JPH04500003A

JPH04500003A - ブタ多クローン性抗体および単クローン性抗体

Info

Publication number: JPH04500003A
Application number: JP1508252A
Authority: JP
Inventors: オスザー，カート・ビー
Original assignee: ヴェリガン・インコーポレーテッド
Priority date: 1988-07-26
Filing date: 1989-07-26
Publication date: 1992-01-09
Also published as: EP0429484A1; WO1990001066A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ブタ多クローン性抗体および単りローン性抗体艦咀の貨量マウス単クローン性抗体は多数のヒトの疾患の診断および治療に用いられてきた。マウス単クローン性抗体の一つである０ＫＴ３は、臓器同種移植における拒絶反応の際の強力な免疫抑制剤として［オルｌ−・マルチセンチ−・トランスズランｌ−・スタディ−・グループ（Ｏｒｔｈｏ　ＭｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒＴｒａｎｓｐｌａｎｔ　５ｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐ）；Ｎｅｗ　Ｅｎ　、Ｊ。

Ｍｅｄ、　、３１３；３３７．１９８５］　、および拒絶の開始を防止するのに有用なものとして［クライス・エイグー（Ｋｒｅ　ｉ　ｓ、Ｈ，）ら、エエ！上 −ａｎｔ　Ｐｒｏｃ、、１７：２７３４．１９８５］記載された。０ＫＴ３は成熟ヒｌ−ＴＭ胞に結合し、Ｔ−＃ｆ＃ｌ受容体に堅く結合する〔モナー・ニス・シー（Ｍｏｎｅｒ、Ｓ、Ｃ，）ら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、　、１５１ニア０５．１９８３］。

初期の楽観論であるが、マウスタンパク質のヒトへの注入はその宿主による免疫応答を誘発することができる。誘発されるアレルギー性反応には熱、発疹、アナフィラキーおよび血清病を挙げることができる。この現象は臨床医学においてマウス単クローン性抗体を利用するのに益々重要となり且つ盛んに研究されてきた［コシミ・エイ・ビー（Ｃｏｓｉｍｉ、Ａ、Ｂ、）ら、Ｎ５Ｅｎ　、Ｊ。

Ｍｅｄ、　、３０５　：　３０８．１９８１；ミラー・アール・エイ（Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｒ，Ａ、）ら、Ｂｌｏｏｄ−５旦＝７８．１９８１；シアーズ・エイグ・ジー（Ｓｅａｒｓ、Ｈ，Ｇ、）ら、Ｌａｎｃｅｔ、’　２：　７６２．１９８２　、ディルマン・アール・オー（Ｄｉ　１１ｍａｎ、Ｒ，Ｏ，）ら、Ｂｌｏｏｄ、５９：１０３Ｇ、１９８２　；コルヴイン・アール・ビー（Ｃｏｌｖｉｎ、Ｒ，Ｂ、）ら、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　、土工：３６３．１９８２　；ジエファース・ジー・ジエイ（Ｊａｆ　ｆｅｒｓ、Ｇ、Ｊ、）ら＋Ｔｒａｎｓ　Ｉａｎｔ　Ｐｒｏｃ、、工旦：０４３：１９８３；コプ口ウス−ｉｒ・エイグ（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｈ，）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、ＵＳＡ、旦：２１６．１９８４　；ボートリハイ・エム・エフ（Ｂａｕｄｒｉｈａｙｅ、Ｍ、Ｆ、）ら、４Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、　、旦＝６８６．１９８４；およびディストレスウェイトジェイ・アール（Ｔｈｉｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ，Ｊ．Ｒ．）ら、Ｔｒａｎｓ −ｌ　ａｎｔａｔ　ｉ　ｏｎ、、１旦；６９５、１９８４コ。

例えば、抗腫瘍剤としてのマウス単クローン性抗体の投与のヒトでの最初の作用は劇的であることが多いが、しかしながら、その作用は宿主の逸脱機構、例えば抗原転調および抗単クローン性抗体による異種感作のために衰えることがある［ナドラー・エル・エム（Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、４０　：　３１４７、１９８０；リッツ・エフ（Ｒｉｔｚ，Ｆ．）ら、Ｂ１ｏｏｃ１ｉ旦：１４１、１９８１；ミラー・アール・エイ（Ｍｉｌｌｅｒ。

Ｒ．Ａ．’Ｉら、Ｌａｎｃｅｔ．２：　２２６、１９８１；ミラー・アール・エイら、Ｎ．Ｅｎ　、Ｊ．Ｍｅｄ．　、３０６：　５１７、１　９８２　、レヴイー・アール（Ｌｅｖｙ，Ｒ．）ら、Ｆｅｄ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｅｘ　、Ｂｉｏｌ．　、４２：２６５０、１９８３．およびミラー・アール・エイら、Ｂｌｏｏｄ，立ｌ：９８８、１９８３］．マウス／ヒトハイプリドーマおよびヒ）・／ヒトハイプリドーマは効果が限定された異種移植作用を排除するための研究で実験が行なわれてきた．更に、明白な理由のために、極めて限られた件数の症例でヒｌー／ヒ）・ハイブリドーマを用いることができるにすぎない。

土盟Ｑ轡量本発明は、所定の抗原と反応性のブタ抗体、好ましくはブタ単クローン性抗体の製造に関する．本発明のブタ抗体は、抗原を用いてブタ抗体が生産される条件下でブタを免疫感作することによって製造される．ブタ多クローン性抗体が望ましい場合、そのブタから血液を採取し、多クローン性抗体を含んでいるその血清を他の血液成分から分離する。

ブタ単クローン性抗体は、ブタの＃！１臓からブタ抗体産生＃Ｉ胞を回収し、それを不滅化細胞と融合させることによってそれらのハイブリドーマを生成することによって製造される。所定の抗原と反応性の単クローン性抗体を産生することが可能なハイブリドーマを培養し、クローン化し、そしてブタ単クローン性抗体をハイブリドーマ上澄みから回収する。

本発明のブタ抗体は、ブタ抗体がヒｉ・に投与される場合に免疫性作用がほとんどないという点で現在用いられているマウス抗体に優る利点を有する。

立型Ω註囮皇説朋ブタとヒトのタンパク質の間の遺伝的類似はインスリンに関して周知である。

更に、ブタの免疫クロプリンはヒ１−の免疫クロプリンに著しく類似している０本発明は、ブタが種々のブタ／′ブタハイブリドーマおよびブタ−ヒトバイブ１ドーマの製造に用いられる有用な抗体産生細胞源であるという発見に関する。他の種とのハイブリドーマを製造することもできる（例えば、サル／ヒトハイブリドーマ）、シかしながら、ヒトおよびサルのような霊長類を種々の抗原による免疫感作に利用することか制限されていることによりハイブリドーマおよび単クローン性抗体の製造にこれらの動物を一般的に利用することはできない、抗体産生４１Ｂ胞源としてブタを用いることは異種感作の危険を減少させることがでさる。

「単クローン性抗体」という用語は抗体全体またはその生物学的機能断片を包含している。典型的に、断片にはそれぞれの抗原に結きすることが可能な抗体の部分か挙げられる。

単クローン性抗体には、２種類の異種（例えば、ヒトの定常領域およびブタの結き部分）から誘導される部分から成るキメラ抗体も挙げられる。２種類の異種から誘導される部分は通常の技法によって化学的に互いに結合させることかできるし、′ｉｉ伝子工学的技法を用いて単一タンパク質として製造することがでさるし、遺伝的転移によ一ノて製造することかできるし、または他の技法によって製造することがでさる。キメラ抗体の両方の部分のタンパク質を略号化するＤＮＡはベクターに挿入することができ、そのキメラ抗体を一連の（ｃｏｎｔｉｎｇｕｏｕｓ）タンパク質として発現することができる。

ヒトに投与された場合にマウス免疫７０プリンよりも免疫性作用か少ない免疫グロブリンを産生ずることが可能なフタの系統または種類を本発明で用いることができる。好ましいブタはヨークシャー（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ）混合種のブタである。用いることがでさる他のブタの種類の例として、ジュロツク種（Ｄｕｒｏｃ）、　ハン′プシャ−Ｎ（Ｈａｍｐ−ｓｈｆ　ｒｅ）、スボッティド・スワイン種（Ｓｐｏｔｔｅｄ　５ｗ１ｎｅ）、ボーランド・チャイナ種（Ｐｏｌａｎｄ　Ｃｈｉｎａ）、チェスター・ホワイト種（ＣｈｅｓｔｅｒＷｈｉｔｅ）、バークシャ一種（Ｂｅｒｋｓｈｉ　ｒｅ）、オー・アイ・シ一種（０，１，Ｃ，）、ヘレフ巧−ド種（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ）、タムワース種＜Ｔａｍｗｏ　ｒ　ｔ　ｈ　）　、ミニビッグ（ｍｉｎｉｐｉｇ）種が挙げられる。

ブタの免疫感作に用いることがでさる抗原として、レトロウィルス、例えばＨｒｖ−１、ＨＩＶ−２また４、ｔＨＴＬＶ−１；サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）。

肝炎ライスル、例えば肝炎Ｂ型ウィルス：狂犬病ウィルス；または各種腫瘍ウィルスなどの他の種類のウィルス；腫瘍壊死因子−α＜ＴＮＰ−α）；敗血症を生じる大ｆｌａｔ菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような＠菌などの病原性ｌ５Ｉｌｌ菌または他の微生物がらの抗原か挙げられる。各Ｓ！腫瘍抗原を免疫原として用いて、抗腫瘍治療に用いるための単クローン性抗体を得ることもできる。或いは、治療しまたは移Ｍ後の臓器拒絶を防止するのに有用なＴ３リンパ球単クローン性抗体を製造する目的で、Ｔ３リンパ球を免疫原として用いることができる。

本発明は、所定の抗原と反応性の抗体の製造方法が（ａ）抗原と反応性の抗体が生産される条件下で、ブタを抗原によって免疫感作し、（ｂ）そのブタから血液を採取することによって抗原と反応性の抗体を含むＭＪ胞を採取し、そして（Ｃ）抗体を含む血清を他の血液成分から分離することを含んで成る方法を包含する。

回収および精製［ｔＩｋに、その抗原に関係した疾患を治療する受動免疫９法の一部分として治療に効果的な投薬量を患者に投与することによ−）て、その抗体を多クローン性形態で直接用いることができる１泊瞭に効果的な投薬量とは泊疫を行なう疾患の症状をかなり減少させるかまたは除去する投薬量である。

或いは、抗体を単クローン性抗体の形態で投与することができる。単クローン性抗体は体細胞ハイブリッド形成法［コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉ　ｌ　ｓｔｅ　ｉ　ｎ）、Ｎａｔｕｒｅ　＜１９７５）コを用いて製造することができる。所定の抗原と反応性の単クローン性抗体を産生ずることが可能なハイブリドーマは、（ａｌブタを、抗原と反応性の抗体が産生される条件下で抗原を用いて免疫感作し、（ｂ）抗体産生細胞をそのブタのＷｅＢがら回収し、（ｄ）ブタの抗体産生細胞を（ブタ、ヒト、または他の霊長類の）不滅化細胞と融合し、ｆｅ）融合きすに残留するブタ抗体産生細胞および不滅化細胞を除去し、（ｆ）所望の抗原と反応性の単クローン性抗体を産生ずることか可能な所望のハイブリドーマを選択することによって製造される。

本発明の更に別の特徴により、所定の抗原に対する抗イデイオタイプ抗体を［ａ）第１の種の動物、例えは第１の種のブタを、抗原と反応性の抗体が産生される条件下で抗原を用いて免疫感作し、（ｂ）抗体か所望の力価に達する時点で第１の動物から血液を採取することによ一ノて抗原と反応性の抗体を採取し、ｆｃ）抗体を血液から分離し、（ｄ）第２の種の動物、例えば第２の種のブタをその抗体を用いて免疫感作し、そして（ｅ）得られる抗−抗体をワクチンとして利用するために回収することによ−ノて製造する。

更に１分に下記に記載されるように、抗イデイオタイプ抗体の利用は異種感作を減少さき、したか−ノで、ヒ）・の泊僚に有用であることかできる。

本発明の尚、更に別の特徴により、ヒトの治療でのマウス単クローン性抗体の利用に潜む危険は、マウス単クローン性抗体を前記に記載した方法を用いて「ブタ／′ブタ」または「ブタ／ヒ１〜」単クローン性抗体に翻訳し且つブタを最初に免疫感作するのにマウス羊クローン性抗体を用いることによって減少させることができるし、可能な限り排除することができる。或いは、本文中前記に記載のように製造されたブタ／ブタまたはブタ／′ヒ）・単クローン性抗体を「サンドイツチ法」と−緒にマウス単りローン性抗体僚法によって投与して後者によ一ノて生じる異種感作を減少させ、または可ｇ：な限り排除する。

本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、その好ましい態様についての下記の詳細な説明から更に１分に明らかになるものである。

ブタ−ヒトバイブ１ドーマの製２本発明の単クローン性抗体を製造するために、ブタを所望の１種類または複数種類の抗原で免疫感作し、ブタを免疫感作した１種類または複数種類の抗原と反応性の１種類または複数種類の抗体についての１分な力価が得られるまで追加抗原を行なう、得られる１分な抗体価は浦常の方法を用いて測定することができる。

例えば、ＨＩＶ−１に対する抗−ｇｐ４８抗体を製造する場＞＜Ｗａ特許出願第２１５．８６７号を参照されたい）、低い正の参照（例えば、Ｗ＊ＨＩＶ−１の正の調節）の力価に少なくとも等しい力価か１分である。エレクトロヌクレオニクス・エライザ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｌｅｏｎｉｃｓ　ＥＬＩＳＡ）試験キットと一緒にベーゾング・エライザ・プロセッサー（Ｂｅｈｒｉｎｇ　ＥＬＩＳＡＰｒｏｃｅｓｓｏｒ）Ｕ型（４９２ｎｍで）を用いて測定する場合、このような低い正の参照値は約０．７である。他の抗体の適当な力価は、他の商業的に入手可能な検定法、例えばＥＬＩＳＡ−ＣＭＶまたは肝炎Ｂ型抗体試験キットをＣＭＶおよび肝炎Ｂ型抗体にそれぞれ用いて測定することができる。

このようにして適当な力価を測定する時点で、免疫細胞を回収することかできる。形質細胞および他の適当な免疫ＩＩＩＩＩ胞は血液または他の臓器、例えば骨髄から得ることができる。膵臓は免疫細胞を採取するのに利用する好ましい臓器である。

ＩｇＭ型特型性異性抗体大の時、すなわち、ワクチン接種後、または１回または数回の追加抗原投与量をブタに投与した後、約８−２０日口重好ましくは１２“ 〜１７日目口重収することができる。ＩｇＧ抗体が好ましい＃ｊき、ブタに約１４−３０日間の間隔をおいて３〜５回ワクチン接種を行ない、最大抗体価は最初のワクチン′接種の約２か刃稜に得られる。好ましくは、その後、ブタを層殺する２〜５日前に、ブタに分割追加抗原投与量を皮下（ｓ、ｃ、）および腹腔内（ｉ。

ｐ、）の双方に与える。続いて、その膵臓を採取し、免疫４ｍ胞を回収する。

次に、ブタの免疫細胞を不滅化細胞（例えば、骨髄腫細胞〉と融きしてハイブリッド細胞（本文中以下、ハイブリドーマ）を生成する。不滅化細胞は４１ＩＩ胞培養培地中で長期間の間生存することが可能なｌＩｌ！ｌ胞である。ブタ／′ブタ（悪性形質細胞）ハイブリッド、またはブタ／ヒトハイプリドーマのようなブタ／′霊長顕ハイブリッドが好ましい、ブタ免疫細胞をヒｌ−Ｊ髄腫細胞または豆類型様細胞と融きさせるのが最も好ましい、０Ｍ４０７２Ｂヒト骨髄Ｉｌ！細胞（ＥＭＣモディファイドＣＭ１５００骨髄Ｉｌ細胞）か特に適当であることが見出された。この細胞系は、従来ヒト／ヒトハイブリドーマ製造に用いられてきた１ｇＧ２に分泌細胞系である。或いは、他の骨髄腫細胞系、例えば１ｇＭ４″ ｒ泌細胞系または他のＩｇＧ分泌細胞系を用いることができる。好都合には、ヒボキサンチン・二アミノプテリン：チミジン（ＨＡＴ）培地に感受性である骨髄Ｗ！細胞、例えばＧ４６７２Ｂ細胞系を用いることができる。

ハイブリドーマを生成するのに、免疫感作されたブタからの膵臓を細かく刻み、その影響細胞（免疫［胞）をＲＰＭＩＩＧ４０またはＩＭＤＭなどの培地で洗浄し、そして融きを行なうのにポリエチレンブリコール（ＰＥＧ）を用いて適当なヒｊ・骨髄腫ＭＢ胞と融きさする。融きには、オイら、およびフぢスターによ一層て記載された１０トコルの変法を用いることができる「オイ・ヴイ・ティー（Ｏｆ、Ｖ、Ｔ、）、へＩレツエン゛ベルグ・工ｌし・エイ＜Ｈｅｒ−ｚｅｎｂｅｒｇ。

Ｌ、Ａ、）、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＣｅｌｌｕｌａｒＴｍｍｕｎｏｌｏ　３５１°−３７２頁、ビー・ビー・ミラェル（Ｂ、Ｂ。

Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびニスーｘム・シイギ（Ｓ、Ｍ、Ｓｈｉ　ｉｇ口監修、サン・フラッジスコ、タブリュー・エイチ・フリーマン・カンパニー＜Ｗ、　Ｈ３Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、＞−１９８０；）間スター・シー（Ｆｏｓｔｅｒ。

Ｃ，）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、Ｒｅｖ、　、９：５９．１９８２］、融きに用いられるＰＥＧは３０〜５０％のＰＥＧ１５００であることができ、細胞はＰＥＧを用いて種々の期間インキュベ−１・することができる。

望ましい敵含度は約３０〜３５％のＰＥＧ濃度で、およそ室温から４０℃の温度で得ることができる。室温を用いる場合、ＰＥＧインキュベーション時間は約７ −９分間であることができる。ＰＥＧを４０℃で用いる場合、一層短いインキュベーション時間が好都合であることができる。例えば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）およびミルスタイン（Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎ）（１９８１）のプロｊ・コルを用いると、適度に高い融き度が得られる。

融ぎ後に１ＩｌｌＩ胞を、例えば２４枚のウェルル−１・に分配し、ＨＡＴ培地を２〜３日毎に加えて、上澄み液の５０％をその加えるＨＡＴで置き換える。ヒ）・骨髄ｌｌ細胞をＨＡＴ培地によ−）て除去し、まだハイブリッド形成されていないブタ形質細胞は数日中に自然に死滅する。

ハイブリドーマクローンの出現は、かなりのハイブリドーマクローンが観察されるまで謬Ｗ１鏡的に観察される。ハイブリドーマを２４枚のウェルルート外培養し、約１０５細胞／ウエルの濃度まで増殖させる．上澄みを、ブタの免疫感作に用いた１種類または複数種類の抗原と反応性の抗体の存在について試験する．前記に記載したのと同様の方法で、例えばＣＭＶまたは肝炎Ｂ型抗体を、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ−ＣＭＶまたは肝炎Ｂ型抗体試験キットで試験を行なうことによーノて容易に測定する．特興性ヒ１〜抗体の測定用試験キ・ントは、ブタ免疫グロブリンおよびヒト免疫グロブリンの双方、更にはブタ／ヒト抗体を抗し）・抗体を用いて検出することができるので、用いることができる．免疫グロブリンＩｇＭまたはＩｇＧの種類を、ノア・パーティジエン・プレート（ＮｏｒＰａｒｔｉｇｅｎ　ｐｌａｔｅ）［ベーリング・ダイアグノスティック（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）］のような抗ヒト（または抗ブタ）免疫グロブリン試験を用いて検出することかできる．次に、限界稀釈によるクローニングを行なう（オイら、前記に引用された、１　９８０＞。

マウス′クローン　体と　応　のブタ　イディオタイプ　の製造ブタを、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂのいずれかの型の既知のマウス単クローン性抗体で免疫感作してそれぞれの種類の免疫グロブリンと反応性のブタで抗−抗体を製造することができる．ブタの血液中の抗体を種々のクラスのマウス免疫グロブリンに対する多クローン性ｖｃ＃どして用いることができる．更に、ハイブリドーマは、ブタがらの免疫細胞と不滅化ｍ胞とをハイブリッド形成さ嬰ることによーノて製造することができる．ハイブリドーマ（ブタ／ブタ、ブタ／′ヒｌ−）は免疫源として用いられる単クローン性抗体と反応性の単クローン性抗体を生じる，単クローン性抗体は於断用検定または油僚に用いることができる。

例えば、ある種のＩｌ瘍抗原に特異的なマウス単クローン性抗体を静脈内投与し、特定のマウス単クローン性抗体を「標的とする」腫瘍抗原に結きさせる．標的抗原への結合はマウス単クローン性抗体の注射後比較的速やかに生じる．その直後に、ブタの抗マウス抗体である多クローン性抗体がまたは革クローン性抗体を静脈内に投与する．次に、ブタの抗マウス免疫グロブリンまたはブタの単クローン性抗マウス抗体は先に投与されたマウス単クローン性抗腫瘍抗体を標的とし、そのマウス単クローン性抗体に結きする．ブタの抗体は放射性同位体で標識することかでき、続いて、患者をスキャニングすることによってマウス単クローン性抗体を結きした１種Ｍまたは複数種類の腫瘍抗体の位置を確認することができる。

このサンドイツチ法にはマウス単クローン性抗体単独の授与に優る二つの利点がある．第一に、「サンドイッチ」に結合した抗体はマウス単クローン性抗体よりも強いシグナルを与える．第二に、そしてなお一層重型なことに、サンドイツチ法の利用は、患者が抗マウス免疫グロブリン抗体を産生ずることがあるという危険をはるかに低いものにし、特に、ブタ／ヒトハイプリドーマがマウス抗体に対する「抗原決定基」に結きし、それによ−ノて、異種感作をかなり減少さ仕るかまたは可能な限り排除する患者をマウス単クローン性抗体を用いて治療する試みであり、それが移植患者の臓器拒絶を防止する泊療である場合［バック・ジェイ・エフ（Ｂａｃｈ　Ｊ。

Ｆ．）ら、Ｔｒａｎｓ　Ｉａｎｔａｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ．１９：（増補１）１７・〜２０頁、１９８７］　、またはマウス単クローン性抗体を用いて宿主による免疫応答を誘発させる他の疾患の４３［コシミ、エイ・ビーら、Ｎ。

Ｅｎ　、Ｊ．Ｍｅｄ．　、３０旦：３ｏ８、１９８１；コシミ、エイ・ビーら、Ｔｒａｎｓ　Ｉａｎｔａｉｏｎ，旦２：５３５、１９８１，ミラー・アール・エイら、Ｂｌｏｏｄ．且旦ニア８、１９８１；シアーズ・エイチ・ジーら、Ｌａｎｃｅｔ，２：　７６２、１９８２；ディルマン・アール・ディー（Ｄｉ　Ｉ　Ｉｍａｎ，Ｒ．Ｄ．）ら、Ｂｌｏｏｄ，５９：　Ｉ０３Ｇ、１９８１；コルヴイン・アール・ビーら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、４１　：　３６３、Ｉ　９８２　。

シエファース・ジー・ジェイら、エム１ユ旦り土工旦二旦旦工、１５：６４６：１　９８３　；シャトノウド・エル（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ，Ｌ．）ら、Ｔｒａｎｓ　１．Ｐｒｏｃ．、ｌ旦：６４３：１９８３；コア０ウスキ・エイチら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．８１：２１Ｃｌ、１９８４、ボートリハイ・エム・エフら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　、旦：６８６、１９８４；ディスｌ−レスウェイｌ−・ジェイ・アールら、Ｔｒａｎｓ−Ｉａｎｔａｔｉｏｎ．３旦：６９５、１９８４］．宿主の異種感作をマウス単クローン性抗体での抗原決定基の「中和」によーノて防止することができる．本発明の方法は、マウス単クローン性抗体をヒトで一層長期間、他の状況では単クローン性抗体を更に利用することを妨げるものである宿主の抗マウス抗体を産生ずることなく利用することを可能にする。

ブタをヒ１〜で用いられることになっているマウス免疫プロブリン種で免疫感作する場き、本文中前記により１分に記載したように、（ＩｇＭ抗体か好ましい場さ）１回のワクチン＃種に追加抗原量を加えた後か、または（ＩｇＧｉｆＡ体が望ましい場合）ワクチン接種を繰り返した後に層殺することができる．ブタ免疫グロブリンを精製後に、そのブタ血清を多クローン性ｒｇＭｔたはＩｇＧとして用いることかできる。

多クローン性抗体は、ブタ血清または部分的に精製された免疫グロブリンを、マウス単クローン性抗体を結きしているセファロースＣＮＢＲ−４Ｂアフィニティーカラムに通すことによー）て更に精製することができる．ブタ抗体はカラム中のマウス単クローン性抗体に結合する，したか−ノで、精製されたブタ抗マウス単りローン性抗体または多クローン性抗体を溶離することができ、得られる抗体は、ブタを免疫感作した種類のマウス単クローン性抗体に対する特異性が高い、ブタ多クローン性抗体を生体内で用いてマウス抗体の抗原決定基を結きし且つ中和することかでき、それによって異種感作を防止する。

ブタの免疫グロブリンはヒト宿主の免疫監視によ−ノてマウス免疫グロブリンよりも］公費は入れられるが、当然ながら、ブタ免疫グロブリンに対する異種感作の可能性も存在する。このような異種感作をいずれも防止するために、免疫感作されたブタからブタ免疫＋１１１Ｉ胞を採取し、ブタ／ヒトハイブリドーマまたはブタ／サルハイブリドーマを製造してマウス単クローン性抗体に対する単クローン性抗体を得て、そして得られる単クローン性抗体をマウス単クローン性抗体と一緒に用いることが好都合である。

マウス単クローン性抗体を種々の予防ワクチン製造用の［ゴールトン・シー・エヌ＜Ｇａ１ｔｏｎ、Ｇ、Ｎ、）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、工旦ヱ：２９３０．１９８（：ｌ］、または自己免疫疾患の治療［エジアス・エム（Ａｇ　ｉ　ｕ　ｓ、　Ｍ、　）　、リッチマン・ディー・ピー（Ｒｉｃｈｍａｎ、Ｄ。

Ｐ、）１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｖ、上ユヱ：２１９５．１９８Ｇ］での抗イデイオタイプ抗体として製造する場合、ブタ抗体を用いて宿主での異種感作を制復することかできる。

したが−ノて、例えばラット単りローン性抗体に対して、またはこのよつな種類の多クローン性抗体に対して、例えばウマ抗ヒトリンパ球血清等に対して単クローン性抗体を産生じたそのような種の動物から任意の種類の単クローン性抗体に対する抗体を製造するのにブタを用いることは本発明の範囲内である。

ブタ免疫グロブリンかまたはブタ単クローン性抗体の結きは、ＥＬＩＳＡ法を用いて、稀釈された動物（マウス、ラット等）の１クロ一ン性抗体をＥＬＩＳＡシステムの半固体相に固定することによ−２て測定することかできる９次に、前記に記載したブタまたはヒ１〜抗体をインキュベージヨシ用の種々の稀釈度の試料に加え、続いて酵素に結きさ亡な抗−ヒトＩｇＧ：ＬなはＩｇＭを加える０次に、半固体相を試料から分離し、着色試薬（例えば、基譬）を加える。試料の着色をブタ単クローン性抗体の存在または不在の表示とＬ７て検出する。

イディオタイプ　体の調イディオタイプおよび抗イデイオタイプの双方について細胞性免疫並びに体液性免疫の操作の試験が行なわれてきた［ラジェウスキ・ゲイ・ニス（Ｒａｊｅｗｓｋｉ、に、Ｓ、）、タケモリ・ティー　（Ｔａｋｅｍｏｒ　ｉ、Ｔ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．．１　：　５６９．１９８３］、近年、これらのｇ察はウィルス性、細菌性または寄生虫性の抗原に対する抗体反応の促進または誘発に用いられてきた［シーガン・ケイ・ジェイ（Ｒｅａｇａｎ、に、Ｊ、）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４８：６６０．１９８３　；ケネディ・アール・シー（Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｒ，Ｃ，）ら、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、２２１　：８５３．１９８３；ケネディ・アール・シーら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、　、１５９：６５５．１９８４；ケネティ・アール・シーラ、又に立上旦呈ヱ、１ユ亘：２４７．１９８４；エア１−ル・エイチ・シー（Ｅｒｔ　１．、Ｈ，Ｃ，）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８上：　２５８０．１９８４．；エアトル・エイチ・シーら、ｌ１上３」し」±虹生工、１旦旦：１７７８．１９８４；アーバイン・ジエイ（Ｕｒｂａｉ　ｎ、Ｊ’、ｌら、上止１旦ユｌ正ユニｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ジー・コーラ−（Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ）、ビー・エイ・カゼナヴ（Ｐ、Ａ、Ｃａｚｅｎａｖｅ）およびジエイ・アーバイン監修、アカデミツク・プレス・インコーホレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｉ　ｎｃ、）、　ニュー−ヨーク、１５頁、１９８４　；　７ランコツ１−−ｚム（Ｆｒａｎｃｏｔｔｅ、Ｍ、）ら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、、ＩＧＯ：　１４８５．１９８４；シ六・−ブ・エイ・エイチ（Ｓｈａｒｐｅ、Ａ、Ｈ，）ら、止工旦ＵＭｅｄ、、１６０：１１９５．１９８４；ウイタツドハーグーｘ−ｙ−ジー（Ｕｙｔａｄｈａａｇ、Ｆ、Ｇ、）ら１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１３４：１２２５．１９８５　；ゲル・ビー・ジー（Ｇｅ　Ｉ、Ｐ、Ｇ、）ら、Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｊｒｏｌ、、並：１８０１．１９８５；テネデイ・アール・シーら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３２：２２０．１９８６；アーバイン・ンエイら、Ａｎｎ。

Ｔｍｍｕｎｏｌ、　、１３３Ｄ：　１７９．１９８２　；マク方マラ・エム・ケイ（ＭｃＮａｍａｒａ、Ｍ、に、）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２６：　１３２５．１９８４、スタイン、ゲイ・イー（Ｓｔｅｉｎ、に、Ｅ、）ら、止、旦五二工Ｍｅｄ、　、１６０：　１００１．１９８４　；カオフマン・ニス・エイチ（Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｓ、Ｈ，）ら、夷　ｒｒｎｍｕｎｏ　１．．１旦４：４１２’３．１９８５；サックス・ディー・エル（Ｓａｃｋｓ、Ｄ、Ｌ、）ら、止一旦玉２工°Ｍｅｄ、、工旦旦：１］、０８．１９８２；サックス・−アイ−・エルら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１旦１−：１５１１．１９８３；ザックス・ディー・エルら、Ｊ工Ｉｍｍｕ也免上工、１旦旦：４１５５．１９８５　；およびグルジク・ジェイ・エム（Ｇｒｚｙｃｈ、Ｊ、Ｍ、）ら、Ｎａｔ−ｕｒｅ、３上旦ニア４．１９８５］、記載されたこれらのシステムは病原体に対する正常の免疫応答での調節イディオタイプの機能を（フランコツト・エムら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、、上亘旦：１４８５．１９８４　）または同類の工と１・−１の機能を利用している（アーバイン・ジェイら、Ｉｄｉｏｔ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇ　ａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ、ジー・コーラ−、ピー・エイ・カゼナヴおよびジェイ・アーバイン監修、アカデミツク・プレス・インコーホレーテッド、二ニー・ヨーク、１５頁、１９８４；シャープ・エイ・エイチら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、　、１Ｇ旦＝１１９５．１９８４）。

単クローン性抗イディオタイプ抗体は免疫感作用に安全且つ効果的に予防するものであることかでき、したが−ノで、ワクチンとして用いることかできる。精製された多クローン性抗−抗体をブタ血液から製造することによる、または抗−単クローン性抗体を生じるブタ／ブタハイブリドーマ、ブタ／霊長類ハイブリドーマまたはブタ／ヒトハイブリドーマを製造することによる抗イデイオタイプ抗体の製造は、抗イデイオタイプ抗体を提供する。ブタ／′ヒト抗イディオタイプ単りローン性抗体は高度に安全で且つ異種感作か最小のワクチンとして用いることができる。

抗イデイオタイプ抗体は、所定の抗原に対して動物を最初に免疫感作し、その抗原に対する多クローン性抗体または単クローン性抗体をそこから回収し：次に、第２の動物をぞの抗体で免疫感作し、それによ−ノて所望の抗−抗体を第２の動物から得ることおよび回収することによ−２て製造することができる。所望により、本文中ｖＩｉｉＬ！に記載した種々の種類のブタをこのように免疫感作される第１および第２の動物用に用い、例えば、ミニビックを最初に免疫感作し、続いてヨークシャー混合種のブタを免疫感作することができる。或いは、逐次的免疫感作に２種類の動物種を、例えば種々のブタの種に加えてウマ、ウシ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、またはサルの種を用いることが可能である。

ヒ）・の泊僚用ワクチンとして抗イデイオタイプ抗体を製造する場合、第２回目の免疫感作にブタの種を用いること、すなわち、ブタの抗−抗体を製造することおよびそこからブタ／′ブタ単りローン性抗体またはブタ／ヒト単りローン性抗体を製造することが好ましい、ウマまたはウシの免疫グロブリンは宿主による免疫性反応を生じることが多いので、それらを例えばヒトに投与することはあまり望ましくない、抗体は抗イデイオタイプ抗体と反応性の抗体を刺激し、それによ −ノで、続いて起こる抗原との反応を防止することができる。獣医学的ワクチン用の抗イデイオタイプ抗体を製造する場合、ブタ以外の宿主を第２の種類の動物に用いることができる。

好ましくは、抗イデイオタイプ抗体（Ａｂ２）の製造はミニビッグを抗原で免疫感作することによって行ない、例えば、抗ＣＭＶ　（Ａｂｌ）の１分に高い力価が得られる時点で、精製されたＣＭＶを回収する。１１！’臓を取出し、免疫細胞を回収する。免疫細胞とブタまたはヒトの骨髄腫細胞とを前記に記載したように融きさせる０選択されたハイブリドーマを限界稀釈法を用いてクローニングし、抗ＣＭＶであるＡｂｌ単クワクローン性抗体出する０次に、選択されたクローンをＩｇＧの製造用に増殖させる。

次に、ＩｇＧ単ク単一ローン性抗体フ呵ンスらによ−２て記載されたような精製方法を用いた後にヨークシャー混合種のブタを免疫感作するのに用いる［）詞ンス・ジー・シー（Ｆｏｎｓ、Ｇ、Ｃ，）ら１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、工旦至。

１２２５．１９８５］、或いは、他の精製方法、例えばサックスらによ−２て記載された方法（サックス・ディー・エルら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｙ、上ユ旦：４１５５．１９８５）を用いることができる。

続いて、キーホール・リンベット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）［シグマ・クミカル（Ｓｈｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、）、ミズーリ州、センｌ−・ルイス〕を文献［ミツシェル・ビー・ビーら、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　ｆｍｍｕｎｏｌｏ　、ダブリュー・ディー・フリーマン（Ｗ、Ｄ、Ｆｒｅｅｍａｎ）　、サン・フランシスコ、３０３頁、１９８０］に記載された方法で免疫原に結合させる。

効果的な免疫感作を行なうために、抗イディオタイプ単りローン性抗体をワクチン接種前にミョウバンと沈殿させることができる。ＴおよびＢ免疫の効果的な誘導物質として役立つことがでさる他の適当な方法は文献に記載されているロサンチェツ・ワイ（Ｓａｎｃｈｅｚ、Ｙ、）ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、１、ジ０　：　７２８、１９８０コ。

抗イデイオタイプ抗体の製造にブタを用いる利点は、ブタの細胞を用いて製造される抗イデイオタイプ抗体が宿主の免疫系に異種感作を生じさせることがマウスの細胞よりも少ないらしいということである。更に、ワクチンとして用いるために遺伝学的に処理されたタンパク質、すなわち、微生物性抗原の炭水化物残基を保持する能力を欠いているタンパク質とは異なって、本発明の抗イデイオタイプワクチンは炭水化物残基を有する。大部分のワクチンにおいて、このような残基は抗イデイオタイプを生成する特定の微生物に対する宿主免疫を与えるのに重要な役割を果たす、したが−）て、抗イデイオタイプは超換え体ワクチンに優る利点を有する。

本発明を下記の実施例によ−Ｊて更に例証する。特に断らない限り、実施例に記載した、または前記の説明で示した部および百分率はいずれも重量で与えられ、温度はいずれもセルシラス度で与えられる。

犬旌区上ブタ　クローン′　の−。

サイトメ力ロウイルス（ＣＭＶ）を、シ：Ｉ糖勾配遠心を用いて単離する。ウィルスを７，２−７．４のｐＨでのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中、０．１−１．０％トすｌ−ン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００に溶解させる。溶解したＣＭＶを完全フロイン）・アジュバントで１００−２００μｇ　Ｉ容量１ｍ】）に乳化さ仕る。

ＣＭＶタンパク質を免疫感作用ヨークシャー混ご種のブタの首の数箇所に皮下注射する。

１４日後にそのブタを不完全フロインドアシュパン・１・に溶解さ仕たＣＭＶタンパク質１００〜２００μｇで免疫感作する。更に１４日後に、そのブタをＰＢＳ中のＣＭＶタンパク質１００〜２００μｇで免疫感作する。ブタ抗ＣＭＶ免疫グロブリンの力価を、ＣＭＶ−Ａｂ　ＥＬＩＳＡ試験キットをベーリンブＥＬＩＳＡプロセッサー■型で用いて測定する。

次に、ブタに溶解したＣＭＶタンパク質の追加抗原量１００＝−２００μｇを与え、２分の１は皮下に、２分の１は腹腔内に投与する。追加抗原の１・−５日後にブタを層殺し、その肺臓を回収する。肺臓を適当な断片に切断し、ピンセットで細かく裂き、または滅菌篩に通して培養培地（ＲＰＭ１１６４０）中に徐々に細かくして＊ｍ細胞を回収する。肺臓細胞をＲＰＭ１１６４０で２回洗浄し、ＲＰＭ１１６４０中に細胞濃度約５Ｘ１０６細胞／′ｍ１まで再懸濁さきる。

ポリエチレンプリコール１５００　（ＢＫＨカタログ第２９５７５番）（１０ｇ）をガラスビン入れてオートクレーブ処理する。冷却後、しがしＰＥＧがまだ液体である内にＲＰＭ１１６４０を１０ｍ１加え、完全に混合する。ＰＨを僅かにアルカリ性に保持する。

ヒト骨髄腫細胞系である０Ｍ４６７２Ｂ　（１ｇＧ２に分泌、ＨＲＰＴ欠損、６ −チオグアニンで選択可能ンを融き用に用い、それが対数増殖期にある時点でその細胞系を得る。を髄腫細胞を採取し、肺臓細胞と２＝１の比率で、すなわち骨髄腫細胞２ｘｌＯ、Ｗ！ｉＡＭＡ胞ｌＸ１０８で混合する。細胞を組織培養管中で徐々にベレッ１−にする。

融合を無菌条件下３７℃の湯浴中でオイおよびヘルツエンベルブによる１０−・フルの変法を用いて行なう（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、３５１−３７２頁、サン・フランシスコ、ダブリュー・エイグ・・フリーマン′、１９８０）、ポリエチレンプリコール［ＰＥＧ１５００−アルドリッチ・ゲミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍ−ｉｃａｌｓ）コ５０％ｖ　／　ｖおよびジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ−ベーカー・クミカル・コーボレー戸ツド（Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）コ５％を含むＲＰＭＩ　１６４０　（ＩＭＤＭを用いることもできる）１ｍｌを１分間を要してＭ織培養管に滴加し、同時に２分間撹拌を続ける０次に、（約３７℃に）加温したＲＰＭ１１６４０の９ｍｌを組織培養管に５分間を要して加える。細胞懸濁液をＲＰＭ１１６４０培地を用いて１回洗浄し、１８０Ｘｇで１ｏ分間（２３℃）遠心分離する。

細胞をウシ胎児血清（３７℃加温）１５％を含む５０ｍ１のＲＰＭｌ　１６４０に徐々に懸濁させ、無菌濾過した小豚血清２％をその細胞懸濁液に加える。細胞懸濁液の一部分く１００μｌずつ）を５枚の９６ウエルミクロタイタープレー１・の各ウェルに分配する。グレートを３７℃でインキュベー）・する（ＣＯ２５％、大気空気９５％、加湿）、３口重毎に培養プレートに、ウシ胎児血清１５％およびブタ血清２％を含む（アミノプテリンを含まない）ＨＴ培地を供給する。

＃Ｉ胞に各ウェルの上澄みの２分の１を置き換えることによ−）て新鮮な培地を供給する。

培養プレートに１日４回ウシ胎児血清１５％およびブタ血清２％を倉むＨＴ培地を供給する。

約８〜１４日間インキュベーション後、ハイブリッドコロニーをＣＭＶ抗体活性について選別する。望ましい反応性を示すものを新たな２４枚のウェル組織培養プレート［ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）またはヌンク（Ｎｕｎｃ）］に移し、集密まで増殖させ（３−５日間）、続いてクローン化する。

ハイブリドーマコロニーを、融合の２週間以内に限界稀釈法を用いてクローン化し、ウェルで混合した細胞懸濁液１ｍｌを問題の抗体を含んでいる１個または数個のウェルから抽出する。連続稀釈を行な−１でウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％を含むＲＰＭ１１６４０中約１０細胞／’ｍｌを得て、１ｍｌを支持細胞１０５７′ｍ！を含む２４枚のウェルプレートの各ウェルに入れる。培養をクローンの興常について厳密に監視しく５′−７日間）、集密について試験を行なう、上澄みをＣＭＶ抗体について試験する。

次に、望ましいｖＬ＃価を示すクローンをｌ／Ｉｉ織培養ビン中で体外培養し、ＦＢ３１０％のＲＰＭ１１６４０で保持する。抗体を含んでいる上澄みを採取する。

ブタの単クローン性抗体をセファロースＣＮＢＲアフィニティーカラムを抗−ヒｌ−１ｇＧ（または抗ブタＩｇＧ）に結合させたもので精製する。この方法では、精製されたブタ単クローン性抗体（Ａｂ　１　）が溶出液中に得られる０次に、精製された単クローン性抗体（ＭｏＡｂｌ）を試験管内でまたは生体内での診断用検定で、例えばＣＭＶ感染の受動免疫陵法で用いることができる。

Ｘ施凹１ｍ　壊゛　αと　応　のブタ゛クローン　の。

ヨークシャー混合種のブタを、組換え体腫瘍壊死因子α（Ｃａｔｈｅｃｔｉｎ）である本文中以下ＴＮＦ−αのワクチン接種に付き２０ｍｇで免疫感作した。そのブタを１４日毎にＴＮＦ−αで免疫感作した。最初のワクチン接種は完全フロインドアジュバント「煮沸」失活ＴＮＦ−αを奇数回（例えば、１＋　３＋　５回目）のワクチン接種に用い、不活性ＴＮＦ−αを偶数回（例えば、２，４．６回目）のワクチン接種に用いた．多クローン性抗体価を細胞学的阻害検定法を用いて追跡し、ブタでかなりの埋置力価を示した＃３き、ＴＮＦ−αの「追加抗原重量を静脈内投与した．静脈内追加抗原にはフロイントアジュバント不在のＳＤＳ中、不活性ＴＮＦ −αを含むＴＮＦ−α２０μｇを含んでいた．最初の免疫感作の数か列後に、肺臓をブタから取出し、小片に切断し、し−グルタミンおよびペン・ストレプ（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）を含むＲＰＭ１１６４０か入っている組織培養管に入れた。

ＧＭ４６７２Ｂ細　ト　− ６週齢の小膝を放血させ、その血清を採取し、５６℃３０分間で失活させた。

次に、その血清を細胞の増殖用［支持体Ｊとして無菌−過した．０Ｍ４６７２Ｂ細胞を増殖させた０Ｍ４Ｇ７２Ｂ用「ならし」培地（６−チオグアニンを２×１０モル、し−グルタミンを１％、ウシ胎児血清を１５％およびペン・ストレグを含むＲＰＭ１１６４０）を融きの際の支持機構の一部分として採取した．４ｆｌ織培養管中のＧＭ４　６　７　２　Ｂ細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した．ＨＡＴ培地の１％溶液を、融合の際の増殖用に用いられる試薬を含むＲＰＭＯ１６４０に加えた．ＰＥＧ１０００の５０％溶液を調製し、融き前に５６℃で保持した。

牌　（　細　）の採取ブタの膵臓断片を小部分に分割し、そのキューブを徐々に細かくすることによ− １て（例えば、ピンセットで、ビンセットとはさみで、篩およびカラス製乳ばちを用いて）肺臓細胞を培地中に分散させた。細胞懸濁液を検査し、吸引排出による処理して均一で滑らかな４Ｍ濁液を調製した１次に、その細胞懸濁液を組織培養管に移した。試験管にＲＰＭ１１６４０を満たし、その細胞懸濁液を８００− −１００ｏｒｐｍで５〜８分間遠心分離した。細胞ベレットを、細胞の概算量に依存する最小量の培地に再懸濁させ、細胞計数を行な−１な、細胞計数は、細胞を＃酸およびブリリアントブルーと混合した後票徴鏡を用いて血球計算器で行な一層た、得られた細胞数は１×１０〜１．９Ｘ１０８／ｍｌであ−１た。細胞の顕微鏡的検査により死滅細胞の百分率か低いことが示された。

ブタＩＩＩＦ１１！１４ｆｌｌ胞とヒト１　腫細　との融合一定比率の、膵臓細胞毎に２個のヒト骨１８！腫細胞（ＧＭ４６７２Ｂ）または牌Ｍｉｉ４８１胞毎に１個のヒト骨髄腫細胞（ＧＭ４Ｇ７２Ｂ）を融合の際に用いた。ポリエチレングリコール１０００を細胞混合物に静かに撹拌しながらまたは細胞混合物を静かに軽く叩きながら徐・マに滴加した。ＲＰＭｌ　１６４０　（３７℃）を加え、細胞をピペットで静かに吸引排出処理した０次に、細胞をし一グルタミン、小豚血清２％、ＦＢ３１５％、ＨＡＴ１％およびペン・ストレプを含むＲＰＭ１１６４０　（３７℃）に移して細胞濃度的Ｉ×１０６７′ｍＩにした。

１合された細　の　外培養混合細胞懸濁液を６枚の９６ウエルミクロタイターグレートに体外培養した。

総数的３６．０００個の体外培養物を部分クローシ化してハイブリッドコロニーを得た。次に、ミクロタイターグレー１・をインキュベ−１・した。

ハイブリドーマクローンのためのスクリーニングプレートに約８〜１０日後に前記に記載した血清を含むＲＰＭ１１６４０を供給した。ウェルを倒立謬黴鏡を用いて選別し、若干のウェルが１６日後に生細胞（ハイブリドーマ）を含むウェル中最大約１６個までの細胞クローンでハイプリドーマ＠胞の増殖を示した。

腫瘍壊・因　−αクローンと　応性のクローン産生ｒ　のためのバイブリドーマのスクリーニングハイブリドーマクローンをエンサイムリンクドイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて選別した。ミクロタイタープレートを組換え体腫瘍壊死因子α［アムゲン（Ａｍｇｅｎ）］の２５ｎｇ／ｍ＋で被覆し、そのグレートをアルブミンで阻止した。免疫感作されたブタからの多価抗血清で中和ＴＮＦ−α活性の存在について予め試験されたものを対照として用いた。ブタ血清には抗ＴＮＦ−αの中和単位１０００７’ｍｌが含まれていた。ＥＬＩＳＡブレー１・のバックグラウンド読みは０．００２であ−ノな、多価ブタ抗ＴＮＦ−αを１：２５の稀釈度で用いて対照となる０、１０の光学濃度（０，Ｄ、）Ｈｉみを与えた０選別された２６４０＠のクローンの内、２１＠Ｊのクローンで抗ＴＮＦ−αが陽性であることが見出たされた。１５個のクローンは、ホースラディツシュペルオキシダーゼに抱合したヤギ抗−ブタＴｇＧと反応する抗体を産生じた。６ａのクローンは抗−ヒトＩｇＧと反応した抗体を産生じた。他の１５個のクローンの内の一つは、抗− ヒ）・および抗−ブタ抱合体との限定的交差反応性を示した。抗ヒｌ−ＩｇＧとのみ反応する６個のクローンの内の一つはホースラディツシュペルオキシダーゼに抱会し、そのＯ，Ｄ、読みは多価ブタ血清対照に比較してかなり高いと考えられる０、３７０であ一ンた。他のクローン・のＯ，Ｄ、読みはＯ，ＯＧＯ〜０，０９０であ−１な。

囮皇１ＪＪ１史乞〈法ブタの多価抗血清を、ＴＮＦ−αに対する中和抗体について固相免疫検定法を用いて検定を行な−１な、多価ブタ抗ＴＮＦ−αの中和力価は１ｏｏｏ単位／ｍ＋であ−）な。

１　産生ハイプリドーマ細ブダ膵臓細胞とヒト骨髄腫紹胞の融合の際に、抗体を産生ずることかできない若干のブタ／ヒト融含４１！ｌ胞が１分な増殖曲線を示すことが発見されたが、極めて活発であると思われる。この細胞種は非抗体産生ハイプリドーマと呼ばれ、体細胞ハイブリッド形成法においてヒト骨ｉｌｉ腫細胞系の代わりに融き相手として用いることかできる。

衷旌己且マウス　クローン性　と　応性のブタ　クローン性　の調製完全フロインドアジュバント３［マウス革クローン性抗体、オルトクローン（Ｏｒｔｈｏｃ　ｌｏｎｅ）ＩＫＴ３、オルト・ファーマソイティカル・コーポレーション（Ｏｒｔｈ。

Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．）、二ニー・シャーシー州、ラリタン］をヨークシャー混３種のブタの首に分割投与量で皮下（Ｓ．Ｃ．）投与する（１００μｇ〜５００μｇ）、１４日後ＧこそのブタにＯＫＴ３（１００〜５００μｇ）を皮下に再度ワクチン接種する（不完全フロインドアジュバントたＯＫＴ）、更に１４日後に、そのブタに３回目のワクチン接種を行ない、マウス免疫グロブリンＩｇＧ２ａに対する抗体価（バック・ジエイ・エフら、エニ且旦且り上立旦工立工土旦旦ーヱニ旦旦且旦亘互、上皇：１７、１９８７）をＥＬＩＳＡ法を用いて測定する．或いは、そのブタを非ＯＫＴ３で免疫感作されたマウスｒｇＧ２Ａで免疫感作することかできる．ｔ！ｉましい抗体価か得られる時点でブタを層殺し、ハイブリドーマを実施例１に記載した方法を用いて製造する。

抗マウスＩｇＧ２ａＭｏＡｂ１は、実施例１に記載のように精製後に、オルトクローンＯＫＴ３を注射した患者にその患者の免疫系がオルトクローンＯＫＴ３に対して抗体を産生ずるのを防止するための投与に用いることができる。

Ｘ癒広丘一イディオタイプ　体の調Ｊミニピックをリン酸緩Ｗｉ溶液（ＰＢＳ）中の１．１月・ンＸ１００　（０．１ −１、０％）に溶解さきたＣＭＶで免疫感作する，ＣＭＶｌｏｏ“〜２００μｇ／ｍ１を総容量１ｍｌで完全フロイントアンユバン）・と混合する．ＣＭＶを分割量で首の部分の皮下および腹腔内に投与する。

そのブタに１４日後に不完全フロインドアジュバントに溶解さ仕たＣＭＶ１００〜２００μｇで皮下に再度ワクチン・接種する．ＰＢＳに溶解さきたＣＭＶでの３回目の免疫感作を更に１４日後に皮下に行なう。

ＣＭＶ抗体をＣＭＶ　Ａｂ　ＥＬＩＳＡ試験キットを用いて測定し、そのブタを層殺し、そして放血さきる．次に、そのブタからの血清をＰＥＧ沈降法で部分的に精製する［カーター・アール・ジェイ（Ｃａｒｔｅｒ、Ｒ．Ｊ．）およびボイド・エフ・ディー（Ｂｏｙｄ，Ｎ．Ｄ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６　：　２１３、１９７９＞、ＩｇＧを、す・ンクらによ一ンてＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｙ，上ユ旦：４１５５、１９８５に記載された方法にしたが −１でプロティンＡセファロース精製法を用いて更に精製する。

ヨークシャー混倉種のブタをサックスおよびシャーによ−１て記載されたプロトコルにしたが−１て抗ＣＭＶ（Ａｂｌ）で免疫感作する［サックス・ディー・エルおよびシャー・エイ・ンエイ（Ｓｈｅｒ，Ａ．Ｊ．＞、Ｔｍｍｕｎｏｌｏ　、上ユ上：１５１１、１９８３コ．次に、ＩｇＧ　Ａｂ２をビオチニル化する（抗体に結きさせたビオチン）、Ａｂｌを、ＰＢＳツイーン（７”ｗｅｅｎｌ中１：１０、１　：　１００、１　：　１０００の稀釈度での容量１−３ｍｌでニトロセルロース紙上に点在させる．アビジンペルオキシダーゼをビオチニル化された［カルビオゲム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）からのビオチンおよびアビジンペルオキシダーゼ］抗体と稀釈度１　：　５０００で３０分間反応させる．洗浄後、ＤＡＢ基質（ＰＢＳ中１２．！５ｍｇ７２５ｍｌ　）を；色反応用に加える。

ブタを１分に免疫感作した時点でそれを層殺し、その肺臓を回収する．免疫細胞を実施例１に記載した１０トコルを用いて＠Ｈし且つ融合させる．次に、Ａｂ２の存在を示すハイブリドーマを限界稀釈によってクローンにする。次に、Ａｂ２産生クローンを増殖させる。

上澄みを採取し、ＣＭＶに対するＡｂｌを結合しているセファロースＣ　Ｎ　Ｂ　ｒアフィニティークロマトグラフィーによ−１て精製する。Ａｂ２（抗−抗ＣＭＶ）を溶離した後、Ａｂ２をゴールトンらによって記載されたＡｂ２製剤を用いてヒ１−のワクチン接種用に用いることかできる（ゴールトン・ジー・エフら、上２Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、上λヱ：　２９３０、１９８Ｇ）。

中和抗体の製造、すなわちこの場合の「抗ＣＭＶ製造」には極めて長期の（最低６０日間の）プロトコルを必要とする（ゴールトン・ジー・エフら、止工Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、１３ヱ：　２９３０．１９８６）。

太姐医旦イ・−イオタイブ　・　・′ ＨｂｓＡｇに対するヒト抗体はイディオタイプまたは最初の抗体（Ａｂｌ）として役立つ、ＩｇＧをプロティン−Ａセファロ−ヌカラム［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）］でのアフィニティータロマドグラフィーを用いて血清から単離する。ＩｇＧをグルタルアルデヒド０．１％を介してキーホール・リンビット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）（カルビオゲム、う・ジ°ヨラ、ＣＡ）５０μｇに抱合させる（ＩｇＧ５０μｇに対してＫＬＨ５０μｇ）、カミンスキらによって記載された方法を参照されたい（カミンスキ・エム・ニスら、二Ｉｍｍｕｎｏ＋、、ユ３０：１１２３．１９８６ン。

ＩｇＧ−ＫＬ）Ｉ　（２００・−５０（ｌｚｚｇ）を完全フロインドアシュパン）・と混きし、ヨークシャー混合種のブタの首の数箇所に注射する。１４日後にそのブタに不完全フロイントアシ゛ユバント中２００〜５００μｇのＩｇＧ−ＫＬＨを与え：更に１４日後にそのブタをｐＨ７，４でのＰＢＳ中のＩｇＧ−ＫＬＨで免疫感作する。

ＨｂＳＡ９　Ａｂ２（抗イデイオタイプンをＨｂＳＡ９　ＥＬＩＳＡ試験で検査した。かなりの力価が検定される時点でぞのブタを屠殺する。ハイブリドーマ（ブタ／′ヒト）を実施例１でのように調製する。

単りローン性抗−抗ＨｂＳ抗体（ＭＡｂ　２　）を、選択されたブタ７′ヒトハイブリドーマを限界稀釈法を用いてクローン化し、その単クローン性抗体をトング（Ｔｏｎｇ）らによ−Ｊて記載されたように土Ｉみがら回収することによ−Ｊて得るＣＩ−シブ・エイ・ダブリュー　（Ｔｏｎｇ、Ａ、Ｗ、）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、旦：４９８７．１９８４］、ＭＡｂ２を、ウサギ抗ＨｂＳ　Ａ、ｂに結合しているセファロースＣＮＢｒ・４Ｂゲルで精製する。精製されたＭＡｂ２はヒト用ワクチンとして有用である。

Ｘ旌己旦マウス単りローン性九体から製造された　イアイオタイブＣＭＶに対するマウス単クローン性抗体（マウスＩｇＧ）をベロサらによ−）て記載された方法用いて精製する［ベロサ（Ｐｅｒｏｓａ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ一旦上工、１ユ旦：　２２０２．１９８７．ルソー・シー（Ｒｕｓｓｏ、Ｃ，ｌら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：２６９．１９８３　；アイ・ピー・エル（Ｅｙ、Ｐ、Ｌ、）ら、工三四上」３０」ロ：ｍｉｓ旦しヱ、二：４２９．１９７８］、精製後に、マウス単クローン性抗体（マウスＭｏＡｂ１）をベロサらによ−２て記載されたように更に精製し［ペロサ・エフ（Ｐｅｒｏｓａ、Ｆ、）ら、Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、＋上皇旦：　２２０２．１９８７］、プツチインらによって記載されたようにグルタルアルデヒドと重合したＫＬＨに結合さする［ブ・ンティン・ジー（Ｂｕｔｔｉｎ、Ｇ、）ら、Ｃｕｒｒ、Ｔ免し工性上二二旦−ｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、旦１：２７．１９７８］。

このように処理されたマウスＭｏＡｂ１抗ＣＭＶ２００μｇを完全フロインドアジュバントに用いる．そのブタに、最初のワクチン接種の１４日後に、不完全フロインドアジュバントなう．更に１４日後に、そのブタにＰＢＳｉｌ街液中のマウスＭｏＡｂｌ　（２００μｇ）で再度追加抗原を行なう。

次に、ブタＭｏＡｂ２　（抗イデイオタイプ抗体、すなわち抗−抗ＣＭＶ）をＥＬＩＳＡミクロタイタープレー１−（９６ウエル）に１；１０−１；１０、０００の種々の稀釈度で半固体相として固定さ仕る．次に、マウスＭｏＡｂｌの稀釈液をインキュベーション（室温１時間ンするためにそのグレートに加える．過剰の未固定上澄みを吸引によって除去し且つ洗浄した後、ウサギ抗ーヒｌーＩｇＧーＨＲＰ抱合体（カルヒオゲム）を１　：　５００−１　：１０、０００の種々の稀釈度で加える．プレートを室温で更に６０分間インキュベートシ、Ｏ．Ｐ．Ｄ．基質［エレクｌ−口・ヌクレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒ。

Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）コを加える。

着色反応をベーリングＥＬＩＳＡグロセッサー■型での４９２ｎｍで読み取る。

かなり高い力価（すなわち、０．４００−２．２００以上）を読み取る時点で、そのブタにＭｏＡｂ２の追加抗原量２００μｇを２分の１は皮下にそして２分の１は腹腔内に分割して投与する。

膵臓を回収し、実施例１に記載のように免疫細胞（形質細胞）を単離し、そしてヒト骨髄腫細胞と融合させる６得られるハイブリドーマをオイおよびヘルツエンベルブによ−２て記載されたように限界稀釈によってクローンにする（オイ・ヴイ・ティーおよびヘルツエンベルブ・エル・エイ、ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｍｍｕｎｏｌｏ　、ビー′ビー・ミンエルおよびニス・エム・シイギ監修、３５１〜３７２頁、サン・フラッジスコ、ダブリュー・エイチ・フリーマン・カンパニー、１９８０）。

次に、ブタＭｏＡｂ２（抗イデイオタイプ、抗−抗ＣＭＶ）を選択されたハイブリドーマクローンの上澄みから、マウスＭｏＡｂ１抗ＣＭＶと結合したセファロースＣＮＢｒ４Ｂでのアフィニティータロマ）・グラフィーを用いて精製する。

溶出液は、続いてヒＩ・のワクチン接種用に用いることができる精製抗イディオタイプのブタＭｏＡｂ２である。

実施例５に記載のように、抗イデイオタイプ抗体（ＭｏＡｂ２）をマウス単クローン性抗体で免疫感作されたブタで誘発させることかできる．同様に、ブタを他の単クローン性抗体で免疫感作することかできる．例えば、油僚または診断のいずれの利用についてもワクチン接種するのに好ましいものであることかでさる任意の種間の抗原／′エビドーグからブタ／′ヒｌ−ＭｏＡｂ２を誘発さΦることができる．したが−ンで、マウス単クローン性抗体ＭｏＡｂｌをブタ／′ヒｌ□ ＭｏＡｂ２に翻訳することかでき、マウス単クローン性抗体ＭｏＡｂ２をブタ／ ′ヒｌ〜ＭｏＡｂ１に翻訳することができる。

或いは、マウス単クロー〉性抗体ＭｏＡｂｌは、別の種の動物、例えばウサギ（または同系マウス）をマウス単クローン性ＭｏＡｂｌで免疫感作することによ− ２てブタ／ヒト単クローン性ＭｏＡｂｌに翻訳することができる．そして、ウサギは抗イデイオタイプとしてウサギ抗体を産生ずることか可能である（ウサギＡｂ２）、したか−ノで、ウサギＡｂ２抗イデづオタイグ抗体は、ブタ抗体（ブタＡｂｌ）、ｔたはブタ／ヒト単りローン性抗体（ブタ／′ヒＩ−ＭｏＡｂｌ）を誘発することかできることのなめに用いることができる．この方法では、ヒトの泊僚に容易に用いることができない任意のブタ単クローン性抗体ＭｏＡｂ１を、マウス抗体、ブタＡｂｌに、またはブタ／′ヒｌ−ＭｏＡｂｌに翻訳することができる。

同様の翻訳機構を、マウス単クローン性抗体ＭｏＡｂ２をブタ抗体、ブタＡｂ２またはブタ／′ヒｌ−ＭｏＡｂ２に翻訳する場きに用いることができる．マウス単クローン性ＭｏＡｂ２は別の動物（同系マウス、ウサギまたは任意の他の動物〉の免疫感作に用いられてマウスＭｏＡｂｌまたはウサギＡｂｌを誘発さ亡、次に、それをブタの免疫感作に用いてブタＡｂ２またはブタ／′ヒトＭｏＡｂ２を誘発させる。

他の動物の単クローン性ＭｏＡｂ１またはＭｏＡｂ２をブタＡｂ２におよび７′ 、またはブタ／ヒトＭｏＡｂ１に翻訳することができるということを理解する必要かあるであろう。

更に、き成ベプグード若しくは組換え体ペプチドまたはタンパク質は、マウスを免疫感作し、単クローン性ＭｏＡｂｌを得て、そしてブタ／ヒトＭｏＡｂ２の抗体を誘発させることによーノてブタＡｂ２にまたはブタ／ヒｌ−ＭｏＡｂ２に翻訳することができるということか理解される．ブタの免疫感作用にマウス単クローン性ＭｏＡｂｌを誘発さ仕る代わりに、ウサギ（または別の種の動物）を免疫感作してＡｂｌヒト抗体発させる、それを１りに再度免疫感作してブタＡｂ２またはブタ７′ヒｌ−ＭｏＡｂ２を与えることかできる。

曳等惣当業者は本文中に記載した発明の具体的な態様に対する多くの均等物を通常の実験たけで認識しまたは確認することが可能である．これらの均等物は下記の特許請求の範囲に包含されることを意図するものである。

国際調査報告 −ｖ−１１１醪ム−”馴−ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３２４０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ブタに抗原を用いて、その抗原と反応性のブタ抗体が産生される条件下で免疫感作し；（ｂ）そのブタから血液を採取することによって抗原と反応性のブタ抗体を含んでいる細胞を採取し；そして（ｃ）抗体を含んでいるブタ血清を他の血液成分から分離することを含んで成る、所定の抗原と反応性のブタ抗体を製造する方法。
２．抗原がウイルス、細菌、腫瘍抗原、Ｔ３リンパ球またはマウス単クローン性抗体である、請求項１に記載の方法。
３．抗原がサイトメガロウイルスまたは腫瘍壊死因子−αである、請求項１に記載の方法。
４．ブタをマウス単クローン性抗体で免疫感作して、各種のマウス単クローン性抗体と反応性のブタでブタ抗体を製造する、請求項１に記載の方法。
５．治療に効果的な投与量のブタ抗体を患者に投与することを含んで成る、疾患を治療する受動免疫療法。
６．治療に効果的な投与量のブタ抗−マウス抗体を患者に投与することを含んで成る、疾患を治療する受動免疫療法。
７．（ａ）ブタに抗原を用いて、その抗原と反応性のブタ抗体が産生される条件下で免疫感作し；（ｂ）そのブタの脾臓から抗体産生細胞を回収し；（ｃ）ブタ抗体産生細胞と不滅化細胞とを融合が生じる条件下で融合し；（ｄ）融合されずに残留するブタ抗体産生細胞および不滅化細胞を除去し；そして（ｅ）所定の抗原と反応性の単クローン住抗体を産生することが可能なハイブリドーマを選択することを含んで成る、所定の抗原と反応性の抗体を産生することが可能なハイブリドーマを生成する方法。
８．不滅化細胞がブタ、ヒトまたは他の霊長類からの骨髄腫細胞である、請求項７に記載の方法。
９．ブタをマウス単クローン性抗体で免疫感作して各種のマウス単クローン性抗体と反応性のブタで抗体を製造する、請求項７に記載の方法。
１０．ブタ抗体産生細胞が形質細胞であり、不滅化細胞がヒト骨髄腫細胞である、請求項７に記載の方法。
１１．請求項６に記載の方法によって製造されるハイブリドーマ。
１２．ブタ抗体産生細胞と不滅化細胞とを触合させることによって生成されるハイブリドーマ。
１３．（ａ）ブタに抗原を用いて、その抗原と反応性のブタ抗体が産生される条件下で免疫感作し；（ｂ）そのブタの脾臓からブタ抗体産生細胞を回収し；（ｃ）ブタ抗体産生細胞と不滅化細胞とを融合させ；（ｄ）融合されずに残留するブタ抗体産生細胞および不滅化細胞を除去し；（ｅ）所望の単クローン性抗体を産生することが可能な選択されたハイブリドーマを、抗原と反応性の単クローン性抗体が産生される条件下でクローニングし；そして（ｆ）単クローン性抗体をハイブリドーマ上澄みから回収することを含んで成る、所定の抗原と反応性の単クローン性抗体を製造する方法。
１４．ブタをマウス単クローン住抗体で免疫感作して各種のマウス単クローン性抗体と反応性のブタで抗体を製造する、請求項１３に記載の方法。
１５．請求項１３に記載の方法によって製造される単クローン住抗体。
１６．ブタ抗体産生細胞によって産生される単クローン性抗体。
１７．治療に効果的な投与量のブタ単クローン性抗体を患者に投与することを含んで成る、疾患を治療する受動免疫療法。
１８．（ａ）第１の動物に抗原を用いて、その抗原と反応性の抗体が産生される条件下で免疫感作し、（ｂ）第１の動物から血液を採取することによって抗原と反応性の抗体を採取し、（ｃ）抗体を血液から分離し、（ｄ）第２の動物にその抗体を用いて抗−抗体が産生される条件下で免疫感作し、そして（ｅ）抗−抗体を第２の動物の血液から回収することを含んで成り、第１の動物または第２の動物の少なくとも一方がブタである、所定の抗原に対する抗イデイオタイプ抗体を製造する方法。
１９．第１の動物がウマ、ウシ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、サルまたは第１の種類のブタであり、第２の動物が第２の種類のブタである、請求項１８に記載の方法。
２０．第１の動物が第１の種類のブタであり、第２の動物が第２の種類のブタである、請求項１８に記載の方法。
２１．抗−抗体が、（ｆ）抗−抗体を有する第２の動物から脾臓細胞を回収し；（ｇ）脾臓細胞を不滅化細胞と融合させることによってハイブリドーマを生成し；（ｈ）融合されずに残留する脾臓細胞および不滅化細胞を除去し；（ｉ）抗イデイオタイプ抗体を産生することが可能なハイブリドーマをクローニングし；そして（ｊ）単クローン性抗体をハイブリドーマ上澄みから回収することによって段階（ｅ）で回収される単クローン性抗体である、請求項１８に記載の方法。
２２．特定の抗原によって引き起こされる疾患に苦しむ患者に、治療に効果的な投与量のブタ抗イデイオタイプ抗体を含むワクチンを投与することを含んで成る、該患者にワクチン接種する方法。
２３．所定の抗原に対するマウス単クローン性抗体を患者に投与することを含んで成る患者の治療処置のための方法において、該患者にブク抗−マウス抗体を追加投与することから成る方法。
２４．患者の治療処置のための方法において、疾患に関係した抗原と反応性のブタ抗体を投与することから成る方法。
２５．ブタ抗原結合部位およびヒト定常領域を含んで成るキメラ単クローン性抗体。
２６．腫瘍壊死因子−αに媒介される疾患に苦しむ個体において抗体が種瘍壊死因子−αの作用を中和するかまたは最小限にするように、腫瘍壊死因−αと反応性のブタ単クローン性抗体の治療に効果的な投与量をその個体に投与することから成る、該個体の治療方法。
２７．サイトメガロウイルスに媒介される疾患に苦しむ個体において抗体がサイトメガロウイルスの作用を中和するかまたは最小限にするように、サイトメガロウイルスと反応性のブタ単クローン性抗体の治療に効果的な投与量をその個体に投与することを含んで成る、該個体の治療方法。
２８．不滅化細胞に融合したブタの非抗体産生細胞から成る、抗体産生細胞との融合相手として有用な非抗体産生ハイブリドーマ細胞。