DK162056B - Anti-tumor, anti-idiotype-antistof til induktion af immunologisk respons - Google Patents

Description

DK 162056 B

Den foreliggende opfindelse angår et anti-idiotype-antistof, der kan anvendes til induktion af et immunologisk respons mod antigener, især tumorer, samt et præparat, der indeholder et sådant antistof.

Sekvensen af aminosyrer i de variable regioner af både tunge (Vg) og 5 lette (Vl) kæder af immunoglobulin (Ig) danner en konformation i antigen-bindingsstedet (dvs. parotopen), hvilket tillader vekselvirkning mellem dette antistof og et specifikt antigen. Injektion af Ig i et heterologt værtsdyr vil give anledning til anti-xenotypiske (specifik for arter), anti-isotypiske (specifik for Ig-klassen) og anti-10 idiotypiske (specifik for det variable antistofområde) antistoffer.

Der kan forekomme to funktionelle klasser af anti-idiotypiske antistoffer, hvoraf den ene reagerer med parotopen, og den anden reagerer med Vjj- og/eller V^-strukturen (strukturdeterminanter). Jfr. generelt Geha, N. Engl. J. Med. 305, 1981, s. 25-28; Jeme, Ann. Immunol.

15 (Paris) 125C, 1974, s. 373-389.

I ét aspekt angår den foreliggende opfindelse et anti-idiotype-antistof, som identificerer en epitop, der er parotopen af et anti-tumor-antistof.

Ved administration af dette anti-idiotype-antistof stimuleres produk-20 tionen af anti-(anti-idiotype)-antistof hos en patient, hvilket antistof identificerer en epitop på en tumorcelle.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan anti-idiotype-antistoffet være polyklonalt, idet en epitop, som identificeres af dette anti-idiotype-antistof, er parotopen af et anti-tumor-antistof, og idet anti-25 idiotype-antistoffet i det væsentlige er fri for anti-isotypiske antistoffer.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan anti-idiotype-antistoffet også være monoklonalt. Det monoklonale anti-idiotype-antistof kan fx fås fra en udødelig B-lymfocyt, som producerer et anti-idiotype-antistof, 30 idet en epitop, som identificeres af dette anti-idiotype-antistof, er parotopen af et anti-tumor-antistof. Det monoklonale antistof er i det væsentlige fri for andre antistoffer.

DK 162056 B

2

Hensigtsmæssige tumorer er faste tumorer såsom faste gastrointestina-le tumorer. Ved administration af anti-idiotype-antistoffet ifølge den foreliggende opfindelse stimuleres patienten, især et pattedyr, mere specielt et menneske, til at producere anti-(anti-idiotype)-5 antistof, som identificerer en epitop på en tumorcelle.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en unik indgangsvinkel til cancerterapi. Traditionel tumorterapi har medført administration af anti-tumor-antistoffer (dvs. antistoffer, som identificerer en epitop på en fast tumorcelle) til patienter for at ødelægge tumoren. Det har 10 nu imidlertid vist sig, at der kan induceres et immunologisk respons mod en patients egne tumorer ved hjælp af et antistof, som er anti-idiotypisk mod et antistof, som genkender et tumor-antigen. Induktionen af dette immunologiske respons er nyttigt som en terapeutisk og forebyggende behandling.

15 Uden at være begrænset til nogen speciel teori med hensyn til udøvelsen antages det, at det iagttagne immunologiske respons, som opnås ved administration af anti-idiotype-antistoffet ifølge den foreliggende opfindelse, skyldes en vekselvirkning mellem anti-idiotype-antistofmolekylerne og den humane patients immunsystem. Det idiotypi-20 ske (dvs. variable) område af anti-idiotype-antistofinolekylet indeholder antigendeterminanter (dvs. epitoper), der af patienten betragtes som et antigen. Dette inducerer produktion af anti-(anti-idiotype)-antistoffer af patienten. Inden for dette sæt af anti-(anti-idiotype) -antistoffer findes sådanne, som er direkte komplementære til 25 parotopen af anti-idiotype-antistoffet. Det antages endvidere, at parotopen af anti-idiotype-antistoffet danner et "indre" billede af den ved hjælp af idiotype-antistoffet identificerede (dvs. selektivt bundne) tumorcelle, og derfor vil anti-(anti-idiotype)-antistofferne også binde tumor-antigenet. Det her omhandlede anti-idiotype-antistof 30 inducerer faktisk et immunologisk respons mod tumoren ved at tilvejebringe et antigen (parotopen af anti-idiotype-antistof), som i det væsentlige ikke kan skelnes fra tumor-antigenet, mod en del af patientens resulterende antistoffer.

Den ovenfor beskrevne administration af anti-idiotype-antistoffet 35 ifølge opfindelsen udgør overraskende en effektiv metode til regule-

DK 162056B

3 ring af tumorvækst. Endvidere frembyder den adskillige fordele i forhold til de mere traditionelle fremgangsmåder. For det første behøver man kun at administrere en meget mindre mængde fremmed antistof til en patient. For det andet er patientens anti-idiotype-respons gun-5 stigt og ikke skadeligt for den påtænkte virkning. For det tredje er patientens egne antistoffer anti-tumor-antistofferne, hvorved nødvendigheden af gentagen administration af exogene anti-tumor-antistoffer elimineres. Andre fordele er åbenlyse for fagfolk.

Idiotypen af et antistof defineres af individuelt forskellige anti-10 gendeterminanter i det variable eller idiotypiske område af antistof-molekylet. En del af disse idiotypiske determinanter vil være på eller tæt forbundet med antistoffets parotop, medens andre vil være i strukturen af det variable område. Selv om hvert antistof har sin egen idiotype, henvises der til specielle antistoffer nedenfor ved 15 hjælp af følgende udtryk. "Idiotype-antistof" eller "Id Ab" refererer til et anti-tumor-antistof (dvs. den epitop, som identificeres af idiotype-antistoffet, er på en celle af en tumor). "Anti-idiotype-antistof" eller "anti-Id Ab" refererer til et antistof, som identificerer en epitop i det variable område af et idiotype-antistof. En del 20 af sådanne antistoffer identificerer en epitop, som er parotopen af idiotype-antistoffet, hvorved der tilvejebringes et "indre" billede af den epitop, som identificeres af idiotype-antistoffet på tumorcellen. "Anti-(anti-idiotype)-antistof" eller "anti-(anti-Id) Ab” er et antistof, som identificerer en epitop i det variable område af anti-25 idiotype-antistoffet. En del af anti-(anti-idiotype)-antistofferne identificerer en epitop, som svarer til 1) parotopen af anti-idiotype-antistoffet, og 2) en epitop på en tumorcelle.

Den foreliggende opfindelse angår i et andet aspekt et præparat til induktion af et immunologisk respons mod en tumor, hvilket præparat 30 omfatter et anti-idiotype-antistof som defineret ovenfor sammen med en hvilken som helst fysiologisk egnet bærer (fx sterilt, pyrogenfrit fysiologisk saltvand). Formuleringen af præparatet er kendt inden for teknikken. Valget af bærer er ikke kritisk, og antistoffet kan formuleres på en hvilken som helst måde, som medfører, at antistoffet ind-35 føres i kredsløbssystemet (fx ved intravenøs, intramuskulær eller subcutan inj ektion).

DK 162056B

4 Værten kan være et hvilket som helst pattedyr, mest almindeligt et menneske. Den mængde antistof, som administreres til en vært, kan variere i vidt omfang og er fx afhængig af det specifikke antistof, som anvendes, og den inokulerede patient. Det er blot nødvendigt, at 5 der administreres tilstrækkeligt anti-idiotype-antistof til at stimulere produktionen af anti-(anti-idiotype)-antistoffer af patientens immunsystem. Den mængde antistof, der anvendes, behøver imidlertid ikke være særlig stor, fordi kun meget små mængder er nødvendige for at inducere et immunologisk respons. I mange tilfælde er en antistof-10 dosis inden for området fra nogle få mikrogram til nogle få milligram tilstrækkelig (fx fra ca. 50-200 /ig til ca. 1-5 mg). Bestemmelsen af en passende dosis ligger inden for den kendte teknik.

Præparatet ifølge opfindelsen administreres fortrinsvis til en human patient for at fremkalde et immunologisk respons mod en tumor, fx en 15 fast tumor (dvs. en fast masse af ondartede celler, som fx produceres af carcinomaer, sarcomaer, melanomaer, etc., i modsætning til spredte, cirkulerende ondartede celler såsom leukæmi). Tumoren er især en gastrointestinal tumor. Som defineret ovenfor binder en underklasse af anti-idiotype-antistoffet selektivt (dvs. identificerer) til paro-20 topen af et anti-tumor-antistof (idiotype-antistof). Et sådant antistof genkender en epitop, som er parotopen af det tilsvarende idioty-pe-antistof. Anti-idiotype-antistoffer, som frembyder indre billeder af tumoren, kan skelnes fra anti-idiotype-antistoffer, som genkender strukturdeterminanter i det variable område af idiotype-antistoffet, 25 ved en hvilken som helst af flere forskellige fremgangsmåder. Én fremgangsmåde til identificering af de ønskede anti-idiotype-antistoffer er et kompetitivt bindingsassay mellem tumor-antigenet (eller haptenen, hvis den er tilgængelig), idiotype-antistoffet og antiidiotype-antistoffet. Hvis antigenet blokerer bindingen af anti-idio-30 type-antistoffet til idiotype-antistoffet, er den epitop, som identificeres af anti-idiotype-antistoffet, tæt forbundet med idiotype-antistoffets parotop. En anden test er at bestemme, om antisera mod anti-idiotype-antistoffet også er anti-tumor. Disse og andre fremgangsmåder til identificering af det hensigtsmæssige anti-idiotype-35 antistof ligger inden for fagområdet. I det præparat, som administreres til en vært, er inkorporering af anti-idiotype-antistoffer, som

DK 162056 B

5 er rettet mod strukturdeterminanter, sammen med den underklasse, som er rettet mod idiotype-antistoffets parotop, acceptabel. Det er blot nødvendigt, at præparatet indeholder den underklasse, som er rettet mod idiotype-antistoffets parotop.

5 Det anvendte anti-idiotype-antistof kan være homologt eller heterologt over for værten. Det foretrukne antistof for et menneske er imidlertid et humant antistof for at minimere det immunologiske respons mellem det konstante område og antistofmolekylet. Eftersom der ved den foreliggende opfindelse kræves relativt små doser af anti-10 idiotype-antistof, kan der imidlertid anvendes heterologt antistof (fx mus, rotte, ged, kanin, etc.). I fraværelse af nogen alvorlig reaktion mod heterologt anti-idiotype-antistof, kan et sådant antistof imidlertid være foretrukket, da det er lettere og billigere at fremstille. Der kan endvidere anvendes polyklonale anti-idiotype-15 antistoffer samt monoklonale anti-idiotype-antistoffer.

Polyklonalt anti-idiotype-antistof kan fremstilles ved sædvanlige fremgangsmåder inden for teknikken fx ved administration til en heterolog vært af et anti-tumor-antistof, hvorefter det ønskede antiidiotype-antis tof isoleres og oprenses fra serumet fra denne vært.

20 Således kan polyklonalt anti-Id Ab fremstilles ved at immunisere et dyr med et monoklonalt anti-tumor-antistof (dvs. Id Ab). Det immuniserede dyr vil producere anti-Id Ab. En underklasse af dette anti-idiotype-antistof i antisera vil identificere en epitop, som er paro-topen af anti-tumor-antistoffet. Antisera, som er udvundet fra dyret, 25 kan oprenses, fx ved sekventiel absorbtion med 1) et immobiliseret antistof af den samme isotype som det monoklonale Id Ab, men forskellig idiotype, for at fjerne anti-isotypiske antistoffer fra antisera, og 2) det immobiliserede monoklonale Id Ab for at fjerne anti-Id Ab, hvoraf en underklasse vil frembyde indre billeder af tumor-antigenet.

30 Anti-Id Ab kan derefter elueres fra det bundne monoklonale anti-tumor-antistof til tilvejebringelse af en opløsning, som i det væsentlige er fri for anti-isotype-antistoffer. Denne opløsning kan derefter testes for tilstedeværelsen af anti-Id Ab, som identificerer parotopen af Id Ab.

DK 162056B

6

Monoklonale anti-idiotype-antistoffer, som i det væsentlige er fri for andre antistoffer, kan isoleres fra supernatanten af i det væsentlige rene kulturer af udødelige B-lymfocytter. Udtrykket "udødelig B-lymfocyt" omfatter en hvilken som helst relativt stabil, konti-5 nuerligt antistofproducerende celle, som kan opretholdes i en kultur i adskillige måneder (fortrinsvis på ubestemt tid), såsom hybridomer (somatiske cellehybrider af normale og ondartede lymfocytter) og normale lymfocytter, som er transformeret af virus (fx Epstein-Barr-vi-rus) eller onkogent DNA. Produktionen af udødelige B-lymfocytter ud 10 fra normale B-lymfocytter, som producerer anti-idiotype-antistof, er kendt inden for teknikken, jfr. fx Monoclonal Antibodies (R.H. Ken-nett, T.J. McKearn & K.B. Bechtol 1980); M. Schreier et al., Hybrido-ma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory (1980); Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (G.J. Hammerling, U. Hammerling & J.F.

15 Kearney 1981); Kozbor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1982, s. 6651-6655; Jonak et al., Hybridoma 2, 1983, s. 124; Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines (R.H. Kennett, K.B. Bechtol & T.J. McKearn 1983); Kozbor et al., Immunology Today 4, 1983, s.

72-79.

20 Normale B-lymfocytter, som producerer anti-id Ab, og som er egnede til produktion af en udødelig B-lymfocyt, kan tilvejebringes ved forskellige fremgangsmåder, som er kendte inden for teknikken. Fx kan et dyr såsom en rotte eller mus immuniseres med et monoklonalt antitumor-antistof, og B-lymfocytter, som producerer anti-ld Ab, udvindes· 25 fra dyrets milt. Humane B-lymfocytter, der producerer anti-ld Ab, kan fås ved at immunisere en patient med monoklonalt anti-tumor-antistof, udvinde periferale blodlymfocyter fra patienten og derefter in vitro inducere vækst af B-lymfocytter, som producerer anti-ld Ab, ved at stimulere kulturen med det monoklonale anti-tumor-antistof, jfr. fx 30 DeFreites et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1982, s.

6646-6650. De animalske eller humane B-lymfocytter, som producerer anti-ld Ab, kan således udvindes og gøres udødelige af fagfolk. Det er naturligvis klart, at de lymfocyter, som producerer anti-ld Ab, som frembyder indre billeder af tumorcelleantigenet, bør skelnes fra 35 de B-lymfocytter, som producerer anti-ld Ab, som er rettet mod strukturdeterminanter i det idiotypiske område.

DK 162056B

7

Anti-idiotype-antistoffet ifølge opfindelsen anvendt mod tumorer kan også anvendes i forbindelse med andre fremgangsmåder til inducering af immunologiske responser mod tumorer såsom anvendelsen af virale onkolysatvacciner, hvilket er beskrevet i US-patentskrift nr.

5 4.108.983.

EKSEMPEL

Monoklonale idiotype-antistoffer I følgende forsøg blev der anvendt de monoklonale muse-antistoffer 10 17-1A, 0^2032 og C4I472, som binder til humane gastrointestinale cancerceller, og som er beskrevet af Herlyn et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 76, 1979, s. 1438-1442, og Koprowski, "Monoclonal Antibodies in vivo” i Monoclonal Antibodies in Cancer’, Proceedings of the Fourth Armand Hammer Cancer Symposium (B. Boss, R. Langman, I. Trow-15 bridge & Dulbecco 1983). Det monoklonale antistof (MAb) C42032 har specificitet over for colorektal carcinoma(CRC)-forbundne antigen(er) med Mr 180, 160, 50 og 40 K. MAb C4I472 (IgG2a) har specificitet over for det CRC-forbundne antigen Mr 50 K. Der blev også anvendt MAb A5C3 mod hepatitisvirus, som er beskrevet af Wands et al., Proc. Hati.

20 Acad. Sci. U.S.A. 78, 1981, s. 1214-1218. MAB's 17-1A (IgG2A, κ let kæde) og C42032 (IgG2a κ let kæde) blev oprenset fra ascites, der var opnået fra hybridoma-bærende mus, ved affinitetschromatografi på protein A-Sepharose® søjle (Pharmacia, Piscataway, N.J.) som beskrevet af Ey et al., Immunochemistry 15, 1978, s. 429-436.

25 Patienter

Alle patienter havde metastatisk eller tilbagevendende gastrointestinalt adenocarcinoma og blev systematisk injiceret med én dosis af et renset sterilt, pyrogenfrit præparat af MAb 17-1A, som var koncentre-30 ret fra ascitesvæske fra Balb/c-mus, ved den fremgangsmåde som er beskrevet af Sears et al., Lancet, 1982, s. 762-765. Ud af ni patienter, som modtog 192 mg eller mindre MAb 17-1A, udviklede syv anti-

DK 162056B

8 muse-globulin-antistoffer. Ud af de tyve patienter, som modtog 200-1000 mg monoklonalt antistof, udviklede tre anti-muse-globulin-antistoffer. Sera fra tre patienter i den første gruppe, som udviklede anti-muse-globulinmolekyler (patienter nr. 07, 08 og 09), og fra 5 to patienter i den anden gruppe (nr. 14 og 23) blev enten screenet eller forarbejdet til isolering af anti-idiotype-antistoffer. Sera, som blev anvendt til isolering af anti-idiotype-antistoffer fra patienterne nr. 07, 08 og 23, blev udvundet på det tidspunkt, da alle tre havde den højeste koncentration af anti-muse-globulin-antistof-10 fer. Patient nr. 08 modtog endnu en injektion af 130 mg monoklonalt antistof 20 måneder efter den første injektion, og serum, der var vundet efter denne anden injektion, blev anvendt i en screeningstest for tilstedeværelsen af anti-idiotype-antistof.

Fremstilling af polyklonale anti-idiotype-antistoffer 15 _

Hvide New Zealand-kaniner blev injiceret subcutant på flere steder med 300 /ig renset Måb 17-1A, som var emulgeret i Freunds komplette adjuvans, og fik 30 dage senere en intramuskulær boosterinjektion med 100 μ% monoklonalt antistof. Sera blev opsamlet på dag 10 af det se-20 kundære respons.

Antisera blev absorberet på immobiliseret MAb 0^2032 og MAb 17-1A. De rensede monoklonale antistoffer (30 mg hver) blev koblet til 2 ml

Affi-gel 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien). Antisera blev derefter sekventielt absorberet på MAb 0^2032 og MAb 17-1A immu- 25 noabsorbenter for at fjerne henholdsvis anti-isotypiske og anti-idio-

typiske antistoffer. Absorberede antistoffer blev elueret med 0,1M

glycinpuffer (pH 2,8), øjeblikkeligt neutraliseret med phosphatpuf- fer, dialyseret mod phosphatpufret saltvand og proteinkvantificeret 1 7 ved absorbans ved 280 nm (E °280 = 14).

30 Antisera, der var vundet fra patienter efter én injektion af MAb 17-1A, blev også udvundet og renset som beskrevet ovenfor. Sera fra patient nr. 23, som modtog 750 mg MAb 17-1A, og fra patienterne nr. 08 og 07, som modtog henholdsvis 133 mg og 125 mg MAb 17-1A, blev udvundet på forskellige tidspunkter efter den første injektion af anti

DK 162056 B

9 stof. De prøver, som ved radio immunoassay-analyse viste sig at indeholde antimurint IgG-antistof, blev sekventielt absorberet på MAb C42032- og MAb 17-lA-immunoabsorbenter for at fjerne henholdsvis anti-isotypiske og anti-idiotypiske antistoffer som beskrevet oven- 5 for. Det anti-idiotype-antistof, som blev isoleret fra sera, viste 125 sig ved binding til I-mærkede anti-humane F(ab')2-fragmenter at være humane immuno globul iner. Udbyttet af anti-idiotypeprotein fra serumprøverne varierede: 13 pg/ml fra nr. 08, 8,9 pg/ml fra nr. 07, og 43 /xg/ml fra nr. 23. Den største mængde blev vundet fra serum fra 10 nr. 23, som også havde det højeste niveau af anti-muse-globulin-anti-stoffer.

Screening af sera for tilstedeværelsen af anti-idiotype-antistoffer

For at acreene serumprøver for tilstedeværelsen af anti-idiotype- 15 antistof blev der udført et kompetitivt assay under anvendelse af kanin-anti-idiotype-antistoffet og fire humane sera, som var præin-125 kuberet med I-mærket MAb 17-1A.

Polystyrenperler med en størrelse på 6,35 mm (Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois) blev vasket tre gange med 95% ethynol. De 20 lufttørrede perler blev inkuberet med en fortynding af enten kanineller humant anti-idiotype-antistof i 0,02M natriumtetraborat, pH 8,2. Efter inkubation natten over ved 4eC under forsigtig omrystning blev perlerne vasket tre gange med phosphatpufret saltopløsning og derefter inkuberet i mindst 3 timer ved stuetemperatur med phosphat- 25 pufret saltopløsning indeholdende 2% bovint serumalbumin og 0,04% 125

NaNj. Perlerne blev derefter udsat for I-mærket MAb 17-1A som den reference-idiotype, som var blevet præinkuberet med den potentielle kilde til humant anti-idiotype-antistof, dvs. humane sera blev fortyndet til en koncentration på 25% i phosphatpufret saltopløsning ++ ++ 30 uden Ca og Mg og suppleret med 2% bovint serumalbumin og 0,04%

NaNj. Efter en yderligere inkubation natten over blev perlerne vasket, og den bundne radioaktivitet blev målt i en gamma-tæller.

Tre af de sera, der var vundet efter én injektion med monoklonalt antistof (nr. 23, 09 og 14), viste inhibering af binding af MAb 17-

DK 162056 B

10 1A, som var højere end den fra præ-monoklonalt antistof-injektions-prøver. Bindingsinhiberingsværdier, der blev opnået for post-monoklo-nalt antis tof serum fra patient nr. 14, var lave i sammenligning med de andre to sera, men højere end værdierne for det præ-monoklonalt 5 antistof-udsatte serum fra den samme patient. Inhiberingsværdier for serum, der var opnået fra patient nr. 08, 7 dage efter at han modtog endnu en injektion af monoklonalt antistof, var allerede høje.

Kompetitivt assay for detektering af anti-idiotype 10 Der blev udført et kompetitivt assay på en måde i lighed med det, som er beskrevet ovenfor, for at bestemme bindingen af isolerede anti-idiotype-antistoffer til MAb 17-1A samt til de monoklonale antistoffer C42032, C41472 og A5C3.

Resultaterne viste, at bindingen af anti-idiotype-antis toffer fra tre 15 sera (nr. 08, 07 og 23) til MAb 17-1A var signifikant højere end til de tre andre monoklonale antistoffer, hvoraf to (C42032 og C41472) også detekterer antigensteder på colorektale carcinomaceller. Disse steder er imidlertid forskellige fra de steder, som genkendes af MAb 17-lA. Immunoglobulin isoleret fra sera fra alle tre patienter før 20 udsættelse for MAb 17-1A blev koncentreret til ca. 2,5 μg/ml og koblet til polystyrenperler. Disse præparater bandt imidlertid ikke nogen af de testede monoklonale antistoffer, hvilket indikerer fraværelse af anti-idiotype-antistoffer i serumet før udsættelse.

Krydsreaktivitet mellem humane anti-idiotype-antistoffer 25 _

Der blev udført et kompetitivt assay for at bestemme, om der var krydsreaktivitet blandt de humane anti-idiotype-sera.

Resultaterne fra det kompetitive assay, som er vist nedenfor, viser signifikant krydsreaktivitet mellem anti-idiotype-sera fra patienter-30 ne nr. 07 og 23 og lidt mindre (men stadig signifikant) krydsreaktivitet mellem anti-idiotype-sera fra patienterne nr. 08 og 23. En lignende krydsreaktivitet blev fundet mellem anti-idiotype-serå fra pa-

DK 162056 B

11 tient nr. 07 og post-monoklonalt antistof senam, der var opnået fra patient nr. 08 (resultater ikke vist). Disse resultater indikerer, at de anti-idiotype-antistoffer, der produceres af forskellige patienter, er rettet mod det samme antigensted.

5 _ Første Andet anti- cmp % inhibering af antistof stofserum fra: Bundet 17-1A MAb-binding

Ingen 4297 10 anti-Id 23 07 præ 4595 0 post 1231 71 08 præ 4097 5 post 2585 40 15 Epitop detekteret af anti-idiotype-antistof

Haptenirihibering af bindingen af humane anti-idiotype-antistoffer til MAb 17-1A blev udført for at vise, at anti-idiotype-antistofferne var rettet mod parotopen af idiotype-antistoffet.

20 En 3M KCl-ekstrakt af SW 1222-celler, en cellelinje, som er afledt af colorektal cancer, blev fremstillet som beskrevet af Herlyn et al., J. Clin. Immunol. 2, 1982, s. 135-140. Præparatet bandt MAb 17-lA, hvilket indikerer, at materialet indeholdt antigenet i dets opløseli-125 ge form. I-Mærkede MAb 17-1A blev inkuberet med CRC-celleekstrak- 25 ten og med en 3M KCl-ekstrakt af melanomaceller, som ikke binder MAb 17-lA. Antistof-antigenblandingerne blev derefter sat til perler, som var overtrukket med anti-idiotype-antistof, som var opnået fra patient nr. 23, og bindingen blev sammenlignet med bindingen af det radiomærkede monoklonale antistof alene. Disse forsøg blev udført med 30 ikke-mættende mængder af ioderet monoklonalt antistof for at detektere ændringer i bindingen med små mængder af konkurrerende haptener.

Til kontrolformål blev det ioderede MAb 17-lA blandet med en ekstrakt fra melanomaceller, hvorom det var kendt, at de ikke bandt MAb 17-lA.

DK 162056B

12 CRC-Celleekstrakterne i koncentrationer på 0,1 eller 0,5 mg/ml viste sig at inhibere bindingen af anti-idiotype-antistoffet fra patient nr. 23 til ioderet MAb 17-1A med henholdsvis 39% og 68%. Ekstrakten fra melanomaceller i koncentrationer op til 0,5 mg/ml påvirkede ikke 5 i signifikant grad bindingen af det monoklonale antistof.

Denne hapteninhibering af bindingsreaktionen indikerer tilstedeværelsen af et "indre billede" af CRC-epitopen på anti-idiotype-antistof-fet. Dette understøttes også af det faktum, at ekstrakten af CRC-cel-ler ikke bandt til anti-idiotype-antistofferne, men som forventet 10 bandt til MAb 17-lA.

Produktion af anti-idiotype- og anti-(anti-idiotype)-antistoffer af humane B-lymfocytter

Buffycoat-celler blev vundet fra patienterne nr. 08 og 23, heriholds-15 vis 20 og 5 måneder efter injektion med MAb 17-1A. Cellerne blev stimuleret med 10 ng/ml F(ab'^-fragmenter af 17-1A in vitro som beskrevet af DeFreitas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1982, s. 6646-6650. I løbet af de følgende 7 dage blev portioner af celler opdelt i T- og B-cellepopulationer ved rosettering med fåre-erythro-20 cyter, som var behandlet med 2-aminoethylisouroniumbromid, jfr. Pel-logrino et al,, Clin. Innmmo. & Iwmmopathol. 3, 1975, s. 324-333.

Begge cellepopulationer blev farvet med F(ab'^-fragmenter af 17-lA eller anti-influenza-monoklonalt antistof og gede-anti-muse~Ig-FITC. Cellepopulationerne blev derefter analyseret i en cytofluorograf.

25 Derudover blev periferale mononucleare blodceller fra samme patient stimuleret med F(ab'^-fragmenter af 17-lA. eller anti-influenza monoklonale antistoffer i 9 dage i en modificeret Mishell-Dutton-kultur til specifik human Ig-produktion som beskrevet af DeFreitas et al., supra. Supernatanter fra disse kulturer blev analyseret i et fast-30 fase-enzymbundet immunoabsorbentassay for specifik humant IgG (KPL

Laboratories, Gaithersburg, Maryland).

Den procentdel af lymfocyter, som indledningsvis bandt 17-lA F(ab')2 fra patient nr. 08, var 1,2% og fra patient nr. 23 0,2%. I løbet af 7 dage i kultur med MAb 17-lA forøgedes procentdelen af lymfocyter fra

DK 162056 B

13 patient nr. 23, som specifikt bandt 17-1A F(ab')2, fra 0,2 til 13%.

Alle de 17-lA-bindende celler var til stede i B-cellepopulationen.

Efter 9 dage blev der endvidere detekteret humant anti-MAb 17-1A IgG. Inkubation af lymfocyter fra den samme patient med anti-influenza-5 monoklonalt antistof under identiske betingelser producerer intet detekterbart humant Ig over for enten MAb 17-1A eller anti-influenza-monoklonale antistoffer.

I et andet forsøg blev humane B-lymfocytter stimuleret til at producere anti-(anti-idiotype)-antistof. B-lymfocytter blev udvundet og 10 stimuleret in vitro som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at cellerne blev stimuleret med autologt anti-idiotype-antistof og ikke idiotype-antistof. Anti-(anti-idiotype)-antistoffer blev produceret af stimulerede B-lymfocyter, og det viste sig, at disse anti-(anti-Id)-Ab identificeredes som en epitop på CRC-celleekstrakt og på hele 15 celler. Det humane immunsystem vil således producere anti-tumor-antistoffer som respons på stimulering med anti-idiotype-antistoffer.

Udødelige B-lymfocytter, som danner anti-idiotype-antistof

Forskellige fremgangsmåder til produktion af udødelige B-lymfocytter, 20 som udsondrer monoklonale antistoffer, er kendte inden for teknikken, jfr. Kozbor et al., Immunology Today 4, 1983, s. 72-79. Humane B-lym-focytter, som udsondrer anti-(anti-idiotype)-antistof, som er vundet fra periferale blodlymfocyter som beskrevet ovenfor, kan derfor gøres udødelige af fagfolk.

25 Én fremgangsmåde, som let kan anvendes, er udødeliggørelse med Ep- stein-Barr-virus (EBV). Ved denne fremgangsmåde inficeres de ovenfor beskrevne normale lymfocyter med EBV in vitro, og udødelige cellelinjer etableres derefter fx ved begrænsende fortynding på et feeder-lag, jfr. Kozbor et al., 1983, supra og referencerne 56-60, som er 30 citeret deri.

En anden fremgangsmåde er at fusionere enten de ovenfor beskrevne anti-Id Ab-udsondrende lymfocyter eller en EBV-transformeret lymfocyt med en human plasmacytoma eller lymfoblastoidfusionspartner. Fx kan

DK 162056 B

14 en EBV-transformeret B-lymfocyt, som udsondrer anti-Id Ab, fusioneres med fx den humane lymfoblastoid-cellelinje KR-4. De ønskede hybrido-mer ville derefter kunne selekteres i hypoxattthin-aminopterin-thymi-dinmedium indeholdende ouabain, som eliminerer modercellerne. Hybri-5 domer testes for specifik antistofproduktion. Positive hybrider klo-nes derefter, genklones og udbredes derefter i en bulk-kultur eller i bughulen af et immunundertrykt pattedyr (fx en nøgen mus), jfr. fx Kozbor et al., Proc. Natl. Acade. Scl. U.S.A. 79, 1982, s. 6651-6655.

Claims (7)

1. Anti-idiotype-antistof, kendetegnet ved, at det identificerer en epitop, som er parotopen af et anti-tumor-antistof.

2. Anti-idiotype-antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er monoklonalt.

3. Anti-idiotype-antistof ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det fås fra en udødelig B-lymfocyt, der producerer et anti-idiotype-antistof, som identificerer en epi-10 top, som er parotopen af et anti-tumor-antistof, og at det i det væsentlige er fri for andre antistoffer.

4. Anti-idiotype-antistof ifølge krav 3, kendetegnet ved, at B-lymfocytten er en hybridoma.

5. Anti-idiotype-antistof ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at det er polyklonalt.

6. Anti-idiotype-antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det fås ved administration til en heterolog vært af et anti-tumor-antistof, hvorefter det ønskede anti-idiotype-antistof isoleres og oprenses fra serumet fra denne vært.

7. Præparat til induktion af et immunologisk respons mod en tumor, kendetegnet ved, at det omfatter et anti-idiotype-antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6.