RU1801117C - Способ получения монокло- нального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита человека, культивируемая клетка гибридомы jthfs-про- дуцентмоноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита чело- века, культивируемая клетка гибридомы jti-if3-f5 - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцитачеловека, культивируемая клетка гибридомы jti-id7 - про- дуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцита человека, культивируемая клетка гибридомы jt2-n15 - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку т4 лимфоцитачеловека - Google Patents

Abstract

Использование: иммунологи , биотехнологи , медицина. Получены моноклональные анти-моноклонально-анти-человеческо-Т4-ли мфоцитные антитела, вырабатываемые новыми лини ми клеток гибридом мышей JTI-IF 3, JTI-IF 3-Е5, JTI-ID 7 и JT2-N15. Линии клеток гибридом получены путем сли ни  NSI/1 клетки миемомы мыши и клетки селезенки мыши, иммунизированной ОКТ4А (монокло- нальное анти-человеческо-лимфоцито-Т4-ан- титело) с помощью полиэтиленгликол . Лини  клеток JTI-IF3 депонирована под номером ЕСАСС 87062501, JTI-IF3-E5 - под номером ЕСАСС 87062502, JTI-ID7 - под номером FERM BP-1685, JT2-N15 - под номером FERM ВР-1684. Моноклональные антитела способны нейтрализовать in vitro ВИДЧ - варианты. 3 табл. Se Ё 00 о

Description

Изобретение относитс  к иммунологии и может быть использовано дл  диагностики и лечени  инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека.

Существует потребность в разработке новых методов дл  диагностики присутстви  ВИДЧ-частици ВИДЧ-инфицированных клеток в образцах биологических жидкостей и тканей. Значительной способностью к нейтрализации in vitro ВИДЧ-инфекционности множества штаммов ВИДЧ обладают моноклональные анти-ОКТ4А-антитела.

Насто щее изобретение описывает способ получени  моноклонального антитела к моноклональному антителу против белка Т4 лимфоцита человека (ОКТ4-А) и используемые при этом новые линии гибридомных клеток мышей. Новые линии гибридомных клеток мышиного происхождени  обозначены JTI-IF3 (депонирована ЕАСС 87062501

IW

25.06.87), JTI-IF3-E5 (депонировала ЕСАСС 87062502 25.06.87), JTI-ID7 (PERM BP-1685 29.01.88), JT2-N15 (депонирована PERM ВР- 1684 29.01.88). JTI-IF3-E5 и JTI-ID7 получают путем субклонировани  JTI-IF3.

Линии гибридомных клеток имеют следующую характеристику:

х) JT2-N15 - продуцент моноклонально- го антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.

1). Родословна :

а) родительские клетки гибридом: NS I/I клетки миеломы мыши и клетки селезенки мыши;

б) антиген: антитело ОКТ4А;

в) сливающий агент: полиэтиленгликоль (ПЭГ) 1500;

г) процент позитивных клонов: 65%. 2). Стандартные услови  выращивани :

а) состав питательной среды: RM1 1640/GIBCO/, 15%-на  инактиви- рованна  лошадина  сыворотка, 2 мМ - глу- тамин, 1 мМ L пируват натри , 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина;

б) температура 37°С;

в) рН питательной среды: 7,4;

г) прочее: 5% С02, 95% воздуха, 100% влажности, 1x10 клеток/на пробирку.

3) Культуральные свойства:

а) способ культивировани : методы кле- точных культур Manmalian;

6J посевна  доза: следует поддерживать 1x10 кл./мл;

в) кратность рассева: 15-20 х,

г) врем  субклонировани : до того, как количество клеток не превысит 1x10 - 2хЮ6/мл.

4) Характеристика культивировани  гибридом в организме животных:

а) вид животного: ВА LB/c мышь. Стар- ше 5 недель;

б) доза клеток при прививке: 2x10 гибридных клеток.

в) метод сенсибилизации животного: инъекци  0,5 мл Pristane за 2-4 недели до прививки гибридных клеток;

г) врем  образовани  асцита или забора сыворотки: 2-3 недели после прививки клеток;

д) прививаемость: хорошо вызывает у мыши асцит;

ж) данные по видовой принадлежности: мышь, BAL В/с;

з) Контроль контаминации: добавление антибиотиков в культуральную среду.

5. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом:

а) группа иммуноглобулинов IgGi

б) специфичность продуцируемых иммуноглобулинов и методы оценки продуциру:

емых иммуноглобулинов: анализируют реакционную способность по отношению к антигену (ОКТ4А) с помощью методики FLiS Assay/Horescence-Linked Immunosorbent - флуоресцентна  методика , включающа  использование иммуносор- бента.

6). Характеристика биосинтеза полезных продуктов in vitro:

а) выход антител: in vitro 1 мкг/мл;

6) уровень активности: 2000 ITC/10 мкг/мл;

в) титр антител: 1000 х7 ). Способ криоконсервации:

а) температура хранени  198°С;

б) среда: R РМ 1640 (GIBСО), 15% лошадина  сыворотка;

в) криопротектор: 10% ДМЗО (диметил- сульфоксид);

г) услови  замораживани  и отогрева: замораживание: -20°С в течение 2 ч, -80°С в течение 1 дн , затем перенести пробирки в жидкий азот.

Отогрев: вытащить пробирку. Затем быстро на вод ную баню при 37°С до превращени  в жидкость. Вз ть клетки пипеткой Пастера и перенести их в 50 мл холодной среды и промыть;

д) жизнеспособность гибридных клеток после криоконсервации: после одного мес ца более чем 80% клеток остаютс  живыми;

е) метод оценки жизнеспособности: Trypam blue Staing (окрашивание Trypam blue).

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример Мышей линии BALB/c в возрасте 5-6 недель иммунизируют антигеном ОКТ4А (коммерческий препарат моноклональ- ного анти-человеческо-лимфоцито-Т4-антите- ла) в дозе 15 мкм очищенного препарата на мышь с помощью иглы, которую ввод т в селе- зекку через разрез на коже брюшка. Вторую иммунизацию повод т через 7 дней после первой путем введени  10 мкг препарата, третью иммунизацию провод т через 13 дней, ввод  5 мкг антитела в селезенку.

Спуст  4 суток после последней бустер- ной инъекции мышей забивают и в асептических услови х извлекают селезенки и их помещают на чашки Петри (на льду), содержащие модифицированную по Дульбекко среду Игла. Селезенки очищают от жира и соединительной ткани, пропускают через сетку из нержавеющей стали калибра 100. Результирующие индивидуальные клетки селезенки центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин с образованием осадка. Клеточный осадок дважды промывают средами (аналогично описанному выше) и повторно суспендируют в RPM 1640 и концентрацию клеток оНредел ют подсчетом на гемоцитометре в присутствии 0,2% трипан-синего.

Клетки миеломы мышей NS1/1 Ад 4.1, полученные на расе Balb/c, выращивают в среде RPM1 1640, содержащей 15% инакти- вЦрованной тепловой обработкой сыворотки лошади (Пел-Фриз). Клетки центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин с оЙразованием осадка и промывают средой RFJM1 1640, не содержащей антибиотика. Концентрацию клеток определ ют подсче- то после повторного суспендировани  в TOЈI же среде.

Клетки селезёнки и NSI/1-комбиниру- ют в соотношении 4:1 и центрифугируют 10 при 1000 об./мин . Надосадочнуюжид- коЈть отсасывают и сли ние клеток провод т при 37°С с использованием по иэтйленгликол  (ПЭГ) 1500, мол.м. 500- 60р. Процедуру провод т при посто нном осторожном перемешивании и добавлении следующего: 1 мл 50% ПЭГ в RPM1 1640, содержащем 15% лошадиную сыворотку, в течение минуты; 1 мл RPM1 1640, содержа- ще|го 15% лошадиную сыворотку, в течение ми|нуты; 1 мл RPM1 1640, содержащего 15% лошадиную сыворотку, добавл емого в те- че(ние 1 мин; 8мкл RPM1 1640, содержащего 15% лошадиной сыворотки, добавл емого в течение 2 мин.

Результирующие клетки сли ни  цент- ри|} угируют 10 мин при 1000 об./мин, повторно суспендируют в RPM1 1640, содержащей 15% лошадиной сыворотки и пейициллин-G и стрептомицин в количестве Юр ед. и 100 мг на 1 мл соответственно. Клетки помещают в чашки в количестве 0,1 мл;на  чейку в 96- чеечных чашках, предварительно уравновешенных в 5% СОа. Чашки инкубируют в течение ночи при 37°С в 5% С02.

На вторые сутки в каждую  чейку ввод т 0,1 мл среды HAT (13,6 мкг/мл гипоксанти- на, 0,176 мкг/мл аминоптерина и 3,88 мкг/мл тимидина) в RPM1 1640, содержащем 15% лошадиную сыворотку. Эта среда обеспечивает избирательное выживание гибридов клеток сыворотки NC1/1, что создает услови  дл  скрининга неслитых кле- ток NC1/1 или слитых с другими клетками. Неслитые первичные клетки селезенки взрослых мышей не выживают в культуре дольше нескольких суток.

На 3, 4, 6, 9 и 12 сутки из каждой  чейки отвод т 0,1 мл среды и добавл ют 0,1 мл свежей HAT в RPM1 1640, содержащей 15% лошадиной сыворотки. На 15, 19, 23 и 27 сутки из каждой  чейки отвод т 0,1 мл среды и замен ют с помощью 0,1 мл среды

RPM1 1640, содержащей 15% лошадиную сыворотку и только гипоксантин и тимидин в указанной выше концентрации. На 28 сутки культуральные надосадочные жидкости из всех  чеек подвергают скринингу дл  вы влени  антитела, специфичного в отношении ОКТ4А.

Дл  вы влени  гибридом, продуцирующих антитела на ОКТ4А используют метод флуоресцентно-св занного иммуносорбен- тного анализа (FLISA). Отобран положительный клон JTI-IF3. Антитела надосадочной жидкости про вл ют реактивность по методу анализа п тен по Уэс- терну с ВИДЧ-белком молекул рной массы 60000-80000. Антитело клона JTI-IF3 относитс  к изотипу IgG.

П р и м е р 2. ВИДЧ-нейтрализаци .

Надосадочные жидкости гибридомных культур провер ют на способность к нейтрализации ВИДЧ следующим образом. Надосадочные жидкости трехсуточного роста разбавл ют 1:5 в пол ной среде (500 мл RPM1 1640; 6 мл 100 х пенициллин стрептомицин; 6 мл 100 х L-глютамин, 100 мл FCS; и 1,2 мл Polybrene Stock (1 мг/мл). 200 мкл разбавленной средой npo6 tубавл ют во все  чейки 24- чеечной микротитровальной чашки, за исключением двух, а в две  чейки ввод т равное количество одной лишь среды. Дополнительную среду добавл ют к одной из  чеек с одной лишь средой и в каждую оставшуюс   чейку ввод т 200 мкл высоко- титрового ВИДЧ-вирусного материала. Чашки запаивают в пластиковые мешки, инкубируют 1-1,5 ч при 4°С и оставл ют доходить до 17°С при сто нии в течение 15 мин. Клетки Н9 инкубируют в полной среде в течение 30 мин при 37°С при плотности 1x10 кл./мл, затем центрифугируют и повторно суспендируют в свежей полной среде при плотности SxlO1 кл./мл. 200 мкл клеточной суспензии добавл ют к каждой  чейке (довод т общий объем до 600 мкл) и чашки инкубируют 1 ч при 37°С. после чего 150 мкл перенос т на дублирующую чашку, содержащую 2 мл свежей полной среды на  чейку. Культуры инкубируют при 37°С в СОа-инкубаторе. Спуст  4 суток культуры дел т и добавл ют свежую полную среду. На 7 сутки инкубировани  готов т пробы дл  нейтрализационного скрининга по методикам IFA и обратной транскриптазы (RT).

В табл.1 приведены результаты in vitro -нейтрализирующей активности дл  антитела JTI-IF3 относительно 3-х испытанных вариантов ВИДЧ (ВИДЧ - вариант HTLV- IIIB, гаит нского ВИДЧ-варианта, обозначенного AL12112C, и африканского ВИДЧ-варианта. 906). Антитело JTI-IF3 распознаетс  как общий эпитоп всех трех ВИДЧ-вариантов. Данные нейтрализацион- ного анализа JTI-IF3, JTI-IF3 - Е5, JTI-ID7 приведены в табл.2.

П р и м е р 3, Процедуры формировани  и скрининга гибридом согласно примерам 1 ,и 3 вновь повтор ют с использованием ОКТ4А при следующих модификаци х процедуры иммунизации. Начальна  иммунизаци  включала внутрибрюшинную инъекцию 10 мкг Monos - очищенного антитела QKT4A, втора  внутрибрюшинна  инъекци  (7 мкг) делалась спуст  17 суток, а последн   (7 мкг внутривенна  доза) вводилась спуст  18 суток. После сли ни  и скри- нинга дл  дальнейшего исследовани  был выбран lgGp-продуцирующий положительный клон, обозначенный JT2-N15. Подобно JTI-IF3 и его субклонам JTI-IF3-E5 и JTI-ID7, клон JT2-N15 продуцировал моноклональ- мое антитело, которое по данным анализа п тен по Уэстерну было реакционноспособ- ным с ВИДЧ-белком молекул рной массой около 65-67.000. Культуральные среды выращивани  JT2 N-15 были положительными по данным анализа ELISA и результаты предварительного нейтрализационного анализа относительно HIV-IIIB-инфективно- сти приведены ниже в табл.3.

В дальнейших процедурах скрининга по нейтрализационной активности анти- идиотипных антител, размноженных асци- тическим методом, предварительно было установлено, что нижеследующа  методика дает наиболее активный асцитический пре- парат. Мышам возраста 5-8 недель делают затравку введением 0,5-1 мл пристана, а спуст  две недели делают инъекцию 2- SxlO6 (предпочтительно SxlO6) гибридом- ных клеток. Сбор асцитических жидкостей начинают, спуст  две недели после инокули- ровани  и собранйые в самом начале жидкости (около 3-5 мл) про вл ют наивысшую нейтрализационную активность. Второй сбор асцитической жидкости провод т спу- ст  трое суток, что дает 8-10 мл жидкости меньшей активности. Третий сбор у выживших животных в общем дает 3-5 мл жидкости , котора  по большей части существенно менее активна, чем любой из материалов

после первого и второго сбора. Нейтрализа- ционные данные, представленные дл  JTI- IF3 в табл.1 и 2, основаны на асцитических жидкост х, объединенных после трех сборов , тогда как данные дл  JTI-IF3-E5, JTI-ID7 и JT2-N15 в табл.2 и 3 основаны на асцитических материалах, объединенных только из первого и второго сборов.

Claims (5)

1. Способ получени  моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека, включающий иммунизацию животного антигеном, получение линии гибридомных клеток путем сли ни  клеток селезенки и клеток миеломы мыши, отбор линии гибридомных клеток, продуцирующих специфическое монокло- нальное антитело, отличающийс  тем, что антиген представл ет собой ОКТ4А-мо- ноклональное антитело, способное к специфическому св зыванию с СД4 белком Т4 лимфоцита человека, а линию гибридомных клеток выбирают из группы, включающей: культивируемую клетку гибридомы (JTI-IF3 ЕСАСС 8706501), или культивируемую клетку гибридомы JTI-IF3-E5 (БСАСС 87062502), или культивируемую клетку гибридомы JTI- ID7 (FERM ВР-1685), или культивируемую клетку гибридомы JT2-N15(FERM BP-1684).

2. Культивируема  клетка гибридомы JTI-IF3 (БСАСС 87062501) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.

3. Культивируема  клетка гибридомы JTHF3-E5 (ЕСАСС 87062502) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека .

4. Культивируема  клетка гибридомы JTI-ID7 (FERM ВР-1685) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.

5. Культивируема  клетка гибридомы JT2-N15(FERM BP-1684) - продуцент моноклонального антитела к моноклональному антителу к белку Т4 лимфоцита человека.

Приоритет по пунктам и признакам:

19,02.87 по п.1 кроме клеточных линий:

29.06.87 по пп.2 и 3:

03.02.88 по пп.4. 5.

Таблица 1

JTI - IF3 - нейтрализаци 

Таблица 2

Продолжение табл. 2

Таблица 3