８５−３０８（１９８０）］で両細胞を融合させ
てハイシリドーマを形成させ、培地をハイブリドーマの
みの生育に適したものに代えていってハイブリドーマの
みの培養物を得る。
このハイシリドーマのみを生育させる培地としては、使
用ミエローマ細胞が上記具体例である場合はその代謝特
性ないし生合成特性に着目したＨＡＴ培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地）がふつうである（肺臓のリンパ球は
、ＨＡＴ培地のような１ｎｖｌｔｒｏ条件下では長期間
増殖できない）。
用ミエローマ細胞が上記具体例である場合はその代謝特
性ないし生合成特性に着目したＨＡＴ培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地）がふつうである（肺臓のリンパ球は
、ＨＡＴ培地のような１ｎｖｌｔｒｏ条件下では長期間
増殖できない）。
３）所望ハイブリドーマのスクリーニングおよびクロー
ニング 上記のようにしてＨＡＴ培地中でハイブリドーマのみを
生育させて１〜２週間後に、マイクロプレート中で前記
緑膿菌菌体とハイブリドーマ上清とを反応させる。反応
させた緑膿菌を遠心洗浄後、抗マウス抗体のペルオキシ
ダーゼでラベルしたものを用いたエンザイム・イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）によって、目的とする菌と特異的に反
応する抗体を産生じているハイブリドーマをスクリーニ
ングする。
ニング 上記のようにしてＨＡＴ培地中でハイブリドーマのみを
生育させて１〜２週間後に、マイクロプレート中で前記
緑膿菌菌体とハイブリドーマ上清とを反応させる。反応
させた緑膿菌を遠心洗浄後、抗マウス抗体のペルオキシ
ダーゼでラベルしたものを用いたエンザイム・イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）によって、目的とする菌と特異的に反
応する抗体を産生じているハイブリドーマをスクリーニ
ングする。
スクリーニングによって所望活性ヲ認めたものについて
、たとえば顕微鏡下でシングル・セル争マニピユレーシ
ョンによって、クローニンクラ行なう。約２週間後に、
ウェル１個当り１個のクロ（１１） −ンのみが生育しているものについて、再度ＥＩＡを行
なって、クローンを確立する。
、たとえば顕微鏡下でシングル・セル争マニピユレーシ
ョンによって、クローニンクラ行なう。約２週間後に、
ウェル１個当り１個のクロ（１１） −ンのみが生育しているものについて、再度ＥＩＡを行
なって、クローンを確立する。
確立されたクローンは、直ちにモノクローナル抗体生産
に使用するものを除き、凍結乾燥等の手段によって保存
することができる。
に使用するものを除き、凍結乾燥等の手段によって保存
することができる。
４）モノクローナル抗体の産生
確立されたクローンのハイシリドーマを適当培地中での
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養およびマウス腹腔内でのＩｎ ｖ
ｉｖｏ 培養のいずれかで増殖させることによって、所
望モノクローナル抗体を産生させることができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養およびマウス腹腔内でのＩｎ ｖ
ｉｖｏ 培養のいずれかで増殖させることによって、所
望モノクローナル抗体を産生させることができる。
たとえば、確立されたりｐ−ンについて常法に従って徐
々にスケールアップを行ない（培養上清には目的の抗体
が含まれている）、更に高い抗体価の標品を得べ（、シ
リスタン（アルドリッチ）０．５ｍ１ｅ予じめ１〜２週
間前に腹腔内投与しておいたＢＡＬＢ／Ｃマウスに細胞
数が１〜１０Ｘ１０６個１０．５ｍｌ となるように
調整したハイシリドーマを腹腔内に投与する。投与後１
〜２週間程度経過して貯留された腹水および血清中には
、ハイブリ（１２） ドーマ培養上清の１０〜５００倍程度の抗体価の目的の
モノクローナル抗体が含まれている。
々にスケールアップを行ない（培養上清には目的の抗体
が含まれている）、更に高い抗体価の標品を得べ（、シ
リスタン（アルドリッチ）０．５ｍ１ｅ予じめ１〜２週
間前に腹腔内投与しておいたＢＡＬＢ／Ｃマウスに細胞
数が１〜１０Ｘ１０６個１０．５ｍｌ となるように
調整したハイシリドーマを腹腔内に投与する。投与後１
〜２週間程度経過して貯留された腹水および血清中には
、ハイブリ（１２） ドーマ培養上清の１０〜５００倍程度の抗体価の目的の
モノクローナル抗体が含まれている。
このようにして得られる培養液や腹水中の目的抗体はそ
のままの姿で使用することができるが、精製して高抗体
価標品とすることが好ましい。精製手段としては、免疫
グロブリンの精製に採用されうる任意のもの、たとえば
硫安による塩析法、ＤＥＡＥセルロース等を用いるイオ
ン交換法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー等、が適当であり、これらを適宜組合せあるいは電
気泳動法と組合せることによって高純度の目的抗体を得
ることができる。
のままの姿で使用することができるが、精製して高抗体
価標品とすることが好ましい。精製手段としては、免疫
グロブリンの精製に採用されうる任意のもの、たとえば
硫安による塩析法、ＤＥＡＥセルロース等を用いるイオ
ン交換法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー等、が適当であり、これらを適宜組合せあるいは電
気泳動法と組合せることによって高純度の目的抗体を得
ることができる。
なお、本発明による製造法で１抗体全取得する」という
ことは、抗体全精製標品として取得する場合の外に、培
養液や腹水の形態で取得する場合をも包含するものであ
る。
ことは、抗体全精製標品として取得する場合の外に、培
養液や腹水の形態で取得する場合をも包含するものであ
る。
３、モノクローナル抗体の用途
このようにして得られるモノクローナル抗体は、その緑
膿菌に対する特異性に着目した各種の用途に供すること
ができる。
膿菌に対する特異性に着目した各種の用途に供すること
ができる。
そのうちのい（つかを示せば、下記の通りである。
１）緑膿菌感染症診断用または画分類用の試薬本発明に
よるモノクローナル抗体は、精製標品の外に、ハイブリ
ドーマ培養上清、腹水および血清の形態においてもＡ−
Ｍ群の緑膿［−明確に区別しうるものである。すなわち
、本発明者の確認したところによると、Ａ群に属する緑
膿菌全感作して得られたハイブリドーマの産生ずるモノ
クローナル抗体はＡ群の菌とのみ反応し、他のＢ−Ｍ群
の菌とはＥＩＡで全（反応しなかった。同様に、Ｍ群の
菌からの抗体はＭ群の菌とのみ反応し、Ａ−Ｌ群の菌と
は完全に区別することができた。
よるモノクローナル抗体は、精製標品の外に、ハイブリ
ドーマ培養上清、腹水および血清の形態においてもＡ−
Ｍ群の緑膿［−明確に区別しうるものである。すなわち
、本発明者の確認したところによると、Ａ群に属する緑
膿菌全感作して得られたハイブリドーマの産生ずるモノ
クローナル抗体はＡ群の菌とのみ反応し、他のＢ−Ｍ群
の菌とはＥＩＡで全（反応しなかった。同様に、Ｍ群の
菌からの抗体はＭ群の菌とのみ反応し、Ａ−Ｌ群の菌と
は完全に区別することができた。
本発明によるモノクローナル抗体はＡ−Ｍ群の緑膿菌の
それぞれについて得られでいて、 Ａ−Ｍ群の各群間の
識別は上記のように可能である。しかし、将来において
Ａ−Ｍ群以外の群に属する緑膿菌が見出され、あるいは
Ａ−Ｍ群のどれかについてさらに下位群が見出され、あ
るいはさらに全く別の分類が採用される可能性があるこ
とは前記した通りであるから、本発明による診断ないし
分類用試薬は現存のＡ−Ｍ群に限定されるものではない
。
それぞれについて得られでいて、 Ａ−Ｍ群の各群間の
識別は上記のように可能である。しかし、将来において
Ａ−Ｍ群以外の群に属する緑膿菌が見出され、あるいは
Ａ−Ｍ群のどれかについてさらに下位群が見出され、あ
るいはさらに全く別の分類が採用される可能性があるこ
とは前記した通りであるから、本発明による診断ないし
分類用試薬は現存のＡ−Ｍ群に限定されるものではない
。
抗体を用いて感染症の診断を行なう場合には、菌が緑膿
菌であるということさえ判明すれば、それがどの群に属
するかは知る必要がない場合もある。そのようなときに
は、Ａ−Ｍ群に関して一つ一つ判定してい（ことは得策
ではない。そのような場合には、Ａ−Ｍ％群に対するモ
ノクローナル抗体（単位抗体という）を全種類または何
種類かを組合せてなる混合物を使用するのが合理的であ
る。
菌であるということさえ判明すれば、それがどの群に属
するかは知る必要がない場合もある。そのようなときに
は、Ａ−Ｍ群に関して一つ一つ判定してい（ことは得策
ではない。そのような場合には、Ａ−Ｍ％群に対するモ
ノクローナル抗体（単位抗体という）を全種類または何
種類かを組合せてなる混合物を使用するのが合理的であ
る。
なお、本発明で［−シュードモナス・エルギノーサ分類
」というときは、感染症での当該菌の分類の場合の外に
、一般に緑膿菌の分類を行なう場合を包含するものであ
る。
」というときは、感染症での当該菌の分類の場合の外に
、一般に緑膿菌の分類を行なう場合を包含するものであ
る。
診断には、精度と同時に簡便さが要求される。
上記の単位抗体全複数種含む診断薬は診断回数が減少し
ているという点でこの趣旨に沿うものであるが、本発明
によるモノクローナル抗体のあるも（１５） のは緑膿菌に対して極めて短時間に特異的な菌の凝集を
引き起し、またあるものは適当な「剤型」にすることに
よって短時間凝集を可能にすることができるので、本発
明分類試薬は分類作業が容易であるという点でこの趣旨
に沿うものである。
ているという点でこの趣旨に沿うものであるが、本発明
によるモノクローナル抗体のあるも（１５） のは緑膿菌に対して極めて短時間に特異的な菌の凝集を
引き起し、またあるものは適当な「剤型」にすることに
よって短時間凝集を可能にすることができるので、本発
明分類試薬は分類作業が容易であるという点でこの趣旨
に沿うものである。
すなわち、一般に、モノクローナル抗体はその特異性が
極めて高いので、目的の特異的抗原−抗体反応に際して
、たとえばポリクローナル抗体の場合のような凝集反応
や寒天内沈降反応等が起らないとされている。従って、
モノクローナル抗体を用いれば正確な診断ないし分類が
行なえるという利点がある訳であるが、また一方モツク
ローナル抗体のあるものは凝集反応や沈降反応を起さな
いので、特異的抗原−抗体反応の生起を簡単に知ること
ができないという問題があった。ところが、本発明によ
るモノクローナル抗体の多くはＩｇＭタイプに属する免
疫グロブリンであり、この抗体は対応する緑膿菌と混合
すると極めて短時間に特異的な凝集反応を引き起すこと
が本発明者によって発見された。従って、特異的抗原−
抗体反応は極（１６） めて容易に検知することができるのである。これは、モ
ノクローナル抗体に関しての上記の知見からすれば思い
がけなかったことというべきであろう。
極めて高いので、目的の特異的抗原−抗体反応に際して
、たとえばポリクローナル抗体の場合のような凝集反応
や寒天内沈降反応等が起らないとされている。従って、
モノクローナル抗体を用いれば正確な診断ないし分類が
行なえるという利点がある訳であるが、また一方モツク
ローナル抗体のあるものは凝集反応や沈降反応を起さな
いので、特異的抗原−抗体反応の生起を簡単に知ること
ができないという問題があった。ところが、本発明によ
るモノクローナル抗体の多くはＩｇＭタイプに属する免
疫グロブリンであり、この抗体は対応する緑膿菌と混合
すると極めて短時間に特異的な凝集反応を引き起すこと
が本発明者によって発見された。従って、特異的抗原−
抗体反応は極（１６） めて容易に検知することができるのである。これは、モ
ノクローナル抗体に関しての上記の知見からすれば思い
がけなかったことというべきであろう。
本発明によるモノクローナル抗体には、免疫グロブリン
としてＩｇＧのタイプとして得られるものがある。モノ
クローナルなＩｇＧの場合は、一般にいわれているよう
にそのままでは凝集が起らない。
としてＩｇＧのタイプとして得られるものがある。モノ
クローナルなＩｇＧの場合は、一般にいわれているよう
にそのままでは凝集が起らない。
しかし、そのような抗体も、これを樹脂ラテックス中の
樹脂粒子等の適当な担体に吸着させたものは、ＩｇＭか
らなる抗体と同様に極めて短時間に特異的な菌の凝集反
応が生じることがわかった。従って、ＩｇＧからなる抗
体の場合についても、特異的抗原−抗体反応は極めて容
易に検知できて、診断ないし分類の簡便性に対する要請
に応えることができる。なお、診断ないし分類に際して
時間的制約がない場合は、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる
抗体のいずれについてもＥＩＡ等を用いることにより確
実に判定を行なうことができる。
樹脂粒子等の適当な担体に吸着させたものは、ＩｇＭか
らなる抗体と同様に極めて短時間に特異的な菌の凝集反
応が生じることがわかった。従って、ＩｇＧからなる抗
体の場合についても、特異的抗原−抗体反応は極めて容
易に検知できて、診断ないし分類の簡便性に対する要請
に応えることができる。なお、診断ないし分類に際して
時間的制約がない場合は、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる
抗体のいずれについてもＥＩＡ等を用いることにより確
実に判定を行なうことができる。
診断薬ないし分類薬として調剤するには、合目的的な任
意の手段を採用して任意の剤型でこれ會得ることができ
る。たとえば、腹水、目的抗体を含む培養液、または精
製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ
（生理食塩を含むリン酸・々ツファー）等で希釈した
のち、０．１％ナトリウムアジド等を防腐剤として加え
る。また、ラテックス等の担体に吸着させたものも、抗
体価を求めて適当に希釈し、防腐剤を添加して用いる。
意の手段を採用して任意の剤型でこれ會得ることができ
る。たとえば、腹水、目的抗体を含む培養液、または精
製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ
（生理食塩を含むリン酸・々ツファー）等で希釈した
のち、０．１％ナトリウムアジド等を防腐剤として加え
る。また、ラテックス等の担体に吸着させたものも、抗
体価を求めて適当に希釈し、防腐剤を添加して用いる。
前記のように、本発明抗体をラテックス粒子上に吸着さ
せたものは、本発明診断ないし分類薬の好ましい「剤型
」の一つである。この場合のラテックスとしては、適当
な樹脂材料たとえばポリスチレン、ポリビニールトルエ
ン、ポリシタジエン等のラテックスが適当である（ラテ
ックス指体に関しては、たとえば、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・メデイスン、２１．８８８〜８９２ （１
９５６）参照）。
せたものは、本発明診断ないし分類薬の好ましい「剤型
」の一つである。この場合のラテックスとしては、適当
な樹脂材料たとえばポリスチレン、ポリビニールトルエ
ン、ポリシタジエン等のラテックスが適当である（ラテ
ックス指体に関しては、たとえば、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・メデイスン、２１．８８８〜８９２ （１
９５６）参照）。
なお、ヒトｒ−グロブリンを粒子上に吸着させたポリス
チレンラテックスがリューマチ様因子検査用試薬として
実用されている。
チレンラテックスがリューマチ様因子検査用試薬として
実用されている。
２）緑膿菌感染症治療剤
本発明による緑膿菌に対するモノクローナル抗体を用い
てマウスの緑膿症感染治療実験を行なったところ、少量
の抗体が菌の所属群に特異的に極めて強い治療効果を示
すこと本発明者は認めている。この実験事実は、緑膿菌
感染疾患を有する動物（ヒｉ含む）に対する本発明モノ
クローナル抗体の治療剤としての利用の可能性を示すも
のである。
てマウスの緑膿症感染治療実験を行なったところ、少量
の抗体が菌の所属群に特異的に極めて強い治療効果を示
すこと本発明者は認めている。この実験事実は、緑膿菌
感染疾患を有する動物（ヒｉ含む）に対する本発明モノ
クローナル抗体の治療剤としての利用の可能性を示すも
のである。
実施例
実施例１
■）実験方法
（１）使用した菌株
緑膿菌研究会主催の型別検討委員会の決定による血清学
的分類に基きＡ−Ｍ群に属する菌株を東大医科学研究所
より入手して使用した。
的分類に基きＡ−Ｍ群に属する菌株を東大医科学研究所
より入手して使用した。
（２）菌の培養
あらかじめ寒天斜面培地で３７℃で一夜培養した谷菌株
を、１００ ｍｌ ＢＨＩ培地（Ｄｌｆｃｏ ） を含
む坂ロフラスコにエーゼでかきとるか、あるいは、１０
ｍｌ（１９） のＢ）（Ｉ培地で種培養した液１〜２ｍｌ を１００
ｍ１ＢＨＩ培地を含む坂ロフラスコに接種し、３７℃で
１７〜Ｕ時間振盪培養した。
を、１００ ｍｌ ＢＨＩ培地（Ｄｌｆｃｏ ） を含
む坂ロフラスコにエーゼでかきとるか、あるいは、１０
ｍｌ（１９） のＢ）（Ｉ培地で種培養した液１〜２ｍｌ を１００
ｍ１ＢＨＩ培地を含む坂ロフラスコに接種し、３７℃で
１７〜Ｕ時間振盪培養した。
（３）菌体の処理
前記の方法にて培養した培養液１００ ｍｌ ｔ １０
．００ＯｒＦＴ＋で加分間遠心分離に付し、得られた菌
体に１０ｍ１ の１０チホルマリン會加えて充分混合し
たのち、３７℃で１夜放置し、使用まで冷蔵庫に保存し
た。
．００ＯｒＦＴ＋で加分間遠心分離に付し、得られた菌
体に１０ｍ１ の１０チホルマリン會加えて充分混合し
たのち、３７℃で１夜放置し、使用まで冷蔵庫に保存し
た。
ホルマリン処理菌体は、使用時に生理的食塩を含むリン
酸バッファー（ｐＨ７，２、以下ＰＢＳと略ｊ）で充分
洗滌してホルマリンを除去したのち、’０Ｄ５５０の値
をもとにＰＢＳで必要濃度に調整して、マ□ウスの感作
および抗体の分析に供試した。
酸バッファー（ｐＨ７，２、以下ＰＢＳと略ｊ）で充分
洗滌してホルマリンを除去したのち、’０Ｄ５５０の値
をもとにＰＢＳで必要濃度に調整して、マ□ウスの感作
および抗体の分析に供試した。
（４）菌体側のリポ多糖体（以下ＬＰＳと略す）の調製
先の方法にて培養した菌体を遠心分離して集菌後、０．
１２ Ｍ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８で洗滌し、関ｍｌ
のＴｒｉｍに懸濁させ、３７℃にしたのち、０．０２Ｍ
ＥＤＴＡ ’ｉｋ含む資ｉｇ ５０ｍ１ を加えて静か
に攪拌した。
１２ Ｍ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８で洗滌し、関ｍｌ
のＴｒｉｍに懸濁させ、３７℃にしたのち、０．０２Ｍ
ＥＤＴＡ ’ｉｋ含む資ｉｇ ５０ｍ１ を加えて静か
に攪拌した。
４分後にＭｇＣ１□終濃度０．０５Ｍになるよう加え、
（２０） １０．００Ｏｒｐｍ でＩ分間遠心し、上清を集めた。
（２０） １０．００Ｏｒｐｍ でＩ分間遠心し、上清を集めた。
得られた上清ｋｏ、ＬＭリン酸バッファーに続いて精製
水に対して透析後、凍結乾燥して、６菌のＬＰＳを得た
。
水に対して透析後、凍結乾燥して、６菌のＬＰＳを得た
。
（５）マウスへの抗原の感作
菌体を感作する場合はホルマリン処理菌体を充分ＰＢＳ
で洗滌してから、ＰＢＳに懸濁させ、０Ｄ５５０が０．
１〜０．２になるように調整したのち、４〜８週令のＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスに０．２〜０．３ｍｌｍ脇腹投与した
。また、ＬＰＳの場合は、凍結乾燥したものをＰＢＳに
溶解し、終濃度５〜２０μｇ ／ ０．２ ｍｌとなる
ように調整したのち、その０．２ｍｌ ’ｅ腹腔内に投
与した。
で洗滌してから、ＰＢＳに懸濁させ、０Ｄ５５０が０．
１〜０．２になるように調整したのち、４〜８週令のＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスに０．２〜０．３ｍｌｍ脇腹投与した
。また、ＬＰＳの場合は、凍結乾燥したものをＰＢＳに
溶解し、終濃度５〜２０μｇ ／ ０．２ ｍｌとなる
ように調整したのち、その０．２ｍｌ ’ｅ腹腔内に投
与した。
（６）ハイブリダイゼーション
菌体またはＬＰＳで動物全感作して少くとも２週間後、
同一抗原で菌体の場合は０Ｄ５５００．２〜０．５のも
のを０５５ｍ１％ＬＰＳの場合は加〜頷μｇ、を尾静脈
より追感作した。追感作７２時間後にマウスをクロロフ
ォルムまたはエチルエーテルで摩砕して、無菌的に肺臓
を摘出した。得られた肺臓’ｉ ＲＰＭＩ−１６４０培
地（日永）で洗滌したのち、ハサミで細片として、供試
肺細胞を得た。得られた牌細胞は、牛胎児血清（以下、
Ｆｅ２と略ｊａｋ含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で洗
滌した。一方、８−アザグアニン１０μｇ／ｍｌおよび
１０ ％ Ｆｅ２ ’に含むＲＰＭＩ −１６４０培地
で、５％ＣＯ２／相対湿度１００チ／３７℃であらかじ
め培養して対数増殖期にあるミエローマ細胞（ｐ３−ｘ
６３−Ａｇｓ−Ｕｔ細胞）をＦ’Ｃ８を含まないＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で洗滌し、先に述べた牌細胞とミエロ
ーマ細胞との数の比が１０：１〜１：１程度になるよう
混合する。混合した細胞ｆ １００１０００ｒｐ〜１５
分間遠心し、上清を捨て、細胞を充分にはＲＰＭＩ−１
６４０培地（ＦＣ８ｉ含まないもの）２ｍｌ。
同一抗原で菌体の場合は０Ｄ５５００．２〜０．５のも
のを０５５ｍ１％ＬＰＳの場合は加〜頷μｇ、を尾静脈
より追感作した。追感作７２時間後にマウスをクロロフ
ォルムまたはエチルエーテルで摩砕して、無菌的に肺臓
を摘出した。得られた肺臓’ｉ ＲＰＭＩ−１６４０培
地（日永）で洗滌したのち、ハサミで細片として、供試
肺細胞を得た。得られた牌細胞は、牛胎児血清（以下、
Ｆｅ２と略ｊａｋ含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で洗
滌した。一方、８−アザグアニン１０μｇ／ｍｌおよび
１０ ％ Ｆｅ２ ’に含むＲＰＭＩ −１６４０培地
で、５％ＣＯ２／相対湿度１００チ／３７℃であらかじ
め培養して対数増殖期にあるミエローマ細胞（ｐ３−ｘ
６３−Ａｇｓ−Ｕｔ細胞）をＦ’Ｃ８を含まないＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で洗滌し、先に述べた牌細胞とミエロ
ーマ細胞との数の比が１０：１〜１：１程度になるよう
混合する。混合した細胞ｆ １００１０００ｒｐ〜１５
分間遠心し、上清を捨て、細胞を充分にはＲＰＭＩ−１
６４０培地（ＦＣ８ｉ含まないもの）２ｍｌ。
およびＤＭＳＯ（和光紬薬）０．７ｍｌから成る溶液０
．５ｍｌ’ｉ静かに加え、遠心管をゆつ（り回転させる
から細胞と混合させる。１分後、ＦＣ８’ｉ含まない培
地１ｍ１ｅゆっくり加えながら静かに遠心管を回転させ
て混合する。以後、Ｉ秒毎に培地１ｍ１ｉ加え、同様の
操作を培地１０ｍ１が加わるまでくり返丁。１０ｍ１
の培地を加え終ったら、１１０００ｒｐで１０〜１５分
遠心して、上清を捨て、充分に細胞をほぐしたのちＦｅ
２１０ ％ ’（ｋ含むＲＰＭＩ−１６４０培地をミエ
ローマ細胞として１×１０５〜ｌＸｌ０”７０．１ ｍ
ｌ になるように加え、プラスチック製９６穴マイク
ロプレート（ヌング）に０，１ｍｌ ずつ分注し、３
７℃１５％ＣＯ２／相対湿度１００ ％にて培養する。
．５ｍｌ’ｉ静かに加え、遠心管をゆつ（り回転させる
から細胞と混合させる。１分後、ＦＣ８’ｉ含まない培
地１ｍ１ｅゆっくり加えながら静かに遠心管を回転させ
て混合する。以後、Ｉ秒毎に培地１ｍ１ｉ加え、同様の
操作を培地１０ｍ１が加わるまでくり返丁。１０ｍ１
の培地を加え終ったら、１１０００ｒｐで１０〜１５分
遠心して、上清を捨て、充分に細胞をほぐしたのちＦｅ
２１０ ％ ’（ｋ含むＲＰＭＩ−１６４０培地をミエ
ローマ細胞として１×１０５〜ｌＸｌ０”７０．１ ｍ
ｌ になるように加え、プラスチック製９６穴マイク
ロプレート（ヌング）に０，１ｍｌ ずつ分注し、３
７℃１５％ＣＯ２／相対湿度１００ ％にて培養する。
つぎの日、ヒポキサンチン０．３８７ ｍｇ ／ １０
０ｍ１．アミノプテリン０．０１７６ ｍｇ 、７１０
０ ｍｌ 、チミジン１．３ ｍｇ ／ １００ ｍｌ
（いずれも８１ｇｍａ ）および１０％ＦＣ８を含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＨＡＴ培地と略ｊ ）
０．１ ｍｌ ｆ加え、融合後２日および３日目に培
地の１７’２ ｖｆ″とってＨＡＴ培地を加える。その
後３〜４日毎に培地を静かに除き、ＨＡＴ培地を加えな
からノンイブリドーマの成育を待つ。約１〜２週間後に
ウェル中にハイブリドーマが生育してくるのが懸微鏡下
で観察される。
０ｍ１．アミノプテリン０．０１７６ ｍｇ 、７１０
０ ｍｌ 、チミジン１．３ ｍｇ ／ １００ ｍｌ
（いずれも８１ｇｍａ ）および１０％ＦＣ８を含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＨＡＴ培地と略ｊ ）
０．１ ｍｌ ｆ加え、融合後２日および３日目に培
地の１７’２ ｖｆ″とってＨＡＴ培地を加える。その
後３〜４日毎に培地を静かに除き、ＨＡＴ培地を加えな
からノンイブリドーマの成育を待つ。約１〜２週間後に
ウェル中にハイブリドーマが生育してくるのが懸微鏡下
で観察される。
（力 目的抗体のスクリーニング
９６穴ポリ塩化ビニールプレート（ヌング）に５（２３
） チウサギ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、４
℃で一夜放置後、培地を捨て、分析しようとするサンプ
ル１００μｍ と抗原となる菌体懸濁液（ＯＤ５．。ユ
１０ ） ５０μｍ を加えて、３７℃で開発間インキ
ュベートした。２．００Ｏｒｐｍで加分遠心後、培地で
２回洗滌し、ベルオキシターゼでラベルした抗マウス抗
体（カロペル）の１００倍希釈液関μｌを加えて、３７
℃でω分反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗滌し、０
．１％ｏ−フェニレンジアミン（１０ｍｌ中、２ ｔｔ
１３０ ％ Ｈ２Ｏ２ｋ含む０．１Ｍクエン酸バッファ
ー、ｐＨ４，５）溶液１００μｌｉ加え、室温に放置し
て加分後に黄かつ色に変化したものを肉眼で判定して選
定した。
） チウサギ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、４
℃で一夜放置後、培地を捨て、分析しようとするサンプ
ル１００μｍ と抗原となる菌体懸濁液（ＯＤ５．。ユ
１０ ） ５０μｍ を加えて、３７℃で開発間インキ
ュベートした。２．００Ｏｒｐｍで加分遠心後、培地で
２回洗滌し、ベルオキシターゼでラベルした抗マウス抗
体（カロペル）の１００倍希釈液関μｌを加えて、３７
℃でω分反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗滌し、０
．１％ｏ−フェニレンジアミン（１０ｍｌ中、２ ｔｔ
１３０ ％ Ｈ２Ｏ２ｋ含む０．１Ｍクエン酸バッファ
ー、ｐＨ４，５）溶液１００μｌｉ加え、室温に放置し
て加分後に黄かつ色に変化したものを肉眼で判定して選
定した。
（８）目的抗体産生細胞のクローニング以下に示す二つ
の方法音用いた。
の方法音用いた。
（ａ） ＢＡＬＢ ／ＣＣマルス胸腺細胞または肺臓
細胞をＨＡＴ培地にＩ Ｘｌ０６／ ０，２ ｍｌ に
なるように懸濁させ、０．２ｍｌ／ウェルになるようあ
らかじめ９６穴マイクロプレートに分注してお（。スク
リーニングの結果、目的抗体を産生じていると判定され
（２４） たウェル中のハイブリドーマをピペットを用い充分はが
して混合したのち、その一部をシャーレにとりＨＡＴ培
地を加えて、細胞の５すい懸濁液を作る。顕微鈍で見な
がら、ガラス製キャピラリーを用いて細胞を一つずつひ
ろい、先に用意した胸腺または肺臓細胞を含む９６穴マ
イクロプレートのウェル中に１個ずつハイブリドーマを
入れる（１細胞／ウエル） （ｂ） スクリーニングの結果、目的抗体を産生じて
いると判断されたウェル中のハイブリドーマの懸濁液を
作り、血球針算盤金用いて正確に細胞数を調べたのち、
ＨＡＴ培地で希釈後、最終的にはＢＡＬＢ／Ｃマウスの
胸腺または肺臓細胞を含む培地に加え、ハイブリドーマ
として０．３〜０．５個１０．２ ｍｌ でかつ胸腺ま
たは肺臓細胞が１×１０６個／ ０，２ ｍｌ とな
るような細胞の懸濁液を作る。これｉｏ、２ｍｌずつ９
６穴マイクロプレートに分注する。
細胞をＨＡＴ培地にＩ Ｘｌ０６／ ０，２ ｍｌ に
なるように懸濁させ、０．２ｍｌ／ウェルになるようあ
らかじめ９６穴マイクロプレートに分注してお（。スク
リーニングの結果、目的抗体を産生じていると判定され
（２４） たウェル中のハイブリドーマをピペットを用い充分はが
して混合したのち、その一部をシャーレにとりＨＡＴ培
地を加えて、細胞の５すい懸濁液を作る。顕微鈍で見な
がら、ガラス製キャピラリーを用いて細胞を一つずつひ
ろい、先に用意した胸腺または肺臓細胞を含む９６穴マ
イクロプレートのウェル中に１個ずつハイブリドーマを
入れる（１細胞／ウエル） （ｂ） スクリーニングの結果、目的抗体を産生じて
いると判断されたウェル中のハイブリドーマの懸濁液を
作り、血球針算盤金用いて正確に細胞数を調べたのち、
ＨＡＴ培地で希釈後、最終的にはＢＡＬＢ／Ｃマウスの
胸腺または肺臓細胞を含む培地に加え、ハイブリドーマ
として０．３〜０．５個１０．２ ｍｌ でかつ胸腺ま
たは肺臓細胞が１×１０６個／ ０，２ ｍｌ とな
るような細胞の懸濁液を作る。これｉｏ、２ｍｌずつ９
６穴マイクロプレートに分注する。
以上述べた（、）または（ｂ）の方法によりクローニン
グしたマイクロプレートｔ−５ｑ６ ＣＯ２７３７℃で
培養すると、１〜２週間後にクローンが生育してくる。
グしたマイクロプレートｔ−５ｑ６ ＣＯ２７３７℃で
培養すると、１〜２週間後にクローンが生育してくる。
顕微鏡で１つのウェル中に１個のクローンしかないもの
を選び、スクリーニングの項で述べた方法で分析して、
目的抗体を産生じているクローンを選択する。
を選び、スクリーニングの項で述べた方法で分析して、
目的抗体を産生じているクローンを選択する。
（９） ｉｎ ｖｌｔｒｏによる細胞の培養および抗
体の産生９６穴マイクロプレートで充分増殖させた目的
クローンは、討入、６穴および４穴のプレートに徐々に
スケールアップして培養し、必要により更に大きなスケ
ールにて培養する。このようにして得られた細胞の培養
上清には、目的菌体と特異的に反応する抗体が産生され
ている。
体の産生９６穴マイクロプレートで充分増殖させた目的
クローンは、討入、６穴および４穴のプレートに徐々に
スケールアップして培養し、必要により更に大きなスケ
ールにて培養する。このようにして得られた細胞の培養
上清には、目的菌体と特異的に反応する抗体が産生され
ている。
２）結果
感作ないし免疫および反応に用いた菌株は、前記第１表
に示した通りである。
に示した通りである。
第２表は、本発明者らの得た代表的なハイブリドーマの
産生ずるモノクローナル抗体と各群の菌との反応性（Ｅ
ＩＡ法による）の関係を示すものである。
産生ずるモノクローナル抗体と各群の菌との反応性（Ｅ
ＩＡ法による）の関係を示すものである。
本発明者らの得た各群に特異的なモノクローナル抗体に
ついて、抗体の免疫グロブリンとしてのクラスを知るた
め検討を行なった。ＩｇＭはメルカプトエタノールやジ
チオスレイトール等のＳＲ試薬に不安定であるが、Ｉｇ
Ｇは安定であること［Ｐｉｒｏｆｓ）ｃｙ等： Ｖｏｘ
ｓａｎｇ、 ２７ ： ４８０−４８８ （１９７４
）］、ならびに市販のμ−鎖特異的およびγ−鎖特異的
な抗マウス免疫グロブリンとの反応性およびモノクロー
ナル抗体の対応する群の菌に対する凝集性等を検討した
結果、得られた抗体はＩｇＭまたはＩｇＧに属するもの
であった。第３表は、結果の一例を示すものである。
ついて、抗体の免疫グロブリンとしてのクラスを知るた
め検討を行なった。ＩｇＭはメルカプトエタノールやジ
チオスレイトール等のＳＲ試薬に不安定であるが、Ｉｇ
Ｇは安定であること［Ｐｉｒｏｆｓ）ｃｙ等： Ｖｏｘ
ｓａｎｇ、 ２７ ： ４８０−４８８ （１９７４
）］、ならびに市販のμ−鎖特異的およびγ−鎖特異的
な抗マウス免疫グロブリンとの反応性およびモノクロー
ナル抗体の対応する群の菌に対する凝集性等を検討した
結果、得られた抗体はＩｇＭまたはＩｇＧに属するもの
であった。第３表は、結果の一例を示すものである。
実施例２ 感染治療実験
モノクローナル抗体を含む腹水での実験例の一部を示せ
ば、下記の通りである。
ば、下記の通りである。
ＩＣＲ系マウス（雄４週令）に緑膿菌を感染させる前日
および４時間前に抗体を含む腹水または腹水全生理食塩
水で希釈したもの０，２ ｍｌ Ｉｔ １ｐ 投与した
。あらかじめ谷緑膿菌のマウスに対するＬ鳴をしらべて
おぎ、ＬＤ５０ の１０〜２０倍量のｍを２５％ムチン
に懸濁させｔｐ投投与−週間観察しく２７） て、生存数をしらべた。対照にはミエローマ全マウスに
投与して得た腹水を希釈せずに用いた。結果全第４表に
示した。
および４時間前に抗体を含む腹水または腹水全生理食塩
水で希釈したもの０，２ ｍｌ Ｉｔ １ｐ 投与した
。あらかじめ谷緑膿菌のマウスに対するＬ鳴をしらべて
おぎ、ＬＤ５０ の１０〜２０倍量のｍを２５％ムチン
に懸濁させｔｐ投投与−週間観察しく２７） て、生存数をしらべた。対照にはミエローマ全マウスに
投与して得た腹水を希釈せずに用いた。結果全第４表に
示した。
対照では全てのマウスが翌日死亡したが、それぞれ対応
する抗体を投与した群では強い治療効果を認めた。治療
効果は菌群特異的でＡ群の菌に対する効果は菌群Ａ特異
的な抗体のみが有し、タイプの異なる抗体では全（効果
會認めなかった。
する抗体を投与した群では強い治療効果を認めた。治療
効果は菌群特異的でＡ群の菌に対する効果は菌群Ａ特異
的な抗体のみが有し、タイプの異なる抗体では全（効果
會認めなかった。
（２８）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス・エルギノーザに対する抗体を産生
ずる細胞とミエローマ細胞とのノ・イブリＰ−マに産生
させた、シュードモナス・エルギノーザに対して特異的
に反応する、シュードモナス・エルギノーザに対するモ
ノクワ−ナル抗体。 ２、 ＩｇＭグロブリンおよびＩｇＧグロブリンから
なる群から選ばれたグロブリンから主としてなる、特許
請求の範囲第１項のモノクローナル抗体。 ３、 ＩｇＭグロブリンから主としてなる、特許請求の
範囲第２項のモノクローナル抗体。 ４、シュードモナス・エルギノーザに対するモノクロー
ナル抗体を少な（とも一種含む、シュードモナス・エル
ギノーサ感染症診断用またはシュードモナス・エルギノ
ーサ分類用の試薬。 ５、モノクローナル抗体がＩｇＭグロブリンおよびＩｇ
Ｇグロブリンからなる群から選ばれたグロブリンから主
としてなる、特許請求の範囲第３項の試薬。 ６、モノクローナル抗体がＩｇＭグロブリンから主とし
てなる、特許請求の範囲第５項の試薬。 ７、モノクローナル抗体が樹脂エマルジョン中の樹脂粒
子に吸着されている、特許請求の範囲第４〜６項のいず
れかの試薬。 ８、モノクローナル抗体がＩｇＧグロブリンである、特
許請求の範囲第７項の試薬。 ９、シュードモナス・エルギノーザに対するモノクロー
ナル抗体を少なくとも一種含む、シュードモナス・エル
ギノーサ感染症治療剤。 １０、シュードモナス・エルギノーザに対する抗体を産
生ずる細胞とミエローマ細胞とを細胞融合に付して両細
胞間のハイシリドーマを形成させ、このハイブリドーマ
を増殖させて、それが産生ずるシュードモナス・エルギ
ノーザに対する抗体を取得することからなる、シュード
モナス・エルギノーザに対するモノクローナル抗体の製
造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13884882A JPS5929622A (ja) | 1982-08-10 | 1982-08-10 | モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途 |
| EP83107814A EP0101039A3 (en) | 1982-08-10 | 1983-08-08 | Monoclonal antibody, method of producing the same and use thereof |
| CA000434174A CA1213536A (en) | 1982-08-10 | 1983-08-09 | Monoclonal antibody, method of producing the same and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13884882A JPS5929622A (ja) | 1982-08-10 | 1982-08-10 | モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5929622A true JPS5929622A (ja) | 1984-02-16 |
| JPH0255039B2 JPH0255039B2 (ja) | 1990-11-26 |
Family
ID=15231584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13884882A Granted JPS5929622A (ja) | 1982-08-10 | 1982-08-10 | モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0101039A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5929622A (ja) |
| CA (1) | CA1213536A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS60224068A (ja) * | 1984-04-20 | 1985-11-08 | Sekisui Chem Co Ltd | 日和見感染における病原菌の判定方法 |
| JPS60248626A (ja) * | 1984-05-25 | 1985-12-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 緑膿菌感染症の予防治療剤 |
| JPS6169796A (ja) * | 1984-05-25 | 1986-04-10 | ジエネテイク システムズ コ−ポレイシヨン | ヒトモノクロ−ナル抗体 |
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| US5366858A (en) * | 1988-12-23 | 1994-11-22 | Canon Kabushiki Kaisha | Method of and apparatus for detecting microorganisms |
| JPH06339372A (ja) * | 1993-05-28 | 1994-12-13 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 形質転換細胞 |
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|---|---|---|---|---|
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| GB8422651D0 (en) * | 1984-09-07 | 1984-10-10 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
| GB8422650D0 (en) * | 1984-09-07 | 1984-10-10 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
| GB8422652D0 (en) * | 1984-09-07 | 1984-10-10 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
| GB8422653D0 (en) * | 1984-09-07 | 1984-10-10 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
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-
1982
- 1982-08-10 JP JP13884882A patent/JPS5929622A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-08 EP EP83107814A patent/EP0101039A3/en not_active Withdrawn
- 1983-08-09 CA CA000434174A patent/CA1213536A/en not_active Expired
Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
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|---|---|
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| EP0101039A2 (en) | 1984-02-22 |
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