FI87734C - Immunologisk motverkan foer tumoerer och virus - Google Patents

Description

1 37734

IMMUNOLOGINEN VASTE KASVAIMILLE JA VIRUKSILLE - IMMUNO-LOGISK MOTVERKAN FÖR TUMÖRER OCH VIRUS

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää tera-5 peuttisesti käyttökelpoisten, uusien anti-idiotyyppis-ten vasta-aineiden valmistamiseksi, joiden avulla ai-kaasaadaan immunologinen vaste kiinteille kasvaimille ja rabies-viruksille.

Aminohapposekvenssi immunoglobuliinin (Ig) 10 sekä raskaiden (VH) että kevyiden (VL) ketjujen vaih-televissa alueissa muodostaa konformaation antigeenin sitoutumiskohdassa (so parotooppi) sallien vasta-aineen vuorovaikutuksen erityisen antigeenin kanssa. Ig:n injektio heterologiseen isäntäeläimeen aiheuttaa an-15 ti-ksenotyyppisten (lajispesifinen), anti-isotyyppisten (spesifinen Ig-luokalle) ja anti-idiotyyppisten (spesifinen vasta-aineen vaihtelevalle alueelle) vasta-aineiden lisääntymisen. Anti-idiotyyppisillä vasta-aineilla voi olla kaksi funktionaalista luokkaa, joista toinen 20 reagoi parotoopin kanssa ja toinen reagoi V - ja/tai VL-rakenteen (framework) kanssa (rakennedeterminantit), kts. yleisesti Geha, (1981) N. Engl. J. Med. 305:25-28; Jerne, (1974) Ann. Immunol. (Paris) 125 C: 373-389.

Keksinnön tarkoituksena on siten tuoda esiin 25 menetelmä anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka on tarkoitettu aikaansaamaan immunologinen vaste kiinteille kasvaimielle ja rabies-virukselle.

Edelleen keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin menetelmällä valmistettuja monoklonaalisia anti-30 idiotyyppisiä vasta-aineita ja immortaaleja B lymfosyytti-lähteitä tällaisia vasta-aineita varten, jotka ovat käyttökelpoisia muodostettaessa immunologisia vasteita kiinteille kasvaimille ja rabies-virukselle.

Keksinnön tarkoituksena on tuoda käyttötarkoi-35 tuksena esiin immunologisen vasteen aikaansaaminen antigeenille, joka on kasvain tai virus, jolloin: (a) tuotetaan keksinnön mukaisella menetelmällä anti- 2 87734 idiotyyppistä vasta-ainetta, mainitun anti-idiotyyppi-sen vasta-aineen identifioiman epitoopin ollessa anti-kasvain tai anti-virus -vasta-aineen parotooppi; (b) stimuloidaan kohteessa anti-(anti-idiotyyppi-5 sen)vasta-aineen muodostus, joka vasta-aine identifioi kasvainsolun tai viruspartikkelin epitoopin, antamalla mainittua anti-idiotyyppistä vasta-ainetta mainitulle ihmiselle.

Edelleen tuodaan esiin keksinnön mukaisella 10 menetelmällä valmistettuja polyklonaalisia anti- idiotyyppisiä vasta-aineita, mainittujen anti-idiotyyp-pisten vasta-aineiden identifioiman epitoopin ollessa anti-kasvain tai anti-virus vasta-aineen parotooppi, jotka ovat olennaisesti vapaita anti-isotyyppisistä 15 vasta-aineista.

Eräänä sovellutuksena esillä oleva keksintö tuo esiin immortaalin B lymfosyytin, joka tuottaa anti-idiotyyppistä vasta-ainetta, mainitun anti-idiotyyp-pisen vasta-aineen identifioiman epitoopin ollessa 20 anti-kasvain tai anti-virus vasta-aineen parotooppi. E- sillä oleva keksintö tuo esiin myös monoklonaalisia vasta-aineita, joita tuottaa keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti yllä mainittu immortaali B lymfosyytti ja jotka ovat olennaisesti vapaita muista vasta-ai-25 neista.

Sopivia kiinteitä kasvaimia ovat esim. kiinteät ruoansulatuselimistön kasvaimet. Sopiva virus on rabies-virus. Annettaessa anti-idiotyyppisiä vasta-aineita kohde, erityisesti imettäväinen, varsinkin ihmi-30 nen, stimuloidaan muodostamaan anti-(anti-idiotyyppis tä) vasta-ainetta, joka identifioi kasvainsolun tai viraalisen partikkelin epitoopin.

Esillä oleva keksintö tuo esiin uuden lähestymistavan syövän hoitoon ja virusimmunointiin. Traditio-35 naaliset lähestymistavat kasvainten hoidossa ovat pe rustuneet anti-kasvain vasta-aineiden (so. vasta-aineiden, jotka identifioivat kiinteän kasvainsolun epitoo- 3 87734 pin) antoon potilaille, jolloin pyrkimyksenä on ollut kasvaimen tuhoaminen. Traditionaalinen anti-virus hoito on perustunut rokotukseen konventionaalisilla rokotteilla. Hakijat ovat kuitenkin havainneet, että immuno-5 loginen vaste potilaan omille kasvaimille tai viruksille voidaan indusoida vasta-aineella, joka on anti--idiotyyppinen vasta-aineelle, joka tunnistaa kasvain-tai virusantigeenin. Tämän immunologisen vasteen muodostuksesta on hyötyä terapeuttisessa ja, ainakin vi-10 ruksien tapauksessa ennaltaehkäisevässä hoidossa.

Siten keksinnön mukaisessa menetelmässä (a) anti-idiotyyppisiä vasta-aineita tuotetaan immortaalin B lymfosyytin avulla, tai (b) annetaan kiinteän kasvaimen vastaista tai rabies-viruksen vastaista vasta-ai-15 netta heterologiselle isännälle ja eristetään ja puhdistetaan halutut anti-idiotyyppiset vasta-aineet isännän seerumista; jolloin anti-idiotyyppiset vasta-aineet identifioivat epitoopin, joka on kiinteän kasvaimen vastaisen tai rabies-viruksen vastaisen vasta-aineen 20 parotooppi.

Vaikka hakijat eivät halua sitoutua tiettyyn toimintateoriaan, on luultavaa, että havaittu immunologinen vaste, joka saavutetaan esillä olevan keksinnön avulla, johtuu anti-idiotyyppisten vastaainemolekyylien 25 ja ihmispotilaan immuunijärjestelmän välisestä vuorovaikutuksesta. Anti-idiotyyppisen vasta-ainemolekyylin idiotyyppinen (so. vaihteleva) alue sisältää antigeenisiä determinantteja (so. epitooppeja), jotka kohde tunnistaa antigeeniksi. Tämä aiheuttaa anti-(anti-idio-30 tyyppisten)vasta-aineiden muodostuksen kohteessa. Tämän anti-(anti-idiotyyppisten)vasta-aineiden sarjaan kuuluu vasta-aineet, jotka ovat suoraan komplementaarisia anti-idiotyyppisen vasta-aineen parotoopille. On edelleen luultavaa, että anti-idiotyyppisen vasta-aineen 35 parotooppi vastaa "sisäistä" kuvaa idiotyyppisen vasta-aineen identifioimasta (so. selektiivisesti sitomasta) kasvainsolu- tai virusepitoopista, ja sen vuoksi 4 87734 anti-(anti-idiotyyppiset) vasta-aineet sitoutuvat myös kasvain- tai virusantigeeniin. Seurauksena tästä esillä olevan keksinnön avulla aikaansaadaan immunologinen vaste kasvaimelle tai virukselle saattamalla antigeeni 5 (anti-idiotyyppisen vasta-aineen parotyyppi), jota osa potilaan muodostamista vasta-aineista ei oleellisesti erota kasvain- tai virusantigeenista.

Yllättäen edellä esitetty menetelmä on tehokas tapa kontrolloida kasvaimen kasvua tai indusoida im-10 munologinen vaste virukselle. Edelleen tällä on useita etuja verrattuna traditionaalisiin hoitotapoihin. Ensiksikin potilaalle tarvitsee antaa huomattavasti vähemmän vieraita vasta-aineita. Toiseksi potilaan anti-idiotyyppinen vaste on pikemminkin hyödyllinen, kuin 15 vahingollinen aiotun vaikutuksen kannalta. Kolmanneksi potilaan omat vasta-aineet ovat anti-kasvain tai anti-virus vasta-aineita eliminoiden täten toistettavien ‘ eksogeenisten anti-kasvain vasta-aineiden annon tar peellisuuden. Muut edut ovat ilmeisiä alan ammattimie-20 helle.

Vasta-aineen idiotyyppi tarkoittaa yksilöllisesti selvästi erotettavia antigeenisiä determinantteja vasta-ainemolekyylin vaihtelevassa tai idiotyyp-pisessä alueessa. Osa näistä idiotyyppisistä deter-25 minanteista on liittynyt tai on läheisesti liittynyt vastaaineen parotooppiin, kun taas muut ovat vaihtele-van alueen rakenteessa (framework). Kunkin vasta-aineen omatessa sen oman idiotyypin, erityisistä vasta-aineista käytetään alla seuraavia termejä. "Idiotyyppinen 30 vasta-aine" tai "IdAb" tarkoittaa anti-kasvain tai anti-virus vasta-ainetta (so. idiotyyppisen vasta-aineen identifioima epitooppi on kasvaimen tai viruspar-tikkelin solussa). "Anti-idiotyyppinen vasta-aine" tai "antildAb" tarkoittaa vasta-ainetta, joka identifioi 35 idiotyyppisen vasta-aineen vaihtelevan alueen epitoo-pin. Osa tällaisista vasta-aineista identifioi epitoo-pin, joka on idiotyyppisen vasta-aineen parotooppi 5 87/44 esittäen täten "sisäistä" kuvaa epitoopista, jonka identifioi idiotyyppinen vasta-aine kasvainsolus-sa. "Anti-(antiidiotyyppinen)vasta-aine" tai "anti-(an-ti-Id)Ab" on vasta-aine, joka identifioi anti-iiotyyp-5 pisen vasta-aineen vaihtelevan alueen epitoopin. Osa anti-(anti-idiotyyppisistä)vasta-aineista identifioi epitoopin, joka vastaa (i) anti-idiotyyppisen vasta-aineen parotooppia ja (ii) epitooppia kasvainsolussa.

Kuten alla on todettu, esillä olevan keksinnön 10 mukaisella menetelmällä valmistettua anti-idiotyyppistä vasta-ainetta voidaan antaa isännälle. Anti-idiotyyppi-nen vasta-aine annetaan isännälle fysiologisesti sopivassa kantajassa (esim. steriili, pyrogeeniton fysiologinen suolaliuos), jonka formulointi on tunnettua alan 15 ammattimiehelle. Kantajan valinta ei ole kriittistä ja vasta-aine voidaan annostella millä tahansa menetelmällä, joka saattaa vasta-aineen kiertojärjestelmään (esim. laskimonsisäinen, lihaksiensisäinen tai ihonalainen injektio).

20 Isäntä voi olla imettäväinen, yleisimmin ihmi nen, ja viruksien kyseessä ollessa kissa tai koira. Isäntään annettavan vasta-aineen määrä voi vaihdella laajoissa rajoissa, esim. riippuen erityisestä annettavasta vasta-aineesta ja potilaasta, jolle sitä an-25 netaan. Oleellista on, että anti-idiotyyppistä vasta-ainetta annetaan riittävä määrä stimuloimaan anti-(an-ti-idiotyyppisten)vasta-aineiden muodostusta potilaan immuunijärjestelmässä. Käytettävän vasta-aineen määrien ei kuitenkaan tarvitse olla kovin suuria, koska vain 30 hyvin pienet määrät ovat riittäviä immunologisen vasteen muodostamiseksi. Monissa tapauksissa vasta-aineen annostelu välillä muutamia mikrogrammoja - muutamia milligrammoja pitäisi olla riittävä, (esim. määrästä noin 50-200 ug määrään noin 1-5 mg). Sopivan annoksen 35 määrääminen on tunnettua alan ammattimiehelle.

Ihmispotilaalle voidaan antaa formulaatiota, joka sisältää anti-idiotyyppistä vasta-ainetta, immu- 6 87734 nologisen vasteen muodostamiseksi kasvaimelle, esim. kiinteälle kasvaimelle (so. kiinteä massa pahanlaatuisia soluja, joita muodostaa karsinooma, sarkooma, melanooma jne., vastakkaisena dispersseille, kiertäville 5 pahalaatuisille soluille, kuten leukemialle). Ensisijaisessa sovellutuksessa kasvain on ruoansulatuselimistön kasvain. Kuten yllä on määritelty anti-idiotyyp-pisen vasta-aineen alaluokka sitoutuu selektiivisesti (identifioi) anti-kasvain vasta-aineen (idiotyyppinen 10 vastaaine) parotooppiin. Sellainen anti-idiotyyppiä sisältävä formulaatio voidaan myös annostella isäntään, jossa anti-idiotyyppisen vasta-aineen parotyyppi on virusantigeenin sisäinen kuva. Tällainen vasta-aine tunnistaa epitoopin, joka on vastaavan idiotyyppisen 15 vasta-aineen parotyyppi. Anti-idiotyyppiset vasta-aineet, jotka esittävät kasvain- tai virusantigeenin sisäisiä kuvia, voidaan erottaa anti-idiotyyppisistä vasta-aineista, jotka tunnistavat rakennedeterminantit idiotyyppisen vasta-aineen vaihtelevassa alueessa, 20 millä tahansa useista menetelmistä. Eräs menetelmä haluttujen antiidiotyyppisten vasta-aineiden identifioimiseksi on kilpaileva sitoutumiskoe kasvain- tai virusantigeenin (tai hapteenin, mikäli tällaista on saatavilla), idiotyyppisen vasta-aineen ja anti-25 idiotyyppisen vasta-aineen välillä. Jos antigeeni estää anti-idiotyyppisen vasta-aineen sitoutumisen idiotyyp-piseen vasta-aineeseen, anti-idiotyyppisen vasta-aineen identifioima epitooppi liittyy läheisesti idiotyyppisen vasta-aineen parotooppiin. Toisessa kokeessa määrite-30 tään toimiiko anti-idiotyyppisen vasta-aineen antiseerumina myös anti-kasvain tai anti-virus. Nämä ja muut menetelmät anti-idiotyyppiaen vasta-aineen identifioimiseksi ovat tunnettuja alan ammattimiehelle. Isännälle annettava formulaatio voi sisältää rakennedeterminant-35 teihin kohdistuvia anti-idiotyyppisiä vasta-aineita alaluokan vasta-aineiden lisäksi, jotka kohdistuvat idiotyyppisen vasta-aineen parotooppiin. On vain vält- 7 87734 tämätöntä, että formulointi sisältää alaluokan, joka on kohdistettu idiotyyppisen vasta-aineen parotooppiin.

Käytetty anti-idiotyyppinen vasta-aine voi olla homologinen tai heterologinen isännälle. En-5 sisijainen vasta-aine ihmiselle on kuitenkin ihmisen vasta-aine immunologisen vasteen minimoimiseksi vakio-alueelle vasta-ainemolekyyliin nähden. Kuitenkin, koska esillä olevassa keksinnössä tarvitaan suhteellisen pieniä anti-idiotyyppisen vasta-aineen annoksia, hete-10 rologista vasta-ainetta voidaan käyttää (esim. hiiri, rotta, vuohi, kaniini jne.). Mikäli ei esiinny mitään vakavaa reaktiota heterologiselle anti-idiotyyppiselle vasta-aineelle, tällainen vasta-aine voi olla ensisijainen johtuen valmistuksen helppoudesta ja edullisista 15 valmistuskustannuksista. Lisäksi polyklonaalisia anti-idiotyyppisiä vasta-aineita voidaan käyttää samalla tavoin kuin monoklonaalisia anti-idiotyyppisiä vasta-aineita .

Polyklonaalista anti-idiotyyppistä vasta-ai-20 netta voidaan valmistaa tekniikan tasosta tunnetuilla menetelmillä. Esim. polyklonaalista anti-IdAb voidaan valmistaa immunisoimalla eläin monoklonaalisella anti-kasvain tai anti-viruksen vasta-aineella (so. IdAb). Immunisoitu eläin tuottaa anti-IdAb. Anti-seerumin 25 sisältämän, tämän anti-idiotyyppisen vasta-aineen alaluokka identifioi epitoopin, joka on anti-kasvain tai anti-virus vasta-aineen parotooppi. Eläimestä kerätty antiseerumi voidaan puhdistaa esim. jaksottaisella absorptiolla käyttäen (i) immobilisoitua vasta-ainetta, 30 joka on samaa isotyyppiä kuin monoklonaalinen IdAb, mutta erilaista idiotyyppiä, anti-isotyyppisten vasta-aineiden poistamiseksi antiseerumista, ja (ii) im-mobilisoidulla monoklonaalilla IdAb anti-IdAb poistamiseksi, jonka alaluokka edustaa kasvain- tai virusanti-35 geenien sisäistä kuvaa. Anti-IdAb voidaan sitten eluoi-da sidotusta monoklonaalisesta anti-kasvain tai anti-virus vasta-aineesta sellaisen liuoksen muodostamisek- 8 87734 si, joka on olennaisesti anti-isotyyppisiä vastaaineita sisältämätön. Tämä liuos voidaan sitten testata IdAb:n parotoopin identifioiman anti-IdAb läsnäolon suhteen.

Monoklonaaliset ja anti-idiotyyppiset vasta-5 aineet, jotka ovat olennaisesti vapaita muista vasta-aineista, voidaan eristää immortaalin B lymfosyytin olennaisesti puhtaiden viljelmien supernatantista. Termi "immortaali B lymfosyytti" tarkoittaa mitä tahansa suhteellisen pysyvää, jatkuvasti vasta-ainetta tuotta-10 vaa solua, joka voidaan viljellä useita kuukausia, (edullisesti loputtomasti), kuten hybridoomaa (normaalien tai pahalaatuisten lymfosyyttien somaattisia solu-hybridejä) tai viruksella tai onkogeenisellä DNA:11a transformoituja normaaleja lymfosyyttejä (esim. Ep-15 stein-Barr virus). Immortaalien B lymfosyyttien valmistus normaaleista B lymfosyyteistä, jotka muodostavat anti-idiotyyppistä vasta-ainetta, on tunnettua alan ammattimiehelle, kts. esim., Monoclonal Antibodies (R.H. Kennett., T.J. McKearn & K.B. Bechtol 1980); M, 20 Schreier et ai., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory 1980); Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (G. J. Hammerling, U. Hammerling & J.F. Kearney 1981); Kozbor et al., (1982) Proc Natl. A-cad. Sei U.S.A. 79:6651-6655; Jonak et al., (1983) 25 Hybridoma 2:124 Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines (R. H. Kennett, K.B. Bechtol & T.J. McKearn 1983); Kozbor et al., (1983 Immunology Today 4: 72-79.

Normaaleja B lymfosyyttejä, jotka muodostavat anti-IdAb ja ovat sopivia immortaalin B lymfosyytin 30 valmistukseen, voidaan valmistaa eri menetelmin kuten on tunnettua alan ammattimiehelle. Esim. eläin, kuten rotta tai hiiri, voidaan immunisoida monoklonaalisella anti-kasvain tai anti-virus vasta-aineella, ja B lymfosyyttejä, jotka muodostavat anti-IdAb, voidaan ottaa 35 talteen eläimen pernasta. Ihmisen B lymfosyyttejä, .·*. jotka muodostavat anti-IdAb voidaan saada immunisoimal la potilas monoklonaalisella anti-kasvain tai anti-vi- 9 87734 rus vasta-aineella, keräämällä periferaalisia verilym-fosyytteja potilaasta ja indusoimalla sitten in vitro anti-IdAb muodostavien B lymfosyyttien kasvu stimuloimalla viljelmää monoklonaalisella anti-kasvain tai 5 anti-virus vasta-aineella, kts. esim DeFreites et ai., (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:6646-6650.

Eläimen tai ihmisen B lymfosyytit, jotka muodostavat anti-IdAb, voidaan sitten ottaa talteen ja tehdä immor-taaleiksi, kuten on tunnettua alan ammattimiehelle. On 10 selvää, että lymfosyytit, jotka muodostavat anti-

IdAb, jotka edustavat kasvainsolun tai virusantigeenin sisäisiä kuvia, pitäisi erottaa niistä B lymfosyyteistä, jotka muodostavat anti-IdAb, jotka kohdistuvat idiotyyppisen alueen rakennedeterminantteihin.

15 Esillä olevassa keksinnössä kiinteisiin kas vaimiin sovellettua menetelmää voidaan luonnollisesti soveltaa muiden menetelmien yhteydessä muodostettaessa immunologisia vasteita kasvaimille, kuten käytettäessä virusperäisiä onkolysaattirokotteita, kuten on kuvattu 20 patenttijulkaisussa US 4 108 983. Mitä tulee viruksiin, haluttaessa, isäntäimettäväisessä muodostettua immuunivastetta voidaan vielä lisätä immunisoimalla tavanomaisella virusrokotteella sen lisäksi, että annetaan anti-IdAb, kuten on kuvattu yllä. Kun isäntäimettäväises-25 sä on stimuloitu anti-(anti-Id)Ab tuotto antamalla anti- IdAb (esim. noin 2 viikkoa annostelun jälkeen), isännälle annetaan tämän jälkeen yksi rokotus virusrokotetta käyttäen tavanomaista tekniikkaa, kuten on tunnettua (esim. tapettuja virusrokotteita, kuten HDC ·' 30 rabies rokote) kts. Plotkin et ai., (1976) Am. J.

Epidemiology 103:75-80, Wiktor et ai., Rabies Vaccine for Human Use: Volume 40, s. 3-9 (1978). Rokotetyypit ja ohjeet niiden käyttämiseksi ovat tunnettuja alalla.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu havainnol-‘ ' 35 listamaan esillä olevaa keksintöä, ja niitä ei ole tarkoitettu rajoittamaan keksinnön suojapiiriä.

Esimerkki 1 - Kiinteän kasvaimen vasta-aineet 10 87 734

Monoklonaaliset idiotyyppiset vasta-aineet Seuraavissa kokeissa käytettiin hiiren mono-klonaalisia vasta-aineita 17-1A, C42032 ja C41472, jotka sitoutuvat ihmisen ruoansulatuselimistön syöpäsoluihin 5 ja joita on kuvattu Herlyn et ai., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 1438-1442 ja Koprowski, "Monoclonal Antibodies In Vivo", Monoclonal Antibodies in Cancer: Proceedings of the Fourth Armand Hammer Cancer Symposium (B.Boss, R. Langman, I. Trowbridge & Dulbecco 10 1983). Monoklonaalinen vasta-aine (MAb) C42032 omaa spesifisyyden paksunsuolen syöpään (kolerektaalikar-sinooma) (CRC)-liittyviin vasta-aineisiin Mr 180, 160, 50 ja 40 K. MAb C41472 (IgG2a) omaa spesifisyyden CRC--liittyvään antigeeniin Mr 50 K. MAb A5C3 hepatitis 15 virusta vastaan käytettiin myös, ja se on kuvattu: Vands et ai., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 12-14-1218. MAb 17-1A (IgG2A, kappa kevyt ketju) ja C42032 (IgG2a kappa kevyt ketju) puhdistettiin askii-tista, jota saatiin hybridoomaa kantavista hiiristä, 20 affiniteettikromatografisesti käyttäen proteiini A-sepharosekolonnia (Pharmacia, Piscataway, NJ), kuten on kuvannut Ey et ai., (1978) Immunochmistry 15: 429-436.

Potilaat: 25 Kaikilla potilailla oli etäispesäkkeitä omaava tai toistuva ruoansulatuselimistön adenokarsinooma (rauhassyöpä), ja heille annettiin säännöllisesti annos puhdistettua steriiliä pyrogeenivapaata valmistetta MAb 17-1A, joka oli konsentroitu Balb/c hiirien askiitti-30 nesteestä menetelmällä, jota on kuvattu Sears et ai., (1982) Lancet 762-765. Yhdeksästä potilaasta, jotka saivat 192 mg tai vähemmän MAb 17-IA, seitsemän kehitti anti-hiiriglobuliinivasta-aineita. 20 potilaasta, jotka saivat 200-1000 mg monoklonaalista vasta-ainetta, kolme 35 kehitti anti-hiiriglobuliinivasta-aineita. Kolmen potilaan seerumia ensimmäisestä ryhmästä, jotka kehittivät -- anti-hiiriglobuliinimolekyylejä (potilaat no. 7, 8 ja 11 87734 9) ja kahden potilaan seerumia toisesta ryhmästä (no. 14 ja 23) seulottiin anti-idiotyyppisten vasta-aineiden eristämiseksi. Seerumia, jota käytettiin anti-idiotyyppisten vasta-aineiden eristämiseksi kohteista 5 no. 7,8 ja 23, saatiin silloin, kun kaikki kolme osoittivat korkeinta anti-hiiriglobuliinivasta-aineiden konsentraatiota. Potilas no. 8 sai toisen ruiskeen, 130 mg monoklonaalista vasta-ainetta, 20 kk ensimmäisen ruiskeen jälkeen, ja tämän toiseen ruiskeen jälkeen 10 saatu seerumi käytettiin seulontakokeeseen anti- idiotyyppisen vasta-aineen toteamiseksi.

Polyklonaalisten anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistus_

Uusseelantilaisia valkoisia kaniineja injek-15 toitiin suonensisäisesti eri kohtiin 300 mg puhdistet tua MAb 17-1A, joka oli emulsioitu Freund'n täydelliseen adjuvanttiin, ja 30 päivää myöhemmin tehostettiin lihaksen sisäisesti lOOug monoklonaalisella vasta-aineella. Seerumi kerättiin 10. päivänä toisesta vastees-20 ta.

Antiseerumi absorboitiin immobilisoituun MAb ·*: c 2032 ja MAb 17-lA. Puhdistetut monoklonaaliset vas- ta-aineet (30 mg kutakin) yhdistettiin 20 ml Affi-Gel 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Antiseerumi 25 absorboitiin sitten peräkkäin immunoabsorbentteihin MAb C42032 ja MAb 17-lA anti-isotyyppisten ja vast, anti-idiotyyppisten vasta-aineiden poistamiseksi. Absorboidut vasta-aineet eluoitiin 0,1 M glysiinipuskurilla (pH 2,8), neutraloitiin välittömästi fosfaattipuskuril-30 la, dialysoitiin fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta vasten, ja proteiini määrättiin kvantitatiivisesti absorptiviteetin avulla 280 nm (E1%280=14 ).

.1 Potilaista yhden MAb 17-lA ruiskeen jälkeen saatu antiseerumi otettiin talteen ja puhdistettiin, 35 kuten on kuvattu yllä. Seerumi kohteesta no. 23, joka sai 750 mg MAb 17-lA, ja kohteista no. 8 ja 7, jotka saivat 133 ja 125 mg MAb 17-lA, kerättiin eri aikoina 12 37734 ensimmäisen vasta-aineruiskeen jälkeen. Näytteet, jotka sisälsivät radioimmunologisen analyysin perusteella antimuriini IgG vasta-ainetta, absorboitiin peräkkäisesti immunoabsorbentteihin MAb C 2032 ja MAb 17-IA an-5 ti-isotyyppisten ja anti-idiotyyppisten vasta-aineiden poistamiseksi, kuten on kuvattu yllä. Anti-idiotyyppi-nen vasta-aine, joka eristettiin seerumista, osoitet-tiin ihmisen immunoglobuliiniksi sitomalla se I-mer-kittyihin anti-ihmisen F(ab')2 jaksoihin. Anti-idio-10 tyyppisen proteiinin saanto seeruminäytteistä vaihteli: 13ug/ml kohteesta no. 8, 8,9 ug/ml kohteesta no. 7, ja 43 ug/ml kohteesta no. 23. Suurin määrä saatiin kohteen no. 23 seerumista, joka myös osoitti korkeampia tasoja anti-hiiren globuliinin vasta-aineilla.

15 Seerumin seulonta antl-idlotyypplsten vasta- aineiden osoittamiseksi_

Seeruminäytteiden seulomiseksi anti-idiotyyppisen vasta-aineen osoittamiseksi suoritettiin kilpaileva määritys käyttäen kaniinin anti-idiotyyppistä vasta-ainetta 20 ja neljää ihmisen seeruminäytettä, joita oli esi-inkuboitu 125I-merkityllä MAb 17-lA:lla.

Polystyreenihelmiä, kooltaan 1/4 tuumaa (6,35mm) (Precision Plastic Ball Co., Chicago, IL) pestiin kolme kertaa 95% etinolilla. Ilmakuivattuja 25 helmiä inkuboitiin laimealla kaniinin tai ihmisen anti-idiotyyppisellä vasta-aineella 0,02 M natriumtetrabo-raatissa, pH 8,2. Yli yön jatkuneen inkuboinnin lämpötilassa 4°C varovaisella ravistelulla jälkeen helmet pestiin kolme kertaa fosfaatti-puskuroidulla suolali-30 uoksella ja inkuboitiin sitten vielä kolme tuntia huoneen lämpötilassa fosfaatti-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 2 % härän seerumialbumiinia ja 0,04 NaN3. Helmiin saatettiin sitten 125I-merkittyä MAb 17-IA vertailuidiotyypiksi, jotka oli esi-inkuboitu potenti-35 aalisella ihmisen anti-idiotyyppisellä vasta-aineella, so. ihmisen seerumi oli laimennettu 25% konsentraatioon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ilman Ca*+ ja ia 87734 aMg +, ja siihen lisättiin 26% härän seerumialbumiinia ja 0,04% NaN3. Lisäinkuboinnin yli yön jälkeen helmet pestiin ja sitoutunut radioaktiivisuus mitattiin gam-malaskimessa.

5 Kolme saaduista seerumnäytteistä, jotka oli saatu monoklonaalisella vasta-aineella injektion jälkeen (no. 23, 9 ja 14) osoittivat MAb 17-1A sitoutumisen inhibitiota, joka oli korkeampi kuin esi-mono-klonaalisen vasta-aineinjektionäytteistä saatu. Poti-10 laan no 14 jälki-monoklonaaliselle seerumille saadut sitoutumisen inhibitioarvot olivat alhaiset verrattuna kahteen muuhun seeruminäytteeseen mutta korkeammat kuin esi-monoklonaalisella vasta-aineseerumilla saadut arvot samassa kohteessa. Saadut seerumin inhibitioarvot poti-15 laalla no. 8 seitsemän päivää sen jälkeen, kun hän oli saanut toisen injektion monoklonaalista vasta-ainetta, olivat jo korkeat.

Kilpaileva määritys anti-idiotyypin havaitsemiseksi 20 Kilpaileva määritys toteutettiin samalla tapaa kuten on kuvattu yllä eristettyjen anti-idiotyyppisten vasta-aineiden MAb 17-lA:aan samaten kuin monoklonaali-'·*· siin vasta-aineisiin 0,2032, C 1472 ja A5C3 sitoutumisen * . \ * 4 4·* . .·. määrittämiseksi.

.·, : 25 Saadut tulokset osoittivat, että anti-idio- .’ tyyppisten vasta-aineiden sitoutuminen kolmesta seeru- ; minäytteestä (no. 8, 7 ja 23) MAb 17-lA:aan oli merkit tävästi korkeampi kuin kolmeen muuhun monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joista kaksi (C42032 ja C41472) havait-30 sivat myös antigeenisiä kohtia paksusuolensyöpäsoluis- sa. Nämä kohdat ovat kuitenkin erilaisia kuin kohdat, jotka MAb 17-IA tunnistaa. Kaikkien kolmen kohteen immunoglobuliini eristettiin seerumista ennen MAb 17-1A altistamista, konsentroitiin noin 2,5 ug/ml:aan ja 35 kiinnitettiin polystyreenihelmiin. Nämä valmisteet eivät kuitenkaan sitoneet mitään testatuista monoklo-naalisista vasta-aineista, mikä osoitti anti-idiotyyp- 14 87734 pisten vasta-aineiden puuttumisen altistamattomasta seerumista.

Ristireaktiivisuus ihmisen antl-idiotyyppisten vasta-aineiden välillä_ 5 Kilpaileva määritys toteutettiinihmisen an- ti-Id-seerumin risti-reaktiivisuuden määrittämiseksi.

Tulokset kilpailevasta määrityksestä, esitetty alla, osoittavat merkittävää ristireaktiivisuutta potilaiden no. 7 ja 23 anti-idiotyyppisen seerumin välillä 10 ja hiukan alhaisempaa (mutta yhä merkittävää) risti-reaktiivisuutta potilaiden no. 8 ja 23 anti-idiotyyppi-sen seerumin välillä. Samanlaista ristireaktiivisuutta havaittiin potilaan no. 7 anti-idiotyyppisen seerumin ja potilaan no. 8 jälki-monoklonaalisen vasta-ainesee-15 rumin välillä (tuloksia ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat sen, että anti-idiotyyppiset vasta-aineet, joita muodostuu eri potilaissa, kohdistuvat samaan antigeeniseen paikkaan.

20 1.vasta- 2.vasta- cmp 17-1A MAb sitoutumi sen • ·*: aine aine sidottu inhibitio-% seerumi 25 ei mitään 4297 anti-Id 23 07 esi 4595 0 : jälki 1231 71 08 esi 4097 5 -i 30 jälki 2585 40

Epitooppi määritettynä anti-idiotyyppisellä • · vasta-aineella

Ihmisen anti-idiotyyppisten vasta-aineiden : 35 sitoitumisen MAb 17-lA:aan hapteeni-inhibitio toteut- ··’: tiin osoittamaan, että anti-idiotyyppiset vasta-aineet kohdistuivat idiotyyppisen vasta-aineen parotooppiin.

is 87734 SW 1222 solujen 3 M KC1 uute, joka solulinja oli johdettu paksunsuolen syövästä, valmistettiin, kuten on kuvannut Herlyn et ai., (1982) J. Clin. Immunol. 2: 135-140. Valmiste sitoutui MAb 17-1A, mikä 5 osoitti sen, että aine sisälsi antigeenin sen liukene-vassa muodossa. I-merkittyä MAb 17-1A inkuboitiin CRC solu-uutteella ja melanoomasolujen M KCl-uutteella, jotka eivät sitoudu MAb 17-IA. Vasta-aine-antigeeni-seokset lisättiin sitten helmiin, jotka oli käsitelty 10 anti-idiotyyppisellä vasta-aineella, joka oli saatu potilaasta no 23, ja sitoutumista verrattiin pelkän radiomerkityn monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumiseen. Nämä kokeet toteutettiin ei-kyllästetyillä määrillä jodinoitua monoklonaalista vasta-ainetta, jotta 15 havaittaisiin muutokset pienillä määrillä kilpailevia hapteeneja. Vertailutarkoituksessa jodinoitu MAb 17-1A sekoitettiin melanoomasolujen uutteeseen, josta tiedettiin, että se ei sitoudu MAb 17-lA:han. CRC-solu-uut-teiden konsentraatioissa 0,1 tai 0,5 mg/ml todettiin 20 inhiboivan anti-idiotyyppisen vasta-aineen sitoutumista potilaasta 23 jodinoituun MAb 17-1A 39 % ja vast. 68 %. Melanoomasoluista saatu uute konsentraatioissa 0,5 mg/ml saakka ei vaikuttanut merkittävästi monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumiseen.

25 Tämä sitoutumisreaktion hapteeni-inhibitio indikoi CRC-epitoopin "sisäisen kuvan" läsnäoloon an-ti-idiotyyppisessä vasta-aineessa. Tätä tukee myös se tosiasia, että CRC-solujen uute ei sitoutunut anti-i-: diotyyppisiin vasta-aineisiin, mutta sitoutui, kuten 30 odotettiin, MAb 17-IA:aan.

Anti-idiotyyppisten ja anti-(anti-idiotyyppis- · ten) vasta-aineiden valmistus ihmisen B lymfosyyteillä_ ·: Buffy-coat-soluja saatiin potilailta no. 8 ja v 35 23 20 ja vast. 5 kuukautta MAb 17-1A injektion jälkeen.

Solut stimuloitiin 10 ng/ml 17-lA:n F(ab‘ ^-fragmenteilla in vitro, kuten on kuvannut DeFreitas et ai., ie 87734 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6646-6650. Seu-raavan 7 päivän aikana osia soluista erotettiin T- ja B-populaatioihin käsittelemällä (rosetting) lampaan erytrosyyteillä, joita oli käsitelty 2-aminoetyyli-iso-5 uroniumbromidilla, kts. Pellogrino et ai., (1975) Clin. Immunol. & Immunopathol. 3: 324-333. Molemmat solupopulaatiot värjättiin 17-lA:n F(ab')2 fragmenttien tai anti-influenssa monoklonaalisen vasta-aineen, ja vuohen anti-hiiri Ig-FITC kanssa. Solupopulaatiot ana-10 lysoitiin sitten sytofluorografisesti. Lisäksi perife-raalisia veren mononukleaarisia soluja samalta potilaalta stimuloitiin 17-lA:n F(ab')2 fragmenteilla tai anti-influenssa monoklonaalisilla vasta-aineilla yhdeksän päivän ajan muunnellussa MishellDutton-viljelmässä 15 ihmisen spesifisen Ig tuottamiseksi, kuten on kuvannut DeFreitas et ai., supra. Viljelmän supernatantit analysoitiin kiinteäfaasientsyymisidottu immunoabsorbent-timäärityksellä tiettyjen ihmisen IgG suhteen (KPL Laboratories, Gaithersburg, MD).

20 Lymfosyyttien osuus, joka alunperin sitoutui potilaan no. 817-1A F(ab')2, oli 1,2 %, ja potilaan no. 23, oli 0,2 %. Seitsemän päivän aikana viljelmässä, joka sisälsi MAb 17-1A, kasvoi potilaan no. 23 lymfosyyttien osuus, joka spesifisesti sitoutui 17-1A F(ab')2 25 arvosta 0,2 % arvoon 13 %. Kaikki 17-lA:n sitovat solut olivat läsnä B-solupopulaatiossa. Lisäksi yhdeksän päivän kuluttua ihmisen anti-MAb 17-1A IgG havaittiin. Saman potilaan lymfosyyttien inkubointi anti-influenssa monoklonaalisen vasta-aineen kanssa identti-30 sissä olosuhteissa ei tuota mitään havaittavaa ihmisen Ig MAb 17-lA:lle eikä anti-influenssan monoklonaalisel-* le vasta-aineelle.

Eräässä toisessa kokeessa ihmisen B lymfosyyttejä stimuloitiin anti-(anti-idiotyyppisen)vasta-aineen 35 muodostamiseksi. B lymfosyytit kerättiin ja stimuloitiin in vitro, kuten yllä on kuvattu, paitsi että soluja stimuloitiin antologisella anti-idiotyyppisellä 17 87734 vasta-aineella idiotyyppisen vasta-aineen sijasta. An-ti-(anti-idiotyyppiset)vasta-aineet valmistettiin stimuloiduilla B lymfosyyteillä ja nämä anti-(anti-Id) Ab osoittautuivat identifioivan CRC-solu-uutteen ja koko 5 solujen epitoopin. Täten ihmisen immuunijärjestelmä tuottaa antikasvain vasta-aineita vasteena anti-idiotyyppisillä vasta-aineilla stimuloinnille.

Immortaalit B lymfosyytit, jotka tuottavat anti-idiotyyppistä vasta-ainetta_ 10 Eri menetelmiä immortaalien B lymfosyyttien valmistamiseksi, jotka erittävät monoklonaalisia vasta-aineita, tunnetaan alalla, kts. Kozbor et ai., (1983) Immunology Today 4: 72-79. Ihmisen B lymfosyyttejä, jotka erittävät anti-(anti-idiotyyppistä) vasta-15 ainetta ja joita saadaan periferaalisista veren lymfo-syyteistä, kuten yllä on kuvattu, voidaan tehdä immor-taaleiksi, kuten on tunnettua alan ammattimiehelle.

Yksi menetelmä, jota voidaan käyttää, on im-mortaaliksi tekeminen Epstein-Barr viruksen (EBV) avul-20 la. Tässä menetelmässä normaaleihin yllä kuvattuihin lymfosyyteihin istutetaan EBV in vitro ja immortaaleja solulinjoja muodostetaan sitten esim. rajoittavalla laimennuksella syöttökerroksessa, kts. esim. Kozbor et ai., (1983), supra ja tämän viitteet 51-60.

25 Toinen mahdollisuus on fuusioida joko yllä kuvattu anti-IdAb erittävät lymfosyytit tai EBV-muun-neltu lymfosyytti ihmisen plasmasytooma- tai lymfoblas-toidifuusiopartnerin kanssa. Esim. EBV-muunneltu B lymfosyytti, joka erittää anti-IdAb:n voidaan fuusioida 30 esim., ihmisen lymfoblastoidisolulinjaan KR-4. Halutut hybridoomat voidaan sitten valita hypoksantiini-amino-pteriini-tymidiini-väliaineessa, joka sisältää ouabaii-nia, joka eliminoi parentaalisolut. Hybridoomat testataan spesifisen vasta-ainetuoton suhteen. Positiiviset 35 hybridit kloonataan, kloonataan uudelleen, kasvatetaan bulkkiviljelmässä tai immuunisuppressoidun imettäväisen vatsaontelossa (esim. paljas hiiri), kts. esim. Kotzbor 18 87734 et ai., (1982) Proc.Natl. Acade. Sei. USA 79:6651-6655.

Esimerkki 2 - Rabis-virusvasta-aineet

Anti-idiotyyppisen vasta-aineen valmistus 5 Esimerkissä tutkittiin anti-idiotyyppisen vasta-aineen (anti-IdAb), joka oli tehty erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vastaiseksi, kykyä rekonstruoida rabies viruksen glykoproteiinin (G) epi-tooppeja. Tämä G aikaansaa monia rabies viruksen biolo-10 gisia ominaisuuksia, joihin kuuluu viruksen neutraloivien vasta-aineiden (VNA) induktio. Tarkkaa G:n kohtaa, joka aiheuttaa tämän toiminnon, ei ole vielä tiedetty. Funktionaalinen epitooppialusta rabies viruksen G altistus virusstandardille (CVS), challenge virus stan-15 dard, joka ehdottaa ainakin kolmea ensisijaista antigeenistä paikkaa tyyppispesifiselle VNA:lie, on kuvattu Lafon et ai., (1983) J. Gen. Virol. 64:843-851.

Viisi anti-G mAb valittiin suuresta hybridoo-majoukosta niiden isotyypin perusteella (mahdollistaen 20 puhdistuksen proteini-A-Sepharose kromatografian avulla) ja rabies viruksen G sitoutumispaikan perusteella, kuten on määritelty funktionaalisen epitooppisen alustan avulla. Anti-rabies virus G mAb'n 509-6, 101-1, 507-1 ja 719-3 on kuvattu aiemmin: Lafon et ai., supra; 25 Wiktor et ai., (1980) J.Exp. Med. 152:99-112. Nämä mAb:t, jotka neutraloivat voimakkaasti rabies viruksen infektiivisyyttä, omaavat seuraavat ominaisuudet: 509-6 (epitooppikartta paikka I; IgG2a), 101-1 (epitooppi-kartta paikka Hb; IgG2a), 507-1 (epitooppikartta paik-30 ka Illb; IgGl) ja 719-3 (epitooppikartta paikka Ile; IgG2a). Anti-G mAb 1104-2(IgGl) saatiin fuusioitaessa splenosyytit rabies-viruksella immunisoiduista BALB/c hiiristä sekä P3x63Ag8 hiiren myeloomasolujen muunnos 653, Kearney et ai., (1979) J. Immunol. 123: 1548-1550, 35 kuten on kuvannut Wictor et ai., (1978) Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 75:3938-3942. Anti-G-erittävät hybridoo-masolut valittiin, kloonattiin rajoittavalla laimennuk- 19 87 734 sella, ja askiitti-liuokset valmistettiin, kuten on kuvannut Wiktor et ai., (1978), supra. 1104-2 mAb valittiin, koska se havainnollisti erinomaisesti sitoutumista ERA-virukseen, mutta huonosti neutraloin-5 tia. Anti-rabies-virus nukleokapsidi mAb 515-3 (IgG2a) ja 389-1 (IgGl) eristettiin samanlaisella tekniikalla Kelev virus-immunisoiduista BALB/c hiiristä.

Kantoja ERA ja CVS käytetyistä rabies-viruksista kasvatettiin BHK 21 soluissa standardimenetelmil-10 lä, kts. Wiktor et ai., Laboratory Techniques in Rabies, s. 101-123 (M. Kaplan & H. Koprowski 3 rd. ed.- 1973). Rabies antigeeniset muunnokset ERA RV194-2 ja RV509-6 on kuvattu ja ne edustavat viruksia, jotka ovat resistenttejä anti-G mAb 194-2 ja 509-6 neutraloinnil-15 le, kts. Dietzschold et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:70-74. Rabies-liukoinen glykoproteiini (Gs) puhdistettiin virion-puuttuvista viljelmäliuoksista immunoadsorbenttikromatografisesti, kuten on kuvannut Dietzschold et ai., (1983) Virology 124:330-337.

20 Kaikki anti-G mAb puhdistettiin askiittines-

teistä. Isotyypin IgG2a vasta-aineet laimennettiin noin suhteessa 1:30 Britton-Robinson puskurilla (BRB), pH

8,0, kts. Gerhard et ai., Monoclonal Antibodies, s. 317-333 (R. Kennett, T. McKearn & K. Bechtol 1980). mAb 25 BRB-puskurissa annettiin kulkea läpi Nalgene 0,45 u suotimen ja sitten läpi proteiini A-Sepharose 4B ab-sorptiokolonnin (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Kolonni pestiin 30 ml puskurilla BRB, pH 8,0 ennenkuin vasta-aine eluoitiin puskurilla BRB, pH 3,0. Anti-G mAb iso-30 tyypistä IgGl saostettiin ensin natriumsulfaatilla loppukonsentraatiossa 18% (w/v). Ig-fratktio liuotet tiin ja dialysoitiin puskurissa BRB, pH 8,0 ja johdettiin sitten läpi proteiini A-Sepharose kolonnin kuten edellä. Ig, joka oli eluoitu kolonnista, määrätettiin 35 radioimmunologisella menetelmällä (RIA) käyttäen ERA-virusta antigeeninä, kts. Dietzschold et ai., (1982) J. Virol. 44: 595-602. Vasta-aineet konsentroitiin 20 87734 tyhjiödialyysillä fosfaatti-puskuroitua suolaliuosta vasten, pH 7,4 (PBS). Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen härän seerumin albumiinia standardina, kts. Bramhall et ai., (1969) Anal Biochem. 31: 146-148.

5 Anti-IdAb valmistettiin, kuten on kuvannut

Staudt et ai., (1983) J. Exp. Med. 157: 687-704. Lyhyesti, naaraspuolisille Uusseelantilaisille valkeille kaniineille annettiin ihonalaisia 300 ug proteiini A-Sepharose-puhdistettua mAb, joka oli emulsifioitu 10 Freund'n täydellisessä liuoksessa (FCA), ruiskeita eri paikkoihin pitkin nisiä. Kaksi lihastensisäistä 100 ug vasta-ainetehostetta PBS:ssa annettiin 7 ja 30 päivän kuluttua ja seerumi kerättiin 10 päivää myöhemmin. Jokainen anti-idiotyyppinen antiseerumi tehtiin spesifi-15 seksi idiotyyppistä aluetta varten johtamalla se läpi Sepharose 4B kolonnin, johon oli yhdistetty joko mAb 515-3 (IgG2a) tai 389-1 (IgGl) anti-isotyyppisen Ab:n poistamiseksi. Effluentti kolonneista sisälsi vasta-aineet, jotka ovat reaktiivisia idiotyyppisten determi-20 nanttien kanssa. Vasta-aineet tiettyjä alueita varten eluoitiin mAb 515-3 ja 389-1 immunoadsorbenttikolon-neista 0,1 M dietyyliamiinilla, pH 11,5. IgG kustakin antiIdAb:sta eristettiin proteiini A-Sepharos kromato-grafisesti, kuten yllä. Kolonnin effluentin reaktiivi-25 suus eiidiotyyppisten determinanttien kanssa oli nega-: tiivinen.

Anti-idiotyyppisten vasta-aineiden karakteri- ‘ sointi

Edellä valmistetun anti-IdAb:n spesifisyys ja 30 ristireaktiivisten idiotyyppien olemassaolo eri anti-G mAb:n yhteydessä määritettiin kutakin anti-IdAb valmistetta varten RIA:ssa.

Kiinteäfaasi RIA käytettiin mittaamaan anti-IdAb: n sitoutuminen kiinteään mAb. Yksittäiset mAb 35 laimennettiin riippuen askiitti-nesteen konsentraatios-ta karbonaatti- bikarbonaatti puskurissa, pH 8,9, seu-: raavasti: 509-6 (1:3000), 101-1 (1:6000), 719-3 2i 87734 (1:6000), 507-1 (1:6000) 1104-2 (1:16000). Sitten 25 ui kutakin näytettä lisättiin polyvinyylimikrotiitterile-vyjen koloihin (Dynatech Laboratories). Näiden vasta--aineiden annettiin kuivaa koloihin inkuboimalla yli 5 yön, 37°C. Vapaita sidospaikkoja koloissa blokattiin ainakin 1 h ajan 10 % agamma hevosen seerumilla (GIBCO Laboratories) PBC:ssa ja 0,08 % natriumatsidilla (PBSN). 25 ui antiIdAb:n laimennos lisättiin, ja 1 h huoneenlämpötilassa jälkeen levyt pestiin voimakkaas-10 ti. Sitoutunut anti-IdAb määritettiin lisäämällä 25 ui 125 (30 000 cpm) I vuohen anti-kaniini IgG (Cappel Laboratories), joka oli leimattu jodogeenisella menetelmällä, ja inkuboitiin lisäksi tunnin ajan huoneenlämpötilassa, kts. Markwell et ai., (1978) Biochemistry 17: 15 4807-4817. Kaikki anti-IdAb tai radioleimatun koettimen laimennukset tehtiin 10% agamma hevosen seerumiin PBSN:ssa. Levyt pestiin puhtaaksi sitoutumattomasta koettimesta ja yksittäisiin koloihin sitoutunut radioaktiivisuus määritettiin gammalaskimessa.

20 Kunkin anti-IdAb valmisteen titraustulokset homologista ja heterologista mAb:a vastaan osoittivat, että jokainen anti-Id Ab oli spesifinen sen homologi- · seen IdmAb nähden.

*. Idiotyypplsen vasta-aineen parotooppiin koh- 25 distuvien anti-idlotyyppisten vasta-aineiden määritys

Kilpaileva RIA toteutettiin testaamaan rabies-viruksen G kykyä estää vuorovaikutus IdAb:n ja anti-IdAb:n välillä, kts. Chaflin et a., (1974) J. Immunol. 30 112:1747-1756; Sher et ai., (1972) J. Immunol.

109:176-178.

Rabies Gg:a käytettiin kilpailevana antigeeni-: na. Esititrattuja mAb:n tasoja inkuboitiin sarjalla Gs:n kaksinkertaisia laimennuksia 1 h ajan ennen standardi-35 soidun anti-IdAb liuoksen lisäämistä. Sidotun anti-see-·* rumin määrä määritettiin sitomalla I-leimattu vuohen- anti-kaniini vasta-ainekoetin. Kolmen sitoutuminen vii- 22 87734 destä anti-IdAb:sta niiden vastaavaan anti-G mAb:aan (509-6/ 507-1 ja 1104-2) inhiboitui Gs:lla. Maksimaalinen inhibitio vaihteli 20-50 %:sta niin paljon kuin 6 ug/ml Gs, mutta ainakin 15 % vähennys havaittiin niin 5 pienellä määrällä kuin 0,75 ug/ml Gs. Kyvyttömyys inhiboida täysin anti-IdAb:n sitoutuminen osoitti sen, että sekä rakenne- että parotooppikohdan erityisominaisuudet olivat läsnä kolmessa polyklonaalisessa anti-Id seerumissa. Tämä varmistettiin anti-IdAb:n reaktiivi-10 suuden Western täpläanalyysillä mAb:11a, joka oli liuotettu natriumdodesyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesiin (SDS-PAGE) pelkistävissä ja ei pelkistävissä olosuhteissa. Koska antigeenin yhdistävä paikka eliminoituu mAb pelkistyksellä, anti-IdAb:n reaktiivi-15 suus pelkistetyllä mAb:11a osoitti spesifisyyden raken-nedeterminanteille. Anti-IdlO1-lAb:n tai anti-Id719-3Ab:n merkittävän Gs aiheuttaman sitoutumisen puuttuminen viittaa siihen, että parotooppisia spesifisyyksiä on vähän tai ne puuttuvat näistä seerumeista. 20 Anti-(anti-idiotvyppisen) vasta-aineen valmis tus

Seuraavat esimerkit havainnollistavat sitä, että anti-IdAb, joka on reaktiivinen anti-IGmAb:n antigeenin yhdistävän kohdan kanssa, sisältää alapopulaa-25 tion, mikä jäljittelee virusepitooppia, jonka tämä an-ti-GmAb tunnistaa, ja voi aiheuttaa immunoligisen vasteen G:lie.

Neljän ICR hiiren ryhmiin rokotettiin ihonalaisesti 40 ug/hiiri proteiini A-Sepharose puhdistet-30 tua anti-IdIgG:aa emulsifioituna FCA:ssa. Ihonalaiset tehosteet annettiin 7 ja 32 päivän kuluttua; kukin 40 ug anti-IdIgG:aa Freund'n epätäydellisessä adjuvantis-sa. Viisi päivää seuraten viimeistä tehostetta eläimiltä otettiin verinäytteitä retro-orbital-plexus'n 35 kautta, ja saadut seerumit analysoitiin rabies-virus neutraloivan vasta-aineen (VNA) suhteen. Vertailunäyt-teenä toinen ryhmä hiiriä sai proteini A-Sepharose 23 87734 puhditetun normaalin kaniini IgG immunisaation.

VNA tasot immunisoiduissa hiirissä määritettiin nopea-fluoresenssi-fokus-inhibitiotestin modifikaatiolla, kts. Smith et ai., Laboratory Techiques in 5 Rabies, s. 354-357 (M. Kaplan et H. Koprowski 3rd ed. 1973). Sarja kaksinkertaisia laimennuksia hiirien seerumista valmistettiin Microtiter II-levyillä (Falcon Plastics) (50 ul/kolo) ja inkuboitiin 1 h ajan lämpötilassa 37°C yhtä suurella määrällä virusta, sisältäen 104 10 PFU/50 ui. Inkuboinnin jälkeen 50 ui juuri trypsinisoi-tuja BHK-21 soluja (2 X 106 solua/ml) lisättiin jokaiseen koloon, sekoitettiin, ja 10 ui seerumi-virus-so-lu-seosta siirrettiin (kahdennettuna) Terasaki levyjen (Falcon Plastics) koloihin. 20 tunnin inkuboinnin jäl-15 keen levyt pestiin ensin PBS:lla ja sitten 50 % (w/v) asetonilla tislatussa vedessä ja kiinnitettiin 30 min 80% asetonissa huoneen lämpötilassa. Levyt kuivattiin ja solut värjättiin 30 min lämpötilassa 37 oC 5 ul/kolo kaniinialkuperää olevalla, fluoreseiini-konjugoidulla 20 antirabies nukleokapsidi vasta-aineella, kts. Wiktor, (1974) Symp. Series Immunolobiol. Standard 21: 102-118. Kontrollikolot (sisältäen virusta mutta ei vasta-ainetta) osoittivat, että noin 40 % soluista sisälsi rabies-virukselle spesifisiä inkluusioita. Vi-25 rusten neutralisoinnin loppupiste määritettiin kään-teislukuna (reciprocal) korkeimmasta seerumin laimennuksesta, joka oli kykenevä vähentämään rabies-viruksen tartuttamien solujen lukumäärää 50%.

Nopean fluoresenssi-fokus-inhibitiotestin 30 tulokset on esitetty taulokossa alla. Merkittävä VNA-tiittereitä muodostui ERA kannan rabies-viruksia vastaan hiirissä, jotka oli immunisoitu anti-Id509-6Ab:11a ja anti-Id 1104-2Ab:11a. Kolme muuta anti-(anti-Id)Ab eivät neutraloineet ERA-virusta. Vertailunäytteet 35 osoittivat, että hiiren anti-(normaali kaniinin IgG)Ab samaten kuin anti-IdAb, joita käytettiin immunointiin, eivät omanneet rabies-virusta neutraloivaa aktiivisuut- 24 87734 ta. Lisäksi anti-(anti-Id509-6) seerumin esi-inkubointi antiId509-6Ab:11a poisti neutralointiaktiivisuuden. Esi-inkubointi normaalilla kaniinin seerumilla ei kuitenkaan aiheuttanut tätä.

5 Muodostuneen VNA:n spesifisyyden testaamiseksi käytettiin muita rabies-viruksia neutralointikokeessa. Sekä mAb 509-6 että 1104-2 sidotun rabies-viruksen CVS-kanta (tuloksia ei esitetty), ja taulukko osoittaa, että CVS neutraloitui sekä anti-(anti-Id 509-6) seeru-10 millä että anti-(anti-Id 1104-2) seerumilla. Toisaalla ERA-viruksen muunnos, RV 509-6, joka sisälsi mutaation epitoopissa 509-6, johtaen mAb 509-6 sitoutumisen tai neutralointiaktiivisuuden menettämiseen, kts. Laton et ai., (1983) J. Gen. Virol. 64: 843-851, ei neutraloi-15 tunut anti-(antl-Id 509-6) seerumilla. Toinen neutralointi-resistenssi muunnos, RV 194-2 neutraloitui tehokkaasti anti-(anti-Id 509-6) seerumilla. Aikaisemmat tulokset osoittavat sen, että anti-G mAb 509-6 ja 194-2 tunnistamat antigeeniset kohdat ovat täysin riippumat-20 tornia, kts. Laton et ai., supra. Nämä tulokset osoittavat sen, että anti-(anti-Id 509-6) seerumi reagoi . . pelkästään epitoopin kanssa, jonka tunnistaa anti-G mAb 509-6 ja täten tätä epitooppia on simuloinut anti-Id 509-6Ab.

25

Rabies-virus-kantojen neutralointi anti-(anti-Id) seerumilla +

Hiirien antiseerumi ERA CVS

kanta RV 509-6 RV 194-2 kanta 30 Normaali kani IgG 4444 anti-Id 509-6 32 4 64 64

anti-Id 101-1 4 ND++ ND ND

anti-Id 179-3 4 ND ND ND

anti-Id 507-1 4 ND ND ND

35 anti-Id 1104-2 128 4 128 64 RIG+++ 16 16 32 32 25 87734 + Käänteisarvo (reciprocal) seerumin korkeimmas ta laimennuksesta, joka on kykenevä vähentämään infektoituneiden solujen lukumäärää 50 %, otettiin neutralointi ti itteriksi 5 ++ Ei tehty *++ Ihmisen anti-rabies Ig laimennettiin 0,2 kan sainväliseen yksikköön per ml, ja sarja kaksinkertaisia laimennuksia inkuboitiin rabies-viruksen kanssa.

10 Yllä esitetyt esimerkit on esitetty vain ha vainnollistavassa tarkoituksessa ja niitä ei ole tarkoitettu rajoittamaan keksintöä, joka on määritelty patenttivaatimuksissa.

Claims (4)

26 87734

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistamiseksi, 5 jotka on tarkoitettu aikaansaamaan immunologinen vaste kiinteille kasvaimille tai rabies-viruksille, tunnettu siitä, että menetelmässä (a) anti-idiotyyp-pisiä vasta-aineita tuotetaan immortaalin B lymfosyytin avulla, tai (b) annetaan kiinteän kasvaimen vastaista 10 tai rabies-viruksen vastaista vasta-ainetta heterolo-giselle isännälle ja eristetään ja puhdistetaan halutut anti-idiotyyppiset vasta-aineet isännän seerumista; jolloin anti-idiotyyppiset vasta-aineet identifioivat epitoopin, joka on kiinteän kasvaimen vastaisen tai 15 rabies-viruksen vastaisen vasta-aineen parotooppi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat monoklonaalisia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että anti-idiotyyppiset vasta- aineet ovat polyklonaalisia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettävä immortaali B lymfosyytti on hybridooma. 27 87734