DE69635843T2

DE69635843T2 - Monoklonaler anti-idiotypischer antikörper 11d10 aus der maus und methoden zu dessen verwendung

Info

Publication number: DE69635843T2
Application number: DE69635843T
Authority: DE
Inventors: Malaya Lexington CHATTERJEE; A. Kenneth Lexington FOON; K. Sunil Lexington CHATTERJEE
Original assignee: University of Kentucky Research Foundation
Current assignee: University of Kentucky Research Foundation
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2016-12-20
Also published as: US7083943B1; ATE318312T1; WO1997022699A2; CA2239799C; US6949244B1; CA2239799A1; ES2259184T3; AU1354297A; DE69635843D1; EP0876486B1; US7399849B2; AU731063B2; BR9612093A; US20060018895A1; EP0876486A2; WO1997022699A3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf monoklonale anti-idiotypische Antikörper. Genauer bezieht sie sich auf den anti-idiotypischen Antikörper 11D10 und auf Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen für 11D10, der eine Immunantwort gegen ein spezifisches Epitop von humanen Milchfettglobuli (HMFG) auslöst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Trotz ausgedehnter medizinischer Forschung und zahlreicher Fortschritte bleibt Krebs die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Brustkrebs ist die häufigste Ursache von Krebstoten bei Frauen. Während die traditionellen Therapiearten wie Chirurgie, Radiotherapie und Chemotherapie breit verwendet werden und in vielen Fällen erfolgreich sind, gibt es immer noch eine signifikante Fehlerrate, besonders für solide Tumoren. Die immer noch vorkommende hohe Todesrate von Krebsen wie Brustkrebs erzwingt den Bedarf nach alternativen Therapiearten.
Die Immuntherapie von menschlichem Krebs unter Verwendung von Tumorzellen oder von aus Tumoren gewonnenen Vaccinen war aus etlichen Gründen enttäuschend. Es war durchweg schwierig, große Mengen gereinigter tumorassoziierter Antigene zu gewinnen, die oftmals chemisch schlecht definiert und schwierig aufzureinigen sind. Zusätzlich bleibt das Problem des immunbiologischen Ansprechpotentials gegen Tumorantigene oder, in anderen Worten, die Frage, ob ein Krebspatient effektiv eine Immunantwort gegen ihren oder seinen Tumor hervorbringen kann. Tumorassoziierte Antigene (TAA) sind oftmals ein Teil des „Selbst" und rufen gewöhnlich eine sehr schlechte Immunantwort in einem tumortragenden Wirt aufgrund von Toleranz gegen die Antigene hervor, wie zum Beispiel T-Zell-vermittelte Suppression. Ferner neigen Krebspatienten dazu, immunsupprimiert zu sein und sprechen nur auf gewisse T-abhängige Antigene an.
Immunbiologen lernten, dass ein schwaches Antigen (in Begriffen des Auslösens einer Immunantwort) zu einem starken Antigen durch Änderung der molekularen Umgebung gewandelt werden kann. Änderungen des Haptenträgers erlauben T-Zell-Helferzellen, aktiv zu werden, was die Gesamtimmunantwort stärker macht. Folglich kann Ändern des Carriers ebenfalls ein immunologische Toleranz bewirkendes Antigen in ein effektives Antigen verwandeln. McBridge et al. (1986) Br. J. Cancer 53: 707. Oftmals wird der immunologische Zustand eines Krebspatienten supprimiert, so dass der Patient nur in der Lage ist, auf gewisse T-abhängige Antigene und nicht auf andere Antigenformen anzusprechen. Von diesen Überlegungen ausgehend würde es Sinn machen, molekulare Änderungen in die tumorassoziierten Antigene einzuführen, bevor sie als Vaccine verwendet werden. Unglücklicherweise ist dies für die meisten Tumorantigene unmöglich zu bewerkstelligen, da sie nicht gut definiert sind und sehr schwierig aufzureinigen sind.
Die Netzwerkhypothese von Lindemann ((1973) Ann. Immunol. 124: 171-184) und Jerne ((1974) Ann. Immunol. 125: 373-389) bietet einen eleganten Ansatz, Epitopstrukturen zu idiotypischen Determinanten, die auf der Oberfläche von Antikörpern exprimiert werden, zu transformieren. Nach dem Netzwerkkonzept wird die Immunisierung mit einem gegebenen tumorassoziierten Antigen die Produktion von Antikörpern gegen dieses tumorassoziierte Antigen erzeugen, bezeichnet als Ab1; dieser Ab1 wird dann verwendet, um eine Reihe von anti-idiotypischen Antikörpern gegen den Ab1 zu erzeugen, bezeichnet als Ab2. Gewisse dieser Ab2-Moleküle können effektiv die dreidimensionale Struktur des durch den Ab1 identifizierten tumorassoziierten Antigens nachahmen. Diese bestimmten anti-Idiotypen, genannt Ab2β, passen in die Paratope von Ab1 und exprimieren das innere Bild des tumorassoziierten Antigens. Ab2β kann spezifische Immunantworten induzieren, ähnlich wie jene, die durch das ursprüngliche tumorassoziierte Antigen induziert werden, und können deshalb als tumorassoziierte Ersatzantigene verwendet werden. Immunisierung mit Ab2β kann zu der Erzeugung von anti-anti-idiotypischen Antikörpern (Ab3) führen, welche das entsprechende ursprüngliche tumorassoziierte Antigen, identifiziert durch Ab1, erkennen. Wegen dieser Ab1-ähnlichen Reaktivität wird der Ab3 auch Ab1' genannt, um anzuzeigen, dass er sich in seinen anderen Idiotopen von Ab1 unterscheiden könnte.
Ein möglicherweise viel versprechender Ansatz für die Krebsbehandlung ist Immuntherapie unter Ausnutzung von anti-idiotypischen Antikörpern. Bei dieser Therapieform wird ein Antikörper, der ein Epitop eines tumorassoziierten Proteins nachahmt, in dem Bemühen verabreicht, das Immunsystem des Patienten gegen den Tumor über das tumorassoziierte Protein zu stimulieren. WO 91/11465 beschreibt Verfahren des Stimulierens einer Immunantwort in einem Menschen gegen maligne Zellen oder ein infektiöses Mittel unter Verwendung von anti-idiotypischen Primatenantikörpern. Es können jedoch nicht alle antiidiotypischen Antikörper bei Therapieplänen gegen Tumoren verwendet werden. Erstens ist nur eine Fraktion von gegen einen Ab 1 erzeugten Antikörpern in ihrer Reaktivität auf das Paratop von Ab1 beschränkt (d. h. sind nicht reaktiv gegen Eigenschaften, die mit anderen möglichen Antikörpern in dem Wirt geteilt werden). Zweitens sind anti-idiotypische Antikörper nicht notwendigerweise immunogen. Drittens, sogar falls ein anti-Idiotyp eine Immunantwort auslöst, löst nur eine Fraktion dieser immunogenen anti-Idiotypen eine Immunantwort gegen das Tumorantigen und nicht gegen andere Antigene mit geringer Spezifität aus. Weiterhin wurde vorgeschlagen, da verschiedene Krebse breit variierende molekulare und klinische Eigenschaften haben, dass die Anti-Idiotyp-Therapie auf einer Fall-zu-Fall-Basis beurteilt werden sollte im Hinblick auf den Tumorursprung und die Antigenexpression.
Monoklonale anti-Id-Antiköper, die tumorassoziierten Antigenen strukturell gleichen, wurden als Antigenersatz in Krebspatienten verwendet. Herlyn et al. (1987) PNAS 84: 8055-8059; Mittleman et al. (1992) PNAS 89: 466-470; Chatterjee et al. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 690: 376-377. Es wurde vorgeschlagen, dass der anti-Id ein Teilanalogon des tumorassoziierten Antigens in einem immunogenen Zusammenhang bereitstellt.
Humane Milchfettglobuli (HMFG) sind Milchfettglobuli, die in die Brustmilch durch die Brustepithelzellen sezerniert werden, und sind aus Fetttröpfchen, die mit Plasmamembran umhüllt sind, zusammengesetzt. Als solches ist HMFG eine reiche Quelle von epithelmembranassoziierten Antigenen. Ein Antigenbestandteil von HMFG ist ein membranassoziiertes Mucin mit hohem Molekulargewicht, das mit Brust- und anderen Krebsen wie Ovarial-, Lungen- und Pankreaskrebs im Zusammenhang steht. Das Mucin enthält ein Protein mit bekannten Aminosäuresequenzen, abgeleitet aus der cDNS. Teilgereinigtes HMFG ist in kleinen Mengen aus etlichen Quellen erhältlich und kann in serologischen Untersuchungen verwendet werden. Peterson et al. (1990) Hybridoma 9: 221-235.HMFG ist jedoch extrem schwierig zu isolieren und aufzureinigen, und aufgereinigtes HMFG ist nicht für die Patientenimmunisierung oder für Tierversuche erhältlich. Ferner könnte, da gewisse der Epitope von HMFG mit normalen Geweben geteilt werden, besonders mit nicht-penetrierenden Glycoproteinen, die Immunisierung mit intaktem HMFG-Molekül mögliche schädigende Autoimmunreaktionen auslösen. Eine Immunreaktion gegen ein tumorassoziiertes Epitop wäre auf der anderen Seite viel wünschenswerter.
Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern (mAbs) der Maus, welche Bestandteile von HMFG erkennen, wurde beschrieben, die hauptsächlich im Zusammenhang mit menschlichen Brustcarcinomen stehen und nicht mit den meisten normalen Geweben. Chatterjee et al. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 690: 376-377; Ceriani et al. (1983) Somatic Cell Genet. 9: 415-427. Unter diesen mAbs ist MC-10 (BrE-1) der Beschränkteste und Spezifischste, wobei er mit einem Mucin-ähnlichen Protein mit großem Molekulargewicht (MW, 400.000), das in einer hohen Dichte und auf >80 % von Brustkrebszellen vorhanden ist und minimal auf wenigen normalen Geweben exprimiert wird, wie die Epithelauskleidung von der Lunge und von Nierentubuli, reagiert. Ceriani et al. (1983); Ceriani et al. (1990) Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 3: 181-198.
Wiederkehrender Brustkrebs ist durch Standardtherapien nicht heilbar. Folglich werden neue therapeutische Ansätze für diese Erkrankung gebraucht. Die vorliegende Erfindung überwindet die Mängel im Stand der Technik durch Bereitstellen eines monoklonalen antiidiotypischen Antikörpers (11 D 10) als ein Antigen (Ag), welches eine Immunantwort gegen HMFG in nichtmenschlichen Primaten auslöst, der für die Behandlung von anti- Tumorimmunität in Patienten mit fortgeschrittenem HMFG-assoziiertem Krebs (wie Brustkrebs) nützlich sein könnte.
Sämtliche hierin zitierten Publikationen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen anti-idiotypischen Mausantikörper, 11 D 10, bereit, der in der Lage ist, eine Immunantwort gegen ein Mucin mit hohem Molekulargewicht aus humanem Milchfettglobuli (HMFG) auszulösen. Diese Erfindung schließt auch Polypeptide ein, umfassend wenigstens einen Teil einer variablen Region eines anti-idiotypischen Antikörpers 11 D 10, und diese Polypeptide kodierende Polynukleotide. Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Vaccine, umfassend 11D10, 11D10-Polypeptide und/oder 11D10-Polynukleotide, ein. Auch in die vorliegende Erfindung eingeschlossen sind diagnostische Kits und Verfahren zur Verwendung von 11D10, 11D10-Polypeptiden und/oder 11D10-Polynukleotiden, einschließlich Verfahren zur Behandlung von HMFG-assoziierten Tumoren.
Weiter ist ein Ziel der Erfindung, eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Verwendung von monoklonalen anti-idiotypischen (anti-Id) 11D10-Polynukleotiden und -Polypeptiden bereitzustellen, um anti-Tumorimmunität in Patienten mit HMFG-assoziierter Erkrankung wie Brustkrebs zu induzieren.
Demgemäß schließt in einem Aspekt die Erfindung einen monoklonalen anti-idiotypischen Antikörper 11D10, hergestellt durch eine Hybridomzelllinie ATCC Nr. 12020 oder deren Nachfahren, ein.
In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung eine Hybridomzelllinie, genannt ATCC Nr. 12020, und Nachfahren davon ein.
In einem Aspekt schließt die Erfindung auch isolierte Polynukleotide ein, umfassend eine Sequenz, die ein Polypeptid mit immunologischer Aktivität des monoklonalen antiidiotypischen Antikörpers 11D10 kodiert, worin das Polypeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer variablen Region von 11D10 umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung isolierte Polynukleotide bereit, die aus einer Region von wenigstens 15 zusammenhängenden Nukleotiden zusammengesetzt sind, wobei diese Region in der Lage ist, eine stabile Duplex mit einem Polynukleotid zu bilden, das aus der die variable Region der leichten Kette kodierenden Sequenz der SEQ ID Nr. 1 besteht, unter Bedingungen, bei denen die Region kein stabiles Hybrid mit SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 14 bildet. Die Erfindung stellt auch isolierte Polynukleotide bereit, welche aus einer Region aus wenigstens 15 zusammenhängenden Nukleotiden zusammengesetzt sind, wobei diese Region in der Lage ist, eine stabile Duplex mit einem Polynukleotid zu bilden, das aus der die variable Region der schweren Kette kodierenden Sequenz der SEQ ID Nr. 3 besteht, unter Bedingungen, unter welchen die Region kein stabiles Hybrid mit SEQ ID Nr. 15 bis SEQ ID Nr. 32 bildet.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das Klonieren und die Expression von Vektoren, umfassend die Polynukleotide der Erfindung. Auch eingeschlossen sind Wirtszellen, umfassend die Polynukleotide der Erfindung.
Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Polypeptide mit der immunologischen Aktivität des monoklonalen anti-idiotypischen Antikörpers 11D10, worin die Polypeptide eine Sequenz aus wenigstens 5 zusammenhängenden Aminosäuren aus einer variablen Region von 11D10 umfassen.
In einem anderen Aspekt werden 11D10-Polypeptide bereitgestellt, die eine Region der Homologie mit HMFG enthalten.
In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung Fusionspolypeptide, umfassend 11D10-Polypeptid(e), ein. Auch in die Erfindung eingeschlossen sind polymere 11 D 10-Polypeptide, ebenso wie humanisierte Antikörper, umfassend 11D10-Polypeptid(e).
In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen und Vaccine, umfassend eine effektive Menge von 11D10, 11D10-Polypeptid(en) und/oder 11D10-Polynukleotid(en), ein.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Auslösen einer anti-HMFG-Immunantwort in einem Individuum mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung bereit, umfassend den Schritt des Verabreichens einer effektiven Menge von 11D10, 11D10-Polynukleotid(en) und/oder -Polypeptid(en) an das Individuum.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren zur Entfernung von markiertem antihumanem Milchfettglobuli- (HMFG-) Antikörper aus einem Individuum bereit, welches markierten anti-HMFG-Antikörper erhalten hat, wobei die Verfahren die Verabreichung von 11D10 einschließen.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit eines anti-HMFG-Antikörpers, gebunden an eine Tumorzelle, bereit, umfassend die Schritte des Kontaktierens der Tumorzelle mit 11D10 für eine ausreichende Zeit, um das Binden an den anti-HMFG-Antikörper zu erlauben, und Detektieren der Anwesenheit von jeglichem 11D10, der an den anti-HMFG-Antikörper gebunden ist.
In einem anderen Aspekt werden Verfahren zum Detektieren einer anti-HMFG-Immunantwort in einem Individuum bereitgestellt. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren einer biologischen Probe aus dem Individuum mit 11D10 unter Bedingungen, die die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen 11D10 und einem Antikörper erlauben, der an 11D10 bindet, und Detektieren von allen stabilen gebildeten Komplexen.
In einem anderen Aspekt werden Verfahren bereitgestellt zum Detektieren eines Antikörpers, der an 11D10 einer biologischen Probe bindet. Diese Verfahren umfassen die Schritte des Kontaktierens von Antikörpern aus der aus einem Individuum gewonnenen Probe mit 11D10 oder einem 11D10-Polypeptid unter Bedingungen, die die Bildung eines stabilen Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, und das Detektieren des gebildeten stabilen Komplexes, falls vorhanden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Verfahren zum Lindern von mit humanen Milchfettglobuli in Zusammenhang stehender Erkrankung in einem Individuum mit fortgeschrittener, mit humanen Milchfettglobuli in Zusammenhang stehender Erkrankung. Diese Verfahren umfassen die Applikation einer effektiven Menge von 11D10 an das Individuum.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung auch Kits zum Detektieren oder Quantifizieren bereit, umfassend 11D10, 11D10-Polypeptid(e) oder 11D10-Polynukleotid(e) in geeigneter Verpackung.
Die obigen und anderen Ziele der Erfindung werden Fachleuten in der relevanten Technik aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Figuren leicht ersichtlich werden, worin nur die bevorzugten Ausführungen der Erfindung gezeigt und beschrieben werden, einfach im Wege der Erläuterung der besten Weise der Durchführung der Erfindung. Wie leicht erkannt werden wird, ist die Erfindung Modifikationen zugänglich, die in dem Können der relevanten Technik liegen, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 bildet die cDNS-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) der variablen Region der leichten Kette von 11D10 und begleitenden Resten ab. CDR und Gerüstregionen sind angezeigt. Die korrekte Translation sollte A oder Alanin für die Aminosäure -18 und E oder Glutaminsäure für die Aminosäure 81 (SEQ ID Nr. 2) zeigen.
2 bildet die cDNS-Sequenz (SEQ ID Nr. 3) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4) der variablen Region der schweren Kette von 11D10 und begleitende Reste ab.
3 bildet die Aminosäuresequenzen der variablen Region der leichten Kette (Aminosäuren 1 bis 107 der SEQ ID Nr. 2; 3A) und der variablen Region der schweren Kette (Aminosäuren 1 bis 118 von SEQ ID Nr. 4; 3B) von 11D10 ab. Jede variable Region besteht aus 4 Gerüstregionen und 3 CDR. Für 3A sollte die korrekte Translation E oder Glutaminsäure für die Aminosäure 81 zeigen.
4 bildet Polynukleotidsequenzen ab, welche zu der die variable Region der leichten Kette von 11D10 kodierenden Sequenz in einer Datenbankrecherche am besten passten. Diese Sequenzen haben die Bezeichnungen SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 14.
5 bildet 10 Nukleotidsequenzen ab, welche zu der die variable Region der schweren Kette von 11D10 kodierenden Sequenz in einer Datenbankrecherche am besten passten. Diese Sequenzen haben die Bezeichnungen SEQ ID Nr. 15 bis SEQ ID Nr. 32. Striche entsprechen weggelassenen Regionen, die nicht zu SEQ ID Nr. 3 homolog sind.
6 ist eine Säulengrafik, die anti-Id-Spezifitäten von 11D10 (Igel, κ) abbildet. Bindung von ¹²⁵I-markiertem 11D10 (~ 25.000 cpm) an zahlreiche monoklonale Mausproteine und anti-HMFG- (Brust-TAA-) Antikörper wurde unter Verwendung eines direkten RIA bestimmt. Die Isotypen der monoklonalen Proteine sind: MC-10 (BrE-1, IgG2b, κ), erste Säule; 1E3 (IgGI, κ), zweite Säule; 4DC6 (IgGI, 1), dritte Säule; BrE-3 (Igel, κ), vierte Säule; Hy-Klon IgG2b, fünfte Säule; Hy-Klon IgG3, k, sechste Säule; IgG3, Hy-Klon IgA, siebte Säule; und MOPC 104E (IgM, 1), achte Säule; RWP1-1 (IgG2b, k), neunte Säule.
7 ist eine Grafik, die die Inhibition der MC-10- (BrE-1-) Bindung an MCF-7- und SKBR3-Zellen durch gereinigten Ab2 abbildet. Gefüllte Kreise bezeichnen 11D10, konkurrierend um die Bindung an MCF-7-Zellen; ungefüllte Kreise bezeichnen 11D10- Bindung an SKBR3-Zellen; ungefüllte Quadrate bezeichnen die 3H1-Bindung an MCF-7- oder SKBR3-Zellen.
8 ist eine Grafik, die die Bindung von absorbierten polyklonalen Maus- und Kaninchen-Ab3-Seren, ebenso wie mAb3, an die Brustcarcinomzelllinie SKBR3 durch ELISA abbildet. Ungefüllte Kreise bezeichnen 11D10-2F7 (mAb3); gefüllte Kreise bezeichnen Maus-Ab3-Seren; ungefüllte Dreiecke bezeichnen Kaninchen-Ab3-Seren; ungefüllte Quadrate bezeichnen 1E3-Kontrolle.
9 ist eine Grafik, die die Inhibition der MC-10- (BrE-1-) Bindung an SKBR3-Zellen durch mAb3- und polyklonale Maus- und Kaninchen-Ab3-Seren abbildet. Gefüllte Kreise bezeichnen Kaninchen- (Ab3-) Seren (# 123); ungefüllte Kreise bezeichnen 11D10-2F7 (mAb3); ungefüllte Quadrate bezeichnen Maus-Ab3-Seren; ungefüllte Dreiecke bezeichnen Seren vor der Immunisierung (Kontrolle).
10 ist eine Halbtonreproduktion einer Transblot-Analyse von HMFG auf Nitrocellulosepapier mit mAb1 und mAb3. Spur 1, MC-10 (10 μg/ml); Spur 2, 1E3 IgGI (Kontrolle; 50 μg/ml); Spur 3, mAb3-IgG1 (50 μg/ml).
11 ist eine Grafik, die die Expressionsspiegel von anti-Id-reaktiven 11D10-Antikörpern in den Seren von Brustkrebspatienten abbildet.
12 ist eine Grafik, die die Inhibition der Ab1- (mAb MC-10) Bindung an 11D10 (Ab2) durch Affen- (PRO 723) Ab3-Seren mittels RIA abbildet. Gefüllte Kreise bezeichnen Serum nach 3 Immunisierungen, offene Kreise bezeichnen Serum nach 2 Immunisierungen, gefüllte Quadrate bezeichnen Serum nach 1 Immunisierung, Kreuze bezeichnen Serum vor der Immunisierung.
13 ist eine Säulengrafik, die die Bindung von Affen-Ab3-Seren an die Brustkrebszelllinie MCF-7 durch ELISA abbildet. Grob schraffierte Säulen bezeichnen Seren vor der Immunisierung, schraffierte Säulen bezeichnen Immunseren, punktierte Säulen bezeichnen Kontrollsäulen. Die gestrichelte Linie kennzeichnet die Bindung von Affen-Ab3-Seren an die Melanomzelllinie M21/P6.
14 ist eine Säulengrafik, die die Bindung von Affen-Ab3-Seren an teilgereinigtes HMFG durch ELISA abbildet. Erste Säule, Immunseren; zweite Säulen, Seren vor der Immunisierung; dritte Säule, Kontrollseren; vierte Säule, Rinderserumalbumin (BSA).
Die 15A und 15B bilden Immundurchflusscytometrieanalyse von MCF-7-Zellen mit Affen-Ab3-Seren ab. In 15A wurden Tumorzellen mit Seren vor der Immunisierung und Ab3-Seren (1:100-Verdünnung) aus mit 11D10 immunisierten Affen zur Reaktion gebracht. In 15B wurden MOLT-4-Zellen, die HMFG nicht exprimieren, mit gegen 11D10 provozierten präimmunisierten und immunisierten Affen-Ab3-Seren zur Reaktion gebracht.
16 ist eine Säulengrafik, die die Bindung von gereinigtem Affen-Ab3 an HMFG oder an gereinigte CEA durch ELISA abbildet. Der linke Teil der Figur stellt mit HMFG überzogene Platten dar; der rechte Teil der Figur stellt mit CEA überzogene Platten dar. Für den linken Teil der Figur gibt die erste Säule Ab3 an, die zweite Säule gibt Kontroll-Ab3 an, die dritte Säule gibt PBS-BSA an. Für den rechten Teil der Figur gilt, dass die erste Säule Ab3 angibt, die zweite Säule gibt PBS-BSA an, die dritte Säule gibt anti-CEA an.
17 ist eine Halbtonreproduktion einer Slot-Blot-Analyse mit HMFG oder gereinigtem CEA. Polyvinylidendiflouridmembran wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen an HMFG (Spuren 1 und 2) und CEA (Spuren 3 und 4) absorbiert. Die Membran wurde mit Ab1 (Spur 1), gereinigtem Ab3 (Spuren 2 und 3) und anti-CEA-mAb (ein Kontroll-Ab1) (Spur 4) inkubiert.
18 ist eine Grafik, die die Inhibition der Ab1-Bindung an MCF-7-Zellen durch gereinigten Ab3 darstellt. Ungefüllte Kreise bezeichnen aus mit 11D10 immunisierten Affen gereinigten Ab3, gefüllte Kreise bezeichnen aus mit der Kontrolle 3H1 immunisierten Affen gereinigten Kontroll-Ab3.
19 ist eine Säulengrafik, die einen T-Zell-Proliferatianstest mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBM) aus Affen abbildet. Der linke Teil der Grafik gibt mit 11D10 stimulierte PBM an, der rechte Teil der Grafik mit 3H1 stimulierte PBM. Für jeden Teil (Hälfte) gilt, dass das linke Kästchen PBM aus dem Affen # 872 angibt, der rechte Teil gibt PBM aus dem Geld [Anmerkung des Übersetzers: müsste wohl Affe (engl. monkey) heißen] # 723 an. Ungefüllte Säulen bezeichnen Seren vor der Immunisierung, gefüllte Säulen bezeichnen Seren nach der Immunisierung.
20 ist eine Grafik, die die Ab3-Reaktivität in dem Serum eines Patienten (Patient # 1) nach der Applikation von 11D10, wie durch Radioimmuntest gemessen, abbildet. Ungefüllte Kreise bezeichnen Seren vor der Immunisierung, gefüllte Kreise bezeichnen Seren nach der Immunisierung.
21 ist eine Grafik, die die Inhibition der Ab1-Bindung; an 11D10 durch das Serum eines Patienten (Patient # 1) abbildet. Ungefüllte Kreise bezeichnen Seren vor der Immunisierung, gefüllte Kreise bezeichnen Seren nach der Immunisierung.
22 ist eine Säulengrafik, die die T-Zell-Proliferation durch die peripheren Blutlymphozyten eines Patienten abbildet. Für jedes Säulenpaar gilt, dass die ungefüllte Säule Zellen vor der Immunisierung und die gefüllte Säule Zellen nach der Immunisierung angibt. Getestete Stimulantien sind: das Medium, erstes Säulenpaar; 11D10, zweites Säulenpaar; 3H1, drittes Säulenpaar; PHA, viertes Säulenpaar.
23 bildet ausgewählte Aminosäuresequenzvergleiche zwischen den variablen Regionen der leichten (Aminosäuren 41 bis 60, 34 bis 56 und 85 bis 107 der SEQ ID Nr. 2) und schweren Kette (Aminosäuren 43 bis 62 der SEQ ID Nr. 4) von 11D10 und tandemartige Wiederholungen von HMFG (SEQ ID Nr. 33 und SEQ ID Nr. 34) ab. Übereinstimmende Aminosäuren sind durch eine durchgezogene Linie angegeben.
24 bildet das Konstruktionsschema von pVV ab, ein generischer Vacciniavektor (Plasmid), für die Expression von 11D10-Polynukleotiden. Die geschwärzte Box gibt Vaccinia-TK-Gen an, die schraffierte Box kennzeichnet den 7,5 K Vacciniapromotor. Restriktionsstellen sind: A, Apa I; Ns, Nsi I; C, Cla I; E, Eco RI; P, Pst I; Nc, Nco I; Sm, Sma I, (E) bzw. (C) bezeichnen mögliche EcoRI- bzw. ClaI-Stellen. Drei Stoppkodons sind durch S1, S2 und S3 gekennzeichnet. VL und VR repräsentieren linke und rechte flankierende Vacciniasequenzen. TK und 7,5 K wurden durch PCR unter Verwendung von DNS aus dem Wildtyp-WR-Stamm von Vaccinia gewonnen.
25 bildet für die Produktion eines 11D10-Fusionsproteins (25A) und einer Chimäre (25B) geeignete Plasmide ab.
26 (A bis C) ist eine Auflistung, in welcher die Aminosäuresequenzen der variablen Region von 11D10 mit 15 aus einer Genbank-Datenbank gewonnenen Immunglobulinsequenzen der leichten und schweren Kette verglichen werden. A zeigt die der reifen variablen Region der leichten Kette von 11D10 (enthalten in SEQ ID Nr. 2) nächstkommenden Sequenzen, B zeigt die der variablen Region der schweren Kette von 11D10 (enthalten in SEQ ID Nr. 4) nächstkommenden Sequenzen. Reste, die mit 11D10 identisch sind, sind durch einen Punkt (.) angegeben, um die Anordnung zu verbessern; eingefügte Lücken über der VDJ-Verknüpfung der schweren Kette sind durch doppelte Linien (_) angezeigt. C zeigt Konsensussequenzen der variablen Region für die leichten und schweren Ketten (SEQ ID Nr. 47 und SEQ ID Nr. 48) und vergleicht sie mit den Sequenzen von 11D10. Die variable Region von 11D10 zeigt einzigartige Splicingunterschiede über der VDJ-Verknüpfung der schweren Kette und zusätzlich 18 punktuelle Unterschiede aus den sowohl in der leichten als auch der schweren Kette lokalisierten Prototypsequenzen.
27A und 27B sind Grafiken, die die Inhibition der Ab1-Bindung an 11D10 durch Serum von Patienten abbildet. 27A zeigt die Daten für die Patienten # 1 (ungefülltes Quadrat), # 2 (ungefüllte Raute), # 3 (ungefüllter Kreis), # 5 (ungefülltes Dreieck) und # 7 (Quadrat mit Schraffur). 21B zeigt die Daten für die Patienten # 6 (angefülltes Quadrat), # 8 (ungefüllte Raute), # 9 (ungefüllter Kreis), # 11 (ungefülltes Dreieck) und # 12 (Quadrat mit Schraffur). Ungefüllte Kreise kennzeichnen Seren vor der Immunisierung, gefüllte Kreise bezeichnen Seren nach der Immunisierung.
28 ist eine Säulengrafik, die die Reaktivität von affinitätsgereinigtem Ab3 aus den Seren von Patienten nach der Applikation von 11D10 abbildet, wie gemessen durch Radioimmuntest (RIA; Patienten # 5(erstes Säulenpaar), # 6 (zweites Säulenpaar) und # 1 (drittes Säulenpaar)). Das vierte Säulenpaar („X") bezeichnet den Ab3 von nicht verwandten Patienten. Das fünfte Säulenpaar bezeichnet MC10; das sechste Säulenpaar bezeichnet phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Bei jedem Säulenpaar kennzeichnet die gefüllte Säule IgG und die ungefüllte Säule IgM. Ungefüllte Kreise bezeichnen Seren vor der Immunisierung, gefüllte Kreise bezeichnen Kreise nach der Immunisierung.
Die 29A und 29B sind Säulengrafiken, die die T-Zell-Proliferation durch periphere Blutlymphozyten von Patienten abbilden. Bei jedem Säulenpaar geben die ungefüllten Säulen Zellen vor der Immunisierung an, die gefüllte (oder schattierte) Säule bezeichnet Zellen nach der Immunisierung. 29A zeigt Daten für Patient # 1, 29B zeigt Daten für Patient # 5. Die untersuchten Stimulantien sind: 11D10, erstes Säulenpaar; 4DC6, zweites Säulenpaar; PHA, drittes Säulenpaar; Medium, viertes Säulenpaar.
WEISEN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Wir entdeckten einen monoklonalen anti-idiotypischen Antikörper, 11D10, der der Immuntoleranz entkommt und eine spezifische Immunantwort gegen ein unterscheidbares und spezifisches Epitop von humanen Milchfettglobuli (HMFG), ein mit Brustkrebs assoziiertes Antigen, induziert. Die durch 11D10 typischerweise ausgelöste Immunantwort umfasst sowohl humorale als auch zelluläre Antworten. Folglich wird von 11D10 erwartet, dass es nützlich ist bei der Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung. Ein Hybridom, das 11D10 produziert, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rocksville, MD, USA 20852, am 17. Januar 1996 unter den Bedingungen des Budapester Abkommens für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentbegehrens hinterlegt. Es wurde ihm die Zugangsnummer 12020 zugewiesen. Eine vollständige Beschreibung von 11D10, einschließlich seiner Erzeugung und Charakterisierung, wird in der ebenfalls zueigenen Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/575,762 (Nummer der US Provisional Application ; Aktenzeichen des Anwalts 30414-20003.00) gefunden.
Krebspatienten sind oftmals immunsuprimiert und sind für zahlreiche tumorassoziierte Antigene (TAA), einschließlich HMFG, tolerant. Das Auslösen einer aktiven Immunantwort auf solche TAA stellt eine wichtige Herausforderung bei der Krebstherapie dar. Die gegenwärtigen Erfinder nutzen einen Netzwerktheorieansatz der Vaccintherapie unter Verwendung von inneren Bildantigenen. Immunisierung mit einem gegebenen Antigen erzeugt die Produktion von Antikörpern gegen das Antigen. Wie hierin verwendet, stellt „Ab1" einen monoklonalen anti-Tumor-Antikörper dar, „Ab2" stellt einen monoklonalen anti-idiotypischen Antikörper dar und „Ab3" stellt einen monoklonalen anti-antiidiotypischen Antikörper dar.
Wir fanden heraus, dass 11D10 wirksam ist beim Auslösen einer Immunantwort (humoral und/oder zellulär) gegen HMFG in sämtlichen untersuchten Säugern, in welchen HMFG nicht ein Auto- (Selbst-) Antigen ist. Wichtig ist auch, dass wir ebenfalls entdeckten, dass 11D10 eine Immunantwort in Patienten mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung, besonders Brustkrebs, auslöst. Dies ist besonders signifikant, da viele dieser Patienten, entweder aufgrund der Art ihrer zuvorigen Behandlung oder ihrer Erkrankung oder beidem, mäßig bis stark geschwächt sind und oftmals 11D10 als eine finale Option erhielten. Während nicht gewünscht wird, durch eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, ist ein Weg, über welchen das Auslösen einer Immunantwort geschehen könnte, jener, dass die 11D10-Kombinierungsstelle eine Region darstellen könnte, welche zum Teil einem Epitop in HMFG gleicht, in Zusammenhang mit anderen Epitopen, was es immunogener macht. Das Epitop von HMFG, welches jenem von 11D10 gleicht, wird durch den anti-HMFG-mAb MC-10 (Ab1) identifiziert, der ein unterscheidbares und spezifisches Epitop auf HMFG erkennt und der verwendet worden war, syngenische BALB/c-Mäuse für die Produktion von anti-Id-mAb 11D10 zu immunisieren. Diese Studien zeigen, dass der Antikörper dieser Erfindung nützlich für die Erzeugung einer Immunantwort und die Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung wie Brustkrebs in einem Individuum mit fortgeschrittener Erkrankung ist. Wir glauben auch, dass 11D10 bei der Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung in Individuen mit hoher Tumorlast wirksam sein wird. Er ist auch nützlich für die Detektion von Ab1 und/oder Ab3.
Wir haben auch Polynukleotidsequenzen entdeckt, die die variablen Regionen von 11D10 kodieren, und die dadurch kodierten Polypeptidfragmente von 11D10. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung Polynukleotidsequenzen, die den anti-idiotypischen Antikörper 11D10 und funktionell äquivalente Fragmente davon kodieren, Polypeptidfragmente von 11D10, rekombinante V erfahren zur Erzeugung dieser 11D10-Polynukleotide und -Polypeptide, pharmazeutische und Vaccinzusammensetzungen, umfassend 11D10-Polynukleotide und -Polypeptide, Diagnosekits, umfassend 11D10-Polynukleotide und – Polypeptide, und Verfahren, die 11D10-Polypeptide und/oder 11D10-Polynukleotide verwenden. Diese Polypeptide und Polynukleotide sind nützlich für die Beurteilung und Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung wie Brustkrebs. Diese und andere Verwendungen von 11D10-Polynukleotiden und 11D10-Polypeptiden dieser Erfindung werden detaillierter unten diskutiert werden.
Die vollständigen Sequenzen der konstanten Regionen der leichten und schweren Kette von 11D10 wurden nicht bestimmt, es wird jedoch von ihnen erwartet werden, dass sie identisch oder beinahe identisch sind mit jenen der anderen Mausimmunglobulinmoleküle.
Für die konstante Region der leichten Kette Kappa der Maus wurden vier genetische Allotypen, die zwei Proteinallotypen kodieren, durch Solin et al. (1993), Immunogenetics 37: 401-407 veröffentlicht, was hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. 1 von Solin et al. bildet Gensequenzen der Immunglobulin-Kappa-Kette von Maus und Ratte ab, wobei die Sequenzen mit der konstanten Region der Kappakette für verschiedene Stämme verglichen werden und allotypische Unterschiede hervorgehoben werden. Eingeschlossen sind die Sequenzen der konstanten Region der Kappakette für BALB/c, PL, SJL und M. spretus. Andere natürlich vorkommende Allotypen sind möglich.
Die DNS-Sequenz der konstanten Region der schweren γ1-Kette der Maus aus neugeborenen Mäusen wurde von Hanjo et al. (1979) Cell 18: 559-568 publiziert, das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. 5 von Hanjo et al. zeigt die Keimbahn-DNS-Sequenz zusammen mit der kodierten Proteinsequenz. In der Linie darüber ist eine andere Proteinsequenz gezeigt, erhalten aus dem Mausmyelom MOPC 21. Andere natürlich vorkommende Allotypen sind möglich.
Von den 10 Datenbank-DNS-Sequenzen, die am stärksten mit jener der variablen Region der 11D10 leichten Kette übereinstimmten, war keine identisch. Es gab ungefähr 8 bis 27 Unterschiede bei der 11D10-DNS-Sequenz, entsprechend ungefähr 6 bis 17 Aminosäureunterschieden. Die sechste übereinstimmende Sequenz (Bezeichnung > gb/M59920/MUSIQKAA3) war eine Maus-Kappa-VJ-Keim-ähnliche Sequenz und stellt möglicherweise das Prototypengen dar, aus welchem die leichte Kette von 11D10 erhalten worden war. Die 11D10-DNS-Sequenzen unterscheiden sich von der Keimbahnsequenz an 14 Positionen, entsprechend ungefähr 7 Aminosäurepunktunterschieden.
Von den 10 Datenbank-DNS-Sequenzen, die mit jenen der variablen Region der schweren Kette von 11D10 am besten übereinstimmten, war keine identisch. Neun der 10 Sequenzen waren 3 bis 12 Basenpaare länger aufgrund von Spliceunterschieden innerhalb der VDJ-Verknüpfung. Zusätzlich gab es ungefähr 15 bis 43 Punktunterschiede im Vergleich mit der 11D10-DNS-Sequenz außerhalb der Verknüpfung, entsprechend ungefähr 11 bis 23 Aminosäureunterschieden.
Folglich gab es wenigstens ungefähr 18 Aminosäureunterschiede zwischen den durch die 11D10-DNS kodierten Aminosäuresequenzen und jenen, die durch die am besten übereinstimmenden Datenbank-DNS kodiert sind. Die Punktunterschiede stammten wahrscheinlich aus somatischer Mutation der Keimbahnsequenzen während der Entwicklung der Antikörper produzierenden Zelle in dem Tier, das verwendet worden ist, um ihn zu erzeugen.
Die Aminosäuresequenzen der variablen Region von 11D10 wurden mit jenen von anderen bekannten Immunglobulinmolekülen verglichen (Beispiel 2). Beide, die Polypeptidsequenzen der variablen Region der leichten und schweren Kette für 11D10, sind einzigartig.
Von den 50 Datenbankaminosäuresequenzen, die mit der variablen Region der leichten Kette von 11D10 am besten übereinstimmten, war keine identisch. 11D10 unterschied sich von den 15 nächstkommenden Sequenzen durch mindestens 7 und durchschnittlich ungefähr 12 Substitutionsunterschiede, welche nicht konservative Substitutionen durch die variable Region hindurch umfassten.
Von den 50 Datenbankaminosäuresequenzen, die mit jener der variablen Region der schweren Kette von 11D10 am besten übereinstimmten, keine war identisch. Das Folgende fasst die aus dem Vergleich abgeleiteten Hauptpunkte zusammen.
Die am besten übereinstimmende Sequenz hatte 11 Substitutionen zwischen den Resten 1 und 98 (vor der VDJ-Verknüpfung), 7 Substitutionsunterschiede nach dem Rest 98.
11D10 unterschied sich in der Länge von den meisten der Sequenzen der schweren Kette durch 1 bis 5 Reste.
Es gab einen Durchschnitt von ungefähr 30 Insertionen, Deletionen und Substitutionsunterschieden zwischen 11D10 und den 50 übereinstimmenden Sequenzen.
26, C, stellt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen der leichten und schweren Kette von 11D10 mit aus den Datenbanksequenzen abgeleiteten Konsensussequenzen bereit. Abgesehen von Spliceunterschieden oberhalb der VDJ-Verknüpfung der schweren Kette gab es wenigstens 18 Unterschiede zwischen 11D10 und den Konsensussequenzen, die wahrscheinlich aus somatischer Mutation während der Antikörperreifung stammten. Punktunterschiede kommen durch die variable Region der leichten und schweren Kette hindurch vor.
Besonders von Interesse bei der Entwicklung von 11D10-Derivaten mit der immunologischen Aktivität von 11D10 sind die Regionen der 11D10-Polynukleotid- oder -Polypeptidsequenz, die einen Teil der VDJ-Verknüpfung der schweren Kette umfassen. Ebenfalls von Interesse sind Regionen, die wenigstens einen, vorzugsweise zwei, bevorzugter drei oder mehr der Punktunterschiede zwischen den 11D10-Aminosäuresequenzen oder den durch SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 32 kodierten Aminosäuresequenzen überspannen.
Die nützlichen Materialien und Vorgänge der vorliegenden Erfindung sind durch das Bereitstellen von 11D10 und die 11D10 kodierenden Polynukleotidsequenzen möglich gemacht. Diese Sequenzen sorgen für die Gestaltung von Polypeptiden, die zum Beispiel als Vaccine nützlich sein können für die Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung oder als Reagenzien für das Detektieren der Anwesenheit von Ab1 und/oder Ab3. Zusätzlich erlauben diese Sequenzen die Gestaltung von Polynukleotiden, die als Sonden und Primer für die Detektion und Amplifikation von Zielregionen von 11D10 nützlich sind, ebenso wie 11D10-Polynukleotide, die als Vaccine nützlich sind.
Definitionen
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „11D10", „11D10-Antikörper" und „monoklonaler 11D10-Antikörper" austauschbar verwendet, um sich auf ein Immunglobulin zu beziehen, das von der bei der ATCC hinterlegten 11D10-Hybridomzelllinie produziert wird. Die Erzeugung und Charakterisierung von 11D10 wird in Beispiel 1 beschrieben. 11D10 ist ein anti-idiotypischer Antikörper (Ab2), der ein Epitop enthält, das wenigstens teilweise einem unterscheidbaren und spezifischen Epitop von menschlichen Milchfettglobuli (HMFG) gleicht, das hauptsächlich in hoher Dichte von Brustcarcinomzellen exprimiert wird. Unterschiedliche biologische Funktionen stehen mit 11D10 in Zusammenhang, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Bindung an Ab1 und/oder Ab3 und die Fähigkeit, eine Immunantwort (humoral und/oder zellulär) gegen HMFG zu indizieren. Solange nicht anderweitig spezifiziert, bezieht sich der Begriff „intakter 11D10" auf die Aminosäuresequenz des gesamten Moleküls von 11D10. Ein „Fragment" von 11D10 ist ein Teil von 11D10. Ebenfalls eingeschlossen in die Definition von „11D10" sind durch enzymatische Spaltung und/oder chemische Behandlung von intaktem Antikörper erzeugte Fragmente, welche sowohl die ganzen variablen Regionen der schweren und leichten Kette von 11D10 einschließen, als auch in der Lage sind, MC-10 in einem Standardimmuntest zu binden, wie zum Beispiel Fab, F(ab')2 und F(ab').
Wie hierin verwendet, bezieht sich „immunologische Aktivität" von 11D10 auf jede der folgenden Aktivitäten: (a) die Fähigkeit, Ab1 (MC-10) zu binden; (b) die Fähigkeit, die Bindung von 11D10 an MC-10 (Ab1) oder von MC-10 an HMFG in einer spezifischen Weise zu inhibieren; oder (c) die Fähigkeit, eine spezifische Immunantwort auszulösen, besonders eine Antikörper-Antwort (humoral) und/oder eine T-Zell-Antwort, und die Effektorfunktionen, die daraus resultieren. Eingeschlossen in eine Antikörperantwort sind antikörpervermittelte Funktionen wie antikörperabhängige Zellcytotoxizität (ADCC) und komplementabhängige Cytotoxizität (CDC). T-Zell-Antwort schließt T-Helferzell-Funktion, cytotoxische T-Zell-Funktion, Entzündungsinduktor-T-Zellen und T-Zell-Suppression ein. Immunologische Aktivität ist messbar unter Verwendung von Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind, wie Radioimmuntest (RIA), enzymgekoppelter Immunabsorptionstest (ELISA), Komplementfixierung, Opsonierung, Detektion von T-Zell-Proliferation und verschiedene ⁵¹Cr-Freisetzungstests. Diese Verfahren sind in der Technik bekannt und werden unter anderem hierin beschrieben. Auf eine Verbindung, die in der Lage ist, eine spezifische Immunantwort gemäß irgendeinem dieser Kriterien auszulösen, wird Bezug genommen als „immunogen". „Immunogenität" bezieht sich auf eine Fähigkeit, eine spezifische humorale und/oder zelluläre Immunantwort auszulösen.
11D10-„Aktivität", „-Funktion(en)" oder „-Eigenschaft(en)" sind untereinander austauschbar verwendet und beziehen sich auf verschiedene Merkmale von 11D10. Beispiele von 11D10-Funktion(en) schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die Bindung an Ab1 und/oder Ab3, die Induktion von Ab3 und/oder die Induktion einer zellulären Immunantwort, vorzugsweise einer anti-HMFG-Antwort, und die Verbesserung oder Linderung einer HMFG-assoziierten Erkrankung.
Ein Antikörper, der „identifizierende Eigenschaften" hat, die identisch sind mit einem anderen Antikörper, bedeutet, dass ein Antikörper strukturelle (d. h. physikalische) und/oder funktionelle (d. h. chemische) Eigenschaften besitzt, die dieselben sind wie die eines anderen Antikörpers. Ähnlich ist ein Hybridom mit „identifizierenden Eigenschaften" einer Zelle einer Hybridomzelllinie ein Hybridom, das strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaften hat, welche dieselben sind wie die der Hybridomzelllinie, mit welcher es verglichen wird. Für Zwecke dieser Erfindung schließen identifizierende Eigenschaften eines Antikörpers jene im Zusammenhang mit 11D10, wie oben diskutiert, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt; identifizierende Eigenschaften eines Hybridoms sind jene, die mit einem Hybridom, das 11D10 produziert, verbunden sind.
Eine „variable Region" von 11D10 bezieht sich auf die variable Region der leichten Kette von 11D10 oder die variable Region der schweren Kette von 11D10, entweder alleine oder in Kombination.
Mit GM-GSF, IL-2 und anderen biologisch aktiven Molekülen, auf die hierin Bezug genommen wird, ist gemeint, dass sie Fragmente und Derivate, basierend auf dem jeweiligen elterlichen Molekül, einschließen, welche dieselbe biologische oder physiologische Funktion haben.
Wie hierin verwendet, sind „Nachfahren" eines Hybridoms Abkömmlinge eines Hybridoms, welche mit der ursprünglichen (elterlichen) Zelle aufgrund von Mutation oder anderer Adaption vollständig identisch sein kann oder nicht sein kann, das aber einen monoklonalen Antikörper produziert, welcher die Fähigkeit, der Immuntoleranz zu entkommen, bewahrt, d. h., eine Immunreaktion gegen HMFG bewirkt.
„HMFG" ist eine Abkürzung für humane Milchfettglobuli.HMFG hat etliche proteinartige (und folglich antigene) Bestandteile. Wie hierin verwendet, bezieht es sich auf einen teilgereinigten Extrakt einer HMFG-exprimierenden Brustkrebszelllinie, wie zubereitet durch das Verfahren von Ceriani et al. ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 582-586), zusammen mit antigenbezogenen Substanzen, einschließlich HMFG, exprimiert auf Brustkrebszellen, und höher gereinigten Aufreinigungen. In HMFG enthalten ist ein Mucin mit hohem Molekulargewicht einer bekannten Aminosäuresequenz, ein Epitop, das durch den monoklonalen Antikörper MC-10, der als Ab 1 bei dem Produzieren von 11D10 verwendet wird, erkannt wird. Demgemäß bindet eine anti-HMFG-Immunreaktivität, induziert durch das Immunisieren eines Tieres mit 11D10, vorzugsweise ein Polypeptidepitop, das mit jenem verwandt ist, das durch MC-10 erkannt wird.
Für Zwecke dieser Erfindung sind „HMFG-assoziierte Erkrankung" oder „HMFG-assoziierte Tumoren" Erkrankungszustände oder Tumoren, die mit einem HMFG-Antigen verbunden sind, besonders exprimiert auf der Zelloberfläche, welches ein MC-10 (Ab1) bindet.
Wie hierin verwendet, ist ein „Polynukleotid" eine polymere Form von Nukleotiden jeder Länge, das Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide und/oder ihre Analoga enthält. Die Begriffe „Polynukleotid" und „Nukleotid", wie sie hierin verwendet werden, werden austauschbar verwendet. Polynukleotide können jede dreidimensionale Struktur haben und können jede Funktion ausführen, ob bekannt oder unbekannt. Der Begriff „Polynukleotid" schließt doppel-, einzelsträngige und tripel-helikale Moleküle ein. Solange nicht anderweitig spezifiziert oder erforderlich, schließt jede Ausführung der hierin beschriebenen Erfindung, die ein Polynukleotid ist, sowohl die doppelsträngige Form als auch jede der beiden komplementären einzelsträngigen Formen ein, von denen bekannt ist oder vorhergesagt wird, dass sie die doppelsträngige Form bilden.
Das Folgende sind nicht beschränkende Beispiele von Polynukleotiden: ein Gen oder Genfragment, Exons, Introns, mRNS, tRNS, rRNS, Ribozyme, cDNS, rekombinante Polynukleotide, verzweigte Polynukleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNS jeder Sequenz, isolierte RNS jeder Sequenz, Nukleinsäuresonden und Primer. Ein Polynukleotid kann modifizierte Nukleotide einschließen wie methylierte Nukleotide und Nukleotidanaloga. Analoga von Purinen und Pyrimidinen sind in der Technik bekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Aziridinylcytosin, 4-Acetylcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, Pseudouracil, 5-Pentynyluracil und 2,6-Diaminopurin. Die Verwendung von Uracil als ein Ersatz für Thymin in einer Desoxyribonukleinsäure wird ebenfalls als eine analoge Form von Pyrimidin angesehen.
Falls vorhanden, kann der Nukleotidstruktur die Modifikation vor oder nach dem Zusammenbau des Polymers verliehen werden. Die Nukleotidsequenz kann durch Nichtnukleotidbestandteile unterbrochen sein. Ein Polynukleotid kann nach der Polymerisierung weiter modifiziert werden wie durch Konjugation mit einer Markierungskomponente. Andere Modifikationstypen, die in dieser Definition eingeschlossen sind, sind zum Beispiel „Caps" (Kappenstrukturen), Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotidmodifikationen, wie zum Beispiel jene mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Cabamate etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate etc.), jene, die überhängende Einheiten wie zum Beispiel Proteine enthalten (z. B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, ply-L-Lysin etc.), jene mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen etc.), jene, die Komplexbildner enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle etc.), jene, die Alkylatoren enthalten, jene mit modifizierten Verknüpfungen (z. B. alphaanomere Nukleinsäuren etc.), ebenso wie unmodifizierte Formen des/der Polynukleotid(e).
Weiterhin kann jede der gewöhnlicherweise in den Zuckern vorhandenen Hydroxylgruppen durch Phosphonatgruppen oder Phosphatgruppen ersetzt sein, geschützt sein durch Standardschutzgruppen oder aktiviert sein, um zusätzliche Verknüpfungen an zusätzliche Nukleotide zu bereiten, oder kann an feste Träger konjugiert sein. Die 5'- und 3'-terminalen OH-Gruppen können phosphoryliert sein oder können mit Aminen oder organischen Kappengruppeneinheiten von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen substituiert sein. Andere Hydroxyle können ebenfalls an Standardschutzgruppen derivatisiert sein.
Polynukleotide können auch analoge Formen von Ribose- oder Desoxyribosezuckern enthalten, die allgemein in der Technik bekannt sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf 2'-O-Methyl-, 2'-O-Alkyl-, 2'-Fluoro- oder 2'-Azidoribose, carbocyklische Zuckeranaloga, α-anomere Zucker, epimere Zucker wie Arabinose, Xylosen oder Lyxosen, Pyranosezuckern, Furanosezuckern, Sedoheptulosen, azyklische Analoga und abasische Nukleosidanaloga wie Methylribosid. Wie oben festgestellt, können eine oder mehrere Phosphodiesterverknüpfungen durch alternative Verknüpfungsgruppen ersetzt sein. Diese alternativen Verknüpfungsgruppen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Ausführungen, worin Phosphat ersetzt ist durch P(O)S („Thioat"), P(S)S („Dithioat"), „(O)NR2 („Amidat"), P(O)R, P(O)OR', CO oder CH2 („Formacetal"), wobei jedes R oder R' unabhängig H oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (1 bis 20 C), wahlweise enthaltend eine Ether- (-O-) Verknüpfung, Aryl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Araldyl. Es brauchen nicht alle Verknüpfungen in einem Polynukleotid identisch zu sein.
Obwohl konventionelle Zucker und Basen bei der Anwendung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden, kann die Substitution von analogen Formen von Zuckern, Purinen und Pyrimidinen bei der Gestaltung eines Endproduktes vorteilhaft sein, wie es alternative Gerüststrukturen, wie ein Polyamidgerüst, sein können.
Ein „Fragment" (auch genannt eine „Region") eines 11D10-Polynukleotids (d. h. ein Polynukleotid, das 11D10 kodiert) ist ein Polynukleotid, umfassend wenigstens 9 zusammenhängende Nukleotide einer variablen Region von 11D10 (d. h. kodierend wenigstens einen Teil einer variablen Region von 11D10). Bevorzugte Fragmente bestehen aus einer Region, die wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer variablen Region von 11D10 kodiert, bevorzugter wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren einer variablen und sogar noch bevorzugter wenigstens 15 zusammenhängende Aminosäuren einer variablen Region.
Der Begriff „rekombinantes" Polynukleotid, wie er hierin verwendet wird, beabsichtigt ein Polynukleotid genomischen, cDNS-, semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs, welches wegen seines Ursprungs oder aufgrund von Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil eines Polynukleotids assoziiert ist, mit welchem es in der Natur assoziiert ist, (2) an ein anderes Polynukleotid geknüpft ist, als es in der Natur verknüpft ist, oder (3) in der Natur gar nicht vorkommt.
Die Begriffe „Polypeptid", „Oligopeptid", „Peptid" und „Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um sich auf Polymere aus Aminosäuren irgendwelcher Länge zu beziehen. Das Polymer kann linear oder verzweigt sein, es kann modifizierte Aminosäuren einschließen und es kann durch Nicht-Aminosäuren unterbrochen sein. Die Begriffe schließen auch ein Aminosäurepolymer ein, das natürlicherweise oder durch Eingriff modifiziert worden ist, zum Beispiel Disulfidbindung, Glycosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder irgendeine andere Manipulation oder Modifikation wie Konjugation mit einem Markierungsbestandteil. Ebenfalls in die Definition eingeschlossen sind zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürliche Aminosäuren etc.), ebenso wie andere in der Technik bekannte Modifikationen. Es wird verstanden, dass, da die Polypeptide dieser Erfindung auf einem Antikörper basiert sind, die Polypeptide als einzelne Ketten oder assoziierte Ketten vorkommen können.
Ein Polypeptid-„Fragment" (auch genannt eine „Region") von 11D10 ist ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz von 11D10, die wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer Sequenz von 11D10 hat, bevorzugter wenigstens 8 zusammenhängende Aminosäuren und sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 10 zusammenhängende Aminosäuren, worin wenigstens 3 der Aminosäuren aus einer variablen Region von 11D10 stammen. Für Zwecke dieser Erfindung kann ein Fragment von 11D10 identifiziert und charakterisiert werden durch jede der folgenden Funktionen: (a) Homologie zu HMFG, (b) die Fähigkeit, Ab1 oder Ab3 zu binden, (c) die Fähigkeit, eine Immunantwort auszulösen (d. h. humorale und/oder zelluläre Antwort), vorzugsweise eine Immunantwort, die anti-HMFG ist, (d) die Fähigkeit, HMFG-assoziierte Tumoren zu verbessern, zu verzögern oder abzubremsen und/oder die Verbesserung oder Linderung des HMFG-assoziierten Erkrankungszustandes. Die Punkte (b), (c) oder (d) fallen unter den Begriff „immunologisch reaktiv". Ein 11D10-Fragment kann irgendeine, mehr als eine oder sämtliche der oben identifizierten Funktionen haben. Verfahren zur Bestimmung dieser Funktionen (a) bis (d) werden unten beschrieben werden.
Ein 11D10-Polypeptid, das zu HMFG „homolog" ist oder mit HMFG „Homologie teilt", bedeutet, dass, wenn die Aminosäuresequenzen von HMFG und einem 11D10-Polypeptid in irgendeiner Weise angeordnet werden, einschließlich in derselben oder in Umkehrorientierung bezüglich einander, wenigstens 2, vorzugsweise 3, bevorzugter 4 zusammenhängende Aminosäuren innerhalb des Polypeptids mit HMFG übereinstimmen. Da funktionelle Peptidfragmente für Zwecke dieser Erfindung sehr klein sein können, können nur wenige Aminosäuren übereinstimmen (zum Beispiel die erforderliche Anzahl zusammenhängender Aminosäuren, die für eine Bindungsstelle und/oder Antigenpräsentierung erforderlich sind, kann so wenig wie 2 bis 5 Aminosäuren sein). Ein 11D10-Polypeptid, das „eine Region der Homologie enthält" mit HMFG, teilt Homologie mit HMFG in seiner Aminosäuresequenz, wie oben definiert.
Ein „Fusionspolypeptid" ist ein Polypeptid, umfassend Regionen in einer anderen Position in der Sequenz, als sie in der Natur vorkommt. Die Regionen können normalerweise in gesonderten Proteinen vorkommen und in dem Fusionspolypeptid zusammengebracht werden, oder sie können normalerweise in demselben Protein vorkommen, aber in einer neuen Anordnung in dem Fusionspolypeptid platziert sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „Immunantwort" auf eine humorale Antwort, eine zelluläre Antwort oder beides.
Ein „funktionell äquivalentes Fragment" eines 11D10-Polypeptids oder -Polynukleotids bewahrt wenigstens eine Eigenschaft und/oder Funktion des 11D10-Polypeptids oder -Polynukleotids. Zum Beispiel können die Sequenzen durch Hinzufügen von zusätzlichen Nukleotiden oder Peptiden variiert werden, wie in der Technik bekannt, so dass die Funktionalität der Sequenz, Immunität zu induzieren, nicht geändert ist. Andere Beispiele sind Deletion und/oder Substitution von Sequenzen. Alternativ können die Sequenzen durch Substituieren von Nukleotiden oder Aminosäuren oder eine Kombination von Addition, Deletion oder Substitution variiert werden. Wie es für einen Fachmann ersichtlich ist, schließt Funktionalität einer Polypeptidsequenz, Immunität zu induzieren, andere Eigenschaften und/oder Aktivitäten der Sequenz ein, wie zum Beispiel Bindung an Ab1 und/oder Ab3. Weiter ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass „induzieren von Immunität" jeden Aspekt der Immunantwort einschließt, wie zum Beispiel eine humorale Antwort oder eine zelluläre Antwort. Es ist auch klar, dass Funktionalität einer Polynukleotidsequenz zum Teil von ihrer beabsichtigten Verwendung abhängt und dass jede Funktionalität, die in einem Fragment eines Polynukleotids bewahrt ist, auf diese Definition zutrifft. Zum Beispiel kann ein „funktionell äquivalentes Fragment" eines 11D10-Polynukleotids eines sein, in welchem eine Fähigkeit zum Hybridisieren bewahrt ist, indem das gewünschte Polynukleotid als eine Sonde verwendet werden kann. Alternativ kann ein „funktionell äquivalentes Fragment" eines 11D10-Polynukleotids bedeuten, dass das Polynukleotid ein Fragment von 11D10 kodiert (welches einen Teil der variablen Region einschließt), das eine Funktion hat, die verbunden ist mit intaktem 11D10 und vorzugsweise eine Funktion im Zusammenhang mit der Induktion von anti-HMFG-Immunität. Ein funktionell äquivalentes Fragment eines 11D10-Polynukleotids oder -Polynukleotids kann dieselbe, eine gesteigerte oder reduzierte Funktion haben, wenn es mit dem 11D10-Polypeptid oder -Polynukleotid verglichen wird. Andere Funktionen von 11D10 wurden oben aufgelistet. Ein funktionell äquivalentes Fragment hat wenigstens 9 Nukleotide oder wenigstens 5 Aminosäuren, vorzugsweise hat es wenigstens 15 Nukleotide oder wenigstens 10 Aminosäuren, sogar noch bevorzugter hat es wenigstens 25 Nukleotide oder wenigstens 20 Aminosäuren.
Eine „Zelllinie" oder „Zellkultur" bezeichnet höhere eukaryotische Zellen, die in vitro wachsen gelassen werden oder aufrechterhalten werden. Es wird verstanden, dass die Abkömmlinge einer Zelle nicht vollständig identisch (entweder morphologisch, genotypisch oder phänotypisch) mit der elterlichen Zelle sein können.
Ein „Vektor" ist ein selbst replizierendes Nukleinsäuremolekül, das ein inseriertes Nukleinsäuremolekül in und/oder zwischen Wirtszellen überträgt. Der Begriff schließt Vektoren ein, die hauptsächlich für die Insertion eines Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle, die Replikation von Vektoren, die hauptsächlich für die Replikation von Nukleinsäure wirken, und Expressionsvektoren, die für die Transkription und/oder Translation der DNS oder RNS wirken. Ebenfalls eingeschlossen sind Vektoren, die mehr als eine der obigen Funktionen bereitstellen.
Eine „Wirtszelle" schließt eine einzelne Zelle oder Zellkultur ein, die ein Empfänger für Vektor(en) oder für die Inkorporation von Nukleinsäuremolekülen und/oder Proteinen sein kann oder war. Wirtszellen schließen Nachfahren einer einzelnen Wirtszelle ein, und die Nachfahren müssen mit der ursprünglichen elterlichen Zelle nicht notwendigerweise vollständig identisch sein (in Morphologie oder in dem Genom des Gesamt-DNS-Bestandteils), aufgrund von natürlicher, zufälliger oder bewusster Mutation. Eine Wirtszelle schließt Zellen ein, die in vivo mit Polynukleotid(en) dieser Erfindung transfiziert worden sind.
„Expressionsvektoren" sind als Polynukleotide definiert, welche, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, zu einem Polypeptid(en) transkribiert und translatiert werden können. Ein „Expressionssystem" bedeutet zugleich gewöhnlich eine geeignete Wirtszelle, umfassend einen Expressionsvektor, der wirken kann, um ein gewünschtes Expressionsprodukt zu ergeben.
Eine „Signalsequenz" ist eine kurze Aminosäuresequenz, die neu synthetisierte sekretorische Proteine oder Membranproteine zu zellulären Membranen wie das endoplasmatische Reticulum und durch sie hindurch lenkt. Signalsequenzen sind typischerweise in dem N-terminalen Teil eines Polypeptids und werden abgespalten, nachdem das Polypeptid die Membran durchquert hat.
„Heterolog" bedeutet gewonnen von (d. h. erhalten von) einer genotypisch unterschiedlichen Einheit von dem Rest der Einheit, mit welcher sie verglichen wird. Zum Beispiel kann ein Polynukleotid durch Techniken der Gentechnik in ein Plasmid oder einen Vektor, gewonnen aus einer verschiedenen Quelle, gegeben werden, was folglich zu einem heterologen Polynukleotid wird. Ein Promotor, der an eine kodierende Sequenz gekoppelt ist, mit welcher er normalerweise nicht gekoppelt ist, ist ein heterologer Promotor.
Ein „isolierter" oder „gereinigter" Antikörper, Polynukleotid oder Polypeptid ist eines, das im Wesentlichen frei ist von den Materialien, mit welchen es in der Natur verbunden ist. Mit im Wesentlichen frei ist gemeint, wenigstens 50 %, vorzugsweise wenigstens 70 %, bevorzugter wenigstens 80 % und sogar noch bevorzugter wenigstens 90 % frei von den Materialien, mit welchen es in der Natur verbunden ist.
Ein „Vaccin" ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für die menschliche oder tierische Verwendung, die mit der Absicht verabreicht wird, den Empfänger mit einem Grad spezifischer immunologischer Reaktivität gegen ein bestimmtes Ziel oder eine Gruppe von Zielen zu verleihen. Die immunologische Reaktivität können Antikörper oder Zellen (besonders B-Zellen, Plasmazellen, T-Helferzellen oder cytotoxische T-Lymphozyten und ihre Vorläufer) sein, die immunologisch reaktiv sind gegen das Ziel oder irgendeine Kombination davon. Für Zwecke dieser Erfindung ist das Ziel, tumorassoziiertes Antigen HMFG oder jedes mit Tumor im Zusammenhang stehende Antigen, das gebunden wird durch 11D10. Immunologische Reaktivität kann gewünscht werden für experimentelle Zwecke, für die Behandlung eines bestimmten Zustands oder für die Eliminierung einer bestimmten Substanz.
Eine „stabile Duplex" aus Polynukleotiden oder ein „stabiler Komplex", gebildet zwischen zwei oder mehr Bestandteilen in einer biochemischen Reaktion, bezieht sich auf eine Duplex oder einen Komplex, der ausreichend lang dauernd ist, um zwischen der Bildung der Duplex oder des Komplexes und der danach folgenden Detektion zu bestehen, einschließlich sämtlicher optionalen Waschschritte oder anderer Manipulationen, die in der Zwischenzeit stattfinden können.
Eine biologische „Probe" umfasst eine Reihe von Probentypen, gewonnen aus einem Individuum, und wird typischerweise bei einem diagnostischen Vorgehen oder Test verwendet. Die Definition umfasst Blut und andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben wie Biopsieproben oder Gewebekulturen oder davon gewonnene Zellen und die Nachfahren davon. Die Definition schließt auch Proben ein, die in irgendeiner Weise nach der Beschaffung manipuliert worden sind, wie zum Beispiel durch Behandlung mit Reagenzien, Solubilisierung oder Anreicherung für gewisse Bestandteile wie Proteine oder Polynukleotide. Der Begriff „biologische Probe" umfasst eine klinische Probe und schließt auch Zellen in Kultur, Zellüberstände, Zelllysate, Serum, Plasma, biologisches Fluid und Gewebeproben ein.
Wie hierin verwendet, ist „Behandlung" ein Ansatz, günstige oder erwünschte klinische Ergebnisse zu gewinnen. Für Zwecke dieser Erfindung schließen günstige oder erwünschte klinische Ergebnisse ein, sind jedoch nicht beschränkt, auf die Erleichterung von Symptomen, die Verminderung des Ausmaßes der Erkrankung, ein stabilisierter (d. h. nicht verschlechternder) Erkrankungszustand, die Verhinderung des Ausbreitens (d. h. Metastase) von Erkrankung, die Verzögerung oder das Abbremsen des Erkrankungsfortschreitens, Verbesserung oder Linderung des Erkrankungszustandes und Remission (ob teilweise oder vollständig), ob detektierbar oder nicht detektierbar. „Behandlung" kann auch bedeuten Verlängerung des Überlebens im Vergleich mit dem erwarteten Überleben, falls keine Behandlung empfangen wird.
„Lindern" einer Erkrankung bedeutet, dass das Ausmaß und/oder unerwünschte klinische Manifestierungen eines Erkrankungszustandes vermindert werden und/oder der Zeitverlauf des Fortschreitens verlangsamt oder verlängert wird im Vergleich zu ohne Verabreichung von 11D10, 11D10-Polynukleotid(en) und/oder 11D10-Polypeptid(en).
Eine „effektive Menge" ist eine Menge, die ausreichend ist, günstige oder gewünschte klinische Ergebnisse zu bewirken. Eine effektive Menge kann in einer oder in mehreren Applikationen verabreicht werden. Für Zwecke dieser Erfindung ist eine effektive Menge von 11D10, 11D10-Polynukleotid und/oder 11D10-Polypeptid eine Menge, die ausreichend ist, eine Immunantwort, besonders eine anti-HMFG-Antwort zu induzieren. In Begriffen der Behandlung ist eine „effektive Menge" von 11D10, 11D10-Polynukleotid und/oder 11D10-Polypeptid eine Menge, die ausreichend ist, das Fortschreiten des HMFG-assoziierten Erkrankungszustands zu lindern, zu verbessern, zu stabilisieren, umzukehren, zu verlangsamen oder zu verzögern. Detektion und Messung dieser Indikatoren der Effizienz sind unten diskutiert.
Ein „Individuum" ist ein Vertebrat, vorzugsweise ein Säuger, bevorzugter ein Mensch. Säuger schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Bauernhoftiere, Sporttiere und Haustiere.
Allgemeine Techniken
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, solange nicht anderweitig angegeben, übliche Techniken der Molekularbiologie (einschließlich Rekombinationstechniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie nutzen, die alle im Fachwissen liegen. Solche Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt, wie zum Beispiel „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, Hrsg., 1984); „Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, Hrsg., 1987); „Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); „Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Wei & C. C. Blackwell, Hrsg.); „Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, Hrsg., 1987); „Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., 1987); „PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Multis et al., Hrsg., 1994); „Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., Hrsg., 1991).
Diese Techniken sind auf die Produktion der Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung anwendbar und sind als solche zu berücksichtigen, wenn diese erfinderischen Aspekte bedacht werden. Besonders nützliche Systeme für einzelne Aspekte werden unten diskutiert.
11D10
In einer Ausführung schließt die Erfindung einen monoklonalen anti-idiotypischen Antikörper (auf den hierin als ein „anti-Id" Bezug genommen wird) ein, hergestellt durch die Hybridomzelllinie ATCC Nr. 12020 oder Nachfahren davon. Ebenfalls eingeschlossen in diese Erfindung ist eine Hybridomzelllinie, bezeichnet ATCC Nr. 12020, und Nachfahren davon. Die Erzeugung und Charakterisierung werden in Beispiel 1 und unten beschrieben.
In einer anderen Ausführung schließt die Erfindung einen gereinigten Antikörper mit identifizierenden Eigenschaften, der identisch ist mit dem Antikörper, der durch die Hybridomzelllinie produziert wird, die ATCC Nr. 12020 genannt wird. Die Erfindung schließt auch ein Hybridom mit sämtlichen identifizierenden Eigenschaften einer Zelle der ATCC Nr. 12020 genannten Hybridomzelllinie ein.
Die Erfindung umfasst auch an eine Markierung konjugierten 11D10, der in der Lage ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen. Diese konjugierten Antikörper sind zum Beispiel nützlich in Detektionssystemen wie die Quantifizierung von Ab1 (und/oder Ab3) oder in bildgebenden Verfahren. Solche Markierungen sind in der Technik bekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungen und andere Antikörper. Die Markierungen können kovalent an 11D10 gekoppelt sein oder können an den 11D10 durch ein zweites Reagenz, wie einen zweiten Antikörper, Protein A oder einen Biotin-Avidin-Komplex konjugiert sein. Verfahren zur Markierung von Antikörper sind in der Technik bekannt und brauchen im Detail hierin nicht beschrieben werden.
Erzeugung und Selektion von 11D10
Selektion eines Ab1, um den anti-Id (Ab2) hervorzurufen. Eine Reihe von zelltypspezifischen monoklonalen Mausantikörpern („mAbs") wurde erzeugt, die Bestandteile von menschlichen Milchfettglobuli- (HMFG-) Membranen, assoziiert mit Brustcarcinomen, nicht aber mit den meist normalen Geweben, erkennen. Ceriani et al. (1983); Taylor-Papadimitriou et al. (1981) Int. J. Cancer 28: 17-21. Unter diesen mAbs ist MC-10 (auch genannt BrE1) ziemlich beschränkt und spezifisch in der Hinsicht, dass er mit einem Mucin mit hohem Molekulargewicht (MW 400.000) reagiert, das nur in winzigen Mengen in menschlichen Brustepithelzellen vorhanden ist und um wenigstens das Zehnfache bei Brustcarcinomzellen erhöht ist. WO 89/07268; EP 401247 . Der Antikörper ist für Brustkrebszellen in In-vitro-Studien cytotoxisch. Ceriani et al. (1983); Peterson et al. (1990).
Der mAb MC-10 hat eine sehr beschränkte histopathologische Verteilung in normalen Geweben. MC-10 bindet nur gewisse Bereiche der Epithelauskleidung der Lunge und verstreuter distaler gewundener Tubuli der Niere, ohne ersichtliche histopathologische Bindung an normale Brust- und viele andere normale Epithelien (Colon, Pankreas, Magen, Schilddrüse, Blase, Leber) und andere normale Gewebe (Nebennierenrinde, Gehirn, Lymphknoten, Myocard, Eierstock, Milz, Hoden). Auf der anderen Seite bindet ein hoher Prozentsatz unterschiedlicher menschlicher Tumoren, einschließlich der Brust, des Endometriums, der Lunge, des Eierstocks und des Pankreas, mAb MC-10 intensiv. Die für die MC-10-Bindung untersuchten, mit Formalin fixierten Tumoren (Anzahl positiver/Gesamtzahl) schließen ein: Brustcarcinom (CA) (144/182), Colon-CA (3/27), Duodenum-CA (0/1), Endometrium-CA (7/14), Nieren-CA (0/11), Lungen-CA (41/47), Eierstock-CA (20/26), Pankreas-CA (9/15), Prostata-CA (0/2), Speicheldrüsen-CA (0/3), Magen-CA (2/7), Schilddrüsen-CA (0/7), Hepatocholangio-CA (8/33), Inselzell-CA (0/2), Lymphom (0/20), Melanom (0/23), Meningiom (0/5), CA der Merkel'schen Zellen (4/9), Mesotheliom (1/11), Neuroblastom (0/2). Onkozytom (1/1), Paragangliom (0/10), pleomorphes Adenom (0/7). Unter den Sarkomen: ohne Sarkom (0/1), alveolar (0/1), Angiosarkom (0/1), der Hellzellen (0/2), Cystosarkom (0/1), Epithelioid (5/12), Ewings Sarkom (0/1), Fibrosarkom (0/1), Leiomyom (0/2), Liposarkom (0/1), malignes Fibrohistiozytom (0/2), Synovialmesotheliom (0/7), Spindelzellen-CA (5/16), undifferenziert (1/9); Schwannom (0/3), Seminom (0/4), Teratom (0/3), Thymom (0/8), Übergangsepithelcarcinom (5/10), undifferenziertes Carcinom (7/29), Warthins Tumor (0/1). Ceriani et al. (1990). Wir untersuchten auch hämatopoetische Zellen im Hinblick auf die Anwesenheit von MC-10-Ag durch FACS-Analyse in unserem Labor, und wir befanden jene Zellen, einschließend Granulozyten und Blutplättchen für Antigen negativ. Die Positivkontrolle MCF-7-Zellen färbten stark mit mAb MC-10. Folglich hat 11D10 das Potential, in einer großen Reihe von Krebsen verwendet zu werden, in welchen HMFG detektiert wird.
Der mAb MC-10 wurde folglich ausgewählt für die Produktion von anti-Id, da er ein einzigartiges und spezifisches Epitop eines Mucins mit hohem Molekulargewicht aus humanen Milchfettglobuli (HMFG) definiert, hauptsächlich in hoher Dichte durch menschlichen Brustkrebs und einigen anderen Tumorzellen exprimiert, er wird jedoch nicht in normalen adulten Geweben durch Immunoperoxydasefärbung gefunden oder bei hämatopoetischen Zellen, einschließlich Granulozyten durch Durchflusscytometrieanalyse.
Das brustkrebsassoziierte Epitop, definiert durch den monoklonalen Antikörper MC-10, ist ein geeignetes Ziel für aktive Immuntherapie gegen diese Tumoren. Dieses Ag wird exprimiert durch > 80 % der Fälle von Brustkrebs und ist in hoher Dichte auf Tumorgeweben im Vergleich mit wenigen normalen Geweben, die dieses Ag in Spurenmengen enthalten, vorhanden. Ceriani et al. (1983); Taylor-Papadimitriou et al. (1991). Das Ag wird in die Zirkulation nur in Spurenmengen ausgestoßen. Peterson et al. (1990) Hybridoma 9: 221-235. Der geringe Spiegel an zirkulierendem Ag scheint ersichtlich nicht die Bindung von radioaktiv markiertem anti-HMFG-mAbs an Tumorziele in In-vivo-Studien in fortgeschrittenen Brustkrebspatienten zu beeinflussen. Die beschränkte Spezifität von MC-10, zusammen mit seiner hohen Bindungsfähigkeit an repräsentative Brustkrebszelllinien MCF-7 und SKBR3, macht ihn zu einem ausgezeichneten Ziel zur Erzeugung von Ab2-Hybridome. Wir gewannen gereinigten MC-10 (IgG2Bκ) (Chargennr. 5319001), um einen anti-Idiotypen zu erzeugen.
Erzeugung von monoklonalen anti-idiotypischen Hybridomen und Selektion von 11D10. 11D10 wurde erhalten durch Immunisieren naiver Mäuse mit MC-10-anti-HMFG-Antikörper, um eine anti-idiotypische Antwort zu erzielen. Syngenische BALB/c-Mäuse wurden viermal mit MC-10 (Ab1) immunisiert und ihre Milchzellen wurden mit den milchsekretorischen Mausmyelom-P3-653-Zellen verschmolzen. Um anti-Idiotypen mit sämtlichen gewünschten Eigenschaften zu erhalten, wurde ein ausgedehnter Auswahlprozess genutzt, der die folgenden vier wichtigen Schritte einschloss: (1) positive Selektion für Antikörperbindung an MC-10; (2) negative Selektion gegen Antikörper erkennende isotypische oder allotypische Determinanten; (3) positive Selektion für eine Fähigkeit, die Bindung von MC-10 an HMFG zu inhibieren; (4) positive Selektion für eine Fähigkeit, eine humorale Immunantwort gegen das ursprüngliche tumorassoziierte Antigen (HMFG) sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen zu induzieren.
Es wurden etliche Ab2-Hybridome erhalten, die für den immunisierenden Id von MC-10 spezifisch waren und nicht mit irgendwelchen isotypischen oder allotypischen Determinanten reagierten. Um zu bestimmen, ob diese Ab2 gegen das Paratop von MC-10 gerichtet waren, wurde die Bindung von radioaktiv markiertem MC-10 an die Brusttumorzelllinien MCF-7 und SKBr3 in der Anwesenheit von variierenden Mengen von Ab2-Hybridomkulturüberständen untersucht. Ab2, die in der Lage waren, MC-10-Bindung an diese Zellen zu inhibieren, wurden wachsen gelassen und aus Ascitesfluid für weitere Untersuchungen aufgereinigt. Verschiedene gereinigte Ab2 wurden als Vaccine zubereitet und in naive Mäuse und Kaninchen in einem zweiwöchigen Plan injiziert. Nach vier Injektionen wurden Serumproben für Anwesenheit von Ab3 titriert, der nicht nur an den immunisierenden Ab2, sondern auch an HMFG band. Der Ab2, der reproduzierbar den höchsten Titer an Ab3 mit der gewünschten Spezifität indizierte, wurde 11D10 genannt. Weitere Details des verwendeten Verfahrens, um 11D10 zu gewinnen, sind in Beispiel 1 bereitgestellt.
Die Immunantwort in mit 11D10 immunisierten Tieren wurde weiter charakterisiert. Immunseren von sowohl Mäusen als auch Ratten, die mit 11D10 immunisiert worden waren, konkurrierten mit 11D10 um die Bindung an die Brustcarcinomzelllinie MCF-7 oder SKBr3 und inhibierten die Bindung von radioiodiertem MC-10 an 11D10 (7). Dies zeigte, dass der Ab3 in Mäusen und Kaninchen Idiotope mit Ab1 (MC-10) teilen könnte und wahrscheinlich an dasselbe Epitop wie Ab 1 bindet.
Es wurde auch monoklonaler Ab3 aus mit 11D10 immunisierten Mäusen gewonnen, der an MC-10-Positivantigen bindet. Der Ab3 (sowohl polyklonal als auch monoklonal) reagierte mit teilweise gereinigtem HMFG-Ag durch Dot-Blot-Analyse und färbte MCF-7-Zellen durch Immunperoxidaseverfahren. Zusätzlich opsonierten Kaninchen-Ab3-Seren die Tumorzelllinien MCF-7 oder SKBr3 in einem komplementvermittelten Cytotoxizitäts(CMC-) Test.
Wir entdeckten auch, dass Applikation von 11D10 an nicht-menschliche Primaten (Cynomolgusaffen) eine Immunantwort erzeugt, sowohl humoral als auch zellulär (Beispiel 3; Cancer Res. (1995) 55: 1525-1530). Der in Antwort auf 11D10 erzeugte Ab3 war spezifisch für HMFG (12 bis 17). Die Konzentration an Antikörpern (Ab3) war ziemlich hoch, da 1,32 mg gereinigter Ab3 aus 30 ml Serum wiedergewonnen wurde (44 μg/ml Serum). Nur 100 ng dieses gereinigten Ab3 waren in der Lage, die Bindung von > 60 % radioaktiv markiertem Ab1 an die HMFG-positive Brustkrebszelllinie MCF-7 zu inhibieren.
Zusätzlich zu humoraler Immunität wurde das zelluläre Immunansprechen in Affen durch T-Zell-Proliferationstest untersucht. Wesentliche Proliferation wurde festgestellt, wenn immunisierte periphere Blutlymphozyten (PBL) aus dem Affen, der 11D10 erhielt, in vitro mit 11D10 provoziert worden sind, aber nicht mit unverwandtem Kontroll-Ab2, 3H1 ( 19), was eine Id-spezifische zelluläre Proliferation nahe legt.
Im Hinblick auf die klinische Anwendung von anti-idiotypischen Antikörpern für die Immuntherapie ist die Demonstration der Induktion von spezifischen anti-TAA-Antikörpern in verschiedenen Tierarten ein wesentliches Erfordernis.
Wichtig ist, dass wir auch herausgefunden haben, obwohl Menschen mit HMFG-assoziierten Tumoren das HMFG-Antigen tolerieren, dass 11D10 der Immuntoleranz entkommt und eine Immunantwort im Individuum mit fortgeschrittener mit menschlichen Milchfettglobuli in Zusammenhang stehender Erkrankung, besonders Brustkrebs, auslöst. Drei Patienten mit HMFG positivem fortgeschrittenem Brustkrebs, bei welchen Standardtherapien fehlgeschlagen sind, wurde 11D10 verabreicht (Beispiel 5). Anfängliche Daten zeigten, dass alle drei dieser Patienten Antikörper entwickelten, welche anti-HMFG waren (20 bis 21); Patient # 2 war unspezifische Bindung, hatte jedoch eine gewisse Ab3-Reaktivität. Zusätzlich zeigte einer der Patienten eine zelluläre Immunantwort, wie belegt durch einen T-Zell-Proliferationstest (22). Nach weiterer Analyse (unter Verwendung von affinitätsgereinigtem Ab3) wurde gefunden, dass nur einer dieser drei Patienten Antikörper entwickelte, die anti-HMFG waren (27 und 28; Beispiel 10). Nach der Bewertung zusätzlicher Patienten (insgesamt 12), als sie zu dieser Studie hinzukamen (Beispiel 10), fanden wir heraus, dass 5 von 10 getesteten Patienten anti-HMFG-Antikörper entwickelten, wie beurteilt durch die Inhibition der Bindung von radioaktiv markiertem MC-10 (Ab1) an 11D10. Insgesamt vier Patienten (# 1, 5, 6 und 12) zeigten eine zelluläre Immunantwort (29). Eine detailliertere Beschreibung dieser Studie wird in den Beispielen 5 und 10 gefunden.
Zubereitung von 11D10
Der Antikörper dieser Erfindung kann durch etliche Wege erhalten werden. 11D10 kann aus dem hierin beschriebenen Hybridom ATCC 12020 produziert werden. Verfahren der Antikörperisolation sind in der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel. Harlow und Lane (1988) Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Der Antikörper kann aus dem Hybridom im Wege der Gewebekultur oder aus Mausascites erhalten werden und gereinigt werden unter Verwendung von üblichen Techniken für die Antikörperaufreinigung. Diese Techniken sind in der Technik bekannt. Zum Beispiel können die Zellen in einem geeigneten Medium kultiviert werden und das verwendete Medium kann als eine Antikörperquelle genutzt werden. Optional können matrixüberzogene Kanäle oder Perlen oder Zell-Co-Kulturen eingeschlossen sein, um das Wachstum der Antikörper produzierenden Zellen zu steigern. Für die Produktion großer Antikörpermengen ist es allgemein praktischer, ein Ascitesfluid zu gewinnen. Solche Verfahren sind in der Technik bekannt und umfassen allgemein das Injizieren von Hybridomzellen in einen immunologisch naiven histokompatiblen oder immuntoleranten Säuger, besonders eine Maus. Der Säuger wird wahlweise für die Ascitesproduktion durch die Vorabapplikation einer geeigneten Zusammensetzung vorbereitet; zum Beispiel Pristane. Vorzugsweise wird 11D10 aus BALB/c-Ascites unter Verwendung von rekombinanter Protein-G-Agarose-Chromatographie, gefolgt von Protein-A-CL-Sepharose-4B-Chromatographie, aufgereinigt.
Alternativ kann 11D10 chemisch synthetisiert werden unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzen und Information und der in der Technik bekannten Techniken, zum Beispiel einem im Handel erhältlichen automatisierten Peptidsynthesegerät, wie jenes, das von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), hergestellt wird.
Der 11D10-Antikörper ist von der Maus-IgG1-Unterklasse und kann durch jede Technik isoliert werden, die geeignet ist für Immunglobuline dieses Isotyps. Aufreinigungsverfahren können Salzfällung (zum Beispiel mit Ammoniumsulfat), Ionenaustauschchromatographie (zum Beispiel auf einer Kationen- oder Anionenaustauschsäule, die bei neutralem pH-Wert laufen gelassen wird und mit Stufengradienten steigender Ionenstärke eluiert wird), Gelfiltrationschromatographie (einschließlich Gelfiltrations-HPLC) und Chromatographie auf Affinitätsharzen wie Protein A, Protein G, Hydroxyapatit und anti-Immunglobulin. 11D10 kann auch gereinigt werden auf Affinitätssäulen, umfassend das MC-10-Paratop, zum Beispiel in der Form eines gereinigten Ab1 oder Ab3.
11D10 kann auch gewonnen werden durch die Verwendung von Routinerekombinationsverfahren, wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al. (1989). Zum Beispiel kann unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzen und Information ein Polynukleotid, das entweder die schwere oder leichte Kette von 11D10 kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor (der Kontrollsequenzen für die Transkription kontrolliert, wie ein Promotor) kloniert sein. Der Expressionsvektor wird wiederum in eine Wirtszelle eingeführt. Die Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen wachsen gelassen, so dass das Polynukleotid zu einem Protein transkribiert und translatiert wird. Schwere und leichte Ketten von 11D10 können gesondert erzeugt werden und können dann durch Disulfidbindungsneuanordnung kombiniert werden. Alternativ können Vektoren mit gesonderten Polynukleotiden, die jede Kette von 11D10 kodieren, oder ein Vektor mit einem einzelnen Polynukleotid, das beide Ketten als gesonderte Transkripte kodiert, in eine einzelne Wirtszelle transfiziert werden, die dann das gesamte Molekül produzieren und zusammenbauen kann. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine höhere eukaryotische Zelle, die das normale Kohlenhydratkomplement des Moleküls bereitstellen kann. Das in der Wirtszelle demzufolge produzierte 11D10 kann unter Verwendung von Standardtechniken in der Technik aufgereinigt werden. Ein 11D10-kodierendes Polynukleotid für die Verwendung bei der Produktion von 11D10 durch irgendeines dieser Verfahren kann wiederum aus dem 11D10-produzierenden Hybridom erhalten werden oder kann synthetisch oder rekombinant aus der hierin bereitgestellten DNS-Sequenz produziert sein.
Falls 11D10 einem Individuum verabreicht werden soll, ist 11D10 vorzugsweise zu wenigstens 80 % rein, bevorzugter zu wenigstens 90 % rein, sogar noch bevorzugter zu wenigstens 95 % rein, immer noch bevorzugter zu ungefähr 97 % rein, sogar noch bevorzugter zu ungefähr 99 % rein, sogar noch bevorzugter zu wenigstens 99,5 % rein, ebenso wie frei von Pyrogenen und anderen Kontaminantien. In diesem Zusammenhang wird prozentuale Reinheit berechnet als ein Gewichtsprozentsatz des gesamten Proteingehalts der Zubereitung.
Verwendungen für 11D10 und Verfahren unter Verwendung von 11D10
11D10 hat etliche Verwendungen. Es kann verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Individuum mit fortgeschrittenen HMFG-assoziierten Tumoren auszulösen, und folglich, um jenen Individuen für HMFG-assoziierte Tumoren zu behandeln. Vorzugsweise ist die Immunantwort anti-HMFG. Weiter kann 11D10 verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, die an HMFG oder 11D10 binden. 11D10 kann auch verwendet werden, um ungewollt im Überschuss markierten Ab1 aus der Zirkulation von Patienten zu entfernen, die zuvor mit markierten monoklonalen anti-HMFG-Antikörpern behandelt worden sind. Die Markierung kann jede an den Antikörper angeheftete Markierung sein, die geeignet ist für ihre beabsichtigte Verwendung, einschließend zum Beispiel Radioisotope, toxische Einheiten wie Toxine und Arzneimittel. 11D10 ist auch nützlich zur Steigerung der Tumordetektion bei der Bildgebung.
Die Verwendung von 11D10, um eine Immunantwort auszulösen oder bei der Behandlung. Die vorliegende Erfindung schließt Verfahren des Auslösens einer Immunantwort in einem Individuum mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung wie HMFG-assoziierten Tumoren, welche die Verabreichung einer effektiven Menge von 11D10 an das Individuum umfassen, ein. In diesem Zusammenhang ist eine „effektive Menge" eine Menge, die ausreichend ist, eine Immunantwort auszulösen, ob humoral und/oder zellulär. Vorzugsweise schließt die Immunantwort die Produktion von anti-HMFG ein.
Geeignete Patienten für die Applikation von 11D10-Antikörper können durch eine Anzahl unterschiedlicher Kriterien identifiziert werden. Versuchstieren kann man 11D10 zum Beispiel applizieren, um die Wirkung von 11D10 auf die Immunantwort zu untersuchen oder um nützliche Reagenzien wie anti-HMFG-spezifische Antikörper und Zelllinien zu gewinnen.
In einer bevorzugten Ausführung kann 11D10 verwendet werden, um eine Immunantwort auszulösen und/oder für die Behandlung und/oder für die Linderung von fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung wie HMFG-assoziierten Tumoren. Ein „HMFG-assoziierter Tumor" ist einer, der ein HMFG-Antigen enthält (d. h. ein mit HMFG assoziiertes Antigen), insbesondere exprimiert auf der Oberfläche von Tumorzellen wie Brust, Endometriumcarcinom, Eierstock, Übergangsepithelcarcinom und undifferenzierte Carcinome (andere Beispiele wurden oben beschrieben). Wie hierin verwendet, bedeutet „fortgeschrittene" HMFG-assoziierte Tumoren, dass Metastasen detektierbar sind, das heißt, detektierbare Tumormasse befindet sich an anderen Stellen als der Primärtumorstelle. Tumoren werden vorzugsweise detektiert durch bildgebende Techniken, die in der Technik bekannt sind, wie Röntgen- oder CT-Bild. Zum Auslösen einer Immunantwort, zur Linderung oder Behandlung wird eine effektive Menge an 11D10 einem Individuum mit fortgeschrittenem/n HMFG-assoziiertem/n Tumoren) verabreicht. Die Verabreichung einer effektiven Menge von 11D10 an Individuen mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung kann die Rate der Progression der Erkrankung verzögern oder verlangsamen oder die Erkrankung verbessern, im Vergleich mit anderen Individuen, die nicht so behandelt worden sind.
Es ist zu verstehen, dass in gewissen Situationen, die fortgeschrittene HMFG-assoziierte Tumoren, besonders fortgeschrittener Brustkrebs, involvieren, das Individuum, das 11D10 erhält, mäßig bis stark immungeschwächt sein kann, entweder aufgrund der Art der vorangegangenen Behandlung, der Erkrankung selber oder beidem. Folglich kann die Zeit, die erforderlich ist, eine Immunantwort zu erzielen und/oder die Anzahl von Injektionen von 11D10 und/oder die Menge an 11D10 pro Applikation variieren. Zum Beispiel kann ein Individuum eine längere Zeit benötigen, um eine Immunantwort auszulösen, wenn 11D10 erst einmal verabreicht worden ist. In diesem Falle wird empfohlen, dass das Individuum weiterhin für eine Immunantwort überwacht wird, falls keine anfängliche Immunantwort (d. h. innerhalb des ersten Monats) detektiert worden ist. Als ein anderes Beispiel kann ein Individuum mehr als die durchschnittliche Anzahl von Injektionen benötigen, um eine Immunantwort auszulösen.
Eine mögliche Indikation der Wirksamkeit der Applikation von 11D10, ob für das Auslösen einer Immunantwort und/oder die Behandlung oder ob Applikation von 11D10 indiziert ist, ist die Dichte von HMFG auf den Tumorzellen. Diese Dichte kann von Individuum zu Individuum stark variieren und kann über den Verlauf der Applikation von 11D10 und/oder mit dem Verlauf der Erkrankung variieren. Wie hierin verwendet, kann sich „Dichte" von HMFG auf jedes oder beides des Folgenden beziehen: (a) die Anzahl von Zellen pro Gesamtzellen in einer gegebenen biologischen Probe, die HMFG auf ihrer Oberfläche trägt; (b) die Menge an HMFG auf der Oberfläche jeder Zelle. Dichte (a) wird berechnet durch Notieren der Anzahl von Zellen in einer Probe, die gefärbt sind oder anderweitig zeigen, dass HMFG vorhanden ist, geteilt durch die Gesamtzahl an Zellen. Diese Dichte würde vorzugsweise höher als ungefähr 20 % sein, bevorzugter höher als ungefähr 30 %, bevorzugter höher als ungefähr 50 %, sogar noch bevorzugter höher als ungefähr 70 %, sogar noch bevorzugter höher als ungefähr 80 %, am bevorzugtesten höher als ungefähr 90 %. Folglich schließt die Erfindung die Applikation von 11D10 an ein Individuum mit einer Dichte von HMFG höher als ungefähr 20 %, vorzugsweise höher als 30 %, bevorzugter höher als 70 %, sogar noch bevorzugter höher als ungefähr 80 %, am bevorzugtesten höher als ungefähr 90 %, ein.
Dichte (b) wird angezeigt durch die relative Intensität der Färbung (oder Intensität irgendeiner Messung, die die Anwesenheit von HMFG anzeigt) von Zellen in einer Probe von einem Individuum im Verhältnis zu zum Beispiel einer Probe aus einem anderen Individuum. Für diese Dichte kann ein Fachmann eine empirische Bestimmung der Dichte machen. Dichte (b) ist relativ zu normalen Geweben (d. h. Zellen, denen HMFG fehlt oder unangegriffene Zellen), solchermaßen bevorzugte Bereiche können ungefähr 1,5fach, vorzugsweise ungefähr 3fach, bevorzugter ungefähr 10fach höhere Expression gegenüber unangegriffenen Zellen sein, wie detektiert durch immunhistochemische Färbungsdichte. Nicht angegriffene Zellen könnten auch von demselben Individuum stammen.
Dies soll nicht heißen, dass Individuen mit niedrigeren Dichten, zum Beispiel weniger als ungefähr 50 %, für die Applikation von 11D10 nicht indiziert sind. Während nicht gewünscht wird, durch eine einzelne Theorie gebunden zu sein, ist es möglich, dass die Applikation von 11D10 eine Reihe von Immunreaktionen auslösen könnte, die in einer allgemeineren Antwort resultieren, die wirksam ist gegen einen HMFG-assoziierten Tumor, wie zum Beispiel eine cytotoxische T-Zell-Antwort. Eine geringere Dichte kann jedoch zeigen, dass zusätzliche Therapien wünschenswert sind.
Es wird verstanden, dass Dichte auch verwendet werden kann als ein Indikator des Ausmaßes der Erkrankung und der Antwort auf die Applikation von 11D10. Zum Beispiel kann eine von einem Individuum beim Einsetzen der 11D10-Applikation entnommene Probe ungefähr 80 % Dichte zeigen (d. h. ungefähr 80 % der Zellen zeigen HMFG. Nach Empfangen von 11D10 kann eine Probe, die aus derselben Örtlichkeit entnommen wird, ungefähr nur 50 % Dichte zeigen, was anzeigt, dass HMFG-exprimierende Zellen zerstört werden. Ähnlich zeigt, falls sich die Intensität der Färbung einer Probe von einem Individuum, das 11D10 erhält, nach dem Erhalten von 11D10 vermindert, dass HMFG-tragende Tumorzellen zerstört werden.
Für Zwecke des Hervorrufens einer Immunantwort oder der Bereitstellung einer Behandlung für Individuen mit fortgeschrittenen HMFG-assoziierten Tumoren wird 11D10 parenteral, vorzugsweise intrakutan, verabreicht. Andere Applikationswege schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf intramuskulär, subkutan und intradermal. 11D10 kann auch indirekt appliziert werden durch Behandlung von kultivierten Zellen, gefolgt von dem Einführen dieser kultivierten Zellen in ein Individuum.
Die Menge des verabreichten 11D10 hängt von etlichen Faktoren ab, wie zum Beispiel dem Zustand des Individuums und dem Applikationsweg. Vorzugsweise wird die Dosis pro Applikation in einem Bereich von ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 20 mg liegen. Bevorzugter wird die Dosis in einem Bereich von ungefähr 0,5 mg liegen; bevorzugter von ungefähr 1 mg bis ungefähr 8 mg. Vorzugsweise beträgt die Dosis ungefähr 2 bis 8 mg. 11D10 wird typischerweise zweiwöchentlich für vier Injektionen verabreicht, gefolgt von monatlichen Injektionen, soweit erforderlich. Die zeitliche Abstimmung nachfolgender Injektionen (d. h. eine Aufrechterhaltungsdosis) wird unter anderem von dem Zustand und dem Ansprechen des behandelten Individuums abhängen. Ab3-Spiegel können zum Beispiel vorzugsweise durch die hierin beschriebenen diagnostischen Verfahren überwacht werden, um zu bestimmen, wann Aufrechterhaltungs- (Booster-) Applikationen gegeben werden sollten, was typischerweise ungefähr alle drei Monate sein würde.
Vorzugsweise wird 11D10 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff verabreicht. Ein pharmazeutisch annehmbarer Hilfsstoff ist eine vergleichsweise inerte Substanz, welche die Applikation einer pharmakologisch wirksamen Substanz erleichtert. Zum Beispiel kann ein Hilfsstoff der Vaccinzusammensetzung Form oder Konsistenz geben oder als ein Verdünnungsmittel wirken. Geeignete Hilfsstoffe schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Stabilisierungsmittel, Benetzungs- und Emulgierungsmittel, Salze zum Variieren der Osmolarität, Verkapselungsmittel, Puffer und Hautpenetrationsverstärker. Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen sind beschrieben in Remingtons Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, Hrsg., 18. Auflage, 1990).
Vorzugsweise wird 11D10 mit einem Adjuvanz verwendet, welches die Präsentation von 11D10 verstärkt oder anderweitig die Immunantwort gegen 11D10 erhöht. Geeignete Adjuvanzien schließen ein Aluminiumhydroxid, Alaun, QS-21 (US-Patent Nr. 5,057,540), DHEA (US-Patente Nr. 5,407,684 und 5,077,284), einschließlich seiner Vorläufer und modifizierten Formen (z. B. DHEA-S, die sulfonierte Form von DHEA), beta-2-Microglobulin (WO 91/16924), Muramyldipeptide, Muramyltripeptide (US-Patent Nr. 5,171,568) und Monophosphoryllipid A (US-Patent Nr. 4,436,728; WO 92/16231) und seine Derivate, z. B. Detox^TM und BCG (US-Patent Nr. 4,726,947). Andere geeignete Hilfsstoffe schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Aluminiumsalze, Squalenmischungen (SAF-1), Muramylpeptid, Saponinderivate, Zubereitungen von Mycobakterienwand, Mycolinsäurederivate, nichtionische oberflächenaktive Block-Copolymer- Substanzen, Quil A, Choleratoxin B-Untereinheit, Polyphosphazen und Derivate und immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) wie jene, die beschrieben sind von Takahashi et al. (1990) Nature 344: 873-875. Für die veterinärmedizinische Verwendung und für die Produktion von Antikörpern in Tieren können mitogene Bestandteile des Freunds Adjuvanz verwendet werden.
Die Wahl eines Adjuvanz wird zum Teil abhängen von der Stabilität des Vaccins in der Anwesenheit des Adjuvanz, dem Applikationsweg und der regulatorischen Annehmbarkeit des Adjuvanz, besonders wenn es für die menschliche Verwendung beabsichtigt ist. Zum Beispiel ist Alaun durch die United States Food and Drug Administration (FDA) für die Verwendung als ein Adjuvanz in Menschen zugelassen und wird in unseren klinischen V ersuchen verwendet. 11D10 kann in einer gefällten Form verabreicht werden; zum Beispiel kann Alaun-gefälltes 11D10 verwendet werden. Die Zubereitung von mit Aluminiumhydroxid gefälltem 11D10 wird beschrieben in den Beispielen 3 und 4. Falls QS-21 verwendet wird, werden vorzugsweise 100 μg für jede Dosis verwendet, die bevorzugt subkutan innerhalb von 30 Minuten nach dem Mischen mit 11D10 verabreicht wird (wobei darauf geachtet wird, sanft zu vermischen). Falls Detox^TM verwendet wird, werden vorzugsweise 0,12 ml für jede Dosis verwendet, welche vorzugsweise subkutan innerhalb von ungefähr 30 Minuten nach dem Mischen mit 11D10 verabreicht wird. Hersteller können allgemein Empfehlungen im Hinblick auf Mengen, Volumen, Zubereitung und Applikationsweg(en) bereitstellen.
Alternativ kann 11D10 verkapselt werden, zum Beispiel in Liposomen. Für das Verpacken von Polypeptiden zur Zufuhr an Zellen geeignete Liposomen sind in der Technik bekannt.
11D10 kann vor der Applikation hitzebehandelt werden und die Hitzebehandlung kann in der Anwesenheit eines Adjuvanz, zum Beispiel Alaun, geschehen. Zum Beispiel kann 11D10 auf ungefähr 40 bis 60 °C, vorzugsweise 45 °C bis 55 °C, für einen Zeitraum von ungefähr 5 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 15 Minuten bis 1 Stunde, erhitzt werden. Hitzebehandlung geschieht bevorzugter bei 45 °C für 30 Minuten in einem sterilen Röhrchen in einem Wasserbad. Die Hitzebehandlung kann jederzeit vor der Applikation geschehen. Vorzugsweise geschieht Hitzebehandlung innerhalb von 7 Tagen der Applikation. Andere Hitzebehandlungsverfahren können verwendet werden, solange die gewünschte Aktivität von 11D10 nicht signifikant unterdrückt wird.
Für die Zwecke des Hervorrufens einer Immunantwort kann 11D10 in einer unmodifizierten Form verabreicht werden. Es mag manchmal bevorzugt sein, 11D10 zu modifizieren, um seine Immunogenität zu verbessern. Verfahren zur Verbesserung der Immunogenität schließen unter anderem das Quervernetzen mit Mitteln wie Glutaraldehyd oder bifunktionellen Kopplungsmitteln oder das Anheften an ein polyvalentes Plattformmolekül ein. Immunogenität kann auch verbessert werden durch Kopplung an einen Proteinträger, besonders einen, der T-Zell-Epitope umfasst.
11D10 kann alleine oder in Verbindung mit anderen Mitteln verwendet werden, welche die gewünschte Aktivität/das gewünschte Ziel fördern. In diesem Zusammenhang kann ein „Mittel" jede einer Reihe von Substanzen sein. Weiter bedeutet „in Verbindung mit", dass das Mittel gleichzeitig, vor oder nach 11D10 verwendet werden kann. Eine angestrebte Aktivität ist jede Aktivität, die das angestrebte Ziel durch die Verwendung von 11D10 erleichtert, verstärkt, fördert oder moduliert. Mittel, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cytokine, Lymphokine, Adjuvanzien und Arzneimittel. Mittel schließen auch Substanzen ein, welche die Zufuhr von 11D10 erleichtern, wie Liposomen, oder Substanzen, welche die Zufuhr von 11D10 zu einem bestimmten Ziel fördern, zum Beispiel einen zellulären Rezeptor. Zum Beispiel kann 11D10 mit einem Cytokin wie GM-CSF verabreicht werden.
Um die Wirkung der Applikation mit 11D10 zu bestimmen, kann ein Individuum überwacht werden, entweder im Hinblick auf einen Antikörper (humoral) oder auf das zelluläre Immunansprechen gegen HMFG oder eine Kombination davon.
Um den Spiegel an HMFG-Antikörper (Ab3) in einer biologischen Probe zu bestimmen, zum Beispiel, werden Serum oder Plasma von dem Individuum gewonnen. Die Probe kann wahlweise für Immunglobulin angereichert werden, bevor der Test durchgeführt wird, obwohl es normalerweise nicht erforderlich ist. Falls ein Mausimmunglobulin (wie 11D10) als ein Testreagenz verwendet werden soll, wird die Probe vorzugsweise vorbehandelt, um anti-Maus-Immunglobulinaktivität zu entfernen. Dies kann zum Beispiel durchgeführt werden durch Abreichern auf einer Mausimmunglobulinsäule oder durch Mischen von unspezifischem Mausimmunglobulin in der Probe und Entfernen von sämtlichem gebildeten Immunpräzipitat.
Um den Test durchzuführen, wird anti-HMFG, das in der Probe vorhanden sein kann, mit einer nicht beschränkenden Menge eines antigenen Äquivalentes von HMFG in Kontakt gebracht. Dies kann isoliertes HMFG, Nitrocellulose mit HMFG, das durch direktes Blotten oder durch Transfer von einem Polyacrylamidgel darauf fixiert ist, HMFG-exprimierende Zellen (wie zum Beispiel MCF-7 oder SKBR3-Zellen), Membranzubereitungen von solchen Zellen oder fixierte Gewebeabschnitte, die HMFG enthalten, sein. Alternativ kann ein anti-Idiotyp, besonders 11D10 verwendet werden.
Wenn der Immunkomplex sich erst einmal gebildet hat, wird er allgemein von unkomplexiertem HMFG-Analogon abgetrennt, und die Menge des vorhandenen Komplexes wird bestimmt. Der Komplex kann zum Beispiel durch Zentrifugation, um Zellen oder ein Immunpräzipitat zu sammeln, oder durch Einfangen durch eine feste Phase abgetrennt werden. Die Menge des vorhandenen Komplexes kann durch Bereitstellen des HMFG-Analogons mit einer Markierung gemessen werden, entweder direkt oder durch Inkubieren mit einem sekundären Reagenz. Alternativ kann ein Kompetitionstest durchgeführt werden, in welchem die Probe zuerst mit dem HMFG-Analogon inkubiert wird und dann eine nicht begrenzende Menge an markiertem HMFG-Reagenz hinzugefügt wird, welche mit dem anti-HMFG konkurriert, das in der Probe vorhanden sein kann. Geeignete Markierungen schließen Radiomarkierungen, Enzymmarkierungen, fluoreszierende Markierungen und chemilumineszierende Markierungen ein. Eine Standardkurve wird unter Verwendung von Lösungen konstruiert, von denen bekannt ist, dass sie kein anti-HMFG enthalten, und unter Verwendung von Lösungen mit verschiedenen relativen Konzentrationen von anti-HMFG, anstelle der Probe. Die Probe, die die unbekannte Menge von anti-HMFG enthält, wird allgemein parallel untersucht, und die relative Menge des darin enthaltenen anti-HMFG wird bestimmt durch Vergleich mit der Standardkurve. Bevorzugte Tests für die Bestimmung von anti-HMFG-Spiegeln unter Verwendung von 11D10-Antikörpern werden detaillierter in dem folgenden Abschnitt beschrieben.
Der Isotyp des anti-HMFG-Antikörpers kann bestimmt werden durch Einschließen eines isotypspezifischen Reagenz in den Immuntest, entweder bei der Zubereitung oder der Markierungsphase. Zum Beispiel kann ein anti-menschliches IgG verwendet werden, um Antikörper der IgG-Klasse abzutrennen oder zu detektieren, der in einer chemischen Probe von menschlichem Ursprung vorhanden sein kann. Die Anwesenheit von spezifischem anti-HMFG der IgG-Klasse zeigt allgemein eine Erinnerungsantwort an. Die Anwesenheit von anti-HMFG der IgM-Klasse zeigt allgemein fortschreitende Immunstimulation an, wie sie zum Beispiel aufgrund der Anwesenheit eines HMFG-exprimierenden Tumors oder fortschreitender Behandlung mit 11D10 vorhanden sein kann.
Falls gewünscht, kann der in einer biologischen Probe detektierte anti-HMFG-Antikörper weiter charakterisiert werden; zum Beispiel durch Kompetition mit anti-MC10 (Ab1), um zu bestimmen, ob sie für verwandte Epitope auf HMFG spezifisch sind. Kompetitionstests zwischen Ab1 und Ab3 sind im Detail in dem Beispielabschnitt beschrieben.
Anti-HMFG-Antikörper kann auch getestet werden, um zu bestimmen, ob er cytotoxisch ist. Komplementvermittelte Cytotoxizität (CMC) wird zum Beispiel bestimmt durch die Verwendung von HMFG-exprimierenden Zielzellen (wie zum Beispiel MCF-7 oder SKBR3), markiert mit ⁵¹Cr. Markierung kann bewerkstelligt werden durch Inkubieren von ungefähr 106 Zellen mit ~ 200 μCi Na₂ ⁵¹CrO₄ für 60 Minuten bei 37 °C, gefolgt von Waschen. Der Test wird durchgeführt durch Inkubieren des Antikörpers (oder der den Antikörper enthaltenden klinischen Probe) mit den Zielzellen. Die opsonierten Zellen werden dann gewaschen und mit einer Komplementquelle inkubiert, zum Beispiel Meerschweinchenserum, das vorabsorbiert worden ist, um intrinsische Antikörperaktivität zu entfernen. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer bei 37 °C wird die Freisetzung von ⁵¹Cr in das Medium bestimmt und verglichen mit jener von nicht opsonierten Kontrollzellen. Die Freisetzung von ⁵¹Cr korreliert mit der CMC-Aktivität.
Ein anderer Weg, den anti-HMFG-Antikörper zu charakterisieren, ist durch Testen seiner Fähigkeit, an einer ADCC-Antwort (Cheresh et al. (1986), Cancer Res. 46: 5112) teilzunehmen. Radioaktiv markierte HMFG-exprimierende Zielzellen werden mit dem anti-HMFG (in der Form von hitzeinaktiviertem Serum) und Effektorzellen inkubiert. Normale menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) sind geeignete Effektorzellen und werden vorzugsweise in einem Verhältnis von Effektor zu Ziel von ungefähr 100 verwendet. Nach annähernd 4 Stunden bei 37 °C wird der Anteil von freigesetztem ⁵¹Cr bestimmt als ein Maß der ADCC-Aktivität.
Die zelluläre Immunantwort in einem Patienten, dem 11D10 verabreicht wird, kann quantifiziert werden durch das Durchführen von Standardfunktionstests für spezifische 7-Zell-Aktivität.
Ein Testtyp misst die T-Zell-Proliferation. Bei diesem Test werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) aus einer Gesamtblutprobe gewonnen, die dem behandelten Patienten entnommen worden ist. Für Versuchstiere können auch Milzzellen verwendet werden. T-Zellen können angereichert werden zum Beispiel durch Zentrifugation auf einem Gradienten wie Ficoll(TM). Die Zellen werden dann in der Anwesenheit von HMFG oder (üblicher) bestrahlten HMFG-exprimierenden Zellen bei zahlreichen Konzentrationen kultiviert. Vorzugsweise sind die Stimulatorzellen autolog mit den Responderzellen, besonders hinsichtlich der Histokompatibilitäts-Klasse-II-Antigene.
Ein anderer Testtyp misst die T-Zell-Cytotoxizität. Bei diesem Test wird eine angereicherte T-Zell-Population verwendet, um die Lyse von mit ⁵¹Cr-markierten HMFG-Expressions-Zielzellen, zubereitet wie zuvor, zu bewirken. Vorzugsweise sind die Effektorzellen autolog mit den Zielzellen, besonders hinsichtlich der Histokompatibilitäts-Klasse-I-Antigene. Die T-Zell-Population kann wahlweise mit HMFG oder einer relevanten Zelllinie vorstimuliert sein. Die T-Zellen werden dann in verschiedenen Verhältnissen mit ungefähr 104 markierten Zielzellen kombiniert, zum Beispiel in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Die Platte wird optional zentrifugiert, um Zellkontakt zu initiieren, und die Zellen werden zusammen für 4 bis 16 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die prozentuale spezifische Freisetzung von ⁵¹Cr in das Medium wird im Vergleich mit markierten Zielen, die allein kultiviert worden sind (Negativkontrolle), und mit einem Detergenz, wie 0,1 % Triton (TM) X-100, lysierten Zielen (Positivkontrolle) gemessen.
Andere relevante Messungen, um die Wirkung der 11D10-Applikation zu bestimmen, schließen klinische Tests ein, wie sie geeignet sein können bei der Bestimmung des Fortschreitens von Krebs des verdächtigen Typs. Solche Tests können Entzündungsindikatoren, Mammographie und Radioscintigraphie einschließen, wie anderswo in dieser Offenbarung beschrieben.
Verwendung von 11D10, um Immuntests durchzuführen. Ein anderer Weg, wie 11D10 verwendet werden kann, ist, die Anwesenheit eines Antikörpers oder eines anderen Immunbestandteils zu untersuchen, der an 11D10 oder an HMFG bindet. Solche Bestandteile können nach der therapeutischen Applikation von 11D10 vorhanden sein oder können spontan aufgrund Anwesenheit eines HMFG-exprimierenden Tumors in einem immunkompetenten Wirt entstehen. Tests können an biologischen Proben, gewöhnlich chemische Proben, durchgeführt werden.
In einer Ausführung dieser Erfindung wird 11D10 verwendet, um die Anwesenheit eines anti-HMFG, besonders anti-11D10-Idiotyp, zu detektieren; der in einer biologischen Probe vorhanden sein könnte. Die Probe wird vor der Durchführung des Tests geeignet zubereitet, wahlweise durch Anreicherung für Antikörperaktivität. Falls die biologische Probe verdächtigt wird, Antikörperaktivität gegen nicht-idiotypische Regionen von 11D10 (besonders Anti-Maus-Immunglobulin) zu enthalten, ist es zu bevorzugen, sie zu entfernen oder den Test durchzuführen, um ihre Detektion zu vermeiden. Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper können aus einer Probe zum Beispiel durch Fällung mit normalem Maus-IgG oder Absorption mit einem Maus-Ig-Absorptionsmittel entfernt werden. Die Bindung von Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, besonders jenem, der spezifisch ist für die Fc-Region, kann durch kluge Auswahl der Testreagenzien minimiert werden. F(ab')2 oder Fab-Fragmente von 11D10 und andere Maus-Immunglobulin-Reagenzien sind besonders geeignet.
Nachdem die Probe geeignet zubereitet ist, wird sie mit einem funktionellen Äquivalent von 11D10 im Überschuss unter Bedingungen vermischt, die die Bildung eines Komplexes zwischen 11D10 und jedem anti-HMFG, das vorhanden sein könnte, erlauben. Die Komplexmenge wird dann bestimmt und mit Komplexen verglichen, die mit Standardproben, die bekannte Mengen von HMFG in dem erwarteten Bereich enthalten, gebildet worden sind. Komplexbildung kann durch Immunfällung oder Nephelometrie beobachtet werden, es ist jedoch allgemein empfindlicher ein Reagenz zu nutzen, das mit solchen Markierungen, wie zum Beispiel Radioisotopen wie ¹²⁵I, Enzymen wie Peroxidase und β-Galactosidase, oder Fluorochromen wie Fuorescein, markiert ist.
Antikörpertests können in flüssiger Phase durchgeführt werden. Zum Beispiel kann anti-HMFG mit markiertem 11D10 vermischt werden. Alternativ kann der anti-HMFG in der Probe verwendet werden, um mit einem markierten anti-HMFG um die Bindungsstellen auf 11D10 zu konkurrieren. Allgemein werden gebundene und ungebundene Markierung voneinander getrennt, um die prozentuale Bindung zu quantifizieren. Geeignete Separationsverfahren schließen Gelfiltrationschromatographie und Fällung mit Antikörper gegen Immunglobulin der Arten, aus welcher die Probe gewonnen ist, wahlweise in der Anwesenheit von Polyethylenglycol, ein. Alternativ kann das Verhältnis von gebundener und ungebundener Markierung in situ bestimmt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Fluoreszenz/Quench-Markierungspaaren oder Enzym/Inhibitor-Markierungspaaren. Siehe zum Beispiel US-Patent 3,996,345 (Ullman et al.).
Es ist allgemein praktischer, einen Fangtest unter Verwendung eines Reagenz durchzuführen, das an eine feste Phase, wie zum Beispiel einem Polyethylenteströhrchen, einer Mikrotiterplattenvertiefung oder Magnetperle, gekoppelt ist. In einem Fangtest vom Kompetitionstyp konkurriert unmarkiertes anti-HMFG in der Probe mit markiertem anti-HMFG um die Bindung an 11D10. 11D10 kann direkt an den festen Untergrund angeheftet sein oder kann später eingefangen werden, zum Beispiel unter Verwendung von anti-11D10. In diesem Test steht die Menge an Markierung, die mit der festen Phase assoziiert ist, in einem umgekehrten Verhältnis zu der Menge an anti-HMFG in der Probe.
Beim Fangtest vom Sandwichtyp wird anti-HMFG durch angeheftetes 11D10 direkt oder durch ein sekundäres Reagenz an einer festen Phase gefangen. Nach dem Waschen wird anti-HMFG unter Verwendung von anti-Immunglobulin der geeigneten Art oder einem zweiten 11D10-Antikörper, an welchem eine Markierung direkt oder indirekt angeheftet ist, detektiert. Alternativ kann das anti-Immunglobulin an die feste Phase angeheftet sein, und markiertes 11D10 wird verwendet, um den Sandwich zu vervollständigen. Falls das verwendete anti-Immunglobulin isotypspezifisch ist, dann kann die Antikörperklasse ebenfalls bestimmt werden. Bei diesem Testtyp steht die Menge an Markierung, assoziiert mit der festen Phase, positiv in Zusammenhang mit der Menge von anti-HMFG in der Probe.
Andere Verfahren zum Messen von spezifischem Antikörper sind in der Technik bekannt und können angepasst werden, um anti-HMFG durch die Verwendung von 11D10 als das Zielantigen zu messen. Alle solchen angepassten Verfahren sind in dieser Erfindung verkörpert. Weitere Beschreibungen bestimmter Ausführungen werden in dem Beispielabschnitt bereitgestellt.
11D10 kann auch verwendet werden, um das Maß an zellulärer anti-HMFG-Aktivität zu messen, besonders anti-11D10-Idiotyp. In einem bevorzugten Beispiel wird 11D10 verwendet, um anti-HMFG-T-Zellen zu identifizieren, definiert für diesen Zweck als Lymphozyten, die einen T-Zell-Rezeptor exprimieren, der das 11D10-Idiotyp bindet. 11D10 kann mit einer Zellpopulation markiert und in Kontakt gebracht werden, die verdächtigt wird, anti-HMFG-T-Zellen zu enthalten. Alternativ kann unmarkierter 11D10 mit den Zellen vermischt werden und mit einem markierten sekundären Reagenz wie markiertes anti-Maus-Immunglobulin oder Protein A verfolgt werden. Geeignete Markierungen für diesen Zweck schließen Radiomarkierungen und fluoreszierende Markierungen ein. Die Verwendung von fluoreszierenden Markierungen würde es auch erlauben, anti-HMFG-Zellen von unspezifischen Zellen in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer abzutrennen.
Verwendung von 11D10, um markierten Ab1 zu entfernen. Die Erfindung schließt auch Verfahren unter Verwendung von 11D10 ein, um eine Markierung, zum Beispiel Radioaktivität, aus einem Individuum zu entfernen, das einen markierten anti-HMFG-Antikörper (Ab1), zum Beispiel für Radioscintigraphie oder Radiotherapie, empfangen hat. Ein Problem, das häufig war bei der Verwendung von Antikörper-gerichteten Radionukliden (d. h. Radioimmuntherapie), war die Anwesenheit von überschüssigem Ab1 in dem System, was die Dosierung von radioaktiv markiertem Antikörper für die Behandlung limitiert. Weiter mangelt es an effektiver Bildgebung unter Verwendung von radioaktiv markierten Antikörpern wegen überschüssigem zirkulierendem radioaktiv markiertem Antikörper, wobei es oftmals etliche Tage braucht, um Zirkulation und Gewebe frei zu bekommen. Bei diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird 11D10 dem Individuum eine bestimmte Zeit nach der Applikation des markierten anti-HMFG verabreicht. Die Absicht ist, dass 11D10 mit anti-HMFG an anderen Stellen als dem Tumor, wie zum Beispiel in der Zirkulation und in interstitiellen Räumen, komplexiert und dadurch seine Clearance gefördert wird. Als ein Ergebnis wird der Spiegel der markierten Einheit (wie Radioisotop) in nicht angegriffenen Geweben reduziert, und die Bildgebung des Tumors (im Vergleich mit benachbarten Geweben) wird erhöht. Ähnlich ist es wünschenswert, wenn Radionuklide Patienten für die Bestrahlung einer Tumorstelle verabreicht werden, kollaterales Aussetzen von nicht angegriffenem Gewebe zu reduzieren. Diese Erfindung schließt folglich Behandlungsverfahren ein, bei welchen ein radiomarkierter anti-HMFG-Antikörper in einer therapeutischen Dosis verabreicht wird, auf die ein molarer Überschuss von 11D10 folgt.
In jeder dieser Anwendungen wird eine 11D10-Menge gewählt, die sich in ausreichendem molarem Überschuss gegenüber dem markierten anti-HMFG befindet, um anti-HMFG, das an der Tumorstelle lokalisiert ist, zu orten und zu binden. Die zeitliche Abstimmung der Applikation und Menge von 11D10 wird von der Art des radioaktiv markierten Antikörpers, der Art des verwendeten Radioisotopes und dem Zustand des Individuums abhängen. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis von 11D10 zu dem anti-HMFG-Antikörper wenigstens ungefähr 5:1, bevorzugter ungefähr 25:1 bis 200:1. Vorzugsweise wird 11D10 5 bis 24 Stunden, nachdem das Individuum den anti-HMFG-Antikörper empfangen hat, verabreicht.
Verwendung von 11D10, um anti-HMFG-Antikörper, der an eine Tumorzelle gebunden ist, zu detektieren. Die Erfindung schließt auch Verfahren des Detektierens der Anwesenheit eines anti-HMFG-Antikörpers ein, der an eine Tumorzelle gebunden ist, umfassend die Schritte des Behandelns der Tumorzelle mit 11D10 für eine ausreichende Zeit, um die Bindung an den anti-HMFG-Antikörper zu erlauben, und Detektieren der Anwesenheit jedes gebildeten Komplexes. Die Absicht ist, für 11D10 anti-HMFG zu detektieren, welches an die Tumorzelle zuvor angeheftet worden ist, oder alternativ, die Bindung von anti-HMFG an die Tumorzelle zu fördern durch Bildung eines polyvalenten anti-HMFG/11D10-Immunkomplexes. Im ersteren Fall wird 11D10 mit einer detektierbaren Markierung oder einem Mittel, durch welches eine Markierung angeheftet werden kann, bereitgestellt. In dem letzteren Fall wird entweder der anti-HMFG oder 11D10 mit einer Markierung bereitgestellt.
Diese Strategie kann zum Beispiel verwendet werden, um eine HMFG-Antigen-tragende Zelle in einer isolierten Zellsuspension zu identifizieren. Die Zellen werden nacheinander oder gleichzeitig mit anti-HMFG und 11D10 inkubiert, gewaschen, und dann werden die markierten Zellen detektiert. Bevorzugte Markierungen für diese Ausführung schließen fluoreszierende Markierungen wie Fluorescein, Rhodamin und Texas-Rot ein. Wahlweise können markierte Zellen von unmarkierten Zellen abgetrennt werden; zum Beispiel durch Sortieren in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer oder durch Affinitätsauftrennung unter Verwendung jeder positiven oder negativen Festphasenimmunselektionstechnik, die in der Technik bekannt ist.
Die Strategie kann auch verwendet werden, zum Beispiel um Tumoren in einem angegriffenen Patienten zu detektieren oder bildlich zu veranschaulichen. Anti-HMFG und 11D10 werden dem Patienten verabreicht (gewöhnlich nacheinander), und es wird ihnen erlaubt, sich an der Tumorstelle zu akkumulieren. Geeignete Markierungen schließen Radiomarkierungen wie ¹¹¹In, ¹³¹I und 99mTc ein. Der Tumor wird dann detektiert oder sichtbar gemacht unter Verwendung von Standardtechniken der Radioscintigraphie.
11D10 Polynukleotide
Die Erfindung umfasst Polynukleotide, die die anti-idiotypischen Antikörper 11D10 oder Fragmente von 11D10 kodieren, basiert auf den in den 1 und 2 gezeigten Polynukleotidsequenzen. Diese Polynukleotide werden isoliert und/oder produziert durch chemische und/oder rekombinante Verfahren oder eine Kombination dieser Verfahren. Solange nicht anderweitig festgestellt, sollen die Begriffe „Polynukleotide" oder „11D10-Polynukleotide" sämtliche Ausführungen der Polynukleotide dieser Erfindung einschließen.
Die 11D10-Polynukleotide dieser Erfindung sind nützlich als Sonden, Primer, in Expressionssystemen und in pharmazeutischen Zubereitungen, einschließlich Vaccinen. Besonders nützliche Anwendungen der Polypeptide werden unten diskutiert.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit, welches eine Sequenz enthält, die ein Polypeptid mit immunologischer Aktivität von 11D10 kodiert, worin das Polypeptid wenigstens fünf zusammenhängende Aminosäuren einer variablen Region von 11D10 einschließt. In einer Ausführung kodiert die kodierende Polynukleotidsequenz die variable Region der leichten Kette. In einer anderen Ausführung kodiert die kodierende Polynukleotidsequenz die variable Region der schweren Kette.
Die Erfindung stellt auch 11D10-Polynukleotide bereit, die in den 1 und 2 abgebildet sind. In einer Ausführung wird ein isoliertes Polynukleotid, kodierend ein Polypeptid mit immunologischer Aktivität von 11D10, bereitgestellt, worin das Polypeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer variablen leichten Kette von 11D10 umfasst, abgebildet in SEQ ID Nr. 2 (1). In einer anderen Ausführung wird ein isoliertes Polynukleotid, kodierend ein Polypeptid mit immunologischer Aktivität von 11D10, bereitgestellt, worin das Polypeptid wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren einer variablen schweren Kette von 11D10 umfasst, abgebildet in SEQ ID Nr. 4 (2). In einer anderen Ausführung wird die (die variable Region) kodierende Polynukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 1 (1) abgebildet. In einer anderen Ausführung wird die (die variable Region) kodierende Polynukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 3 (2) abgebildet. Die Polynukleotidsequenz kann ähnlich sein mit jener, die in SEQ ID Nr. 1 (1) oder SEQ ID Nr. 3 (2) abgebildet ist, mit kleineren Änderungen, die gestaltet sind, die Codonverwendung oder -stabilität zu optimieren oder kann signifikant variieren. Es liegt im Fachwissen, solche Polynukleotide zu gestalten, wenn die Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 der SEQ ID Nr. 4 gegeben ist. 1 bildet die Nukleotidsequenz, SEQ ID Nr. 1, und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) der variablen Region der leichten Kette von 11D10 ab. 2 bildet die Nukleotidsequenz, SEQ ID Nr. 3, und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 1) der variablen Region der schweren Kette von 11D10 ab. Die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 ist 435 Basenpaare lang und wurde aus in Beispiel 2 beschriebenen Klonen gewonnen. Die Polynukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 3 hat 467 Basenpaare und wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, gewonnen.
In einer anderen Ausführung umfasst die Erfindung ein Polynukleotid, das einen Teil der variablen Region der leichten Kette von 11D10 kodiert, umfassend wenigstens ungefähr 60 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise 70 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 80 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugter wenigstens ungefähr 100 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 150 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID Nr. 1. Die Erfindung umfasst auch ein Polynukleotid, das einen Teil der variablen Region der leichten Kette von 11D10 kodiert, umfassend wenigstens ungefähr 15 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 25 zusanmenhängende Nukleotide, bevorzugter wenigstens ungefähr 30 zusammenhängende Nukleotide der CDR1-kodierenden Sequenz davon. Die Erfindung umfasst auch ein Polynukleotid, das einen Teil der variablen Region der leichten Ketten von 11D10 kodiert, umfassend wenigstens ungefähr 10 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 15 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 20 zusammenhängende Nukleotide der CDR2- oder CDR3-kodierenden Sequenz davon.
In einer anderen Ausführung umfasst die Erfindung ein Polynukleotid, das einen Teil der variablen Region der schweren Kette von 11D10 kodiert, umfassend wenigstens ungefähr 60 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 70 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 80 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugter wenigstens ungefähr 100 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 150 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID Nr. 3. Die Erfindung umfasst auch ein Polynukleotid, das einen Teil der variablen Region der schweren Kette von 11D10 kodiert, umfassend wenigstens 10 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 15 zusammenhängende Nukleotide, der CDR1-kodierenden Sequenz davon. Die Erfindung umfasst auch ein Polynukleotid, umfassend einen Teil der variablen Region der schweren Kette von 11D10, umfassend wenigstens 15 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 20 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens ungefähr 25 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugter wenigstens 35 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 50 zusammenhängende Nukleotide der CDR2- oder CDR3-kodierenden Sequenz davon.
In einer anderen Ausführung umfasst die Erfindung j edes der oben beschriebenen 11D10-Polynukleotide, worin das/die Polynukleotid(e) wenigstens 5 Aminosäuren einer komplementaritätsdefinierenden Region (CDR) kodiert/en. CDRs werden unten diskutiert.
Die Erfindung schließt Modifikationen der oben beschriebenen 11D10-Polynukleotide ein wie Deletionen, Substitutionen, Additionen oder Änderungen in der Art jeder Nukleinsäureeinheit. Eine „Modifikation" ist jeder Unterschied in der Nukleotidsequenz im Vergleich mit einem hierin gezeigten Polynukleotid, um ein 11D10-Polypeptidfragment zu kodieren und/oder jeder Unterschied hinsichtlich der Nukleinsäureeinheiten des Polynukleotids/der Polynukleotide. Solche Änderungen können nützlich sein, um das Klonieren zu erleichtern und die Expression von 11D10-Polynukleotiden zu modifizieren. Solche Änderungen können auch nützlich sein, um den Polynukleotid(en) wünschenswerte Eigenschaften wie Stabilität zu verleihen. Die Definition des hierin bereitgestellten Polynukleotids gibt Beispiele dieser Modifikationen an.
Die Erfindung umfasst 11D10-Polynukleotide, einschließlich solche voller Länge (nicht verarbeitet), verarbeitet, kodierend, nicht-kodierend oder Teile davon, vorausgesetzt, dass diese Polynukleotide eine Region enthalten, die wenigstens einen Teil der variablen Region von 11D10 kodieren. Auch verkörpert sind die mRNS- und cDNS-Sequenzen und Fragmente davon, welche einen Teil des die variable Region kodierenden Segmentes einschließen.
Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die für funktionell äquivalente Varianten und Derivate von 11D10 und funktionell äquivalente Fragmente davon kodieren, die die Eigenschaften der dadurch kodierten Polypeptide verstärken, reduzieren oder nicht signifikant beeinflussen können. Diese funktionell äquivalenten Varianten, Derivate und Fragmente zeigen die Fähigkeit, eine Immunantwort zu induzieren, vorzugsweise eine anti-HMFG-Immunantwort. Zum Beispiel sind Änderungen in einer DNS-Sequenz, welche die kodierte Aminosäuresequenz nicht ändern, ebenso wie Änderungen, die in konservativen Substitutionen von Aminosäureresten resultieren, eine oder wenige Aminosäuredeletionen oder -additionen und Substitutionen von Aminosäureresten durch Aminosäureanaloga jene Änderungen, die nicht signifikant die Eigenschaften des kodierten Polypeptids beeinflussen werden. Nukleotidsubstitutionen, die die kodierten Aminosäurereste nicht ändern, können nützlich sein, um die Genexpression in unterschiedlichen Systemen zu optimieren. Geeignete Substitutionen sind Fachleuten bekannt und werden zum Beispiel gemacht, um bevorzugte Codonverwendung in bestimmten Expressionssystemen widerzuspiegeln. In einem anderen Beispiel können alternativ gesplicte Polynukleotide ein funktionell äquivalentes Fragment oder Variante von 11D10 hervorrufen. Alternativ verarbeitete Polynukleotidsequenzvarianten werden definiert als Polynukleotidsequenzen, die mRNS entsprechen, welche sich in der Sequenz unterscheiden, die jedoch aus derselben genomischen Region stammen, zum Beispiel mRNS, die aus dem Folgenden resultiert: 1) die Verwendung von alternativen Promotoren, 2) die Verwendung von alternativen Polyadenylierungsstellen, oder 3) die Verwendung von alternativen Splicestellen.
Die 11D10-Polynukleotide der Erfindung schließen auch Polynukleotide ein, die andere 11D10-Fragmente kodieren. Die 11D10-Fragmente kodierenden Polynukleotide sind zum Beispiel nützlich als Sonden, therapeutische Mittel und als eine Matrize zum Kodieren von zahlreichen funktionellen und/oder Bindungsdomänen von 11D10. Demgemäß schließt die Erfindung ein Polynukleotid ein, das eine Region aus wenigstens 15 zusammenhängenden Nukleotiden einschließt, bevorzugter von wenigstens ungefähr 20 zusammenhängenden Nukleotiden, bevorzugter wenigstens ungefähr 25 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugter ungefähr 35 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugter ungefähr 50 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 75 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 100 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 200 zusammenhängende Nukleotide, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 300 zusammenhängende Nukleotide, die ein stabiles Hybrid mit einem Polynukleotid, welches die variable Region der leichten Kette oder der schweren Kette von 11D10 kodiert, bilden, aber nicht mit anderen Immunglobulin kodierenden Regionen, die zum Zeitpunkt der Anmeldung dieser Anmeldung bekannt sind. In einer Ausführung ist die Region in der Lage, eine stabile Duplex mit einem Polynukleotid zu bilden, das aus der die variable Region der leichten Kette kodierenden Sequenz, SEQ ID Nr. 1, besteht, unter Bedingungen, unter denen die Region ein stabiles Hybrid mit SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 14 nicht bildet. In einer anderen Ausführung ist die Region in der Lage, eine stabile Duplex mit einem Polynukleotid zu bilden, das aus einer die variable schwere Kette kodierenden Sequenz der SEQ ID Nr. 3 besteht, unter Bedingungen, unter denen die Region ein stabiles Hybrid mit SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 32 nicht bildet.
In einer anderen Ausführung umfassen die 11D10-Polynukleotidfragmente ungefähr 15, vorzugsweise 20, sogar noch bevorzugter 30 Basen der in 1 (SEQ ID Nr. 1) oder 2 (SEQ ID Nr. 3) abgebildeten Sequenz. Ein Fragment dieser ungefähren Größe könnte für eine Bindungsstelle für einen Ab1- oder Ab3-Antikörper kodieren. Geeignete Fragmente sind jene, die spezifisch an 11D10-DNS oder -RNS hybridisieren, so dass sie wirksam sind als Primer oder Sonden. Die Primer sind besonders nützlich bei der Polymerasekettenreaktion (PCR).
Hybridisierungsreaktionen können unter Bedingungen unterschiedlicher „Stringenz" durchgeführt werden. Bedingungen, die die Stringenz einer Hybridisierungsreaktion erhöhen, sind weit bekannt und in der Technik veröffentlicht. Siehe zum Beispiel Sambrook und Maniatis. Beispiele relevanter Bedingungen schließen ein (in der Reihenfolge steigender Stringenz): Inkubationstemperaturen von 25 °C, 37 °C, 50 °C und 68 °C; Pufferkonzentrationen von 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (wobei SSC 0,15 M NaCl und 15 mM Citratpuffer ist) und ihre Äquivalente unter Verwendung von anderen Puffersystemen; Formamidkonzentrationen von 0 %, 25 %, 50 % und 75 %; Inkubationszeiten von 5 Minuten bis 24 Stunden; 1, 2 oder mehr Waschschritte; Waschinkubationszeiten von 1, 2 oder 15 Minuten; und Waschlösungen aus 6 X SSC, 1 X SSC oder 0,1 X SSC oder entmineralisiertes Wasser.
„Tm" ist die Temperatur in Grad Celsius, bei welcher 50 % einer Polynukleotidduplex, hergestellt aus komplementären Strängen, die in antiparalleler Richtung durch Watson-Crick-Basenpaarung über Wasserstoff gebunden sind, in Einzelstränge unter Bedingungen des Experimentes dissoziieren. Tm kann gemäß einer Standardformel vorhergesagt werden, wie zum Beispiel: Tm = 81,5 + 16,6 Log[Na+] + 0,41 (%G/C) – 0,61 (%F) – 600/Lwobei [Na+] die Kationenkonzentration (gewöhnlich Natriumion) in mol/l ist; (%G/C) die Anzahl von G- und C-Resten als ein Prozentsatz von Gesamtresten in der Duplex; (%F) der prozentuale Anteil von Formamid in der Lösung (w/v); und L die Anzahl von Nukleotiden in jedem Duplexstrang ist.
Nützliche 11D10-Polynukleotid kodierende Fragmente von 11D10 können erhalten werden durch die Erzeugung von Polynukleotidfragmenten (basierend auf SEQ ID Nr. 1 in 1 oder SEQ ID Nr. 3 in 2, zum Beispiel) und Testen der dadurch kodierten Polypeptide für die Funktion von Interesse. Alternativ könnte eine Polynukleotidsequenz, wenn ein gewünschtes 11D10-Polypeptid gegeben ist, aus der Aminosäuresequenz des 11D10-Polypeptids abgeleitet werden. Zum Beispiel können 11D10-Polypeptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Ab1 und/oder Ab3 zu binden oder eine Immunantwort auszulösen, getestet werden. Untersuchungen dieser zahlreichen Funktionen werden unten diskutiert.
Gewinnung schließt auch Polynukleotide ein, die 11D10-Derivate oder – Varianten kodieren, welche eines oder mehrere 11D10-Polypeptide enthalten, wie zum Beispiel Polynukleotide, die scFv, Polymere, Fusionsproteine und Chimären kodieren. Diese 11D10-Formen sind unten diskutiert.
Die Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die kovalent mit einer detektierbaren Markierung gekoppelt sind. Solche Polynukleotide sind zum Beispiel nützlich als Sonden für die Detektion verwandter Nukleotidsequenzen.
Zubereitung von 11D10 Polynukleotiden
Die Polynukleotide dieser Erfindung können unter Verwendung von chemischer Synthese, rekombinanten Verfahren oder PCR erhalten werden.
Verfahren der chemischen Polynukleotidsynthese sind in der Technik wohlbekannt und brauchen im Detail hierin nicht beschrieben werden. Ein Fachmann kann die hierin bereitgestellten Sequenzen und ein kommerzielles DNS-Synthesegerät verwenden, um eine gewünschte DNS-Sequenz zu produzieren.
Für die Zubereitung von 11D10-Polynukleotiden unter Verwendung von rekombinanten Verfahren kann ein eine gewünschte Sequenz umfassendes Polynukleotid in einem geeigneten Vektor inseriert werden, und der Vektor kann wiederum in eine geeignete Wirtszelle für die Replikation und Amplifikation eingeführt werden. Polynukleotide können in Wirtszellen durch jedes in der Technik bekannte Mittel inseriert werden. Zellenwerden transformiert durch Einführen eines Fremdpolynukleotids durch direkte Aufnahme, Endocytose, Transfektion, F-Paarung oder Elektroporation. Wenn es erst einmal eingeführt ist, kann das Fremdpolynukleotid in der Zelle als ein nicht-integrierter Vektor (wie zum Beispiel ein Plasmid) aufrechterhalten werden oder kann in das Wirtszellgenom integriert werden. Das so amplifizierte Polynukleotid kann aus der Wirtszelle durch in der Technik wohlbekannte Verfahren isoliert werden. Siehe zum Beispiel Sambrook et al. (1989).
Alternativ erlaubt PCR die Reproduktion von DNS-Sequenzen. PCR-Technologie ist in der Technik wohlbekannt und ist beschrieben in den US-Patenten mit den Nr. 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 und 4,683,202, ebenso wie PCR: The Polymerase Chain Reaction Mulis et al., Hrsg., Birkauswer Press, Boston (1994).
RNS kann erhalten werden unter Verwendung der isolierten DNS in einem geeigneten Vektor und ihr Inserieren in eine geeignete Wirtszelle. Wenn die Zelle repliziert und die DNS in RNS transkribiert wird, dann kann die RNS unter Verwendung von Fachleuten wohlbekannten Verfahren isoliert werden, wie dargelegt in Sambrook et al. (1989), zum Beispiel.
Falls sie als Vaccin verwendet werden, werden 11 D 10-Polynukleotide enthaltende Plasmide zubereitet, wie beschrieben von Horn et al. ((1995) Human Gene Therapy 6: 565-573), was eine Plasmid-DNS pharmazeutischer Güte erzeugt, geeignet für die Applikation.
Klonier- und Expressionsvektoren, umfassend ein 11D10 Polynukleotid Die vorliegende Erfindung schließt weiter eine Reihe von Vektoren ein, die darin 11D10-Polynukleotid(e) kloniert haben. Diese Vektoren können für die Expression von rekombinanten Polypeptiden, ebenso wie als eine Quelle von 11D10-Polynukleotiden verwendet werden. Kloniervektoren können verwendet werden, um wiederholt Kopien der 11D10-Polynukleotide, die sie enthalten, zu gewinnen, oder als ein Mittel zur Lagerung der Polynukleotide in einer Hinterlegung für die zukünftige Wiedergewinnung. Expressionsvektoren (und Wirtszellen, die diese Expressionsvektoren enthalten) können verwendet werden, um Polypeptide zu gewinnen, die aus den Polynukleotiden erzeugt werden, die sie enthalten. Sie können auch verwendet werden, wo es wünschenswert ist, 11D10-Polypeptide in einem Individuum zu exprimieren, um folglich intakte Zellen haben, die in der Lage sind, das Polypeptid zu synthetisieren, wie zum Beispiel bei der Gentherapie. Geeignete Klonier- und Expressionsvektoren schließen alle in der Technik bekannten ein, zum Beispiel jene für die Verwendung in bakteriellen, Säuger-, Hefe- und Insektenexpressionssystemen. Spezifische Vektoren und geeignete Wirtszellen sind in der Technik bekannt und brauchen im Detail hierin nicht beschrieben werden. Zum Beispiel siehe Gacesa und Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994).
Klonier- und Expressionsvektoren enthalten typischerweise einen selektierbaren Marker (zum Beispiel ein Gen, das ein Protein kodiert, welches für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist), obwohl solch ein Markergen auf einer anderen Polynukleotidsequenz getragen sein kann, die gleichzeitig in die Wirtszelle eingeführt worden ist. Nur jene Wirtszellen, in welche ein selektierbares Gen eingeführt worden ist, werden überleben und/oder wachsen unter selektiven Bedingungen. Typische Selektionsgene kodieren Protein(e), das/die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxinsubstanzen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat etc., verleiht/en; (b) auxotrophe Komplementmängel; oder (c) die kritische Nährstoffe liefern, die aus den Komplexmedien nicht erhältlich sind. Die Wahl des sauberen Markergens wird von der Wirtszelle abhängen und geeignete Gene für verschiedene Wirte sind in der Technik bekannt. Klonier- und Expressionsvektoren enthalten auch typischerweise ein durch den Wirt erkanntes Replikationssystem.
Geeignete Kloniervektoren können gemäß Standardtechniken konstruiert werden oder können aus einer großen Anzahl von in der Technik erhältlichen Kloniervektoren ausgewählt werden. Während der ausgewählte Kloniervektor nach der Wirtszelle variieren kann, von der beabsichtigt ist, dass sie verwendet wird, werden nützliche Kloniervektoren allgemein die Fähigkeit zur Selbstreplikation haben, können ein einzelnes Ziel für eine bestimmte Restriktionsendonuklease besitzen und/oder können Gene für einen Marker tragen, der beim Selektieren von den Vektor enthaltenden Klonen verwendet werden kann. Geeignete Beispiele schließen Plasmide und bakterielle Viren ein, z. B. pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, Co1E1, pCR1, RP4, Phagen-DNS und Shuttlevektoren wie pSA3 und pAT28. Diese und viele andere Kloniervektoren sind von kommerziellen Verkäufern wie BioRad, Strategene und Invitrogen erhältlich.
Expressionsvektoren sind allgemein replizierbare Polynukleotidkonstrukte, die ein Polynukleotid enthalten, welches ein 11D10-Polypeptid von Interesse kodiert. Das 11D10-Polypeptid kodierende Polynukleotid ist operativ an geeignete Transfektionskontrollelemente gekoppelt, wie zum Beispiel Promotoren, Enhancer und Terminatoren. Für die Expression (d. h. Translation) sind gewöhnlich ein oder mehrere Translationskontrollelemente ebenfalls erforderlich, wie zum Beispiel Ribosomenbindungsstellen, Translationsstartstellen und Stoppkodons. Diese Kontrollelemente (transkriptional und translational) können von 11D10-Nukleotiden (d. h. dem 11D10-Gen) abgeleitet werden oder sie können heterolog sein (d. h. von anderen Genen und/oder anderen Organismen erhalten sein). Eine Polynukleotidsequenz, die ein Signalpeptid kodiert, kann auch eingeschlossen sein, um einem 11D10-Polypeptid zu erlauben, Zellmembranen zu überqueren und/oder in ihnen zu stecken oder von der Zelle sezerniert zu werden. Eine Anzahl von für die Expression in eukaryotischen Zellen, einschließlich Hefe-, Vogel- und Säugerzellen, geeignete Expressionsvektoren sind in der Technik bekannt. Ein Beispiel eines Expressionsvektors ist pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), bei welchem die Transkription durch den frühen Cytomegalovirus- (CMV-) Promotor/Enhancer gelenkt wird. Dieser Vektor enthält auch Erkennungsstellen für multiple Restriktionsenzyme für die Insertion des 11D10-Polynukleotids von Interesse. Ein anderes Beispiel eines Expressionsvektors (-systems) ist das Baculovirus/Insektensystem.
Die Polynukleotide von Interesse enthaltenden Vektoren können in die Wirtszelle durch jedes einer Anzahl geeigneter Mittel eingeführt werden, einschließlich Elektroporation, Transfektion und der Nutzung von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran oder andere Substanzen; Mikroprojektilbeschuss; Lipofektion; und Infektion (wo der Vektor ein infektiöses Mittel ist, wie Vacciniavirus, was unten diskutiert wird). Die Wahl des Mittels zum Einführen von Vektoren oder 11D10-Polynukleotiden wird oftmals von der Wirtszelle abhängen.
Wenn erst einmal in eine geeignete Wirtszelle, zum Beispiel E. coli oder COS-7, eingeführt, kann die Expression von 11D10-Polypeptid(en) bestimmt werden unter Verwendung jeder der hierin beschriebenen Untersuchungen. Zum Beispiel kann die Anwesenheit von 11D10-Polypeptid detektiert werden durch RIA oder ELISA des Kulturüberstandes (falls das 11D10-Polypeptid(e) sezerniert wird) oder Zelllysaten.
Ein besonders nützlicher Expressionsvektor für 11D10-Polynukleotide ist ein Vacciniavirus, einschließend eine 11D10-Polynukleotidsequenz, das auch bei Vaccinzubereitungen verwendet werden kann. Moss (1991) Science 252: 1662-1667. Um Polynukleotidsequenzen in Vaccinia einzuführen, die das 11D10-Polypeptid, einschließlich 11D10-Polypeptidfragmenten kodieren, wird die Polynukleotidsequenz von Interesse als erstes in ein Plasmid inseriert, das einen Vacciniaviruspromotor mit flankierenden Sequenzen enthält, die zu Vaccinia-DNS-homolog sind, die nicht essentiell für die Replikation ist. Plasmid enthaltende Zellen werden dann mit Vaccinia infiziert, was zu einem niedrigen Niveau an homologer Rekombination zwischen Plasmid und Virus führt, mit dem Ergebnis des Transfers des Vacciniapromotors und der 11D10-Polypeptidkodierenden Polynukleotidsequenz in das Vacciniavirusgenom. Typischerweise wird das 11D10-Polynukleotid in das virale tk- (Thymidinkinase-) Gen inseriert. Insertion in die tk-Stelle schwächt das Virus um mehr als das 10.000fache im Vergleich mit Wildtyp ab (Flexner et al. (1980) Vaccine 88 (Cold Spring Harbor Laboratory), 179-184). Rekombinantes Virus wird durch den tk^--Phänotypen identifiziert. Vorzugsweise befindet sich die Expression des 11 D 10-Polynukleotids unter der Kontrolle des frühen/späten Promotors von Vaccinia (7,5 K), wodurch die resultierenden 11D10-Polypeptide in infizierten Zellen während des Lebenszyklus' des Virus hindurch exprimiert werden können. Andere in der Technik bekannte Promotoren können jedoch verwendet werden, wie zum Beispiel pH6, synthetische Promotoren, SV40-Promotoren oder Promotoren aus Adenovirus. Die Expression des 11D10-Polypeptids/der -Polypeptide geschieht in Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia infiziert sind, oder Individuen, die mit lebendem rekombinanten Vacciniavirus immunisiert worden sind. Die Konstruktion eines Vacciniavektors für die Expression von 11D10-Polypeptiden ist in Beispiel 4 bereitgestellt. Jeder aus etlichen Stämmen von Vaccinia kann verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf WR, ALVAC und NYVAC. Die ALVAC- und NYVAC-Stämme werden verwendet, um Vogelzellen zu infizieren.
Ein Vacciniavirus dieser Erfindung kann ein oder mehrere Polynukleotid(e) enthalten, kodierend ein oder mehrere 11D10-Polypeptid(e). Es kann auch Polynukleotidsequenzen enthalten, die andere Polypeptide kodieren, welche das gewünschte Ergebnis steigern, erleichtern oder modulieren, wie zum Beispiel Lymphokine, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf IL-2, IL-4 und GM-CSF. Ein bevorzugtes Lymphokin ist GM-CSF. Falls GM-CSF verwendet wird, ist es auch bevorzugt, AU-reiche Elemente aus dem 3'-untranslatierten Regionen von RNS-Transkripten durch rekombinante Verfahren zu eliminieren und/oder Sequenzen in der 5'-untranslatierten Region zu eliminieren, die in der Lage sind, eine Haarnadelschleife zu bilden. Auch umfasst von dieser Erfindung sind Vacciniavektoren, die für rekombinante 11D10-Varianten kodieren, enthaltend 11D10-Polypeptide, wie zum Beispiel scFvs, Chimären und Polymere (unten beschrieben).
Mit 1ID10-Polynukleotiden transformierte Wirtszellen
Eine andere Ausführung dieser Erfindung sind Wirtszellen, die transformiert worden sind mit (d. h. umfassend) 11D10-Polynukleotide und/oder Vektoren mit 11D10- Polynukleotidsequenzen, wie oben beschrieben. Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen können verwendet werden. Prokaryotische Wirte schließen bakterielle Zellen ein, zum Beispiel E, coli und Mycobakterien. Unter den eukaryotischen Wirten sind Hefe-, Insekten-, Vogel-, Pflanzen- und Säugerzellen. Wirtsysteme sind in der Technik bekannt und brauchen nicht im Detail hierin beschrieben werden. Ein Beispiel einer Säugerwirtszelle ist NS0, zu erhalten von der European Collection of Cell Cultures (England). Transfektion von NS0-Zellen mit einem Plasmid, zum Beispiel, welches von einem Cytomegalovirus- (CMV-) Promotor gelenkt wird, gefolgt von der Amplifikation dieses Plasmids unter Verwendung von Glutaminsynthetase, stellt ein nützliches System für die Proteinproduktion bereit. Cockett et al. (1990) Bio/Technology 8: 662-667.
Die Wirtszellen dieser Erfindung können unter anderem als Aufbewahrungsort von 11D10-Polynukleotiden und/oder Vehikeln für die Produktion von 11D10-Polynukleotiden und – Polypeptiden verwendet werden. Sie können auch als Vehikel für die In-vivo-Zufuhr von 11D10-Polypeptiden verwendet werden.
Verwendungen für und Verfahren unter Verwendung von 11D10 Polynukleotiden
Die 11D10-Polynukleotide dieser Erfindung haben etliche Verwendungen. 11D10-Polynukleotide sind zum Beispiel nützlich in Expressionssystemen für die rekombinante Produktion von 11D10 oder 11D10-Fragmenten. Sie sind auch nützlich als Hybridisierungssonden, um unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren für die Anwesenheit von 11D10-Polynukleotidsequenzen (oder verwandte Sequenzen) in einer Probe zu untersuchen. Ferner sind 11D10-Polynukleotide auch nützlich als Primer, um Amplifikation von gewünschten Polynukleotiden zu bewirken. Die Polynukleotide dieser Erfindung sind auch als Vaccine und für die Gentherapie nützlich.
11D10-Polynukleotide dieser Erfindung können als Primer für die Amplifikation von Polynukleotiden verwendet werden, kodierend 11D10 oder ein Fragment davon, wie zum Beispiel in einer Polymerasekettenreaktion (PCR). PCR wurde oben beschrieben. Die Bedingungen für das Durchführen von PCR-Reaktionen hängen von der gewünschten Spezifität ab, welche wiederum angepasst werden kann durch den verwendeten Primer und die Reaktionsbedingungen. Solche Anpassungen sind in der Technik bekannt und brauchen nicht im Detail hierin diskutiert werden.
11D10-Polynukleotide können auch als Hybridisierungssonden für die Detektion von zum Beispiel der Anwesenheit von 11D10-Polynukleotiden in einer Zelle verwendet werden. Zum Beispiel könnte ein 11D10-Polynukleotid als eine Sonde verwendet werden, um die Anwesenheit von 11D10-Polynukleotidsequenzen in bei der Gentherapie verwendeten Zellen zu bestimmen. Für diese Verfahren wird eine geeignete Zellprobe oder eine von Zellen gewonnene Probe (von denen bei jeder vermutet wird, dass sie 11D10-Polynukleotidsequenzen enthält) gewonnen und für die Anwesenheit von 11D10-Polynukleotid durch Kontaktieren der Polynukleotide aus der Probe mit 11D10-Polynukleotidsonde getestet. Das Verfahren wird durchgeführt, um Hybridisierung zwischen der 11D10-Sonde und dem 11D10-Polynukleotid von Interesse zu erlauben, und der resultierende hybridisierte Komplex (falls vorhanden) wird detektiert. Solche Verfahren sind in der Technik wohlbekannte Verfahren, wie zum Beispiel Zellkultur, Polynukleotidzubereitung, Hybridisierung und Detektion von gebildeten Hybridkomplexen, falls vorhanden. Unter Verwendung von ähnlichen Verfahren können die Sonden auch verwendet werden, um Vektoren zu detektieren, die wiederum verwendet werden, um 11D10-Polypeptide, intakten 11D10 oder rekombinante, variante Formen von 11D10 zu produzieren.
Die 11D10-Polynukleotide dieser Erfindung können in Expressionssystemen verwendet werden, um 11D10-Polypeptide, intakten 11D10 oder rekombinante Formen von 11D10, einschließend intaktem 11D10, zu produzieren, die gesteigerte, äquivalente oder unterschiedliche wünschenswerte Eigenschaften haben. Diese rekombinanten Formen werden unter Verwendung von Routineverfahren der Technik gemacht. Beispiele von rekombinanten Formen von 11D10 und 11D10-Polypeptiden schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Hybride, Chimären, Einzelkettenvarianten und Fusionsproteine, enthaltend andere Bestandteile wie Cytokine. Eine detailliertere Beschreibung dieser rekombinanten Formen von 11D10 und 11D10-Polypeptiden und wie sie gemacht werden, wird unten bereitgestellt.
Eine andere Verwendung von 11D10-Polynukleotiden ist in Vaccinen und bei der Gentherapie. Das allgemeine Prinzip ist, das Polynukleotid so zu verabreichen, dass es entweder die Expression des darin kodierten Polypeptids fördert oder abschwächt. Folglich schließt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort und Verfahren zur Behandlung ein, umfassend die Applikation einer wirksamen Menge von 11D10-Polynukleotid(en) an ein Individuum. Bei diesen Verfahren wird ein 11D10-Polypeptid-kodierendes 11D10-Polynukleotid einem Individuum verabreicht, entweder direkt oder über mit 11D10-Polynukleotid(en) transfizierte Zellen. Vorzugsweise wird das 11D10-Polynukleotid innerhalb einer Zelle repliziert. Folglich ist/sind 11D10-Polynukleotid(e) operativ an einen geeigneten Promotor wie einen heterologen Promotor gekoppelt, der intrinsisch in Zellen vom Zielgewebetyp aktiv ist. Eindringen des Polynukleotids in die Zelle wird bewerkstelligt durch in der Technik bekannte Techniken, wie zum Beispiel im Wege eines viralen Expressionsvektors, wie zum Beispiel ein Vaccinia- oder Adenovirusvektor oder durch Assoziation des Polynukleotids mit einem kationischen Liposom. Vorzugsweise befinden sich 11D10-Polynukleotid(e) in der Form eines zirkulären Plasmids, vorzugsweise in einer supergeknäuelten Konfiguration. Vorzugsweise bestehen Plasmide, wenn sie erst einmal im Zellkern sind, als zirkuläre, nicht-replizierende episomale Moleküle fort. In-vitro-Mutagenese kann wiederum durchgeführt werden mit den Plasmidkonstrukten, um stärker immunogene Moleküle oder T-Zell-Epitope mit einem wünschenswerten HLA-Motiv, zum Beispiel, zu kodieren.
Um zu bestimmen, ob 11D10-Polynukleotid-enthaltende Plasmide zur Expression in eukaryotischen Zellen in der Lage sind, können eukaryotische Zellen, wie zum Beispiel COS-7, CHO (Vogelursprung) oder HeLa (menschlichen Ursprungs), mit Plasmiden transfiziert werden. In einem 11D10-Polypeptid(e) resultierende Expression wird dann durch RIA oder ELISA bestimmt. Westernblotting mit Zelllysat unter Verwendung von MC-10 (Ab1) als Sonde kann durchgeführt werden, um für zellassoziiertes 11D10-Polypeptid zu überprüfen. Alternativ kann für kleinere 11D10-Polypeptide Expression zum Beispiel detektiert werden durch Konstruktion des Plasmids, so dass das resultierende 11D10-Polypeptid rekombinant markiert wird, wie zum Beispiel mit einer enzymatischen Markierung. Weitere Charakterisierung des exprimierten 11D10-Polypeptids kann erreicht werden durch Reinigung des 11D10-Polypeptids, gefolgt vom Durchführen der hierin beschriebenen funktionalen Tests (z. B. Zellbindungsinhibitionstest).
Diese Erfindung umfasst auch die Ex-vivo-Transfektion von 11D10-Polynukleotiden, bei welcher aus Individuen entnommene Zellen mit Vektoren transfiziert werden, die 11D10-Polypeptide kodieren, und in das Individuum wieder eingeführt werden. Geeignete transfizierte Zellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf periphere mononukleäre Blutzellen.
Die therapeutische Anwendung von 11D10-Polynukleotiden wird detaillierter unten diskutiert.
11D10-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung umfasst Polypeptidfragmente von 11D10, enthaltend wenigstens einen Teil einer variablen Region von 11D10, und Proteine, umfassend ein 11D10-Fragment. Die Polypeptidfragmente von 11D10, die jede Region oder Unterregion der SEQ ID Nr. 2 (2) oder SEQ ID Nr. 4 (2) umfassen können (vorausgesetzt, dass die Fragmente wenigstens einen Teil einer variablen Region umfassen), werden identifiziert und charakterisiert durch jedes (eines oder mehrere) der folgenden Kriterien: (a) Fähigkeit, Ab1 und/oder Ab3 zu binden; (b) Fähigkeit, eine Immunantwort gegen HMFG zu induzieren; (c) Homologie (d. h. wesentliche Sequenzidentität) mit einem Teil von HMFG; (d) Fähigkeit, eine HMFG-assoziierte Erkrankung, besonders HMFG-assoziierte Tumoren, zu lindern, zu verbessern, zu reduzieren oder zu verzögern.
Die Polypeptidfragmente von 11D10 haben eine Reihe von Verwendungen, einschließlich ihrer Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vaccinen, als ein diagnostisches Tool zum Überwachen von Ab1- und/oder Ab3-Spiegeln, ihrer Verwendung bei der Herstellung von Antikörper, der an HMFG bindet, und ihrer Verwendung bei der Entfernung von markiertem Ab 1 aus einem Individuum, das markierten anti-HMFG-Antikörper empfangen hat.
Solange nicht spezifisch festgestellt, soll der Begriff„11D10-Polypeptide" alle Ausführungen der Polypeptide dieser Erfindung einschließen.
Die Erfindung schließt Polypeptide mit immunologischer Aktivität von 11D10 ein, worin das Polypeptid zusammengesetzt ist aus einer Sequenz aus wenigstens 5 zusammenhängenden Aminosäuren aus einer variablen Region von 11D10. In einer Ausführung stammt die variable Region von einer leichten Kette, genauer abgebildet in SEQ ID Nr. 2 (1). In einer anderen Ausführung stammt die variable Region von einer schweren Kette, genauer abgebildet in SEQ ID Nr. 4 (2). In einer anderen Ausführung stammen die 5 zusammenhängenden Aminosäuren von einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR).
Die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 2 (1) und SEQ ID Nr. 4 (2) sind in 3 präsentiert, welche Gerüst- und CDR-Sequenzen der variablen Regionen der leichten bzw. schweren Ketten von 11D10 abbildet. Die Gerüstsequenzen sind verantwortlich für die korrekte β-Faltblattbildung der VL- und VH-Domänen und für die Wechselwirkungen zwischen den Ketten, welche die Domänen zusammenbringen. Die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) beziehen sich auf sechs hypervariable Sequenzen der variablen Region (3 von VL und 3 von VH), die zusammengebracht werden, um die Antigenbindungsstelle zu bilden. Ableitung dieser Region, ebenso wie Identifikation der Leitsequenz von 11D10, wurde auf einer Recherche und Analyse in Kabats immunologischer Datenbank durch das BLAST-Programm basiert.
Eine andere Ausführung der Erfindung sind Polypeptidfragmente von 11D10, die die aus der Gruppe, bestehend aus den in 3 abgebildeten Aminosäuresequenzen (Fragmenten), ausgewählten Sequenzen umfassen. Diese Polypeptide stellen funktionelle Unterregionen der variablen Regionen der leichten und schweren Kette dar (d. h. Gerüst und CDR). Bevorzugt umfassen diese 11D10-Polypeptide eine CDR.
Die Erfindung schließt auch ein Polypeptidfragment der variablen Region der leichten Kette von 11D10 ein, umfassend wenigstens 25 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 28, bevorzugter wenigstens 30 zusammenhängende Aminosäuren, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 35 zusammenhängende Aminosäuren, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 50 zusammenhängende Aminosäuren der variablen Region, abgebildet in SEQ ID Nr. 2 (2), oder wenigstens 5 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 7 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 8 zusammenhängende Aminosäuren, bevorzugter wenigstens ungefähr 10 zusammenhängende Aminosäuren der CDR1 oder CDR2 davon, oder wenigstens 7 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 8 zusammenhängende Aminosäuren, bevorzugter wenigstens 9 zusammenhängende Aminosäuren der CDR3 davon.
In einer anderen Ausführung schließt die Erfindung ein Polypeptidfragment der variablen Region der schweren Kette von 11D10 ein, umfassend wenigstens 17 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 20 zusammenhängende Aminosäuren, bevorzugt wenigstens ungefähr 25 zusammenhängende Aminosäuren, noch bevorzugter wenigstens ungefähr 35 aufeinander folgende Aminosäuren, sogar noch bevorzugter wenigstens ungefähr 50 zusammenhängende Aminosäuren der variablen Region, abgebildet in SEQ ID Nr. 4 (1), oder 5 zusammenhängende Aminosäuren der CDR1 davon oder wenigstens 6 zusammenhängende Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 7 zusammenhängende Aminosäuren, bevorzugter wenigstens ungefähr 10 zusammenhängende Aminosäuren der CDR2 oder CDR2 davon.
Die Größe der 11D10-Polypeptidfragmente kann breit variieren, da die Länge, die erforderlich ist, Aktivität zu bewirken, sehr klein sein kann, während die Maximallänge typischerweise nicht schädlich ist, um Aktivität zu bewirken. Die Minimalgröße muss ausreichend sein, eine gewünschte Funktion bereitzustellen. Zum Beispiel kann eine Bindungsstelle auf einem Polypeptid so klein sein wie ungefähr 5 Aminosäuren lang, während andere Bindungsstellen durch Konvergenz von Aminosäuren gebildet werden, die räumlich nah sind, aber nicht in zusammenhängender Sequenz sind. Folglich schließt die Erfindung Polypeptidfragmente von 11D10 ein, umfassend einen Teil der in SEQ ID Nr. 2 (1) oder SEQ ID Nr. 4 (2) abgebildeten Aminosäurensequenz, bei welchen das 11D10-Polynukleotid ungefähr 5 Aminosäuren lang ist. Die Erfindung stellt auch Polypeptidfragmente von 11D10 bereit, umfassend einen Teil der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 (1) oder SEQ ID Nr. 4 (2) abgebildet ist, bei welchen das 11D10-Polynukleotid ungefähr 10, 15, 25, 30, 50, 100 oder 150 Aminosäuren lang ist. Die Erfindung stellt auch Polypeptidfragmente von 11D10 bereit, umfassend einen Teil der in SEQ ID Nr. 2 (1) oder SEQ ID Nr. 4 (2) abgebildeten Aminosäuresequenz mit wenigstens 5 Aminosäuren und meistens ungefähr 100 Aminosäuren. Wie es für einen Fachmann offensichtlich ist, können diese 11D10-Polypeptide, ungeachtet ihrer Größe, auch mit anderen Substanzen oder Mitteln assoziiert sein oder damit konjugiert sein, um die Funktion und/oder Spezifität eines 11D10-Polypeptids zu erleichtern, zu steigern oder zu modulieren. Beispiele solcher Modifikationen werden unten diskutiert werden.
In einer anderen Ausführung werden 11D10-Polypeptidfragmente bereitgestellt, die eine Region enthalten, die homolog ist zu HMFG, besonders zu der 20 Aminosäuren langen tandemartigen Wiederholung innerhalb von HMFG. Siehe zum Beispiel Larocca et al. (1992) Hybridoma 11: 191-201. Solche homologen Fragmente können wenigstens zum Teil nominell dem Mucinantigen mit hohem Molekulargewicht von HMFG ähneln und können folglich bei der Antigenpräsentation durch Nachahmen von HMFG, dem letztlichen Zielantigen, teilnehmen. Diese 11D10-Polypeptide können auch an der Antigenpräsentation in Zusammenhang mit Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC-) Antigenen teilnehmen, wodurch folglich cytotoxische T-Zell-Abtötung ausgelöst wird. 23 zeigt Anordnungen zwischen ähnlichen Sequenzen von 11D10 und HMFG, wenn die Aminosäuresequenzen in beiden Richtungen angeordnet werden (d. h. angeordnet in derselben und in Umkehrorientierung). Beispiele von Homologieregionen mit HMFG, die von dieser Erfindung umfasst sind, sind (Aminosäurenummerierung, basierend auf den Aminosäuren 1 bis 107 der SEQ ID Nr. 2; 3): (a) Aminosäure 51 bis Aminosäure 52; Aminosäure 54 bis Aminosäure 56; Aminosäure 92 bis Aminosäure 93 der leichten Kette; und (b) Aminosäure 57 bis Aminosäure 58 der schweren Kette. Demgemäß schließt die Erfindung auch 11 D 10-Polypeptide ein, die die Aminosäuresequenz von ungefähr der Aminosäure 50 bis ungefähr zu der Aminosäure 53 umfassen, ungefähr Aminosäure 50 bis ungefähr Aminosäure 56, ungefähr Aminosäure 92 bis ungefähr Aminosäure 93 oder ungefähr Aminosäure 90 bis ungefähr Aminosäure 94 der in 3A (Aminosäuren 1 bis 107 der SEQ ID Nr. 2) abgebildeten Sequenz, ebenso wie Polypeptide, welche umfassen von ungefähr der Aminosäure 57 bis ungefähr zu der Aminosäure 58, ungefähr Aminosäure 56 bis ungefähr Aminosäure 58 oder ungefähr Aminosäure 53 bis ungefähr Aminosäure 58 der in 3B abgebildeten Sequenz (Aminosäuren 1 bis 118 der SEQ ID Nr. 4).
Die Erfindung schließt Modifikationen an 11D10-Polypeptiden ein, einschließlich funktionell äquivalenten Fragmenten der 11D10-Polypeptide, die nicht signifikant ihre Eigenschaften beeinflussen, und Varianten, die eine gesteigerte oder reduzierte Aktivität haben. Modifikation von Polypeptiden ist Routinepraxis in der Technik und braucht nicht im Detail hierin beschrieben zu werden. Beispiele modifizierter Polypeptide schließen Polypeptide mit konservativen Substitutionen von Aminosäureresten, eine oder mehrere Deletionen oder Additionen von Aminosäuren, die nicht signifikant schädlich die funktionelle Aktivität ändern oder chemische Analoga verwenden, ein. Aminosäurereste, die konservativ substituiert werden können für eine andere, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Glycin/Alanin; Valin/Isoleucin/Leucin; Asparagin/Glutamin; Asparaginsäure/Glutaminsäure; Serin/Threonin, Lysin/Arginin und Phenylalanin/Tryosin. Diese Polypeptide schließen auch glycosilierte und nicht-glycosilierte Polypeptide ein, ebenso wie Polypeptide mit anderen posttranslationalen Modifikationen wie zum Beispiel Glycosilierung mit unterschiedlichen Zuckern, Acetylierung und Phosphorylierung. Vorzugsweise wären die Aminosäuresubstitutionen konservativ, d. h., die substituierte Aminosäure würde ähnliche chemische Eigenschaften besitzen wie jene der ursprünglichen Aminosäure. Solche konservativen Substitutionen sind in der Technik bekannt und Beispiele wurden oben bereitgestellt. Aminosäuremodifikationen können sich erstrecken vom Ändern oder Modifizieren von einer oder mehreren Aminosäuren bis zur vollständigen Umgestaltung einer Region, wie zum Beispiel der variablen Region. Änderungen in der variablen Region können die Bindungsaffinität und/oder -spezifität ändern. Andere Verfahren der Modifikation schließen die Verwendung von in der Technik bekannten Kupplungstechniken ein, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf enzymatische Mittel, oxidative Substitution und Komplexbildung. Modifikationen können zum Beispiel für das Anheften von Markierungen für Immuntest verwendet werden, wie zum Beispiel das Anheften von radioaktiven Einheiten für Radioimmuntest. Modifizierte 11D10-Polypeptide werden unter Verwendung von etablierten Vorgängen in der Technik gemacht und können unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardtests gescreent werden, von welchen etliche unten und in den Beispielen beschrieben werden.
Die Erfindung umfasst auch Fusionsproteine, einschließend eines oder mehrere 11 D 10-Polypeptide. In einer Ausführung wird ein Fusionspolypeptid bereitgestellt, das wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren der variablen Region der leichten Kette einschließt, abgebildet in SEQ ID Nr. 2 (1), und wenigstens 10 Aminosäuren der variablen Region der schweren Kette, abgebildet in SEQ ID Nr. 4 (2). In einer anderen Ausführung enthält das Fusionspolypeptid eine heterologe konstante Immunglobulinregion. In einer anderen Ausführung enthält das Fusionspolypeptid eine variable Region der leichten Kette und eine variable der schweren Kette von 11D10. Für Zwecke dieser Erfindung enthält ein 11D10-Fusionsprotein eines oder mehrere 11D10-Polypeptide und eine andere Aminosäuresequenz, an welche es in dem nativen Molekül nicht angeheftet ist, zum Beispiel eine heterologe Sequenz oder eine homologe Sequenz aus einer anderen Region. Nützliche heterologe Sequenzen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Sequenzen, die für die Sekretion von einer Wirtszelle sorgen, das immunologische Reaktionsvermögen steigern oder das Koppeln des Polypeptids an einen Immuntestuntergrund oder einen Vaccinträger erleichtern. Andere Beispiele sind so genannte bakterielle „Superantigene" wie zum Beispiel Staphylococcenenterotoxin A (SEA). Dohlsten et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8945-8949. Zum Beispiel kann ein 11D10-Polypeptid mit einem Modifikator der Bioantwort fusioniert sein. Beispiele von Modifikatoren der Bioantwort schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cytokine oder Lymphokine wie zum Beispiel GM-CSF, Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4) und γ-Interferon. Demgemäß schließt die Erfindung 11D10-Fusionspolypeptide ein, die GM-CSF oder IL-2 enthalten.
25 bildet ein Beispiel eines Plasmidkonstrukts für eine Fusion eines 11D10-Polypeptids und der bevorzugten Lymphokine GM-CSF oder IL-2 ab. Co-Transfektion dieses Plasmids (welches, wie gezeigt, die schwere Kette von 11D10 kodiert) mit einem die 11D10 leichte Kette kodierenden Plasmid ergibt auch ein 11D10-Fusionspolypeptid. Bevorzugt wird ein Plasmid, das eine leichte Kette von 11D10 kodiert, als erstes in Sp2/0- oder NS0-Zellen durch Protoplastenfusion (Shin et al. (1989) Meth. Enzym. 178: 459-476) transfiziert, gefolgt von der Transfektion von Plasmid enthaltenden kodierenden Sequenzen für eine schwere Kette von 11D10 durch Elektroporation in hoch produzierende Klone aus der ersten Transfektion. Shin et al. (1989). Diese Vorgänge sind detaillierter in Beispiel 7 beschrieben.
Ein Antikörper (das heißt, ein Antikörper, der eine schwere und leichte Kette enthält), der als ein Ergebnis der Transfektion der obigen Plasmide (ob durch Co-Transfektion oder sequentielle Transfektion) erzeugt worden ist, kann durch jeden Test detektiert werden, der die Bildung einer leichten Kette, gekoppelt an eine schwere Kette detektiert. Solche Tests sind in der Technik Routine. Zum Beispiel kann nicht reduzierende SDS-Gelelektrophorese verwendet werden, um die Anwesenheit eines Antikörpermoleküls zu detektieren, das sowohl die leichten als auch die schweren Ketten enthält, wie angezeigt durch das Molekulargewicht. Ein anderes Beispiel eines Tests, der an eine schwere Kette gekoppelte leichte Kette detektiert, ist ein ELISA wie folgt. Mikrotiterplatten werden mit Ziegen-anti-Mensch-kappa-Leichte-Kette-Antikörper bei Standardkonzentrationen überzogen, mit BSA geblockt und gewaschen. Die überzogenen Platten werden mit Kulturüberstand von Zellen zur Reaktion gebracht, wobei die verschiedene Testkonstrukte exprimieren. Nach dem Waschen werden die Platten dann mit Ziegen-anti-Mensch-gamma-1-Antikörpern mit alkalischem Phosphatasekonjugat behandelt und auf die übliche Weise entwickelt. Optische Dichte wird bei 405 nm gemessen. Falls der Fusionsantikörper ein bioreaktives Molekül enthält, wie zum Beispiel ein Cytokin, kann der Antikörper auch unter Verwendung eines Tests detektiert werden, der die Reaktivität von zum Beispiel dem Cytokin misst. Solche Tests sind in der Technik bekannt und brauchen nicht im Detail hierin beschrieben werden. Zum Beispiel kann ein GM-CSF-Fusions-11D10-Antikörper und/oder -11D10-Polypeptid wie folgt detektiert werden. Platten werden mit Ziegen-anti-Mensch-kappa-Antikörper überzogen, und die überzogenen Platten werden mit Kulturüberstand (falls die Fusion sezerniert wird) zur Reaktion gebracht. Die reagierten Platten werden dann mit Rattenantikörper für Maus-GM-CSF/Biotin-Konjugat behandelt und ein resultierender Komplex wird durch Messen der optischen Dichte bei 490 nm detektiert. Diese Tests sind detaillierter in Beispiel 7 beschrieben.
Alternativ kann das Plasmid der 25 in eine Verlustmutante ohne schwere Kette transfiziert werden. Zum Beispiel können Verlustmutanten ohne schwere Kette erhalten werden durch Behandeln von 2 × 107 11D10-Zellen mit Fluoreszein markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG (H-Kette spezifisch, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) gemäß der Instruktion des Lieferanten. Die gefärbten und ungefärbten Zellpopulationen werden in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer analysiert. Die ungefärbten Zellen werden in einem sterilisierten Röhrchen gesammelt und in 96-Well-Platten mit 1 Zelle/Vertiefung durch begrenzende Verdünnung gegeben. Die Kulturüberstände werden dann durch ELISA unter Verwendung von anti-Maus-IgG aus Ziegen (spezifisch für die schwere Kette) und anti-Maus-Kappa aus Ziegen getestet. Die Klone mit Kappa-positivem und IgG-negativem Phänotyp werden wenigstens dreimal subkloniert, um stabile 11D10(-H)-Mutanten zu gewinnen. Mutmaßliche mutierte Klone ohne schwere Kette (11D10(-H)) können isoliert werden, und die Sequenz der cDNS der variablen Region der leichten Kette wird bestimmt, um zu verifizieren, dass die verbleibende leichte Kette jene von 11D10 ist. Umkehr-PCR der mRNS für 11D10-VH wird mit zwei Sätzen aus 5'- und 3'-Primern durchgeführt, verwendet für das Klonieren von 11D10(-H)-cDNS (Beispiel 2). Eine Mutante ohne schwere Kette sollte keine detektierbare DNS-Bande ergeben.
Transfektion dieser Zellen mit dem Konstrukt mit der schwerem Ketten kann dann unter Verwendung von Standardverfahren in der Technik, wie zum Beispiel Elektroporation, bewerkstelligt werden.
Ein 11D10-Fusionspolypeptid kann zum Beispiel durch chemische Synthese oder durch Schaffen und Translatieren eines Polynukleotids geschaffen werden, in welchem die Peptidregionen in dem gewünschten Verhältnis kodiert werden. Diese Fusionsproteine können nützlich sein, um eine Aktivität eines 11D10-Polypeptids zu steigern, zu modifizieren und/oder zu erleichtern.
Die Erfindung umfasst auch geänderte, rekombinante Formen von 11D10, enthaltend 11D10-Polypeptid(e), das heißt, 11D10-Polypeptide, die wenigstens einen Teil einer variablen Region von 11D10 enthalten, wie abgebildet in den 1 und 2. Wie hierin verwendet, enthält eine „geänderte" oder „rekombinante" Form von 11D10 11D10-Polypeptid(e) einer Sequenz und/oder Konfiguration, die von jener von intaktem 11D10 verschieden ist. Eine in dieser Erfindung eingeschlossene rekombinante Form von 11D10-Antikörper ist ein Hybridantikörper, bei welchem ein Paar aus schweren und leichten Ketten homolog ist mit jenem in einem ersten Antikörper, bei welchem das andere Paar aus schweren und leichten Ketten homolog ist mit jenem in einem anderen zweiten Antikörper. Für Zwecke dieser Erfindung stammt ein Paar aus leichten und schweren Ketten von 11D10. Typischerweise wird jedes dieser beiden Paare an unterschiedliche Epitope von HMFG binden. Solche Hybride können auch unter Verwendung von chimären Ketten gebildet werden, wie unten dargelegt.
In einer anderen Ausführung werden 11D10-Chimären bereitgestellt, in welchen die schweren und/oder leichten Ketten Fusionsproteine sind. Typischerweise stammt die konstante Domäne der Ketten von einer bestimmten Art und/oder Klasse und die variablen Domänen stammen von einer davon verschiedenen Art und/oder Klasse. Zum Beispiel ist ein „humanisierter" 11D10-Antikörper einer, bei welchem die konstante Region menschlichen Ursprungs ist, und die variable Region von 11D10 stammt (d. h. Maus). Auch verkörpert in der Erfindung ist ein Antikörper mit einer humanisierten variablen Region, in welcher die CDR-Region 11D10-Aminosäuresequenzen umfasst, während die Gerüstregionen von menschlichen Sequenzen abgeleitet sind. Siehe zum Beispiel EP 0 329 400 . Auch verkörpert werden funktionelle Fragmente von Chimären. Ein Beispiel ist ein humanisiertes Fab-Fragment, welches eine menschliche Gelenkregion, eine menschliche erste konstante Region, eine menschliche konstante Region der leichten Kappa- oder schweren Kette und die variable Region von 11D10 enthält. Die humanisierten 11D10-Fab-Fragmente können wiederum gemacht werden, um Fab-Dimere zu bilden.
Typischerweise werden die 11D10-Chimären dieser Erfindung hergestellt durch zubereiten und exprimieren eines Polypeptids, das diese kodiert, unter Verwendung von hierin verschiedenen rekombinanten Verfahren, obwohl sie auch zubereitet werden können durch andere in der Technik bekannte Mittel, einschließlich zum Beispiel chemischer Synthese.
Ein anderes Beispiel geänderter rekombinanter Formen von 11D10, die von dieser Erfindung umfasst sind, sind geänderte Antikörper, was sich auf Antikörper bezieht, in welchen die Aminosäuresequenz von 11D10 variiert worden ist. Unter Verwendung von Standardrekombinationstechniken können 11D10-Antikörper gestaltet werden, um gewünschte Eigenschaften zu erhalten. Zum Beispiel kann eine Änderung in der Aminosäuresequenz in einer stärkeren Immunogenität des resultierenden 11D10-Polypeptids resultieren. Die Änderung bewegt sich von der Änderung von einer oder mehreren Aminosäuren bis zur vollständigen Umgestaltung einer Region, zum Beispiel der konstanten Region. Änderungen in der konstanten Region im Allgemeinen können gewünschte zelluläre Prozesseigenschaften erzielen, zum Beispiel Änderungen in der Komplementfixierung, Wechselwirkung mit Membranen und andere Effektorfunktionen. Änderungen in der variablen Region können gemacht werden, um Bindungseigenschaften zu ändern. Der geänderte/rekombinante 11D10-Antikörper kann auch gestaltet werden, um bei der spezifischen Zufuhr einer Substanz (wie zum Beispiel ein Lymphokin) an eine Effektorzelle zu helfen. Andere Aminosäuresequenzmodifikationen wurden oben diskutiert.
Die Erfindung umfasst auch einzelkettige Fragmente der variablen Region („scFv") von 11D10. Einzelkettige Fragmente der variablen Region werden durch Verknüpfung der variablen Regionen von leichter und/oder schwerer Kette und durch Verwendung eines kurzen Kopplungspeptids gemacht. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426. Ein Beispiel eines Kopplungspeptids ist (GGGGS)3 (SEQ ID Nr. 35), welches annähernd 3,5 nm zwischen dem Carboxyterminus einer variablen Region und dem Aminoterminus der anderen variablen Region überbrückt. Linker anderer Sequenzen wurden gestaltet und verwendet. Bird et al. (1988). Linker können wiederum für zusätzliche Funktionen modifiziert werden, wie zum Beispiel das Anheften von Arzneimitteln oder das Anheften an feste Untergründe.
Demgemäß ist eine Ausführung der vorliegenden Erfindung ein Fusionspolypeptid, umfassend wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren der variablen Region der leichten Kette, abgebildet in SEQ ID Nr. 2 (1), und wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren der variablen Region der schweren Kette, abgebildet in SEQ ID Nr. 4 (2), worin die Aminosäuresequenzen durch ein Linkerpolypeptid mit ungefähr 5 bis 20 Aminosäuren verbunden sind. In einer anderen Ausführung umfasst das Fusionspolypeptid (scFv) die variable Region der leichten Kette der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 (1) abgebildet ist, und die variable Region der schweren Kette der in SEQ ID Nr. 4 (2) abgebildeten Aminosäuresequenz.
Jedes Peptid, das ausreichend Flexibilität und Länge hat, kann als ein Linker in einem scFv verwendet werden. Gewöhnlich wird der Linker so ausgewählt, dass er eine geringe bis gar keine Immunogenität hat. Im Hinblick auf 11D10-Bestandteile von scFv kann können alles oder ein Teil der schweren und/leichten Kette verwendet werden. Typischerweise sind die vollständigen variablen Regionen in das scFv eingeschlossen. Zum Beispiel kann die variable Region der leichten Kette an die variable Region der schweren Kette gekoppelt sein. Alternativ kann ein Teil der variablen Region der leichten Kette gekoppelt werden an die gesamte oder einen Teil der variablen Region der schweren Kette. Für asymmetrische Linker, wie zum Beispiel (GGGGS)3 (SEQ ID Nr. 35), können die scFvs in jeder Reihenfolge zusammengebaut sein, zum Beispiel VH-(Linker)-VL oder VL-(Linker)-VH. Falls jedoch in E. coli exprimiert wird, kann es einen Unterschied in dem Expressionsmaß dieser beiden Konfigurationen geben. Es ist auch möglich, ein Hybrid zu konstruieren oder biphasisches scFv, in welchem ein Bestandteil in 11D10-Polypeptid und ein anderer Bestandteil ein unterschiedliches Peptid wie zum Beispiel ein T-Zell-Epitop ist. Tandem-scFvs können auch gemacht werden, wie zum Beispiel (X)-(Linker)-(X)-(Linker)-(X), in welchem sich X 11D10-Polypeptide oder Kombinationen von 11D10-Polypeptiden mit anderen Polypeptiden befinden.
Die einzelkettigen Varianten können entweder rekombinant oder synthetisch produziert werden. Für die synthetische Produktion von scFv kann ein automatisiertes Synthesegerät verwendet werden. Für die rekombinante Produktion von scFv kann ein geeignetes Plasmid, enthaltend Polynukleotid, welches das scFv kodiert, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, entweder eukaryotische wie Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säuger- oder prokaryotische Zellen wie zum Beispiel E. coli. Polynukleotide, die das scFv von Interesse kodieren, können durch Routinemanipulationen wie Ligation von Polynukleotiden gemacht werden. Das resultierende scFv kann unter Verwendung von Standardproteinaufreinigungstechniken, die in der Technik bekannt sind, isoliert werden.
Ein besonders nützliches System für die Produktion von 11D10-scFv ist der Plasmidvektor pET-22b(+) (Novagen, Madison, W) in E. coli. pET-22b(+) enthält eine Nickelionenbindungsdomäne, bestehend aus 6 aufeinander folgenden Histidinreste, die als eine Basis für die scFv-Aufreinigung dient. Dieses Beispiel (präsentiert in Beispiel 7) dient jedoch lediglich für erläuternde Zwecke und ist nicht beschränkend. Ein anderes Beispiel eines Vektors, der verwendet werden kann, ist pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), der oben beschrieben worden ist.
Falls E. coli für die scFv-Produktion verwendet wird, sollten die Bedingungen so sein, dass das scFv-Polypeptid die optimale Tertiär- und Quartärstruktur annehmen kann. In Abhängigkeit von dem verwendeten Plasmid (besonders der Aktivität des Promotors) und der Wirtszelle kann es notwendig sein, die Produktion des scFv zu modulieren. Zum Beispiel kann die Verwendung eines schwächeren Promotors oder die Expression bei niedrigeren Temperaturen notwendig sein, um die Produktion des scFv zu optimieren. Alternativ kann die Expression von scFv in eukaryotischen Zellen wie Hefe, Insekten, Pflanzen oder Säugern geeignet sein.
Zahlreiche scFvs können für die Bindungsaktivität getestet werden, zum Beispiel unter Testen der direkten Bindung an Ab1 oder indem sie genutzt werden in hierin beschriebenen Kompetitionsexperimenten. Jeder der unten beschriebenen Tests für das Testen von Fragmenten von 11D10-Aktivität kann genutzt werden für das Testen von scFvs. Zum Beispiel wird radioaktiv markierter Ab1 (MC-10) mit HMFG+-Zellen, wie zum Beispiel MCF-7-Zellen, in der Abwesenheit oder Anwesenheit (in steigenden Mengen) des zu testenden scFv zur Reaktion gebracht. Die beobachtete prozentuale Inhibition wird verglichen mit 11D10 oder einem anderen Ab2. Ein 11 D 10-scFv wird charakterisiert als in der Lage zu binden, falls das scFv die Bindung von Ab1 an die HMFG-positiven Zellen inhibiert, wenn es mit einer Negativkontrolle verglichen wird, wie zum Beispiel ein unverwandter anti-idiotypischer Antikörper. Alternativ können scFvs charakterisiert werden unter Verwendung von anderen hierin beschriebenen immunologischen Tests, wie zum Beispiel die Fähigkeit, eine Immunantwort auszulösen. Weiter können scFvs konstruiert werden mit oder ohne eine Immunglobulinleitsequenz (für die Sekretion), in Abhängigkeit davon, ob eine sezernierte oder zellassoziierte Form von scFv gewünscht wird.
In einer anderen Ausführung werden einzelkettige 11D10-Antikörperpolypeptide ohne einen Linker oder mit einem sehr kurzen, unflexiblen Linker bereitgestellt. Diese so genannten „bivalenten" Antikörper sind nicht in der Lage, an einer Intra-Kettenwechselwirkung aufgrund des Fehlens eines Linkers (oder der Anwesenheit eines sehr kurzen Linkers) teilzunehmen, und treten folglich mit anderen einzelnen Ketten in Wechselwirkung, wodurch „Diabodies" gebildet werden. Zum Beispiel kann ein bivalentes 11D10-Antikörperpolypeptid unter Verwendung von rekombinanten Verfahren in jeder der folgenden Konfigurationen gemacht werden: VL-VH oder VH-VL.
Die Erfindung umfasst auch polymere Formen von 11D10-Polypeptiden. Wie hierin verwendet, enthält eine polymere Form eines 11D10-Polypeptids eine Vielzahl (d. h. mehr als 1) von 11D10-Polypeptiden. In einer Ausführung werden lineare Polymere von 11D10-Polypeptiden bereitgestellt. Diese linearen 11D10-Polymere können an einen Träger konjugiert sein. Diese linearen Polymere können multiple Kopien eines einzelnen 11D10-Polypeptids oder Kombinationen verschiedener Polypeptide umfassen und können Tandem-11D10-Polypeptide oder 11D10-Polypeptide haben, die durch andere Aminosäuresequenzen getrennt sind. Diese linearen Polymere können unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Standardrekombinationsverfahren gemacht werden. In einer anderen Ausführung werden multiple 11D10-Antigenpeptide (MAPs) bereitgestellt. MAPs haben einen kleinen immunologisch inerten Kern mit radial verzweigenden Lysindendriten, auf welchen eine Anzahl von 11D10-Polypeptiden verankert (d. h. kovalent angeheftet) werden kann. Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 1719-1725; Tam (1989) Meth. Enz. 168: 7-15. Das Ergebnis ist ein großes Makromolekül mit einem hohen molaren Verhältnis von 11D10-Polypeptiden zu Kern. MAPs sind nützliche, effiziente Immunogene, ebenso wie nützliche Antigene für Tests wie ELISA. 11D10-MAPs können synthetisch gemacht werden und können kommerziell erhalten werden (Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA). In einem typischen MAP-System wird eine Kernmatrix aus drei Lysinebenen und acht Aminosäuren zum Ankern von 11D10-Polypeptiden gemacht. Das MAP kann durch jedes in der Technik bekannte Verfahren synthetisiert werden, zum Beispiel mit einem Festphasenverfahren, zum Beispiel R. B. Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149.
In einer anderen Ausführung der Erfindung kann die Immunogenität der 11D10-Polypeptide gesteigert werden, indem sie in Expressionssystemen zubereitet werden, in welchen sie mit Partikel bildenden Proteinen wie zum Beispiel jenen, die mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen assoziiert sind, verschmolzen werden oder mit diesem zusammengebaut werden. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,722,840. Konstrukte, worin das 11D10-Polypeptid direkt an die Partikel bildenden, Protein kodierenden Sequenzen gekoppelt ist, erzeugen Hybride, die immunogen in Bezug auf das 11D10-Polypeptid sind. Zusätzlich schließen alle der zubereiteten Vektoren Epitope ein, die spezifisch sind für HBV, aufweisend verschiedene Immunogenitätsgrade, wie zum Beispiel das Prä-S-Peptid. Folglich sind Partikel, die aus Partikel bildendem Protein, welches 11D10-Sequenzen einschließt, konstruiert sind, immunogen in Bezug auf 11D10 und HBV. Diese Formen von 11D10-Polypeptiden können in eukaryotischen Zellen gemacht werden, wie zum Beispiel in Hefe- oder Säugerzellen.
In einer anderen Ausführung können 11D10-Polypeptide mit einem Träger konjugiert sein. In Fällen, wo das 11D10-Polypeptid korrekt konfiguriert ist, um eine Bindungsstelle bereitzustellen, aber zu klein ist, um immunogen zu sein, kann das Polypeptid an einen geeigneten Träger gekoppelt sein. Eine Anzahl von Techniken zur Gewinnung solch einer Verknüpfung sind in der Technik bekannt und brauchen im Detail hierin nicht beschrieben werden. Jeder Träger kann verwendet werden, der selbst nicht die Produktion von Antikörper, die für den Wirt schädlich sind, induziert. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie Proteine, Polysaccharide wie zum Beispiel latexfuntionalisierte Sepharose, Agarose, Cellulose, Celluloseperlen und Ähnliches, polymere Aminosäuren wie Polyglutaminsäure, Polylysin und Ähnliches, Aminosäurecopolymere und inaktive Viruspartikel oder abgeschwächte Bakterien wie Salmonellen. Besonders nützliche Proteinsubstrate sind Serumalbumine, Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin, Immunglobulinmoleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin, Tetanustoxoid und andere Proteine, die Fachleuten wohlbekannt sind. Wie für Fachleute ersichtlich ist, können die oben beschriebenen rekombinanten Formen von 11D10-Polypeptiden und 11D10, wie zum Beispiel Fusionsproteine, wiederum mit anderen Aminosäuresequenzen verschmolzen sein. Zum Beispiel kann ein 11D10-scFv an ein Cytokin wie IL-2 fusioniert sein. 25 stellt ein Beispiel eines Plasmidkonstrukts bereit, das solch ein Fusionsprotein erzeugt.
11D10-Polypeptide der Erfindung können in einer Anzahl von Wegen identifiziert werden. Zum Beispiel können die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten durch Zubereiten einer Reihe von kurzen Polypeptiden gescreent werden, die zusammen die gesamte Aminosäuresequenz der variablen Region überspannen. Indem zum Beispiel mit 50mer oder 20mer Polypeptiden begonnen wird, wäre es Routine, jedes Polypeptid auf die Anwesenheit einer gewünschten Eigenschaft zu testen. Screening solcher Polypeptide liegt wohl innerhalb des Fachwissens. Es ist auch bekannt, eine Computeranalyse einer Proteinsequenz durchzuführen, um möglicherweise interessierende Polypeptide zu identifizieren, zum Beispiel Homologie mit HMFG, oder ein Computeralgorithmus, der auf molekularer Erkennungstheorie basiert, um mutmaßliche Regionen in Zusammenhang mit Idiotyp-anti-Idiotyp-Kontakt zu identifizieren und dann diese Polypeptide, die jene Regionen umfassen, für das Testen zuzubereiten.
Fachleute werden leicht schätzen, dass die verschiedenen Formen und Derivate von 11D10, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, auf verschiedenen Wegen kombiniert werden können, um andere 11D10-Polypeptide mit wünschenswerten Eigenschaften zu erzeugen.
Zum Beispiel können 11D10-Polypeptide mit modifizierten Resten in einem MAP umfasst sein. In einem anderen Beispiel wird 11D10-scFv an ein Cytokin wie IL-2 fusioniert.
Zubereitung von Polypeptiden
Die Polypeptide dieser Erfindung können durch in der Technik bekannte Vorgehensweisen gemacht werden. Die Polypeptide können durch proteolytischen oder anderen Abbau von 11D10 erzeugt werden, durch rekombinante Verfahren (d. h. einzelne oder Fusionspolypeptide), wie oben beschrieben, oder durch chemische Synthese. 11D10-Polypeptide, besonders kürzere Polypeptide von bis zu ungefähr 50 Aminosäuren, werden üblicherweise durch chemische Synthese gemacht. Verfahren der chemischen Synthese sind in der Technik bekannt und sind kommerziell erhältlich. Zum Beispiel könnte ein 11D10-Polypeptid durch ein automatisiertes Polypeptidsynthesegerät unter Nutzung des Festphasenverfahrens erzeugt werden.
Vorzugsweise werden die Polypeptide wenigstens teilweise von anderen zellulären Bestandteilen gereinigt. Vorzugsweise sind die Polypeptide zu wenigstens 50 % rein. In diesem Zusammenhang wird Reinheit berechnet als ein Gewichtsprozentsatz des Gesamtproteingehalts der Zubereitung. Bevorzugter sind die Proteine zu 50 bis 75 % rein. Höher gereinigte Polypeptide können ebenfalls erhalten werden und sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Für die klinische Verwendung sind die Polypeptide bevorzugt hoch gereinigt, zu wenigstens ungefähr 80 % rein, bevorzugt zu wenigstens ungefähr 90 % rein, bevorzugt zu wenigstens 95 % rein, sogar noch bevorzugter zu wenigstens ungefähr 99 % rein und frei von Pyrogenen und anderen Kontaminantien. Verfahren der Proteinreinigung sind in der Technik bekannt und werden hierin im Detail nicht beschrieben. Alternativ braucht das 11D10-Polypeptid, falls 11D10-Polypeptide) in geeignetem Lagerungsmedium wie ein Pflanzensamen exprimiert wird, nicht gereinigt werden und könnte sogar ohne Aufreinigung verabreicht werden. Fiedler et al. (1995) Biotechnology 13: 1090-1093.
11D10-Polypeptide können aus intaktem 11D10 gewonnen werden, wenn es wiederum aus dem 11D10-produzierenden Hybridom (ATCC HB12020) isoliert werden kann, welches in der ebenfalls zueigenen US-Patentanmeldung Nr. 08/575,762 (Provisional Nr.; Anwaltsakte Nummer 30414-20003.00) beschrieben ist. Techniken zum Isolieren von Antikörpern aus Hybridomen sind in der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Harlow und Lane (1988). Wenn erst einmal intaktes 11D10 gewonnen worden ist, können 11 D 10-Polypeptide gewonnen werden durch Abbau von intaktem 11D10 durch die Verwendung von zum Beispiel proteolytischen Enzymen (Proteinasen). Beispiele proteolytischer Enzyme schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Trypsin, Plasmin und Thrombin. Intakter 11D10 kann mit einer oder mehreren Proteinasen inkubiert werden oder die Verdauung kann sequentiell durchgeführt werden. Die Art und das Ausmaß der proteolytischen Spaltung werden von der gewünschten Polypeptidlänge abhängen, ebenso wie von den verwendeten Enzymen. Diese Techniken sind in der Technik wohlbekannt. Alternativ oder zusätzlich kann intakter 11D10 mit Disulfid-reduzierenden Mitteln behandelt werden, um das Molekül zu dissoziieren.
11D10-Polypeptide können durch chemische Synthese unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren gemacht werden.
11D10-Polypeptide können auch durch Expressionssysteme unter Verwendung von rekombinanten Verfahren gemacht werden. Die Zugänglichkeit von 11D10-Polypeptidkodierenden 11D10-Nukleotiden erlaubt die Konstruktion von Expressionsvektoren, die intakten 11D10 kodieren, funktionell äquivalenten Fragmenten davon oder rekombinanten Formen von 11D10. Ein Polynukleotid, das das gewünschte 11D10-Polypeptid kodiert, ob in fusionierter oder reifer Form und ob eine Signalsequenz, um die Sekretion zu erlauben, enthaltend oder nicht, kann in Expressionsvektoren ligiert werden, die geeignet sind für jeden üblichen Wirt. Sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Wirtssysteme können verwendet werden. Das Polypeptid wird dann aus lysierten Zellen isoliert oder aus dem Kulturmedium und wird aufgereinigt bis zu dem Maß, das für seine beabsichtigte Verwendung gebraucht wird. Aufreinigung oder Isolation der in Wirtssystemen exprimierten Polypeptide können durch jedes in der Technik bekannte Verfahren bewerkstelligt werden. Zum Beispiel kann intakte 11D10-kodierende cDNS oder ein Fragment davon an einen geeigneten Promotor operativ gekoppelt sein, in einen Expressionsvektor inseriert sein oder in eine geeignete Wirtszelle transfiziert sein. Die Wirtszelle wird dann unter Bedingungen kultiviert, welche es der Transkription und Translation erlauben, zu geschehen, und das gewünschte Polypeptid wird wiedergewonnen. Andere kontrollierende Transkriptions- oder Translationssegmente wie Signalsequenzen, welche das Polypeptid zu einem spezifischen Zellkompartiment (d. h. für die Sekretion) lenken, können auch verwendet werden. Beispiele von prokaryotischen Wirtszellen sind in der Technik bekannt und schließen zum Beispiel E. coli ein. Beispiele von eukaryotischen Wirtszellen sind in der Technik bekannt und schließen Hefe-, Vogel-, Insekten-, Pflanzen- und Tierzellen ein, wie zum Beispiel COS7, HeLa, CHO und andere Säugerzellen.
Die Polypeptide dieser Erfindung können auch unter Verwendung von rekombinanten Vacciniavirus als einen Vektor exprimiert werden. Diese Anwendung wäre besonders nützlich bei Vaccinformulierungen, da sich ein Vacciniavirusträger, enthaltend heterologe Antigendeterminanten, als erfolgreiche Immunogene erwiesen haben. Die Expression von 11D10-Polypeptiden in Vacciniavektoren und ihre Verwendung wird oben und unten diskutiert.
Charakterisierung von 11D10 Polypeptiden
Die 11D10-Polypeptide dieser Erfindung können auf etlichen Wegen charakterisiert werden. Zum Beispiel kann ein 11D10-Polypeptid hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet werden, an Ab1 und/oder Ab3 zu binden. Alternativ können 11D10-Polypeptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet werden, eine Immunantwort auszulösen, vorzugsweise eine anti-HMFG-Antwort. 11D10-Polypeptide können auch hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet werden, HMFG-assoziierte Erkrankung wie HMFG-assoziierte Tumoren zu lindern oder zu verbessern. Es wird verstanden, dass nur eine dieser Eigenschaften vorhanden zu sein braucht, damit ein Polypeptid innerhalb dieser Erfindung liegt, obwohl mehr als eine dieser Eigenschaften vorhanden sein können. Die Fähigkeit eines 11D10-Polypeptids, Ab 1 und/oder Ab3 zu binden, kann auf etlichen Wegen beurteilt werden. In einem Test kann die Bindung von 11D10-Polypeptid(en) an Ab1 direkt getestet werden, zum Beispiel durch Radioimmuntest (RIA), zum Beispiel, indem radioaktiv markiertes 11D10-Polypeptid mit Ab1 oder Ab3, mit denen Mikrotiterplatten überzogen sind, zur Reaktion gebracht wird, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
In einer anderen Vorgehensweise wird die Bindung von Ab1 oder Ab3 durch kompetitiven Immuntest bestimmt. In einer Variation dieses Vorgehens wird die Bindung von markiertem(n) 11D10-Polypeptid(en) oder funktionell äquivalenten Fragmenten an Ab 1 (MC-10) in der Anwesenheit von verschiedenen Ab1, anderen Ab2, 11D10 oder Analoga davon, anderen 11D10-Polypeptid(en), HMFG oder Extrakten, die HMFG enthalten, oder anderen Proteinen gemessen. Prozentuale Inhibition wird gemäß der folgenden Formel berechnet:
In einer anderen Variation wird das Testfragment mit mutmaßlicher 11D10-Aktivität für seine Fähigkeit getestet, die Bindung zwischen Ab1 und Ab2 oder Ab1 und HMFG zu beeinflussen. Dieser Test kann bei gewissen Anwendungen empfindlicher sein, da eine Wechselwirkung mit niedriger Affinität zwischen 11D10 und Ab1 zu schwach sein kann, um eine stabile Bindung zu bilden, aber geeignet sein kann, um die Bindung eines andren Liganden-Rezeptor-Paars zu beeinflussen, wenn es in ausreichender Konzentration vorhanden ist. HMFG kann als ein gereinigtes Antigen oder als HMFG-exprimierende Zellen bereitgestellt werden. Der Test kann durchgeführt werden, indem entweder der Ab 1 oder HMFG oder Ab2 markiert wird und indem wahlweise das andere Mitglied des Liganden-Rezeptor-Paars auf einem festen Träger zur Erleichterung der Auftrennung immobilisiert wird. Das Testfragment wird mit dem markierten Reagenz inkubiert und dann wird die Mischung dem immobilisierten Ziel oder der Testzelle präsentiert, um zu bestimmen, ob das Testfragment in der Lage ist, die Bindung zu inhibieren. Der Grad der Inhibition korreliert mit 11D10-Aktivität.
Zahlreiche Beispiele von Kompetitionstests werden unten in dem Beispielabschnitt präsentiert. Ein Test, der 11D10-Polypeptidaktivität zeigt ist, die Bindung von radioaktiv markiertem Ab1 (MC-10) an teilgereinigtes oder gereinigtes HMFG in der Anwesenheit von verschiedenen Mengen von 11D10-Polypeptid(en) zu messen. Siehe zum Beispiel Beispiel 1. Die Ab1-HMFG-Mischung wird dann zu Platten, die mit 11D10-Polypeptid(en) überzogen sind, hinzugefügt und die Bindung wird mit der Bindung von markiertem Ab 1 alleine verglichen. Vorzugsweise wird dieser Test mit nicht gesättigten Mengen von markiertem Ab1 durchgeführt, um Änderung in der Bindung mit kleinen Mengen von kompetitivem HMFG zu detektieren. Ein Beispiel dieses Tests, wie er mit intaktem 11D10 durchgeführt wird, ist in Beispiel 1 bereitgestellt. In einem anderen Kompetitionstest werden HMFG-positive Zielzellen (wie MCF-7 oder SKBR3) in 96-Well-Gewebekulturplatten als eine konfluente Monoschicht wachsen gelassen. Bindung von radioaktiv markiertem Ab1 (MC-10) in Abwesenheit und Anwesenheit von 11D10-Polypeptiden wird bestimmt. Der Grad der Inhibition kann mit jenem von intaktem 11D10 oder anderen 11D10-Polypeptiden verglichen werden. Ein Beispiel dieses Kompetitionstests unter Verwendung von intaktem 11D10 wird in Beispiel 1 bereitgestellt. Ein anderes Beispiel dieses Tests, wobei das Ausmaß der Inhibition zwischen einem 11D10-scFv und intaktem 11D10 verglichen wird, ist in Beispiel 8 gezeigt.
Ein 11D10-Polypeptid wird als Ab1-bindend betrachtet, falls es keine Inhibition gibt, wenn es mit einer Negativkontrolle wie einem nicht verwandten anti-idiotypischen Antikörper verglichen wird, der an Ab 1 nicht bindet.
Bei allen oben beschriebenen Tests ist es für einen Fachmann klar, dass ein markiertes Molekül auf verschiedenen Wegen markiert werden kann, wie zum Beispiel mit Radioisotopen (d. h. ¹²⁵I) und nichtradioaktiven Markierungen wie biotinylierten Molekülen und Molekülen für die enzymatische Detektion, fluoreszierende Markierungen und chemilumineszierende Markierungen.
Die oben diskutierten Tests können auch verwendet werden, um Eigenschaften verschiedener 11D10-Polypeptidfragmente zu vergleichen. Zum Beispiel können Kompetitionstests durchgeführt werden, in welchen ein erstes 11D10-Polypeptid um die Bindung an Ab1 (MC-10) in der Anwesenheit variierender Mengen eines zweiten 11D10-Polypeptids konkurriert. Solche Tests können relative Grade von Bindungsaffinitäten oder anderen Eigenschaften zeigen.
Ein anderer Weg für die Charakterisierung von 11D10-Polypeptiden ist, ihre Fähigkeit zu testen, eine Immunantwort zu erzeugen. Wie hierin verwendet, zeigt „Immunantwort" entweder eine humorale Antwort, eine zelluläre Antwort oder beides an. Wie hierin verwendet, bezieht sich die „Fähigkeit, eine Immunantwort auszulösen", auf irgendein Individuum, einschließlich Mensch.
Die Fähigkeit eines 11D10-Polypeptids, eine humorale Antwort zu erzeugen, kann bestimmt werden durch Testen für die Anwesenheit eines Antikörpers, der an 11D10-Polypeptid(e) nach der Applikation der 11D10-Polypeptid(e) bindet. Es wird verstanden, dass dieser Antikörper (Ab3) nicht vorhanden war oder in niedrigeren Mengen vorhanden war vor der Applikation der 11D10-Polypeptid(e). Immunogenität wird bevorzugt in Individuen ohne eine vorangegangene anti-11D10-Antwort getestet. Beispiele geeigneter Individuen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Mäuse, Kaninchen, Affen und Menschen. Für diesen Test wird einem Individuum 11D10-Polypeptid(e) verabreicht. Die Menge pro Applikation und die Anzahl von Applikationen werden variieren in Abhängigkeit von dem Individuum. Basierend auf unseren vorangegangenen Studien unter Verwendung von intaktem 11D10 benötigt eine Maus annähernd 100 μg KLH-gekoppeltes 11D10-Polypeptid in der Anwesenheit von CFA und IFA pro Dosis und drei Applikationen. Affen benötigen annähernd 2 mg. Für Zwecke dieser Erfindung liegt der Bereich von 11D10-Polypeptid(en), der Menschen verabreicht werden kann, von ungefähr 10 μg bis ungefähr 10 mg, vorzugsweise 100 μg bis 10 mg, vorzugsweise 500 μg bis 8 mg, bevorzugter 1 mg bis 4 mg, sogar noch bevorzugter bei ungefähr 2 mg.
Die Anwesenheit eines Ab3 kann bestimmt werden, indem zuerst Seren mit autologem Immunglobulin vorinkubiert werden, um Antikörper gegen isotypische und allotypische Determinanten zu blockieren, und dann die Seren für die Bindung an HMFG und/oder 11D10-Polypeptid(e), zum Beispiel unter Verwendung von ELISA oder RIA, getestet werden. Zum Beispiel werden unterschiedliche Verdünnungen von vorreagierten Seren mit 11D10 (oder 11D10-Polypeptid), der auf Mikrotiterplatten überzogen ist, zur Reaktion gebracht. Ein nicht verwandter Ab2 dient als eine Kontrolle. Nach dem Waschen wird der Ab3-11D10-Komplex unter Verwendung von zum Beispiel ¹²⁵I-markiertem 11D10 in einem homogenen Sandwichtest markiert. Ergebnisse aus diesem Test werden mit jenen verglichen, die vor der Applikation des 11D10-Polypeptids gewonnen worden sind. Eine detailliertere Beschreibung solch eines Tests für die Detektion von Ab3, ausgelöst durch intakten 11D10 in Mäusen, wird in Beispiel 1 bereitgestellt. Alternativ kann die Bindung an HMFG-positive Zellen, wie menschliche Coloncarcinom-LS 174-T-Zellen, unter Verwendung von Immundurchflusscytometrie getestet werden.
Bindung von Ab3 und HMFG kann auch durch Immunfällung oder Immunreaktivität mit HMFG-positiven Gewebeproben oder Dot-Blot-Analyse bestimmt werden. In einem Verfahren der Dot-Blot-Analyse wird ein teilweise gereinigter Extrakt von HMFG direkt auf ein Nitrocellulosefilter geblottet. Das Filter wird darin mit Seren inkubiert, die Ab3 enthalten, und die Rektion wird durch enzymkonjugiertes anti-Immunglobulin entwickelt (Beispiel 1). Falls der Ab3 an HMFG bindet, sollte ein positiver Blot erscheinen. Für das Testen mit Gewebeproben kann ein Immunperoxidasetest verwendet werden (Beispiel 1).
Falls gewünscht, können durch 11D10-Polypeptid(e) ausgelöste Ab3 weiter charakterisiert werden. Zum Beispiel können Kompetitionstests durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob Ab3 Ab1-Idiotope teilt. Bei diesem Test wird Serum aus einem mit einem 11D10-Polypeptid immunisierten Individuum für die Inhibition der Bindung von markiertem 11D10-Polypeptid (oder intaktem 11D10) an Ab1 getestet. Inhibition zeigt an, dass Ab3 und Ab 1 wenigstens ähnliche Bindungsdeterminanten enthalten. Ähnlich kann die Kompetition von Ab3 mit Ab1 um die Bindung an HMFG (ob teilweise gereinigt, gereinigt oder auf der Oberfläche einer HMFG-positiven Zelle befindlich) getestet werden durch Co-Inkubieren einer festen Menge an markiertem Ab1 (MC-10) mit unterschiedlichen Verdünnungen von Ab3, enthaltend Seren oder Ab1-Zubereitung, und HMFG (oder HMFG-assoziierte Zellen wie zum Beispiel MCF-7 oder SKBR3). Diese Tests werden für intakten 11D10 in Beispiel 1 erläutert.
Wie es für einen Fachmann ersichtlich ist, kann der Ab3 wiederum verwendet werden, um 11D10-Polypeptide zu charakterisieren, unter Verwendung der oben beschriebenen Tests.
Ein anderer Weg, ein 11D10-Polypeptid zu charakterisieren ist durch Testen seiner Fähigkeit, einen Antikörper auszulösen, der cytotoxisch ist. Für die Bestimmung von komplementvermittelter Cytotoxizität (CMC) werden SKBR3- (Ziel-) Zellen (d. h. Zellen, die HMFG exprimieren) mit ⁵¹ Cr markiert. Markierung kann bewerkstelligt werden durch Inkubieren von ungefähr 10⁶ Zellen mit annähernd 200 μCi Na₂SO₄ für 60 Minuten bei 37 °C, gefolgt von Waschen. Der Test wird durchgeführt durch Hinzufügen und Inkubieren von Serum, von welchem vermutet wird, dass es Antikörper enthält. Meerschweinchenserum, das mit LS 174-T-Zellen (oder einer anderen Komplementquelle) voradsorbiert ist, wird dann hinzugefügt. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer bei 37 °C wird das Ausmaß an ⁵¹Cr-Freisetzung dann gemessen und mit jener von nichtopsonierten Kontrollzellen verglichen. Freisetzen von ⁵¹Cr korreliert mit der CMC-Aktivität. Herlyn et al. (1981) Int. J. Cancer 27: 769.
Ein anderer Weg, ein 11 D 10-Polypeptid zu charakterisieren, ist, durch Testen seiner Fähigkeit, einen anti-HMFG-Antikörper auszulösen, der an einer ADCC-Antwort teilnimmt. Cheresh et al. (1968) Cancer Research 46: 5112-5118. Bei diesem Test werden kultivierte MCF-7- oder SKBR3-Zellen (d. h. Zellen, die HMFG auf ihrer Oberfläche exprimieren) mit ⁵¹Cr markiert und werden als Zielzellen verwendet. Normale menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden als Effektorzellen verwendet. Vorzugsweise wird der ADCC-Test durchgeführt in der Anwesenheit von hitzeinaktiviertem Serum mit einem Effektor-Zielzell-Verhältnis von 100:1 für 4 Stunden, obwohl andere geeignete Bedingungen verwendet werden können. Die Menge an freigesetztem ⁵¹Cr wird dann gemessen.
Die 11D10-Polypeptide dieser Erfindung können auch charakterisiert werden durch ihre Fähigkeit, eine zelluläre Antwort auszulösen. Wie hierin verwendet, ist eine „zelluläre Antwort" eine Antwort, die T-Zellen involviert und in vitro oder in vivo beobachtet werden kann.
Ein Weg, eine zelluläre Immunantwort zu detektieren, ist durch Untersuchen für T-Zell-Proliferationsaktivität. Durch diesen Test wird zelluläre Immunantwort gemessen durch Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMs), die mit 11D10-Polypeptid(en) inkubiert worden sind. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus Blut nach einer erforderlichen Anzahl von Applikationen von 11D10-Polypeptid(en) isoliert und werden mit variierenden Konzentrationen an 11D10-Polypeptid(en) inkubiert. Falls Mäuse verwendet werden, werden T-Zellen aus der Milz gewonnen. T-Zellen können zum Beispiel angereichert werden durch Zentrifugation auf einem Gradienten wie Ficoll^TM. Ein unspezifisches Mitogen wie PHA dient als eine Positivkontrolle; Inkubation mit einem nicht verwandten anti-idiotypischen Antikörper dient als eine Negativkontrolle. Vorzugsweise sind die Stimulatorzellen autolog mit den Responderzellen, besonders hinsichtlich der Histokompatibilitäts-Call-II-Antigene. Nach Inkubation der PBMs für eine geeignete Anzahl von Tagen, um die Proliferation zu erlauben, wird [³H]Thymidin-Einbau gemessen. In vielen Fällen ist eine geeignete Zeit 5 Tage. Falls gewünscht, kann die Bestimmung, welcher Untersatz von T-Zellen proliferiert, unter Verwendung von Durchflusscytometrie durchgeführt werden. Wahlweise können Milz-T-Zellen vor dem Proliferationstest vorab von entweder CD1⁺- oder CD8⁺-Zellen durch Inkubation mit monoklonalem Antikörper RL.172 (anti-CD4⁺) oder mAb.168 (anti-CD8⁺) und Komplement abgereichert werden.
Ein anderer Weg, eine zelluläre Immunantwort zu detektieren, ist für T-Zell-Cytotoxizitäts-(CTL-) Aktivität zu testen. Bei diesem Test werden T-Lymphozyten (d. h. eine angereicherte 7-Zell-Population) isoliert (typischerweise aus Milzzellen) für die Verwendung als Ziele in einem Standard-⁵¹Cr-Freisetzungstest. Kantor et al. (1992) J. Natl. Cancer Inst. 84: 1084-1091. Ein Beispiel eines ⁵¹Cr-Freisetzungstest ist der Folgende. Kurz, HMFG-positive Tumorzellen (typischerweise 1-2 × 10⁶ Zellen) werden als Zielzellen mit ungefähr 200 μCi Na₂ ⁵¹CrO₄ (Amersham Corp., Arlington Heights, I11.) für 60 Minuten bei 37 °C radioaktiv markiert, gefolgt von gründlichem Waschen, um nicht eingebaute Isotope zu entfernen. T-Zellen und Ziele (1 × 10⁴/Vertiefung), beide in Kulturmedium resuspendiert, werden dann bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen in 96-Well-Platten mit U-förmigem Boden (Costar Corp.) vermischt. Die Platten werden bei 100 xg für 5 Minuten zentrifugiert, um Zellkontakt zu initiieren, und werden für 4 bis 16 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Nach der Inkubation werden Überstände unter Verwendung eines Überstandsammelsystems (Supernatant Collection System; Skatron, Inc., Sterling, VA) gesammelt und Radioaktivität wird in einem Gamma-Zählgerät (Beckman Instruments) quantifiziert werden. Spontane Freisetzung von ⁵¹Cr wird durch Inkubation von Zielen in der Abwesenheit von Effektoren bestimmt, während die maximale oder Gesamtfreisetzung von ⁵¹Cr durch Inkubation von Zielen in 0,1 % Triton X-100 bestimmt werden wird. Der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung von ⁵¹Cr wird durch die folgende Formel bestimmt: Prozent spezifische Freisetzung =[(experimentell – spontan)/(maximal – spontan)] × 100
Ein anderer Weg, 11D10-Polypeptide zu charakterisieren ist, Testen ihrer Fähigkeit, das Verzögern des Fortschreitens und/oder Reduzieren des Ausmaßes von HMFG-assoziierten Tumoren zu verzögern. Solche Tests können Entzündungsindikatoren, Radioscintigraphie oder Messung von zirkulierenden HMFG-Spiegeln einschließen (solche Tests sind kommerziell erhältlich).
Verwendungen und Verfahren unter Verwendung von 11D10 Polypeptiden
11D10-Polypeptide haben eine Anzahl von Verwendungen. 11D10-Polypeptide können verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Individuum zu induzieren, vorzugsweise eine anti-HMFG-Antwort. Sie können auch verwendet werden, um Ab3-Spiegel zu detektieren und zu überwachen und um Ab3 aufzureinigen. 11D10-Polypeptide sind auch nützlich für die Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung, zum Beispiel colorectales Carcinom, gewisse Lungenkrebse (Adenocarcinome), Magenkrebs, Pankreaskrebs und gewisse Brustkrebse.
Folglich schließt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort in einem Individuum ein, umfassend die Applikation eines 11D10-Polypeptids in einer Menge, die wirksam ist, eine Immunantwort zu induzieren. Vorzugsweise hat das Individuum HMFG-assoziierte Tumoren. In diesem Zusammenhang ist eine „effektive Menge" eine Menge, die ausreichend ist, eine messbare Immunantwort auszulösen, ob humoral und/oder zellulär. Eine wirksame Menge kann in einer oder in mehreren Applikationen verabreicht werden.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Detektieren eines Antikörpers in einer biologischen Probe, der an 11D10 bindet (d. h. Ab3 und/oder Ab1). Diese Verfahren sind in der klinischen Einstellung, zum Beispiel um Ab1- oder Ab3-Spiegel in einem Individuum zu überwachen, ebenso wie bei einer industriellen Einstellung anwendbar, in welchen die kommerzielle Produktion von Ab3 gewünscht wird. Diese Verfahren erfordern das Kontaktieren des Ab3 und/oder Ab 1 in der Probe mit einem 11D10-Polypeptid unter Bedingungen, die geeignet sind, die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen Ab3 und/oder Ab 1 und dem 11D10-Polypeptid zu erlauben, und das Detektieren eines gebildeten stabilen Komplexes, falls vorhanden. Eine Anzahl von Immuntestverfahren ist in der Technik bekannt und wurde hierin beschrieben. Für die weitere Erläuterung kann eine Testprobe, möglicherweise enthaltend Ab3 und/oder Ab1, mit einer vorherbestimmten, nicht beschränkenden Menge des 11D10-Polypeptids vermischt werden, das typischerweise detektierbar markiert ist (wie zum Beispiel mit einem Radioisotop oder Enzym). In einem Flüssigphasentest werden nicht umgesetzte Reagenzien durch Separationstechnik wie Filtration oder Chromatographie entfernt. Bei diesen Immuntesttechniken korreliert die Menge an mit dem Komplex assoziierter Markierung positiv mit der Menge an in der Probe vorhandenem Ab3 und/oder Ab 1. Ähnliche Tests können gestaltet werden, in welchen Ab3 und/oder Ab1 in der Testprobe mit markiertem Antikörper um die Bindung an eine begrenzende Menge des 11D10-Polypeptids konkurriert. Hier korreliert die Menge an Markierung negativ mit der Menge an Ab3 und/oder Ab 1 in der Probe. Geeignete Proben, in welchen Ab3- und/oder Ab1-Spiegel gemessen werden sollen, sind biologische Proben, einschließlich Serum oder Plasma, vorzugsweise Serum. Andere Proben schließen Gewebeproben ein.
Weiter schließt die Erfindung auch Verfahren zum Aufreinigen von Ab3 (oder Ab1) ein, umfassend das Kontaktieren einer Ab3 (und/oder Ab1) enthaltenden biologischen Probe mit einem 11D10-Polypeptid und Gewinnen eines dadurch gebildeten Komplexes, falls vorhanden. Typischerweise wird/werden 11D10-Polypeptide) an eine Affinitätsmatrix für Affinitätssäulenreinigung gekoppelt. Solche Verfahren sind in der Technik Routine und brauchen im Detail hierin nicht beschrieben werden.
Auch in diese Erfindung eingeschlossen sind Verfahren zur Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung wie HMFG-assoziierter Tumor, umfassend das Applizieren einer effektiven Menge eines 11D10-Polypeptids. Ein „HMFG-assoziierter Tumor" ist einer, der HMFG enthält, besonders exprimiert auf der Oberfläche von Tumorzellen, wovon Beispiele oben beschrieben worden sind. In diesem Zusammenhang ist eine effektive Menge für die Behandlung eine Menge, die ausreichend ist, den Erkrankungszustand zu lindern. Eine effektive Menge kann in einer oder in mehr als einer Applikation gegeben werden. Die Behandlung von Individuen mit einer effektiven Menge von 11D10-Polypeptid kann zum Beispiel die Progressionsrate der Erkrankung im Vergleich mit nicht so behandelten Individuen reduzieren.
In einer anderen Ausführung werden Verfahren bereitgestellt zum Stimulieren einer T-Zell-Antwort in einem Individuum mit HMFG-assoziierter Erkrankung. Diese T-Zell-Antwort kann als Proliferation von T-Zellen und/oder Förderung von cytotoxischer T-Zell-Aktivität unter Verwendung von 11D10-Polypeptiden, besonders 11D10-Polypeptiden, die mit HMFG homolog sind, manifestiert sein. Die 11D10-Polypeptide können direkt (entweder als Polypeptide oder Plasmide, die 11D10-Polypeptide) kodierende Polynukleotide enthalten) verabreicht werden oder können zu einer Ex-vivo-Kultur aus geeigneten Zellen hinzugefügt werden. 11D10-Polypeptide werden zum Beispiel zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen in einer Menge hinzugefügt, die wirksam ist, die gewünschte T-Zell-Aktivität zu stimulieren. Die stimulierten T-Zellen werden dann in das Individuum wieder eingeführt. Die Menge(n) von 11D10-Polypeptid(en), die hinzugefügt wird, wird von etlichen Faktoren abhängen, wie dem Zustand des Individuums, vorangegangenen und/oder gleichzeitigen Behandlungsvorgängen und anderen verwendeten Substanzen.
Die Polypeptide dieser Erfindung können alleine oder zusammen mit anderen Mitteln verwendet werden, welche die/das gewünschte Aktivität/Ziel fördern. 11D10-Polypeptide können auch in verschiedenen Kombinationen miteinander verwendet werden. In diesem Zusammenhang kann ein „Mittel" jedes einer Reihe von Substanzen sein. Weiter bedeutet „zusammen mit", dass das Mittel gleichzeitig, vor oder nach dem Polypeptid(en) verwendet werden kann. Das Mittel kann auch kovalent an das Polypeptid gekoppelt sein, wie ein Fusionsprotein, oder sich in enger physikalischer Nähe zu dem Polypeptid befinden. Eine gewünschte Aktivität ist jede Aktivität, die das gewünschte Ziel durch die Verwendung der 11D10-Polypeptide erleichtert, verstärkt, fördert oder moduliert.
Mittel, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cytokine, Lymphokine, Adjuvanzien und Arzneimittel. Mittel schließen auch Substanzen ein, welche die Zufuhr der Polypeptide erleichtern, wie zum Beispiel Liposomen, oder Substanzen, die die Zufuhr der Polypeptide an ein bestimmtes Ziel fördern, zum Beispiel ein zellulärer Rezeptor. Zum Beispiel können ein oder mehrere 11D10-Polypeptide als Fusionsproteine) erzeugt werden, welches) auch ein Cytokin enthält wie GM-CSF. Alternativ können eines oder mehrere 11D10-Polypeptide) mit einem Cytokin wie GM-CSF verabreicht werden.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren unter Verwendung von 11D10-Polypeptiden, um eine Markierung, zum Beispiel Radioaktivität, aus einem Individuum zu entfernen, das einen markierten anti-HMFG-Antikörper (Ab1) erhalten hat, zum Beispiel für die Radioscintigraphie oder Radiotherapie. Diese Erfindung schließt auch Verfahren zur Behandlung ein, in welchen ein radioaktiv markierter anti-HMFG-Antikörper in einer therapeutischen Dosis verabreicht wird, gefolgt von einem molaren Überschuss an 11D10-Polypeptid.
Die Verwendung von 11D10 für diesen Zweck wurde oben diskutiert und jene Prinzipien passen ähnlich auf 11D10-Polypeptide. Eine 11D10-Polypeptidmenge wird gewählt, die sich im ausreichenden molaren Überschuss gegenüber dem markierten anti-HMFG befindet, um alles anti-HMFG zu lokalisieren und zu binden, das nicht an der Tumorstelle lokalisiert ist. Der zeitliche Ablauf der Applikation und die Menge an 11D10-Polypeptid werden von der Art des radioaktiv markierten Antikörpers, der Art des verwendeten Radioisotops und dem Zustand des Individuums abhängen. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis von 11D10-Polypeptid zu dem anti-HMFG-Antikörper wenigstens ungefähr 5:1, bevorzugter ungefähr 25:1 bis 200:1. Vorzugsweise wird 11D10-Polypeptid 5 bis 24 Stunden, nachdem das Individuum den anti-HMFG-Antikörper erhalten hat, verabreicht.
Für 11D10-Polypeptide, die an anti-HMFG-Antikörper binden, besonders MC-10, kann die Detektion von anti-HMFG auf der Oberfläche einer Tumorzelle durch Kontaktieren der Tumorzelle mit 11D10-Polypeptid(en) für eine ausreichende Zeit bewerkstelligt werden, um die Bindung an den anti-HMFG-Antikörper zu erlauben, und durch Detektieren der Anwesenheit von jeglichem 11D10, das an den anti-HMFG-Antikörper gebunden ist. Die Entwicklung von experimentellen Parametern (wie zum Beispiel die Menge an 11D10-Polypeptid oder die Reaktionszeit) sind empirische Bestimmungen, die gut innerhalb des Fachwissens liegen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Vaccine, umfassend 11D10, 11D10-Polynukleotide und/oder 11D10 Polypeptide
Die vorliegende Erfindung umfasst pharmazeutische Zusammensetzungen und Vaccine, enthaltend 11D10, 11D10-Polynukleotid(e) und/oder 11D10-Polypeptid(e). Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen/Vaccine sind nützlich zum Auslösen einer Immunantwort und/oder für die Behandlung von HMFG-assoziierter Erkrankung wie Brustkrebs. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen/Vaccine können HMFG-assoziierte Erkrankung, entweder alleine oder zusammen mit anderen Therapieformen wie Chemotherapie oder Radiotherapie, lindern oder verbessern. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen, umfassend eine effektive Menge an 11D10, 11D10-Polynukleotid(en) und/oder 11D10-Polypeptid(en) in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff sind für systemische Applikationen an Menschen und Tieren in Dosiseinheitsformen, sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, sterilen nicht-parenteralen Lösungen oder oralen Lösungen oder Suspensionen, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen und Ähnlichem geeignet. Formulierungen der parenteralen und nicht-parenteralen Arzneimittelzufuhr sind in der Technik bekannt und sind dargelegt in Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing (1990).
Ein pharmazeutisch annehmbarer Hilfsstoff ist eine vergleichsweise inerte Substanz, die die Applikation einer pharmakologisch wirksamen Substanz erleichtert. Zum Beispiel kann ein Auszugsmittel einer Vaccinzusammensetzung Form oder Konsistenz geben oder als ein Verdünnungsmittel wirken. Geeignete Auszugsmittel schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Stabilisierungsmittel, Benetzungs- und Emulgierungsmittel, Salze für variierende Osmolarität, Verkapselungsmittel, Puffer und Hautpenetrationsverstärker. Beispiele pharmazeutischer annehmbarer Auszugsmittel sind beschrieben in Remingtons Pharmaceutical Sciences (1990), oben.
In einer Ausführung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein 11D10-Polypeptid(e), verwendet, um zum Beispiel Ex-vivo-Kulturen aus peripheren Blutmonocyten (PBMs) von einem Individuum zu stimulieren. Die PBMs werden dann in das Individuum erneut eingeführt. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird alleine oder in Kombination mit anderen die Bioantwort modifizierenden Substanzen wie Lymphokinen verwendet.
Ein Typ einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist ein Vaccin. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung auch Vaccine ein, umfassend eine effektive Menge an 11D10, 11D10-Polynukleotid(en), 11D10-Polypeptid(en) oder Kombinationen davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff. Diese Vaccine können unter anderem verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Individuum auszulösen, besonders in einem Individuum mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung wie HMFG-assoziierte Tumoren. Vorzugsweise schließt die Immunantwort die Produktion von anti-humanen Milchfettglobuliantikörper ein. Diese Vaccine sind besonders nützlich für die Behandlung, Modulation und/oder Linderung von HMFG-assoziierter Erkrankung.
Die Verabreichung von 11D10 enthaltenden Vaccinen wurde oben diskutiert.
11D10-Polynukleotide enthaltende Vaccine, oben beschrieben, können für die so genannte „genetische Immunisierung" verwendet werden, oder DNS-Vaccine, in welchen Polynukleotide ein Antigenpolypeptid kodieren, werden in Wirtszellen eingeführt, um eine schützende Immunantwort auszulösen. Tang et al. (1992) Nature 356: 152-154. Wenn sie sich erst einmal in dem Zellkern befinden, können die Plasmide als zirkuläre, nicht replizierende Episomen fortdauern, was zu einer dosisabhängigen und langlebigen Expression führt. Spooner et al. (1995) Gene Therapy 2: 173-180. Von der Immunisierung unter Verwendung von Polynukleotiden wurde gezeigt, dass sowohl zelluläre als auch humorale Antworten erzeugt werden. Spooner et al. (1995); Wang et al. (1995) Human Gene Therapy 6: 407-418. Genetische Immunisierung hat viele der Vorteile von lebenden oder abgeschwächten Mikroorganismen als Vehikel zum Auslösen einer Immunantwort ohne das Infektionsrisiko.
Vorzugsweise werden 11D10-Polynukleotide als Plasmidvektoren eingeführt, die geeignete Kontrollsequenzen für die Transkription und Translation enthalten, wie zum Beispiel Promotoren, Enhancer und Signalsequenzen. Eines oder mehrere 11D10-Polynukleotide können in einem einzelnen Kloniervektor verwendet werden und/oder multiple Vektoren können verwendet werden. Falls multiple 11D10-Polynukleotide verwendet werden, sollten sie im Leseraster innerhalb des Vektors inseriert werden oder sollten sich unter der Kontrolle von gesonderten Promotoren befinden. Die Länge und/oder Art des verwendeten 11D10-Polynukleotids können variieren und werden von etlichen Faktoren abhängen, wie zum Beispiel dem klinischen Ziel des Verabreichens des Vaccins, dem Zustand des Individuums und dem immunologischen Profil des Individuums. Zusätzlich können auch 11D10-Polynukleotide, die andere Substanzen kodieren, welche die Immunantwort verstärken, erleichtern und/oder erhöhen, in den Vektor inseriert werden. Beispiele solcher Substanzen wie GM-CSF wurden oben beschrieben.
Zum Beispiel wird in einer Ausführung ein Polynukleotid, das ein scFv von 11D10 kodiert, in einen der oben beschriebenen Expressionsvektoren (Plasmide) inseriert. In einem anderen Beispiel werden in 19 abgebildete, 11D10-Fragmente kodierende Polynukleotide in den Expressionsvektor für die Applikation als ein Vaccin inseriert. In einem anderen Beispiel wird ein ein immunogenes Fragment eines 11D10 kodierenden Polynukleotids in einen Expressionsvektor eingeführt. Eine andere Art von Vaccin, die 11D10-Polynukleotide nutzt, ist die so genannte Expressionsbibliothekimmuninsierung, in welcher eine Expressionsbibliothek aus 11D10-Polynukleotiden (kodierend verschiedene Teile von 11D10) verwendet wird, um einen Wirt zu immunisieren. Barry et al. (1995) Nature 377: 632-635. Das resultierende, vielteilige, nicht-infektiöse Vaccin kann sich als besonders günstig herausstellen, da es mehrere Peptide als mögliche Immunogene präsentiert. Die Präsentation von mehreren Immunogenen hat den zusätzlichen Vorteil, dass jeder bestimmte Wirt (d. h. Individuum), welchem es verabreicht wird, in der Lage ist, die immunologisch effektiven Polypeptide auszuwählen, welche von Individuum zu Individuum variieren können. Die für die Expression von 11D10-Polypeptiden verwendete Expressionsbibliothek kann umfassend sein, das heißt, zusammen das gesamte 11D10-Molekül kodieren, oder kann teilweise sein. Die Expressionsbibliothek für die Immunisierung wird durch allgemeine, oben beschriebene, rekombinante Verfahren gemacht, unter Verwendung eines geeigneten Vektorsystems. Typischerweise werden 11D10-Polynukleotide im Leseraster an einer Signalsequenz fusioniert, die Sekretion vermittelt.
Die Menge des zu verabreichenden 11 D 10-Polynukleotids wird von etlichen Faktoren abhängen, wie zum Beispiel der Art und dem Weg der Applikation (d. h. direkte Injektion im Gegensatz zu Ex-vivo-Kultur und Transfektion), dem von dem 11D10-Polynukleotid kodierten 11D10-Polypeptid, dem Zustand des Individuums (wie zum Beispiel dem immunologischen und/oder Erkrankungszustand) und dem gewünschten Ziel. Typischerweise beträgt die Menge pro Applikation ungefähr 10 μg bis 1 mg, vorzugsweise 25 μg bis 500 μg, bevorzugter 30 μg bis 250 μg, sogar noch bevorzugter 50 μg bis 100 μg, falls direkt appliziert.
In einer anderen Ausführung werden 11D10-Polynukleotide in lebenden oder abgeschwächten Viren oder viralen Vektoren verwendet, die ein kodiertes 11D10-Polypeptid(e) für Vaccinformulierungen exprimieren können. Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Adenovirus, adeno-assoziierte Retroviren (AAV) und SV40. Vorzugsweise ist das Virus Vaccinia. Rekombinantes Vacciniavirus kann ein starkes Mittel bereitstellen, um effektiv die durch 11D10-Polynukleotid(e) kodierten 11D10-Polypeptide) zusammen mit dem immunogenen viralen Partikel gleichzeitig zu präsentieren. Konstruktion von Vacciniavirusvektoren wurde oben beschrieben. Allgemein werden rekombinante virale Vektoren in einer Menge hinzugefügt, die ausreichend ist, in vivo Infektion von Wirtszellen zu bewirken. Die Menge hängt von der Art des verwendeten Virus ab, der Art des kodierten 11D10-Polypeptids, dem Zustand des Individuums und dem gewünschten Ergebnis. Rekombinantes Vaccinia (welches 11D10-Polypeptide oder 11D10-Varianten kodieren kann, die 11D10-Polypeptide enthalten, wie zum Beispiel scFv) kann direkt für die Vaccinierung mit ungefähr 107 bis 108 plaquebildenden Einheiten pro Dosis verwendet werden. Vaccinia kann parenteral appliziert werden, durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, zum Beispiel, ebenso wie durch mucosale Membranen wie nasal, oral oder durch Inhalation. Alternativ kann Vaccinia über Vaccinia-infizierte Zellen verabreicht werden. Bei dieser Technik werden geeignete Zellen wie Tumorzellen mit Vaccinia in Kultur infiziert. Die infizierten Zellen werden dann dem Individuum erneut zugeführt. Verfahren zum Infizieren von Zellen mit Vaccinia und erneutem Einführen dieser infizierten Zellen wurden beschrieben. Sie zum Beispiel Moss (1991).
Vaccine können auch aus einem oder mehreren 11D10-Polypeptiden zubereitet werden. 11D10-Polypeptide können durch jedes der oben beschriebenen Verfahren zubereitet werden, besonders durch die Aufreinigung aus einem geeigneten Expressionsvektor. In einer Ausführung umfassen die Vaccine ein oder mehrere 11D10-Polypeptid(e). 11D10-Polypeptide können in einem Vaccin als neutrale oder Salzformen formuliert sein. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen die sauren Additionssalze (gebildet mit freien Aminogruppen des 11D10-Polypeptids) ein und die, welche mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure oder Phosphorsäure oder solchen organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Bernstein-, Maleinsäure und Ähnliches gebildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch aus anorganischen Basen gewonnen werden wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminethanol, Histidin, Procain und Ähnliches.
In einer anderen Ausführung werden Vaccine bereitgestellt, die ein 11D10-Polypeptid enthalten, das an ein Viruspartikel fusioniert ist, wie zum Beispiel das Heptatitis-B-Oberflächenantigen.
Die Zubereitung von Vaccinen, die 11D10-Polynukleotide oder -Polypeptide als einen aktiven Bestandteil enthalten, schließt Standardpraxis in der Technik ein. Typischerweise werden solche Vaccine als injizierbare Stoffe zubereitet, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, geeignet für die Lösung in oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion, können ebenfalls zubereitet werden. Das Vaccin kann auch emulgiert werden oder 11D10-Polypeptide) und/oder -Polynukleotid(e) können mit Liposomen assoziiert sein.
11D10, 11D10-Polypeptide und/oder 11D10-Polynukleotide in den Vaccinen können rein verwendet werden, werden aber oftmals mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen vermischt. Geeignete Hilfsstoffe sind zum Beispiel Wasser, Salzlösung, physiologische gepufferte Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon. Falls gewünscht, kann das Vaccin auch kleinere Mengen von Hilfsstoffen wie Benetzungs- und Emulgierungsmittel, pH-Puffermittel, Stabilisatoren und/oder Adjuvanzien enthalten. Beispiele von Adjuvanzien wurden oben beschrieben. Für die veterinärmedizinische Verwendung und für die Produktion von Antikörpern in Tieren können mitogene Bestandteile von Freunds Adjuvanz verwendet werden. Die Auswahl eines Adjuvanz wird zum Teil abhängen von der Stabilität des Vaccins in der Anwesenheit des Adjuvanz, dem Applikationsweg und der regulatorischen Annehmbarkeit des Adjuvanz, besonders wenn es für die menschliche Verwendung beabsichtigt ist. Zum Beispiel ist Alaun von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassen für die Verwendung als ein Adjuvanz im Menschen. Zum Erhöhen der Immunantwort unter Verwendung eines ein 11D10-Polynukleotid enthaltendes Vaccin kann die Verkapselung in kationischen Lipiden verwendet werden. Für die Zufuhr von 11D10-Polypeptiden kann auch die Verkapselung in Liposomen angemessen sein. Liposomen, die geeignet sind zum Verpacken von Polynukleotiden und/oder Polypeptiden für die Zufuhr an Zellen, sind in der Technik bekannt.
11D10-Polypeptid(e) kann/können wahlweise chemisch behandelt werden, um ihre Immunogenität zu steigern, besonders falls ein 11D10-Polypeptid 100 Aminosäuren oder weniger umfasst. Solch eine Behandlung kann Quervernetzung einschließen, zum Beispiel mit Glutaraldehyd; Verknüpfung an einen Proteinträger wie Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Tetanustoxoid.
Falls eine suboptimale Immunantwort als an Suppressor-T-Zellen liegend betrachtet wird, welche durch ein Vaccin dieser Erfindung induziert worden sind, kann Cyclophosphamid (100 mg/kg Körpergewicht) ebenfalls intraperitoneal verabreicht werden.
Die Vaccine der vorliegenden Erfindung werden typischerweise parenteral verabreicht, zum Beispiel durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär, intraperitoneal oder intradermal. Die Applikation kann auch intranasal, intrapulmonal (d. h. durch Aerosol), oral und intravenös erfolgen. Zusätzliche Formulierungen, die geeignet sind für andere Applikationsweisen, schließen Suppositorien und in manchen Fällen orale Formulierungen ein. Der Applikationsweg wird von dem Zustand des zu behandelnden Individuums und der gewünschten klinischen Wirkung abhängen.
Applikationen können auf einer wöchentlichen oder zweiwöchigen Basis begonnen werden, bis ein gewünschter, messbarer Parameter detektiert wird, wie Auslösen einer Immunantwort (humoral und/oder zellulär). Die Applikation kann dann auf einer weniger häufigen Basis fortgesetzt werden, wie zweiwöchig oder monatlich. Für 11D10 enthaltende Vaccine werden die Verabreichungen vorzugsweise zweiwöchentlich für die ersten vier Applikationen gegeben, gefolgt von monatlichen Applikationen.
Die Vaccine werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie prophylaktisch und/oder therapeutisch effektiv sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Individuum, der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, dem Applikationsweg und dem Grad des gewünschten Schutzes ab. Präzise Mengen von aktiven Bestandteilen, die erforderlich sind, verabreicht zu werden, können von dem Urteil des Praktikers abhängen und werden dem Individuum zueigen sein. Allgemeine Dosisbereiche für 11D10, 11D10-Polynukleotide und 11D10-Polypeptide wurden oben gegeben.
Typischerweise wird das Vaccin als eine Reihe von Dosen verabreicht, startend mit einer Dosisgruppe, um die Immunantwort vorzubereiten, gefolgt von weniger eng beabstandeten „Aufrechterhaltungs"-Dosen. Zum Beispiel kann das Vaccin auf einer wöchentlichen Basis verabreicht werden, um eine Immunantwort zu etablieren, gefolgt von zweiwöchentlichen oder monatlichen Injektionen, um die Antwort aufrecht zu erhalten.
Die 11D10-Polypeptide und/oder 11D10-Polynukleotide in den Vaccinen können alleine gegeben werden, in Kombination mit anderen 11D10-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden, in Kombination mit intaktem 11D10 und/oder in Kombination mit anderen Substanzen wie Lymphokinen und Arzneimitteln, die die gewünschte Wirkung verstärken, erleichtern oder modulieren. Beispiele solcher Substanzen wurden oben beschrieben. 11D10-Polypeptide können durch Zubereiten einer Mischung der 11D10-Polypeptide in Lösung oder durch Synthetisieren eines Fusionsproteins kombiniert werden.
Die Vaccine dieser Erfindung können auch zusammen mit rekombinantem Vaccinia verabreicht werden, das ein HMFG-kodierendes Polynukleotid enthält oder ein Fragment davon, und/oder rekombinantes Vaccinia, das ein Polynukleotid enthält, welches ein Lymphokin wie GM-CSF kodiert. Weiter wird verstanden werden, dass die Vaccine dieser Erfindung zusammen mit anderen Therapieweisen verwendet werden können, ob etabliert oder experimentell. Solch eine Verwendung ist zum Beispiel angezeigt, wenn die Applikation des Vaccins die klinischen Ergebnisse verbessert, im Vergleich mit der Applikation von anderen Therapieweise(n) wie Chemotherapie oder Radiotherapie.
Die Immunogenität eines 11D10-Vaccins kann durch Messen von Ab3-Spiegeln und/oder Überwachen des Erkrankungszustandes überwacht werden. Detektion und Messung von Ab3 unter Verwendung von RIA oder ELISA und Messung von T-Zell-Aktivität (d. h. Proliferation und/cytotoxische Aktivität) wurde oben beschrieben. Als ein Beispiel, Ab3 kann wie folgt quantifiziert werden. Mikrotiterplatten werden mit MC-10 (Ab1) überzogen und werden mit einer festen Menge an ¹²⁵I-markiertem 11D10-Polypeptid zur Reaktion gebracht. Es wird eine Standardinhibitionskurve unter Verwendung von gereinigtem MC-10 als dem Inhibitor erzeugt. Seren bei verschiedenen Verbindungen werden für die Fähigkeit getestet, Ab1-Ab2-Reaktion zu inhibieren und die Menge von Ab3 in dem Serum wird aus der Standardinhibitionskurve abgeschätzt. Alternativ kann die T-Zell-Antwort unter Verwendung von jedem der oben beschriebenen Tests gemessen werden. Der Erkrankungszustand kann unter Verwendung von Standardtechniken der Technik überwacht werden, wie zum Beispiel die Messung eines tumorassoziierten Markers, Röntgen, CT-Bild und andere messbare klinische Manifestationen.
Es wird erkannt, dass eine Anzahl von alternativen Vaccinzusammensetzungen, nicht beschränkt auf jene hierin beschriebenen, wirksam sein kann beim Induzieren einer Immunantwort. Sämtliche solche Zusammensetzungen sind in der vorliegenden Erfindung verkörpert, vorausgesetzt, dass sie ein 11D10-Polynukleotid oder -Polypeptid als einen aktiven Bestandteil einschließen.
Kits, umfassend 11D10, 11D10 Polynukleotide und/oder 11D10-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Kits, enthaltend 11D10, 11D10-Polynukleotid(e) und/oder 11D10-Polypeptid(e), vorzugsweise diagnostische Kits. Diagnostische Vorgänge unter Verwendung von 11D10, 11D10-Polynukleotiden und/oder 11D10-Polypeptiden dieser Erfindung können durch Diagnoselaboratorien, experimentelle Laboratorien, Praktiker oder private Individuen durchgeführt werden. Durch diese Erfindung verkörperte Kits schließen jene ein, die jemandem erlauben, einen Test für anti-HMFG- oder anti-11D10-Aktivität durchzuführen, wie zum Beispiel jedem von jenen hierin offenbarten, wodurch folglich jene Aktivitäten detektiert und/oder quantifiziert werden. Die durch diese Erfindung verkörperten Kits schließen auch Kits ein, die Detektion von 11D10-Polynukleotiden in zum Beispiel ex-vivo- oder in-vivo-transfizierten Zellen erlauben. Diese Kits können verwendet werden für die Detektion der Quantifikation eines Polynukleotids, das ein Polynukleotid umfasst, welches eine variable Region von 11D10 oder einen Teil davon kodiert. 11D10-Polynukleotide, die mit variablen Regionen von 11D10hybridisieren können (d. h. ein stabiles Hybrid bilden), aber nicht mit Polynukleotiden anderer variabler Regionen (bekannt an dem Zeitpunkt der Anmeldung dieser Anmeldung), wie hierin beschrieben worden ist, sind besonders geeignet.
Zum Beispiel kann die Anwesenheit von Ab3 in einer biologischen Probe getestet werden für die Verwendung eines 11D10-Polypeptids. Die Probe kann wahlweise für die Anreicherung von Ab3 vorbehandelt sein.
Die Kits dieser Erfindung umfassen 11D10, 11D10-Polynukleotid(e) und/oder 11D10-Polypeptid(e) in geeigneter Verpackung. Der Kit kann wahlweise zusätzliche Bestandteile bereitstellen, die bei dem Vorgehen nützlich sind. Diese wahlweisen Bestandteile schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Puffer, Fangreagenzien, Entwicklungsreagenzien, Markierungen, Reaktionsoberflächen, Detektionsmittel, Kontrollproben, Instruktionen und interpretierende Information.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu erläutern, aber nicht zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Erzeugung und Charakterisierung von 11D10 anti-idiotypischem Antikörper
Die Hybridomzelllinie, die monoklonale anti-idiotypische Antikörper 11D10 erzeugt, wurde geschaffen und identifiziert nach der folgenden Beschreibung. Aspekte von sowohl dem Immunisierungsvorgehen als auch dem Screeningvorgehen waren wichtig, um einen Antikörper mit der gewünschten Spezifität und Funktionalität zu gewinnen. 11D10 war einer einer Anzahl von Ab2, die anfänglich produziert worden waren, und wurde identifiziert als der Kandidat mit den wünschenswertesten Eigenschaften.
Der Immunisierungsantikörper (Ab 1) war der monoklonale anti-HMFG-Mausantikörper MC-10, auf den in diesem Abschnitt als BrE-1 Bezug genommen wird. Da das ansprechende Tier auch eine Maus war, wurde von den erzeugten Ab2 erwartet, dass er gegen idiotypische Eigenschaften von BrE-1 gerichtet ist. Nur eine Fraktion von jenem wäre jedoch gegen den BrE-1-Paratop gerichtet, sogar ein noch kleinerer Anteil wäre immunogen und in der Lage, einen Ab3 auszulösen, und ein immer noch kleinerer Anteil würde Ab3 auslösen, welche mit dem tumorassoziierten Antigen kreuzreagierten.
Um BrE-1 ausreichend immunogen in einer autologen Art zu machen, wurde er an den Carrier KLH konjugiert und in Freunds Adjuvanz emulgiert. Er wurde wiederholt in die Empfängertiere nach einem ungewöhnlichen Plan mit nur zwei Wochen, die zwischen den Dosen liegen, verabreicht. Fünf Wochen wurde nach diesem Plan immunisiert. Wesentliche Reaktionen ergaben sich in ungefähr drei Mäusen nur nach der vierten Immunisierung. Ansprechende Tiere wurden mit einer fünften Dosis BrE-1 i.v. geboostert, Milzzellen wurden isoliert und Hybridome wurden aus jedem Tier gesondert zubereitet. Klonieren wurde nach Standardtechniken durchgeführt.
Das Screeningvorgehen umfasste vier wichtige Schritte: (1) Positivselektion für Antikör-perbindung an BrE-1; (2) Negativselektion gegen Antikörper erkennende isotypische oder allotypische Determinanten; (3) Positivselektion für eine Fähigkeit, die Bindung von BrE-1 in HMFG zu inhibieren; und (4) Positivselektion für eine Fähigkeit, eine humorale Immunantwort gegen das ursprüngliche tumorassoziierte Antigen (HMFG) sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen zu induzieren. Der Rest dieses Abschnittes stellt einen Überblick über das Screeningvorgehen bereit, welches detaillierter in den Abschnitten, die folgen, wiedergegeben ist.
Anfängliches Screening wurde durchgeführt durch Immuntest, um die Klone zu identifizieren, welche mit BrE-1 reagierten, aber nicht mit anderen monoklonalen Zielantikörpern, die dieselben allotypischen oder isotypischen Determinanten teilen. Ein kritischer Test war ein Sandwich-RIA, in welchem BrE-1 an eine feste Phase angeheftet ist, überschichtet mit Kulturüberstand und mit radioiodiertem BrE-1 entwickelt. Dieser Test erfordert, dass der Antikörper in dem Hybridomüberstand funktionell bivalent ist und dass er in der Lage ist, den Fang-BrE-1 und den Entwicklungs-BrEI zu überbrücken. Etliche Klone, die idiotypenspezifisch waren und ein starkes Signal in diesem Test gaben, wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt.
Nachfolgendes Screening wurde durch Kompetitionstests durchgeführt, in welchen der Ab2 erforderlich war, um die Bindung von BrE-1 und HMFG zu hemmen. Dies wies nach, dass Ab2 den Paratop von BrE-1 erkannte. HMFG wurde in der Form von MCF-7-Zellen bereitgestellt, einer menschlichen Brustzelltumorlinie, die HMFG an der Zelloberfläche exprimiert. Die Art des Tests erfordert es, dass Ab2 die Wechselwirkung zwischen BrE-1 und dem Tumorantigen in seiner bestimmten Weise der Präsentation auf Tumorzellen hemmt. Zu einem Minimum waren Kandidaten-Ab2s erforderlich, von jenen, die die früheren Screeningtests passiert hatten, die die Bindung von BrE-1 an die Zellen um wenigstens 85 % inhibieren. Es gab ungefähr drei Ab2, welche wesentlich das Minimum überschritten, wobei 11D10 ungefähr den höchsten Inhibitionsgrad bereitstellte.
Der letzte Screeningtest war eine Bestimmung, ob die Kandidaten-Ab2 in der Lage waren, einen Ab3 der gewünschten Spezifität auszulösen, wenn sie in einen Empfänger injiziert werden. Ausreichende Mengen von Ab2 wurden aus Mausascites zubereitet und in Mäusen und Kaninchen getestet. Seren aus den Testtieren wurden als erstes für die Anwesenheit von Ab3 in einem Sandwich-Immuntest untersucht, unter Verwendung desselben markierten Ab2, der für die Immunisierung verwendet worden war. Seren, die positiv testeten, wurden dann für die Fähigkeit des Ab3 untersucht, gegen das tumorassoziierte Antigen, nämlich HMFG, zu reagieren. Eine teilweise gereinigte Zubereitung von HMFG wurde verwendet, um Mikrotiterplatten zu überziehen, wurden mit dem Testserum in seriellen Verbindungen überschichtet und der Ab3, der band, wurde unter Verwendung von markiertem Anti-Immunglobulin detektiert. Der Titer der Ab3-Bindung an HMFG definierte die „Qualität" von Ab2, als eine Reflexion seiner Fähigkeiten als ein Induktor von Anti-HMFG.
Der monoklonale Antikörper 11D10 ging als der Anti-Idiotyp mit der höchsten Qualität hervor und ist die Basis für verschiedene Verbindungen, Zusammensetzungen und Vorgehensweisen, die in dieser Erfindung verkörpert sind.
Materialien und Methoden
Zellen: Der Fusionspartner, der verwendet worden ist, um die Hybridomlinien zu erzeugen, war die nicht-sekretorische Maus-Myelomzelllinie P3-653, über Vorfahren verwandt mit P3X63Ag8.653, erhältlich von der ATCC als Nummer CRL-1580. Etablierte menschliche Zelllinien wurden in RPMI 1640, ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum kultiviert, wie anderswo beschrieben (Seon et al. (1984) J. Immunol. 132: 2089).
HMFG: Entfettete HMFG wurden von Roberto L. Ceriani geliefert und wurden nach seinem Protokoll zubereitet (Ceriani et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci USA 74: 582-586). Kurz, die gewaschene Sahnefraktion von menschlicher Milch wurde zweimal mit zwei Volumen Chlorophorm extrahiert und zweimal mit einem Volumen Ether extrahiert und dann lyophilisiert. Die Proteinkonzentration wurde durch die Lowry-Methode bestimmt.
BrE-1 Antikörper: Der monoklonale Mausantikörper BrE-1 (MC-10) wurde großzügigerweise bereitgestellt von Dr. R.L. Ceriani und ist beschrieben in WO 89/07268. Ascites von BrE-1-Hybridomen wurden zubereitet durch Injizieren von einzelnen Pristan vorbereiteten Mäusen i.p. mit 2-10 × 10⁶ lebensfähigen Zellen. Die IgG-Fraktion wurde isoliert aus Ascites durch Fällung mit 45 % gesättigtem Ammoniumsulfat und anschließender Chromatographie auf Protein A Sepharose^TM CL-4B (Ey et al. (1978) Immunochemistry 15: 429). Die Reinheit des isolierten IgG wurde überprüft durch Immundiffusion, Immunoelektrophorese und Hochdruckflüssigchromatographie-(HPLC)-Fraktionierung. Andere unverwandte Ab1 und Ab2 unterschiedlicher Isotypen wurden als Kontrolle verwendet.
Zubereitung von F(ab')₂-Fragmenten von BrEl: Die F(ab')₂-Fragmente wurden durch Standardpepsinverdauung zubereitet (Parham (1983) J. Immunol. 131: 2895). Kurz, die IgG-Fraktion aus dem BrE-1-Ascites wurde gegen 0,1 M Citratpuffer, pH 3,5, dialysiert und mit Pepsin (25 Tg/mg IgG) bei 37 °C für 8 Stunden verdaut. Nach der Spaltung wurde der pH-Wert auf 7,0 mit 3,0 M Trispuffer, pH 8,6, eingestellt und die Lösung wurde gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) in der Kälte dialysiert. Das Verdaute wurde durch HPLC unter Verwendung einer Sepharose^TM-6-Säule aufgetrennt. Die Reinheit des isolierten F(ab')₂ wurde durch Immundiffusion und durch Reaktion mit Anti-Isotypenreagenzien in einem Standard-ELISA bestimmt.
Kopplung von Antikörper mit KLH: BrEl wurde gekoppelt an Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin (KLH) nach einem von Maloney et al. (1985) Hybridoma 4: 191) beschriebenen Verfahren. Antikörperstammlösung (1 mg/ml) wurde mit KLH (1 mg/ml) in PBS in der Anwesenheit von frisch verdünnter Glutaraldehydlösung (Endkonzentration 0,05 %) vermischt. Die Mischung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur im Trommelmischer rotiert und wurde dann gegen PBS bei 40 °C erschöpfend dialysiert.
Immunisierung von syngenischen BALB/c-Mäusen: BALB/c-Weibchen wurden viermal über einen Zeitraum von 2 Monaten immunisiert. Die erste Injektion wurde i.p. unter Verwendung von 100 Tg BrEl, emulgiert in Freunds vollständigen Adjuvanz, gegeben. Die nächsten beiden Injektionen wurden mit 100 Tg BrE1, gekoppelt an KLH in unvollständigem Freunds Adjuvanz, gegeben, entweder s.c. oder i.p.. Mäusen wurde von Zeit zu Zeit Blut abgenommen und Seren wurden für anti-idiotypische Aktivität durch ELISA in einem Bindungstest unter Verwendung von F(ab')₂-Fragmenten von BrE-1 und normalem vereinigtem BALB/c-Mausserum-IgG als Kontrolle getestet. Drei Tage vor der Fusion wurden die Mäuse i.v. mit BrE-1 in PBS geboostert.
Produktion von anti-idiotypischen Hybridomen
Der Fusionspartner, der verwendet wurde, um die Hybridomlinien zu produzieren, war die nicht-sektretorische Mausmyelomzelllinie P3-653, über Ahnen verwandt mit P3X63Ag8.653, erhältlich von der ATCC als Nr. CRL-1580. Etablierte menschliche Zelllinien wurden im RPMI 1640 kultiviert, ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum, wie anderswo beschrieben (Seon et al. (1984) J. Immunol. 132: 2089).
Hybridome wurden im Wesentlichen nach dem Verfahren von Oi und Herzenberg (1980) Selected Methods of Cellular Immunology, Mishell & Shiigi, Hrsg., Freeman Publs. auf 351-372) produziert. Milzzellen aus immunisierten Mäusen wurden mit P3-653-Zellen in einem Verhältnis von 1:1 bis 10:1 in der Anwesenheit von 50 % Polyethylenglycol (PEG, MW 4500) vermischt. Fusionierte Zellen wurden dann gewaschen und kultiviert. Hybride wurden unter Verwendung von Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medien selektiert.
Anfängliche Selektion von anti-idiotypischem Antikörper- (Ab2-) sezernierenden Hybridomklonen
Anfängliches Screening der Hybridomklone wurde durchgeführt durch RIA. Gereinigter BrE-1 wurde radioiodiert durch die Chloramin-T-Methode (Hunter (1970) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133: 989). BrE-1 oder Kontrollantikörper (monoklonale Antikörper verschiedener Isotypen und nicht verwandter Spezifitäten und normales IgG von BALB/c) wurden auf PVC-Platten in einer Konzentration von 500 mg/Vertiefung überzogen. Nach Inkubieren über Nacht bei 40 °C wurden die Platten mit 1 % Rinderserum Albumin (BSA) in PBS geblockt. Überzogene Platten wurden mit Reihenverdünnungen von Hybridomüberstand für vier Stunden inkubiert und entwickelt unter Verwendung von ~ 50.000 cpm ¹²⁵I-BrE-1. Der RIA- Test ist ein stringenter Spezifitätstest für den Antikörper und erfordert auch, dass der Antikörper in der Lage ist, zwischen zwei BrE-1-Molekülen zu überbrücken.
Zusätzlich wurden ELISA-Tests durchgeführt, um die Klasse und Subklasse jedes Klons zu bestimmen. ELISA wurde durchgeführt durch Überziehen von Mikrotiterplattenvertiefungen mit BrE-1-Antikörper (oder Kontrolle) mit 500 ng/Vertiefung. Nach Inkubieren über Nacht bei 40 °C wurden die Platten mit 1 % BSA in PBS geblockt. 100 TI Hybridomkulturüberstände oder 20 x Konzentrat wurden in der Vertiefung für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Platten weiter für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 40 °C mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Isotypenreagenzien inkubiert und mit dem Substrat entwickelt. Antikörper gewisser IgG-Subklassen wird leicht durch Protein-A-Chromatographie gereinigt und kann nützliche Effektorfunktionen haben.
Die Kulturüberstände aus 1300 Vertiefungen mit primären Fusionen wurden anfänglich gescreent. Zweiundvierzig Ab2-Hybridome wurden gewonnen, die mit BrE-10 in dem RIA reagierten, nicht aber mit Isotyp- oder Allotyp-angepassten Kontrollimmunglobulinen.
Eine Reihe von monoklonalen Ab2-sezernierenden Zelllinien gingen aus diesem Screeningtest mit den gewünschten Eigenschaften hervor. Unter diesen war der monoklonale Antikörper 11D10.
Bestätigung, dass monoklonale Ab2 spezifisch für BrE-1 Idiotyp sind
Idiotypspezifität von Ab2 wurde bestätigt durch direkte Bindung an Ab1. Verschiedene gereinigte Ab2 wurden mit ¹²⁵I markiert und für die Bindung an mit einem Satz an mit monoklonalem Anti-TAA-Ab1 überzogenen Platten getestet. Ergebnisse für ein Experiment unter Verwendung von ¹²⁵I-11D10 sind in 6 gezeigt. Die Ergebnisse sind in mittleren cpm (c = 3, S.D. < 10 %) präsentiert. 11D10 band annähernd ausschließlich an BrE-1; es gab praktisch keine Kreuzreaktivität mit irgendeinem der anderen getesteten Ab 1.
Idiotypspezifität von Ab2 wurde auch durch Umkehren der Position von Ab1 und Ab2 bestätigt. Platten wurden mit 100 ng, 300 ng und 1000 ng gereinigtem Ab2 überzogen und mit verschiedenen markierten Ab1 zur Reaktion gebracht. Eingeschlossen waren ¹²⁵I-BrE-1 und ¹²⁵I-BrE-3. BrE-3 ist ein IgGI, der spezifisch ist für ein anderes tumorassoziiertes HMFG-Epitop, und diente als Kontrolle. Ergebnisse eines Experimentes, in welchem 11D10 durch dieses Verfahren getestet wurde, sind in Tabelle 1 gezeigt und bestätigen die Spezifität für BrE-1.
Tabelle 1: Bindung der mAb1 BrE-1 und BrE-3 an Anti-Idiotyp (11D10)
Spezifität für den BrE-1-Idiotyp wurde weiter in Kompetitionsexperimenten nachgewiesen. Verschiedene markierte Ab2 waren gemischte unterschiedliche Mitglieder eines Satzes aus unmarkierten Kompetitoren, umfassend Ab2, Ab1 und andere Mausimmunglobuline. Die Ab2 wurden dann für die Bindung an mit BrE-1 überzogene Platten getestet. Für den besten Ab2 wurde eine Inhibition von mehr als 90 % unter Verwendung von 250 ng unmarkierten Ab2 oder BrE-1 als Kompetitor beobachtet. Praktisch gar keine Inhibition wurde bis zu einer Konzentration von 10 Tg unter Verwendung der anderen Immunglobuline als mögliche Kompetitoren erhalten. Repräsentative Ergebnisse, in welchen 11D10 der getestete Ab2 war, sind in Tabelle 2 gezeigt (mittlere cpm, n = 3, S.D. < 10 %).
Tabelle 2: Inhibition von Idiotyp-Anti-Idiotyp-Bindung
Screening für Anti-Idiotypen, gerichtet gegen das BrE-1 Paratop
Um zu bestimmen, ob die Ab2 gegen das Paratop von BrE-1 gerichtet waren, wurden die Ab2 verwendet, um um die Bindung von radioaktiv markiertem BrE-1 in HMFG zu konkurrieren, wie exprimiert auf menschlichen Brustcarcinomzelllinien MCF-7 oder SKBR3.
Um den Test durchzuführen, wurden die Zielzellen als konfluente Monoschicht in 96-Well-Gewebekulturplatten wachsen gelassen. Verschiedene Verdünnungen des Test-Ab2 (entweder Kulturüberstand oder gereinigter Antikörper) wurden mit dem markierten BrE-1 vermischt und dann zu konfluenten Zellkulturen in Mikrotiterplattenvertiefungen hinzugefügt. Prozentuale Inhibition des Tests wurde berechnet nach der folgenden Formel:
wo R_T die durchschnittlichen cpm der experimentellen Vertiefung mit Inhibitoren ist; R_C die durchschnittlichen Hintergrund-cpm ist; und R_MAX die durchschnittliche maximale Bindung ohne irgendwelche Inhibitoren ist.
7 zeigt Ergebnisse dieses Experimententyps, durchgeführt unter Verwendung von 11D10 als der konkurrierende Antikörper. 250 ng des Ab2 11D10 inhibierte die Bindung von markiertem BrE-1 an die HMFG-exprimierenden Zellen um über 90 % (7).
Ungefähr 24 der 42 getesteten monoklonalen Antikörper in diesem Stadium (einschließlich 11D10) inhibierten die Bindung von markiertem BrE-1 an die HMFG-exprimierenden Zellen oder an den HMFG-Extrakt in einem Plattenbindungstest in so niedrigen Mengen wie ungefähr 25 ng. Gereinigter 3H1 (ein monoklonaler Mausantikörper irrelevanter Spezifität) wurde als ein Kontrollkompetitor verwendet und inhibierte die Bindung von BrE-1 an die Zellen nicht. Allgemein wurde ein Ab2, der wenigstens 85 % Inhibition erzeugte, als diesen Schritt in dem Screeningvorgang bestanden habend erachtet.
Bestätigung der Bindungsspezifität
Für den vielversprechendsten Ab2 wurden Bestätigungsexperimente durchgeführt, um die Spezifität der Bindung an BrE-1 unter Verwendung von HMFG zu bestätigen.
Ungefähr 40.000 cpm ¹²⁵I-BrE-1 wurden gleichzeitig mit einer teilweise gereinigten Zubereitung von HMFG inkubiert. Die Antikörper-Ag-Mischung wurde zu mit Ab2 überzogenen Platten (500 ng/Vertiefung) hinzugefügt und die Fähigkeit von HMFG, die Bindung zu inhibieren, wurde bestimmt. Die Ab2-Menge war nicht beschränkend in Bezug auf die Menge an BrE-1, welche binden konnte, und war deshalb ein empfindlicher Indikator für kleine Mengen konkurrierender HMFG.
Sechs der 24 antikörperproduzierenden Klone, die in den bis jetzt beschriebenen Screeningtests positiv getestet hatten, wurden verwendet, um Mausascites als eine Quelle an Ab2 zuzubereiten. Die Ab2 wurden durch Chromatographie unter Verwendung eines Protein-A-Affinitätsharzes durch Standardtechniken gereinigt.
Die Bindung von BrE-1 an 11D10 wurde durch HMFG inhibiert.
Screening für Anti-Idiotypen, die fähig sind, eine tumorspezifische Immunantwort auszulösen
Da ein zentraler Zweck dieser Experimente war, einen Anti-Idiotypen zu finden, der fähig ist, eine Anti-HMFG-Immunantwort auszulösen, war der nächste Screeningschritt, seine Immunogenität in Tiermodellen zu testen. Der Ab2 würde nicht nur immunogen sein müssen, sondern fähig, Ab3 hervorzurufen, welche zurück mit dem Tumorantigen HMFG kreuzreagierten.
Demgemäß wurden die Ab2, welche das stärkste Ergebnis in den Kompetitionsexperimenten mit den HMFG-exprimierenden Zellen ergaben, zum Testen in Immunisierungsexperimenten gebracht.
Für jeden zu testenden Ab2 wurden 5 BALB/c-Mäuse und zwei weiße Neuseeland-Kaninchen immunisiert. Für die Mäuse wurde Ab2 an KLH konjugiert. 50 μg wurden pro Maus injiziert und 200 μg wurden pro Kaninchen injiziert, nach einem zweiwöchigen Plan. Anfängliche Injektionen wurden in vollständigem Freunds Adjuvanz und nachfolgende Injektionen in unvollständigem Freunds Adjuvanz zubereitet. Seren wurden regelmäßig für die Analyse gesammelt. Anfänglich wurden Ab3-Titer in einem Standard-Sandwich-Radioimmuntest unter Verwendung von Ab2 sowohl als Fang- als auch Detektionsantikörper gemessen. Die Antikörperantwort gegen Ab2 erreichte wesentliche Spiegel nach der 5. Immunisierung.
Anschließend wurde ein Test durchgeführt, in welchem Platten mit der HMFG-Zubereitung überzogen waren. Seren wurden in der Vertiefung inkubiert und gebundener Antikörper wurde mit enzymgekoppeltem Anti-Immunglobulin detektiert. Dieser Test erfordert es, dass der Antikörper an das ursprüngliche tumorassoziierte Antigen bindet, und weist nach, dass wenigstens ein Teil des durch Immunisierung mit dem Anti-Idiotypen induzierten Ab3 Tumorantigen-spezifisch ist. Der Spiegel an HMFG-spezifischem Ab3 wurde durch Reihenverdünnung titriert und definierte die „Qualität" des immunisierenden Ab2.
Der monoklonale Antikörper 11D10 stellte sich als die höchste Qualität unter den getesteten Kandidaten aufweisend heraus.
Bestätigung, dass der durch 11D10 ausgelöste Ab3 die gewünschte Spezifität hat
Da das therapeutische Ziel von 11D10 in seiner Fähigkeit liegt, eine Antwort, die gegen das tumorassoziierte Antigen reaktiv ist, auszulösen, wurde die Spezifität des gewonnenen Ab3 in einer Anzahl von nachfolgenden Experimenten bestätigt.
Ab3 enthaltende Seren (abgereichert für anti-isotypische und anti-allotypische Aktivität) inhibierten annähernd vollständig die Bindung von markiertem BrE-1 an 11D10 oder umgekehrt. Dies zeigt, dass die Ab3-Antikörper Idiotope mit Ab1 teilen. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, unabhängig davon, ob die Ab3-produzierenden Tiere mit 11D10 immunisiert worden waren, der an KLH konjugiert war, oder mit 11D10, der in Freunds Adjuvanz emulgiert war.
Milzzellen aus mit 11D10 immunisierten Mäusen wurden verwendet, um monoklonale Ab3-produzierende Zelllinien zu erzeugen. Kompetitionsexperimente, ähnlich wie jene in dem vorangegangenen Absatz beschriebenen, zeigten, dass der monoklonale Ab3 an HMFG in einer identischen Weise wie BrE-1 band.
Bindungsexperimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob der durch 11D10 induzierte Ab3 zur Bindung an HMFG, wie es auf Tumorzelllinien exprimiert ist, fähig ist. 8 zeigt Ergebnisse der direkten Bindung von verschiedenen Ab3-Zubereitungen an die Brustcarcinomzelllinie SKBR3. Polyklonaler Maus-Ab3, polyklonaler Kaninchen-Ab3 und monoklonaler Maus-Ab3 wurden zubereitet durch Adsorbieren mit Mausimmunglobulin und getestet für die Bindung bei etlichen Verdünnungen. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Ab3-Seren aus mit 11D10 immunisierten Tieren banden an die HMFG-positiven Zelllinien MCF-7 und SKBr3, aber nicht an die Antigen-negative Melanomzelllinie M21/P6.
Verschiedene Kompetitionsexperimente wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass der durch 11D10 induzierte Ab3 die gewünschte Spezifität hatte. Konfluente Monoschichtkulturen von SKBR3-Zellen in Mikrotitervertiefungen wurden mit 50.000 cpm ¹²⁵I-BrE1 und zahlreichen Verdünnungen von Ab3 als Kompetitor zur Reaktion gebracht. Ein monoklonaler Antikörper mit nicht verwandter Spezifität, 1E3, wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. 20 μg eines monoklonalen Ab3 inhibierte die Bindung um 25 %. Maus- oder Kaninchenseren, enthaltend polyklonale Ab3-Seren, verdünnt in einer 1:50-Verdünnung, erzeugten 38 % bzw. 30 % Inhibition. Dies zeigte, dass der Ab3 an dasselbe HMFG-Epitop wie Ab1 bindet. Unvollständige Inhibition unter diesen Bedingungen legt nahe, dass etliche Ab3 eine niedrigere Affinität oder Avidität für HMFG haben könnten als Ab1.
Milzzellen aus mit 11D10 immunisierten Mäusen wurden auch in einem T-Zell-Proliferationstest verwendet. Die Milzzellen wurden für fünf Tage in der Anwesenheit von teilweise gereinigtem HMFG kultiviert und wurden dann mit [³H]Thymidin gepulst. Eine höhere Aufnahme in Zellen aus mit 11D10 immunisierten Tieren als von Kontrollen steht in Übereinstimmung mit der Anwesenheit einer Id-spezifischen zellulären Immunantwort. Mit 11D10-Alugel immunisierte Kaninchen zeigten gewisse DTH-Hautreaktionen gegen eine teilgereinigte Zubereitung von HMFG, nicht aber gegen reinen CEA (eine negative Spezifitätskontrolle). Da HMFG etliche Epitope umfasst und nicht in gereinigter Form erhältlich ist, können wir über die Spezifität der Reaktion nicht sicher sein.
Dot-Blot-Analyse von mAb1 und mAb3
HMFG-Antigen in verschiedenen Verdünnungen wurde auf Nitrocellulosefilter transgeblottet und mit BrE-1 (Ab1) und mAb3 zur Reaktion gebracht (10). Die Spuren 1-3 wurden mit HMFG transgeblottet und mit BrE-1, 10 μg/ml, der Kontrolle 1E3-IgG1, 50 μg/ml, und dem mAb3-IgG1, 50 μg/ml, inkubiert. Die Reaktion wurde entwickelt durch die Verwendung von Ziegen-anti-Maus-IgG, alkalische Phosphatasereagenzien und Substrat. Die Färbung war identisch, aber intensiver mit Ab1, während der Kontrollantikörper negativ war.
Übereinstimmungsexperiment für kreuzreagierenden Idiotyp in Brustkrebspatienten
Wir untersuchten Serien aus 50 zufällig ausgewählten Brustkrebspatienten, um zu bestimmen, ob irgendeiner von diesen einen bereits existierenden übereinstimmenden Idiotypen hat, welcher durch Ab2 11D10 erkannt werden würde. Mikrotiterplatten wurden mit 250 ng/Vertiefung gereinigtem F(ab')₂-Fragment von 11D10 (Ab2) überzogen und mit 1:100-Verdünnung von Patientenseren inkubiert und mit Enzym-markierten Ziegen-anti-Mensch-IgG-Antikörpern entwickelt. Die Bindung der Seren an Ab2 wurde detektiert unter Verwendung von an alkalische Phosphatase konkugiertem Anti-Mensch-IgG-Antikörper (γ-kettenspezifisch) und Substrat.
Wie in 11 gezeigt, hatte eine geringe Anzahl (8150) der Seren dieser Brustkrebspatienten erhöhte Spiegel an mit 11D10 reaktiven Antikörpern. Die selektiven Kriterien bei der Anti-Id-Therapie sind basiert auf der Annahme, dass die Erkrankung selber einen Zustand des Vorbereitens von B-Zellen und T-Zellen in den Wirt induziert. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass in Patienten, die einen entsprechend übereinstimmenden Id exprimieren, Ab2-Simulation dann in der Lage wäre, effektiv solche bereits vorbereiteten B- und T-Zellen zu stimulieren. Die Feststellung von Id-übereinstimmenden Seren aus Brustkrebspatienten legt nahe, dass sie besonders geeignet sein könnten als mögliche Kandidaten für die aktive Anti-Id-Immuntherapie mit dem Ab2 11D10.
Clearance-Studie von ¹¹¹In-BrE-1 in MX-1-tumortragenden BALB/c Nacktmäusen
Um zu bestimmen, ob 11D10 als ein zweites Reagenz geeignet wäre, um im Überschuss vorhandenen, radioaktiv markierten Antikörper bei der Radioimmuntherapie zu binden, führten wir eine Clearance-Studie durch. Jeder BALB/c-Nacktmaus wurden 20 μCi 2,9 μg ¹¹¹In-BrE-1 injiziert. Nach 24 Stunden wurden 20 μg Anti-Id 11D10 einer Gruppe aus sechs Mäusen bestehenden Gruppe, die nach 30 Minuten zu schlachten waren, und einer anderen nach 40 Stunden zu schlachtenden Gruppe injiziert. Die Kontrollgruppen aus Mäusen nach 30 Minuten und 40 Stunden wurden nicht mit Anti-Id 11D10 injiziert. Nach dem Schlachten der Mäuse wurden Blut und Organe für das Messen von Radioaktivitätsspiegeln entfernt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt und werden als prozentuale Dosis pro g ¹¹¹In-BrE-1 ± SEM ausgedrückt. Werte sind ausgedrückt als Mittelwert % SEM. Sowohl nach 30 Minuten als auch nach 40 Stunden gab es eine signifikante Clearance von Radioaktivität in annähernd sämtlichen Organen (besonders in Blut, Niere, Muskel und Lunge), mit der Ausnahme der Leber in den experimentellen Gruppen im Vergleich mit den Kontrollen. Die Tumorretention wurde nicht beeinträchtigt nach 30 Minuten; nach 40 Stunden gab es jedoch eine gewisse Clearance in der behandelten Gruppe.
Tabelle 3 Prozentuale Dosis pro Gramm ¹¹¹In BrE-1 in BALB/c Nacktmäusen mit MX-1-Tumor
Beispiel 2: Klonieren und Sequenzieren von 11D10-cDNS
Solange nicht anderweitig spezifiziert, waren sämtliche Kloniertechniken im Wesentlichen wie beschrieben von Sambrook et al. (1989) und sämtliche Reagenzien wurden verwendet nach den Anweisungen des Herstellers.
Die Polynukleotidsequenz wurde für den 11D10-Antikörper durch Isolieren von Boten-RNS aus der 11D10-produzierenden Zelllinie gewonnen. Für jede Sequenzbestimmung wurde Gesamt -RNS aus 1 x 107 11D10-Hybridomzellen isoliert. Boten-RNS wurde zubereitet durch Führen durch zwei Chromatographiezyklen aus Oligothymidylat-Cellulose-Säulen. Die Ausbeute an mRNS betrug ungefähr 100 μg. cDNS des ersten Stranges wurde synthetisiert unter Verwendung des Superscript Preamplification Kits (GIBCO/BRL).
Um die variable Region der schweren Kette zu sequenzieren, wurden PCRs an der cDNS unter Verwendung eines Rückwärts-(3'-)Primers, entsprechend den Aminosäuren 126 bis 119 der konstanten Maus-γ1-Region durchgeführt:
5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG -3' (Sequenz ID Nr. 36)
und unter Verwendung von verschiedenen Mischungen aus Vorwärtsprimern, entsprechend den N-terminalen Leitsequenzen aus Untergruppen der variablen Region der Maus. Der (5'-) Vorwärtsprimer, der eine positive Reaktion ergab, war:
5'-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYXTYCTCTT-3' (Sequenz ID Nr. 37)
entsprechend den Aminosäuren –20 bis –13 (I = Inosin, R = A oder G, Y = C oder T, K = G oder T, S = C oder G, W = A oder T).
Das amplifizierte cDNS-Fragment wurde im pT7-Plasmid subkloniert und NovaBluekompetente Zellen wurden unter Verwendung eines von dem Lieferanten (Novagen) bereitgestellten Protokols transformiert. Rekombinante Kolonien wurden durch Farbselektion aufgepickt und Plasmid-DNS wurde zubereitet durch Miniprep-Vorgehen. Die DNS-Sequenz des doppelsträngigen Plasmids wurde bestimmt unter Verwendung eines Sequenase Version 2,0 Kits (USB, Cleveland, Ohio). Die Sequenz des DNS-Inserts in dem Plasmid wurde aus beiden Orientierungen unter Verwendung von für das Plasmid spezifischen Primern bestimmt; nämlich T7-Promoterprimer (TAATACGACTCACTATAGGG – Sequenz ID Nr. 38) und U-19-Primer (GTTTTCCCAGTCACGACGT – Sequenz ID Nr. 39). Wenigstens 8 Klone wurden für Sequenzbestimmung gepickt.
Die Sequenz der variablen Region der leichten Kette von 11D10 wurde in einer ähnlichen Weise bestimmt. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die ein positives Ergebnis in der PCR ergaben, waren:
5'-ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3' (Sequenz ID Nr. 40)
5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3' (Sequenz ID Nr. 41)
entsprechend den Aminosäuren –20 bis –10 der Leitsequenz bzw. 122 bis 116 der konstanten Region der Maus-κ-Kette.
Um die Fehlerraten bei der PCR-Amplifikation zu minimieren, wurde pfu-DNS-Polymerase (Stratagene, San Diego) für die Amplifikation in sämtlichen nachfolgenden Experimenten verwendet. Die Mutationshäufigkeit mit dieser thermostabilen DNS-Polymerase ist 1/10 im Vergleich mit Taq-DNS-Polymerase.
Die Bestätigung, dass die isolierte cDNS den schweren und leichten Ketten von 11D10 entsprach, wurde durch Aminosäuresequenzieren des N-Terminus des isolierten Antikörpers erhalten. 50 μg gereinigter 11D10-Antikörper wird verdünnt mit Probenbeladungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1 % SDS, 1 % Glycerol, 0,1 % β-Mercaptoethanol) und auf 100 °C für 3 Minuten erhitzt. Das denaturierte Protein wurde auf ein 7,5 % Polyacrylamidgel (BioRad Miniprotean II Dual Slab Cell), enthaltend SDS, geladen und Elektrophorese bei 200 V für eine Stunde ausgesetzt. Proteine in den Genen wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF-) Membranen durch das von Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4350-4354) beschriebene Vorgehen bei 150 mA über Nacht transferiert. Der Transferpuffer enthält 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % (v/v) Methanol. Die Membranen wurden durch schnelles Eintauchen in 0,1 % Coomasie Brilliantblau in 50 % Methanol – 50 % Essigsäure, gefolgt von Waschen in einer Lösung, enthaltend 40 % Methanol plus 10 % Essigsäure, gefärbt. Nach Trocknen der Membran bei Raumtemperatur wurden die gefärbten Banden der schweren und leichten Ketten mit einer sauberen Rasierklinge ausgeschnitten. Die Proteine auf den Membranschnitten wurden N-terminalem Mikrosequenzieren durch automatisierten Edman-Abbau unter Verwendung eines Proteinsequenziergerätes von Applied Biosystems, Modell 477A, unter Ausnutzung von gepulster Flüssigchemie und von on-line durchgeführter Phenyl-Ethiohydantoin-Aminosäureidentifikation ausgesetzt. Jedes Protein wurde 10-15 abbauenden Zyklen ausgesetzt und die umgewandelten Spaltprodukte aus jedem Zyklus wurden durch Umkehrphasen-HPLC analysiert.
Die Nukleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des monoklonalen Antikörpers 11D10 sind in den 1 bzw. 2 gezeigt.
Die Nukleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des monoklonalen Antikörpers 11D10 sind in den 1 bzw. 2 gezeigt.
Aus 1 wird klar, dass die dritte Aminosäure der Leitsequenz (Aminosäure -18) und die 25. Aminosäure des Gerüstes 3 (Aminosäure 81) fehlerhaft sind. Wie es für einen Fachmann leicht ersichtlich ist, ist die durch das Nukleotidtriplett „GCC" kodierte Aminosäure A oder Alanin (für Aminosäure -18), und die durch das Nukleotidtriplett „GAA" kodierte Aminosäure ist E oder Glutaminsäure (Aminosäure 81). Ähnlich ist in 3A die Aminosäure 81 (innerhalb des Gerüstes 3) E oder Glutaminsäure. Sequenz ID Nr. 58 bildet die fehlerhafte Aminosäuretranslation ab, wie gezeigt durch die Schreibfehler auf dem getippten Blatt mit der Anzeige „1", das mit dieser Offenbarung übergeben worden ist. Sequenz ID Nr. 2 bildet die richtige Aminosäuretranslation ab.
Die Nukleinsäuresequenz wurde wie zuvor in diesem Beispiel durch PCR-Amplifikation von Boten-RNS aus der antikörperproduzierenden Zelllinie gewonnen. Die Aminosäuresequenz wurde anschließend durch Translation der Polynukleotidsequenz unter Verwendung des genetischen Codes gewonnen. Die richtigen Aminosäuren sind aufgrund des genetischen Codes selbstverständlich. Die korrekte Aminosäuresequenz ist auch der antikörperproduzierenden Zelllinie, zur Stützung dieser Offenbarung hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer HB-12020, innewohnend.
Die Polynukleotid- und Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Kette wurden unter Verwendung des BLAST-Algorithmus am National Center for Biotechnology Information verglichen mit Sequenzen, die erhältlich sind von den Datenbanken PDB, SwissProt, PIR, SPUpdate, GenPept und GPUpdate. Der Vergleich wurde am 19. Januar 1996 durchgeführt.
Von den 10 Datenbank-DNS-Sequenzen, die am besten zu jener der variablen Region der leichten Kette von 11D10 passten, war keine identisch. Es gab ungefähr 8-27 Unterschiede mit der 11D10-DNS-Sequenz, entsprechend ungefähr 6-17 Aminosäuredifferenzen. Die sechste übereinstimmende Sequenz (Bezeichnung > gb/M59920/MUSIQKAA3) war eine kappa-VJ-keimähnliche Sequenz der Maus und stellt möglicherweise das Prototypengen dar, aus welchem die leichte Kette von 11D10 abgeleitet worden ist. Die 11D10-DNS-Sequenz unterscheidet sich von der Keimbahnsequenz an 14 Positionen, entsprechend ungefähr 7 Aminosäurepunktunterschieden.
Von den 10 Datenbank-DNS-Sequenzen, die am besten zu jener der variablen Region der schweren Kette von 11D10 passten, war keine identisch. 9 der 10 Sequenzen waren 3-12 Basenpaare länger aufgrund von Spliceunterschieden innerhalb der VDJ-Verknüpfung. Zusätzlich gab es ungefähr 15-43 Punktunterschiede im Vergleich mit der 11D10-DNS-Sequenz außerhalb der Verknüpfung, entsprechend ungefähr 11-23 Aminosäureunterschieden.
Folglich gab es wenigstens ungefähr 18 Aminosäureunterschiede zwischen den Aminosäuresequenzen, die durch die 11D10-DNS kodiert werden, und j enen, die durch die am besten übereinstimmenden Datenbank-DNS kodiert werden. Die Punktunterschiede entstanden wahrscheinlich durch somatische Mutation von Keimbahnsequenzen während der Entwicklung der antikörperproduzierenden Zelle in dem Tier, das verwendet worden ist, um ihn zu erzeugen.
4 zeigt die zehn am besten passenden Polynukleotidsequenzen mit der kodierenden Sequenz der variablen Region der leichten Kette von 11D10. 5 zeigt die zehn am besten übereinstimmenden Polynukleotidsequenzen für die kodierende Sequenz der variablen Region der schweren Kette von 11D10.
Die Aminosäuresequenzen der variablen Region der leichten und schweren Kette wurden mit anderen bekannten Sequenzen unter Verwendung des BLAST-Algorithmus am National Center for Biotechnology Information mit Sequenzen verglichen, die erhältlich sind aus den Datenbanken PDB, SwissProt, PIR, SPUpdate, GenPept und GPUpdate. Der Vergleich wurde am 19. Januar 1996 durchgeführt.
Die bei der BLAST-Recherche gefundenen 15 nahekommendsten Aminosäuresequenzen haben die in Tabelle 6 gezeigten Identifikationen.
26(A) und (B) sind eine vergleichende Abbildung der Aminosäuresequenzen der leichten und schweren Kette von 11D10 mit den bei der BLAST-Recherche gefundenen 15 nächstkommenden Sequenzen. (A) zeigt den Vergleich der leichten Kette. (B) zeigt den Vergleich der schweren Kette. Reste, die mit den 11D10-Sequenzen identisch sind, werden durch einen Punkt (.) angegeben. Lücken, die eingeführt worden sind, um die Anordnung über der VDJ-Verknüpfung der schweren Kette zu verbessern, sind mit einer doppelten Linie (_) angegeben.
Unter den 50 Datenbankaminosäuresequenzen, die am besten mit jener der variablen Region der leichten Kette von 11D10 übereinstimmten, war keine identisch. 11D10 unterschied sich von den 15 nächstkommenden Sequenzen durch mindestens 7 und durchschnittlich ungefähr 12 Substitutionsunterschiede. Ein Cluster aus Unterschieden geschah in der Nähe des Endes von CDR1. Ander Unterschiede geschahen in CDR3 und dem Gerüst.
Unter den 50 Datenbankaminosäuresequenzen, die am besten mit jener der variablen Region der schweren Kette von 11D10 übereinstimmten, war keine identisch. Das Folgende fasst die Hauptpunkte, abgeleitet von dem Vergleich, zusammen.
Die nächstkommendste Übereinstimmung geschah mit der variablen Region einer schweren Kette, die durch ihre Genbank-Bezeichnung als ein anderer Anti-Idiotyp seiend angegeben war (Bezeichnung gp|X64805|MMAIDHCH_1). Es gab 11 Substitutionen zwischen den Resten 1 und 98 (vor der VDJ-Verknüpfung), 7 Substitutionsunterschiede nach Rest 98.
11D10 unterschied sich in der Länge von 40 der Sequenzen schweren Ketten. Die anderen Sequenzen waren um bis zu 5 Reste länger oder kürzer und bis zu 2 Reste um die VDJ-Verknüpfung herum.
Mit der Ausnahme für die beiden nächstkommendsten übereinstimmenden Sequenzen, gab es wenigstens 18 und durchschnittlich ungefähr 22 Substitutionsunterschiede zwischen den Resten 1 und 98.
Eine Reihe von D- und J-Regiongenen scheint bei dem Prototypen-V-Gen verwendet zu werden. Nur eine der 50 Sequenzen schien dieselbe D-Region zu verwenden. Es gab einen Punktunterschied innerhalb der D-Region und einen Splicingunterschied von 3 Resten.
Bei den am nächstkommendsten übereinstimmenden 50 Sequenzen gab es insgesamt 18 Insertionen, Deletionen und Substitutionsunterschiede. Die anderen 49 Sequenzen hatten insgesamt wenigstens 25 und durchschnittlich ungefähr 30 Insertionen, Deletionen und Substitutionsunterschiede.
Unterschiede erschienen durch die variable Region hindurch.
26(C) zeigt Aminosäurekonsensussequenzen für die variablen Regionen der leichten und schweren Kette der 15 am besten übereinstimmenden Sequenzen (Sequenz ID Nr. 47 und Sequenz ID Nr. 48). Diese stellen Prototypen für das zusammengebaute VJ-Gen der leichten Kette und VDJ-Gen der schweren Kette dar. Reste in der 11D10-Sequenz, die identisch sind mit der Konsensussequenz, sind angegeben durch Punkte (.). CDRs werden angegeben durch Sternchen (*). Ebenfalls gezeigt sind Fragmente aus dem menschlichen Milchfettglobulin (HMFG) in Orientierung N→C (oberer Pfeil) oder C→N (unterer Pfeil).
Die folgenden Punkte können abgeleitet werden:

• 11D10 hat wenigstens 18 Abweichungen von der Konsensussequenz. 7 von diesen geschehen in der leichten Kette und 11 geschehen in der schweren Kette.
• Die Punktunterschiede geschehen durch die Sequenzen der variablen Region der leichten und schweren Kette von 11D10 hindurch. 8 geschehen innerhalb von CDR und 10 geschehen außerhalb von CDR.
• Die Anordnung der 11D10-Sequenzen mit HMFG-Fragmenten scheint nicht von den Punktmutationen abzuhängen.

Sequenzen von Fragmenten der variablen Region, besonders jene, die die VDJ-Verknüpfung der schweren Kette umfassen, oder jeder der Punktunterschiede, gezeigt in 26(C), sind bei der Entwicklung von Polypeptiden dieser Erfindung mit der immunologischen Aktivität von 11D10 von Interesse. Kodierende Sequenzen um die VDJ-Verknüpfung herum oder jeder der Punktunterschiede sind von Interesse bei der Entwicklung von Polynukleotiden dieser Erfindung.
Beispiel 3: Induktion einer brustkrebsspezifischem Ansprechen durch 11D10 in Affen
Zelllinien
Die menschliche Brustcarcinomzelllinie MCF-7, welche HMFG-Antigen exprimiert, wurde in RPM1-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FCS, 1 % L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin, wachsen gelassen und wurde für die Detektion von Antitumorantworten verwendet. Die menschliche Melanomzelllinie M21/P6 (freundlicherweise bereitgestellt durch Dr. Ralph Reisfeid, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) und die T-Zelllinie MOLT-4, welche beide HMFG-negativ sind, wurden in demselben Medium wachsen gelassen und wurden als Negativkontrollen verwendet.
Antikörper
Der Ab1-mAb-MC-10 (IgG2b, κ), der ein gesondertes und spezifisches Epitop auf dem HMFG-Molekül mit MW400.000 erkennt, wurde verwendet, um syngenische BALB/c-Mäuse für die Produktion von Anti-Id-mAb 11D10 (IgG1-κ) zu immunisieren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Der mAb2 3H1 (IgG1-κ) ist ein Maus-anti-Id-mAb, der verwandt ist mit dem menschlichen CEA (Bhattacharya- Chatterjee et al. (1990) J. Immunol. 145: Z758-2765), und ist als eine Kontrolle verwendet worden.
Adjuvanz
Um die Immunogenität des anti-Id-Vaccins zu erhöhen, ist ein Adjuvanz erforderlich. Aluminiumhydroxid ist zugelassen durch die United States Food and Drug Administration für die Verwendung als ein Adjuvanz in Menschen. Wir immunisierten deshalb Affen in dieser präklinischen Studie mit Ab2 11D10, gefällt mit Aluminiumhydroxid, wie unten beschrieben.
Antikörperzubereitung
11D10 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen. Der mAb2 3H1 (ein IgG1-κ) ist ein Maus-anti-Id-mAb, der verwandt ist mit dem menschlichen CEA (Bhattacharya – Chatterjee et al. (1990) J. Immunol. 145: Z758-2765), und wurde als Kontrolle verwendet.
Aluminiumhydroxidfällung
Ein Adjuvanz wurde verwendet, um die Immunogenität des anti-Id-Vaccins zu erhöhen. Aluminiumhydroxid ist zugelassen von der United States Food and Drug Administration für die Verwendung als ein Adjuvanz in Menschen. Wir immunisierten deshalb Affen in dieser präklinischen Studie mit Ab2 11D10. Kurz, zu 5 mg Aliquoten aus gereinigten mAb anti-Id (Ab2) wurde 1 ml 2 % Alu-Gel S (Serva Fine Biochem, Inc., Garden City, Long Island, NY) hinzugefügt. Das Volumen wurde dann auf 10 ml mit Dulbecco's-PBS aufgefüllt und die Mischung wurde auf einem Wirbelmischer für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde dann bei 2000 rpm bei 24 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Die Menge an in der Gelschicht gebundenem mAb wurde durch spektrophotometrisches Messen der Menge an ungebundenem Antikörper in dem Überstand bestimmt. Der Alu-Gel-gefällte Antikörper wurde bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert. Dieses Vorgehen wurde aseptisch durchgeführt in einer Laminarströmungshaube und das Endprodukt wurde steril und deutlich markiert als anti-Id 11D10-Alu-Gel und wurde in pyrogenfreie sterile Glasgefäße aliquotiert.
Immunisierung von Affen
Cynomolgus-Affen wurden mit 11D10 oder mit der 3H1-Kontrolle immunisiert. Affen wurden gehalten an den White Sands Research Institutes (Alamogordo, NM). Ein Paar männliche und weibliche Affen, Gewicht 3-4 kg, wurde mit entweder 2 mg 11D10 oder 3H1 intrakutan an vier unterschiedlichen Stellen an den Tagen 0, 14, 28 bzw. 42 immunisiert. Nur zwei Affen wurden aus finanziellen Gründen für jeden anti-Id (Ab2) bei einzelnen Dosen verwendet. Die 2 mg-Dosis wurde ausgewählt, basierend auf vorangegangenen präklinischen und klinischen Studien mit verschiedenen anti-Id-Vaccinen. Blutproben wurden vor der Immunisierung und 10 Tage nach jeder Immunisierung gesammelt.
Toxizität
Die Induktion von Ab3-Reaktionen in Affen verursachte keine ersichtlichen Nebenwirkungen bei Tieren. Nur leichtes lokales Anschwellen und Irritation wurden an der Injektionsstelle als ein Ergebnis von mehreren Immunisierungen beobachtet. Die Affen wurden routinemäßig durch ärztliche Untersuchungen und Gewichtsmessungen überprüft. Sie zeigten keinerlei Anzeichen von Anomalien.
Entwicklung von humoraler Immunität, induziert durch Immunisierung mit aluminiumhydroxidgefälltem Ab2
Spezifische Ab3 Antwort auf Ab2. Seren aus immunisierten Affen wurden für die Anwesenheit von anti-Id-Antikörpern getestet. Seren wurden mit normalem Mausimmunglobulin vorinkubiert, um Affenantikörper gegen isotypische und allotypische Determinanten zu blockieren, und wurden dann auf die Anwesenheit von anti-anti-Id (Ab3) durch Reaktion mit dem immunisierenden anti-Id (11D10), überzogen auf Mikrotiterplatten, durch RIA überprüft. Nicht verwandter Ab2 wurde als die Kontrolle verwendet. Nach dem Waschen wurde die Antigen-Antikörper-Reaktion durch die Verwendung von ¹²⁵I-markiertem anti-Id-Reagenz in einem homogenen Sandwich-RIA markiert. Seren vor der Immunisierung und Seren aus Affen, die mit dem Kontroll-Ab2 3H1 immunisiert worden sind, wurden auch bei diesen Tests verwendet. Zusätzlich wurde ¹²⁵I-markierter monoklonaler Ab2 3H1 als Kontrolle verwendet.
Idiorypenanalyse von Ab3. Falls eine positive Reaktion bei dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wird, wurden Ab3-Seren aus jenen Affen hinsichtlich ihrer Fähigkeit überprüft, die Bindung von ¹²⁵I-markiertem 11D10 an BrE-1 (Ab1), gebunden an Mikrotiterplatten, zu inhibieren oder umgekehrt (Inhibition der Bindung von radioaktiv markiertem BrE-1 an 11D10 auf der Platte). Ein nicht verwandtes Ab1-Ab2-System wurde als eine Kontrolle verwendet (Bhattacharya- Chatterjee et al. (1987) J. Immunol. 139: 1354-13605). Dies zeigte, ob Ab3 in Affenseren Idiotope mit BrE-1 (Ab1) teilen. Diese Inhibitionstests der Ab1-Ab2-Bindung durch Ab3-Seren zeigt auch, ob Ab3 ein echter Antianti-Id ist.
Bindung von Ab3 an Tumorantigen. Um humorale Immunantworten, gerichtet gegen negative Zielantigene, zu bewerten, wurden Affen-Ab3-Seren auf Reaktivität mit Zelllinien in einem RIA getestet, von denen bekannt ist, dass sie HMFG exprimieren. Zusätzlich wurden die Seren für Reaktivität gegen eine solubilisierte teilgereinigte Zubereitung von HMFG-Antigen, überzogen auf Mikrotiterplatten, überprüft. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wurde detektiert durch die Verwendung von ¹²⁵I-markierten anti-menschlichen Immunglobulinreagenzien oder mit phosphatasemarkiertem anti-menschlichem Immunglobulinin-ELISA. Seren vor der Immunisierung wurden als eine Kontrolle verwendet. Der nicht verwandte CEA wurde ebenfalls als eine Kontrolle bei diesem Test verwendet. Der Isotyp von Affen-Ab3-Seren-Bindung an HMFG-Antigen wurde bestimmt durch ELISA unter Verwendung von anti-menschlichen isotypspezifischen Reagenzien.
Die Bindung von Ab3 an Tumorzelllinien wurde auch überprüft durch Immundurchflusscytometrie. Antigenpositive MCF-7-Zellen (1 × 10⁶ pro Vertiefung) wurden mit Ab1 (MC-10) und Ab3 mit 100 μl bei 4 °C für 60 Minuten zur Reaktion gebracht. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit entweder Ziegen-anti-Maus- oder Ziegen-anti-Mensch-F(ab')2-IgG-FITC-markiertem Antikörper (Tago, Burlingame, CA) für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Sie wurden dann zweimal gewaschen, in 2 % Paraformaldehyd fixiert und durch Immundurchflusscytometrie (FACStar, Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Antigennegative MOLT-4-Zellen wurden als eine Kontrolle bei diesem Test verwendet.
Aufreinigung von Anti-anti-Id-Antikörper (Ab3) aus hyperimmunisierten Affenseren. 20 ml Hyperimmunserum wurde über eine Immunadsorptionssäule, bestehend aus immunisierendem anti-Id-Immunglobulin (11D10-IgG1), gekoppelt an Sepharose 4B, geführt. Anti-anti-Id-Antikörper (Ab3) wurden mit 0,1 M Glycin-Salzsäurepuffer (pH 2,4) eluiert und auf pH 7,0 mit 3 M Tris neutralisiert. Der eluierte Antikörper wurde dann über eine Immunadsorptionssäule, bestehend aus einem nicht verwandten anti-Id-mAb mit angepasstem Isotyp-Allotyp, gekoppelt an Sepharose 4B geführt, um anti-isotypische- und antiallotypische Reaktivitäten zu entfernen. Antikörper, der hindurchgeführt worden war, wurde konzentriert und als gereinigter Ab3 verwendet. Der Isotyp des Ab3 wurde durch ELISA bestimmt, unter Verwendung von menschlichen anti-Isotyp-spezifischen Reagenzien (Tago).
Epitopanalyse von Ab3. Um zu zeigen, dass in Affen erzeugte Ab3s und Ab1 (BrE-1) an dieselbe Antigendeterminante binden, wurde die Inhibition der BrE-1-Bindung an die antigenpositive Tumorzelllinie MCF-7 oder an HMFG-Antigen durch gereinigten Ab3 durch RIA überprüft, wie beschrieben (Bhattacharya- Chatterjee et al. (1990)).
Slot-Blot-Analyse von gereinigtem Ab3 mit HMFG. Polyvinylidendifluoridmembran wurde in Methanol für 5 Minuten aktiviert und transferiert in 0,02 M PBS, pH 7,0. Unterschiedliche Proteinkonzentrationen (5 μg, 2 μg, 1 μg) wurden auf die Membran unter Verwendung des Hybrislot-Gerätes (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) adsorbiert. Die Membran wurde dann mit 2 % BSA in PBS für 2 Stunden unter Schütteln geblockt, gefolgt von Inkubation mit 5 ml einer Lösung aus 20 μg/ml Ab 1 oder Ab3 für 3 Stunden unter Schütteln. Die Membranen wurden dann 5-mal mit 1 % BSA in PBS gewaschen und mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-anti-Mensch-Immunglobulin oder Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin (1:1000-Verdünnung) für 90 Minuten inkubiert, gewaschen und entwickelt mit Substrat, das in dem Bio-Rad-Kit geliefert worden ist.
Test für Id-spezifisches proliferatives Ansprechen
Periphere mononukleäre Blutzellen wurden durch StandardFicoll-Hypague-Dichtegradientenzentrifugationsverfahren isoliert und 5 × 10³ Zellen/Vertiefung wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an 11D10 und der Kontrolle 3H1 (10 ng bis 2 μg) in RPMI-1640-Medium mit 5 % hitzeinaktiviertem FCS, Penicillin und Streptomycin inkubiert. Das unspezifische Mitogen Phytohämagglutinin-P wurde als eine Positivkontrolle mit 2 und 1 μg/Vertiefung verwendet. Nachdem die Zellen für 5 Tage bei 37 °C in einer 5 % Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre inkubiert worden sind, wurden sie mit [³H]Thymidin (1 μCi/Vertiefung) für 20 Stunden gepulst. Daten sind als mittlere Zählwerte (dreifache Vertiefungen)/min des [³H]Thymidineinbaus ausgedrückt. Die SD der Daten betrug < 10 % für jede Bestimmung.
Ergebnisse
Induktion von Anti-anti-Id-(Ab3) Antworten in Affen. Die Seren aus Affen wurden 10 Tage nach der vierten Immunisierung gewonnen und wurden auf Ab3-Antworten des Sandwich-RIA und Inhibition der Ab2-Bindung an Ab1 analysiert (Tabelle 4). Für diese Tests wurden die Seren mit normalem Mausimmunglobulin (500 μg/ml) vorbehandelt, um anti-isotypische und antiallotypische Reaktivität zu hemmen. Bei dem Sandwich-RIA wurden Ab3-Seren, gewonnen nach der vierten Immunisierung, mit PBS, enthaltend normales Mausimmunglobulin (500 mg/ml), verdünnt. Die Seren wurden mit normalem Maus-IgG vor dem Test vorinkubiert. Ab3 in einer 1:40-Verdünnung wurde mit anti-Id-mAb 11D10 oder 3H1, überzogen auf die Mikrotiterplatte, inkubiert und wurde dann mit ¹²⁵I-markiertem 11D10 oder 3H1 (~ 50.000 cpm) in einem Sandwichtest zur Reaktion gebracht. Die Ergebnisse sind als gebundene cpm in einem Sandwichtest ausgedrückt. Die Ergebnisse sind dargestellt als mittlere cpm (n = 3). Die SD der Daten war < 10 %. Wir testeten dann die Bindung von Affen-Ab3-Seren an teilgereinigte HMFG. Ab3-Seren aus Affen (PRO 723 und PRO 872), immunisiert mit 11D10, banden spezifisch an den immunisierenden Ab2 (11D10) mit minimaler Reaktivität mit nicht verwandtem Ab2 (3H1). Affen-Ab3 wurden ebenfalls durch die Bindung von radioaktiv markiertem Ab2 an Ab1 um 91 bzw. 95 % inhibiert, sogar in einer Verdünnung von 1:40 (Tabelle 4). Es gab keine Inhibition mit Seren vor der Immunisierung oder Seren, die aus Affen (PRO 541 und PRO 667) gewonnen worden waren, die mit dem nicht verwandten Ab2 3H1 immunisiert worden waren. Gereinigter 11D10 wurde verwendet, um die Platte zu überziehen (250 ng/Vertiefung) und die Bindung von radioaktiv markiertem BrE-1 (~ 50.000 cpm) an 11D10 wurde in Hinblick auf die Inhibition in der Anwesenheit von unterschiedlichen Verdünnungen von Ab3-Seren getestet. In einem parallelen Kontrollexperiment wurde ein nicht verwandtes Ab1-Ab3-System (mAb 5019-3H1) als die Kontrolle verwendet. Die Kinetiken der Ab3-Antwort sind in 12 gezeigt unter Verwendung von Seren aus dem Affen PRO 723, was die Inhibition der Bindung von radioaktiv markiertem Ab1 an Ab2 demonstriert. Eine ähnliche Reaktivität wurde gesehen mit Seren aus dem Affen PRO 872. Diese Ergebnisse zeigen, dass Affen-Ab3-Seren Idiotypen mit dem Ab1 teilen.
Tabelle 4: Analyse von Affen-anti-anti-ID-Seren, erzeugt mit anti-Id-mAb 11D10
Induktion der Antitumorzell Antikörperantwort. Um zu bestimmen, ob mit 11D10 immunisierte Affenseren spezifisch an HMFG-positive Brustkarzinomzellen gebunden hatten, wurde die Bindung von Affen-Ab3-Seren an die Brustkrebszelllinie MCF-7 durch ELISA getestet. Ab3-Seren bei unterschiedlichen Verdünnungen wurden zu konfluenten Monoschichten aus den in 96-Well-Mikrotiterplatten wachsen gelassenen Zellen hinzugefügt und entwickelt mit enzymmarkierten Ziegen-anti-Mensch-IgG- (H- und L-kettenspezifisch) Antikörpern. Die Extinktion (OD) wurde nach einer Stunde abgelesen. Der Affe PRO 872 wurde mit Ab2 11D10 immunisiert. Der Affe PRO 667 wurde mit unverwandtem Kontroll-Ab2 (3H1) immunisiert. Affenserum vor der Immunisierung wurde auch als Kontrolle verwendet. Die Bindung von Affen-Ab3-Seren (...) an die Melanomzelllinie M21/P6 durch ELISA wurde unter Befolgung desselben Protokolls getestet. Die Ergebnisse sind dargestellt als die mittlere Extinktion bei 405 nm (n = 3). Die SD der Daten war < 10 % für jeden Test. Wie in 13 gezeigt, reagierten Ab3-Seren, erhalten nach der vierten Immunisierung in verschiedenen Verdünnungen, mit MCF-7-Zellen, aber nicht mit der antigennegativen Melanomzelllinie M21/P6. Wir testeten dann die Bindung von Affen-Ab3-Seren an teilgereinigte HMFG. Die Platte wurde mit HMFG (2 mg/Vertiefung) überzogen und mit Ab3-Seren (1:100-Verdünnung) aus dem mit dem Ab2 11D10 immunisierten Affen (PRO 723) und aus dem mit nicht verwandtem Ab2 3H1 desselben Isotyps und Allotyps immunisierten Affen (PRO 667) zur Reaktion gebracht. Seren vor der Immunisierung und PBS-BSA wurden auch als Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 9 und sind als die mittlere Extinktion (OD) bei 405 nm präsentiert. In einem parallelen Kontrollexperiment wurden dieselben Seren auf einer mit gereinigtem CEA-überzogenen Platte überprüft. Es gab keine Reaktivität mit 11D10-immunisierten Affenseren; die erhaltene Extinktion war vergleichbar mit jener, die mit der FBS-BSA-Kontrolle gewonnen wurde. Die Ergebnisse werden als die mittlere Extinktion bei 405 nm (n = 3) präsentiert. Die SD der Daten war < 10 %. Die Unterschiede zwischen Experimentell- und Kontrollwerten waren statistisch signifikant. Die Ab3-Seren banden auch spezifisch an teilgereinigte HMFG, auf Mikrotiterplatten überzogen, durch ELISA (14). Kontrollseren aus Affen vor der Immunisierung oder mit nicht verwandtem Ab2 (3H1) immunisierten Affen zeigten keine nennenswerte Bindung an HMFG. In Parallelexperimenten wurden dieselben Ab3 aus dem Affen PRO 723 auf einer mit CEA überzogenen Platte verglichen und waren negativ.
Um die Reaktivität mit Zelloberflächen-HMFG zu bestimmen, wurden NCF-7-Zellen durch Immundurchflußcytometrie getestet. Wie in 10 gezeigt, zeigten die Ab3 aus Ab2-immunisierten Affen eine unterscheidbare Bindung (15-A), die ähnlich war zu dem mit Ab1 erhaltenen Bindungsmuster (nicht gezeigt). Signifikante Bindung wurde nicht mit MOLT-4-Zellen erhalten, die HMFG nicht exprimieren (15-B).
Die Ab3-Antikörper wurden dann von den Seren aufgereinigt, wie oben beschrieben. Die Reaktivität von gereinigtem Ab3 wurde durch ELISA überprüft. Die Platte wurde mit HMFG (2 mg/ml, 10 ng/Vertiefung) überzogen und wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde mit 1 % BSA geblockt und mit gereinigtem Ab3 (20 mg/ml) aus mit entweder 11D10 oder Kontroll-Ab2 (3H1) immunisierten Affen zur Reaktion gebracht. PBS-BSA wurde als Negativkontrolle verwendet. In der mit CEA überzogenen Platte wurde der mAb8019 (anti-CEA) als eine Positivkontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 16 und sind präsentiert als die mittlere Extinktion (OD) bei 405 nm (n = 3). Die SD der Daten war < 10 %. Affen-Ab3 reagierte spezifisch mit auf Mikrotiterplatten überzogenen HMFG, wohingegen keine Reaktion mit CEA-überzogenen Kontrollplatten erhalten wurde.
Die Spezifität von gereinigtem Ab3 vor HMFG wurde weiter bestätigt durch Slot-Blot-Analyse (17). In 6 wurden die Spuren 1 und 2 mit teilgereinigtem HMFG überzogen und die Spuren 3 und 4 waren mit gereinigtem CEA überzogen. Die Membranen wurden mit Ab1 (Spur 1), gereinigtem Ab3 (Spuren 2 und 3) und anti-CEA in mAb8019 (Spur 4) inkubiert. Die Reaktivität mit HMFG und nicht mit CEA wurde gezeigt.
Kompetition von Maus Ab1 und Affen Ab3 um die MCF-7-Zellbindung. Falls Ab3 eine ähnliche Bindungsstelle hat wie Ab1, sollte er mit Ab1 um die Bindung an HMFG auf MCF-7 konkurrieren. Konfluente Monoschichten aus MCF-7-Zellen in Mikrotiterplatten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an gereinigtem Ab3 und einer festen Menge an ¹²⁵Imarkiertem Ab 1 (~ 50.000 cpm) zur Reaktion gebracht. Die prozentuale Inhibition wurde berechnet und gegen den Inhibitor (mg Ab3) ausgewertet. Eine fixierte Menge an radioaktiv markiertem Ab1 wurde mit verschiedenen Mengen an gereinigtem Ab3 oder Kontroll-Ab3-Zubereitungen und MCF-7-Zellen co-inkubiert (18). 100 ng an gereinigtem Ab3 inhibierten die Bindung um 60 % und 1 mg gereinigter Ab3 ergaben über 80 % Inhibition, wohingegen der als eine Smg-Konzentration verwendete Kontroll-Ab3 überhaupt keine Inhibition erzeugte. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ab2-immunisierte Affenantikörper an dasselbe Antigen binden wie Ab1; deshalb enthält die Ab3-Zubereitung Antikörpermoleküle mit Ab1'-Eigenschaften.
Zelluläre Antworten auf anti-Id. Zelluläre Immunantworten wurden gemessen durch die Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen, inkubiert mit aluminiumhydroxidgefälltem anti-Id-Antikörper (11D10) und aluminiumhydroxidgefälltem anti-Id-Antikörper (3H1). Periphere Blutlymphozyten (PBL), erhalten aus immunisierten Affen, wurden auf ihr Ansprechvermögen auf die Stimulation mit 11D10-Alugel oder 3H1-Alugel in vitro untersucht. PBL wurden für 5 Tage mit 11D10-Alugel^TM (2 μg bis 100 ng) und 3H1-Alugel (2 μg bis 100 ng) kultiviert und die Proliferation wurde gemessen durch Einbau von ³H-Thymidin. Periphere mononukleäre Blutzellen, gewonnen von dem Affen PRO 723, wurden in vitro mit 11D10 (1 mg/ml) stimuliert; Kontrolle nicht verwandter Ab2 3H1 (1 mg/ml). Ähnlich wurden aus dem Affen PRO 872 gewonnene periphere mononukleäre Blutzellen in vitro mit 11D10 (1 mg/ml) stimuliert; nicht verwandter Ab2 3H1 (1 mg/ml). Stimulation wurde gemessen durch den Grad des Einbaus eines ³H-Thymidin-Pulses. Kulturmedium ohne jedes Antigen wurde auch als eine Kontrolle verwendet. Die peripheren mononukleären Postimmunisierungsblutzellen wurden 10 Tage nach der dritten Immunisierung gesammelt. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt und sind als mittlere cpm aus dreifach-bestimmten Vertiefungen exprimiert. Die SD der Daten war < 10 % für jede Bestimmung. Die Unterschiede zwischen Experimentell- und Kontrollwerten waren statistisch signifikant. Positive Proliferationsantworten wurden in beiden Affen, PRO 872 und PRO 723, gesehen, die annähernd vergleichbar waren mit der Antwort auf das Mitogen Phytohämagglutinin-P. Zellen vor der Immunisierung hatten keine proliferative Antwort auf den anti-Id-Antikörper, wohingegen Zellen nach der Immunisierung eine signifikante Antwort hatten. Es gab auch eine kleinere aber signifikante Antwort auf den isotypangepassten 3H1-anti-Id-Antikörper, die signifikant geringer war als jene der 11D10-Antwort; dies stellt wahrscheinlich eine Antwort auf die nicht-Id-Bestandteile des Immunglobulinmoleküls dar. Proliferative Antworten wurden als erstes nach der dritten Injektion festgestellt und eine ähnliche Reaktivität wurde nach der vierten Immunisierung erhalten. Aufgrund einer beschränkten Versorgung mit Blut konnten wir keine T-Zell-Proliferation in der Anwesenheit von teilgereinigtem HMFG-Antigen testen und folglich die Antigenspezifität der in den Lymphozyten induzierten zellulären Immunantworten ebenso wie die Phänotypen dieser Lymphozyten nachweisen.
Beispiel 4: Applikation von 11D10 an Menschen
Immunisierung mit Alaun gefälltem anti Id 11D10 bei entweder 1, 2, 4 oder 8 mg 11D10 pro Injektion
Patienten sind randomisiert, um eine der vier 11D10-Dosen mit intrakutanen Injektionen an den Tagen 0, 14, 28 und 42 zu erhalten. Jede Dosisgruppe schließt 3 bis 8 Patienten ein. Aluminiumhydroxidfällung wird nach dem Verfahren von Herlyn et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8055 durchgeführt. Kurz, das Vaccin besteht aus anti-Id 11D10 nach Aluminiumhydroxidfällung, enthaltend 0,2 % Alu-Gel S. Zu 5mg-Aliquoten aus gereinigtem monoklonalen anti-Id (Ab2) wird 1 ml 2 % Alu-Gel S (Serva Fine Biochem, Inc., Garden City, Long Island, NY) hinzugefügt. Das Volumen wird dann auf 10,0 ml mit D-PBS angepasst und die Mischung wird auf einem Wirbelmischer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wird dann bei 2000 rpm bei 24 C für 10 Minuten zentrifugiert. Die Menge an in der Gelschicht gebundenem Antikörper wird durch spektrophotometrisches Messen der Menge an ungebundenem Antikörper in dem Überstand bestimmt. Der Alu-Gel-gefällte Ab wird bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert. Die gesamte Operation wird unter einer Laminarströmungshaube aseptisch gemacht. Das Endprodukt ist steril und deutlich markiert als anti-Id-11D10-Alu-Gel und in pyrogenfreie, sterile Glasfläschchen portioniert. Die Aktivität des aluminiumhydroxidgefällten Idiotops wird überwacht durch Testen der Bindung an Ab1-F(ab')₂ in ELISA. Schließlich wird die biologische Aktivität der Charge überprüft in den Seren von kleinen Tieren nach Immunisierung mit den Idiotypträgern, wie beschrieben (Bhattacharya-Chatterjee et al. (1987) J. Immunol. 139: 1354; Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) J. Immunol. 141=1398). Das abgefüllte Endprodukt wird getestet für Endotoxin, Sterilität und allgemeine Sicherheit im Meerschweinchen. Der aluminiumhydroxidgefällte 11D10 wird dann vor der Applikation bei 45 °C für 30 Minuten in einem Wasserbad hitzebehandelt.
Humorale Immunität
Humorale Immunantworten von jenen Patienten, die anti-anti-Id-Antikörper (Ab3) entwickeln, werden charakterisiert. Antikörper werden beurteilt für (a) die Bindung an Tumorzellen oder isoliertes teilgereinigtes Antigen, um zu bestimmen, ob der Ab3 in der Tat Ab1-Antikörper enthält; (b) cytotoxische Aktivität gegen Brutskrebstzellen mit Effektorzellen oder Komplement als Vermittler von cytotoxischen Wirkungen; (c) Isotypcharakterisierung mit anti-menschlichen isotypspezifischen Reagenzien; (d) Idiotypanalyse von Ab3, d. h. Teilen von Idiotopen mit Ab1; und (e) Epitopanalyse von Ab3 (d. h. Bindung an denselben Epitop wie Ab1).
Die Entwicklung von humoraler Immunität, induziert durch Immunisierung mit alaungefälltem Ab2, wird beurteilt durch das Testen von Seren, die aus Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen werden, wie in dem Protokoll vermerkt. Das Serum wird anfänglich durch Sandwich-RIA getestet im Hinblick auf humane anti-Maus-Antikörper-(HAMA-) Gesamtantworten (anti-iso/allo/und anti-anti-Isotypantikörper). Kurz, Mikrotiterplatten werden mit 11D10 überzogen und werden mit unterschiedlichen Verdünnungen an Patientenseren inkubiert. Nach den Waschschritten wird die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem Anti-Id 11D10 in einem homogenen Sandwich-RIA eingefangen. Da 11D10 als intakter IgGI injiziert wird, wird von dem Patienten erwartet, dass sie HAMA-Antworten entwickeln.

(a) Spezifische Ab3-Antwort auf Ab2: Seren aus immunisierten Patienten mit positiven HAMA-Antworten werden auf die Anwesenheit von anti-anti-idiotypischen Antikörpern getestet. Seren werden mit normalem Mausimmunglobulin vorinkubiert, um menschliche Antikörper gegen isotypische und allotypische Determinanten zu blockieren und werden dann für die Anwesenheit von anti-anti-Id (Ab3) durch Reaktion mit dem immunisierenden anti-Id (11D10), überzogen auf Mikrotiterplatten, durch RIA überprüft. Nicht verwandter Ab2 wird als Kontrolle verwendet. Nach den Waschschritten wird die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem Anti-Id-Reagenz in einem homogenen Sandwich-RIA wie oben eingefangen. Vorbehandelte, nicht-Immunseren und Seren aus normalen Donoren werden als Kontrollen in diesen Tests verwendet.
(b) Idiotypanalyse von Ab3: Falls eine positive Reaktion in (a) oben erhalten wurde, werden Ab3-Seren aus jenen behandelten Patienten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Bindung von ¹²⁵I-markiertem 11D10 an MC-10 (Ab 1), gebunden an Mikrotiterplatten, oder umgekehrt (Inhibition der Bindung von radioaktiv markiertem MC-10 an 11D10 auf der Platte), zu inhibieren, überprüft. Ein nicht verwandtes Ab1-Ab2-System wird als eine Kontrolle verwendet. Dieser Test zeigt, ob Ab3 in den Seren von Patienten Idiotopen mit MC-10 (Ab1) teilen. Diese Inhibitionstests der Ab1-Ab2-Bindung durch Ab3-Seren zeigen auch, ob Ab3 ein echter anti-anti-Idiotyp ist.
(c) Bindung von Ab3 an Tumorantigen: Um humorale Immunantworten, gerichtet gegen native Zielantigene, zu bewerten, werden die Ab3-Seren von Patienten für ihr Reaktionsvermögen mit Zelllinien getestet, von denen bekannt ist, dass sie HMFG in einem RIA exprimieren. Zusätzlich werden die Seren für ein Reaktionsvermögen gegen eine solubilisierte teilgereinigte Zubereitung von HMFG-Antigen, überzogen auf Mikrotiterplatten, überprüft. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird detektiert durch die Verwendung von ¹²⁵I-markiertem anti-menschlichen Ig-Reagenzien oder mit alkalischer Phosphatase markierten anti-menschlichen Ig in ELISA. Seren vor der Immunisierung und nicht verwandtes Antigen werden als Kontrollen verwendet. Der Isotyp von HMFG-Antigenbindenden menschlichen Ab3-Seren wird durch ELISA unter Verwendung von antimenschlichen isotypspezifischen Reagenzien bestimmt. Für diese Experimente wird HMFG als ein Fusionsprotein aus E. coli erhalten, nach dem Verfahren von Larocca et al. (1992) Hybridoma 11 (2): 191-201.
(d) Epitopanalyse von Ab3: Um zu zeigen, dass in behandelten Patienten erzeugter Ab3 und Ab1 (MC-10) an dieselbe Antigendeterminante binden, wird die Inhibition der MC-10-Bindung an die Ag-positive Tumorzelllinie MCF-7 oder an HMFG-Antigen durch Ab3-Seren durch RIA überprüft.
(e) Cytotoxische Aktivitäten von Ab3: Falls Ab3 in Patientenseren spezifisch an Tumorzellen binden, wird die Fähigkeit von Ab3, diese Zellen in Verbindung mit Effektorzellen und/oder Komplement zu lysieren, durch Standard-ADCC (Cheresh et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 515) oder CMC-Tests (Herlyn et al. (1981) Int. J. Cancer 27: 769) getestet. Cytotoxische Aktivität des Ab3 können jedoch abhängig sein von seinem Isotypen; IgG1, der in ADCC wirksam ist, und IgG1, IgG2, IgG3 und IgM, die in CMC wirksam sind.

Bestimmung der Wirkungen der 11D10 Immunisierung auf zelluläre Immunantworten des Patienten
Um zu testen, ob die Immunisierung von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs mit 11 D 10-Alugel zur Aktivierung von T-Zellen führt, von denen manche eine cytolytische Aktivität gegen ihre eigenen Tumorzellen zeigen könnten, sollten die T-Zellen von Patienten, falls sie in vivo durch Ab2β aktiviert worden sind, auf die In-vitro-Stimulation mit Ab2β, Antigen oder autologen Tumorzellen mit Proliferation und möglicherweise CTL-Induktion ansprechen.

(a) Die proliferative Antwort von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von Patienten wird in der Anwesenheit von immunisierendem anti-Id 11D10, Kontroll-Ab2 oder teilgereinigtem HMFG-Antigen getestet. Alternaiv werden PBMC stimuliert mit autologen bestrahlten Tumorzellen (cryokonserviert während Chirurgie oder Aufrechterhalten in Kurzzeitkultur, wo machbar). Falls die Zellen proliferieren, werden sie durch Durchflusscytometrie phänotypisiert, um den Subtyp an Zellen, der in die Proliferation involviert ist, zu bestimmen. Die proliferative Antwort wird durch den Einbau von ³H-Thymidin gemessen und mit dem PBMC Stimulation Index vor der Therapie verglichen. Vor diesem Test werden Blutproben nach der dritten und vierten Immunisierung und ein Monat nach der letzten Therapie gesammelt.
(b) Cytotoxische Aktivität in vitro. Das zelluläre Immunprofil wird bewertet durch Testen der cytotoxischen In-vitro-Aktivität von T-Zellen für autologe Krebszellen (wo machbar) oder allogene MC-10-Ag-positive Tumorzellen in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest. Wie von Ertie et al. (22) vorgeschlagen, kann die Fähigkeit von anti-Id-Antikörper, cytotoxische T-Zellen, die nicht MH-10 beschränkt sind, auf dem Niveau der Effektorphase zu induzieren, die Schwierigkeit der Verwendung von autologen Tumorzellen als Ziele überwinden und kann die Verwendung von allogenen Tumorzellen ebenso erleichtern. Periphere Blutlymphozytenzubereitungen aus Brustkrebspatienten und gesunden Donoren werden inkubiert mit unterschiedlichen Dosen an anti-Id (Bereich 10 ng-100 mg), an Bio-Perlen unlöslich gemacht oder auf Plastikplatten überzogen. Die optimale Anzahl an Lymphozyten wird in einer 135mm-Petrischale mit optimalen Konzentrationen an Idiotypvaccinen in 2 ml Mishell-Dutton-Kulturmedien kultiviert. Zellen werden 5 bis 6 Tage später geerntet und werden als Effektorzellen in einem 4-stündigen oder 18-stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungscytoxizitätstest gegen ⁵¹Cr-markierte Ziele verwendet, wie beschrieben (84). Wenn immer möglich, werden autologe Tumorzellen (während der Diagnose oder vor der Therapie cryokonserviert) als Zielzellen verwendet. Es könnte machbar sein, eine Bereitstellung von autologen Zellen durch Vermehren und Aufrechterhalten von frischen Tumorzellen in Nacktmäusen oder Zellkultur zu haben, wenigstens in einigen ausgewählten Patienten. Allogene MC-10-Ag-positive Tumorzelllinien werden ebenfalls gleichzeitig als Ziele getestet. Falls es Tumorzellabtötung gibt, charakterisieren die folgenden Experimente die Spezifität: (i) Falls Lymphozyten cytotoxisch für Brustkrebszellen werden, werden sie in dem cytotoxischen Test mit einer Anzahl von Zielen getestet, die Antigen nicht exprimieren (d. h. Lymphoidzellen, andere Carcinomzelllinien). Fehlen von Cytotoxitität legt nahe, dass das Ziel möglicherweise mit Brustkrebs verwandeter Ag ist. (ii) Lymphocyten werden mit nicht verwandten antiidiotypischen Hybridomen desselben Isotyps wie der verwendete Ab2β inkubiert und werden in dem cytotoxischen Test mit ⁵¹Cr-markierten Zieltumorzellen getestet. Fehlen von Cytotoxizität zeigt, dass die Wirkung von anti-Id spezifisch ist.

In gesonderten Experimenten werden die Lymphozyten des Patienten mit autologen bestrahlten Tumorzellen inkubiert (wo möglich). Zellen werden 5 bis 6 Tage später geerntet und lebende Zellen werden über Lymphozytenseparationsmedien aufgereinigt. Cytotoxizität wird gegen ⁵¹Cr-markierte autologe Zieltumorzellen gemessen.
Dieser In-vitro-Cytotoxizitätstest nutzt aus Blut isolierte PBMC, gewonnen nach Vortherapie, nach der vierten Immunisierung und einen Monat nach der letzten Immunisierung.
Bestimmung der optimalen Dosis von 11D10
Die optimale Dosis für das weitere klinische Testen wird nach den folgenden zwei Kriterien ausgewählt:

(a) Die Ab2-Dosis, die die maximale Ab3-Antwort induziert, wird bestimmt. Diese kann durch einen Inhibitionstest bestimmt werden.
(b) Die Ab2-Dosis, die die maximale Ab3-Bindungsantwort an den Tumor induziert (Ab1'-Antwort).

Quantifizierung der Ab3- und Ab1'-Antwort
Die Expression von anti-anti-Id-Antikörper (Ab3) in den Seren von Patienten wird quantifiziert durch RIA-Inhibitionsstudien wie folgt. Kurz, Mikrotiterplatten werden mit MC-10-IgG1 (Ab1) überzogen und werden mit einer festen Menge an ¹²⁵I-markiertem Ab2 zur Reaktion gebracht. Es wird eine Standardinhibitionskurve unter Verwendung von gereinigten MC-10-IgG1 als Inhibitoren erzeugt. Als nächstes werden die Seren von Patienten, die von anti-iso-allotypischer Aktivität abgereichert sind, überprüft für ihre Fähigkeit, die Ab1-Ab2-Reaktion bei verschiedenen Verdünnungen zu inhibieren, und die Menge an Ab1-ähnlichem Antikörper in den Seren wird aus der Standardinhibitionskurve abgeschätzt. Die Induktion der Ab3-Antwort, ebenso wie die Dauer, können unter unterschiedlichen Dosislevels verglichen werden. Falls es keinen statistischen Unterschied zwischen Ab3-Antworten oder der Dauer bei einer Anzahl von Dosen gibt, wird der Titer der spezifischen Antitumorantwort (Ab1') in den Seren durch ELISA-Test gegen mit teilgereinigtem HMFG-Antigen überzogenen Platten verglichen.
In vitro-Studien. Falls zirkulierender Ab1' oder Ab3-positive Patientenseren vorhanden sind, können sie anzeigen, dass sie an Patiententumorzellen gebunden sein können oder an zirkulierendes Tumorantigen (sogar obwohl das Ag in Blut in einer geringen Menge sezerniert wird) oder sie sind von einer geringen Affinität. Patienten-PBMC werden in vitro mit Antigen oder Ab2 für die Induktion von tumorspezifischem Antikörper stimuliert. Für diesen Zweck werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), gewonnen aus Blut, das in der Zeit vor der Therapie und dann einen Monat nach der vierten Immunisierung gesammelt worden ist, mit verschiedenen Konzentrationen 11D10 oder nicht verwandtem Ab2 oder HMFG-Antigen (10 μg bis 110 ng) in einer modifizierten Mishell-Dutton-Kultur (DeFreitas et al. (1985) Curr. Top Microbiol. Immunol (119: 75) kultiviert. Kulturüberstände werden geerntet und werden als erstes für die Produktion von spezifischen menschlichen Immunglobulinen durch ELISA-Test überprüft und für die Bindung an eine insolubilisierte Zubereitung von Ab2 durch Radioimmuntest. Zusätzlich werden die Überstände für den Gehalt an idiotyptragenden Molekülen durch ihre Fähigkeit, die Reaktion zwischen dem ¹²⁵I-markierten MC-10 (Ab1) an Ab2β zu inhibieren, getestet. Die Überstände werden auch für ihre Reaktivität mit MC-10-Ag-positiven Brustcarcinomzellen und Ag-negativen Lymphoidzellen in einem Bindungstest mit ¹²⁵I-markierten anti-menschlichen Ig-Reagenzien durch RIA oder ELISA-Test (Empfindlichkeit > 1 ng) im Hinblick auf die Bewertung des Ab1'-Antikörpers überprüft.
Die Spezifität der Wirkung von Ab2β wird durch Inkubieren von PBMC mit nicht verwandten Ab2 desselben Isotyps überwacht. Da nur Ab3-positive Patienten in diese In-vitro-Studie eingeschlossen werden, sollten mit Ab2β stimulierte PBMC Antikörper sezernieren, die an Ab2β (11D10) binden, und sollten als eine Positivkontrolle dienen.
Mögliche Induktion einer Ab4-Antwort
Nach der Netzwerkhypothese können mit Ab2 immunisierte Patienten eventuell auch eine Ab4-Antwort (anti-anti-anti-Id) induzieren, welche die Spezifität von Ab2 nachahmen könnte. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, werden Ab3-positive Seren von Patienten (abgereichert von anti-Iso- und anti-Allotyp-Antikörpern) mit MC-10 (Ab1) durch ELISA oder RIA wie beschrieben zur Reaktion gebracht. Positive und negative Kontrollen werden, wie für den Ab3-Test beschrieben, eingeschlossen werden. Seren für diesen Test werden drei Monate nach der letzten Therapie gewonnen werden.
Beispiel 5: Analyse von durch die Applikation von 11D10 an Patienten mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung ausgelöster Immunantwort
Wir erhielten IND von der U.S. FDA für den klinischen Versuch von Brustkrebspatienten mit dem mit Alaun gefällten anti-Id 11D10 (BB-IND # 5745). Wir schlossen fünf Patienten in diesen Phase-1b-Versuch ein. Sämtliche Patienten hatten fortgeschrittenen Brustkrebs, der zuvor mit Standardtherapie behandelt worden war, und ihre Tumorzellen waren positiv für das Brustkrebsantigen HMFG, wie definiert durch den monoklonalen Antikörper MC-10 (BrEl). Patienten wurden randomisiert auf entweder 1 mg-, 2 mg-, 4 mg- oder 8 mg-Dosen von 11D10-Alugel (Alaun) pro Injektion. Sie wurden intrakutan immunisiert, zweiwöchentlich für mindestens vier Injektionen. Therapie schritt auf einer monatlichen Basis fort bis die Erkrankung des Patienten fortschritt.
Der erste Patient erhielt acht Immunisierungen mit 8 mg bis jetzt; der zweite Patient erhielt vier Immunisierungen mit 4 mg; der dritte Patient erhielt vier Immunisierungen mit 2 mg; der vierte und fünfte Patient, erhaltend Dosen von 1 mg bzw. 4 mg, begannen kürzlich die Studie.
Toxizität
Toxizität war mit nur lokalen Reaktionen an der Injektionsstelle mit leichtem Erythem und Induration minimal. Die anti-Id-Behandlung hatte keine schädliche Wirkung auf hämatopoetische Zellen, auf die Nieren- oder Leberfunktion.
Humorale Antworten auf Anti-Idiotyp
Die Entwicklung von humoraler Immunität, induziert durch Immunisierung mit alaungefälltem Anti-Id 11D10 (beschrieben wie in Beispiel 4), wurde bewertet durch das Testen von Seren von Patienten vor der Therapie und nach jeder Behandlung mit dem Vaccin. Hyperimmunisierungsseren (nach vier Immunisierungen) von den ersten drei Patienten zeigten signifikante Spiegel an humanen Anti-Maus-Gesamtantikörperantworten, einschließlich anti-iso/allo/anti-anti-idiotypischen Antworten gegen den immunisierenden Ab2 11D10. Repräsentative Daten von dem ersten Patienten sind in 20 gezeigt. Als nächstes wurden die Seren aus diesen Patienten für ihre Fähigkeit überprüft, die Bindung von ¹²⁵I-MC-10 (Ab1) an den Ab2 11D10 auf der Platte durch Radioimmuntest zu inhibieren, oder umgekehrt (Inhibition von radioaktiv markiertem Ab2, der an Ab1 auf der Platte bindet). Diese Reaktionen wurden in der Anwesenheit von überschüssigem normalen Maus-Ig gemacht, um menschliche Antikörper gegen isotypische und allotypische Determinanten zu blockieren. 21 zeigt Daten an dem ersten Patienten. Ungefähr 40 %ige Inhibition wurde in einer 1:40-Verdünnung von Serum erhalten, wohingegen eine Inhibition von nur 9 % und 22 % mit den Seren des zweiten und dritten Patienten bei derselben Verdünnung erhalten wurden. Nach der siebten Immunisierung zeigte der erste Patient eine 83 %ige Inhibition in einer 1:40-Verdünnung von Serum. Seren vor der Immunisierung aus allen drei Patienten zeigten gar keine Inhibition. Diese Ergebnisse zeigen, dass Patient # 1 signifikant anti-antiidiotypische Antikörper (Ab3) entwickelte und die anderen beiden Patienten eine gewisse Ab3-Reaktivität hatten.
Als nächstes untersuchten wir, ob anti-Id 11D10 eine für anti-Tumor-Antigen (HMFG) spezifische Antikörperantwort in immunisierten Patienten induzieren könnte. Zu diesem Zweck wurden die nach den vierten Immunisierungen gewonnenen Seren gegen HMFG-Antigen (Fusionsprotein, erhalten von Dr. Ceriani; Larocca et al. (1992)), überzogen auf Mikrotiterplatten, durch einen ELISA-Test getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt und werden als Mittelwert von dreifach-bestimmten Vertiefungen ausgedrückt (S.D. < 10 %).
Tabelle 5: Binden von A63-Seren an HMFG-Antigen durch ELISA
Ab3-Seren von Patient #1 und #3 zeigten spezifische Bindung an HMFG-Antigen im Vergleich mit Seren vor der Immunisierung (prä). Sowohl Prä- als auch Postimmunisierungsseren von Patient #2 zeigten eine unspezifische Bindung an HMFG, welche mit der Immunisierung nicht zunahm.
Zelluläre Immunantworten auf Anti-Idiotyp
Zelluläre Immunantworten wurden gemessen durch die Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen, inkubiert mit alaungefälltem anti-Id 11D10 und dem iso-, allotypangepassten Kontroll-anti-Id 3H1. Positive proliferierende Antworten wurden nur in Patient #1 gesehen (22), aber nicht in den anderen beiden Patienten. Präimmunisierungszellen von Patient Nr. 1 hatten keine proliferierende Antwort, während hyperimmunisierte Zellen eine signifikante Antwort auf anti-Id 11D10 hatten. Es gab auch eine Antwort auf den Kontroll-anti-Id 3H1; diese Antwort war signifikant geringer als j ene der 11D10-Antwort, wahrscheinlich eine Antwort auf die nicht-idiotypischen Bestandteile des Mausimmunglobulinmoleküls darstellend.
Das Ergebnis legt nahe, dass der anti-Id 11D10 sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten in Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs induzieren kann.
Beispiel 6: Konstruktion eines rekombinanten Vacciniavektors, kodierend ein 11D10-Polypeptidfragment
Plasmidkonstruktion und Produktion von rekombinanten Vacciniaviren
Das Schema für die Konstruktion eines allgemeinen Vacciniavektors (rvv) ist in 18 gezeigt. Wir holten die vollständige Sequenz des TK-Gens des Wildtyp-WR-Stamms von Vacciniavirus (GenBank, Zugangsnr. J02425) aus dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) durch das BLAST-Programm heraus. Aitschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Aus den Sequenzdaten wurden Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer, 5'-CAGATGGAAGGGCCCAAC (Sequenz ID Nr. 42) und 5'-GATTGATGCATATCATTACC (Sequenz ID Nr. 43) synthetisiert, entsprechend den Nukleotiden 22-39 bzw. 727-708 der TK-Sequenz. Hruby et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3411-3415. Eine Apa I-Stelle (unterstrichen) wurde in den Vorwärtsprimer eingeführt und eine Nsi I-Stelle (unterstrichen) in den Rückwärtsprimer eingeführt, für die Insertion in das Plasmid pGEM-7Zf(+)(Promega). DNS aus dem Wildtyp-WR-Stamm von Vaccinia wurde isoliert und TK-Gen wurde durch PCR amplifiziert. Ein DNS-Fragment der erwarteten Größe (ungefähr 700 bp) wurde durch PCR gewonnen. Diese DNS wurde durch Elektrophorese in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt abgetrennt und gereinigt durch Verdauung mit GELase (Epicentre Tech.). Das TK-DNS-Fragment wurde in das pGEM-7Zf(+) nach Verdauung mit Apa I plus Nsi I ligiert. Das resultierende Plasmid (pGEM-TK) wurde durch Standardstransformationtechniken amplifiziert. Insertion wurde durch Restriktionskartierung verifiziert.
Der Promoter 7.5 K wurde aus dem Wildtyp-Vacciniavirus durch PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-GTTATCGATGTCGAATAGCC (Sequenz ID Nr. 44) und des Rückwärtsprimers 5'-TTGCTGCAGATTGAGTACTGTTCT (Sequenz ID Nr. 45), entsprechend den Nukleotiden 69-88 und 335-312 der 7.5 K-Promotersequenz, amplifiziert. Cochran et al. (1985) J. Virol. 54 : 30-37. Eine Cla I-Stelle (vorwärts) und eine Pst I-Stelle (rückwärts) wurden in die Primer eingeschlossen. Das amplifizierte DNS-Fragment wurde mit Pst I verdaut. Ein Polynukleotidadapter wurde synthetisiert, wobei das kleinere Oligonukleotid an dem 5'-Ende durch Polynukleotidkinase phosphoryliert wurde. Der teilphosphorylierte Adapter wurde an mit Pst I verdautes, PCR-amplifiziertes 7.5 K-Promoter-DNS-Fragment ligiert. Das Produkt wurde verdaut mit Cla I/EcoR I, verdaut pGEM-TK.
Ein cDNS-Insert, das ein 11D10-Polypeptid kodiert, wird zwischen die NcoI- und XmaI-(SmaI-)Stellen von pVV inseriert. Diese Plasmid enthält auch die Leitsequenz des V_H an dem 5'-Ende der scFv-cDNS. Falls gewünscht, kann ein Vacciniakontrollplasmid konstruiert werden, enthaltend cDNS für E.coli-β-Galactosidase.
Konstruktion von rvv
Rvvs werden durch homologe Rekombination von Vacciniaplasmiden und Wildtyp-WR-Stamm von Vacciniavirus nach dem Vorgehen von Mackett et al. (DNA Cloning, Band II, D.M. Glover, Hrsg. IRL Press 1985) unter Verwendung von CV-1-Zellen konstruiert. Rekombinante virale Klone, exprimierend β-Galactosidase (Kontrollen), werden ausgewählt durch Wachstum auf TK^--143B-Zellen in der Anwesenheit von 5'-Bromdesoxyuridin und 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-Galactosidase (X-Gal). Blaue rekombinante Viren werden mit Pasteurpipetten gepickt und plaquegereinigt. Als ein zweiter Schritt bei der Klonselektion wird Southernblot aus extrahierter DNS unter Verwendung von 11D10-cDNS als der Sonde durchgeführt. Weitere Selektion von rvv wird durch Testen von Kulturüberstand des viral infizierten CV-1 oder jeder anderen eukaryotischen Zelle durch ELISA gemacht. Falls zellassoziiertes 11D10-Polypeptid in dem rvv ist (d. h. falls die Leitsequenz deletiert ist), wird Zelllysat untersucht. Westernblotting mit MC-10 (Ab1) als Sonde wird ebenfalls durchgeführt. Biologische Aktivität des durch das Vacciniavirus synthetisierten 11D10-Polyppeptids wird durch Zellbindungsinhibitionstest bestimmt, wie oben beschrieben. Rvv-Klone, enthaltend 11D10-Polynukleotide, werden durch Färben mit 0,1 % Neutralrot selektiert und plaquegereinigt wie oben. Virale Klone werden in einem Hochtiterlysat unter Verwendung von Standardtechniken wachsen gelassen. Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419. Typischerweise wird ein Klon, das die höchste Menge an 11D10-Polypeptid produziert, für weitere Studien ausgewählt.
Test von 11D10 Polypeptiden (Fremdproteinen), exprimiert durch rekombinantes Vacciniavirus
CV-1-Zellen werden in Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötales Kälberserum und 100 Penicillineinheiten und 100 μg Streptomycin pro ml, in 25cm²-Kolben oder 6-Well-Cluster-Kolben vermehrt. Zellen werden mit rvv bei einem MOI von 30 inokuliert. Dem Virus wird erlaubt, für 2 Stunden bei 37 °C in einem Gewebekulturinkubator zu absorbieren, wonach das Inoculum mit dem Kulturmedium ersetzt wird und die Inkubation fortgesetzt wird. Überstand wird nach der Inkubation für die angegebene Zeit entfernt und das sezernierte 11D10-Polypeptid wird untersucht. Als eine Kontrolle wird Überstand aus scheininfizierten Zellen verwendet. Tests von 11D10-Polypeptiden können durchgeführt werden durch Testen für die Bindung an MC-10 (Ab1), zum Beispiel wie beschrieben in den Beispielen 1 und 5. Durch rvv-lacZ produziertes β-D-Galactopyranosid wird nach Miller (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Pines 1972) mit p-nitro-β-D-Galactopyranosid als Substrat untersucht. Kulturüberstand aus virusinfizierten Zellen wird mit β-Propionat behandelt, um das Virus vor dem Test zu inaktivieren (Corcoran et al. (1988) J. Parasit. 74: 763. Einbau von ³H-Thymidin durch NFS60-Zellen wurde als ein Maß der Zellproliferation verwendet. Jaffee et al. (1993) Cancer Res. 53: 2221-2226. Radioaktivität aufgrund des ³H-Thymidineinbaus in der Anwesenheit von Überstand aus scheininfizierten CV-1-Zellen wird als Hintergrund abgezogen. Als positive Kontrolle und für den Standard an biologischer Aktivität wird intakter 11D10 verwendet. Alternativ können Standardlösungen an GM-CSF verwendet werden.
Testen von Vaccinia-11D10-Vaccinen
Für die Applikation von Vaccinia wird ein Virustiter aus 10⁴ bis 10⁴ pfu in eine Maus injiziert. Injektionen können subkutan, intramuskulär, intradermal oder intraperitoneal sein. Immunisierungen werden wöchentlich durchgeführt. Mäuse werden 7 Tage nach jeder Immunisierung für die Bestimmung von Ab3 (einschließend Ab1') bluten gelassen. Testen für die Entwicklung von 7-Zell-Immunität wird 10 Tage nach der Boosterimmunisierung durchgeführt. Mäuse können auch durch Tumorherausforderung getestet werden, wobei Überleben nach Injektion mit Tumorzellen überwacht wird.
Für die Applikation von Vaccinia über viral infizierte Tumorzellen werden autologe Tumorzellen in Eagle's Medium, enthaltend 10 % (v/v) fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und Gentamicin, aufrechterhalten. Eine Monoschicht aus konfluenten Zellen in einem 75cm²-Kolben wird inoculiert mit (3 × 108) plaquebildenden Einheiten (pfu) von rvv. Nach 2 Stunden bei 37 °C wurde das Inoculum durch DMEM ersetzt und die Inkubation wurde für weitere 24 Stunden fortgesetzt. Nach der Untersuchung unter dem Mikroskop werden Zellen durch Abkratzen gesammelt und werden zweimal mit PBS gewaschen und in PBS bei der gewünschten Konzentration (10³ bis 10⁵/200 μl) resuspendiert. Weibliche C57BL/6-Mäuse, 6-8 Wochen alt, werden von Harlan Bioproducts for Science Inc. (IN) erworben. Tiere werden subkutan mit dem zellulären Vaccin in die rückwärtige linke Flanke injiziert und zwei Wochen später werden Tumorzellen an der rechten rückwärtigen Flanke für die Provokation injiziert. Überleben von Mäusen nach Tumorprovokation unter Anwesenheit von Tumor wird täglich überwacht. Falls Tumor messbar ist, werden Tumoren wöchentlich durch Greifzirkel in zwei Dimensionen gemessen und die Volumina werden unter Verwendung der Formel (Breite² × Länge)/2 berechnet. Tumoren, die greifbar sind, die jedoch zu klein sind, um das Volumen genau zu messen, werden als Nullvolumen aufgenommen, Tumorauftreten wird jedoch als positiv aufgenommen. Tumorvolumina werden nur für jene im Durchschnitt berechnet, die tatsächlich Tumoren über dem Beobachtungszeitraum von 120 Tagen entwickeln. Nullwerte werden für jene Mäuse eingeschlossen, die schließlich Tumoren entwickeln, die jedoch zu einem gegebenen Zeitpunkt tumorfrei waren.
Statistische Bewertung
Statistische Bewertung wird gemacht unter Verwendung von SigmaStat-Software (Jandel, Inc. San Rafael, CA, USA). Ein P-Wert von < 05 wurde als statistische Signifikanz anzeigend erachtet.
Beispiel 7: Konstruktion von Expressionsvektoren, kodierend 11D10-Fusionsproteine
Die variable VDJ-Region der schweren Kette von 11D10-kodierender cDNS wurde aus dem Plasmid pUC911D10V isoliert und in den in 25 gezeigten Vektor ligiert. In diesem Vektor wurde ein DNS-Fragment, das das reiche Peptid von Maus-GM-CSF oder IL-2 kodiert, 3' zu dem CH₃-Exon ligiert. Dies wurde bewerkstelligt durch Schaffen einer ClaI-Stelle zwischen dem letzten Codon und dem Stoppcodon auf dem CH₃-Exon und einer NotI-Stelle 3' zu dem Stopcodon. CDNS, die die leichte Kette von 11D10 kodiert, wurde in das Expressionsplasmid pSV 184-Δ Hneo, wie in 25 gezeigt, eingebaut. Das pSV 184-Δ Hneo-Plasmid wurde zuvor beschrieben von Shin et al. (1989) Meth. Enzymol. 178: 459-476).
Nach der ersten Transfektion wurde das die leichte Kette von 11D10 enthaltende Plasmid in die obigen Zellen durch Elektroporation nach einem modifizierten Verfahren von Shin et al. (1989) wie folgt transfiziert. Zellen wurden aus Wachstumsmedien durch Zentrifugation entfernt und zweimal mit Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium (IMDM, GIBCO) gewaschen. Zellen wurden in kaltem IMDM (ohne Serum) bei einer Konzentration von 4,5 × 10⁶/ml resuspendiert. Aus dieser Suspension wurden 0,9 ml (4 × 10⁶ Zellen) zu einer 0,4cm-BioRad-Cuvette hinzugefügt. Ungefähr 20 μg pSV211D10V_H-Cytokin-DNS wurden mit einem Restriktionsenzym linearisiert, das zwischen den EcoRI-Stellen von pSV211D10V_H-Cytokin nicht vorhanden ist, wie z. B. PvuII. Nach Phenol/Chlorophormextraktion und Ethanolfällung wurde DNS in < 50 ml IMDM suspendiert und zu der Zellsuspension hinzugefügt. Nach Abkühlen der Zellsuspension-DNS-Mischung auf Eis für 10 Minuten wurde ein elektrischer Puls bei 200 Volt, einem Widerstand von 960 μF durch einen Gene Pulser Transfection Apparatus von Bio-Rad angelegt. Nach Inkubation auf Eis für 10 Minuten wurden Zellen in 96 ml IMDM, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, suspendiert und mit Mehrkanalpipetten auf acht 96-Well-Platten verteilt, 125 μl/Vertiefung, wodurch 5 × 10³ Zellen/Vertiefung bereitgestellt werden. Nach 2 Tagen wurden 125 μl IMDM, enthaltend 10 % fötales Kälberserum und 25 μg/ml Mycophenolsäure, pro Vertiefung hinzugefügt. Vier Tage später wurde die Hälfte des Mediums aus jeder Vertiefung entfernt und 125 μl 1 × IMDM-Mycophenolsäure-Medium wurden hinzugefügt. Nachdem Klone sichtbar wurden (ungefähr 10-15 Tage), wurde kultivierter Überstand für Untersuchung mit MC-10 für die Detektion von Transfektomen entfernt.
Tabelle 6 zeigt die verschiedenen konstruierten Expressionsplasmide. mIL-2 und mGM-CSF bezeichnen Maus-IL-2 bzw. -GM-CSF. V_H und V_L enthielten die Signalpeptide.
Tabelle 6: Eukaryotische Expressionsvektoren für schwere und leichte Ketten von 11D10
Für die Detektion von hochproduzierenden Transfektomen werden die Zellen in 96-Well-Platten nach Begrenzen der Verdünnung (1 Zelle/Vertiefung) ausplattiert. Wenn die Klone in Mikrovertiefungen sichtbar werden, aber immer noch klein bleiben, wird kultivierter Überstand für die Detektion von funktionellen Antikörpern durch Sandwich-Radioimmuntest untersucht werden. 96-Well-Platten werden überzogen mit MC-10 und 50 μl Kulturüberstand aus Transfektoren wird erlaubt, mit dem überzogenen Antikörper zu reagieren. Die Menge an durch jedes Transfektom erzeugtem funktionellem Antikörper wird durch Radioimmuntest mit ¹²⁵I-markiertem MC-10 bestimmt. Für die weitere Beurteilung der stark antikörperproduzierenden Transfektanten werden verschiedene Verdünnungen der Kulturüberstände aus selektierten Klonen ähnlich untersucht.
Ein die Fusion aus schwerer Kette und GM-CSF enthaltendes Plasmid wurde transfiziert in Sp2/0-Zellen durch Protoplastenfusion unter Verwendung der Technik von Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214-221. Stark produzierende Klone wurden für die anfängliche biochemische Charakterisierung der Fusionsproteine selektiert.
Zwei ELISAs wurden wie folgt durchgeführt. Bei Test 1 wurden Mikrotiterplatten mit Ziegen-anti-Mensch-kappa-leichte-Kette (Orgomon Teknika Corp. West Chester, PA) bei Standardkonzentration überzogen, mit BSA geblockt und gewaschen. Überstände aus Kulturen von Zellen, die verschiedene Testkonstrukte exprimieren, wurden dann in den Vertiefungen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit an alkalische Phosphatase konjugiertem, für schwere Ketten spezifischem Ziegen-anti-Mensch-IgG1 (Sigma) überschichtet und wurden auf die übliche Weise entwickelt. Eine positive Reaktion zeigte an, dass der Überstand ein Immunglobulin mit den konstanten Regionen sowohl der menschlichen schweren als auch leichten Kette des erwarteten Typs enthielt. Test 2 wurde in einer ähnlichen Weise durchgeführt, jedoch entwickelt unter Verwendung von an Biotin konjugiertem Ratten-anti-Maus-GM-CSF (Pharmingen), gefolgt von Avidinperoxidasekonjugat (Sigma). Eine positive Reaktion zeigte an, dass der Überstand ein Immunglobulin mit einer menschlichen leichten Kette und einem GM-CSF-Bestandteil enthielt, welcher am C-Terminus der schweren Kette erwartet wurde.
Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse von Tests von Überständen von 9 Klonen für die Anwesenheit von an schwere Kette gekoppelter leichter Kette (Test 1) und für GM-CSF-Aktivität (Test 2). Die Ergebnisse zeigen, dass eine Anzahl von Fusionsproteinen erhalten worden ist, welche Determinanten für leichte Kette, schwere Kette und GM-CSF auf demselben Molekül enthalten.
Fusionsproteine werden durch Affinitätschromatographie isoliert, unter Verwendung von Sepharose-Protein-A-Säulen und werden wie folgt unter Verwendung der folgenden Antikörper und Standards charakterisiert: Monoklonaler Maus-anti-Mensch-IL-2 (Genzyme, Code, DMA-1), Standard natürlicher menschlicher IL-2 (BRL Katalog #13288-014); monoklonaler anti-Maus-IL-2 (UBI, Katalog #05-115), Standard rekombinanter Maus-IL-2 (Sigma, Katalog #I 4517); menschlicher GM-CSF-Testkit mit menschlichem GM-CSF-Standard (R&D System Katalog DGM00), Ratten-anti-Maus-GM-CSF (BRL, Katalog #13306-014), Standard rekombinanter Maus-GM-CSF (UBI, Katalog, 01-167).
Tabelle 7: ELISA für Fusionsprotein aus 11D10 und Maus-GM-CSF
Gereinigte chimäre (d. h. Fusions-)Proteine werden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Molekulargewichtstandards und gereinigter 11D10 werden in dieses Experiment eingeschlossen. Die Proteinbanden werden durch Coomassie-Brilliantblau-Färbung gefärbt. Die Wirkung des gereinigten Fusionsproteins auf die Bindung von MC-10 (Ab1) an 11D10 (Ausgangs-Ab2) und an HMFG (das nominale Antigen) wird durch Inhibitions-RIA untersucht, wie kürzlich gemacht für die Charakterisierung des Ab2, um die Ab1-Bindungsspezifität des Fusionsproteins nachzuweisen. Inhibition der Bindung von markiertem Ab1 an SKBR3-Zellen (Brustkrebszelllinien, die HMFG exprimieren) durch das Fusionsprotein stellt eine zusätzliche Unterstützung für die Spezifität der Antigen-Antikörper-Bindung bereit. Die biologische Aktivität von Maus-IL-2 wird durch Zellproliferationstest unter Verwendung von Suspensionen aus CTLL-2-T-Zellen bestimmt. Proben und Standards werden in vollständigem RPMI-10-Medium seriell verdünnt und 50 μl Aliquoten werden in Vertiefungen von 96-Well-Platten gegeben. CTLL-2-Zellen werden bis zur aktiven logarithmischen Phase wachsen gelassen und werden mit vollständigem RPMI-10 gewaschen, um Rest-IL-2 zu entfernen. Zellen werden in vollständigem RPMI-10 mit 1 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Die Zellen werden in drei Gruppen eingeteilt, wobei ein Satz monoklonalen anti-Maus-IL-2 erhielt, ein Satz erhielt anti-Mensch-IgG-γ-Kette und der andere erhielt die für die Verdünnung dieser Antikörper verwendete Lösung. Zellsuspensionen (50 μl, 5 × 10³ Zellen) werden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Zellen werden bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator für 24 Stunden inkubiert. ³H-Thymidin wird hinzugefügt und die Inkubation wird für weitere 24 Stunden fortgesetzt, gefolgt von Ernten und Bestimmung der eingebauten Radioaktivität. Differentielle Zählungen in Vertiefungen mit und ohne Antikörper werden als die biologische Nettoaktivität der Probe oder des Standards erachtet. 11D10 wird auch in diese Tests eingeschlossen, um zu bestimmen, ob der Antikörper selber Zellproliferation von CTLL-2 induzieren kann. Die biologische Aktivität von menschlichem IL-2 wird ähnlich mit CTLL-2-Zellen bewertet, in der Anwesenheit und Abwesenheit des spezifischen Antikörpers. Für den biologischen Test von GM-CSF werden ähnliche Zellproliferationstests durchgeführt. Für Maus- und Mensch-GM-CSF werden NFS-60-Zellen (Holmes et al., (1985) Proc Natl. Acad. Sci (USA, 82: 6687-6691) bzw. M-07e-Zellen (Genetics Institute) verwendet.
Dateninterpretation, erwartete Ergebnisse, mögliche Probleme und alternative Strategie. Von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen wird erwartet, dass sie Proteinbanden um 25 kd für sowohl 11D10 als auch die Fusionsproteine zeigt; Banden mit höherem Molekulargewicht werden zeigen, dass die Transfektome das an die schwere Kette fusionierte Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein produziert haben. Durch Elektrophorese unter nicht reduzierenden Bedingungen ist es möglich zu bestimmen, ob tetrameres Immunglobulin gebildet wurde. In jenem Fall wird das Fusionsprotein eine einzelne Bande erzeugen, deren Molekulargewicht um eine Menge höher sein sollte, die zweimal äquivalent ist mit dem Cytokinmolekül, d. h. das Fusionsprotein ist dimerisch in Bezug auf das Cytokin. ELISA und biologische Tests für die Cytokine werden anzeigen, ob das Cytokinmolekül exprimiert wird und biologisch aktiv ist. Quantitative Tests für die Cytokine werden anzeigen, ob das Cytokinmolekül exprimiert wird und biologisch aktiv ist. Quantitativer Test mit rekombinantem Standardcytokin wird anzeigen, ob die biologische Aktivität des als das Fusionsprotein vorhandenen Cytokins mit freiem Cytokin vergleichbar ist oder erhöht ist. Inhibition der biologischen Aktivität oder des Cytokins durch seinen entsprechenden Antikörper im Vergleich mit einem Kontrollantikörper zeigt an, dass die Wirkung des Cytokins spezifisch ist. Inhibition der biologischen Aktivität des Cytokins durch anti-Mensch-IgG-γ-Kette wird zeigen, dass die Cytokineinheit als ein Fusionsmolekül mit dem IgG vorhanden ist.
Beispiel 8: Expression und Charakterisierung eines 11D10 scFv
Ein cDNS-Konstrukt, kodierend V_H-(GGGS)₃-V_L (Sequenz ID Nr. 46) für 11D10 wird zubereitet. Eine cDNS für dieses 11D10-Fragment wird eingebaut in den pET-22b(+)-Plasmidvektor (Novagen, Madison, WI) und wird in E. coli exprimiert. Sequenzanalyse wird durchgeführt, um das Plasmid zu bestätigen, welches das Carboxyende von V_H, gekoppelt an das Gerüst von V_L, enthält und welches nicht die Leitregion enthält. pET-22b(+) enthält eine Nickelionenbindungsdomäne, bestehend aus 6 aufeinander folgenden Histidinresten (His₆). Diese His₆-Domäne hat eine hohe Affinität für Nickel, welches für die Aufreinigung des rekombinanten 11D10-scFvs verwendet wird.
Ein Zellbindungskompetitionstest wird durchgeführt, um zu untersuchen, ob das 11D10 scFv die durch intakten 11D10 gezeigte Antigenmimikry bewahrt. HMFG-positive MCF-7 oder SKBR3 (1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in einem Volumen von 50 μl) werden in einer 96-Well-Platte gegeben. Die Zellen werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit [¹²⁵I]-MC-10 (Ab1), 100.000 cpm, inkubiert, in der Abwesenheit und Anwesenheit von steigenden Mengen von 11D10 oder dem 11D10-scFv-Fragment. Prozentuale Inhibition wird nach der folgenden Formel berechnet:
Wo R_T die durchschnittliche Radioaktivität einer experimentellen Vertiefung, R_MAX die Radioaktivität in der Abwesenheit jeglichen Proteins und R_C die Hintergrundradioaktivität ist.
Beispiel 9: Testen von rekombinanten 11D10-Polynukleotidvaccinen in Mäusen
Rekombinante 11D10-Polynukleotidkandidatenvaccine werden wie hierin beschrieben zubereitet. Zwei Gruppen aus 10-15 weiblichen C57BL/6-Mäusen (6-8 Wochen alt) werden intramuskulär mit Dosen aus 50-100 g gereinigtem Plasmid immunisiert, welches an KLH unter Verwendung von Glutaraldehyd gekoppelt ist, wie beschrieben von Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988).
Zusätzlich werden verschiedene Applikationswege verglichen, wie z. B. intramuskulär, intradermal, subkutan und unterperitoneal.
Mäusen wird 7 Tage nach jeder Immunisierung für die Bestimmung der Ab3- (einschließlich der Ab1'-) Produktion Blut entnommen, wie oben beschrieben. Drei Mäuse aus jeder Gruppe werden für die Isolierung von Milzen für den T-Zell-Proliferationstest 10 Tage nach einer Booster-Immunisierung geschlachtet.
Um zu bestimmen, ob irgendeine beobachtete Wirkung spezifisch ist, im Gegensatz zu unspezifischer humoraler oder zellulärer Immunität (durch indirekte Mechanismen wie Cytokinproduktion, induziert durch das injizierte Polynukleotid), werden die folgenden Kontrollen verwendet: (a) Plasmid ohne 11D10-Polynukleotidinsert; (b) Plasmid mit 11D10-Polynukleotidinsert in der entgegengerichteten (d. h. Gegensinn-) Orientierung; und (c) Plasmid, enthaltend ein Polynukleotid, das einen nicht verwandten Ab2 kodiert.
Beispiel 10: Weitere Analyse von Immunantwort, ausgelöst durch die Applikation von 11D10 an Patienten mit fortgeschrittener HMFG-assoziierter Erkrankung
Die Phase Ib der U.S. FDA für die klinische Studie von Brustkrebspatienten mit anti-Id 11D10, gefällt mit Alaun (BB-IND#5745), wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde ausgedehnt, um 12 Patienten einzuschließen. Sämtliche Patienten hatten fortgeschrittenen Brustkrebs, der zuvor mit Standardtherapie behandelt worden ist, und ihre Tumorzellen waren für das Brustkrebsantigen, HMFG, positiv, wie definiert durch den monoklonalen Antikörper MC-10 (BrE1). Patienten wurden randomisiert auf entweder 1 mg, 2 mg, 4 mg oder 8 mg-Dosen von 11D10-Alugel (Alaun) pro Injektion. Sie wurden intrakutan immunisiert, zweiwöchentlich für mindestens vier Injektionen. Therapie ging auf einer monatlichen Basis weiter bis die Erkrankung der Patienten fortschritt. Patienten wurden sehr stark für Erkrankungsaktivität überwacht und wurden sämtlich aufgrund von Erkrankungsfortschreiten oder Tod aus der Studie entfernt. Details der 12 Patienten dieser Studie sind in Tabelle 8 zur Verfügung gestellt.
Tabelle 8: Details von Brustkrebspatienten in der klinischen Studie Phase 1b
Toxizität
Toxizität war mit nur lokalen Reaktionen an der Injektionsstelle mit leichtem Erytherm und Verhärtung minimal. Die anti-Id-Behandlung hatte keinerlei schädliche Wirkungen auf hämatopoetische Zellen, die Nieren- oder Leberfunktion.
Humorale Antworten auf anti-Idiotyp
Die Entwicklung von humoraler Immunität, induziert durch Immunisierung mit alaungefälltem anti-Id 11D10 (zubereitet wie in Beispiel 4 beschrieben) wurde bewertet durch Testen von Seren aus Patienten vor der Therapie und nach jeder Behandlung mit dem Vaccin. Hyperimmunisierungsseren (nach der vierten Immunisierung) von fünf von zehn Patienten zeigten signifikante Spiegel an menschlichen anti-Maus-Gesamtantikörperantworten, einschließlich anti-iso/allo/anti-anti-idiotypische Antworten gegen immunisierenden Ab2 11D10. Als nächstes wurden die Seren aus diesen Patienten durch Radioimmuntest für ihre Fähigkeit überprüft, die Bindung von ¹²⁵I-MC-10(Ab1) an den Ab2 11D10 auf der Platte zu inhibieren, oder umgekehrt (Inhibition von radioaktiv markierter Ab2-Bindung an Ab1 auf der Platte). Diese Reaktionen wurden in der Anwesenheit von überschüssigem normalen Maus-Ig gemacht, um menschliche Antikörper gegen isotypische und allotypische Determinanten zu blockieren.
Die 27A und 27B zeigen Daten aus 10 Patienten, einschließlich Patient # 1. (Daten von Patient #1 sind auch in Beispiel 5 diskutiert). Seren aus den Patienten #1, 5, 6, 7 und 12 zeigten eine signifikante Inhibition sogar bei einer Verdünnung von 1:100. Seren vor der Immunisierung aus Patienten #1, 5, 6, 7 und 12 zeigten gar keine Inhibition. In der Summe zeigen diese Ergebnisse, dass die Patienten #1, 5, 6, 7 und 12 signifikant anti-antiidiotypische Antikörper (Ab3) entwickelt hatten, wohingegen die anderen Patienten (#2, 3, 8, 9 und 10) überhaupt keine signifikante Ab3-Reaktivität entwickelten.
Als nächstes untersuchten wir, ob anti-ID 11D10 eine für das anti-Tumorantigen (HMFG) spezifische Antikörperantwort in immunisierten Patienten induzieren könnte. Hierfür wurden die nach den vierten Immunisierungen aus den Patienten #1 ,6 und 12 gewonnenen Seren auf einer anti-Id-11D10-Säule affinitätsgereinigt und gereinigter Ab3 wurde gegen auf Mikrotiterplatten überzogenes HMFG-Antigen (Fusionsprotein, erhalten von Dr. Ceriani; Larocca et al. (1992)) durch einen ELISA-Test getestet.
Die Ergebnisse sind in 28 gezeigt. Gereinigte Ab3-Seren aus Patienten #1, #6 und 12 zeigten spezifische Bindung an HMFG-Antigen im Vergleich mit gereinigtem Ab3, gewonnen aus einem Colonkrebspatienten, der mit dem Kontroll-anti-Id 3H1 behandelt worden war. Der Isotyp des Antikörpers (Ab1') in den Seren von mit 11D10 immunisierten Patienten war überwiegend IgG.
Zelluläre Immunantworten auf anti Idiotyp
Zelluläre Immunantworten wurden durch die Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen gemessen, mit alaungefälltem anti-Id 11D10 und der iso-, allotyp angepassten Kontrolle anti-Id 3H1 inkubiert. Positive proliferative Antworten wurden in den Patienten #1, 5, 6 und 12 gesehen, aber nicht in den anderen getesteten Patienten. Die 29A und 29B zeigen Daten aus den Patienten # 1 bzw. #5. Zellen vor der Immunisierung aus Patienten hatten gar keine proliferative Antwort, wohingegen Hyperimmunzellen eine signifikante Antwort auf anti-Id 11D10 hatten. Es gab auch eine Antwort auf den Kontroll-anti-Id 3H1; diese Antwort war geringer als jene der 11D10-Antwort, was wahrscheinlich eine Antwort auf die nicht isotypischen Bestandteile des Mausimmunglobulinmoleküls darstellt.
Die Ergebnisse bestätigen die Erkenntnisse von Beispiel 5, was nahelegt, dass der anti-Id 11D10 sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten in Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs induzieren kann (die auch mit verschiedenen Therapien stark behandelt worden sind).
Obwohl die vorangegangene Erfindung in einem gewissen Detail im Wege der Erläuterung und des Beispiels für Zwecke der Klarheit des Verständnisses beschrieben worden ist, wird es für Fachleute ersichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen praktiziert werden können. Deshalb sollten die Beschreibung und die Beispiele nicht als den Schutzumfang der Erfindung beschränkend ausgelegt werden, welcher durch die angehängten Ansprüche geschildert ist.
Teilweises Sequenzprotokoll

Claims

Monoclonaler Antikörper 11D10, hergestellt von der Hybridomzelllinie ATCC No. 12020 oder der Nachkommenschaft davon, oder anti-idiotypischer Antikörper mit einer Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der leichten Kette identisch zu SEQ ID No. 2 und einer Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Kette identisch zu SEQ ID No. 4.
Antikörper nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend einen Marker, der ein detektierbares Signal erzeugen kann.
Hybridomzelllinie, bezeichnet als ATCC No. 12020, und Nachkommenschaft davon oder ein Hybridom, das einen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 1 erzeugt.
Polypeptid mit der immunologischen Aktivität des monoclonalen antiidiotypischen Antikörpers 11D10, wobei die Aktivität ausgewählt ist unter der Fähigkeit Ab1 und/oder Ab3 zu binden, der Fähigkeit, die Bindung von 11D10 an Ab 1 oder von Ab 1 an menschliche Milchfettglobuli (HMFG) auf spezifische Weise zu inhibieren, und der Fähigkeit, eine HMFG-Immunantwort auszulösen, worin das Polypeptid mindestens 5 benachbarte Aminosäuren aus einem variablen Bereich der leichten Kette von 11D10 mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 2 oder aus einem variablen Bereich der schweren Kette von 11D10 mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID No. 4 umfasst und worin das Polypeptid mindestens eine die Komplimentarität bestimmende Region (CDR) umfasst, ausgewählt unter RASQDIGINLH, ATSSLGS, LQYASSPYT, SYNMH, NIFPGNGDTYYNQKFKG und GNWEGALDY.
Polypeptid nach Anspruch 4, das die CDRs des variablen Bereichs der leichten Kette des Antikörpers 11D10 oder die CDRs des variablen Bereichs der schweren Kette des Antikörpers 11D10 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5, welches Polypeptid einen Bereich enthält, der homolog zu menschlichen Milchfettglobuli ist.
Fusionspolypeptid, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 7, zusätzlich umfassend ein Cytokin oder den konstanten Bereich eines heterologen Immunglobulins.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 8, worin das Cytokin GM-CSF oder IL-2 ist.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 7, umfassend mindestens 10 benachbarte Aminosäuren des variablen Bereichs der leichten Kette, gezeigt in SEQ ID NO. 2, und mindestens 10 benachbarte Aminosäuren des variablen Bereichs der schweren Kette, gezeigt in SEQ ID No. 4, wahlweise verbunden über ein Lirilcer-Polypeptid von etwa 5 bis 20 Aminosäuren.
Humanisierter Antikörper, umfassend das Polypeptide nach einem der Ansprüche 4 bis 10.
Polymeres 11D10-Polypeptid, umfassend eine Vielzahl der Polypeptide nach Anspruch 4.
Isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Sequenz, kodierend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
Polynucleotid nach Anspruch 13, worin die kodierende Sequenz in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 3 gezeigt ist.
Polynucleotid nach Anspruch 13 oder 14, umfassend mindestens 100 benachbarte Nucleotide, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder mindestens 80 benachbarte Nucleotide, gezeigt in SEQ ID No. 3.
Isoliertes Polynucleotid, umfassend einen Bereich von mindestens 15 benachbarten Nucleotiden, wobei der Bereich eine stabile Duplex mit einem Polynucleotid bilden kann, bestehend aus einer den variablen Bereich der leichten oder der schweren Kette kodierenden Sequenz der SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3, und zwar unter Bedingungen, unter denen der Bereich kein stabiles Hybrid mit der SEQ ID No. 5 bis SEQ ID No. 14 oder SEQ ID No. 15 bis DEQ ID No. 32 bildet.
Clonierungs- oder Expressionsvector, umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
Expressionsvector nach Anspruch 17, bei dem es sich um den Expressionsvector Vaccinia handelt.
Wirtszelle, welche das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 13 bis 16 umfasst oder die mit dem Expressionsvector nach Anspruch 17 oder 18 transformiert worden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des Antikörpers nach Anspruch 1, 2, oder 11, des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder des Polypeptids nach einem der Ansprüche 4 bis 10 und einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
Impfstoff, umfassend eine wirksame Menge des Antikörpers nach Anspruch 1, 2 oder 11, des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 13 bis 16, des Expressionsvectors nach Anspruch 17 oder 18 oder des Polypeptids nach einem der Ansprüche 4 bis 10 sowie wahlweise ein Adjuvants.
Impfstoff nach Anspruch 21, bei dem es sich um einen lebenden Virus oder einen viralen Expresionsvector handelt.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1, 2 oder 11 oder des Impfstoffes nach Anspruch 21 oder 22 zur Herstellung eines Medikaments zum Auslösen einer Immunantwort in einem Individuum mit einer fortgeschrittenen, mit humanen Milchfettglobuli assoziierten Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 23, worin die fortgeschrittene, mit menschlichen Milchfettglobuli assoziierte Erkrankung Brustkrebs ist.
Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit eines gegen humane Milchfettglobuli (HMFG) gerichteten Antikörpers, gebunden an eine Tumorzelle, umfassend die Schritte des Kontaktierens der Tumorzelle mit dem Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder 11 für ausreichende Zeit, um die Bindung des Anti-HMFG-Antikörpers zu gestatten, und das Detektieren der Anwesenheit jeglichen 11D10's, der an den Anti-HMFG-Antikörper gebunden ist.
In Vitro-Verfahren zum Detektieren einer gegen humanes Milchfettglobuli gerichteten immunologischen Antwort in einem Individuum, umfassend die Schritte (a) in Kontaktbringen einer biologischen Probe, erhalten aus dem Individuum, mit dem Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder 11 unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Komplexes zwischen dem Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder 11 und einem Antikörper gestatten, der an 11D10 bindet, und (b) Detektieren des gebildeten stabilen Komplexes.
In Vitro-Verfahren zum Detektieren eines Antikörpers in einer Probe, der an den monoclonalen Antikörper 11D10 bindet, umfassend die Schritte (a) Kontaktieren des Antikörpers aus einer aus einem Individuum erhaltenen Probe mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 4 bis 10 unter Bedingungen, welche die Bildung eines stabilen Antigen/Antikörper-Komplexes gestatten, und (b) das Detektieren des in Schritt (a) gebildeten, stabilen Komplexes, falls vorhanden.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 1 oder 11 für die Herstellung eines Medikaments zur Linderung einer mit humanen Milchfettglobuli assoziierten Erkrankung in einem Individuum, welches eine fortgeschrittene, mit humanen Milchfettglobuli assoziierte Erkrankung hat.
Kit zur Detektion oder Quantifizierung eines gegen humane Milchfettglobuli gerichteten Antikörpers, umfassend den Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder 11 oder das 11D10-Polypeptid nach einem der Ansprüche 4 bis 10 in einer geeigneten Verpackung.
Kit zum Detektieren oder Quantifizieren eines Polynucleotids, umfassend ein Polynucleotid, welches einen variablen Bereich des monoclonalen Antikörpers 11D10 oder einen Teil davon codiert, wobei der Kit das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 13 bis 16 in geeigneter Verpackung enthält.