KR910001127B1 - 종양 및 비루스에 대한 면역반응을 유발하는 항-이디오타입항체 함유조성물 - Google Patents

종양 및 비루스에 대한 면역반응을 유발하는 항-이디오타입항체 함유조성물 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
종양 및 비루스에 대한 면역반응을 유발하는 항-이디오타입항체 함유조성물
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 항원, 특히 종양과 비루스에 대한 면역반응의 유발에 관한 것이다. 더욱 상세히, 본 발명은 그와같은 면역반응을 유발하는 항－이디오타입 항체(anti-idiotype antibodies)와 이 항체를 사용하는 방법 및 이를 생산하는 셀라인에 관한 것이다.
[본 발명의 배경]
면역글로불린(Ig)의 중쇄(H－사슬)와 경쇄(L－사슬)의 가변부(VH)와 (VL)의 아미노산 서열은 항원결합 부위(즉, 파로토프-parotope)에서 그 항체와 특이항원과의 상호작용을 가능하게 하는 구조를 제공한다.
Ig를 이형의 숙주 동물에 주사하면 항-제노타입(anti-xenotype, 종에 대해 특이적인), 항-이소타입(anti-idiotype, 항체가변부에 대해 특이적인)항체가 생산된다.
항－이디오타입 항체는 기능적으로 두가지로 분류할 수 있는데, 그중 하나는 파로토프와 반응하며 다른 하나는 VH및/또는 VL프레임워크(프레임워크 결정인자)와 반응한다. 참조. Geha(1981) N.engl.J.Med. 305 : 25－28 ; Jerne, (1974) Ann. Immunol.(Paris) 125C : 373-389.
[본 발명의 개요]
본 발명의 목적은 종양, 특히 충실성 종양 및 비루스, 예를들면 광견병 비루스에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 그와같은 면역반응을 유발하기 위해 항－이디오타입 항체를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 종양, 특히 충실성 종양 및 광견병 비루스와 같은 종양 및 비루스에 대한 면역 반응을 유발하는데 있어서 유용한 모노크로날 항－이디오타입 항체 및 그 항체의 영구증식성 B임파구 원(immortal B lymphocyte sources)을 제공하는 것이다.
하기의 구체적인 설명에 의해 본 발명의 상기 목적들 및 기타 목적들이 이루어진다.
구체적 일례로서, 본 발명은 (a) 항－이디오타입 항체에 의해 동정된 에피토프(epitope)가 항－종양 또는 항－비루스 항체의 파로토프인 상기 항 이디오타입 항체를 제공하고; (b) 인체에 상기 항－이디오타입 항체를 투여하여 종양세포 또는 비루스 입자상의 에피토프를 동정하는 항－(항－이디오타입) 항체의 생산을 자극시키는 것으로 구성된 종양 또는 비루스 항원에 대한 면역반응을 유발하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항－이소타입 항체가 실질상 거의 없는 폴리크로날 항－이디오타입 항체를 제공하는데, 이 항－이디오타입 항체에 의해 동정되는 에피토프는 항－종양 또는 항－비루스 항체의 파로토프이다.
또 다른 구체적 실례로서, 본 발명은 항－이디오타입 항체를 생산하는 영구증식성 B 임파구를 제공하는데, 상기 항－이디오타입 항체에 의해 동정되는 에피토프는 항－종양 또는 항－비루스 항체의 파로토프이다. 본 발명은 또한, 다른 항체가 실질상 거의 없는 상기의 불멸의 임파구에 의해 생산되는 모노크로날항체를 제공한다.
적합한 종양은 충실성 위장 종양(gastrointestinal tumors)과 같은 충실성 종양이다. 적합한 비루스는 인플루엔자, 헤르페스, 심플렉스, 헤파티티스가 포함되며 특히 광견병 비루스가 포함된다.
본 발명에 의한 항－이디오타입 항체를 포유동물, 특히 인체와 같은 피검체에 투여하면, 그 피검체는 종양세포 또는 비루스 입자상의 에피토프를 동정하는 항－(항－이디오타입)항체를 생산하도록 자극된다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 암 치료 및 비루스 면역법에 대한 독특한 접근 방법을 제공한다. 종양치료의 전통적인 방법은 그 종양을 파괴하기 위한 노력으로 환자에 항－종양항체(즉, 충실성 종양 세포상의 에피토프를 동정하는 항체)를 투여하는 것으로 이루어져 왔다. 그러나, 본 발명자들은 환자자신의 종양 또는 비루스에 대한 면역반응이 종양 또는 비루스 항원을 인식하는 항체에 대하여 항－이디오타입인 항체를 사용하여 유발될 수 있음을 발견하였다. 이 면역 반응의 유발은 치료 및 최소한 비루스 경우에 있어서는 예방치료면에서 유용성이 있다.
본 발명자들은 이 작용성에 관해 특정 이론에 의해 이런 반응이 이루어질 것으로 생각한 바는 없었으나 본 발명에 의하여 이루어지는 면역반응은 항－이디오타입 항체 분자와 사람 환자의 면역시스템간의 상호작용에 기인한 것으로 간주된다.
항－이디오타입 항체 분자의 이디오타입부위(즉, 가변부)는 피검체에 의해 항원으로 인식되는 항원성 결정인자(즉, 에피토프)를 포함하고 있다. 이것은 피검체에 의한 항－(항－이디오타입)항체의 생산을 유발시킨다. 항－(항－이디오타입)항체내에는 항－이디오타입 항체의 파로토프에 직접 상보적인 곳이 존재한다. 또한 항－이디오타입 항체의 파로토프는 이디오타입 항체에 의해 동정되는 (즉, 선택적으로 결합되는)종양세포 또는 비루스 에피토프의"내부"이미지(image)를 표시하고 있으므로, 이 항－(항－이디오타입)항체가 또한 종양 또는 비루스 항원과도 결합할 것이다. 실제로 본 발명의 방법은 종양 또는 비루스 항원과 거의 구별되지 않는 환자가 생산한 일부분의 항체를 항원(항－이디오타입 항체의 파로토프)으로 제공함으로써 종양 또는 비루스에 대한 면역반응을 유발한다.
놀랍게도, 상기 방법은 종양의 생장을 제어하거나 비루스에 대한 면역반응을 유발하는 효과적인 방법이다. 또한, 상기 방법은 종래의 접근 방법에 비하여 몇가지 장점을 가진다.
첫째로, 훨씬 적은 이질성(foreign) 항체가 환자에 투여된다.
둘째로, 환자의 항－이디오타입 반응은 소정 효과에 손상을 주기보다는 오히려 유익하다.
셋째로, 환자자신의 항체가 항－종양 또는 항－비루스 항체이므로 외인성(exogeneous) 항－종양 항체를 반복 투여할 필요성이 제거된다. 그 밖의 장점들은 본 기술분야의 숙련가들에게는 용이하게 인지될 수 있을 것이다.
항체의 이디오타입이란 그 항체분자의 가변부 또는 이디오타입 부위내에 있는 특이항원성 결정인자들로 정의된다.
이들 이디오타입 결정인자들중 일부는 항체의 파로토프상에 존재하거나 또는 그 파로토프와 인접하게 회합되어 있으며 그 외에는 가변부의 프레임 위크내에 존재할 것이다. 각 항체는 그 자신의 이디오타입을 가지지만 하기에서는 특정 항체들을 다음의 용어로써 표현한다."이디오타입 항체" 또는 Id Ab"는 항－종양 또는 항－비루스 항체를 표시한다. (즉, 그 이디오타입 항체로 동정되는 에피토프는 종양 세포 또는 비루스 입자상에 존재한다.)
"항－이디오타입 항체" 또는 "항－Id Ab"는 상기 이디오타입 항체의 가변부내에 있는 에피토프를 동정하는 항체를 말한다.
그와같은 항체중 일부는 이디오타입 항체의 파로토프인 에피토프를 동정할 것이며, 따라서 종양 세포상의 이디오타입 항체에 의해 동정되는 에피토프의 "내부" 이미지가 제공된다.
"항－(항－이디오타입)항체" 또는 "항－(항－Id)Ab"는 상기 항－이디오타입 항체의 가변부 내의 에피토프를 동정하는 항체이다. 항－(항－이디오타입)항체들의 일부분은 (i) 항－이디오타입 항체의 파로토프와 (ⅱ) 종양세포상의 에피토프에 해당하는 에피토프를 동정할 것이다.
하기에서는 본 발명의 방법에서 숙주에 항－이디오타입 항체를 투여하는 것을 고찰하기로 한다. 상기항－이디오타입 항체는 어떠한 생리학적으로 적합한 담체(예.멸균, 무 발열질 생리적 식염수)내에 가해, 이를 숙주에 투여하며, 이 같은 제제들은 본 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 것들이다. 담체의 선택은 중요한 것이 아니며 상기 항체는 그 항체를 순환계로 유입시키는 어떠한 방법에 의해서도 투여될 수 있다(예. 정맥, 근육내, 또는 피하주사).
숙주는 어떠한 포유동물이어도 무방하며, 인체가 가장 일반적이고, 비루스의 경우에는 개 또는 고양이가 포함될 수 있다. 숙주에 투여되는 항체의 양은 예컨대 사용된 특정 항체 및 접종될 환자에 따라서 변화될 수 있다.
단 환자의 면역계에 의한 항－(항－이디오타입)항체의 생산을 자극하기에 충분한 양의 항－이디오타입 항체가 투여될 필요가 있다. 그러나, 면역반응을 유발하는데에 필요한 양은 대단히 소량이므로 많은 양의 항체가 투여될 필요가 없다. 많은 경우에 있어서, 수마이크로그람 내지 수 밀리그람 범위의 항체 투여분이면 충분하다(즉 약 50－200㎍ 내지 약 1－5㎎). 적절한 투여량은 본 기술 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
일례로서, 충실성 종양(즉, 암, 육종, 흑종 등에 의해 유발되는 것과 같은 악성종양의 고화응어리로서 류케미아스와 같이 분산상태로 순환하는 악성 세포와는 반대의 개념)과 같은 종양에 대한 면역반응을 유발시키기 위해 인체 환자에 항－이디오타입 항체 함유 제제를 투여하는 것을 본 발명에서는 고찰하기로 한다.
바람직한 예로, 상기 종양은 위장 종양이 있다. 상기 정의한 바와같이, 항－이디오타입 항체의 한 아강(subclass)은 선택적으로 항－종양항체(이디오타입 항체)의 파로토프에 결합한다(즉, 그 파로토프를 동정한다). 항－이디오타입을 함유하는 제제는 또한 숙주에 투여될 수 있는데, 이 항－이디오타입 항체의 파로토프는 비루스 항원의 내부이미지이다.
상기 항체는 해당 이디오타입 항체의 파로토프인 에피토프를 인식한다. 종양이나 비루스 항원의 내부 이미지를 제공하는 항－이디오타입 항체는 몇가지 방법에 의해 이디오타입 항체의 가변부내의 프레임워크 결정인자를 인식하는 항－이디오타입 항체와 구별될 수 있다. 목적하는 항－이디오타입 항체를 동정하는 한가지 방법은 종양 또는 비루스 항원(또는 입수용이하다면합텐), 이디오타입 항체 그리고 항－이디오타입 항체간의 경쟁적 결합분석법(competitive binding assay)이다. 상기 항원이 상기 이디오타입 항체에 대한 항－이디오타입 항체의 결합을 차단한다면, 상기 항－이디오타입 항체에 의해 동정되는 에피토프는 이디오타입 항체의 파라토프와 인접하게 회합된 것이다. 다른 방법은 항－이디오타입 항체에 대한 항혈청이 또한 항－종양 또는 항－비루스성인지를 결정하는 것이다. 이들 및 그밖의 특정 항－이디오타입 항체의 동정법은 본 기술분야의 공지된 방법들이다.
숙주에 투여되는 제제에 있어서, 이디오타입 항체의 파로토프에 대해 지시된 항－이디오타입 항체의 아강을 포함하는 프레임워크 결정인자에 대해 지시된 항－이디오타입 항체의 봉입체가 허용될 수 있다. 그 제제는 상기 이디오타입 항체의 파로토프에 대해 지시된 아강을 함유할 필요가 있다. 사용되는 항－이디오타입 항체는 숙주에 대하여 동형이거나 또는 이형일 수 있다. 그러나 인체에 대해 바람직한 항체는, 그 항체분자의 불변 부위에 대한 면역반응을 최소로하는 인체항체이다. 그러나 본 발명에서는 비교적 적은량의 항－이디오타입 항체가 요구되므로, 이형의 항체가 사용될 수 있다(예.마우스, 레트, 염소, 토끼등). 그러나 이형의 항－이디오타입 항체에 대한 어떤 중요한 반응이 없을 때에만, 그와 같은 항체는 제조의 용이성 및 비용면에서 바람직할 수 있다. 또한 모노크로날 항－이디오타입 항체 뿐만 아니라 폴리크로날 항－이디오타입 항체가 사용될 수 있다.
폴리크로날 항－이디오타입 항체는 본 기술상의 공지 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예컨대, 폴리크로날 항－Id Ab는 동물을 모노크로날 항－종양항체 또는 항비루스 항체(즉, Id Ab)로 면역시켜 생산할 수 있다.
면역동물은 항－Id Ab를 생산할 것이다.
항－혈청내의 상기 항－이디오타입 항체의 아강은 항－종양 또는 항 비루스 항체의 파로토프인 에피토프를 동정할 것이다. 동물에서 수취된 항－혈청은 예컨대(i)이 항－혈청으로부터 항－이소타입 항체를 제거하기 위하여, 상기 모노크로날 Id Ab와 이디오타입은 다르지만 이소타입은 동일한 고정된 항체, 그리고(ⅱ)종양 또는 비루스 항원의 내부 이미지를 나타내는 항－Id Ab아강을 제거하기 위하여 고정된 모노크로날 Id Ab을 사용해 순차적으로 흡수함으로써 정제될 수 있다. 그후 상기 항－Id Ab를 그 결합된 모노크로날 항－종양 또는 비루스 항체로부터 용출시켜 항－이소타입 항체가 실질상 없는 용액을 제공한다.
그후 이 용액은 Id Ab의 파로토프를 동정하는 항－Id Ab가 존재하는지에 대해 피검될 수 있다. 다른 항체가 실질상 없는 모노크로날 항－이디오타입 항체는 영구증식성 B 임파구의 순수 배양체의 상청액으로부터 분리될 수 있다.
"영구증식성 B 임파구"란 비루스(예. Epstein－Barr virus) 또는 종양원성 DNA에 의해 형질변환된 정상 임파구 및 하이브리도마(정상 및 악성 종양 임파구의 체세포 하이브리드)와 같이, 몇달간의(바람직하게는 무한정)배양에서 유지될 수 있는 비교적 안정하고 연속적인 항체－생산성 세포를 포괄하여 일컫는 것이다.
항－이디오타입 항체를 생산하는 정상의 B 임파구로부터 영구증식성 B 임파구를 제조하는 방법은 본 기술 분야에 공지된 것이다.
참조예. Monoclonal Antibodies(R.H.Kennett, T.J.Mckearn ＆ K.B.Bechtol 1980); M.Schreier 등의 Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory(1980); Monoclonal Antibodies and T－Cell Hybridomas(G.J.Hammerling, U.Hammerling ＆ J.F.Kearney 1981); Kozbor 등의 (1982) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 79 : 6651－6655 ; Jonak 등의 (1983) Hybridoma 2 : 124 ; Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines(R.H.Kennett. K.B.Bechtol ＆ T.J.Mckearn 1983) ; Kozbor 등의 (1983) Immunology Today 4 : 72－79.
항 Id－Ab를 생산하고 영구증식성 B 임파구 제조에 적합한 정상의 B 임파구는 기술상 공지된 여러 가지 방법에 의해 제공될 수 있다. 예컨대, 레트 또는 마우스와 같은 동물을 모노크로날 항－종양 또는 항－비루스 항체로 면역시키고, 항－Id Ab를 생산하는 B 임파구를 상기 동물의 비장으로부터 회수한다. 항－Id Ab를 생산하는 인체 B 임파구는 모노크로날 항－종양 또는 항－비루스 항체로 환자를 면역시키고, 이 환자로 부터 말초혈액 임파구를 수거한 후 모노크로날 항－종양 또는 항－비루스 항체로 B 임파구 배양체를 자극함으로써 실험적으로 항－Id Ab를 생산하는 B 임파구의 생장을 유발시켜 얻을 수 있다.
참조예. DeFreites 등의 (1982) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 79 : 6646－6650. 그렇게 함으로써, 항－Id Ab를 생산하는 동물 또는 인체의 B 임파구가 회수되고 기술상 공지된 방법으로 영구증식시킬 수 있다.
물론, 종양세포 또는 비루스 항원의 내부 이미지를 제공하는 항－Id Ab를 생산하는 임파구들은 이디오타입 주위내의 프레임워크 결정인자에 대해 지시된 항－Id Ab를 생산하는 B 임파구와는 구별됨을 알 수 있다.
종양에 대한 본 발명의 방법은 또한 미합중국특허 제 4,108,983호에서 기술된 바와 같은 비루스의 종양세포용해질 백신의 사용과 같은 종양에 대한 면역반응을 유발하는 다른 방법과 함께 실시될 수 있다. 비루스와 관련하여 필요하다면, 비루스에 대해 숙주 포유동물에서 얻어진 면역반응은 상술한 항－Id Ab의 투여외에도 통상의 비루스 백신을 사용한 면역에 의하여 더욱 보강될 수도 있다. 항－Id Ab의 투여외에도 통상의 비루스 백신을 사용한 면역에 의하여 더욱 보강될 수도 있다. 항－Id Ab를 투여함으로써 항－(항－Id)Ab의 생산이 숙주 포유동물에서 자극된 후(예, 투여 약 2주일 후), 본 기술분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 비루스 백신(HDC 광견병 백신과 같은 사멸된 비루스 백신)을 상기 숙주에 접종한다. 참조 Plotkin등의(1976) Am.J.Epidemiology 103 : 103 : 75－80 ; Wiktor 등의 Rabies Vaccine for Human Use : Volume 40 pp. 3－9(1978).
하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한시키려는 것은 아니다.
[실시예]
[종양항체]
[모노크로날 이디오타입 항체]
하기 실험은 인체의 위장암 세포들에 결합하는 마우스의 모노크로날 항체들 17－1A, C42032 와 C41472을 사용하였으며, 그들은 Herlyn등에 의해(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 76 : 1438－1422와 Koprowski에 의해"Monoclonal Antibodies In Vivo,"in "Monoclonal Antibodies in Cancer : Proceeding of the Fourth Armand Hammer Cancer Symposium(B. Boss, R. Langman, I. Trowbridge ＆ Dulbecco 1983)에 공지된 것들이다.
모노크로날 항체(MAb)C42032는 Mr180,160,50 및 40K의 결장직장암(CRC)－결합 항원에 대하여 특이성을 가진다. MAb C4 1472(IgG2a)는 CRC－결합 항원 Mr50K에 대하여 특이성을 가진다. 간염 비루스에 대한 MAb A5C3가 또한 사용되었으며, 이는 Wands 등에 의해(1981) Proc.Natl.Acad.U.S.A. 78 : 1214－1218에 공지되어 있는 것이다. MAb 17－1A(IgG2A, 카파 경쇄=Kappa light Chain)와 C4 2032(IgG2a 카파경쇄)는 Ey 등에 의해 (1978) Immunochemistry 15 : 429－436에 기술된 대로 단백질 A－세파로오즈 칼럼(Pharmacia, Piscataway. NJ)상의 친화력 크로마토그래피에 의하여 하이브리도마 보유 마우스에서 얻어진 복수로부터 정제되었다.
[환자]
선발된 모든 환자는 전이성 또는 재발성 위장선종암을 가졌으며 Sears 등에 의해(1982) Lancet 762－765에 공지된 방법으로 Bald/c마우스의 복수유액으로부터 농축된 MAb 17－1A의 정제 및 살균처리된 무발열질의 제제를 체계적으로 일회 주사하였다. MAb 17－1A의 정제를 192mg 또는 그 이하로 투여받은 9명의 환자중 7명에게서 항－마우스 글로불린 항체가 생산되었다. 200－1000mg의 모노크로날 항체가 투여된 20명의 환자중 3명의 환자에게서 항－마우스 글로불린 항체가 생산되었다. 항－마우스 글로불린 분자가 생산된 첫번째 그룹의 3명환자(07,08,09번의 환자)의 혈청과 두번째 그룹의 2명 환자(14,23번)의 혈청을 항－이디오타입 항체의 분리를 위하여 스크린하거나 또는 분리처리했다. 피검체 번호 07,08 및 23으로부터 얻어진 항－이디오타입 항체를 분리하기 위해 사용된 혈청은 3명 모두가 최고농도의 항－마우스 글로불린 항체 농도를 나타낼 때 수취한 것이다.
환자번호 08은 일차 주사한지 20개월 후, 130mg의 모노크로날 항체를 이차로 주사하고, 이 이차 주사후에 얻어진 혈청을 항－이디오타입 항체의 존재를 검사하기 위한 스트리닝 테스트에 사용했다.
[폴리크로날 항－이디오타입 항체의 제조]
뉴우질랜드 화이트 래빗을 프로인드의 완전보조제중(Freund's complet adjuvant)에 유탁시킨 300㎍의 정제 MAb 17－1A를 사용해 여러 부위에 피하주사 시키고 30일 뒤에 100㎍의 모노크로날 항체를 근육 주사했다. 이차반응의 10일째의 혈청을 수거한다.
항－혈청을 고정 MAb C42032와 MAb 17－1A상에 흡수시킨다. 정제된 모노크로날 항체들을(각각 30mg)2ml의 Affi－Gel 10(Bio－Rad Laboratories, Richmond, CA)에 결합시킨다. 그후 상기 항－혈청을 MAb C42032와 MAb 17－1A 면역 흡수제상에 순서대로 흡수시켜 항－이소타입과 헝－이디오타입 항체들을 각각 제거시켰다. 흡수된 항체들은 0.1M의 글리신 완충제(pH2.8)를 사용해 용출시킨 즉시 포스페이트 완충제로 중화시키고 포스페이트 완충식염수에 대하여 투석한 후 280nm에서의 흡광도를 측정해 단백질을 정량했다. (
Figure kpo00001
) MAb 17－1A의 일회 주사후에 환자로부터 수취된 항－혈청을 상술한 바와같이 얻어서 정제하였다. 750mg의 MAb 17－1A가 투여된 23번 환자로부터의 혈청과 133mg과 125mg의 MAb 17－1A가 투여된 08번과 07번의 환자로부터의 혈청을 일차 항체 주사후 여러시간에서 수취했다. 방사능 면역 분석법에 의해 항－쥐의 IgG 항체를 함유하는 것으로 나타난 샘플들을 MAb C42032와 MAb 17－1A 면역 흡수제상에 순서대로 흡수시켜 상술한 바와 같이 항－이소타입과 항－이소타입 항체들을 각각 제거했다. 그 혈청으로부터 분리된 항－이디오타입 항체들은125I－라벨된 항－인체 F(ab')2분체에 결합됨으로써 인체 면역 글로불린임이 증명되었다.
혈청 샘플로부터의 항－이디오타입 단백질의 수율은 다양하였다 : 08번으로부터13㎍/ml; 23번으로부터 43㎍/ml. 가장 많은 양은 가장 고농도의 항－마우스 글로불린 항체를 나타냈던 23번 혈청에서 얻어졌다.
[항－이디오타입 항체의 존재에 대한 혈청 스크리닝]
항－이디오타입 항체의 존재에 대해 혈청 샘플을 스크린하기 위하여, 토끼－항－이디오타입 항체 및125I－라벨된 MAb 17－1A와 함께 예비 배양된 4개의 인체 혈청을 사용하여 경쟁 분석법(Competion assay)을 실시했다.
1/4－인치(6.35mm)크기의 폴리스티렌 비이드(Precision Plastic Ball Co., Chicago, IL)를 95% 에탄올로 세번 세척했다. 상기 비이드를 자연 건조시키고, 이를 pH 8.2의 0.02M의 나트륨 테트라보레이트중의 토끼 또는 인체 항－이디오타입 항체의 희석액과 함께 배양시켰다. 가볍게 교반하면서 4℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 상기 비이드를 포스메이트－완충식염수로 세번 세척하고, 그후 2% 송아지 혈청 알부민과 0.04% NaN3를 함유하는 포스페이트 완충 식염수와 함께 실온에서 최소 3시간동안 배양시켰다. 대조용 이디오타입으로서 인체 항－이디오타입 항체의 잠재 제공원과 함께 예비배양시켰던125I－라벨된 MAb 17－1A에 상기 비이드를 노출시켰다. 즉, 상기 인체항－이디오타입 항체의 잠재제공원인 인체혈청들은 Ca++와 Mg++가 없고 2% 송아지 혈청 알부민과 0.04%의 NaN3가 보충된 포스페이트 완충식염수중에 25% 농도로 희석시켰다. 하룻밤 더 배양한 후, 상기 비이드를 세척하고 결합된 방사능 활성도를 감마 계수기로 측정했다. 모노크로날 항체로 1회 주사된 후에 얻어진 혈청중 세가지(번호 23,09와 14)는 프리(pre)－모노크로날 항체 주사 샘플보다 더 높은 MAb 17－1A의 결합 억제치를 나타냈다. 14번 환자의－모노크로날 항체 혈청에 대하여 산출된 결합 억제치는 다른 두개의 혈청에 비해서는 낮은 것이지만, 동일한 피검체의 프리(pre)－모노크로날 항체 노출 혈청의 억제치보다는 높은 것이었다. 모노크로날 항체를 2차 주사받은지 7일 후 08번 환자에서 얻어진 혈청의 억제치는 이미 높은 상태였다.
[항－이디오타입의 검출을 위한 경쟁 분석법]
분리된 항－이디오타입 항체의 모노크로날 항체 C42032, C41472와 A5C3에 대하여 뿐만 아니라, MAb 17－1A에 대한 결합을 측정하기 위하여 상술한 방법과 유사한 방법으로 경쟁 분석법을 실시했다. 그 결과는 세가지 혈청(번호 08,07과 23)으로부터 얻어진 항－이디오타입 항체의 MAb 17－1A에 대한 결합은 세가지 다른 모노크로날 항체에 대한 것보다 현저하게 높다는 것이 나타났는데, 그들 중 두가지(C42032와 C41472)는 또한 결장 직장 암세포상의 항원성 부위를 검출한다. 그러나, 이들 부위들은 MAb 17－1A에 의해 인식되는 부위와는 다르다. MAb 17－1A에 노출하기전의 세가지 모든 피검체의 혈청에서 분리된 면역 글로불린은 약2.5㎍/ml로 농축되어 폴리스티렌 비이드에 결합되었다. 그러나 이들 제제는 피검되는 모노크로날 항체중 어떠한 것과도 결합하지 않았는데, 이는 노출 이전 상태의 혈청중에는 항－이디오타입 항체가 없음을 알려주는 것이다.
[인체 항－이디오타입 항체들간의 교차반응성]
인체 항－Id 혈청들간의 교차반응성이 존재하는가를 측정하기 위하여 경쟁 분석법이 실시되었다. 하기한이 경쟁분석법의 결과는 07번 환자와 23번 환자의 항－이디오타입 혈청들간에 현저한 교차 반응성이 있으며 08번과 23번 환자의 항－이디오타입 혈청들간에는 약간 덜한 편이기는 하나 여전히 상당한 교차 반응성이 나타났다. 유사한 교차반응성이 07번 환자의 항－이디오타입 혈청과 08번 환자의 포스트－모노크로날 항체 혈청사이에서 발견되었다. 이들 결과는 다른 환자들에 의해 만들어진 항－이디오타입 항체들이 동일한 항원성 부위에 대하여 지시된 것임을 나타내고 있다.
Figure kpo00002
[항－이디오타입 항체에 의해 검출된 에피토프]
항－이디오타입 항체가 이디오타입 항체의 파로토프에 대해 지시된 것임을 증명하기 위하여, 인체－항－이디오타입 항체의 MAb 17－1A에 대한 결합에 관한 합텐 억제반응을 실시했다. 결장 직장 암에서 유래된 셀라인인 SW 1222 세포의 3M KCL 추출물을 Herlyn 등의 (1982) J.Clin.Immunol.2 : 135－140에서 기술된 방법대로 제조했다. 그 제조물은 MAb 17－1A와 결합하는데, 이는 그 물질이 가용성 형태로 항원을 함유하고 있음을 나타내는 것이다.125I－라벨된 MAb 17－1A를 CRC 세포추출물 및 MAb 17－1A와 결합하지 않는 흑종세포와 3M KCl 추출물과 함께 배양했다.
그 항체－항원 혼합물을 23번 환자로부터 얻어진 항－이디오타입 항체로 피복된 비이드에 가하고, 그 결합을 방사 라벨된 모노크로날 항체 단독의 결합과 비교했다. 이들 실험들은 소량의 경쟁적 합텐과의 결합에 있어서의 변화를 검출하기 위하여 비－포화량의 요오드화 모노크로날 항체를 사용해 실시했다.
대조를 목적으로, 요오드화 MAb 17－1A와 결합하지 않는 것으로 알려진 흑종 세포로부터의 추출물과 혼합했다. CRC세포 추출물은 0.1 또는 0.5mg/ml의 농도에서 23번 환자로부터 얻어진 항－이디오타입 항체의 요오드화 MAb 17－1A에 대한 결합을 각각 39%와 상기 68% 정도 억제하는 것으로 밝혀졌다. 0.5mg/ml이하의 농도에서 흑종 세포로 부터의 추출물은 상기 모노크로날 항체 결합에 현저하게 영향을 미치지는 않았다.
상기 결합 반응을 합텐이 억제하는 것은 항－이디오타입 항체상에 CRC 에피토프의 "내부 이미지"가 존재함을 나타내는 것이다. 이것은 또한 CRC 세포의 추출물이 항"디오타입 항체에 결합하지 않고 예상대로 MAb 17－1A에 결합했다는 사실로부터 지지된다.
[인체 B 임파구에 의한 항－이디오타입 항－(항－이디오타입)]
[항체의 생산]
MAb 17－1A를 주사한지 각각 20새월과 5개월 후에 08번 환자와 23번 환자로부터 버피코트 세포(Buffy coat cell)를 산출했다. 그 세포들을 DeFreitas 등에 의해(1982), Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 79: 6646－6650에 설명된 대로 실험관내에서 17－1A의 F(ab')2분체 10ng/ml로 자극했다. 그후 7일동안, 세포의 부분 표본들을 2－아미노 에틸이소우로늄 브로마이드로 처리한 양의 적혈구로 로제팅(rosetting)하여 T 세포와 B 세포군으로 분리했다. 함조 Pellogrino 등이 (1975) Clin.Immunol. ＆ Immunopathol.3 : 324－333 두 세포군을 17－1A의 F(ab')2분체 또는 항－인플루엔자 모노크로날 항체 및 염소의 항－마우스 Ig－FITC로 염색했다.
그후 상기 세포군들을 시토플루오로그래프(cytofluorograph)에서 연속적으로 분석했다. 그외에, 특정 인체 Ig 생산을 위해 동일한 환자로 부터 얻은 말초혈액 단핵 세포를 상기한 DeFreitas 등의 저서에서 설명된 바와 같이 변형된 Mishell－Dutton 배양액중에서 9일동안 17－1A의 F(ab')2분체 또는 항－인플루엔자 모노크로날 항체를 사용해 자극시켰다. 배양액으로 부터 얻은 상청액은 고체상 효소－결합 면역 흡착제 분석법으로 특정인체 IgG(KPL Laboratories, Gaithersburg, MD)에 대해 분석되었다.
08번 환자의 17－1A F(ab')2에 처음 결합된 퍼센테이지는 1.2%이며 23번 환자에서는 0.2%이었다. MAb 17－1A과 함께 배양되는 7일동안 17－1A F(ab')2와 특이적으로 결합된 23번 환자의 임파구 퍼센테이지는 0.2에서 13%로 증가하였다. 모든 17－1A 결합세포가 B 세포군에 존재하였다. 또한 9일후에는 인체 항－MAb 17－1A IgG가 검출되었다. 동일한 조건하에 항－인플루엔자 모노크로날 항체와 함께 같은 환자로 부터 얻은 임파구를 배양하였을 때 MAb 17－1A 또는 항－인플루엔자 모노크로날 항체중 어느 하나에 대해 인체 Ig는 검출되지 않았다.
또 다른 실험으로, 인체 B 임파구를 항－(항－이디오타입)항체를 생산하도록 자극하였다. B 임파구를 상술한 바와같이 실험관내에서 수거하고 자극시켰는데, 단 상기 세포들을 이디오타입 항체 보다는 자가인식항－이디오타입 항체를 사용해 자극시켰다.
항－(항－이디오타입) 항체가 자극된 B 임파구에 의해 생산되며 이들 항－(항－Id)Ab는 CRC 세포추출물과 전세포상의 에피토프로서 동정되는 것이 입증되었다. 따라서, 인체 면역계는 항－이디오타입 항체를 사용한 자극에 대한 반응으로 항－종양 항체를 생산할 것이다.
[항－이디오타입 항체를 생산하는 영구증식성 B 임파구]
모노크로날 항체를 분비하는 영구증식성 B 임파구를 제조하기 위한 여러 가지 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 참조. Kozbor 등의(1983) Immunology Today 4 : 72－79. 그러므로 본 기술분야의 숙련자에 의해, 상술한 바와 같이 말초혈액 임파구로부터 산출된 항－(항－이디오타입)항체를 분비하는 인체 B 임파구를 영구증식 시킬 수 있다.
용이하게 사용할 수 있는 한가지 방법은 에피스테인－바르 비루스 (EBV)로 불멸화 시키는 것이다. 이 방법에서, 상술한 정상 임파구는 실험관내에서 EBV로 감염되며, 그후 영구증식성 셀라인은 예컨대 배양층상의 한계 희석법에 의해 확인된다. 참조예. Kozbor 드의(1983) Immunology Today 4 : 72－79 및 그 문헌에서 인용된 참조문헌 51－60.
다른 방법으로는 항－Id Ab를 분비하는 임파구들 또는 EBV－형질 변환된 임파구 중 하나를 인체 형질 세포종(플라스마시토마) 또는 임파아구 융합 파트너와 융합시키는 것이다. 예컨대, 항－Id Ab를 분비하는 EBV－형질변환된 B 임파구는 인체 임파구 셀라인 KR－4와 융합될 수 있다.
바람직한 하이브리도마는 모세포를 제거하는 와바인(ouabain)을 함유하는 히포크산틴－아미노 프테린－티미딘 배지에서 선별될 수 있다. 하이브리도마는 특정 항체 생산에 대하여 피검된다. 양성 하이브리드를 클로닝하고 재클로닝한 후 대량 배양체로 또는 면역－억제 포유동물(예.누드마우스)의 복막강내에서 증식시킨다.
참조예. Kozbor 등의 (1982) Proc.Natl.Sci.U.S.A. 79 : 6651－6655.
[실시예 2]
[비루스 항체]
[항－이디오타입 항체의 제조]
광견병 비루스 당 단백질(G)의 에피토프를 재구성하는 여러 가지 모노크로날 항체(mAb)에 대하여 만들어진 항－이디오타입 항체 (항－Id Ab)의 성능이 연구되었다.
상기 당 단백질(G)는 비루스－중화 항체(VNA)의 유발을 포함한 광견병 비루스의 여러 가지 중요한 생물학적 특성에 관여한다. 정확하게, G의 어떠한 부분이 이러한 기능에 관여하는 것인지는 아직 밝혀지지 않았다. 타입－특이성 VNA에 대해 최소한 세개의 주요 항원성 부위가 존재함을 시사하는 광견병 비루스 G의 비루스 표준 공격주(CVS)에 대한 작용 에피토프 메트(mat)는 Lafon 등에 의해 (1983) J. Gen.Virol. 64 : 843－851에 기술된 바 있다.
5개의 항－G mAb가 그들의 이소타입(단백질 A－세파로오즈 크로마토그래프로 정제가능)과 상기 작용 에피토프 메트로 정의된 광견병 비루스 G상의 결합부위에 근거하여 광범위한 패널(panel)의 하이브리도마들로 부터 선택되었다. 항－광견병 비루스 G mAb인 509－6, 101－1과 719－3은 이미 공지되어 있다(Lafon 등의 (1983) J. Gen.Virol. 64 : 843－851 ; Wiktor 등의 (1980) J.Exp.Med. 152 : 199－112).광견병 비루스의 감염성을 중화시키는 이들 mAb는 하기 특성을 갖는다 : 509－6(에피토프 지도부위 I : IgG2a), 101－1(에피토프 지도 부위 IIb ; IgG1) 507－1(에피토프 지도 부위 IIb ; IgG2a), 719－3(에피토프 지도 부위 IIc : IgG2a). 항－G mAb 1104－2(IgG1) 은 광견병 비루스로 면역된 BALB/c 마우스의 비세포(splenocyte)를 P3x63Ag8 마우스 골수증 세포의 653 변종과 추가 융합시켜 얻은 융합체로 부터 얻을 수 있다. 참조예. Kearney 등의 (1979) J.Immunol. 123 ; 1548－1550 ; Wiktor 등의 (1978) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 75 : 3928－3942.
항－G－분비성 하이브리도마 세포를 선별하고 한계 희석법으로 클로닝 하여 Wiktor 등에 의해(1978) 상기 문헌에 설명된대로 복수 유액을 제조했다. 1104－2 mAb는 ERA 비루스에 대하여 우수한 결합을 나타내지만 중화는 불량하기 때문에 선택되었다. 항－광견병 비루스 뉴클레오시드 mAb 515－3(IgG2a)와 389－1(IgGl)은 Kelev 비루스－면역된 BALB/c 마우스로부터 유사한 방법으로 분리되었다.
사용된 광견병 비루스의 ERA 또는 CVS 균주를(Stocks) 표준 방법에 의해 BHK－21 세포내에서 증식시켰다. 참조. Wiktor 등의 Laboratory Techniques in Rabies, pp.101－123.
(M.Kaplan ＆ H.Koprowski 3rd ed. 1973). 광견병 항원성 변이주, ERA RV 194－2와 RV 509－6은 공지된 것으로 각각 항－G mAb 194－2와 509－6d에 의한 중화에 내성인 비루스들이다. 참조예. Dietzschold 등의(1983) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80 : 70－74.
광견병 용해성 당단백질(G5)은 Dietzschold 등에 의해(1983) Virology 124 : 330－337에 기술된 대로 면역 흡착제 크로마토그래피에 의해 비루스 입자가 제거된 배양 유체로부터 정제되었다.
모든 항－G mAb는 복수유액으로부터 정제되었다. IgG2a 이소타입의 항체는 pH 8.0의 Britton－Robinson 완충제(BRB)을 사용해 약 1 : 30으로 희석했다. 참조예. Gerhard 등의 Monoclonal Antibodies, pp.317－333(R.Kennett, T.McKearn ＆ K. Bechtol 1980). BRB중의 mAb는 Nalgene 0.45u 필터를 통과시켜 단백질 A－세파로오즈 4B 흡착컬러(Pharmacia, Piscataway, N.J.)상으로 통과시켰다.
pH 3.0의 BRB로 항체를 용출시키기 전에 상기 컬럼을 30ml의 pH 8.0, BRB로 세척했다. IgGI 이소타입의 항－G mAb는 최종농도 18%(w/v)에서 황산나트륨으로 침전되었다. Ig분획을 용해시키고, pH 8.0, BRB중에서 투석하고, 전술한 바와같이 단백질－A－세파로오즈 컬럼상에 통과시켰다. 컬럼에서 용출된 Ig는 항원으로서 ERA 비루슬를 사용하는 방사능 면역 분석법(RIA)에 의해 검출되었다.
참조예. Dietzschold 등의 (1982) J.Virol.44: 59－602. 항체를 pH 7.4의 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 대한 감압 투석에 의해 농축했다. 단백질 농도는 표준물질로 송아지 혈청 알부민을 사용하여 측정했다. 참조예.Bramhall 등의 (1969) Anal Biochem.31 : 146－148.
항－Id Ab를 Staudt등에 의해 (1983) J.Exp.Med.157 : 687－704에 공지된 바와 같이 제조했다. 간단하게 뉴우질랜드 화이트 토끼 암컷에 프로인드의 완전보강제(FCA)에 현탁된 300㎍의 단백질 A－tpvhfhdhwm－정제된 mAb를 유방체인을 따라 여러군데에 피하 투여했다. 7일과 30일째에, PBS중의 100㎍항체를 2회 근육내로 주사해 추가 항원 자극을 주고 10일 뒤에 혈청을 수거했다. 항－이소타입 Ab를 제거하기 위하여 mAb 515－3(IgG2a) 또는 389－1(IgG1)중 하나가 결합되어 있는 세파로오즈 4B 컬럼을 통과시킴으로써 이디오타입 부위에 특이적인 각각의 항－이디오타입 항－혈청이 만들어졌다.
상기 컬럼으로부터의 유출물은 이디오타입 결정인자와 반응성인 항체를 포함하고 있다. 불변 부위에 대한 항체는 0.1M의 디에틸아민(pH 11.5)를 사용해 mAb 515－3과 389－1 면역흡착제 컬럼으로부터 용출되었다. 각 항－Id Ab로부터의 IgG는 상기와 같이 단백질 A－세파로오즈 크로마토그래피에 의해 분리된다. 컬럼 용출물과 비－이디오타입 결정인자와의 반응성은 무시할 수 있다.
[항－이디오타입 항체의 특성]
상기에서 제조된 항－Id Ab의 특이성과 여러 가지 항－G mAb사이의 교차반응성 이디오타입의 존재를 RIA법으로 각각의 항－Id Ab 제조물에 대하여 측정했다. 고체상 RIA는 고정된 mAb에 대한 항－Id Ab의 결합을 측정하기 위해 사용했다. 각각의 mAb는 pH 8.9의 카르보네이트－비이카르본네이트 완충제중에 복수용액 농도에 따라 다음과 같이 희석했다. : 509－6(1 : 3,000), 101－1(1 : 6,000), 719－3(1 : 6,000), 507－1(1 : 6,000), 1104－2(1 : 16,000).
그후 각각 25㎕씩을 폴리비닐 마이크로 적정플레이트(Dynatech Laboratories)의 웰에 가했다. 상기 웰을 37℃에서 하룻밤 배양하여 이들 항체를 건조시켰다. 0.08% 나아트륨아지드(PBSN)와 함께 PBS중의 10% 무감마말혈청(GIBCO Laboratories)을 사용해 최소 1시간 동안 웰상의 유리결합 부위(free binding site)를 차단시켰다. 항－Id Ab의 25㎕의 희석액을 가하고 실온에서 1시간 후 상기 플레이트를 세척했다. 아이오도겐 방법(iodogen method)에 의해 라벨된125I 염소－항－토끼 IgG(Cappel Laboratories) 25㎕(30,000cpm)을 가하고, 실온에서 1시간 동안 더 배양하여 결합된 항－Id Ab를 검출했다. 참조예. Markwell 등의(1978) Biochemistry 17 : 4807㎕4817. 모든 항－Id Ab 또는 방사라벨된 프로오브는 PBSN 중의 10 무감마 말혈청을 사용해 모두 희석물을 제조했다. 플레이트를 세척하여 결합하지 않은 프로오브들을 제거하고 각 웰에 결합된 방사능 활성을 감마계수기로 측정했다.
동형 및 이형 mAb에 대한 각각의 항－Id Ab 제조물의 역가측정 결과는 각각의 항－Id Ab가 이것의 동형 Id mAb에 대하여 특이적 임을 증명하고 있다.
[이디오타입 항체의 파로토프에 대해 지시된 항－이디오타입 항체의 결정]
Id Ab와 항－Id Ab사이의 상호작용을 억제하는 광견병 비루스 G의 억제능을 실험하기 위하여 경쟁적 RIA법이 고안되었다. 참조예.Chaflin 등의 (1974) J.Immunol.112 : 1747－1756; Sher 등의 (1972) J.Immunol.109 : 176－178.
광견병 G5를 경쟁항원으로 사용했다. 표준화된 항－Id Ab 희석액을 가하기 전에 예비 역가가 측정된 소정 농도의 mAb를 1시간 동안 일련의 G5의 2배 희석액들과 함께 배양했다.
결합된 항 혈청의 양은 125I－라벨된 염소 항－토끼 항체 프로오브를 결합시켜 측정했다. 그 해당 항－GmAb에 대해 5개의 항－Id Ab중 3개의 결합(509－6, 507－1 및 1104－2)이 G5에 의해 억제되었다. 최대억제치는 6㎍/ml정도의 G5양에서는 20－50%로 다양하였지만 0.75㎍/ml정도의 G5의 양에서는 최소한 15%의 감소가 관찰되었다. 항－Id Ab의 결합을 완전히 억제할 수 없는 것은 프레임 워크와파로토프 부위의 특이성이 모두 3개의 폴리크로날 항－Id 혈청내에 존재함을 나타내 주는 것이다. 이것은 환원 및 비환원 조건하에서 나트륨도데실 설페이트－폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS－PAGE)에 의해 분석되는 mAb와 항－Id Ab간의 반응성의 웨스턴 블롯 분석법(Western blot analysis)에 의해 확인되었다.
항원결합부위는 mAb의 환원에 의하여 제거되기 때문에, 환원된 항－Id Ab의 반응성은 프레임워크의 결정인자에 대한 특이성을 나타낸다. 항－Id 101－1 Ab 또는 항－Id 719－3 Ab에 대한 Gs에 의한 결합억제 정도가 그리 크지 않은 것은 혈청내의 파로토프 특이성이 부재하거나 적다는 것을 암시한다.
[항－(항－이디오타입)항체의 제조]
하기 실시예들은 항－G mAb의 항원－결합부위와 반응하는 항－Id Ab가 이들 항－G mAb에 의해 인삭되는 비루스 에피토프를 모방한 G에 대한 면역반응을 유발할 수 있는 아군(subpopulation)을 함유한다는 것을 설명한 것이다. 4그룹의 ICR 마우스에 프로인드의 완전보강제에 현탁된 단백질 A－세파로즈－정제된 항－Id IgG 40㎍/마우스를 피하투여했다. 7일과 32일째에 추가 항원 자극을 위한 피하 접종을 실시했다. 각각 불완전 프로인드 보강제중의 40㎍의 항－Id IgG를 사용했다. 마지막 추가 항원 자극 접종 5일 후, 마우스를 레트로－오르비탈 플렉서스를 통해 유혈시켜 혼주된 혈청을 광견병 비루스－중화항체(VNA)에 대하여 검사했다. 대조용으로서, 다른 그룹의 마우스에 단백질A－세파로즈－정제된 정상토끼 IgG를 투여해 면역화시켰다.
면역된 마우스에서 VNA의 농도는 변형된 고속형광 촛점 억제 테스트법으로 측정했다. 참조예. Smith등의 Laboratory Techniques in Rabies, pp. 354－357(M.Kaplan ＆ H.Koprowski 3rd ed.1973). 마우스 혈청을 두배 희석한 일련의 희석액들을 마이크로 적정 II 플레이트(Falcon Plastics)(50㎕/well)에 제조하고 1시간 동안 37℃에서, 104PUF/50㎕를 함유하는 동량의 비루스와 함께 배양시겼다. 배양후, 각 웰에 50㎕의 신선한 트립신화된 BHK－21 세포(2×106세포 ml)를 가하여 혼합하고 혈청－비루스－세포 혼합물의 부분표본 10㎕를 데라사끼 플레이트(Terasaki plate, Falcon Plastics)의 웰내로 옮겼다(2벌). 20시간 배양한 후 플레이트들을 우선 PBC로 헹구고, 그후 증류수중의 80% (v/v) 아세톤으로 세정하여 30분동안 실온에서 80% 아세톤 중에서 고정시켰다. 플레이트들을 건조시키고, 세포는 30분간 37℃에서, 토기유래의 플루어레스신－교합 항－광견병 뉴클레오시드 항체 5㎕/웰로 염색했다. 참조예. Wiktor, (1974) Symp.Series Immunobiol. Standard 21 : 102－118.
대조용 웰(비루스는 함유하고 항체는 함유하지 않음)은 광견병 비루스－특이성 붕입체를 함유하는 세포가 약 40% 정도로 나타났다. 비루스 중화의 최종점은 광견병 비루스－감염세포의 수가 50%까지 감소될 수 있는 최고의 혈청희석 배수의 역수로 정의된다.
고속 형광 촛점 억제 테스트의 결과는 하기표에 나타내었다.
VNA 역가는 항－Id 509－6 Ab와 항－Id 1104－2 Ab로 면역된 마우스에서 ERA 균주 광견병 비루스에 대하여 현저한 것으로 나타났다. 다른 세개의 항－(항－Id)Ab는 ERA 비루스를 중화시키지 못했다. 대조용 실험은 면역을 위해 사용한 항－Id Ab 뿐아니라 마우스 항－(정상토끼 IgG)Ab도 광견병 비루스 중화활성을 가지지 않음을 나타냈다. 또한, 항－Id 509－6 Ab와 함께 항－(항－Id 509－6) 혈청을 예비배양한 경우 그 중화활성이 제거되었다. 그러나 정상토끼 혈청과 함께 다른 예비 배양한 것은 그 활성이 제거되지 않았다. 형성된 VNA의 특이성을 테스트하기 위하여, 다른 광견병 비루스를 중화분석에서 사용했다. 광견병 비루스의 CVS 균주는 mAb 509－6과 1104－2에 결합하여 하기표는 CVS가 항－(항－Id 509－6) 혈청과 항－(항－Id 1104－2)혈청에 의해 중화되는 것을 나타내고 있다. 한편, mAb에 의한 결합 또는 중화활성의 손실을 초래하는 509－6 에피토프내의 돌연변이를 가지는 ERA 비루스의 변이주, RV 509－6은(참조예. Laton 등의(1983) J.CenS.Virol. 64 : 843－851)항－(항－Id 509－6)혈청에 의해 중화되지 않았다. 다른 중화－내성변이주, RV 194－2는 항－(항－Id 509－6) 혈청에 의해 효과적으로 중화되었다. 전술한 결과는 항－G mAb 509－6과 194－2에 의해 인식되는 항원성 부위들이 완전히 개별적임을 나타내는 것이다. 참조예. Laton 등의 (1983) J.Gen.Virol. 64. 이들 데이타는 항－(항－Id 509－6) 혈청이 항－G mAb 509－6에 의해 인식되는 에피토프와 유일하게 반응하며, 따라서 이 에피토프가 항－Id 509－6 Ab에 의해 자극되었음을 알려준다.
Figure kpo00003
상기 실시예들은 단지 설명을 목적으로 제시한 것으로 본 발명을 제한시키기 위한 것이 아니며 본 발명은 청구범위로써만 명시된다.

Claims (2)

  1. 항－종양 또는 항－비루스 항체의 파로토프인 에피토프를 동정하는 모노크로날 또는 폴리크로날 항체로부터 선택된 항－이디오타입 항체를 함유하는, 사람의 위장 및 결장직장암 그리고 광견병 비루스 중에서 선택되는 종양 또는 비루스에 대한 면역반응을 유발하기 위한 조성물.
  2. 이종숙주에 항－종양 또는 항－비루스 항체를 투여하고 이 숙주의 혈청으로부터 그 목적 항－이디오타입 항체를 분리 및 정제하는 것으로 구성된 항－종양 또는 항－비루스 항체의 파로토프인 에피토프를 동정하는 모노크로날 또는 폴리크로날 항체로 부터 선택된 항－이디오타입 항체를 제조하는 방법.
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