JPH0662886A - モノクロ−ナル抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 緑膿菌の血清型別抗原に対して特異的な親和
性を有し、かつ緑膿菌に対して直接凝集活性をもつ、グ
ロブリンクラスがＩｇＧであるモノクローナル抗体。 【効果】 本モノクローナル抗体は、緑膿菌に対してす
ぐれた予防、治療効果を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は緑膿菌感染症の予防治療
に有効性を示すモノクローナル抗体及びその用途に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】緑膿菌（以下、シュードモナス・アエル
ギノーサということがある）は自然界に広く存在し、
水、下水等又ヒト、動物の口腔、腸内からも高率に見い
出される。この菌が病原性を発揮するのはこの菌自体の
菌力による一般感染患者におけるよりもむしろ感染抵抗
の低下した患者、即ち癌患者、免疫抑制療法下の人、移
植患者、熱傷患者および新生児等である。

【０００３】現在、緑膿菌感染症は最も治療の困難な感
染症と考えられている。すなわち、緑膿菌はこれまで常
用されて来た抗生物質のほとんどすべてに対して耐性を
示すばかりでなく、近年開発された抗生物質に対しても
容易に緑膿菌が耐性型に誘導される症例が多いからであ
る。又、抗生物質療法の限界に立って、宿主側の緑膿菌
処理能力の増強をめざした菌体成分による感染防御剤す
なわちワクチンの開発、例えば１３種類以上ある血清型
別緑膿菌の表在抗原をそれぞれ精製して混合した緑膿菌
多価ワクチンや緑膿菌の血清学的共通抗原としてタンパ
クを主成分とするＯＥＰ、あるいはＯＥＰに本菌から調
製したプロテアーゼトキソイド、エラスターゼトキソイ
ドあるいはエクソトキソイドを加えた３種あるいは４種
混合ワクチン等がある。しかしながら、いずれのワクチ
ンも感染防御能あるいは安全性が不十分で、実用性のあ
るすぐれたものが待望されていると言っても過言でな
い。さらに、健常人の血清から製造したヒト血清免疫グ
ロブリン製剤の受動免疫による免疫グロブリン療法も研
究されているが実際の製剤中には緑膿菌に対する抗体価
が低いものが多く、その予防・治療効果を疑問視する向
きも少なくない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
技術の現状に鑑みてなされたものであって、緑膿菌血清
型別抗原に対して特異的な親和性をもち、かつ緑膿菌菌
体に対して直接凝集活性を合わせもつグロブリンクラス
がＩｇＧからなるモノクローナル抗体を作り、単品又は
それらを組み合せることにより予防および治療剤に使用
して目的を達成しようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、緑膿菌血清型別菌
で免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ（腫瘍細
胞株）との細胞融合によりハイブリドーマを作らせ、そ
れが産生する抗体の中から血清型別抗原に対して特異的
に反応するもので該凝集活性をもち、グロブリンクラス
がＩｇＧクラスからなる抗体を選択することにより、目
的とする緑膿菌に対するモノクローナル抗体を作製する
のに成功し、その結果、本発明の完成に至ったものであ
る。

【０００６】また、本発明により目的とするモノクロー
ナル抗体の作製が可能となったので、この点を利用して
更に研究を行った結果、本発明によるモノクローナル抗
体の単剤又は２剤以上の組み合せにより、広く緑膿菌感
染症に対するすぐれた予防治療効果が達成される新規な
薬剤の完成にも成功した。

【０００７】本発明は、これらに基づいてなされたもの
であるが、特に本発明で注目すべきことは、緑膿菌の血
清型別抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗
体の中で、グロブリンクラスがＩｇＧでかつ緑膿菌菌体
に直接凝集活性をもつ抗体は、その抗体と反応する緑膿
菌に対して極めて低温度・低用量で予防、および治療効
果を発揮することを本発明者らがはじめて見い出したこ
とである。

【０００８】以下、本発明について具体的に説明する。

【０００９】１．使用緑膿菌 本発明では使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主催の血清
型別検討委員会の決定（１９７５）による血清学的分類
に従った(下記の表１で示される第１表）。

【００１０】

【表１】

【００１１】２．モノクローナル抗体の製造 本発明による緑膿菌に対するモノクローナル抗体は細胞
融合法によって作製される。

【００１２】細胞融合法によるモノクローナル抗体の作
製は、基本的には、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ
らの方法に準拠した方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，３９，２８５−３０８（１９８０））に従っ
て作製した。この方法によるモノクローナル抗体の作製
は一般に（１）準備、（２）細胞融合、（３）クローニ
ング、（４）モノクローナル抗体の検出、（５）大量モ
ノクローナル抗体の調製、（６）抗体の精製、の工程か
らなっている。

【００１３】次に各工程につき詳細な説明を加える。

【００１４】（１）準備 ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（以
下ＨＡＴという）含有溶液を調製する。これらはいずれ
も１００倍濃度の溶液として貯蔵しておくと便利であ
る。とくに、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）は
合せてストック溶液を作製すると便利である。各ストッ
ク溶液はフィルター濾過（０．２μｍメンブランフィル
ター）により滅菌し、適当量に小分けして−２０℃にて
凍結保存する。次に、市販のダルベッコＭＥＭ培地、ピ
ルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシ
ン、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、牛胎
児血清からなる完全培地（以下、ＤＭＥＭ）を調製す
る。これは４℃で６週間保存できる。上記ダルベッコＭ
ＥＭ培地の代りに市販のＲＰＭＩ−１６４０培地を用い
ることも可能である。

【００１５】次にＤＭＥＭにＨＡＴ又はＨＴストック溶
液を加えたＨＡＴ培地、又はＨＴ培地を調製する。そし
て別に再蒸留水中にＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・
２Ｈ₂Ｏ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、グルコース、フェノー
ルレッドを含有するＧＫＮ塩類溶液を用意する。

【００１６】細胞融合にはセンダイウィルスを用いるＨ
ＶＪ法とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法の二つの
方法があるが、安全性や取り扱い法等の点で後者の方法
が有用性が高い。ＰＥＧにはその平均分子量によって種
々の種類があるが、通常はＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−
４０００、ＰＥＧ−６０００の中から適宜選んで用いら
れる。融合する細胞や目的によってどの分子量のものを
用いるかは異なってくるが、一般に分子量が小さい程粘
性が少なく扱いやすいが細胞毒性は大きくなる。細胞融
合率および細胞毒性は、ＰＥＧの濃度に特に依存する。
又メーカーごとのＬｏｔ差もあるので、以上の要点を考
慮に入れて、用いるＰＥＧを決める。用いるＰＥＧの濃
度は、一般に、４２．５％〜５０％濃度の間で使用され
る。又ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）やポリ−
Ｌ−アルギニンは融合効率を高めることが知られてい
る。しかし、ＤＭＳＯはＰＥＧ溶液の細胞毒性を高める
ので、融合時間を短かくしたり、融合操作後の洗浄をく
り返し十分行うなどの工夫が必要である。

【００１７】ハイブリドーマの増殖促進に用いられるフ
ィーダー細胞としては、マウス腹腔マクロファージ又は
脾リンパ球が好適である。いずれの場合も無菌的に採取
して細胞浮遊液を調製する。培養液にて３回洗浄して遠
心を室温にて４００×ｇ、１０分間行なう。洗浄後トリ
パンブルー液で生細胞数をカウントする。生存率は常に
９５％以上のものを用いる。

【００１８】（２）細胞融合 細胞融合に用いる抗体産生細胞をどの動物由来のものを
用いるかは、融合に使用するＨＡＴ培地に感受性のパー
トナー細胞、すなわち腫瘍細胞株によって異なるが、一
般にマウスとラットが多く用いられている。マウス腫瘍
細胞株とウサギやヒトの抗体産生リンパ球の融合は、ハ
イブリドーマの出現頻度の点で効率がよくない場合が多
い。本発明では、以下の理由でマウス由来の抗体産生リ
ンパ球を用いている。すなわち、マウス腫瘍細胞株では
すべての免疫グロブリン産生能を喪失しているものが利
用しうること、また、該細胞株はマウス由来の抗体産生
リンパ球との融合効率が高く、ハイブリドーマの出現頻
度も良いこと、さらにマウスのＩｇＧはクラスを問わ
ず、すべてプロティンＡと結合するため抗体の精製が容
易に行い得ることが知られているからである。

【００１９】マウスの系統では、ＢＡＬＢ／Ｃマウスが
最も好適であり、抗原によっては他の系統のマウスを用
いることも可能である。抗体産生リンパ球の採取には雌
性で８−１２週令のマウスが最適である。また、本発明
のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得のため
に細胞融合に供するマウスの抗体産生リンパ球は第１表
のＡ〜Ｍ群に属する緑膿菌菌株をそれぞれ培養し、ホル
マリン処理して得られる無毒化洗浄菌体あるいは該菌体
から得られるリポ多糖体画分を抗原としてマウスに皮下
あるいは腹腔内投与により免疫することによって得るこ
とが出来る。この際、免疫に用いられるアジュバントと
しては、フロイントのアジュバント、ミョウバン、水酸
化アルミニウム等を用いることが出来る。抗原の種類に
よって、用いるアジュバントや投与ルート、回数、抗原
量が異なってくるが、緑膿菌菌体を抗原とする場合、１
〜１００μｇの抗原を等量のフロイントの不完全アジュ
バントで油中水型にして腹腔投与を２〜５回行ない、最
終免疫後３〜４日後マウスの脾臓を採取して細胞融合に
用いる。なお、細胞融合の前処置として被免疫マウスの
脾臓リンパ球をあらかじめ試験管内で抗原刺激するか、
抗原と共にレントゲン照射したマウス宿主内にトランス
ファーすることは目的とする抗体産生細胞数を非常に増
加させることになり、結果的に効率良くハイブリドーマ
を得ることが出来る。

【００２０】細胞融合に用いられるＨＡＴ培地の感受性
の腫瘍細胞株は、本発明の場合、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４．１（略号ＮＳ−１）あるいはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ
８．Ｕ１（略号Ｐ３Ｕ１）などの通常細胞融合に用いら
れるマウス細胞株が好適である。細胞融合は、腫瘍細胞
がもっとも良く増殖している時（１０⁴〜５×１０⁵／ｍ
ｌ）に行なう。

【００２１】次に実際の細胞融合は次の如く行なう。

【００２２】免疫が成立した動物の脾臓を無菌的にとり
出し、抗体産生細胞を含むリンパ球液を作製する。パー
トナー細胞の腫瘍細胞に対して約１０倍量のリンパ球を
混和して遠心し、吸引にて培養液を除去する。ペレット
を解きほぐし、あらかじめ３７℃に温めておいた４５％
ＰＥＧを１ｍｌ加える。細胞同士が良く衝突するように
静かに試験管をときどき振るようにする。５〜６分後、
ＤＭＥＭ約５０ｍｌを加えて反応を止める。遠心を行い
上清を吸引除去する。３７℃に温めておいたＨＡＴ培地
をゆっくり加え、大きな細胞塊を解きほぐす。ついて２
４ウエル又は９６ウエルの培養プレートに分注する。２
〜３日毎に培地の半分をＨＡＴ培地で交換する。約２週
間この操作過程をくり返した後、ハイブリドーマの増殖
が認められたウエルの培養上清につき種々のアッセイ法
により目的抗体の産生の有無をしらべ、抗体産生ハイブ
リドーマを検索する。

【００２３】（３）クローニング ハイブリドーマが確立したら出来るだけ早くクローニン
グを行う。方法としては、ハイブリドーマが３個／ｍｌ
となるように通常培地で希釈し、９６ウエルのプレート
に０．２ｍｌ／毎分注することからなる限界希釈法、Ｄ
ＭＥＭ中に浮遊させたハイブリドーマの懸濁液とＤＭＥ
Ｍ−寒天を等量づつ混和してペトリディシュにまき、３
７℃のＣＯ₂培養器にて約１０日間培養し、生じたコロ
ニーを裸眼もしくは低倍率の実体顕微鏡で観察し、パス
ツールピペットにてつり上げることからなる軟寒天法、
操作が簡単で、クローニングの効率が高いフイブリンゲ
ルを利用したフイブリンゲル法、又これらの方法とは別
に抗原と結合させたフルオレスセントミクロフェアーを
ハイブリドーマと反応させて目的抗体産生ハイブリドー
マをシングルクローンとして選別するセルソーター法等
をいずれも用いることが出来る。

【００２４】本発明者らは、経験的に操作が簡便な限界
希釈法を多用してクローニングを行なっている。

【００２５】（４）モノクローナル抗体の検出 モノクローナル抗体の検出のためのアッセイ方法として
は以下のような方法がある。１つはプロティンＡを結合
させた赤血球を用いた方法で、特異抗体を検出する方法
の中で優れた鋭敏度、特異性を示す方法である。また凝
集の程度を観察し抗体価を決める凝集反応法、グロブリ
ンクラスあるいはサブクラスを決めるのに最も簡単な方
法で、一般に培養上清を１０倍程度濃縮しなければなら
ないが、放射能標識された上清を抗体で沈降させ、それ
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルなどで展開し確認す
ることも出来るオクタロニー法である。また、ポリビニ
ルクロライド製のＵ字型マイクロタイタープレートに抗
原もしくは細胞を固定しておき、そこへ培養上清を加え
インキュベートして抗原−抗体反応させた後¹²⁵Ｉ又は
酵素で標識した抗マウス抗体あるいはＰｒｏｔｅｉｎＡ
を加え洗浄後、各ウエル中の放射活性又は酵素活性を調
べるラジオイムノアッセイ法や酵素免疫測定法（ＥＩＡ
法）もある。

【００２６】本発明においては、上記した種々のアッセ
イ法の中で目的に合った方法を選択すればよい。基本的
には短時間で、感度がよく安価であることが重要なこと
である。本発明者らは、次のようなＥＩＡ法を用いてい
る。

【００２７】すなわち、緑膿菌菌体を抗原としてメンブ
ランフィルターに一定量ドットして用い、これにハイブ
リドーマの培養上清を反応させた後、ペルオキシダーゼ
標識ウサギ抗マウスイムノグロプリン抗体（ＤＡＫＯ
社）を作用させ酵素反応の呈色割合により抗体産生量を
測定できるドットイムノバインディングアッセイ法（Ｄ
ＩＢＡ法、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１１９，１４２，１９８２）を用いている。

【００２８】（５）大量モノクローナル抗体の調製 大量にモノクローナル抗体を調製する方法としては、拡
大培養法、リポソーム；マイクロカプセルを利用した大
量培養法、またヌードマウスにハイブリドーマを移植し
血清中に出現してくる抗体を取得することからなる調製
法、さらにはプリスティンを前投与されたＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの腹腔内にハイブリドーマを移植しマウスの腹水
から硫安濃縮やＤＥＡＥ−セルロース、プロティンＡ−
セファロースなどのカラムで精製する調製方法等がある
が、いずれも本発明に適用可能である。特に本発明にお
いてはハイブリドーマを免疫抑制剤（プリスティン）で
前処置したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に移植し該ハイ
ブリドーマの増殖にともなって貯留する腹水から本発明
のモノクローナル抗体を大量調製する方法を大量調製に
採用している。

【００２９】（６）抗体の精製 本発明のモノクローナル抗体を精製するには、下記の非
特異的精製法及び特異的精製法を単独で又は各種組み合
わせて行う。

【００３０】非特異的精製 腹水等からの本発明のモノクローナル抗体の精製はゲル
濾過法、イオン交換セルロースクロマトグラフィー、硫
酸アンモニウムによる塩析法などの公知の方法の組み合
わせにより行うことが出来る。

【００３１】特異的精製 臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社）あるいはアフィゲル−１０（バイオラッド社）に
抗原を結合させ不溶化したカラムに、免疫グロブリン画
分又は腹水を流入し抗体を結合させた後、尿素溶液など
で吸着抗体を溶出させて精製するアフィニテイクロマト
グラフィーも必要に応じて使用出来る。また本発明のモ
ノクローナル抗体がＩｇＧの場合、プロティンＡを固定
化したアフィニティカラムを用いると精製が容易である
という点で推奨される。

【００３２】なお、本発明のモノクローナル抗体は、上
述のように緑膿菌の血清型別抗原に対して特異的な親和
性を有しかつ緑膿菌菌体に対して直接凝集活性を持つグ
ロブリンクラスがＩｇＧからなるものであるが、これら
の性質は下記に示す方法により規定することが出来る。
すなわち、緑膿菌の血清型別抗原に対する特異的な親和
性とは第１表のＡ〜Ｍ群の緑膿菌の血清型別菌のうち、
１つの群に属する菌株とのみ反応し、他の群に属する菌
株とは反応しないこと（例えばＡ群の菌とのみ反応し、
他のＢ−Ｍ群とは反応しないこと）を意味している。

【００３３】また、本発明のモノクローナル抗体の緑膿
菌菌体に対する直接凝集活性とは実施例１に示すよう
に、９６ウエルのＵ底マイクロプレート中で緑膿菌のホ
ルマリン処理又は加熱処理による死菌体をそれぞれ直接
凝集する抗体活性を意味する。

【００３４】さらに本発明のモノクローナル抗体のグロ
ブリンクラスは、該精製抗体のセファクリルＳ３００
（ファルマシア社）を用いたゲル濾過パターンおよびパ
ーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル
社）によるＤＩＢＡ法でＩｇＧと同定されたものを意味
している。

【００３５】本発明のモノクローナル抗体が緑膿菌感染
に対してすぐれた予防および治療効果を示すことは試験
例に例示する如くであるが、該抗体を緑膿菌感染症の予
防、治療剤として用いる場合は注射剤の型で用いるのが
好ましい。以下に実施例及び試験例を例示し、本発明を
さらに具体的に説明する。

【００３６】実施例１ 各血清型緑膿菌に対するマウス
モノクローナル抗体の作製とその性質

【００３７】１）使用菌株 第１表の緑膿菌Ｂ型ＩＩＤ１００２株、Ｅ型ＩＩＤ１１
３０株、Ｇ型ＡＴＣＣ１０１４５株、Ｉ型ＩＩＤ１０１
０株をそれぞれ使用した。

【００３８】２）菌の培養 各血清型緑膿菌を普通寒天培地で３７℃１夜培養し、増
殖した菌体を生理食塩液に懸濁し、その０．５ｍｌを本
間らの合成培地（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８３，７１
１，１９７８）１５０ｍｌを含む坂口フラスコに接種
し、３７℃で１６時間振とう培養した。培養後、坂口フ
ラスコ内に０．３％濃度になるようホルマリンを加えて
充分混合し室温に１時間放置した。ついで培養液を遠心
分離（１２０００×ｇ ３０分間）して菌体を集め、さ
らに生理食塩液と蒸留水で洗浄処理と遠心分離を繰返し
てホルマリン処理菌体を得た。

【００３９】３）免疫 各血清型緑膿菌の０．３％ホルマリン処理菌体をフロイ
ントの不完全アジュバントでエマルジョンとし、１週間
おきに計５回ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に投与して免
疫した。

【００４０】４）細胞融合 最終免疫の４日後のマウスの脾細胞５×１０⁸個とＮＳ
−１マウスミエローマ細胞５×１０⁷個との５０％ポリ
エチレングリコール存在下における細胞融合によって得
られたハイブリドーマを９６穴平底プレートに分注し、
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジ
ン含有）を添加した１０％牛胎児血清加ダルベッコＭＥ
Ｍ培地で５％ＣＯ₂存在下３７℃で培養した。ハイブリ
ドーマの増殖を認めたウエルについて培養上清の抗緑膿
菌モノクローナル抗体の存在の有無を酵素免疫測定法で
あるＤＩＢＡ法で測定した。

【００４１】ＤＩＢＡ法は、９６穴Ｕ底マルチプレート
を用い、１ドット当り０．４μｇの０．３％ホルマリン
処理各血清型緑膿菌の全菌体を抗原として固定したメン
ブランフィルター（３．１ｍｍ角）と上記の培養上清１
００μｌを室温で３０分、ついでパーオキシダーゼ標識
ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）
と３０分反応後、クロルナフトールを基質として発色さ
せ、抗原を固定したメンブランフィルター上に肉眼観察
で発色を認めたものを抗体産生が陽性と判定した。培養
上清にモノクローナル抗体産生が認められたハイブリド
ーマはさらに、限界希釈法でクローニングを行ない、モ
ノクローンになったハイブリドーマはフラスコで増殖さ
せた後、免疫抑制剤プリスタン（アルドリッチ社）処置
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に移植し得られたマウス腹
水からプロティンＡ−セファロース（ファルマシア
社）、アフィニティカラム（ＩｇＧ向）、およびセファ
クリルＳ３００（ＩｇＭ向）を用いてモノクローナル抗
体を精製した。

【００４２】かくして得られた種々の抗緑膿菌モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの中から、本発明者らは
緑膿菌の血清学的分類に基づく各型に特異的に反応する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１８株を
見い出した。このうち、Ｅ型、Ｂ型、Ｇ型、Ｉ型に特異
的に反応するハイブリドーマはそれぞれ６株、４株、５
株、３株であった。これらハイブリドーマのうち、大部
分の株がグロブリンクラスがＩｇＧで、ＩｇＭは２株が
産生した。結果を下記の表２、３、４、５で表わされる
第２、３、４、５表に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】

【表３】

【００４５】

【表４】

【００４６】

【表５】

【００４７】なお、緑膿菌菌体に対するモノクローナル
抗体の直接凝集活性の測定はつぎの方法で行なった。９
６ウエルのＵ底マルチプレート（ファルコン社）に各血
清型の緑膿菌の０．３％ホルマリン処理あるいは１２０
℃加熱処理による死菌体の懸濁液（ＰＢＳ（−）に懸
濁、ＯＤ₅₄₀が０．４）を５０μｌづつ分注した。つい
でこれにモノクローナル抗体のＰＢＳ（−）による希釈
系列を５０μｌずつ分注し、プレート表面をシーラー
（リンブロ社プレートシーラー）でカバーし、室温で１
０分間振とうし３７℃で１時間静置した。さらにこれを
４℃〜１０℃で１５時間以上放置した後プレートを室温
にもどしプレートの裏面より透かして菌体の凝集反応像
を観察し判定した。

【００４８】試験例１ 血清学的分類による各血清型緑
膿菌に特異的に反応するマウスモノクローナル抗体の緑
膿菌感染に対する防御活性 実施例１で得られた各型の特異的に反応するモノクロー
ナル抗体の緑膿菌に対する感染防御能について検討し
た。生後、１０週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹
に各菌型に特異的に反応するモノクローナル抗体をマウ
ス１匹当り５０ｎｇ、５００ｎｇ、５μｇ、５０μｇ、
５００μｇ、５ｍｇをそれぞれ腹腔内へ投与し、２時間
後にそれぞれの菌型に特異な菌株を（ＩＩＤ１１３０
（Ｅ型）、ＩＩＤ１００２（Ｂ型）、ＡＴＣＣ１０１４
５（Ｇ型）、ＩＩＤ１０１０（Ｉ型）)１×１０⁶腹腔内
へチャレンジした。対照群はモノクローナル抗体のかわ
りに生理食塩液のみ投与した。緑膿菌感染後、７日目に
各投与群のマウスの生存率から５０％有効投与量（ＥＤ
₅₀値）を求めた。結果は、第２表〜第５表の通りで、各
種モノクローナル抗体の中でグロブリンクラスがＩｇＧ
で、強い凝集能活性をもつ抗体に極めて、強力な緑膿菌
感染防御効果が認められた。

【００４９】実施例２ 液剤 実施例１で得られた抗緑膿菌活性を示したモノクローナ
ル抗体を３／１０Ｍアミノ酢酸液で溶かし、グロブリン
濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにした。このようにして
得られたものを、メンブランフィルター（ニュクリポア
ーＮｏ．２０、ヌクリポア社製）を用いて無菌濾過して
１ｍｌずつバイアルに無菌的に分注して本発明物質の液
剤を得た。

【００５０】実施例３ 凍結乾燥製剤 実施例１で得られた緑膿菌感染に対して効果を示したモ
ノクローナル抗体を最終濃度３／１０Ｍになるようにア
ミノ酢酸を加えた生理食塩に溶かし、１ｍｇ／ｍｌと
し、さらにマンニトールを５０ｍｇ／ｍｌ濃度になるよ
う添加して、メンブランフィルター（ニュクリポアーＮ
ｏ．２０、ヌクリポア社製）を用いて無菌濾過し、２ｍ
ｌずつバイアルに無菌的に分注して凍結乾燥して本発明
物質の凍結乾燥製剤を得た。

【００５１】試験例２ 各血清型緑膿菌特異性マウスモ
ノクローナル抗体を利用した治療効果 試験例１で、予防効果の認められたモノクローナル抗体
Ｎｏ．１、４、５、Ｉ、ＩＩ、Ｂ、Ｅ、Ｙについてそれ
ぞれ治療効果の実験を行なった。

【００５２】すなわち、生後１０週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌
性マウス１群５匹に、試験例１と同様にそれぞれのモノ
クローナル抗体に反応する菌を１×１０⁶腹腔内へチャ
レンジして２時間後に、上記のモノクローナル抗体を各
々１００ｎｇ〜１０ｍｇ腹腔内に投与し、７日目でＥＤ
₅₀値を求めた。結果を、表６で示される第６表に表し
た。試験例１で強く予防効果を示した各々のモノクロー
ナル抗体の治療効果は１／６から１／１０に低下するも
のの、治療効果も認められた。

【００５３】

【表６】

【００５４】

【発明の効果】本発明に係るモノクローナル抗体は、緑
膿菌の血清型別抗原に対して特異的に反応し、グロブリ
ンクラスがＩｇＧで且つ緑膿菌菌体に直接凝集性を有す
る従来未知の新規抗体である。この抗体は、それと反応
する緑膿菌に対して極めて低濃度、低用量で有効性を示
すので、緑膿菌に対するすぐれた予防、治療剤としてき
わめて有用である。

【００５５】また本発明によれば、各種の緑膿菌に対し
て有効なモノクローナル抗体をそれぞれ効率よく作製す
ることができるので、これら各モノクローナル抗体を複
数種類配合することにより、各種タイプの緑膿菌に一度
で対応しうるきわめて適用範囲の広いすぐれた予防、治
療剤を調製することができ、治療がきわめて困難な感染
症のひとつである緑膿菌感染症に有効に使用することが
できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 緑膿菌の血清型別抗原に対して特異的な
   親和性を有し、かつ緑膿菌に対して直接凝集活性をも
   つ、グロブリンクラスがＩｇＧであるマウス由来のモノ
   クローナル抗体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
   少なくとも１種含有することを特徴とする緑膿菌感染症
   の予防治療剤。