ES2259184T3 - Anticuerpos anti-idiotipo monoclonal murino 11d10 y sus procedimientos de utilizacion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN ANTICUERPO ANTI-IDIOTIPO MURINO MONOCLONAL 11D10 QUE PROVOCA UNA RESPUESTA INMUNITARIA CONTRA UN EPITOPO ESPECIFICO DE UNA MUCINA DE ELEVADO PESO MOLECULAR DE GLOBULO GRASO DE LECHE HUMANA (HMFG) Y UN HIBRIDOMA QUE PRODUCE 11D10. EL HIBRIDOMA QUE PRODUCE 11D10 SE SELECCIONO MEDIANTE PROCEDIMIENTOS ESPECIFICOS. 11D10 INDUCE UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA CONTRA HMFG EN RATONES, CONEJOS, MONOS Y PACIENTES CON TUMORES AVANZADOS ASOCIADOS CON HMFG. ESTA INVENCION PROPORCIONA COMPOSICIONES DERIVADAS DE SECUENCIAS POLINUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN LAS REGIONES VARIABLE LIGERA Y/O VARIABLE PESADA DEL ANTICUERPO ANTI-IDIOTIPO 11D10, ASI COMO LOS POLIPEPTIDOS CODIFICADOS POR LAS MISMAS. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA COMPOSICIONES QUE PUEDEN UTILIZARSE EN LA DETECCION O TRATAMIENTO DE LOS TUMORES ASOCIADOS CON HMFG.

Description

Anticuerpos anti-idiotipo monoclonal murino 11D10 y sus procedimientos de utilización.

Campo técnico

Esta invención está relacionada con anticuerpos anti-idiotipo monoclonales. Más específicamente, está relacionada con el anticuerpo anti-idiotipo 11D10 y con las secuencias de polinucleótido y de polipéptido para el 11D10, el cual provoca una respuesta inmune contra un epítope específico del glóbulo graso en la leche humana (HMFG).

Antecedentes de la invención

A pesar de la vasta investigación médica y de los numerosos avances realizados, el cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en los Estados Unidos. El cáncer de pecho es la causa más común de entre las muertes por cáncer en las mujeres. Mientras que los modos tradicionales de terapia, tales como cirugía, radioterapia y quimioterapia son ampliamente utilizados y, en muchos casos, con éxito, existe aún un importante porcentaje de fracaso, especialmente en relación con los tumores sólidos. El alto porcentaje aún existente de muerte por cánceres tales como el de pecho impone la necesidad de encontrar modos alternativos de terapia.

La inmunoterapia del cáncer humano utilizando células tumorales o vacunas derivadas de tumores ha sido decepcionante debido a varias razones. Ha sido siempre difícil el obtener grandes cantidades de antígenos purificados asociados a tumores, los cuales se encuentran a menudo mal definidos químicamente y son difíciles de purificar. Además, queda el problema del potencial de respuesta inmunobiológica contra los antígenos tumorales o, en otras palabras, la cuestión de si un paciente con cáncer puede montar con efectividad una respuesta inmune contra su tumor. Los antígenos asociados a tumores (TAA) son a menudo una parte del organismo y, usualmente, provocan una respuesta inmune muy pobre en un huésped portador de tumor debido a la tolerancia a los antígenos, como la supresión mediada por células T. Por otra parte, los pacientes de cáncer tienden a ser inmunosuprimidos, y únicamente responden a ciertos antígenos dependientes de células T.

Los inmunobiólogos han aprendido que un antígeno pobre (en términos de provocación de una respuesta inmune) puede ser transformado en un antígeno fuerte por medio del cambio de su entorno molecular. Los cambios de hapteno-portador permiten a las células T de ayuda convertirse en activas, haciendo más fuerte la respuesta inmune global. De esta forma, el cambiar al portador puede transformar también a un antígeno tolerogénico en un antígeno efectivo.
McBridge et al. (1986) Br. J. Cancer 53:707. A menudo, el estatus inmunológico de un paciente con cáncer es suprimido de tal forma que el paciente es únicamente capaz de responder a ciertos antígenos dependientes de células T, y no a otras formas de antígeno. Partiendo de estas consideraciones, tendría sentido el introducir cambios moleculares dentro de los antígenos asociados a tumor antes de utilizarlos como vacunas. Desafortunadamente, esto es imposible de llevar a cabo en la mayor parte de los antígenos tumorales, debido a que no se encuentran bien definidos y son muy difíciles de purificar.

La hipótesis de red de Lindemann ((1973) Ann. Immunol. 124:171-184) y Jerne ((1974) Ann. Immunol. 125:373-389) ofrece un enfoque elegante a la hora de transformar estructuras epitópicas en los determinantes idiotípicos expresados en la superficie de los anticuerpos. Conforme al concepto de red, la inmunización con un antígeno asociado a tumor dado generará la producción de anticuerpos contra este antígeno asociado a tumor, llamado Ab1. A continuación, este Ab1 es utilizado para generar una serie de anticuerpos anti-idiotipo contra el Ab1, llamados Ab2. Algunas de estas moléculas Ab2 pueden mimetizar con éxito la estructura tridimensional del antígeno asociado a tumor identificado como Ab1. Estos anti-idiotipos particulares llamados Ab2\beta encajan dentro de los paratopos del Ab1 y expresan la imagen interna del antígeno asociado a tumor. Los Ab2\beta pueden inducir respuestas inmunes específicas similares a las inducidas por el antígeno asociado a tumor original y, por lo tanto, pueden ser utilizados como antígenos subrogados asociados a tumor. La inmunización con Ab2\beta puede llevar a la generación de anticuerpos anti anti-idiotipo (Ab3) que reconocen al correspondiente antígeno asociado a tumor original, identificado como Ab1. Debido a esta reactividad de tipo Ab1, el Ab3 es llamado también Ab1', para indicar que podría diferir del Ab1 en sus otros idiotopos.

Un enfoque potencialmente prometedor al tratamiento del cáncer es la inmunoterapia empleando anticuerpos anti-idiotipo. En esta forma de terapia es administrado un anticuerpo mimetizando un epítope de una proteína asociada a tumor, en un esfuerzo para estimular el sistema inmune del paciente contra el tumor, por medio de la proteína asociada a tumor. En WO 91/11465 se describen métodos de estimulación de una respuesta inmune en un humano contra células malignas o un agente infeccioso utilizando anticuerpos anti-idiotipo de primate. Sin embargo, no todos los anticuerpos anti-idiotipo pueden ser utilizados en regímenes terapéuticos contra tumores. Primeramente, sólo una fracción de los anticuerpos cultivados contra un Ab1 se encuentra limitada en su reactividad al paratopo del Ab1 (es decir, no es reactiva contra características compartidas con otros anticuerpos potenciales en el huésped). En segundo lugar, los anticuerpos anti-idiotipo no son necesariamente inmunogénicos. En tercer lugar, incluso si un anti-idiotipo provoca una respuesta inmune, únicamente una fracción de estos anti-idiotipos inmunogénicos provoca una respuesta inmune contra el antígeno tumoral y no contra otros antígenos con menor especificidad. Por otra parte, debido a que los diferentes cánceres poseen una amplia variedad de características moleculares y clínicas, se ha sugerido que la terapia anti-idiotipo debería ser evaluada caso por caso, en términos de origen tumoral y antígenos expresados.

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Han sido utilizados como substitutos antigénicos en pacientes con cáncer anticuerpos monoclonales anti-id asemejándose estructuralmente a antígenos asociados a tumor. Herlyn et al. (1987) PNAS 84:8055-8059; Mittleman et al. (1992) PNAS 89:466-470; Chatterjee et al. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 690:376-377. Ha sido propuesto que el anti-id proporciona un análogo parcial del antígeno asociado a tumor en un contexto inmunogénico.

Los glóbulos grasos en la leche humana (HMFG) son glóbulos grasos en leche secretados en la leche mamaria por la célula epitelial mamaria, y están compuestos por gotas de grasa recubiertas por membrana plasmática. Como tal, el HMFG es una fuente rica en antígenos asociados a la membrana epitelial. Un componente del antígeno del HMFG es una mucina asociada a la membrana con un alto peso molecular, que se encuentra asociada al cáncer de pecho y a otros cánceres, tales como el de ovarios, pulmón y páncreas. La mucina contiene una proteína con secuencias aminoacídicas conocidas derivada del ADNc. El HMFG semipurificado se encuentra disponible en pequeñas cantidades procedente de distintas fuentes y puede ser utilizado en ensayos serológicos. Peterson et al. (1990) Hybridoma 9:221-235. Sin embargo, el HMFG es extremadamente difícil de aislar y purificar, y el HMFG purificado no se encuentra disponible para inmunización de pacientes o estudios con animales. Además, puesto que algunos de los epítopes en el HMFG son compartidos por los tejidos normales, específicamente por las glicoproteínas no penetrantes, la inmunización con la molécula intacta del HMFG podría desencadenar reacciones autoinmunes potencialmente perjudiciales. Una reacción inmune contra un epítope asociado a tumor, por otra parte, sería mucho más deseable.

Han sido descritos una serie de anticuerpos monoclonales murinos (mAbs) que reconocen componentes del HMFG, los cuales están asociados sobre todo con los carcinomas humanos de pecho y no con la mayoría de los tejidos normales. Chatterjee et al. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 690:376-377; Ceriani et al. (1983) Somatic Cell Genet. 9:415-427. Entre estos mAbs, el MC-10 (BrE-1) es el más restringido y específico, reaccionando con una proteína del tipo de la mucina con un gran peso molecular (MW 400.000) presente en alta densidad y en más del 80% de células de cáncer de pecho, y es mínimamente expresado en unos pocos tejidos normales, tales como el recubrimiento epitelial del pulmón y los túbulos renales. Ceriani et al. (1983); Ceriani et al. (1990) Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 3:181-198.

El cáncer de pecho recurrente no es curable por medio de terapias estándar. De esta forma, son necesarios nuevos enfoques terapéuticos para esta enfermedad. La presente invención supera las deficiencias existentes hasta ahora en este campo al proporcionar un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal (11D10) como un antígeno (Ag) que provoca una respuesta inmune contra el HMFG en primates no humanos, lo cual puede ser útil para el tratamiento de la inmunidad anti tumoral en pacientes con cáncer asociado al HMFG en estado avanzado (como el cáncer de pecho).

Todas las publicaciones aquí citadas son incorporadas aquí en su totalidad como referencia.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal murino, 11D10, el cual es capaz de provocar una respuesta inmune contra una mucina de alto peso molecular del glóbulo graso en la leche humana (HMFG). Esta invención abarca también los polipéptidos comprendiendo, al menos, una parte de una región variable de un anticuerpo anti-idiotipo 11D10 y polinucleótidos codificando estos polipéptidos. La invención incluye también composiciones farmacéuticas y vacunas comprendiendo el 11D10, polipéptidos 11D10 y/o polinucleótidos 11D10. También se encuentran incluidos en la presente invención kits de diagnóstico y métodos de utilización del 11D10, de los polipéptidos 11D10 y/o de los polinucleótidos 11D10, incluyendo métodos de tratamiento de tumores asociados al HMFG.

Adicionalmente, un objetivo de la invención es proporcionar una composición y un método de utilización de polinucleótidos y polipéptidos 11D10 monoclonales anti-idiotipo (anti-id), con el fin de inducir la inmunidad antitumoral en pacientes con una enfermedad asociada al HMFG, como el cáncer de pecho.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención incluye un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal 11D10 producido por una línea celular hibridoma ATCC nº 12020 o una progenie de la misma.

En otro aspecto, la invención incluye una línea celular hibridoma llamada ATCC nº 12020 y la progenie de la misma.

En otro aspecto, la invención incluye también polinucleótidos aislados comprendiendo una secuencia codificando un polipéptido que posee la actividad inmunológica del anticuerpo anti-idiotipo monoclonal 11D10, en donde el polipéptido comprende, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una región variable del 11D10.

En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos aislados que están compuestos de una región de, al menos, 15 nucleótidos contiguos, siendo capaz dicha región de formar un dúplex estable con un polinucleótido consistente en la secuencia codificadora variable de cadena ligera de la SEC. ID. Nº 1, bajo condiciones donde la región no forma un híbrido estable con las SEC. ID. desde la Nº 5 a la Nº 14. La invención proporciona también polinucleótidos aislados que están compuestos de una región de, al menos, 15 nucleótidos contiguos, siendo capaz dicha región de formar un dúplex estable con un polinucleótido consistente en la secuencia codificadora variable de cadena pesada de la SEC. ID. Nº 3, bajo condiciones donde la región no forma un híbrido estable con las SEC. ID. desde la Nº 15 a la Nº 32.

Otro aspecto de la invención es el de vectores de clonaje y expresión comprendiendo los polinucleótidos de la invención. También se encuentran incluidas células huésped comprendiendo los polinucleótidos de la invención.

Otro aspecto de la invención son los polipéptidos que poseen la actividad inmunológica del anticuerpo anti-idiotipo monoclonal 11D10, en donde el polipéptido comprende una secuencia de, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una región variable del 11D10.

En otro aspecto, son proporcionados polipéptidos 11D10 que contienen una región de homología con el HMFG.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos de fusión comprendiendo un polipéptido(s) 11D10. También incluidos en la invención se encuentran los polipéptidos 11D10 poliméricos, así como anticuerpos humanizados comprendiendo un polipéptido(s) 11D10.

En otro aspecto, la invención incluye composiciones farmacéuticas y vacunas comprendiendo una cantidad efectiva del 11D10, del polipéptido(s) 11D10, y/o del polinucleótido(s) 11D10.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para provocar una respuesta inmune anti-HMFG en un individuo con enfermedad asociada al HMFG en estado avanzado, comprendiendo la fase de administración al individuo de una cantidad efectiva del 11D10, del polinucleótido(s) y/o del polipéptido(s) 11D10.

Otro aspecto de la invención es el de métodos para eliminar el anticuerpo marcado anti-glóbulo graso en leche humana (HMFG) procedente de un individuo que ha recibido anticuerpo anti-HMFG marcado, comprendiendo los métodos la administración del 11D10.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la detección de la presencia de un anticuerpo anti-HMFG unido a una célula tumoral, comprendiendo las fases de puesta en contacto de la célula tumoral con el 11D10 durante un tiempo suficiente como para permitir la unión al anticuerpo anti-HMFG, y la detección de la presencia de cualquier 11D10 que se encuentre unido al anticuerpo anti-HMFG.

En otro aspecto, son proporcionados métodos para la detección de respuesta inmunológica anti-HMFG en un individuo. Estos métodos comprenden la puesta en contacto de una muestra biológica procedente de un individuo con el 11D10, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo estable entre el 11D10 y un anticuerpo que se una al 11D10, y la detección de cualquiera de los complejos estables formados.

En otro aspecto, son proporcionados métodos para la detección de un anticuerpo que se una al 11D10 en una muestra biológica. Estos métodos conllevan las fases de puesta en contacto del anticuerpo procedente de la muestra obtenida de un individuo con un 11D10, o con un polipéptido 11D10, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo estable de antígeno-anticuerpo, y la detección del complejo estable formado, si existe.

Otro aspecto de la invención son métodos para paliar la enfermedad asociada a la globulina de la grasa de la leche humana en un individuo poseyendo una enfermedad asociada a la globulina de la grasa de la leche humana en estado avanzado. Estos métodos conllevan la administración al individuo de una cantidad efectiva del 11D10.

En otro aspecto, la invención proporciona también kits para la detección o cuantificación, comprendiendo 11D10, polipéptido(s) 11D10 o polinucleótido(s) 11D10 en embalaje adecuado.

Lo anterior y otros objetivos de la invención serán fácilmente evidentes para aquéllos expertos en este campo, conforme a la siguiente descripción detallada y cifras, en donde únicamente son mostradas y descritas las realizaciones preferidas de la invención, simplemente a modo de ilustración de la mejor manera de llevar a cabo la invención. Como es fácilmente reconocido, la invención es capaz de modificaciones dentro del ámbito del campo en cuestión, sin apartarse del espíritu y ámbito de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de ADNc (SEC. ID. Nº 1) y la secuencia aminoacídica (SEC. ID Nº 2) de la región variable de cadena ligera del 11D10 y residuos adyacentes. Se encuentran indicadas las regiones CDRs y marco. La traducción correcta debería mostrar A, o alanina, para el aminoácido 18, y E, o ácido glutámico para el aminoácido 81 (SEC. ID. Nº 2).

La Figura 2 representa la secuencia de ADNc (SEC. ID. Nº 3) y la secuencia aminoacídica (SEC. ID. Nº 4) de la región variable de cadena pesada del 11D10 y residuos adyacentes.

La Figura 3 representa las secuencias aminoacídicas de la región variable de cadena ligera (aminoácidos 1-107 de la SEC. ID. Nº 2; Fig. 3A) y la región variable de cadena pesada (aminoácidos 1-118 de la SEC. ID. Nº 4; Fig. 3B) del 11D10. Cada región variable consiste en 4 regiones marco y 3 CDRs. Para la Figura 3A, la traducción correcta debería mostrar E, o ácido glutámico, para el aminoácido 81.

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La Figura 4 representa 10 secuencias de polinucleótido que fueron las más coincidentes con la secuencia codificadora de la región variable de cadena ligera del 11D10 en una búsqueda de base de datos. Estas secuencias tienen las denominaciones de SEC. ID. Nº 5 a SEC. ID. Nº 14.

La Figura 5 representa 10 secuencias nucleótidas que son las más coincidentes con la secuencia codificadora de la región variable de cadena pesada del 11D10, en una búsqueda de base de datos. Estas secuencias tienen las denominaciones de SEC. ID. Nº 15 a SEC. ID. Nº 32. Los guiones corresponden a regiones omitidas que no son homólogas a la SEC. ID. Nº 3.

La Figura 6 e un gráfico de barras representando especificidades anti-id del 11D10 (IgG1, \kappa). Fue determinada la unión del 11D10 marcado con 125l (\sim25.000 cpm) con varias proteínas monoclonales murinas y anticuerpos anti-HMFG (TAA de pecho) utilizando un RIA directo. Los isotipos de las proteínas monoclonales son: MC-10 (BrE-1, IgG2b, \kappa), primera barra; 1E3 (IgGl, \kappa), segunda barra; 4DC6 (IgG1, l), tercera barra; BrE-3 (IgG1, \kappa), cuarta barra; clon Hy IgG2b, quinta barra; clon Hy IgG3, \kappa, sexta barra; IgG3, clon Hy IgA, séptima barra; y MOPC 104E (IgM, l), octava barra; RWP1-1 (IgG2b, \kappa), novena barra.

La Figura 7 es un gráfico representando la inhibición de la unión MC-10 (BrE-1) con células MCF-7 y SKBR3 por medio de Ab2 purificado. Los círculos negros indican el 11D10 compitiendo para unirse a células MCF-7; los círculos blancos indican la unión del 11D10 con células SKRB3; los cuadrados blancos indican la unión del 3H1 con células MCF-7 o SKBR3.

La Figura 8 es un gráfico representando la unión de suero Ab3 policlonal absorbido murino y de conejo, así como del mAb3, con la línea celular SKBR3 de carcinoma de pecho por medio de ELISA. Los círculos blancos indican 11D10-2F7 (mAb3); los círculos negros indican suero Ab3 murino; los triángulos blancos indican suero Ab3 de conejo; los cuadrados blancos indican 1E3 de control.

La Figura 9 es un gráfico representando la inhibición de la unión del MC-10 (BrE-1) con células SKBR3 por medio de mAb3 y de suero Ab3 policlonal murino y de conejo. Los círculos negros indican suero de conejo (Ab3) (nº 123); los círculos blancos indican 11D10-2F7 (mAb3); los cuadrados blancos indican suero Ab3 murino; los triángulos blancos indican suero pre-inmune (control).

La Figura 10 es una reproducción de medio tono de un análisis transblot de HMFG sobre papel de nitrocelulosa con mAb1 y mAb3. La franja 1, MC-10 (10 \mug/ml); la franja 2, 1E3 IgG1 (control; 50 \mug/ml); la franja 3, mAb3 IgG1 (50 \mug/ml).

La Figura 11 es un gráfico representando el nivel de expresión de anticuerpos reactivos anti-id 11D10 en el suero de pacientes con cáncer de pecho.

La Figura 12 es un gráfico representando la inhibición de la unión Ab1 (mAb MC-10) con el 11D10 (Ab2) por medio de suero Ab3 (PRO 723) de mono por medio de RIA. Los círculos negros indican el suero después de 3 inmunizaciones; los círculos blancos indican el suero después de 2 inmunizaciones; los cuadrados negros indican el suero después de 1 inmunización; las cruces indican el suero pre-inmune.

La Figura 13 es un gráfico de barras representando la unión de suero Ab3 de mono con la línea celular MCF-7 de cáncer de pecho por medio de ELISA. La barra con rayas separadas indica el suero pre-inmune; la barra rayada denota el suero inmune; la barra sombreada indica el suero control. La línea de puntos indica la unión del suero Ab3 de mono con la línea celular de melanoma M21/P6.

La Figura 14 es un gráfico de barras representando la unión del suero Ab3 de mono con el HMFG semi-purificado por medio de ELISA. La primera barra, suero inmune; la segunda barra, suero pre-inmune; la tercera barra, suero de control; la cuarta barra, albúmina sérica bovina (BSA).

Las Figuras 15A y 15B representan el análisis inmune mediante citometría de flujo de las células MCF-7 con suero Ab3 de mono. En la Figura 15A, las células tumorales fueron hechas reaccionar con suero pre-inmune y suero Ab3 (dilución 1:100) procedente de monos inmunizados con 11D10. En la Figura 15B, células MOLT-4 que no expresan el HMFG fueron hechas reaccionar con suero Ab3 de mono pre-inmune e inmune preparado contra el 11D10.

La Figura 16 es un gráfico de barras representando la unión del Ab3 de mono purificado con HMFG o con CEA purificado por medio de ELISA. La parte izquierda de la figura representa placas recubiertas con HMFG; la parte derecha de la figura representa placas recubiertas con CEA. Para la parte izquierda de la figura, la primera barra indica el Ab3; la segunda barra indica el Ab3 de control; la tercera barra indica el PBS-BSA. Para la parte derecha de la figura, la primera barra indica el Ab3; la segunda barra indica el PBS-BSA; la tercera barra indica el anti-CEA.

La Figura 17 es una reproducción de medio tono de un análisis slot blot con HMFG o CEA purificado. Una membrana de difluoruro de polivinilideno fue empapada con diferentes concentraciones de HMFG (Franjas 1 y 2) y de CEA (Franjas 3 y 4). Las membranas fueron incubadas con Ab1 (Franja 1), Ab3 purificado (Franjas 2 y 3), y mAb anti-CEA (un Ab1 de control) (Franja 4).

La Figura 18 es un gráfico representando la inhibición de la unión de Ab1 con células MCF-7 por medio de Ab3 purificado. Los círculos blancos indican el Ab3 purificado procedente de mono inmunizado con 11D10; los círculos negros indican el Ab3 purificado de control procedente de mono inmunizado con 3H1 de control.

La Figura 19 es un gráfico de barras representando un ensayo de proliferación de células T con células mononucleares sanguíneas periféricas de mono (PBM). La parte de la izquierda del gráfico indica las PBMs estimuladas con 11D10; la parte derecha del gráfico indica las PBMs estimuladas con 3H1. Para cada parte (mitad), la caja de la izquierda indica las PBMs procedentes del mono nº 872; la parte de la derecha indica las PBMs procedentes del mono nº 723. Las barras blancas indican el suero pre-inmune; las barras negras indican el suero después de inmunizar.

La Figura 20 es un gráfico representando la reactividad del Ab3 en suero de un paciente (paciente nº 1) después de la administración del 11D10, conforme es medido por medio de radioinmunoensayo. Los círculos blancos indican el suero pre-inmune; los círculos negros indican el suero después de inmunizar.

La Figura 21 es un gráfico representando la inhibición de la unión de Ab1 con el 11D10 por medio del suero de un paciente (paciente nº 1). Los círculos blancos indican suero pre-inmune; los círculos negros indican el suero después de inmunizar.

La Figura 22 es un gráfico de barras representando la proliferación de células T por medio de linfocitos sanguíneos periféricos procedentes de un paciente. Para cada par de barras, la barra blanca indica células pre-inmunes; la barra negra indica células después de la inmunización. Los estimulantes testados son: medio de cultivo, primer par de barras; 11D10, segundo par de barras; 3H1, tercer par de barras; PHA, cuarto par de barras.

La Figura 23 representa comparaciones de secuencia aminoacídica seleccionadas entre las regiones variables de cadena ligera (aminoácidos 41-60, 34-56 y 85-107 de la SEC. ID. Nº 2) y pesada (aminoácidos 43-62 de la SEC. ID. Nº 4) del 11D10, y repeticiones en tándem del HMFG (SEC. ID. Nº 33 y SEC. ID. Nº 34). Los aminoácidos que coinciden son indicados por medio de una línea negra.

La Figura 24 representa el esquema para la construcción de pVV, un vector vaccinia genérico (plásmido) para la expresión de polinucleótidos 11D10. La caja oscurecida indica el gen TK vaccinia; la caja rayada indica el promotor vaccinia de 7,5 K. Los sitios de restricción son: A, Apa I; Ns, Nsi I; C, Cla I; E, Eco RI; P, Pst I; Nc, Nco I; Sm, Sma I. (E) y (C) indican sitios potenciales para EcoRI y ClaI, respectivamente. Son indicados tres codones de terminación por medio de S1, S2 y S3. VL y VR representan secuencias que flanquean a vaccinia por la derecha y por la izquierda. TK y K 7,5 fueron obtenidos por medio de PCR, utilizando ADN procedente de la cepa WR de tipo salvaje de
vaccinia.

La Figura 25 representa plásmidos adecuados para la producción de una proteína fusión 11D10 (Figura 25A) y de una quimera (Figura 25B).

La Figura 26 (A-C) es un listado en el cual las secuencias aminoacídicas de la región variable del 11D10 son comparadas con 15 secuencias inmunoglobulínicas de cadena ligera y de cadena pesada obtenidas de una búsqueda en la base de datos GenBank. El Panel A muestra las secuencias más próximas a la región variable de cadena ligera del 11D10 maduro (contenida en la SEC. ID. Nº 2); el Panel B muestra las secuencias más próximas a la región variable de cadena pesada del 11D10 maduro (contenida en la SEC. ID. Nº 4). Los residuos que son idénticos al 11D10 son indicados por medio de un punto (.); los huecos introducidos para mejorar el alineamiento alrededor de la unión VDJ de la cadena pesada son indicados por medio de guiones (=). El panel C muestra secuencias consenso de la región variable para las cadenas ligera y pesada (SEC. ID. Nº 47 y SEC. ID. Nº 48) y las compara con las secuencias del 11D10. La región variable del 11D10 muestra diferencias de empalme únicas alrededor de la unión VDJ de la cadena pesada y, adicionalmente, una diferencia adicional de 18 puntos en relación con las secuencias prototipo localizadas tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada.

Las Figuras 27A y 27B son gráficos representando la inhibición de la unión del Ab1 con el 11D10 procedente de suero de pacientes. La Figura 27A muestra información de los pacientes nº 1 (cuadrado blanco), nº 2 (diamante blanco), nº 3 (círculo blanco), nº 5 (triángulo blanco) y nº 7 (cuadrado con rayas). La Figura 27B muestra información de los pacientes nº 6 (cuadrado blanco), nº 8 (diamante blanco), nº 9 (círculo blanco), nº 11 (triángulo blanco) y nº 12 (cuadrado con rayas). Los círculos blancos indican suero pre-inmune; los círculos negros indican el suero después de inmunizar.

La Figura 28 es un gráfico de barras representando la reactividad del Ab3 purificado por afinidad procedente del suero de pacientes después de la administración del 11D10, conforme es medido por medio de radioinmunoensayo (RIA; pacientes nº 5 (primer par de barras), nº 6 (segundo par de barras) y nº 1 (tercer par de barras)). El cuarto par de barras ("X") indica un Ab3 no emparentado del paciente. El quinto par de barras indica el MC10; el sexto par de barras indica solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por cada par de barras, la barra negra indica IgG y la barra blanca indica IgM. Los círculos blancos indican suero pre-inmune; los círculos negros indican suero después de inmunizar.

Las Figuras 29A y 29B son gráficos de barras representando la proliferación de células T por medio de linfocitos sanguíneos periféricos de pacientes. Por cada par de barras, la barra blanca indica células pre-inmunes; la barra negra (o sombreada) indica células después de inmunizar. La Figura 29A muestra información del paciente nº 1. La Figura 29B muestra información del paciente nº 5. Los estimulantes testados fueron: 11D10, primer par de barras; 4DC6, segundo par de barras; PHA, tercer par de barras; medio de cultivo, cuarto par de barras.

Modos de llevar a cabo la invención

Hemos descubierto un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal, 11D10, el cual escapa de la tolerancia inmune e induce una respuesta inmune específica contra un epítope distinto y específico del glóbulo graso en leche humana (HMFG), un antígeno asociado al cáncer de pecho. La respuesta inmune provocada por el 11D10 comprende, usualmente, tanto respuestas humorales como celulares. De esta forma, se espera que el 11D10 sea útil en el tratamiento de la enfermedad asociada al HMFG. Ha sido depositado un hibridoma que produce 11D10 en la American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, U.S.A. 20852 el 17 de enero de 1996, bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a Efectos del Procedimiento de Patentes. Le fue concedido el número de acceso 12020. Una descripción completa del 11D10, incluyendo su generación y caracterización, es encontrada en la solicitud de patente de dominio público, número de serie 08/575.762 (U.S. Número de Solicitud Provisional ..................... ; número de matrícula de agente 30414-20003.00).

Los pacientes con cáncer son a menudo inmunosuprimidos y tolerantes a distintos antígenos asociados a tumor (TAA), incluyendo el HMFG. El desencadenar una respuesta inmune activa ante tales TAA representa un importante reto en la terapia contra el cáncer. Los presentes inventores utilizan un enfoque de teoría de redes ante la terapia por vacuna, utilizando imagen interna de los antígenos. La inmunización con un antígeno dado genera la producción de anticuerpos contra el antígeno. Conforme es aquí utilizado, "Ab1" representa al anticuerpo monoclonal antitumoral; "Ab2" representa al anticuerpo monoclonal anti-idiotípico; y "Ab3" representa al anticuerpo monoclonal anti anti-idiotípico.

Hemos encontrado que el 11D10 es efectivo a la hora de provocar una respuesta inmune (humoral y/o celular) contra el HMFG en todos los mamíferos testados, en los cuales el HMFG no es un autoantígeno. Es importante el que hayamos descubierto también que el 11D10 provoca una respuesta inmune en pacientes con una enfermedad asociada al HMFG en estado avanzado, particularmente el cáncer de pecho. Esto es especialmente significativo ya que muchos de estos pacientes, tanto debido a la naturaleza de su tratamiento previo como a su enfermedad, o a ambos, se encuentran moderada o seriamente en peligro y, a menudo, recibieron el 11D10 como una opción final. Aun sin desear verse constreñido a una determinada teoría, una forma de que tenga lugar la provocación de una respuesta inmune es que el sitio de combinación del 11D10 pueda presentar una región que se asemeje parcialmente a un epítope en el HMFG, en el contexto de otros epítopes que lo vuelven más inmunogénico. El epítope del HMFG que se asemeja al del 11D10 es identificado por medio del mAb MC-10 (Ab1) anti-HMFG, el cual reconoce un epítope distinto y específico en el HMFG, y fue utilizado para inmunizar ratones BALB/c singenéicos para la producción del mAb anti-id 11D10. Estos estudios indican que el anticuerpo de esta invención es útil para la generación de una respuesta inmune y el tratamiento de una enfermedad asociada al HMFG, como el cáncer de pecho, en un individuo con la enfermedad en estado avanzado. También creemos que el 11D10 será efectivo en el tratamiento de una enfermedad asociada al HMFG en individuos con una alta carga tumoral. Es útil también para la detección del Ab1 y/o del Ab3.

Hemos descubierto también secuencias de polinucleótidos codificando las regiones variables del 11D10 y los fragmentos de polipéptido del 11D10 codificados por las mismas. De esta forma, la presente invención abarca las secuencias de polinucleótido codificando el anticuerpo anti-idiotipo 11D10 y fragmentos equivalentes funcionales del mismo, fragmentos de polipéptido del 11D10, métodos recombinantes para la producción de estos polinucleótidos y polipéptidos 11D10, composiciones farmacéuticas y de vacuna comprendiendo polinucleótidos y polipéptidos 11D10, kits de diagnóstico comprendiendo polinucleótidos y polipéptidos 11D10 y métodos utilizando polipéptidos 11D10 y/o polinucleótidos 11D10. Estos polipéptidos y polinucleótidos son útiles para la valoración y tratamiento de una enfermedad asociada al HMFG, como el cáncer de pecho. Estos y otros usos de los polinucleótidos 11D10 y polipéptidos 11D10 de esta invención serán expuestos más abajo en detalle.

No han sido determinadas las secuencias completas de las regiones constantes de cadena ligera y pesada del 11D10, pero se espera que sean idénticas, o casi idénticas, a aquéllas de otras moléculas inmunoglobulínicas murinas.

Para la región constante de la cadena ligera kappa murina han sido publicados por Solin et al. (1993) Immunogenetics 37:401-407 cuatro alotipos genéticos codificando dos alotipos proteínicos, lo cual es incorporado aquí como referencia. La Figura 1 de Solin et al. representa secuencias génicas de cadena kappa de inmunoglobulina de ratón y rata, comparando las secuencias dentro de la región constante de la cadena kappa para diferentes cepas y poniendo de relieve las diferencias alotípicas. Están incluidas secuencias de la región constante de la cadena kappa para BALB/c, PL, SJL y M. spretus. Son posibles otros alotipos que tienen lugar en la naturaleza.

La secuencia de ADN de la región constante de la cadena pesada \gamma1 murina procedente de ratones recién nacidos ha sido publicada por Honjo et al. (1979) Cell 18:559-568, la cual es incorporada aquí como referencia. La Figura 5 de Honjo et al. muestra la secuencia de ADN de la línea germinal, junto con la secuencia proteínica codificada. Mostrada en la línea de más arriba se encuentra otra secuencia proteínica obtenida del mieloma murino MOPC21. Son posibles otros alotipos que tienen lugar en la naturaleza.

Entre las 10 secuencias de ADN de la base de datos que encajaron mejor con la de la región variable de la cadena ligera del 11D10, ninguna fue idéntica. Había alrededor de 8 a 27 diferencias con la secuencia de ADN del 11D10, correspondiendo a alrededor de 6 a 17 diferencias aminoacídicas. La sexta secuencia encajada (llamada >gb/M59920/MUSIQKAA3) fue una secuencia de tipo germinal VJ kappa murina y, probablemente, representa el gen prototipo del cual fue derivada la cadena ligera del 11D10. Las secuencias de ADN del 11D10 difieren de la secuencia germinal en 14 posiciones, correspondiendo a alrededor de 7 diferencias de punto aminoacídicas.

Entre las 10 secuencias de ADN de la base de datos que encajaron mejor con la de la región variable de la cadena pesada del 11D10, ninguna fue idéntica. Nueve de las 10 secuencias fueron de 3 a 12 pares de bases más largas, debido a diferencias de empalme dentro de la unión VDJ. Además, hubo alrededor de 15 a 43 diferencias de punto en comparación con la secuencia de ADN del 11D10 fuera de la unión, correspondiendo a alrededor de 11 a 23 diferencias aminoacídicas.

De esta forma, hubo al menos alrededor de 18 diferencias aminoacídicas entre las secuencias aminoacídicas codificadas por los ADNs del 11D10 y aquéllas codificadas por los ADNs que encajaban mejor dentro de la base de datos. Las diferencias de punto probablemente han aparecido por mutación somática de las secuencias germinales durante el desarrollo de la célula productora de anticuerpos en el animal utilizado para generarla.

Las secuencias aminoacídicas de la región variable del 11D10 fueron comparadas con aquéllas de otras moléculas inmunoglobulínicas conocidas (Ejemplo 2). Tanto las secuencias de la región variable del polipéptido de cadena ligera como el de cadena pesada para el 11D10 son únicas.

Entre las 50 secuencias aminoacídicas de la base de datos que encajaron mejor con la de la región variable de la cadena ligera del 11D10, ninguna fue idéntica. El 11D10 difirió de las quince secuencias que encajaron mejor por un mínimo de 7, y un promedio de alrededor de 12, diferencias de substitución, lo cual comprendió substituciones no conservadoras a todo lo largo de la región variable.

Entre las 50 secuencias aminoacídicas de la base de datos que encajaron mejor con la de la región variable de la cadena pesada del 11D10, ninguna fue idéntica. Lo siguiente resume los puntos principales deducidos de la comparación.

La secuencia que encajó mejor poseía 11 substituciones entre los residuos 1 y 98 (delante de la unión VDJ), 7 diferencias de substitución después del residuo 98.

El 11D10 difirió en cuanto a longitud de 1 a 5 residuos, en relación con la mayoría de las secuencias de cadena pesada.

Hubo un promedio de alrededor de 30 diferencias de inserción, supresión y substitución entre el 11D10 y las 50 secuencias encajadas.

La Figura 26 del Panel C proporciona una comparación de las secuencias de cadena ligera y pesada aminoacídicas del 11D10, con secuencias consenso derivadas de las secuencias de la base de datos. Existen, al menos, 18 diferencias, distintas de las diferencias de empalme alrededor de la unión VDJ de la cadena pesada, entre el 11D10 y las secuencias consenso, que han surgido probablemente de mutación somática durante la maduración del anticuerpo. Tienen lugar diferencias de punto a lo largo de la región variable de la cadena ligera y de la pesada.

Particularmente de interés para el desarrollo de derivados del 11D10 con actividad inmunológica 11D10 son las regiones de la secuencia del polinucleótido o del polipéptido 11D10 comprendiendo una parte de la unión VDJ de la cadena pesada. Son también de interés las regiones que atraviesan al menos una, preferiblemente 2, más preferiblemente 3 o más de las diferencias de punto entre las secuencias aminoacídicas 11D10 o las secuencias aminoacídicas codificadas por las SEC. ID. desde la Nº 5 a la Nº 32.

Los materiales y procesos útiles de la presente invención han sido posibles gracias al 11D10 y a las secuencias de polinucleótido codificando el 11D10. Estas secuencias permiten el diseño de polipéptidos que pueden ser útiles, por ejemplo, como vacunas para el tratamiento de una enfermedad asociada al HMFG, o como reactivos para la detección de la presencia del Ab1 y/o del Ab3. Además, estas secuencias permiten diseñar polinucleótidos, los cuales son útiles como sondas e iniciadores para la detección y amplificación de regiones diana del 11D10, así como polinucleótidos 11D10 que son útiles como vacunas.

Definiciones

Conforme son utilizados aquí, los términos "11D10", "anticuerpo 11D10" y "anticuerpo monoclonal 11D10" son utilizados de forma intercambiable para referirse a la inmunoglobulina producida por la línea celular hibridoma 11D10 depositada en la ATCC. La generación y caracterización del 11D10 son descritas en el Ejemplo 1. El 11D10 es un anticuerpo anti-idiotipo (Ab2), el cual contiene un epítope que, al menos parcialmente, se asemeja a un epítope distinto y específico del glóbulo graso en leche humana (HMFG), principalmente expresado en una alta densidad por las células carcinoma del pecho. Son asociadas al 11D10 distintas funciones biológicas, incluyendo, aunque sin estar limitadas a las mismas, la unión al Ab1 y/o al Ab3, y una habilidad para inducir una respuesta inmune (humoral y/o celular) contra el HMFG. A no ser que se especifique de otra forma, el término "11D10 intacto" se refiere a la secuencia aminoacídica de la molécula completa del 11D10. Un "fragmento" del 11D10 es una parte del 11D10. También están incluidos en la definición del "11D10" fragmentos producidos por medio de clivaje enzimático y/o tratamiento químico del anticuerpo intacto, que comprenden tanto las regiones variables completas de cadena ligera como las de cadena pesada del 11D10, y son capaces de unirse al MC-10 en un inmunoensayo estándar, tales como el Fab, F(ab')2 y F(ab').

Conforme es utilizado aquí, "actividad inmunológica" del 11D10 se refiere a cualquiera de las siguientes actividades: (a) habilidad para unirse al Ab1 (MC-10); (b) habilidad para inhibir la unión del 11D10 con el MC-10 (Ab1), o del MC-10 con el HMFG, de una manera específica; o (c) la habilidad de provocar una respuesta inmune específica, particularmente una respuesta de anticuerpo (humoral), y/o una respuesta de células T, y las funciones efectoras resultantes de ello. Incluidas en una respuesta de anticuerpos se encuentran las funciones mediadas por anticuerpos, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La respuesta de células T incluye la función de las células T de ayuda, la función de células T citotóxicas, células T inductoras de inflamación, y supresión de células T. La actividad inmunológica es medible utilizando métodos estándar conocidos en este campo, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), fijación del complemento, opsonización, detección de proliferación de células T, y distintos ensayos de liberación de Cr51. Estos métodos son conocidos en este campo y están descritos aquí inter alia. Un compuesto capaz de provocar una respuesta inmune específica conforme a cualquiera de estos criterios es referido como "inmunogénico". "Inmunogenicidad" se refiere a una capacidad de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular
específica.

"Actividad", "función(es)" o "característica(s)" 11D10 son usados de forma intercambiable y se refieren a distintos rasgos del 11D10. Ejemplos de función(es) 11D10 incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, la unión al Ab1 y/o al Ab3, la inducción del Ab3 y/o la inducción de una respuesta inmune celular, preferiblemente una respuesta anti-HMFG, y la mejora, o efecto paliativo, de una enfermedad asociada al HMFG.

Un anticuerpo que posee "características de identificación" que son idénticas a las de otro anticuerpo, significa que un anticuerpo posee propiedades estructurales (es decir, físicas) y/o funcionales (es decir, químicas) que son las mismas que las de otro anticuerpo. De forma similar, un hibridoma poseyendo "características de identificación" de una célula de una línea celular hibridoma, es un hibridoma que posee propiedades estructurales y/o funcionales que son las mismas que las de la línea celular hibridoma con la cual es comparado. A efectos de la presente invención, características de identificación de un anticuerpo incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, aquéllas asociadas con el 11D10, conforme es indicado más arriba; características de identificación de un hibridoma son aquéllas asociadas con un hibridoma que produce el 11D10.

Una "región variable" del 11D10 se refiere a la región variable de la cadena ligera del 11D10, o a la región variable de la cadena pesada del 11D10, tanto por separado como en combinación.

GM-GSF, IL-2 y otras moléculas biológicamente activas aquí referidas se pretende que incluyan fragmentos y derivados basados en la molécula progenitora respectiva que tiene la misma función biológica o fisiológica.

Conforme es utilizado aquí, "progenie" de un hibridoma son los descendientes de un hibridoma, los cuales pueden, o no, ser completamente idénticos a la célula original (progenitora) debido a mutación u otra adaptación, pero que producen un anticuerpo monoclonal que mantiene la habilidad de escapar a la tolerancia inmune, es decir, de causar una reacción inmune contra el HMFG.

"HMFG" es una abreviatura del glóbulo graso en sangre humana. El HMFG posee varios componentes proteináceos (y, de esta forma, antigénicos). Conforme es utilizado aquí, se refiere a un extracto semi-purificado de una línea celular de cáncer de pecho expresando el HMFG, conforme es preparado por el método de Ceriani et al. ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:582-586), junto con substancias relacionadas antigénicamente, incluyendo el HMFG expresado en células cancerígenas de pecho y purificaciones más altamente purificadas. Contenida en el HMFG se encuentra una mucina con un peso molecular alto de secuencia aminoacídica conocida, un epítope de la cual es reconocido por el anticuerpo monoclonal MC-10 utilizado como Ab1 en la preparación del 11D10. Por consiguiente, la reactividad inmunológica anti-HMFG inducida por medio de la inmunización de un animal con el 11D10 une preferiblemente un epítope de polipéptido emparentado con el reconocido por el MC-10.

A los efectos de esta invención, "enfermedad asociada al HMFG" o "tumores asociados al HMFG" son estados de enfermedad o tumores que se encuentran asociados a un antígeno del HMFG, especialmente expresado en la superficie celular, que se une al MC-10 (Ab1).

Conforme es aquí utilizado, un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, los cuales contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o sus análogos. Los términos "polinucleótido" y "nucleótido", conforme son utilizados aquí, son usados de forma intercambiable. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye moléculas de hebra doble, sencilla y de triple hélice. A no ser que sea especificado o requerido de otra forma, cualquier realización de la invención aquí descrita que sea un polinucleótido comprende tanto la forma de doble hebra, como cada una de las dos formas complementarias de hebra sencilla conocidas o pronosticadas como integradoras de la forma de doble hebra.

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Los siguientes son ejemplos no limitadores de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y promotores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados, y análogos de nucleótidos. Son conocidos en este campo análogos de purinas y pirimidinas, e incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, la aziridinilcitosina, la 4-acetilcitosina, el 5-fluorouracilo, el 5-bromouracilo, el 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, el 5-carboximetil-aminometiluracilo, la inosina, la N6-isopenteniladenina, la 1-metiladenina, el 1-metilpseudouracilo, la 1-metilguanina, la 1-metilinosina, la 2,2-dimetilguanina, la 2-metiladenina, la 2-metilguanina, la 3-metilcitosina, la 5-metilcitosina, el pseudouracilo, el 5-pentiniluracilo y la 2,6-diaminopurina. La utilización de uracilo como un substituto de la timina en un ácido desoxirribonucleico es también considerada como una forma análoga de la pirimidina.

Si se encuentra presente, la modificación de la estructura nucleotídica puede ser realizada antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de los nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede ser modificado adicionalmente después de la polimerización, como por ejemplo al conjugarlo con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son, por ejemplo, "caps", substitución de uno o más de los nucleótidos que tienen lugar en la naturaleza por un análogo, modificaciones internucleótidas tales como, por ejemplo, aquéllas con ligandos no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con ligandos cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquéllas conteniendo restos dependientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquéllas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquéllas conteniendo queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, borón, metales oxidativos, etc.), aquéllas conteniendo alquiladores, aquéllas con ligandos modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido(s).

Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presente de forma ordinaria en los azúcares puede ser reemplazado por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados con soportes sólidos. Los grupos OH 5’ y 3’ terminal pueden ser fosforilados o substituidos por aminas o restos de grupos orgánicos con estructura "capping" de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos pueden ser derivatizados también a grupos protectores estándar.

Los polinucleótidos pueden contener también formas análogas de azúcares de ribosa o de desoxirribosa que son generalmente conocidos en este campo, incluyendo, aunque sin estar limitados a los mismos, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-,
2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos carbocíclicos del azúcar, azúcares \alpha-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como la metil ribosida.

Conforme es indicado más arriba, pueden ser reemplazados uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, realizaciones en donde el fosfato es reemplazado por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo substituido o no substituido conteniendo opcionalmente (1-20 C) y enlace éter(-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos.

Aunque serán utilizados a la hora de aplicar el método de la invención azúcares y bases convencionales, puede ser ventajosa la substitución de formas análogas de azúcares, purinas y pirimidinas a la hora de diseñar un producto final, como también lo pueden ser estructuras de soporte alternativas como un soporte de poliamida.

Un "fragmento" (también llamado una "región") de un polinucleótido 11D10 (es decir, un polinucleótido codificando el 11D10) es un polinucleótido compuesto de, al menos, 9 nucleótidos contiguos de una región variable del 11D10 (es decir, codificando, al menos, una parte de una región variable del 11D10). Los fragmentos preferidos están compuestos de una región codificando, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una región variable del 11D10, más preferiblemente, al menos, 10 aminoácidos contiguos de una región variable, y aún más preferiblemente, al menos, 15 aminoácidos contiguos de una región variable.

El término polinucleótido "recombinante", conforme es aquí utilizado, se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético, el cual, en virtud de su origen o manipulación: (1) no se encuentra asociado con un polinucleótido completo, o con parte del mismo, con el cual se encuentra asociado en la naturaleza, (2) está ligado a un polinucleótido distinto de aquél al que se encuentra ligado en la naturaleza, o (3) no tiene lugar en la naturaleza.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" son utilizados aquí de forma intercambiable para referirse a polímeros o aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede ser interrumpido por no aminoácidos. Los términos también comprenden un polímero aminoacídico que ha sido modificado naturalmente o por medio de intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tales como conjugado con un componente marcador. Se encuentran también incluidos dentro de la definición, por ejemplo, los polipéptidos conteniendo uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en este campo. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención están basados en un anticuerpo, los polipéptidos pueden aparecer como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

Un "fragmento" de polipéptido (también llamado una "región") del 11D10 es un polímero comprendiendo una secuencia aminoacídica del 11D10 que posee, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una secuencia del 11D10, más preferiblemente, al menos, 8 aminoácidos contiguos, y aún más preferiblemente, al menos, 10 aminoácidos contiguos, en donde, al menos, 3 de los aminoácidos proceden de una región variable del 11D10. Para los propósitos de esta invención, un fragmento del 11D10 puede ser identificado y caracterizado por medio de cualquiera de las funciones siguientes: (a) homología con el HMFG; (b) habilidad de unirse al Ab1 o al Ab3; (c) habilidad para provocar una respuesta inmune (es decir, respuesta humoral y/o celular), preferiblemente una respuesta inmune que sea anti-HMFG; (d) habilidad de causar mejora, retraso o ralentización de tumores asociados al HMFG, y/o mejora o efecto paliativo del estado de enfermedad asociado al HMFG. Los puntos (b), (c) o (d) entran dentro del término "inmunológicamente reactivo". Un fragmento de 11D10 puede poseer cualquiera, más de una o todas las funciones identificadas más arriba. Serán descritos más abajo métodos para determinar estas funciones, de la (a) a la (d).

Un polipéptido 11D10, el cual es "homólogo" al HMFG o "comparte homología" con el HMFG significa que, cuando las secuencias aminoacídicas del HMFG y las de un polipéptido 11D10 se encuentran alineadas de cualquier manera, incluida en la misma orientación, o en sentido inverso, entre sí, al menos 2, preferiblemente 3, más preferiblemente 4 aminoácidos contiguos dentro del polipéptido encajan con el HMFG. Debido a que los fragmentos peptídicos funcionales pueden ser muy pequeños para los propósitos de esta invención, únicamente pueden encajar unos pocos aminoácidos (por ejemplo, el número requerido de aminoácidos contiguos necesario para un sitio de unión y/o presentación de antígeno puede ser tan bajo como de 2 a 5 aminoácidos). Un polipéptido 11D10 que "contenga una región de homología" con el HMFG comparte homología con el HMFG dentro de su secuencia aminoacídica, conforme es definido más arriba.

Un "polipéptido de fusión" es un polipéptido comprendiendo regiones en una posición en la secuencia distinta de la que tendría en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente en proteínas separadas y son juntadas en el polipéptido de fusión; o pueden existir normalmente en la misma proteína pero son colocadas en una nueva disposición en el polipéptido de fusión.

Conforme es utilizado aquí, una "respuesta inmune" se refiere a una respuesta humoral, una respuesta celular, o a ambas.

Un "fragmento funcionalmente equivalente" de un polipéptido o polinucleótido 11D10 mantiene, al menos, una propiedad y/o función del polipéptido o polinucleótido 11D10. Por ejemplo, las secuencias pueden ser variadas por medio de la adición de nucleótidos o péptidos adicionales, conforme es conocido en este campo, de tal forma que la funcionalidad de la secuencia para inducir inmunidad no se vea alterada. Otros ejemplos son la supresión y/o substitución de secuencias. Alternativamente, las secuencias pueden ser variadas al substituir nucleótidos o aminoácidos, o mediante una combinación de adición, supresión o substitución. Como es evidente para un experto en este campo, la funcionalidad de una secuencia de polipéptido para inducir inmunidad incluye otras características y/o actividades de la secuencia, tales como la unión al Ab1 y/o al Ab3. Además, es evidente para un experto en este campo que "inducir inmunidad" incluye cualquier aspecto de la respuesta inmune, como una respuesta humoral o una respuesta celular. Está claro también que la funcionalidad de una secuencia de polinucleótido depende en parte del uso que se le vaya a dar, y cualquier funcionalidad que esté preservada en un fragmento de un polinucleótido satisface esta definición. Por ejemplo, un "fragmento funcionalmente equivalente" de un polinucleótido 11D10 puede ser uno en el cual esté preservada una habilidad para hibridizar, ya que el polinucleótido deseado puede ser utilizado como una sonda. Alternativamente, un "fragmento funcionalmente equivalente" de un polinucleótido 11D10 puede significar que el polinucleótido codifica un fragmento del 11D10 (el cual incluye una parte de la región variable) que posee una función asociada con el 11D10 intacto, y preferiblemente una función asociada con la inducción de inmunidad anti-HMFG. Un fragmento funcionalmente equivalente de un polipéptido o polinucleótido 11D10 puede tener la misma función, la función mejorada o tenerla disminuida, cuando es comparado con el polipéptido o polinucleótido 11D10. Han sido listadas más arriba otras funciones del 11D10. Un fragmento funcionalmente equivalente posee, al menos, 9 nucleótidos o, al menos, 5 aminoácidos, preferiblemente posee, al menos, 15 nucleótidos o, al menos, 10 aminoácidos, aún más preferiblemente posee, al menos, 25 nucleótidos o, al menos, 20 aminoácidos.

Una "línea celular" o "cultivo celular" indica células eucarióticas superiores, cultivadas o mantenidas in vitro. Se entiende que los descendientes de una célula pueden no ser completamente idénticos (morfológicamente, genotípicamente o fenotípicamente) a la célula progenitora.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico auto-replicante que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada dentro de células huésped y/o entre ellas. El término incluye vectores que funcionan sobre todo para la inserción de una molécula de ácido nucleico dentro de una célula, para replicación de vectores, que funcionan principalmente para el replicado de ácido nucleico, y vectores de expresión, que funcionan para la transcripción y/o traducción de ADN o ARN. También se encuentran incluidos vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriormente indicadas.

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Una "célula huésped" incluye una célula individual, o cultivo celular, la cual puede ser, o ha sido, un receptor para el vector(es) o para la incorporación de moléculas de ácido nucleico y/o proteínas. Las células huésped incluyen la progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en genómica del complemento de ADN total) a la célula progenitora original, debido a mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido(s) de esta invención.

Los "vectores de expresión" son definidos como polinucleótidos, los cuales, cuando son introducidos dentro de una célula huésped apropiada, pueden ser transcritos y traducidos en un polipéptido(s). Un "sistema de expresión" tiene la connotación, usualmente, de una célula huésped adecuada compuesta de un vector de expresión que puede funcionar para proporcionar un producto de expresión deseado.

Una "secuencia señal" es una secuencia aminoacídica corta que dirige proteínas de membrana, o secretoras, de reciente sintetización hacia las membranas celulares, y a través de ellas, tales como el retículo endoplasmático. Las secuencias señal se encuentran usualmente en la parte N-terminal de un polipéptido y son clivadas después de que el polipéptido ha cruzado la membrana.

"Heterólogo" significa derivado de (es decir, obtenido de) una entidad genotípicamente distinta al resto de la entidad con la cual está siendo comparado. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser colocado por medio de técnicas de ingeniería genética dentro de un plásmido o de un vector derivado de una fuente diferente, convirtiéndose de esta forma en un polinucleótido heterólogo. Un promotor que se encuentra unido a una secuencia codificadora con la cual no se haya ligado de forma natural es un promotor heterólogo.

Un anticuerpo, polinucleótido o polipéptido "aislado" o "purificado" es uno que se encuentra substancialmente libre de los materiales con los cuales está asociado en la naturaleza. Por substancialmente libre se entiende, al menos, un 50%, preferiblemente, al menos, un 70%, más preferiblemente, al menos, un 80%, y aún más preferiblemente, al menos, un 90% libre de los materiales con los cuales se encuentra asociado en la naturaleza.

Una "vacuna" es una composición farmacéutica para uso humano o animal, la cual es administrada con la intención de conferir al receptor de un grado de reactividad inmunológica específica contra una diana particular, o grupo de dianas. La reactividad inmunológica puede ser de anticuerpos o de células (particularmente células B, células plasmáticas, células T de ayuda, y linfocitos T citotóxicos y sus precursores) que son inmunológicamente reactivos contra la diana, o cualquier combinación de los mismos. Para los propósitos de esta invención, la diana es el antígeno HMFG asociado a tumor, o cualquier antígeno asociado a tumor unido por el 11D10. La reactividad inmunológica puede ser deseada para propósitos experimentales, para tratamiento de una dolencia en particular, o para la eliminación de una determinada substancia.

Un "dúplex estable" de polinucleótidos, o un "complejo estable" formado por cualquier grupo de dos o más componentes en una reacción bioquímica, se refiere a un dúplex o complejo que sea lo suficientemente duradero como para persistir entre la formación del dúplex o complejo y la subsiguiente detección, incluyendo cualquier fase de lavado opcional u otra manipulación que pueda tener lugar en el ínterin.

Una "muestra" biológica comprende una variedad de tipos de muestra obtenidos de un individuo y, usualmente, es utilizada en un procedimiento diagnóstico o ensayo. La definición abarca muestras sanguíneas y de otro líquido de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como un espécimen de biopsia, o cultivos celulares, o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. La definición incluye también muestras que han sido manipuladas de cualquier forma después de su obtención, como por ejemplo, por medio de tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento con ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos. El término "muestra biológica" comprende una muestra clínica e incluye también muestras de células en cultivo, de sobrenadantes celulares, de lisados celulares, de suero, de plasma, de fluido biológico y de tejido.

Conforme es utilizado aquí, "tratamiento" es un enfoque para la obtención de resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, el alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, la prevención de la extensión (es decir, metástasis) de la enfermedad, el retraso o ralentización del progreso de la enfermedad, la mejora o efecto paliativo sobre el estado de la enfermedad, y la remisión (tanto parcial como total), tanto si es detectable como si no lo es. "Tratamiento" puede significar también la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento.

"Efecto paliativo" de una enfermedad significa que la extensión y/o las manifestaciones clínicas no deseables de un estado de enfermedad son disminuidas y/o el curso del tiempo de la progresión es ralentizado o alargado, si se compara con el de la no administración del 11D10, del polinucleótido(s) 11D10, y/o del polipéptido(s) 11D10.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente como para producir resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o en más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una cantidad efectiva del 11D10, del polinucleótido 11D10, y/o del polipéptido 11D10 es una cantidad que es suficiente como para inducir una respuesta inmune, particularmente una respuesta anti-HMFG. En términos de tratamiento, una "cantidad efectiva" del 11D10, del polinucleótido 11D10, y/o del polipéptido 11D10 es una cantidad que es suficiente como para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, ralentizar o retrasar la progresión de un estado de enfermedad asociado al HMFG. La detección y medición de estos indicadores de eficacia son expuestas más abajo.

Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, animales de granja, animales de caza y mascotas.

Técnicas Generales

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que sea indicado de otra forma, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales se encuentran dentro del ámbito de este campo. Tales técnicas son explicadas en su totalidad en la literatura existente sobre las mismas, tales como "Molecular Cloning: A Laboratoy Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Wei & C.C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., eds., 1991).

Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, como tales, han de ser consideradas cuando se contemplen estos aspectos de la invención. Serán descritos más abajo sistemas particularmente útiles para los aspectos individuales.

11D10

En una realización, la invención incluye un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal (aquí referido como un "anti-id"), producido por la línea celular hibridoma ATCC Nº 12020 o la progenie de la misma. También se encuentra incluida en esta invención una línea celular hibridoma designada como ATCC Nº 12020 y la progenie de la misma. La generación y caracterización son descritas en el Ejemplo 1 y más abajo.

En otra realización, la invención incluye un anticuerpo purificado poseyendo características de identificación idénticas a las del anticuerpo producido por la línea celular hibridoma designada como ATCC Nº 12020. La invención incluye también un hibridoma poseyendo todas las características de identificación de una célula de la línea celular hibridoma designada como ATCC Nº 12020.

La invención comprende también el 11D10 conjugado con un marcador capaz de producir una señal detectable. Estos anticuerpos conjugados son útiles, por ejemplo, en sistemas de detección, tales como cuantificación del Ab1 (y/o del Ab3) o visualización. Tales marcadores son conocidos en este campo e incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, radioisótopos, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y otros anticuerpos. Los marcadores pueden estar enlazados covalentemente al 11D10, o estar conjugados con el 11D10 a través de un reactivo secundario, como un segundo anticuerpo, proteína A, o un complejo biotina-avidina. Los métodos para el marcaje de anticuerpos son conocidos en este campo y no es necesaria aquí su descripción en detalle.

Generación y selección del 11D10

Selección de un Ab1 para producir el anti-id (Ab2). Ha sido generada una serie de anticuerpos monoclonales murinos específicos de un tipo de célula ("mAbs"), los cuales reconocen componentes de las membranas del glóbulo graso en leche humana (HMFG) asociado a carcinomas de pecho, pero no asociados a la mayoría de los tejidos normales. Ceriani et al. (1983); Taylor-Papadimitriou et al. (1981) Int. J. Cancer 28:17-21. Entre estos mAbs, el MC-10 (también llamado BrE1) es bastante restringido y específico, en el sentido de que reacciona con una mucina de alto peso molecular (MW 400.000) presente únicamente en pequeñas cantidades en las células epiteliales mamarias humanas, y que se ve incrementada en, al menos, 10 veces en las células de carcinoma mamario. WO 8907268; EP 401247. El anticuerpo es citotóxico para las células del cáncer de pecho en estudios in vitro. Ceriani et al. (1983); Peterson et al. (1990).

El mAb MC-10 posee una distribución histopatológica muy restringida en los tejidos normales. El MC-10 únicamente se une a algunas áreas del recubrimiento epitelial del pulmón y en los túbulos contorneados distales repartidos por el riñón, sin aparente unión histopatológica con el pecho normal y muchos otros epitelios normales (colon, páncreas, estómago, tiroides, vejiga, hígado) y otros tejidos normales (suprarrenal, cerebro, nódulo linfático, miocardio, ovario, bazo, testículo). Por otra parte, un alto porcentaje de distintos tumores humanos, incluyendo el de pecho, endometrio, pulmón, ovario y páncreas se unen intensamente al mAb MC-10. Los tumores fijados con formalina estudiados para determinar la unión con el MC-10 (número positivo/número total) incluyen: carcinoma de pecho (CA) (144/182), CA de colon (3/27), CA de duodeno (0/1), CA de endometrio (7/14), CA de riñón (0/11), CA de pulmón (41/47), CA de ovario (20/26), CA de páncreas (9/15), CA de próstata (0/2), CA de glándula salivaria (0/3), CA de estómago (2/7), CA de tiroides (0/7), CA de hepatocolangio (8/33), CA de célula isleta (0/2), linfoma (0/20), melanoma (0/23), meningioma (0/5), CA de célula de Merkel (4/9), mesotelioma (1/11), neuroblastoma (0/2), oncocitoma (1/1), paraganglioma (0/10), píleoadenoma (0/7). Entre los sarcomas: no clasificado (0/1), alveolar (0/1), angiosarcoma (0/1), de célula clara (0/2), cistosarcoma (0/1), epitelioide (5/12), de Ewing (0/1), fibrosarcoma (0/1), leiomioma (0/2), liposarcoma (0/1), fibrohistiocitoma maligno (0/2), mesotelioma sinovial (0/7), CA de célula del huso (5/16), no diferenciado (1/9); schwanoma (0/3), seminoma (0/4), teratoma (0/3), timoma (0/8), CA de células de transición (5/10), CA no diferenciado (7/29), tumor de Warthin (0/1). Ceriani et al. (1990). Hemos estudiado también células hematopoyéticas para determinar la presencia del Ag MC-10 por medio de análisis FACS en nuestro laboratorio, y hemos encontrado que esas células, incluyendo granulocitos y plaquetas, son negativas para el antígeno. El control positivo de células MCF-7 se encontró altamente tintado con el mAb MC-10. De esta forma, el 11D10 posee el potencial para ser utilizado en una amplia variedad de cánceres en los cuales es detectado el HMFG.

De esta forma, el mAb MC-10 fue escogido para la producción de anti-id, debido a que éste define un epítope único y específico de una mucina de alto peso molecular del glóbulo graso en leche humana (HMFG), principalmente expresada en alta densidad por el cáncer de pecho humano y por algunas otras células tumorales, pero que no se encuentra en tejidos adultos normales, según es determinado por medio de tinción por inmunoperoxidasa, o en células hematopoyéticas, incluyendo los granulocitos, según es determinado por medio de análisis de citometría de flujo.

El epítope asociado al cáncer de pecho definido por el anticuerpo monoclonal MC-10 es una diana adecuada para la inmunoterapia activa contra estos tumores. Este Ag es expresado por más del 80% de los casos de cáncer de pecho, y se encuentra presente en una alta densidad en tejidos tumorales si se compara con unos pocos tejidos normales, los cuales contienen este Ag en cantidades muy pequeñas. Ceriani et al. (1983); Taylor-Papadimitriou et al. (1991). El Ag es puesto en circulación únicamente en cantidades muy pequeñas. Peterson et al. (1990) Hybridoma 9:221-235. El bajo nivel de Ag en circulación aparentemente no interfiere con la unión de los mAbs anti-HMFG radiomarcados con las dianas tumorales en estudios in vivo en pacientes con cáncer de pecho en estado avanzado. La especificidad restringida del MC-10 junto con su alta capacidad de unión con las líneas celulares representativas de cáncer de pecho, MCF-7 y SKBR3, le convierten en una diana excelente para generar hibridomas Ab2. Obtuvimos MC-10 purificado (IgG2b\kappa) (Lot. Nº 5319001) para generar un anti-idiotipo.

Generación de hibridomas anti-idiotipo monoclonales y selección del 11D10. El 11D10 fue obtenido por medio de inmunización de ratones sin tratar con anticuerpo anti-HMFG MC-10, con el fin de obtener una respuesta anti-idiotipo. Ratones singenéicos BALB/c fueron inmunizados cuatro veces con MC-10 (Ab1) y sus células del bazo fueron fusionadas con las células no secretoras P3-653 de mieloma de ratón. Para obtener un anti-idiotipo con todos los rasgos deseados fue realizado un vasto proceso de escrutinio, el cual incluyó las siguientes cuatro fases importantes: (1) Selección positiva para unión de anticuerpo al MC-10; (2) Selección negativa contra los determinantes isotípicos o alotípicos reconocedores del anticuerpo; (3) Selección positiva para una habilidad de inhibición de la unión del MC-10 con el HMFG; (4) Selección positiva para una habilidad de inducción de una respuesta inmune humoral contra el antígeno original asociado a tumor (HMFG) tanto en ratones como en conejos.

Fueron obtenidos algunos hibridomas Ab2 que eran específicos para el Id inmunizador del MC-10 y que no reaccionaban con cualquiera de los determinantes isotípicos o alotípicos. Para determinar si estos Ab2 estaban dirigidos contra el paratopo del MC-10, fue estudiada la unión del MC-10 radiomarcado con la línea celular de tumor de pecho MCF-7 y SKBR3 en presencia de distintas cantidades de los sobrenadantes del cultivo del hibridoma Ab2. Los Ab2s capaces de inhibir la unión del MC-10 con estas células fueron cultivados y purificados de fluido de ascites para estudios posteriores. Fueron preparados diferentes Ab2s purificados como vacunas, e inyectados en ratones y conejos sin tratar con una pauta bisemanal. Después de 4 inyecciones, las muestras de suero fueron tituladas para determinar la presencia del Ab3 que se unió no solo con el Ab2 inmunizador, sino también con el HMFG. El Ab2 induciendo reproduciblemente el título más alto del Ab3 con la especificidad deseada fue llamado 11D10. Son proporcionados en el Ejemplo 1 detalles adicionales del método utilizado para obtener el 11D10.

La respuesta inmune en animales inmunizados con el 11D10 ha sido caracterizada adicionalmente. El suero inmune procedente tanto de los ratones como de los conejos inmunizados con el 11D10 compitió con el MC-10 para la unión a la línea celular de carcinoma de pecho MCF-7 o SKBR3, e inhibió la unión del MC-10 radioiodinado con el 11D10 (Figura 7). Esto indicó que el Ab3 en ratones y conejos puede compartir idiotipos con el Ab1 (MC-10) y, probablemente, se une al mismo epítope que el Ab1.

Ha sido obtenido también, procedente de ratones inmunizados con 11D10, Ab3 monoclonal que se une al antígeno positivo MC-10. El Ab3 (tanto policlonal como monoclonal) reaccionó con el Ag de HMFG semi-purificado según análisis dot blot, y tintó células MCF-7 por medio del método de inmunoperoxidasa. Además, el suero Ab3 de conejo opsonizó las líneas celulares tumorales MCF-7 o SKBr3 en un ensayo de citotoxicidad mediada por complemento (CMC).

Hemos descubierto también que la administración del 11D10 a primates no humanos (monos cinomolgus) genera una respuesta inmune, tanto humoral como celular (Ejemplo 3; Cancer Res. (1995) 55:1525-1530). El Ab3 producido en respuesta al 11D10 fue específico para el HMFG (Figuras 12-17). La concentración del anticuerpo (Ab3) fue bastante alta, ya que fueron recogidos 1,32 mg. de Ab3 purificado de los 30 ml de suero (44 \mug/ml suero). Una cantidad tan pequeña como 100 ng de este Ab3 purificado fue capaz de inhibir la unión de más del 60% del Ab1 radiomarcado con la línea celular de cáncer de pecho MCF-7 positiva al HMFG.

Además de la inmunidad humoral, fue estudiada la respuesta inmune celular en monos por medio de ensayo de proliferación de células T. Fue observada una substancial proliferación cuando linfocitos sanguíneos periféricos (PBL) inmunes procedentes del mono que recibió el 11D10 fueron estimulados in vitro con el 11D10, pero no con el Ab2 de control no emparentado, 3H1 (Figura 19), sugiriendo proliferación celular específica de Id.

En relación con la aplicación clínica de anticuerpos anti-idiotipo para inmunoterapia, es un requisito esencial la demostración de la inducción de anticuerpos anti-TAA específicos en diferentes especies de animales.

De forma importante, aunque humanos con tumores asociados al HMFG toleran el antígeno del HMFG, hemos descubierto también que el 11D10 escapa a la tolerancia inmune y provoca una respuesta inmune en individuos con enfermedad asociada al glóbulo graso en lecho humana en estado avanzado, particularmente cáncer de pecho. A tres pacientes con cáncer de pecho en estado avanzado positivo al HMFG, con los cuales no habían tenido éxito las terapias estándar, les fue administrado 11D10 (Ejemplo 5). La información inicial indicó que los tres pacientes desarrollaron anticuerpos que eran anti-HMFG (Figuras 20-21); el paciente nº 2 mostró unión no específica, pero tuvo algo de reactividad Ab3. Además, uno de los pacientes mostró una respuesta inmune celular, como fue evidenciado por ensayo de proliferación de células T (Figura 22). Al efectuar un análisis adicional (utilizando Ab3 purificado de afinidad), fue descubierto que únicamente uno de estos tres pacientes desarrolló anticuerpos que eran anti-HMFG (Figuras 27 y 28; Ejemplo 10). Al evaluar pacientes adicionales (un total de 12) ya que correspondían a este estudio (Ejemplo 10), descubrimos que cinco de cada 10 pacientes testados desarrollaron anticuerpos anti-HMFG, conforme fue evaluado por la inhibición de la unión de MC-10 (Ab1) radiomarcado con el 11D10. Un total de cuatro pacientes (números 1, 5, 6 y 12) mostraron una respuesta inmune celular (Figura 29). Una descripción más detallada de este estudio puede encontrarse en los Ejemplos 5 y 10.

Preparación del 11D10

El anticuerpo de esta invención puede ser obtenido de distintos modos. El 11D10 puede ser producido del hibridoma ATCC 12020 aquí descrito. Los métodos de aislamiento de anticuerpos son de sobra conocidos en este campo. Ver, por ejemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. El anticuerpo puede ser obtenido del hibridoma por medio de cultivo tisular, o de ascites de ratón, y ser purificado utilizando técnicas convencionales para la purificación de anticuerpos. Estas técnicas son conocidas en este campo. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas en un medio adecuado, y puede ser utilizado el medio gastado como una fuente de anticuerpos. Opcionalmente, pueden ser incluidos canales o partículas recubiertos de matriz y cocultivos celulares, con el fin de mejorar el crecimiento de células productoras de anticuerpos. Para la producción de grandes cantidades de anticuerpos usualmente es más conveniente el obtener un fluido de ascites. Tales métodos son conocidos en este campo y, generalmente, comprende la inyección de células hibridoma en un mamífero inmunológicamente sin tratar histocompatible o inmunotolerante, especialmente un ratón. El mamífero es opcionalmente inmunizado para la producción de ascites al serle administrada con anterioridad una composición adecuada; por ejemplo, Pristane. Preferiblemente, el 11D10 es purificado de ascites de BALB/c utilizando cromatografía en agarosa-proteína G recombinante, seguido de cromatografía 4B proteína A-CL-sefarosa.

De forma alternativa, el 11D10 puede ser sintetizado químicamente utilizando las secuencias e información aquí proporcionadas y las técnicas conocidas en este campo, por ejemplo, un sintetizador peptídico automatizado disponible comercialmente, como los fabricados por Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA).

El anticuerpo 11D10 es de la subclase murina IgG1, y puede ser aislado por medio de cualquier técnica adecuada para las inmunoglobulinas de este isotipo. Los métodos de purificación pueden incluir precipitado de sal (por ejemplo, con sulfato de amonio), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, en una columna de intercambio catiónico o aniónico, conducida con un pH neutro y eluída con gradientes graduales de fuerza iónica en aumento), cromatografía de filtración por gel (incluyendo filtración por gel HPLC), y cromatografía en resinas de afinidad tales como proteína A, proteína G, hidroxiapatita y anti-inmunoglobulina. El 11D10 puede ser purificado también en columnas de afinidad comprendiendo el paratopo MC-10; por ejemplo, en la forma de un Ab1 o de un Ab3 purificados.

El 11D10 puede ser obtenido también empleando métodos recombinantes rutinarios, tales como los descritos en Sambrook et al. (1989). Por ejemplo, utilizando las secuencias e información aquí proporcionadas, un polinucleótido codificando el 11D10 de cadena pesada o el de cadena ligera puede ser clonado en un vector de expresión adecuado (el cual contiene secuencias de control para la transcripción, tales como un promotor). El vector de expresión es introducido, a su vez, dentro de una célula huésped. La célula huésped es cultivada bajo condiciones adecuadas de tal forma que el polinucleótido es transcrito y traducido en una proteína. Las cadenas pesada y ligera del 11D10 pueden ser producidas de forma separada y, después, ser combinadas por medio de recolocación de enlace disulfuro. De forma alternativa, los vectores con polinucleótidos separados codificando cada cadena del 11D10, o un vector con un único polinucleótido codificando ambas cadenas como transcritos separados, pueden ser transfectados dentro de una única célula huésped, la cual puede entonces producir y ensamblar la molécula completa. Preferiblemente, la célula huésped es una célula eurocariótica superior que puede proporcionar el complemento carbohidrato normal de la molécula. De esta forma, el 11D10 producido en la célula huésped puede ser purificado utilizando técnicas estándar en este campo. Un polinucleótido codificando el 11D10 para su utilización en la producción del 11D10 por medio de cualquiera de estos métodos puede ser obtenido, a su vez, del hibridoma productor del 11D10, o ser producido sintéticamente o de forma recombinante de la secuencia de ADN aquí proporcionada.

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Si el 11D10 va a ser administrado a un individuo, el 11D10 es preferiblemente, al menos, un 80% puro; más preferiblemente, al menos, un 90% puro; aún más preferiblemente, al menos, un 95% puro; aún más preferiblemente, alrededor de un 97% puro; aún más preferiblemente, alrededor de un 99% puro; aún más preferiblemente, al menos, alrededor de un 99,5%, así como encontrarse libre de pirógenos y otros contaminantes. En este contexto, el porcentaje de pureza es calculado como un porcentaje en peso del contenido total de proteína de la preparación.

Usos para el 11D10 y Métodos para la Utilización del 11D10

El 11D10 tiene diversos usos. Puede ser utilizado para provocar una respuesta inmune en un individuo que posee tumores asociados al HMFG en estado avanzado y, de esta forma, tratar a aquellos individuos con tumores asociados al HMFG. Preferiblemente, la respuesta inmune es anti-HMFG. Además, el 11D10 puede ser utilizado para detectar anticuerpos que se unen al HMFG o al 11D10. El 11D10 puede ser utilizado también para eliminar un exceso no deseado de Ab1 marcado de la circulación de los pacientes previamente tratados con anticuerpos anti-HMFG monoclonales marcados. El marcador puede ser cualquier marcador unido al anticuerpo, adecuado para el uso al que se le destina, incluyendo, por ejemplo, radioisótopos, restos tóxicos tales como toxinas, y fármacos. El 11D10 es útil también para la mejora de la detección tumoral en los métodos de visualización.

Utilización del 11D10 para provocar una respuesta inmune, o en tratamiento. La presente invención incluye métodos para provocar una respuesta inmune en un individuo que posee una enfermedad asociada al HMFG en estado avanzado, como tumores asociados al HMFG, que conlleva la administración al individuo de una cantidad efectiva del 11D10. En este contexto, una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente como para provocar una respuesta inmune, humoral y/o celular. Preferiblemente, la respuesta inmune incluye la producción de anti-HMFG.

Sujetos adecuados para la administración del anticuerpo 11D10 pueden ser identificados por medio de un número de criterios distintos. A los animales de experimentación se les puede administrar el 11D10, por ejemplo, para estudiar el efecto del 11D10 en la respuesta inmune, o para obtener reactivos útiles, tales como anticuerpos específicos anti-HMFG y líneas celulares.

En una realización preferida, el 11D10 puede ser utilizado para provocar una respuesta inmune y/o para el tratamiento, o efecto paliativo, de una enfermedad asociada al HMFG en estado avanzado, como tumores asociados al HMFG. Un "tumor asociado al HMFG" es un tumor que contiene un antígeno HMFG (es decir, un antígeno asociado al HMFG), expresado especialmente en la superficie de las células tumorales, tales como cáncer de pecho, carcinoma de endometrio, carcinoma de ovarios, el transicional y el no diferenciado (han sido descritos más arriba otros ejemplos). Conforme es utilizado aquí, tumores asociados al HMFG "en estado avanzado" quiere decir que existe metástasis detectable, es decir, masas tumorales detectables en sitios distintos del sitio originario del tumor. Las masas son detectadas, preferiblemente, por medio de técnicas de visualización conocidas en este campo, tales como rayos X o escáner CT. Para provocar una respuesta inmune, paliación o tratamiento, es administrada una cantidad efectiva del 11D10 a un individuo con tumor(es) asociado al HMFG en estado avanzado. La administración de una cantidad efectiva del 11D10 a individuos con tumor asociado al HMFG en estado avanzado puede retrasar o ralentizar la velocidad de progresión de la enfermedad, o mejorar la enfermedad, en comparación con otros individuos que no reciben este tratamiento.

Se entiende que para algunas situaciones que tienen relación con tumores asociados al HMFG en estado avanzado, particularmente el cáncer de pecho en estado avanzado, el individuo que recibe el 11D10 puede estar desde modera a severamente inmunocomprometido, debido a la naturaleza del tratamiento previo, a la enfermedad en sí, o a ambas. De esta forma, pueden variar el tiempo requerido para montar una respuesta inmune y/o el número de inyecciones del 11D10 y/o la cantidad del 11D10 por administración. Por ejemplo, un individuo puede necesitar un tiempo más largo para provocar una respuesta inmune una vez que ha sido administrado el 11D10. En este caso, se recomienda que el individuo continúe siendo monitorizado para detectar una respuesta inmune, aún cuando no haya sido detectada ninguna respuesta inmune inicial (es decir, dentro del primer mes). Como otro ejemplo, un individuo puede requerir un número mayor de inyecciones que el promedio para provocar una respuesta inmune.

Una posible indicación de la efectividad de la administración de 11D10 -bien para provocar una respuesta inmune y/o tratamiento, o si es indicada la administración del 11D10- es la densidad del HMFG en las células tumorales. Esta densidad puede variar ampliamente de un individuo a otro, y puede variar a lo largo del curso de la administración del 11D10 y/o a lo largo del curso de la enfermedad. Conforme es utilizado aquí, "densidad" del HMFG puede referirse a cada una de las siguientes opciones, o a ambas: (a) el número de células dentro del número total de células en una muestra biológica dada, las cuales tienen al HMFG en su superficie; (b) la cantidad de HMFG en la superficie de cada célula. La densidad (a) es calculada anotando el número de células en una muestra que aparecen tintadas, o que indican de otra forma que el HMFG se encuentra presente, dividido por el número total de células. Esta densidad sería, preferiblemente, mayor que alrededor del 20%; más preferiblemente, mayor que alrededor del 30%; más preferiblemente, mayor que alrededor del 50%; aún más preferiblemente, mayor que alrededor del 70%; aún más preferiblemente, mayor que alrededor del 80%; más preferiblemente, mayor que alrededor del 90%. De esta forma, la invención incluye la administración del 11D10 a un individuo poseyendo una densidad del HMFG mayor que alrededor del 20%, preferiblemente mayor que el 30%, más preferiblemente mayor que el 70%, aún más preferiblemente mayor que alrededor del 80%, más preferiblemente mayor que alrededor del 90%.

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La densidad (b) es indicada por medio de la intensidad relativa de tinción celular (o intensidad de cualquier medida que indique la presencia del HMFG) en una muestra procedente de un individuo en relación, por ejemplo, con una muestra procedente de otro individuo. Para esta densidad, un experto en este campo puede hacer una determinación empírica de la densidad. La densidad (b) se determina en relación con tejidos normales (es decir, células sin HMFG, o células no afectadas), por ello, los intervalos preferidos pueden ser alrededor de 1,5 veces, preferiblemente alrededor de 3 veces, más preferiblemente alrededor de 10 veces una mayor expresión en comparación con las células no afectadas, según es detectado por medio de densidad de tinción inmunohistoquímica. Las células no afectadas podrían proceder también del mismo individuo.

Esto no quiere decir que los individuos con densidad más bajas, por ejemplo, inferiores a alrededor del 50%, no sean indicados para la administración del 11D10. Sin querer estar constreñidos por una única teoría, es posible que la administración del 11D10 pudiera provocar una serie de reacciones inmunes que produzcan una respuesta más general que sea efectiva contra un tumor asociado al HMFG, tales como una respuesta de células T citotóxicas. Una densidad inferior, sin embargo, puede indicar que son deseables terapias adicionales.

Se entiende que la densidad puede ser utilizada también como un indicador de la extensión de la enfermedad y de respuesta a la administración del 11D10. Por ejemplo, una muestra tomada de un individuo al comienzo de la administración de 11D10 puede mostrar una densidad de alrededor del 80% (es decir, alrededor del 80% de las células exhiben el HMFG). Después de recibir el 11D10 una muestra tomada del mismo sitio puede mostrar únicamente alrededor del 50% de densidad, indicando que las células expresoras del HMFG están siendo destruidas. De forma similar, si la intensidad de la tinción de una muestra procedente de un individuo que está recibiendo el 11D10 disminuye al recibir el 11D10, esto indica que las células tumorales portadoras del HMFG están siendo destruidas.

A efectos de la creación de una respuesta inmune o de proporcionar tratamiento a individuos con tumores asociados al HMFG en estado avanzado, el 11D10 es administrado parenteralmente, preferiblemente intracutáneamente. Otras rutas de administración incluyen, aunque no están limitadas a las mismas, la intramuscular, la subcutánea y la intradérmica. El 11D10 puede ser administrado también indirectamente, por medio del tratamiento de células cultivadas seguido de la introducción de estas células cultivadas en un individuo.

La cantidad del 11D10 administrada depende de distintos factores, tales como el estado del individuo y la ruta de administración. Preferiblemente, la dosis por administración variará desde alrededor de 0,1 mg hasta alrededor de 20 mg. Más preferiblemente, la dosis variará desde alrededor de 0,5 mg; más preferiblemente, desde alrededor de 1 mg hasta 8 mg. Preferiblemente, la dosis es de alrededor de 2 a 8 mg. El 11D10 es usualmente administrado dos veces por semana, en cuatro inyecciones, seguido de inyecciones mensuales conforme se requiera. El calendario de las inyecciones subsiguientes (es decir, una dosis de mantenimiento) dependerá, inter alia, del estado y respuesta del individuo en tratamiento. Los niveles de Ab3 pueden ser monitorizados, por ejemplo, preferiblemente por medio de los métodos diagnósticos aquí descritos, con el fin de determinar cuándo las administraciones de mantenimiento (reinyecciones) deben ser proporcionadas, lo cual usualmente sería alrededor de cada 3 meses.

Preferiblemente, el 11D10 es administrado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un excipiente farmacéuticamente aceptable es una substancia relativamente inerte que facilita la administración de una substancia farmacológicamente efectiva. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia a la composición de vacuna, o actuar como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsificadores, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones, y mejoradores de la penetración dérmica. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, ed., 18ª edición, 1990).

Preferiblemente, el 11D10 es utilizado con un adyuvante, el cual mejora la presentación del 11D10, o mejora la respuesta inmune contra el 11D10. Adyuvantes adecuados incluyen el hidróxido de aluminio, alum, QS-21 (Patente americana nº 5.057.540), DHEA (Patentes americanas núms. 5.407.684 y 5.077.284) incluyendo sus precursores y formas modificadas, (por ejemplo, DHEA-S, la forma sulfonada de DHEA), beta-2 microglobulina (WO 91/16924), dipéptidos de muramil, tripéptidos de muramil (Patente americana nº 5.171.568) y monofosforil lípido A (Patente americana nº 4.436.728; WO 92/16231) y sus derivados, por ejemplo, Detox™, y BCG (Patente americana nº 4.726.947). Otros adyuvantes adecuados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, sales de aluminio, mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramil, derivados de saponina, preparados de pared celular de micobacteria, derivados de ácido micólico, surfactantes no iónicos de copolímero en bloque, Quil A, subunidad B de toxina de cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) tales como aquellos descritos por Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875. Para uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales pueden ser utilizados componentes mitogénicos del adyuvante de Freund.

La elección de un adyuvante dependerá en parte de la estabilidad de la vacuna en presencia del adyuvante, de la ruta de administración, y de la aceptabilidad regulatoria del adyuvante, particularmente cuando es para uso en humanos. Por ejemplo, el alum ha sido aprobado por la United States Food and Drug Administration (FDA) para su utilización como un adyuvante en humanos y será utilizado en nuestras pruebas clínicas. El 11D10 puede ser administrado en forma de precipitado; por ejemplo, puede ser utilizado 11D10 alum precipitado. La preparación del precipitado de hidróxido de aluminio 11D10 es descrita en los Ejemplos 3 y 4. Si es utilizado QS-21, preferiblemente son utilizados 100 \mug para cada dosis, la cual es administrada preferiblemente de forma subcutánea dentro aproximadamente de los 30 minutos desde que se mezcla con el 11D10 (teniendo cuidado de mezclarlo suavemente). Si es utilizado Detox™, son utilizados preferiblemente 0,12 ml por cada dosis, la cual es administrada preferiblemente de forma subcutánea, dentro de alrededor de los 30 minutos desde que se realiza la mezcla con el 11D10. Los fabricantes pueden proporcionar, por lo general, recomendaciones en relación con las cantidades, volumen, preparación y ruta(s) de administración.

Alternativamente, el 11D10 puede ser encapsulado, por ejemplo, en liposomas. Son conocidos en este campo liposomas adecuados para el almacenaje de polipéptidos para su suministro a las células.

El 11D10 puede ser tratado por calor antes de su administración, y el tratamiento por calor puede ser realizado en presencia de un adyuvante, por ejemplo, el alum. Por ejemplo, el 11D10 puede ser calentado hasta alrededor de 40 a 60ºC, preferiblemente de 45ºC a 55ºC, durante un período de alrededor de 5 minutos a 2 horas, preferiblemente de 15 minutos a 1 hora. El tratamiento por calor es realizado más preferiblemente a 45ºC durante 30 minutos en un vial estéril, en un baño de agua. El tratamiento por calor puede tener lugar en cualquier momento con anterioridad a su administración. Preferiblemente, el tratamiento por calor se realiza en el plazo de 7 días antes de la administración. Pueden ser utilizados otros procedimientos de tratamiento por calor, siempre que la actividad deseada del 11D10 no se vea comprometida de forma significativa.

A los efectos de crear una respuesta inmune, el 11D10 puede ser administrado en una forma no modificada. Algunas veces puede ser preferible el modificar el 11D10 con el fin de mejorar su inmunogenicidad. Los métodos para mejorar la inmunogenicidad incluyen, inter alia, el reticulado con agentes tales como gluteraldehido o acopladores bifuncionales, o la unión a una molécula plataforma polivalente. La inmunogenicidad puede ser mejorada también por medio de acoplamiento a un portador de proteína, particularmente uno que comprenda epítopes de células T.

El 11D10 puede ser utilizado solo o en conjunción con otros agentes, lo cual promueve la actividad/objetivo deseado. En este contexto, un "agente" puede ser cualquiera de entre una variedad de substancias. Además, "en conjunción con" significa que el agente puede ser utilizado concomitantemente, antes, o después del 11D10. Una actividad deseada es cualquier actividad que facilite, mejore, promueva o module el objetivo deseado al utilizar el 11D10. Agentes que pueden ser utilizados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, citoquinas, linfoquinas, adyuvantes y fármacos. Los agentes incluyen también substancias que facilitan la administración del 11D10, tales como liposomas, o substancias que promueven la administración del 11D10 a una diana determinada, por ejemplo, un receptor celular. Por ejemplo, el 11D10 puede ser administrado con una citoquina como la GM-CSF.

Con el fin de determinar el efecto de la administración con el 11D10, un individuo puede ser monitorizado para detectar una respuesta inmune de anticuerpo (humoral) o una celular contra el HMFG, o una combinación de las mismas.

Para determinar el nivel del anticuerpo HMFG (Ab3) en una muestra biológica, por ejemplo, es obtenido del individuo suero o plasma. La muestra puede ser enriquecida opcionalmente con inmunoglobulina antes de que sea realizado el ensayo, aunque no es requerido usualmente. Si va a ser utilizada una inmunoglobulina murina (como el 11D10) en un reactivo de ensayo, la muestra es preferiblemente pre-tratada para eliminar la actividad de la inmunoglobulina anti-ratón. Esto puede ser realizado, por ejemplo, por depleción en una columna de inmunoglobulina de ratón, o mezclando inmunoglobulina de ratón no específica en la muestra y eliminando cualquier inmunoprecipitado que se forme.

Para llevar a cabo el ensayo, es puesto en contacto anti-HMFG que puede encontrarse en la muestra con una cantidad no limitada de un antigénico equivalente del HMFG. Éste puede ser el HMFG asilado, nitrocelulosa con HMFG fijado por blotting directo o por transferencia de un gel de poliacrilamida, células expresoras del HMFG (tales como células MCF-7 o SKBR3), preparados de membrana procedentes de tales células, o secciones de tejido fijadas conteniendo HMFG. De forma alternativa, puede ser utilizado un anti-idiotipo, particularmente el 11D10.

Una vez se ha formado el complejo inmune, es separado, por lo general, del análogo HMFG no complejo, y es determinada la cantidad del complejo que se haya presente. El complejo puede ser separado, por ejemplo, por medio de centrifugado para recoger células o un inmunoprecipitado, o capturar por medio de una fase sólida. La cantidad del complejo presente puede ser medida al proporcionar al análogo del HMFG un marcador, bien directamente, o por medio de la incubación con un reactivo secundario. Alternativamente, puede ser llevado a cabo un ensayo competitivo, en el cual la muestra en incubada primeramente con el análogo del HMFG y, a continuación, es añadida una cantidad no limitada de un reactivo anti-HMFG marcado, el cual compite con el anti-HMFG que puede estar presente en la muestra. Marcadores adecuados incluyen los radiomarcadores, los marcadores enzimáticos, los marcadores fluorescentes y los marcadores quimioluminiscentes. Es construida una curva estándar utilizando soluciones que se sabe no contienen anti-HMFG, y soluciones con distintas concentraciones relativas de anti-HMFG, en lugar de la muestra. La muestra conteniendo la cantidad desconocida de anti-HMFG es, por lo general, sometida a ensayo en paralelo, y la cantidad relativa de anti-HMFG contenida en ella es determinada al compararla con la curva estándar. Los ensayos preferidos para la determinación de los niveles de anti-HMFG utilizando anticuerpo 11D10 son descritos en más detalle en una próxima sección.

El isotipo del anticuerpo anti-HMFG puede ser determinado al incluir en el inmunoensayo un reactivo específico del isotipo, bien en la fase de separación o en la de marcaje. Por ejemplo, puede ser utilizado IgG anti-humano para separar o detectar anticuerpo de la clase IgG, presente en una muestra clínica de origen humano. La presencia de anti-HMFG específico de la clase IgG indica, por lo general, una respuesta de memoria. La presencia de anti-HMFG de la clase IgM indica, por lo general, inmunoestimulación en curso, como la que puede ser debida a la presencia de un tumor expresor del HMFG, o tratamiento en curso con el 11D10.

Si así se desea, el anticuerpo anti-HMFG detectado en una muestra biológica puede ser caracterizado adicionalmente; por ejemplo, por medio de competencia con el anti-MC10 (Ab1), para determinar si son específicos para epítopes emparentados con el HMFG. Los ensayos competitivos entre el Ab1 y el Ab3 son descritos en detalle en la sección de Ejemplos.

El anticuerpo anti-HMFG puede ser testado también para determinar si es citotóxico. La citotoxicidad mediada por complemento (CMC) es determinada, por ejemplo, utilizando células diana expresoras del HMFG (tales como las MCF-7 o las SKBR3) marcadas con Cr51. El marcaje puede ser realizado al incubar alrededor de 106 células con \sim200 \muCi Na251CrO4 durante 60 minutos a 37ºC, seguido de lavado. El ensayo es llevado a cabo incubando el anticuerpo (o muestra clínica conteniendo el anticuerpo) con las células diana. A continuación, las células opsonizadas son lavadas e incubadas con una fuente de complemento; por ejemplo, suero de cerdo de guinea pre-absorbido para eliminar la actividad de anticuerpo intrínseca. Después de un período de incubación adecuado a 37ºC, es determinada la liberación del Cr51 en el medio de cultivo, y es comparada con la de células de control no opsonizadas. La liberación del Cr51 tiene correlación con la actividad de CMC.

Otra forma de caracterización del anticuerpo anti-HMFG es testando su habilidad para participar en una respuesta ADCC (Cheresh et al. (1986), Cancer Res. 46:5112). Células diana expresoras del HMFG radiomarcadas son incubadas con el anti-HMFG (en la forma de suero inactivado por calor), y células efectoras. Células normales mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) son adecuadas como células efectoras y, preferiblemente, son utilizadas en una proporción de efector:diana de alrededor de 100. Después de aproximadamente 4 horas a 37ºC, la proporción de Cr51 liberado es determinada como una medida de actividad ADCC.

La respuesta inmune celular en un sujeto al que le está siendo administrado el 11D10 puede ser cuantificada por medio de la realización de ensayos funcionales estándar para determinar la actividad específica de células T.

Un tipo de ensayo mide la proliferación de células T. En esta prueba son obtenidas células mononucleares sanguíneas periféricas (PMBC) procedentes de una muestra de sangre completa recogida de sujeto tratado. Para animales de experimentación, pueden ser utilizadas también células del bazo. Las células T pueden ser enriquecidas, por ejemplo, por medio de centrifugación en un gradiente como el Ficoll(TM). A continuación, las células son cultivadas en presencia del HMFG o (más usualmente) de células expresoras del HMFG irradiadas en distintas concentraciones. Preferiblemente, las células estimuladoras son autólogas en relación con las células respondedoras, particularmente en términos de antígenos de histocompatibilidad de clase II.

Otro tipo de ensayo mide la citotoxicidad de células T. En esta prueba es utilizada una población de células T enriquecidas, para causar la lisis de las células diana expresoras del HMFG marcado con el CR51, preparado conforme es indicado con anterioridad. Preferiblemente, las células efectoras son autólogas en relación con las células diana, particularmente en términos de antígenos de histocompatibilidad de clase I. La población de células T puede ser opcionalmente pre-estimulada con HMFG o con una línea celular relevante. A continuación, las células T son combinadas en distintas proporciones con alrededor de 104 células diana marcadas; por ejemplo, en pocillos de una placa de microtítulos. La placa es centrifugada opcionalmente para iniciar la puesta en contacto de las células, y las células son cultivadas juntas de 4 a 16 horas a 37ºC. El porcentaje de liberación específica del Cr51 en el medio de cultivo es medido en comparación con las dianas marcadas cultivadas solas (control negativo) y con las dianas lisadas con un detergente como el Triton (TM) 0,1% X-100 (control positivo).

Otras mediciones relevantes para determinar el efecto de la administración del 11D10 incluyen pruebas clínicas conforme sean adecuadas a la hora de determinar la progresión del cáncer del tipo bajo sospecha. Tales pruebas pueden incluir indicadores de inflamación, mamografía y radioescintigrafía, conforme son descritas en otra parte de este informe.

Utilización del 11D10 para llevar a cabo inmunoensayos. Otra forma de que el 11D10 pueda ser utilizado es realizar un ensayo para determinar la presencia de un anticuerpo, u otro componente inmune, que se una al 11D10 o al HMFG. Tales componentes pueden estar presentes después de la administración terapéutica del 11D10, o pueden surgir espontáneamente debido a la presencia de un tumor expresor de HMFG en un huésped inmunocompetente. Los ensayos pueden ser realizados en muestras biológicas, usualmente muestras clínicas.

En una realización de esta invención, el 11D10 es utilizado para detectar la presencia de un anti-HMFG, particularmente el idiotipo anti-11D10, que puede estar presente en una muestra biológica. La muestra es preparada de forma adecuada antes de llevar a cabo el ensayo, enriqueciéndola opcionalmente para la actividad de anticuerpos. Si se sospecha que la muestra biológica contiene actividad de anticuerpos contra regiones no idiotípicas del 11D10 (particularmente inmunoglobulina anti-ratón), es preferible eliminarlas o llevar a cabo el ensayo de tal forma que se evite su detección. El anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón puede ser eliminado de una muestra, por ejemplo, por medio de precipitado con IgG de ratón normal, o por adsorción con un adsorbente Ig de ratón. La unión del anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón, particularmente el específico para la región Fc, puede ser minimizada por medio de una cuidadosa selección de los reactivos del ensayo. Son especialmente apropiados los fragmentos F(ab')2 o Fab del 11D10 y otros reactivos de la inmunoglobulina de ratón.

Después de que la muestra ha sido adecuadamente preparada, es mezclada con un exceso del equivalente funcional del 11D10 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el 11D10 y cualquiera de los anti-HMFG que puedan estar presentes. A continuación, es determinada la cantidad del complejo, y es comparada con los complejos formados con muestras estándar conteniendo cantidades conocidas de anti-HMFG en el rango esperado. La formación de complejos puede ser observada por medio de inmunoprecipitado o nefelometría, pero generalmente es más sensato el emplear un reactivo marcado con marcadores tales como los radioisótopos, como el I^{125}, enzimas, como la peroxidasa y la \beta-galactosidasa, o fluorocromos, como la fluoresceína.

Pueden ser llevados a cabo en fase fluida ensayos de anticuerpos. Por ejemplo, el anti-HMFG puede ser mezclado con 11D10 marcado. De forma alternativa, el anti-HMFG en la muestra puede ser utilizado para competir con un anti-HMFG marcado por los sitios de unión en el 11D10. Generalmente, el marcador unido y sin unir es separado para cuantificar el porcentaje de unión. Los métodos de separación adecuados incluyen cromatografía de filtración por gel, y precipitado con anticuerpo contra inmunoglobulina de las especies de las cuales es obtenida la muestra, opcionalmente en presencia de glicol de polietileno. Alternativamente, la proporción de marcador unido y no unido puede ser determinada in situ, por ejemplo, utilizando pares de marcadores fluorescencia/apagado o pares de marcadores enzima/inhibidor. Ver, por ejemplo, la Patente americana nº 3.996.345 (Ullman et al.).

Es más conveniente, por lo general, el llevar a cabo un ensayo de captura utilizando un reactivo ligado a una fase sólida, como un tubo de prueba de polietileno, pocillo de placa de microtítulo, o partícula magnética. En un ensayo de captura de tipo competitivo el anti-HMFG no marcado en la muestra compite con un reactivo anti-HMFG marcado para la unión con el 11D10. El 11D10 puede estar unido directamente al soporte sólido, o ser capturado más tarde, por ejemplo, utilizando un anti-11D10. En este ensayo, la cantidad de marcador asociado con la fase sólida se encuentra inversamente relacionada con la cantidad de anti-HMFG existente en la muestra.

En el ensayo de captura de tipo sándwich el anti-HMFG es capturado por el 11D10 unido directamente, o por medio de un segundo reactivo, a una fase sólida. Después del lavado, el anti-HMFG es detectado utilizando anti-inmunoglobulina procedente de las especies adecuadas, o un segundo anticuerpo 11D10, al cual se encuentra unido un marcador directa o indirectamente. De forma alternativa, la anti-inmunoglobulina puede estar unida a la fase sólida, y el 11D10 marcado es utilizado para completar el sándwich. Si la anti-inmunoglobulina utilizada es específica del isotipo, entonces puede ser determinada también la clase del anticuerpo. En este tipo de ensayo la cantidad de marcador asociado con la fase sólida se correlaciona positivamente con la cantidad de anti-HMFG existente en la muestra.

Son conocidos en este campo otros métodos de medición del anticuerpo específico, y pueden ser adaptados para medir el anti-HMFG por medio de la utilización del 11D10 como el antígeno diana. Todos estos métodos adaptados se encuentran incorporados en esta invención. Son proporcionadas descripciones adicionales de realizaciones particulares en la sección de Ejemplos.

El 11D10 puede ser utilizado también para medir el nivel de actividad celular anti-HMFG, particularmente anti-idiotipo 11D10. En un ejemplo preferido, el 11D10 es utilizado para identificar células T anti-HMFG, definidas para este propósito como linfocitos expresando un receptor de célula T que se une al idiotipo 11D10. El 11D10 puede ser marcado y puesto en contacto con una población de células sospechosas de contener células T anti-HMFG. Alternativamente, el 11D10 no marcado puede ser mezclado con las células y, después, con un reactivo secundario marcado, como la inmunoglobulina anti-ratón marcada o la proteína A marcada. Marcadores adecuados para este propósito incluyen los radiomarcadores y los marcadores fluorescentes. La utilización de marcadores fluorescentes permitiría también que las células anti-HMFG fueran separadas de las células no específicas en un clasificador celular activado por fluorescencia.

Utilización del 11D10 para eliminar el Ab1 marcado. La invención comprende también métodos utilizando el 11D10 para eliminar un marcador, por ejemplo radioactivo, de un individuo que ha recibido un anticuerpo anti-HMFG (Ab1) marcado, por ejemplo, para radioescintigrafía o radioterapia. Un problema común en la utilización de radionúclidos como diana de anticuerpos (es decir, radioinmunoterapia) ha sido la presencia de un exceso de Ab1 en el sistema, lo cual limita la dosis de anticuerpo radiomarcado por tratamiento. Además, la visualización efectiva utilizando anticuerpos radiomarcados se ve dificultada debido a un exceso de anticuerpo radiomarcado en circulación, el cual tarda a menudo varios días en desaparecer de la circulación y de los tejidos. En estos métodos de la presente invención, el 11D10 es administrado al individuo a una hora especificada después de la administración del anti-HMFG marcado. La intención es que el 11D10 forme un complejo con el anti-HMFG en sitios que no sean el tumor, como en la circulación y en los espacios intersticiales y, de esta forma, promover su desaparición. Como resultado, el nivel de resto marcado (como radioisótopo) en tejidos no afectados es reducido, y la imagen del tumor (en comparación con los tejidos vecinos) se ve mejorada. De forma similar, cuando los radionúclidos son dados a sujetos para la irradiación de un sitio de tumor, es deseable el reducir la exposición colateral de los tejidos no afectados. De esta forma, esta invención incluye métodos de tratamiento, en los cuales un anticuerpo anti-HMFG radiomarcado es administrado en una dosis terapéutica, y seguido de un exceso molar del 11D10.

En cada una de estas aplicaciones es escogida una cantidad del 11D10 que se encuentre en un exceso molar suficiente sobre el anti-HMFG marcado como para localizar y unir cualquier anti-HMFG que no se encuentre localizado en el sitio del tumor. El calendario de administración y la cantidad del 11D10 dependerá de la naturaleza del anticuerpo radiomarcado, del tipo de radioisótopo utilizado y del estado del individuo. Preferiblemente, la proporción molar del 11D10 en relación con el anticuerpo anti-HMFG es de, al menos, alrededor de 5:1, más preferiblemente, alrededor de 25:1 hasta 200:1. Preferiblemente el 11D10 es administrado de 5 a 24 horas después de que el individuo ha recibido el anticuerpo anti-HMFG.

Utilización del 11D10 para detectar el anticuerpo anti-HMFG unido a una célula tumoral. La invención incluye también métodos para detectar la presencia de un anticuerpo anti-HMFG unido a una célula tumoral, comprendiendo las fases de tratamiento de la célula tumoral con el 11D10 durante un tiempo suficiente como para permitir la unión al anticuerpo anti-HMFG, y la detección de la presencia de cualquier complejo formado. La intención es que el 11D10 detecte el anti-HMFG que se haya pre-unido a la célula tumoral; o, alternativamente, promover la unión del anti-HMFG con la célula tumoral al formar un complejo inmune polivalente anti-HMFG/11D10. En el caso anterior, el 11D10 está provisto de un marcador detectable, o un medio por el cual un marcador pueda ser unido. En el último caso, está provisto de un marcador el anti-HMFG o el 11D10.

Esta estrategia puede ser utilizada, por ejemplo, para identificar una célula portadora del antígeno HMFG en una suspensión celular aislada. Las células son incubadas secuencial o simultáneamente con anti-HMFG y 11D10, lavadas y, a continuación, las células marcadas son detectadas. Los marcadores preferidos para esta realización incluyen los marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína, rodamina y rojo Texas. Opcionalmente, las células marcadas pueden ser separadas de las células no marcadas; por ejemplo, por clasificación en un clasificador celular activado por fluorescencia, o por medio de separación por afinidad, utilizando cualquiera de las técnicas de inmunoselección positiva o negativa de fase sólida conocidas en este campo.

La estrategia puede ser utilizada también, por ejemplo, para detectar o visualizar tumores en un sujeto afectado. El anti-HMFG y el 11D10 son administrados (usualmente secuencialmente) al sujeto y se permite que se acumulen en el sitio del tumor. Los marcadores adecuados incluyen los radiomarcadores tales como el 111In, el 131I y el 99mTc. A continuación, el tumor es detectado, o visualizado, utilizando técnicas estándar de radioescintigrafía.

Polinucleótidos 11D10

La invención abarca polinucleótidos codificando el anticuerpo anti-idiotipo 11D10 o fragmentos del 11D10, basándose en las secuencias de polinucleótido mostradas en las Figuras 1 y 2. Estos polinucleótidos son aislados y/o producidos por medio de métodos químicos y/o recombinantes, o una combinación de estos métodos. A no ser que sea especificado de otra forma, los términos "polinucleótidos" o "polinucleótidos 11D10" incluirán todas las realizaciones de los polinucleótidos de esta invención.

Los polinucleótidos 11D10 de esta invención son útiles como sondas, iniciadores, en sistemas de expresión y en preparaciones farmacéuticas, incluyendo vacunas. Aplicaciones de los polipéptidos especialmente útiles de los polipéptidos serán expuestas más abajo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que contiene una secuencia codificando un polipéptido que posee actividad inmunológica del 11D10, en donde el polipéptido comprende, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una región variable del 11D10. En una realización, la secuencia codificadora del polinucleótido codifica la región variable de la cadena ligera. En otra realización, la secuencia codificadora del polinucleótido codifica la región variable de la cadena pesada.

La invención proporciona también polinucleótidos 11D10 que son representados en las Figuras 1 y 2. En una realización es proporcionado un polinucleótido aislado codificando un polipéptido que posee la actividad inmunológica del 11D10, en donde el polipéptido comprende, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una cadena ligera de la región variable del 11D10 representado dentro de la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1). En otra realización es proporcionado un polinucleótido aislado codificando un polipéptido que posee la actividad inmunológica del 11D10, en donde el polipéptido comprende, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una cadena pesada de la región variable del 11D10 representado dentro de la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2). En otra realización, la secuencia de polinucleótido codificadora (de la región variable) es representada dentro de la SEC. ID. Nº 1 (Figura 1). En otra realización, la secuencia de polinucleótido codificadora (de la región variable) es representada dentro de la SEC. ID. Nº 3 (Figura 2). La secuencia de polinucleótido puede ser similar a las representadas en la SEC. ID. Nº 1 (Figura 1) o en la SEC. ID. Nº 3 (Figura 2) con cambios menores, diseñados para optimizar la utilización del codón o la estabilidad, o puede variar significativamente. Se encuentra dentro de los conocimientos de un persona experta en este campo el diseñar tales polinucleótidos, una vez dadas las secuencias aminoacídicas en la SEC. ID. Nº 2 o en la SEC. ID. Nº 4. La Figura 1 representa la secuencia nucleotídica SEC. ID. Nº 1 y la secuencia aminoacídica derivada (SEC. ID. Nº 2) de la región variable de la cadena ligera del 11D10. La Figura 2 representa la secuencia nucleotídica SEC. ID Nº 3 y la secuencia aminoacídica derivada (SEC. ID. Nº 1) de la región variable de la cadena pesada del 11D10. La secuencia nucleotídica de la SEC. ID. Nº 1 es de 435 pares de bases y fue obtenida de clones, conforme es descrito en el Ejemplo 2. La secuencia de polinucleótido de la SEC. ID. Nº 3 es de 467 pares de bases y fue obtenida conforme es descrito en el Ejemplo 2.

En otra realización la invención comprende un polinucleótido codificando una parte de la región variable de la cadena ligera del 11D10, comprendiendo, al menos, alrededor de 60 nucleótidos contiguos, preferiblemente 70 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 80 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 100 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 150 nucleótidos contiguos de la SEC. ID. Nº 1. La invención comprende también un polinucleótido codificando una parte de la región variable de la cadena ligera del 11D10, comprendiendo, al menos, alrededor de 15 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 25 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 30 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora de la CDR1 del mismo. La invención también comprende un polinucleótido codificando una parte de la región variable de la cadena ligera del 11D10, comprendiendo, al menos, alrededor de 10 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 15 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora de la CDR2 o de la CDR3 del mismo.

En otra realización, la invención comprende un polinucleótido codificando una parte de la región variable de la cadena pesada del 11D10, comprendiendo, al menos, alrededor de 60 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 70 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 80 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 100 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 150 nucleótidos contiguos de la SEC. ID. Nº 3. La invención comprende también un polinucleótido codificando una parte de la región variable de la cadena pesada del 11D10, comprendiendo, al menos, 10 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 15 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora de la CDR1 del mismo. La invención también comprende un polinucleótido codificando una parte de la región variable de la cadena pesada del 11D10, comprendiendo, al menos, alrededor de 15 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 20 nucleótidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 25 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 35 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 50 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora de la CDR2 o de la CDR3 del mismo.

En otra realización, la invención comprende cualquiera de los polinucleótidos 11D10 anteriormente descritos, en donde el polinucleótido(s) codifica, al menos, cinco aminoácidos de una región determinante de complementariedad (CDR). Las CDRs son expuestas más abajo.

La invención incluye modificaciones en los polinucleótidos 11D10 descritas más arriba, tales como deleciones, substituciones, adiciones o cambios en la naturaleza de cualquiera de los restos del ácido nucleico. Una "modificación" es cualquier diferencia en la secuencia nucleótida si se compara con un polinucleótido aquí mostrado para codificar un fragmento de polipéptido 11D10, y/o cualquier diferencia en términos de los restos de ácido nucleico del polinucleótido(s). Tales cambios pueden ser útiles para facilitar el clonaje y la modificación de expresión de los polinucleótidos 11D10. Tales cambios pueden ser útiles para conferir al polinucleótido(s) propiedades deseables, tales como la estabilidad. La definición del polinucleótido aquí proporcionada presenta ejemplos de estas modificaciones.

La invención comprende polinucleótidos 11D10 incluyendo los de longitud total (no procesados), los procesados, los codificadores, los no codificadores o partes de los mismos, siempre que estos polinucleótidos contengan una región codificando, al menos, una parte de una región variable del 11D10. También se encuentran comprendidas las secuencias de ARNm y ADNc, y fragmentos de las mismas que incluyan una parte del segmento codificador de la región variable.

La invención comprende también polinucleótidos codificando para variantes funcionalmente equivalentes y derivados del 11D10, y fragmentos del mismo funcionalmente equivalentes, lo cual puede mejorar, disminuir o no afectar de manera significativa las propiedades de los polipéptidos codificados de esta forma. Estas variantes funcionalmente equivalentes, derivados y fragmentos muestran la habilidad de inducir una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta inmune anti-HMFG. Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no modifiquen la secuencia aminoacídica codificada, así como aquéllos que den como resultado substituciones conservadoras de residuos aminoacídicos, una o unas pocas deleciones o adiciones aminoacídicas, y substitución de residuos aminoacídicos por análogos aminoacídicos, son aquéllos que no afectarán de manera significativa las propiedades del polipéptido codificado. Las substituciones de nucleótidos que no alteran los residuos aminoacídicos codificados pueden ser útiles para optimizar la expresión génica en diferentes sistemas. Las substituciones adecuadas son conocidas por los expertos en este campo y son realizadas, por ejemplo, para reflejar la utilización de codones preferidos en los sistemas de expresión particulares. En otro ejemplo, polinucleótidos alternativamente empalmados pueden dar lugar a un fragmento o variante funcionalmente equivalente del 11D10. Alternativamente, las variantes de secuencia de polinucleótido procesadas son definidas como secuencias de polinucleótido que corresponden a ARNms que difieren en cuanto a secuencia entre sí, pero que son derivados de la misma región genómica, por ejemplo, ARNms que resultan de: 1) la utilización de promotores alternativos; 2) la utilización de sitios de poliadenilación alternativos; o 3) la utilización de sitios de empalme alternativos.

Los polinucleótidos 11D10 de la invención incluyen también polinucleótidos codificando otros fragmentos de 11D10. Los polinucleótidos codificando fragmentos de 11D10 son útiles, por ejemplo, como sondas, agentes terapéuticos, y como un templete para codificar varios dominios funcionales y/o de unión del 11D10. Por consiguiente, la invención incluye un polinucleótido que comprende una región de, al menos, 15 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 20 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 25 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 35 nucleótidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 50 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 75 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 100 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 200 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 300 nucleótidos contiguos que forma un híbrido estable, con un polinucleótido codificando la región variable de cadena ligera o la de cadena pesada del 11D10, pero no lo forma con otras regiones codificadoras de la inmunoglobulina, conocidas en el momento en el que se inscribe esta solicitud. En una realización, la región es capaz de formar un dúplex estable con un polinucleótido, consistente en la secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera, SEC. ID. Nº 1, bajo condiciones donde la región no forme un híbrido estable con las SEC. ID. Nº 5 a la SEC. ID. Nº 14. En otra realización, la región es capaz de formar un dúplex estable con un polinucleótido, consistente en una secuencia codificadora de la región variable de cadena pesada, SEC. ID. Nº 3, bajo condiciones donde la región no forme un híbrido estable con las SEC. ID. Nº 5 a la SEC. ID. Nº 32.

En otra realización, los fragmentos de polinucleótido 11D10 comprenden alrededor de 15 bases, preferiblemente 20, aún más preferiblemente 30, de la secuencia representada en la Figura 1 (SEC. ID. Nº 1) o en la Figura 2 (SEC. ID. Nº 3). Un fragmento de este tamaño aproximado podría codificar para un sitio de unión para un anticuerpo Ab1 o Ab3. Fragmentos adecuados son aquéllos que hibridizan especialmente con el ADN o el ARN del 11D10, de tal forma que son efectivos como iniciadores o sondas. Los iniciadores son particularmente útiles en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las reacciones de hibridización pueden ser llevadas a cabo bajo condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que incrementan la rigurosidad de una reacción de hibridización son ampliamente conocidas y publicadas en este campo. Ver, por ejemplo, Sambrook y Maniatis. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden ascendente de rigurosidad): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC; concentraciones de tampón de 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (donde SSC es 0,15 M de NaCl y 15 mM de tampón citrato) y su equivalente utilizando otros sistemas de tamponado; concentraciones de formamida del 0%, 25%, 50% y 75%; tiempos de incubación desde 5 minutos hasta 24 horas; 1, 2 o más fases de lavado; tiempos de lavado de incubaciones de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC, o agua desionizada.

"Tm" es la temperatura en grados centígrados a la cual el 50% de un dúplex de polinucleótido compuesto de hebras complementarias enlazadas por hidrógeno en dirección antiparalela por medio de apareamiento de bases Watson-Crick se disocian en hebras individuales bajo las condiciones del experimento. La Tm puede ser predicha conforme a una fórmula estándar, como la siguiente:

Tm = 81,5 + 16,6 \ log[Na+] + 0,41 (%G/C) - 0,61(%F) - 600/L

donde [Na+] es la concentración catiónica (usualmente ión de sodio) en mol/L; (%G/C) es el número de residuos G y C como un porcentaje de los residuos totales en el dúplex; (%F) es el porcentaje de formamida en la solución (wt/vol); y L es el número de nucleótidos en cada hebra del dúplex.

Pueden ser obtenidos polinucleótidos 11D10 útiles codificando fragmentos del 11D10 por medio de la generación de fragmentos de polinucleótido (basados en la SEC. ID. Nº 1 en la Figura 1, o en la SEC. ID. Nº 3 en la Figura 2, por ejemplo) y analizando los polipéptidos codificados de esta forma para determinar la función de interés. Alternativamente, dado un polipéptido 11D10 deseado, una secuencia de polinucleótido podría ser derivada de la secuencia aminoacídica del polipéptido 11D10. Por ejemplo, los polipéptidos 11D10 pueden ser analizados para determinar su habilidad de unión al Ab1 y/o al Ab3, o para provocar una respuesta inmune. Son expuestos más abajo ensayos para determinar estas funciones varias.

La invención incluye también polinucleótidos codificando derivados o variantes del 11D10, los cuales contienen uno o más polipéptidos 11D10, tales como los polinucleótidos codificando scFv, polímeros, proteínas de fusión y quimeras. Estas formas del 11D10 son expuestas más abajo.

La invención proporciona también polinucleótidos ligados covalentemente con un marcador detectable. Tales polinucleótidos son útiles, por ejemplo, como sondas para la detección de secuencias nucleótidas relacionadas.

Preparación de polinucleótidos 11D10

Los polinucleótidos de esta invención pueden ser obtenidos utilizando síntesis química, métodos recombinantes o PCR.

Los métodos de síntesis química de polinucleótidos son de sobra conocidos en este campo, y no es necesaria su descripción aquí en detalle. Un experto en este campo puede utilizar las secuencias aquí proporcionadas y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.

Para la preparación de polinucleótidos 11D10 utilizando métodos recombinantes, un polinucleótido comprendiendo una secuencia deseada puede ser insertado dentro de un vector adecuado, y el vector, a su vez, puede ser introducido dentro de una célula huésped adecuada para su replicado y amplificación. Los polinucleótidos pueden ser insertados dentro de células huésped por cualquiera de los medios conocidos en este campo. Las células son transformadas por medio de la introducción de un polinucleótido exógeno a través de captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento f o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede ser mantenido dentro de la célula como un vector no integrado (como un plásmido), o ser integrado dentro del genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede ser aislado de la célula huésped por medio de métodos de sobra conocidos en este campo. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989).

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Alternativamente, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología PCR es de sobra conocida en este campo, y es descrita en las Patentes americanas núms. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 y 4.683.202, así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).

El ARN puede ser obtenido utilizando el ADN aislado en un vector apropiado, e insertándolo dentro de una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN es transcrito en ARN, entonces el ARN puede ser aislado utilizando métodos de sobra conocidos para aquéllos expertos en este campo, como es indicado en Sambrook et al., (1989), por ejemplo.

Si son utilizados como vacuna, los plásmidos conteniendo los polinucleótidos 11D10 son preparados conforme es descrito por Horn et al. ((1995) Human Gene Therapy 6:565-573), lo cual produce un ADN de plásmido de grado farmacéutico adecuado para la administración.

Vectores de clonaje y expresión comprendiendo un polinucleótido 11D10

La presente invención incluye adicionalmente una variedad de vectores que tienen clonados en los mismos el polinucleótido(s) 11D10. Estos vectores pueden ser utilizados para la expresión de polipéptidos recombinantes, así como una fuente de polinucleótidos 11D10. Los vectores de clonaje pueden ser utilizados para obtener copias replica de los polinucleótidos 11D10 que contienen, o como un medio de almacenaje de polinucleótidos en un depósito para una futura recuperación. Los vectores de expresión (y células huésped conteniendo estos vectores de expresión) pueden ser utilizados para obtener polipéptidos producidos de los polinucleótidos que contienen. También pueden ser utilizados donde sea deseable expresar los polipéptidos 11D10 en un individuo y, de esta forma, poseer células intactas capaces de sintetizar el polipéptido, como en la terapia génica. Los vectores de clonaje y expresión adecuados incluyen cualquiera de los conocidos en este campo, por ejemplo, aquéllos para su utilización en sistemas de expresión bacterianos, de mamífero, de levadura y de insecto. Los vectores específicos y las células huésped adecuadas son conocidos en este campo y no es necesaria su descripción aquí en detalle. Por ejemplo, ver Gacesa y Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994).

Los vectores de clonaje y expresión usualmente contienen un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen codificando una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula huésped transformada con el vector), aunque un gen marcador de este tipo puede ser transportado en otra secuencia de polinucleótido co-introducida dentro de la célula huésped. Únicamente aquellas células huésped en las cuales haya sido introducido un gen seleccionable sobrevivirán y/o crecerán bajo condiciones selectivas. Los genes de selección usuales codifican la proteína(s) que (a) confiere resistencia a los antibióticos u otras substancias de tipo toxina, por ejemplo, la ampicilina, la neomicina, el metotrexato, etc.; (b) complementa deficiencias auxotróficas; o (c) proporciona nutrientes indispensables no disponibles en el compuesto del medio de cultivo. La elección del gen marcador adecuado dependerá de la célula huésped, y son conocidos en este campo genes adecuados para los diferentes huéspedes. Los vectores de clonaje y expresión contienen también usualmente un sistema de replicado reconocido por el huésped.

Los vectores de clonaje adecuados pueden ser construidos conforme a técnicas estándar, o pueden ser seleccionados de entre un amplio número de vectores de clonaje disponibles en este campo. Aunque el vector de clonaje seleccionado puede variar según la célula huésped que vaya a ser utilizada, los vectores de clonaje útiles tendrán generalmente la habilidad de auto-replicarse, pueden poseer una diana única para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden portar genes para un marcador que pueden ser utilizados a la hora de seleccionar clones que contengan el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADNs fago, y vectores lanzadera tales como el pSA3 y el pAT28. Estos y otros muchos vectores de clonaje se encuentran disponibles de vendedores comerciales como BioRad, Strategene e Invitrogen.

Los vectores de expresión son, usualmente, constructos de polinucleótido replicable que contienen un polinucleótido codificando un polipéptido 11D10 de interés. El polinucleótido codificando el polipéptido 11D10 se encuentra ligado operativamente a elementos de control transcripcional adecuados, tales como promotores, mejoradores y terminadores. Para la expresión (es decir, traducción) son usualmente requeridos también uno o más elementos de control de traducción, tales como sitios de unión del ribosoma, sitios de iniciación de traducción y codones de terminación. Estos elementos de control (transcripcional y de traducción) pueden ser derivados de nucleótidos 11D10 (es decir, el gen 11D10), o podrían ser heterólogos (es decir, derivados de otros genes y/o otros organismos). Puede ser incluida también una secuencia de polinucleótido codificando un péptido señal, con el fin de permitir que un polipéptido 11D10 cruce y/o se aloje en membranas celulares, o sea secretado por la célula. Son conocidos en este campo un número de vectores de expresión adecuados para la expresión en células eucarióticas, incluyendo células de levadura, de ave y de mamífero. Un ejemplo de un vector de expresión es el pcADN3 (Invitrogen, San Diego, CA), en el cual la transcripción es conducida por el promotor/mejorador temprano del citomegalovirus (CMV). Este vector contiene también sitios de reconocimiento para múltiples enzimas de restricción para inserción del polinucleótido 11D10 de interés. Otro ejemplo de un vector de expresión (sistema) es el sistema de baculovirus/insecto.

Los vectores conteniendo los polinucleótidos de interés pueden ser introducidos dentro de la célula huésped a través de cualquiera de entre un número de medios adecuados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrán u otras substancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (donde el vector es un agente infeccioso, como un virus vaccinia, el cual es expuesto más abajo).
La elección del medio de introducción de vectores o polinucleótidos 11D10 dependerá a menudo de la célula huésped.

Una vez introducido dentro de una célula huésped adecuada, E. coli o COS-7, la expresión de un polipéptido(s) 11D10 puede ser determinada utilizando cualquiera de los ensayos aquí descritos. Por ejemplo, puede ser detectada la presencia del polipéptido 11D10 por medio de RIA o ELISA en el sobrenadante del cultivo (si es secretado el polipéptido(s) 11D10) o en lisados celulares.

Un vector de expresión particularmente útil para los polinucleótidos 11D10 es un virus vaccinia compuesto de una secuencia de polinucleótido 11D10, el cual puede ser utilizado también en preparaciones de vacuna. Moss (1991) Science 252:1662-1667. Para introducir secuencias de polinucleótido codificando el polipéptido 11D10, incluyendo fragmentos del polipéptido 11D10, dentro de vaccinia, la secuencia del polinucleótido de interés es insertada primeramente dentro de un plásmido conteniendo un promotor de virus vaccinia, con secuencias flanqueadoras homólogas al ADN de vaccinia no esenciales para el replicado. A continuación, células conteniendo el plásmido son infectadas con vaccinia, lo cual lleva a un menor nivel de recombinación homóloga entre el plásmido y el virus, resultando en una transferencia del promotor vaccinia y de la secuencia de polinucleótido codificando el polipéptido 11D10 dentro del genoma del virus vaccinia. Usualmente, el polinucleótido 11D10 es insertado dentro del gen viral tk (timidina quinasa). La inserción en el sitio tk atenúa el virus más de 10.000 veces, comparado con el tipo salvaje (Flexner et al. (1980) Vaccine 88 (Cold Spring Harbor Laboratory), 179-184). El virus recombinante es identificado por el fenotipo tk. Preferiblemente, la expresión del polinucleótido 11D10 se encuentra bajo el control del promotor temprano/tardío de vaccinia (7,5 K), por el que el polipéptido 11D10 resultante puede ser expresado en células infectadas a lo largo de todo el ciclo vital del virus. Sin embargo, pueden ser utilizados otros promotores conocidos en este campo, tales como el pH6, los promotores sintéticos, los promotores SV40 o los promotores procedentes de adenovirus. La expresión del polipéptido(s) 11D10 tiene lugar en células infectadas con la vaccinia recombinante o en individuos que son inmunizados con el virus vaccinia recombinante vivo. Es proporcionada en el Ejemplo 4 la construcción de un vector vaccinia para la expresión de polipéptidos 11D10. Puede ser utilizada cualquier hebra de vaccinia de entre las varias existentes, incluyendo, aunque sin estar limitadas a las mismas, la WR, la ALVAC y la NYVAC. Las hebras ALVAC y NYVAC son utilizadas para infectar células de aves.

Un vector vaccinia de esta invención puede contener uno o más polinucleótidos codificando un polipéptido(s) 11D10. Puede contener también secuencias de polinucleótido codificando otros polipéptidos que mejoren, faciliten o modulen el resultado deseado, tales como linfoquinas, incluyendo, aunque sin estar limitadas a las mismas, la IL-2, la IL-4 y la GM-CSF. Una linfoquina preferida es la GM-CSF. Si es utilizada la GM-CSF, es preferible también eliminar elementos ricos en AU de las regiones no traducidas 3’ de los transcritos de ARN, y/o eliminar secuencias en la región no traducida 5’ que son capaces de formar un lazo en horquilla, por medio de métodos recombinantes. También se encuentran comprendidos en esta invención los vectores vaccinia codificando para variantes 11D10 recombinantes conteniendo polipéptidos 11D10, tales como scFvs, quimeras y polímeros (descritos más abajo).

Células huésped transformadas con polinucleótidos 11D10

Otra realización de esta invención son células huésped transformadas (es decir, comprendiendo) con polinucleótidos 11D10 y/o vectores que poseen secuencias de polinucleótido(s) 11D10, conforme es descrito más arriba. Pueden ser utilizadas tanto células huésped procarióticas como eucarióticas. Los huéspedes procarióticos incluyen células bacterianas, por ejemplo, E. coli y micobacteria. Entre los huéspedes eucarióticos se encuentran las células de levadura, de insecto, de ave, de planta y de mamífero. Los sistemas huésped son conocidos en este campo y no necesitan ser descritos aquí en detalle. Un ejemplo de una célula huésped de mamífero es la NS0, obtenible de la European Collection of Cell Cultures (Inglaterra). La transfección de células NS0 con un plásmido, por ejemplo, lo cual es conducido por un promotor del citomegalovirus (CMV), seguido de la amplificación de este plásmido al utilizar glutamina sintetasa, proporciona un sistema útil para la producción de proteínas. Cockett et al. (1990) Bio/Technology 8:662-667.

Las células huésped de esta invención pueden ser utilizadas, inter alia, como repositorios de polinucleótidos 11D10 y/o vehículos para la producción de polinucleótidos y polipéptidos 11D10. Pueden ser utilizadas también como vehículos para la administración in vivo de polipéptidos 11D10.

Usos y Métodos de Utilización de polinucleótidos 11D10

Los polinucleótidos de esta invención poseen varios usos. Los polinucleótidos 11D10 son útiles, por ejemplo, en sistemas de expresión para la producción recombinante del 11D10, o de fragmentos del 11D10. Son útiles también como sondas de hibridización en ensayos para determinar la presencia en una muestra de secuencias de polinucleótido(s) 11D10, o relacionadas, utilizando métodos de sobra conocidos por aquéllos que trabajan en este campo. Además, los polinucleótidos 11D10 son útiles también como iniciadores para llevar a cabo la amplificación de los polinucleótidos deseados. Los polinucleótidos de esta invención son útiles también como vacunas y para la terapia génica.

Los polinucleótidos 11D10 de esta invención pueden ser utilizados como iniciadores en la amplificación de polinucleótidos codificando el 11D10, o un fragmento del mismo, como en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR ha sido descrita más arriba. Las condiciones para llevar a cabo las reacciones PCR dependen de la especificidad deseada, la cual, a su vez, puede ser ajustada por medio del iniciador utilizado y de las condiciones de la reacción. Tales ajustes son conocidos en este campo y no es necesario que sean explicados aquí en detalle.

Los polinucleótidos 11D10 pueden ser utilizados también como sondas de hibridización para la detección, por ejemplo, de la presencia de polinucleótidos 11D10 en una célula. Por ejemplo, podría ser utilizado un polinucleótido 11D10 como una sonda para determinar la presencia de secuencias de polinucleótido 11D10 en células usadas en terapia génica. Para estos métodos, es obtenida una muestra celular adecuada, o una muestra derivada de células (cualquiera de las cuales es sospechosa de contener secuencias de polinucleótido 11D10), y es testada para determinar la presencia del polinucleótido 11D10 por medio de la puesta en contacto de los polinucleótidos de la muestra con la sonda de polinucleótido 11D10. El método es llevado a cabo para permitir que tenga lugar la hibridización entre la sonda 11D10 y el polinucleótido 11D10 de interés, y el complejo hibridizado resultante (si es que lo hay) es detectado. Tales métodos conllevan procedimientos de sobra conocidos en este campo, tales como cultivo celular, preparación de polinucleótidos, hibridización y detección de complejos híbridos formados, si es que los hay. Utilizando métodos similares, las sondas pueden ser utilizadas también para detectar vectores, los cuales son utilizados, a su vez, para producir polipéptidos 11D10, 11D10 intacto, o formas variantes recombinantes del 11D10.

Los polinucleótidos 11D10 de esta invención pueden ser utilizados en sistemas de expresión para producir polipéptidos 11D10, 11D10 intacto, o formas recombinantes del 11D10, incluyendo 11D10 intacto, las cuales poseen propiedades deseables mejoradas, equivalentes o diferentes. Estas formas recombinantes son realizadas utilizando métodos rutinarios en este campo. Ejemplos de formas recombinantes del 11D10 y de polipéptidos 11D10 incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, híbridos, quimeras, variantes de cadena sencilla, y proteínas de fusión conteniendo otros componentes como las citoquinas. Es proporcionada más abajo una descripción más detallada de estas formas recombinantes del 11D10 y de polipéptidos 11D10, y de cómo son realizadas.

Otra utilización de los polinucleótidos 11D10 es en vacunas y en terapia génica. El principio general es administrar el polinucleótido de tal forma que, o bien promueva, o atenué la expresión del polipéptido codificado en él. De esta forma, la presente invención incluye métodos de inducción de una respuesta inmune, y métodos de tratamiento comprendiendo la administración a un individuo de una cantidad efectiva del polinucleótido(s) 11D10. En estos métodos es administrado a un individuo un polinucleótido 11D10 codificando un polipéptido 11D10, bien directamente o por medio de células transfectadas con el polinucleótido(s) 11D10. Preferiblemente, el polinucleótido 11D10 es replicado dentro de una célula. De esta forma, el polinucleótido(s) 11D10 se encuentra ligado operativamente a un promotor adecuado, como un promotor heterólogo, que sea intrínsecamente activo en células del tipo tisular diana. La entrada del polinucleótido dentro de la célula es conseguida por medio de técnicas conocidas en este campo, como por medio de un vector de expresión viral, como un vector vaccinia o adenovirus, o por asociación del polinucleótido con un liposoma catiónico. Preferiblemente, el polinucleótido(s) 11D10 se encuentra en forma de un plásmido circular, preferiblemente en una configuración superhelicoidal. Preferiblemente, una vez que se encuentran en el núcleo celular, los plásmidos persisten como moléculas episomales circulares no replicativas. La mutagénesis in vitro puede ser llevada a cabo, a su vez, con los constructos plásmidos, para codificar, por ejemplo, más moléculas inmunogénicas o epítopes de células T con un motivo HLA deseable.

Con el fin de determinar si los plásmidos conteniendo polinucleótidos 11D10 son capaces de expresión en células eucarióticas, células eucarióticas tales como, por ejemplo, células COS-7, CHO (de origen aviar) o HeLa (de origen humano) pueden ser transfectadas con los plásmidos. A continuación, la expresión que da como resultado el polipéptido(s) 11D10 es determinada por medio de RIA o ELISA. Puede ser realizado el western blotting con un lisado celular utilizando MC-10 (Ab1) como una sonda, con el fin de chequear el polipéptido 11D10 asociado a la célula. Alternativamente, para polipéptidos 11D10 más pequeños, la expresión puede ser detectada, por ejemplo, construyendo el plásmido de tal forma que el polipéptido 11D10 resultante esté marcado de forma recombinante, como por ejemplo con un marcador enzimático. La caracterización adicional del polipéptido 11D10 expresado puede ser conseguida por medio de la purificación del polipéptido 11D10, seguido de la realización de los ensayos funcionales aquí descritos (por ejemplo, ensayo de inhibición de unión celular).

Esta invención comprende también la transfección ex vivo de polinucleótidos 11D10, en la cual las células eliminadas de individuos son transfectadas con vectores codificando polipéptidos 11D10, y son reintroducidas dentro del individuo. Las células transfectadas adecuadas incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, las células mononucleares sanguíneas periféricas.

La administración terapéutica de los polinucleótidos 11D10 es expuesta más abajo en detalle.

Polipéptidos 11D10

La presente invención comprende fragmentos de polipéptido del 11D10 conteniendo, al menos, una parte de una región variable del 11D10 y proteínas comprendiendo un fragmento del 11D10. Los fragmentos de polipéptido del 11D10, los cuales pueden comprender cualquier región o sub-región de la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) o de la SEC. ID.
Nº 4 (Figura 2) (siempre que los fragmentos comprendan, al menos, una parte de una región variable), son identificados y caracterizados por medio de cualquiera (uno o más) de los siguientes criterios: (a) habilidad para unirse al Ab1 y/o al Ab3; (b) habilidad para inducir una respuesta inmune contra el HMFG; (c) homología (es decir, identidad substancial de secuencia) con cualquier parte del HMFG; (d) habilidad para paliar, mejorar, reducir o retrasar una enfermedad asociada al HMFG, particularmente tumores asociados al HMFG.

Los fragmentos de polipéptido del 11D10 poseen una variedad de usos, incluyendo su utilización en composiciones farmacéuticas y vacunas, como una herramienta de diagnóstico para monitorizar los niveles del Ab1 y/o del Ab3, su utilización a la hora de producir un anticuerpo que se una al HMFG, y su utilización para eliminar Ab1 marcado de un individuo que ha recibido anticuerpo anti-HMFG marcado.

A no ser que sea indicado específicamente, el término "polipéptidos 11D10" incluirá todas las realizaciones de los polipéptidos de esta invención.

La invención incluye polipéptidos que poseen la actividad inmunológica del 11D10, en donde el polipéptido está compuesto de una secuencia de, al menos, 5 aminoácidos contiguos procedentes de una región variable del 11D10. En una realización, la región variable es de una cadena ligera, más particularmente, representada dentro de la SEC. ID.
Nº 2 (Figura 1). En otra realización, la región variable es de una cadena pesada, más particularmente, representada dentro de la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2). En otra realización, los 5 aminoácidos contiguos son de una región determinante de complementariedad (CDR).

Las secuencias aminoacídicas de la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) y de la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2) son presentadas en la Figura 3, la cual representa secuencias marco y CDR de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del 11D10, respectivamente. Las secuencias marco son responsables del correcto plegamiento en hoja \beta de los dominios VL y VH, y de las interacciones entre cadenas que juntan los dominios. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se refieren a seis secuencias hipervariables de la región variable (3 del VL y 3 del VH), las cuales se cree que, juntas, forman el sitio de unión del antígeno. La delineación de estas regiones así como la identificación de las secuencias líder del 11D10 se basó en una búsqueda y en el análisis de la base de datos inmunológica Kabat, por medio del programa BLAST.

Otra realización de la invención son fragmentos de polipéptido del 11D10, los cuales comprenden las secuencias seleccionadas de entre el grupo consistente en las secuencias aminoacídicas (fragmentos) representadas en la Figura 3. Estos polipéptidos representan sub-regiones funcionales de las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada (es decir, marco y CDR). Preferiblemente, estos polipéptidos 11D10 comprenden una CDR.

La invención incluye también un fragmento de polipéptido de la región variable de cadena ligera del 11D10, comprendiendo, al menos, 25 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, 28, más preferiblemente, al menos, 30 aminoácidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 35 aminoácidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 50 aminoácidos contiguos de la región variable representada dentro de la SEC. ID. Nº 2 (Figura 2) o, al menos, 5 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, 7 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, 8 aminoácidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 10 aminoácidos contiguos de la CDR1 o de la CDR2 de la misma o, al menos, 7 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, 8 aminoácidos contiguos, más preferiblemente, al menos, 9 aminoácidos contiguos de la CDR3 de la misma.

En otra realización, la invención incluye un fragmento de polipéptido de la región variable de cadena pesada del 11D10, comprendiendo, al menos, 17 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, 20 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, alrededor de 25 aminoácidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 35 aminoácidos contiguos, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de 50 aminoácidos contiguos de la región variable representada dentro de la SEC. ID. Nº 4 (Figura 1), o 5 aminoácidos contiguos de la CDR1 de la misma o, al menos, 6 aminoácidos contiguos, preferiblemente, al menos, 7 aminoácidos contiguos, más preferiblemente, al menos, alrededor de 10 aminoácidos contiguos de la CDR2 o de la CDR3 de la misma.

El tamaño de los fragmentos del polipéptido 11D10 puede variar ampliamente, ya que la longitud requerida para producir la actividad puede ser muy pequeña, mientras que la longitud máxima usualmente no va en detrimento de causar la actividad. El tamaño mínimo debe ser el suficiente como para proporcionar una función deseada. Por ejemplo, un sitio de unión en un polipéptido puede ser de longitud tan pequeña como de alrededor de 5 aminoácidos, mientras que otros sitios de unión están formados por la convergencia de aminoácidos, los cuales se encuentran espacialmente próximos, pero no en secuencia contigua. De esta forma, la invención incluye fragmentos de polipéptido del 11D10 comprendiendo una parte de la secuencia aminoacídica representada en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) o en la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2), en la cual el polinucleótido 11D10 tiene una longitud de alrededor de 5 aminoácidos. La invención proporciona también fragmentos de polipéptido del 11D10 comprendiendo una parte de la secuencia aminoacídica representada en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) o en la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2), en la cual el polinucleótido 11D10 tiene una longitud de alrededor de 10, 15, 25, 30, 50, 100 o 150 aminoácidos. La invención proporciona también fragmentos de polipéptido del 11D10 comprendiendo una parte de la secuencia aminoacídica representada en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) o en la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2) poseyendo, al menos, alrededor de 5 aminoácidos y, como máximo, alrededor de 100 aminoácidos. Como resulta evidente para alguien experto en este campo, estos polipéptidos 11D10, sin tener en cuenta su tamaño, pueden estar asociados también, o conjugados, con otras substancias o agentes para facilitar, mejorar o modular la función y/o especificidad de un polipéptido 11D10. Ejemplos de tales modificaciones serán expuestos más abajo.

En otra realización son proporcionados fragmentos de polipéptido 11D10 que contienen una región que es homóloga al HMFG, particularmente a la repetición en tándem de 20 aminoácidos dentro del HMFG. Ver, por ejemplo, Larocca et al. (1992) Hybridoma 11:191-201. Tales fragmentos homólogos pueden, al menos en parte, asemejarse nominalmente al antígeno mucina de alto peso molecular del HMFG y, de esta forma, pueden participar en la presentación antigénica al mimetizar al HMFG, el antígeno diana final. Estos polipéptidos 11D10 pueden participar también en la presentación antigénica en asociación con los antígenos del complejo de histocompatibilidad mayor de clase I (MHC), desencadenando de esta forma la matanza por parte de células T citotóxicas. La Figura 23 muestra alineaciones entre secuencias similares del 11D10 y del HMFG, cuando las secuencias aminoacídicas se encuentran alineadas en ambas orientaciones (es decir, alineadas en la misma orientación, y en la orientación inversa). Ejemplos de regiones de homología con el HMFG comprendidas en esta invención son (la numeración aminoacídica está basada en los aminoácidos 1 a 107 de la SEC. ID. Nº 2; Figura 3): (a) del aminoácido 51 al aminoácido 52; del aminoácido 54 al aminoácido 56; del aminoácido 92 al aminoácido 93 de la cadena ligera; y (b) del aminoácido 57 al aminoácido 58 de la cadena pesada. Por consiguiente, la invención incluye también polipéptidos 11D10 que comprenden la secuencia aminoacídica desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 53, desde alrededor del aminoácido 50 hasta alrededor del aminoácido 56, desde alrededor del aminoácido 92 hasta alrededor del aminoácido 93, o desde alrededor del aminoácido 90 hasta alrededor del aminoácido 94, de la secuencia representada en la Figura 3-A (aminoácidos 1 a 107 de la SEC. ID. Nº 2), así como polipéptidos que comprenden desde alrededor del aminoácido 57 hasta alrededor del aminoácido 58, desde alrededor del aminoácido 56 hasta alrededor del aminoácido 58 o, desde alrededor del aminoácido 53 hasta alrededor del aminoácido 58, de la secuencia representada en la Figura 3-B (aminoácidos del 1 al 118 de la SEC. ID. Nº 4).

La invención incluye modificaciones en los polipéptidos 11D10, incluyendo fragmentos funcionalmente equivalentes de los polipéptidos 11D10, las cuales no afectan significativamente a sus propiedades, y variantes, los cuales han mejorado o disminuido la actividad. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en este campo, y no es necesaria su explicación aquí en detalle. Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen los polipéptidos con substituciones conservadoras de residuos aminoacídicos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos, las cuales no cambian deletereamente de forma significativa la actividad funcional, o la utilización de análogos químicos. Los residuos aminoacídicos, los cuales pueden ser substituidos de forma conservadora entre sí, incluyen, pero sin estar limitados a los mismos: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/triosina. Estos polipéptidos incluyen también polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones post-traducción, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferiblemente, las substituciones aminoacídicas serán conservadoras, es decir, el aminoácido substituido poseería propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Tales substituciones conservadoras son conocidas en este campo y han sido proporcionados ejemplos más arriba. Las modificaciones aminoacídicas pueden variar desde cambiar o modificar uno o más aminoácidos, hasta un completo rediseño de una región, como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o la especificidad. Otros métodos de modificación incluyen la utilización de técnicas de acoplamiento conocidas en este campo, incluyendo, aunque sin estar limitadas a las mismas, medios enzimáticos, substitución oxidativa y quelación. Las modificaciones pueden ser utilizadas, por ejemplo, para la unión de marcadores en el inmunoensayo, como la unión de restos radioactivos para radioinmunoensayo. Los polipéptidos 11D10 modificados son preparados utilizando procedimientos establecidos en este campo y pueden ser monitorizados utilizando ensayos estándar conocidos en este campo, algunos de los cuales son descritos más abajo y en los Ejemplos.

La invención abarca también las proteínas de fusión, comprendiendo uno o más polipéptidos 11D10. En una realización es proporcionado un polipéptido de fusión que comprende, al menos, 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena ligera representada en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) y, al menos, 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena pesada representada en la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2). En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región constante de la inmunoglobulina heteróloga. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada del 11D10. Para los propósitos de esta invención, una proteína de fusión 11D10 contiene uno o más polipéptidos 11D10 y otra secuencia aminoacídica a la cual no se encuentra unida la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga procedente de otra región. Secuencias heterólogas útiles incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, secuencias que proporcionan la secreción en una célula huésped, que mejoran la reactividad inmunológica, o que facilitan el acoplamiento del polipéptido con un soporte para inmunoensayo o con un portador de vacuna. Otros ejemplos son los así llamados "súper antígenos" bacterianos, tales como la enterotoxina A del estafilococo (SEA). Dohlsten et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8945-8949. Por ejemplo, un polipéptido 11D10 puede ser fusionado con un modificador de biorespuesta. Ejemplos de modificadores de biorespuesta incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, las citoquinas o linfoquinas tales como la GM-CSF, la interleuquina-2 (IL-2), la interleuquina-4 (IL-4) y el interferón \gamma. Por consiguiente, la invención incluye polipéptidos de fusión 11D10 que contienen la GM-CSF o la IL-2. La Figura 25 representa un ejemplo de un constructo plásmido para una fusión de un polipéptido 11D10 y las linfoquinas preferidas GM-CSF o IL-2. La co-transfección de este plásmido (el cual, conforme es mostrado, codifica la cadena pesada del 11D10) con un plásmido codificando la cadena ligera del 11D10 proporciona también un polipéptido 11D10 de fusión. Preferiblemente, un plásmido codificando una cadena ligera del 11D10 es transfectado en primer lugar en células Sp2/0 o NS0 por medio de fusión protoplástica (Shin et al. (1989) Meth. Enzym. 178:459-476) seguido de la transfección de un plásmido conteniendo las secuencias codificadoras para una cadena pesada del 11D10 por medio de electroporación dentro de clones de alta producción procedentes de la primera transfección. Shin et al. (1989). Estos procedimientos son descritos con más detalle en el Ejemplo 7.

Un anticuerpo (es decir, un anticuerpo conteniendo una cadena pesada y una ligera) producido como resultado de la transfección de los plásmidos anteriores (por medio de co-transfección o de transfección secuencial) puede ser detectado por medio de cualquier ensayo que detecte la formación de una cadena ligera acoplada a una cadena pesada. Tales ensayos son rutinarios en este campo. Por ejemplo, puede ser utilizada la electrofóresis no reductora en gel SDS para detectar la presencia de una molécula anticuerpo que contenga tanto la cadena ligera como la pesada, según es indicado por el peso molecular. Otro ejemplo de un ensayo que detecta la cadena ligera acoplada a la cadena pesada es el ELISA, conforme sigue. Placas de microtítulo son recubiertas con anticuerpo de cadena ligera kappa anti-humana de cabra en concentraciones estándar, son bloqueadas con BSA y lavadas. Las placas recubiertas son hechas reaccionar con sobrenadante de cultivo de células expresando distintos constructos de la prueba. Después del lavado, las placas son tratadas a continuación con anticuerpo gamma-1 antihumano de cabra con conjugado de fosfatasa alcalina, y desarrolladas de la manera usual. La densidad óptica es medida a 405 nm. Si el anticuerpo de fusión contiene una molécula reactiva, como una citoquina, el anticuerpo puede ser detectado también utilizando un ensayo que mida la reactividad de la citoquina, por ejemplo. Tales ensayos son conocidos en este campo y no es necesaria aquí su descripción detallada. Por ejemplo, un anticuerpo 11D10 y/o polipéptido 11D10 de fusión GM-CSF puede ser detectado como sigue. Las placas son recubiertas con anticuerpo kappa anti-humano de cabra, y las placas recubiertas son hechas reaccionar con sobrenadante de cultivo (si es secretada la fusión). Las placas que han sido hechas reaccionar son tratadas a continuación con anticuerpo de rata conjugado con GM-CSF murina/biotina, y el complejo resultante es detectado midiendo la densidad óptica a 490 nm. Estos ensayos son descritos con más detalle en el Ejemplo 7.

De forma alternativa, el plásmido de la Figura 25 puede ser transfectado dentro de un mutante que haya perdido la cadena pesada. Por ejemplo, los mutantes que han perdido la cadena pesada pueden ser obtenidos tratando 2 x 10^{7} células 11D10 con IgG de conejo anti-ratón marcado con fluoresceína (específico de cadena P, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) conforme a las instrucciones del proveedor. Son analizadas las poblaciones celulares tintadas y sin tinción en un clasificador celular activado por fluorescencia. Las células no tintadas son recogidas en un tubo esterilizado y colocadas en placas de 96 pocillos, con 1 célula/pocillo por medio de dilución limitada. A continuación, los sobrenadantes del cultivo son sometidos a ELISA utilizando IgG de cabra anti-ratón (específico de cadena pesada) y kappa de cabra anti-ratón. Los clones con fenotipo kappa-positivo e IgG-negativo son subclonados al menos 3 veces, con el fin de obtener mutantes estables 11D10(-P). Los clones putativos mutantes sin cadena pesada (11D10(-P)) pueden ser aislados, y es determinada la secuencia del ADNc de la región variable de la cadena ligera para verificar que la cadena ligera que queda es la del 11D10. Es realizada PCR con transcripción reversa del ARNm para el VH 11D10 con dos juegos de iniciadores 5’ y 3’, utilizados para clonar el ADNc del 11D10(-P) (Ejemplo 2). Un mutante sin cadena pesada debería proporcionar una banda de ADN no detectable. A continuación puede ser realizada la transfección de estas células con el constructo de cadena pesada utilizando métodos estándar en este campo, tales como la electroporación.

Un polipéptido de fusión 11D10 puede ser creado, por ejemplo, por medio de síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en el cual las regiones peptídicas son codificadas con la relación deseada. Estas proteínas de fusión pueden ser útiles para la mejora, modificación y/o facilitación de una actividad de un polipéptido 11D10.

La invención abarca también formas alteradas, recombinantes, del 11D10, comprendiendo polipéptido(s) 11D10, es decir, polipéptidos 11D10 que contengan, al menos, una parte de una región variable del 11D10, conforme es representado en las Figuras 1 y 2. Conforme es utilizado aquí, una forma "alterada" o "recombinante" del 11D10 contiene un polipéptido(s) 11D10 en una secuencia y/o configuración que es diferente a la del 11D10 intacto. Una forma recombinante de anticuerpo 11D10 incluida en esta invención es un anticuerpo híbrido, en el cual un par de cadenas pesada y ligera es homólogo a las de un primer anticuerpo, en el cual el otro par de cadenas pesada y ligera es homólogo a las de un segundo anticuerpo distinto. Para los propósitos de esta invención, un par de cadenas ligera y pesada proceden del 11D10. Usualmente, cada uno de estos dos pares unirá epítopes distintos del HMFG. Tales híbridos pueden ser formados también utilizando cadenas quiméricas, conforme es indicado más abajo.

En otra realización son proporcionadas quimeras 11D10, en las cuales las cadenas pesada y/o ligera son proteínas de fusión. Usualmente el dominio constante de estas cadenas procede de una especie y/o clase determinada, y los dominios variables proceden de especies y/o clases diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo 11D10 "humanizado" es un anticuerpo en el cual la región constante es de origen humano, y las regiones variables proceden del 11D10 (es decir, murinas). También se encuentra representado dentro de la invención un anticuerpo con una región variable humanizada, en el cual las regiones CDR comprenden secuencias aminoacídicas 11D10, mientras que las regiones marco son derivadas de secuencias humanas. Ver, por ejemplo, EP 0329400. También se encuentran representados los fragmentos funcionales de quimeras. Un ejemplo es un fragmento Fab humanizado, el cual contiene una región bisagra humana, una región constante primera humana, una región constante de cadena pesada o ligera kappa humana, y la región variable procedente del 11D10. Los fragmentos Fab 11D10 humanizados pueden, a su vez, ser construidos para formar dímeros Fab. Usualmente, las proteínas de fusión 11D10 y las quimeras 11D10 de esta invención son construidas preparando y expresando un polinucleótido codificándolas, utilizando métodos recombinantes aquí descritos, aunque pueden ser preparadas también por otros medios conocidos en este campo, incluyendo, por ejemplo, la síntesis química.

Otro ejemplo de formas alteradas, recombinantes, del 11D10 que están comprendidas en esta invención son los anticuerpos alterados, lo cual se refiere a anticuerpos en los que la secuencia aminoacídica del 11D10 ha sido variada. Utilizando técnicas recombinantes estándar los anticuerpos 11D10 pueden ser diseñados para obtener las propiedades deseadas. Por ejemplo, un cambio en la secuencia aminoacídica pueda dar como resultado una mayor inmunogenicidad del polipéptido 11D10 resultante. Los cambios varían desde el cambio de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, por ejemplo, de la región constante. Los cambios en la región constante, en general, pueden conseguir características deseadas de procesado celular, por ejemplo, cambios en la fijación del complemento, interacción con membranas y otras funciones efectoras. Los cambios en la región variable pueden ser realizados para alterar las características de unión. El anticuerpo 11D10 alterado/recombinante puede ser diseñado también para ayudar al suministro específico de una substancia (como una linfoquina) a una célula efectora. Han sido expuestas más arriba otras modificaciones de secuencia aminoacídica.

La invención abarca también fragmentos de la región variable de cadena sencilla ("scFv") del 11D10. Los fragmentos de la región variable de cadena sencilla son preparados ligando las regiones variables de la cadena ligera y/o de la cadena pesada por medio de la utilización de un péptido ligando corto. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Un ejemplo de un péptido ligando es el (GGGGS)3 (SEC. ID. Nº 35), el cual se extiende aproximadamente 3,5 nm entre el terminal carboxi de una región variable y el terminal amino de la otra región variable. Han sido diseñados y utilizados ligandos de otras secuencias. Bird et al. (1988). Los ligando pueden ser modificados, a su vez, para funciones adicionales, tales como unión de fármacos o unión a soportes sólidos.

Por consiguiente, una realización de la presente invención es un polipéptido de fusión comprendiendo, al menos, 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena ligera representada en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) y, al menos, 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena pesada representada en la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2), en donde los segmentos aminoacídicos son unidos por medio de un polipéptido ligando de alrededor de 5 a 20 aminoácidos. En otra realización, el polipéptido de fusión (scFv) comprende la región variable de la cadena ligera de la secuencia aminoacídica representada en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 1) y la región variable de la región pesada de la secuencia aminoacídica representada en la SEC. ID. Nº 4 (Figura 2).

Puede ser utilizado cualquier péptido teniendo la suficiente flexibilidad y longitud como un ligando en un scFv. Usualmente, el ligando es seleccionado para poseer de poca a ninguna inmunogenicidad. En relación con los componentes 11D10 del scFv, puede ser utilizada toda o una parte de la cadena pesada y/o de la cadena ligera. Usualmente, se encuentran incluidas en el scFv las regiones variables completas. Por ejemplo, la región variable de la cadena ligera puede ser ligada a la región variable de la cadena pesada. Alternativamente, una parte de la región variable de la cadena ligera puede ser ligada a toda, o a una parte, de la región variable de la cadena pesada. Para ligandos asimétricos, tales como el (GGGGS)3 (SEC. ID. Nº 35), los scFvs pueden ser ensamblados en cualquier orden, por ejemplo, VH-(ligando)-VL o VL-(ligando)-VH. Sin embargo, si son expresadas en el E.coli, puede existir una diferencia en el nivel de expresión de estas dos configuraciones. Es posible también el construir un scFv híbrido, o bifásico, en el cual un componente es un polipéptido 11D10 y otro componente es un polipéptido diferente, como un epítope de célula T. Pueden ser construidos también scFvs tándem, tales como (X)-(ligando)-(X)-(ligando)-(X), en los cuales X son polipéptidos 11D10, o combinaciones de polipéptidos 11D10 con otros polipéptidos.

Las variantes de cadena sencilla pueden ser producidas recombinantemente o sintéticamente. Para la producción sintética del scFv puede ser utilizado un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante del scFv puede ser introducido un plásmido adecuado, conteniendo un polinucleótido que codifique el scFv, dentro de una célula huésped adecuada, eucariótica -como células de la levadura, de planta, de insecto o de mamífero-, o procariótica, como el E. coli. Los polinucleótidos codificando el scFv de interés pueden ser preparados por medio de manipulaciones rutinarias, como ligado de polinucleótidos. El scFv resultante puede ser aislado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en este campo.

Un sistema especialmente útil para la producción de scFvs del 11D10 es el vector plásmido pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI) en E. coli. El pET-22b(+) contiene un dominio de unión iónica de níquel consistente en 6 residuos de histidina secuenciales, el cual sirve como una base para la purificación del scFv. Sin embargo, este ejemplo (presentado en el Ejemplo 7) es únicamente a efectos ilustrativos y no es limitador. Otro ejemplo de un vector que puede ser utilizado es el pcADN3 (Invitrogen, San Diego, CA), el cual ha sido descrito más arriba.

Si es utilizado el E. coli para la producción del scFv, las condiciones deben ser tales que el polipéptido scFv pueda asumir la estructura óptima terciaria y cuaternaria. Dependiendo del plásmido utilizado (especialmente de la actividad del promotor) y de la célula huésped, puede ser necesario modular la producción del scFv. Por ejemplo, puede ser necesaria la utilización de un promotor más débil, o la expresión a temperaturas más bajas, con el fin de optimizar la producción del scFv. De forma alternativa, puede ser apropiada la expresión del scFv en células eucarióticas, tales como de levadura, de insecto, de planta o de mamífero.

Pueden ser testados varios scFvs para determinar la actividad de unión, por ejemplo, testando la unión directa al Ab1, o empleándolos en experimentos de tipo competitivo aquí descritos. Cualquiera de los ensayos descritos infra para la prueba de fragmentos para determinar la actividad 11D10 puede ser utilizado para testar los scFvs. Por ejemplo, el Ab1 (MC-10) radiomarcado es hecho reaccionar con células HMFG+, tales como células MCF-7, en ausencia o presencia (en cantidades en aumento) del scFv a ser testado. El porcentaje de inhibición observado es comparado con el del 11D10 u otro Ab2. Un scFv 11D10 es caracterizado como capaz de unirse si el scFv inhibe la unión del Ab1 con las células HMFG positivas cuando es comparado con un control negativo, como un anticuerpo anti-idiotipo no emparentado. Alternativamente, los scFvs pueden ser caracterizados utilizando otros ensayos inmunológicos aquí descritos, como por la habilidad de provocar una respuesta inmune. Además, los scFvs pueden ser construidos con o sin una secuencia líder de inmunoglobulina (para secreción), dependiendo de si se desea una forma de scFv asociada a célula o secretada.

En otra realización son proporcionados polipéptidos anticuerpo 11D10 de cadena sencilla sin un ligando, o con uno muy corto, inflexible. Estos anticuerpos así llamados "bivalentes" son incapaces de unirse en una interacción entre-cadenas, debido a la ausencia de un ligando (o la presencia de un ligando muy corto) y, de esta forma, interaccionan con otras cadenas sencillas, formando "diabodies". Por ejemplo, un polipéptido anticuerpo 11D10 bivalente puede ser confeccionado utilizando métodos recombinantes en cualquiera de las siguientes configuraciones: VL-VH o VH-VL.

La invención abarca también formas poliméricas de polipéptidos 11D10. Conforme es aquí utilizado, una forma polimérica de un polipéptido 11D10 contiene una pluralidad (es decir, más de uno) de polipéptidos 11D10. En una realización son proporcionados polímeros lineales de polipéptidos 11D10. Estos polímeros lineales 11D10 pueden ser conjugados con un portador. Estos polímeros lineales pueden comprender copias múltiples de un único polipéptido 11D10, o combinaciones de diferentes polipéptidos 11D10, y pueden tener polipéptidos 11D10 en tándem o polipéptidos 11D10 separados por otras secuencias aminoacídicas. Estos polímeros lineales pueden ser preparados utilizando métodos estándar recombinantes de sobra conocidos en este campo. En otra realización son proporcionados péptidos de antígenos múltiples (MAPs). Los MAPs poseen una parte central pequeña inmunológicamente inerte que tiene dendritas de lisina radialmente ramificadas, a las cuales pueden ser anclados un número de polipéptidos 11D10 (es decir, unidos covalentemente). Posnett et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:1719-1725; Tam (1989) Meth. Enz. 168:7-15. El resultado es una macromolécula grande que posee un alta proporción molar de polipéptidos 11D10 en relación con la parte central. Los MAPs son inmunogenes útiles, eficientes, así como antígenos útiles para ensayos tales como ELISA. Los MAPs 11D10 pueden ser preparados sintéticamente y pueden ser obtenidos comercialmente (Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA). En un sistema MAP típico, una matriz central está compuesta de tres niveles de lisina y ocho aminoácidos para el anclaje de polipéptidos 11D10. El MAP puede ser sintetizado por medio de cualquier método conocido en este campo, por ejemplo, un método de fase sólida, por ejemplo, R.B. Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149.

En otra realización de la invención, la inmunogenicidad de los polipéptidos 11D10 puede ser mejorada preparándolos en sistemas de expresión, en los cuales son fusionados, o ensamblados, con proteínas formadoras de partículas tales como, por ejemplo, la asociada con el antígeno de superficie de la hepatitis B. Ver, por ejemplo, la Patente americana nº 4.722.840. Los constructos, en donde el polipéptido 11D10 está ligado directamente con las secuencias codificadoras de la proteína formadora de partícula, producen híbridos, los cuales son inmunogénicos con respecto al polipéptido 11D10. Además, todos los vectores preparados incluyen epítopes específicos del HBV, poseyendo varios grados de inmunogenicidad, tales como, por ejemplo, el péptido pre-S. De esta forma, las partículas construidas procedentes de la proteína formadora de partícula, las cuales incluyen las secuencias 11D10, son inmunogénicas con respecto al 11D10 y al HBV. Estas formas de polipéptidos 11D10 pueden ser preparadas en células eucarióticas, tales como las células de la levadura o de mamífero.

En otra realización, los polipéptidos 11D10 pueden ser conjugados con un portador. En los casos donde el polipéptido 11D10 se encuentra correctamente configurado para proporcionar un sitio de unión, pero que es demasiado pequeño para ser inmunogénico, el polipéptido puede ser ligado a un portador adecuado. Son conocidas en este campo un número de técnicas para la obtención de tales uniones y no es necesaria aquí su descripción en detalle. Puede ser utilizado cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el huésped. Los portadores adecuados son usualmente macromoléculas grandes, de lenta metabolización, tales como las proteínas; polisacáridos, tales como la sefarosa funcionalizada con látex, la agarosa, la celulosa, partículas de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos, tales como el ácido poliglutámico, la polilisina y similares; copolímeros aminoacídicos; y partículas de virus inactivo o bacterias atenuadas, tales como la salmonela. Substratos de proteína especialmente útiles son las albúminas séricas, la hemocianina de la lapa californiana, las moléculas de inmunoglobulina, la tiroglobulina, la ovalbúmina, el toxoide tetánico, y otras proteínas de sobra conocidas para aquéllos expertos en este campo. Como es obvio para una persona experta en este campo, las formas recombinantes anteriormente descritas de polipéptidos 11D10 y del 11D10, tales como las proteínas de fusión, puede ser fusionadas, a su vez, con otras secuencias aminoacídicas. Por ejemplo, un scFv 11D10 puede ser fusionado con una citoquina, como la IL-2. La Figura 25 proporciona un ejemplo de un constructo plásmido que produce una proteína de fusión de este tipo.

Los polipéptidos 11D10 de la invención pueden ser identificados de distintas maneras. Por ejemplo, las regiones variables de las cadenas ligera y pesada pueden ser sometidas a escrutinio preparando una serie de polipéptidos cortos que juntos abarquen la secuencia aminoacídica de la región variable completa. Empezando, por ejemplo, con polipéptidos de 50mer o de 20mer, sería algo rutinario el testar cada polipéptido para determinar la presencia de una propiedad deseada. El escrutinio de tales polipéptidos se encuentra dentro de las técnicas de este campo. También es conocido el llevar a cabo un análisis computacional de una secuencia de proteína para identificar polipéptidos potencialmente interesantes, por ejemplo, homología con el HMFG, o un algoritmo computacional basado en la teoría de reconocimiento molecular para identificar regiones putativas asociadas con un contacto idiotipo-anti-idiotipo y, a continuación, preparar estos polipéptidos comprendiendo estas regiones para su testado.

Aquellas personas expertas en este campo apreciarán fácilmente que las distintas formas y derivados del 11D10 descritos en esta sección pueden ser combinados de distintas maneras para producir otros polipéptidos 11D10 con propiedades deseadas. Por ejemplo, un MAP puede estar compuesto de polipéptidos 11D10 con residuos modificados. En otro ejemplo, un scFv 11D10 es fusionado con una citoquina, como la IL-2.

Preparación de polipéptidos

Los polipéptidos de esta invención pueden ser preparados por medio de procedimientos conocidos en este campo. Los polipéptidos pueden ser producidos por medio de degradación proteolítica, u otro tipo de degradación, del 11D10, a través de métodos recombinantes (es decir, polipéptidos sencillos o de fusión) conforme es descrito más arriba, o por medio de síntesis química. Los polipéptidos 11D10, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta alrededor de 50 aminoácidos, son preparados convenientemente por medio de síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en este campo y se encuentran disponibles de forma comercial. Por ejemplo, un polipéptido 11D10 podría ser producido por medio de un sintetizador de polipéptidos automatizado, utilizando el método de fase
sólida.

Preferiblemente, los polipéptidos son purificados, al menos parcialmente, de otros constituyentes celulares. Preferiblemente, los polipéptidos son, al menos, un 50% puros. En este contexto, la pureza es calculada como un porcentaje en peso del contenido total de proteína en la preparación. Más preferiblemente, las proteínas son entre un 50 y un 75% puras. Pueden ser obtenidos también polipéptidos más altamente purificados, y se encuentran comprendidos dentro de la presente invención. Para su uso clínico, los polipéptidos son preferiblemente altamente purificados, al menos alrededor de un 80% puros, preferiblemente, al menos, alrededor de un 90% puros, más preferiblemente, al menos, alrededor de un 95% puros, aún más preferiblemente, al menos, alrededor de un 99% puros, y libres de pirogenes y de otros contaminantes. Los métodos para la purificación de proteínas son conocidos en este campo y no son descritos aquí en detalle. De forma alternativa, si un polipéptido(s) es expresado en un medio de almacenaje adecuado, como una semilla de planta, no es necesario que el polipéptido 11D10 sea purificado, y podría incluso ser administrado sin proceso de purificación. Fiedler et al. (1995) Biotechnology 13:1090-1093.

Los polipéptidos 11D10 pueden ser obtenidos del 11D10 intacto, el cual, a su vez, puede ser aislado del hibridoma (ATCC HB12020) productor del 11D10, el cual es descrito en la solicitud de patente americana de dominio público, número de serie 08/575.762 (Número de Solicitud Provisional ..................... ; número de matrícula de agente 30414-20003.00). Las técnicas para el aislamiento de anticuerpos procedentes de hibridomas son de sobra conocidas en este campo. Ver, por ejemplo, Harlow y Lane (1988). Una vez que es obtenido el 11D10 intacto, los polipéptidos 11D10 pueden ser obtenidos por medio de degradado del 11D10 intacto, utilizando, por ejemplo, enzimas proteolíticas (proteinasas). Ejemplos de enzimas proteolíticas incluyen, aunque sin estar limitadas a las mismas, la tripsina, la plasmina y la trombina. El 11D10 intacto puede ser incubado con una o más proteinasas, o las digestiones pueden ser realizadas de forma secuencial. La naturaleza y extensión del clivaje proteolítico dependerá de la longitud deseada del polipéptido, así como de las enzimas utilizadas. Estas técnicas son de sobra conocidas en este campo. Alternativamente, o de forma adicional, el 11D10 intacto puede ser tratado con agentes reductores de disulfuro para disociar la molécula.

Los polipéptidos 11D10 pueden ser preparados por medio de síntesis química utilizando técnicas conocidas en este campo.

Los polipéptidos 11D10 pueden ser preparados también por medio de sistemas de expresión, utilizando métodos recombinantes. La disponibilidad de polinucleótidos 11D10 codificando polipéptidos 11D10 permite la construcción de vectores de expresión codificando el 11D10 intacto, fragmentos funcionalmente equivalentes del mismo, o formas recombinantes del 11D10. Un polinucleótido codificando el polipéptido 11D10 deseado, tanto si se encuentra en forma fusionada o madura, y tanto si contiene como si no una secuencia señal para permitir la secreción, puede ser ligado a vectores de expresión adecuados para cualquier huésped conveniente. Pueden ser utilizados sistemas huésped tanto eucarióticos como procarióticos. A continuación, el polipéptido es aislado de las células lisadas, o del medio de cultivo, y es purificado hasta el punto necesitado para el uso que se le vaya a dar. La purificación o aislamiento de los polipéptidos expresados en sistemas huésped pueden ser llevados a cabo por medio de cualquiera de los métodos conocidos en este campo. Por ejemplo, ADNc codificando 11D10 intacto, o un fragmento del mismo, puede ser ligado operativamente a un promotor adecuado, ser insertado en un vector de expresión, y transfectado dentro de una célula huésped adecuada. La célula huésped es cultivada entonces bajo condiciones que permitan que tenga lugar la transcripción y traducción, y es recuperado el polipéptido deseado. Pueden ser utilizados otros segmentos controladores de la transcripción o traducción, tales como secuencias señal que dirigen al polipéptido hacia un compartimiento celular específico (es decir, para la secreción). Ejemplos de células huésped procarióticas son conocidos en este campo, e incluyen, por ejemplo, el E. coli. Son conocidos en este campo ejemplos de células huésped eucarióticas, e incluyen células de la levadura, de ave, de insecto, de planta y de animal, tales como la COS7, la HeLa, la CHO y otras células de mamífero.

Los polipéptidos de esta invención pueden ser expresados también utilizando el virus vaccinia recombinante como un vector. Esta aplicación sería especialmente útil en formulaciones de vacuna, como en un portador de virus vaccinia conteniendo determinantes antigénicos heterólogos, que han demostrado ser inmunogenes efectivos. La expresión de los polipéptidos 11D10 en vectores vaccinia, y su utilización, son expuestas más arriba e infra.

Caracterización de los polipéptidos 11D10

Los polipéptidos 11D10 de esta invención pueden ser caracterizados de distintas formas. Por ejemplo, un polipéptido 11D10 puede ser testado para determinar su habilidad para unirse al Ab1 y/o al Ab3. Alternativamente, los polipéptidos 11D10 pueden ser testados para determinar su habilidad para provocar una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta anti-HMFG. Los polipéptidos 11D10 pueden ser testados también para determinar su habilidad para paliar o mejorar una enfermedad asociada al HMFG, como los tumores asociados al HMFG. Se entiende que con que una de estas propiedades esté presente en un polipéptido, éste entra dentro del ámbito de esta invención, aunque se encuentre presente más de una de estas propiedades.

La habilidad de un polipéptido 11D10 para unirse al Ab1 y/o al Ab3 puede ser sometida a ensayo en distintas maneras. En un test, la unión del polipéptido(s) 11D10 con el Ab1 puede ser testada directamente, por ejemplo, por medio de radioinmunoensayo (RIA), por ejemplo, haciendo reaccionar al polipéptido 11D10 radiomarcado con el Ab1 o el Ab3 que recubre placas de microtítulo, conforme es descrito en el Ejemplo 1.

En otro procedimiento, la unión con el Ab1 o el Ab3 es determinada por medio de inmunoensayo de tipo competitivo. En una variación de este procedimiento, la unión del polipéptido(s) 11D10 marcado, o de fragmentos funcionales equivalentes, con el Ab1 (MC-10) es medida en presencia de un Ab1 diferente, de otros Ab2s, del 11D10 o análogos del mismo, de otro polipéptido(s) 11D10, del HMFG o extractos conteniendo HMFG, o de otras proteínas. El porcentaje de inhibición es calculado conforme a la siguiente fórmula:

% \ inhibición = \left[1-\left(\frac{R_{T}-R_{C}}{R_{MAX}-R_{C}}\right)\right]x 100%

En otra variación, el fragmento bajo prueba con actividad 11D10 putativa es testado para determinar su habilidad para interferir con la unión entre el Ab1 y el Ab2, o el Ab1 y el HMFG. Esta prueba puede ser más sensible en algunas aplicaciones, ya que una interacción de afinidad menor entre el 11D10 y el Ab1 puede ser demasiado débil para formar una unión estable, pero puede ser adecuada para interferir con la unión de otro par ligando-receptor cuando se encuentra presente en una concentración suficiente. El HMFG puede ser proporcionado como antígeno purificado o células expresoras del HMFG. El ensayo puede ser llevado a cabo marcando el Ab1, o el HMFG, o el Ab2, e inmobilizando opcionalmente al otro miembro del par ligando-receptor en un soporte sólido para una separación más fácil. El fragmento bajo prueba es incubado con el reactivo marcado y, a continuación, la mezcla es presentada a la diana inmobilizada, o célula de la prueba, con el fin de determinar si el fragmento bajo prueba es capaz de inhibir la unión. El grado de inhibición se correlaciona con la actividad del 11D10.

Son presentados infra, en la sección de Ejemplos, varios ejemplos de ensayos de tipo competitivo. Una prueba que indica la actividad del polipéptido 11D10 es medir la unión del Ab1 (MC-10) radiomarcado con el HMFG semipurificado o purificado, en presencia de distintas cantidades del polipéptido(s) 11D10. Ver, por ejemplo, el Ejemplo 1. A continuación, la mezcla Ab1-HMFG es añadida a las placas recubiertas con el polipéptido(s) 11D10 y es comparada la unión con la unión del Ab1 marcado por separado. Preferiblemente, este test es realizado con cantidades no saturadoras de Ab1 marcado, con el fin de detectar cambios en la unión con pequeñas cantidades del HMFG competitivo. En el Ejemplo 1 es proporcionado un ejemplo de este test, conforme es realizado con 11D10 intacto. En otro ensayo de tipo competitivo, células diana positivas al HMFG (tales como las MCF-7 o las SKBR3) son cultivadas en placas de cultivo tisular de 96 pocillos como una monocapa confluente. Es determinada la unión del Ab1 (MC-10) radiomarcado en ausencia y en presencia de los polipéptidos 11D10. El grado de inhibición puede ser comparado con el del 11D10 intacto u otros polipéptidos 11D10. Es proporcionado un ejemplo de este ensayo de tipo competitivo utilizando 11D10 intacto en el Ejemplo 1. Otro ejemplo de este ensayo, comparando el grado de inhibición entre un scFv 11D10 y el 11D10 intacto, es mostrado en el Ejemplo 8.

Se considera que un polipéptido 11D10 se une al Ab1 si existe inhibición cuando se compara con un control negativo, como un anticuerpo anti-idiotipo no emparentado, el cual no se une con el Ab1.

En todos los ensayos anteriormente descritos, está claro para una persona experta en este campo que la molécula marcada puede ser marcada de distintas maneras, como por ejemplo con radioisótopos (es decir, I^{125}) y marcadores no radioactivos, tales como moléculas biotiniladas, y moléculas para la detección enzimática, marcadores fluorescentes y marcadores quimioluminiscentes.

Las pruebas más arriba expuestas pueden ser utilizadas también para comparar características de distintos fragmentos del polipéptido 11D10. Por ejemplo, pueden ser llevados a cabo ensayos de tipo competitivo, en los que un primer polipéptido 11D10 compite para la unión con el Ab1 (MC-10) en presencia de distintas cantidades de un segundo polipéptido 11D10. Tales pruebas pueden indicar grados relativos de afinidades de unión u otras características.

Otra forma de caracterizar los polipéptidos 11D10 es testar su habilidad para generar una respuesta inmune. Conforme es utilizado aquí, "respuesta inmune" indica una respuesta humoral, una respuesta celular o ambas. Conforme es utilizado aquí, la "habilidad para provocar una respuesta inmune" pertenece a cualquier individuo, incluyendo un humano.

La habilidad de un polipéptido 11D10 para generar una respuesta humoral puede ser determinada testando para determinar la presencia de un anticuerpo que se una al polipéptido(s) 11D10 después de la administración del polipéptido(s) 11D10. Se entiende que este anticuerpo (Ab3) no se encontraba presente, o lo estaba en cantidades más pequeñas, antes de la administración del polipéptido(s) 11D10. La inmunogenicidad es testada preferiblemente en individuos sin una respuesta previa anti-11D10. Ejemplos de individuos adecuados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, ratones, conejos, monos y humanos. Para esta prueba, a un individuo se le suministra un polipéptido(s)
11D10. La cantidad por administración y el número de administraciones variará dependiendo del individuo. Basándonos en nuestros estudios previos utilizando 11D10 intacto, un ratón precisa aproximadamente de 100 \mug del polipéptido 11D10 acoplado a KLH, en presencia de CFA e IFA por dosis, y tres administraciones. Los monos precisan, aproximadamente, 2 mg. Para los propósitos de esta invención, la variación de cantidad del polipéptido(s) 11D10 que puede ser administrada a humanos es desde alrededor de 10 \mug hasta 10 mg, preferiblemente 100 \mug hasta 10 mg, preferiblemente 500 \mug hasta 8 mg, más preferiblemente 1 mg a 4 mg, aún más preferiblemente alrededor de 2 mg.

La presencia de un Ab3 puede ser determinada mediante la pre-incubación, en primer lugar, del suero con inmunoglobulina autóloga con anticuerpos contra determinantes isotípicos y alotípicos y, a continuación, testando el suero para determinar la unión con el HMFG y/o con el polipéptido(s) 11D10, por ejemplo, utilizando ELISA o RIA. Por ejemplo, son hechas reaccionar diferentes diluciones de suero hecho reaccionar previamente con el 11D10 (o polipéptido 11D10) que recubre placas de microtítulo. Un Ab2 no emparentado sirve como un control. Después de su lavado, el complejo Ab3-11D10 es marcado utilizando, por ejemplo, 11D10 marcado con I^{125}, en un ensayo homogéneo de tipo sándwich. Los resultados procedentes de este ensayo son comparados con los obtenidos antes de la administración del polipéptido 11D10. Es proporcionada en el Ejemplo 1 una descripción más detallada de un ensayo de este tipo, para la detección del Ab3 provocado por el 11D10 intacto en ratones. Alternativamente, la unión con células positivas al HMFG, tales como las células LS174-T del carcinoma de colon humano, puede ser testada utilizando citometría de flujo inmune.

La unión del Ab3 con el HMFG puede ser determinada también por medio de inmunoprecipitado o inmunoreactividad con muestras de tejido positivo al HMFG, o por análisis dot blot. En un método del análisis dot blot, un extracto semipurificado del HMFG es sometido a "blotting" directamente en un filtro de nitrocelulosa. A continuación, el filtro es incubado con suero conteniendo Ab3, y la reacción desarrollada por medio de anti-inmunoglobulina conjugada con enzima (Ejemplo 1). Si el Ab3 se une con el HMFG debe aparecer un "blot" positivo. Para hacer la prueba con muestras de tejido puede ser utilizado un ensayo de inmunoperoxidasa (Ejemplo 1).

Si así se desea, el Ab3 provocado por el polipéptido(s) 11D10 puede ser caracterizado adicionalmente. Por ejemplo, pueden ser realizados ensayos de tipo competitivo para determinar si el Ab3 comparte idiotopos del Ab1. En esta prueba, el suero procedente de un individuo inmunizado con un polipéptido 11D10 es testado para determinar la inhibición de unión del polipéptido 11D10 marcado (o del 11D10 intacto) con el Ab1. La inhibición indica que el Ab3 y el Ab1 contienen, al menos, determinantes de unión similares. De forma similar, la competencia del Ab3 con el Ab1 para unirse con el HMFG (parcialmente purificado, purificado, o en la superficie de una célula positiva al HMFG) puede ser testada por medio del co-incubado de una cantidad fija del Ab1 (MC-10) marcado con diferentes diluciones del Ab3 conteniendo suero o preparado Ab1 y HMFG (o células asociadas al HMFG, tales como las MCF-7 o las SKBR3). Estas pruebas son ilustradas para determinar el 11D10 intacto en el Ejemplo 1.

Como es evidente para un experto en este campo, el Ab3 puede ser utilizado, a su vez, para caracterizar polipéptidos 11D10, utilizando los ensayos descritos más arriba.

Otra forma de caracterizar un polipéptido 11D10 es testando su habilidad para provocar la aparición de un anticuerpo que sea citotóxico. Para la determinación de la citotoxicidad mediada por complemento (CMC), células SKBR3 (diana) (es decir, células que expresan el HMFG) son marcadas con Cr^{51}. El marcaje puede ser realizado por medio del incubado de alrededor de 10^{6} células con aproximadamente 200 \muCi de Na_{2}SO_{4} durante 60 minutos a 37ºC, seguido de lavado. El ensayo es llevado a cabo añadiendo e incubando suero sospechoso de contener anticuerpo. Es añadido a continuación suero de cerdo de guinea pre-absorbido con células LS174-T (u otra fuente de complemento). Después de un periodo de incubación adecuado a 37ºC, a continuación es medida la cantidad de liberación de Cr^{51} y comparada con la de células de control no opsonizadas. La liberación de Cr^{51} se correlaciona con la actividad de CMC. Herlyn et al. (1981) Int. J. Cancer 27:769.

Otra manera de caracterizar un polipéptido 11D10 es testando su habilidad para provocar un anticuerpo anti-HMFG que participe en una respuesta ADCC. Cheresh et al. (1986) Cancer Research 46:5112-5118. En este ensayo células MCF-7 o SKBR3 (es decir, células que expresan el HMFG en su superficie) son marcadas con Cr^{51} y son utilizadas como células diana. Células normales mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) son utilizadas como células efectoras. Preferiblemente, el ensayo ADCC es llevado a cabo en presencia de suero inactivado por calor, con una proporción de efector/célula diana de 100:1 durante 4 horas, aunque pueden ser utilizadas otras condiciones adecuadas. A continuación es medida la cantidad de Cr^{51} liberado.

Los polipéptidos 11D10 de esta invención pueden ser caracterizados también por su habilidad para provocar una respuesta celular. Conforme es utilizado aquí, una "respuesta celular" es una respuesta que implica a las células T, y puede ser observada in vitro o in vivo.

Una forma de detectar una respuesta inmune celular es mediante ensayos para determinar la actividad proliferadora de las células T. En esta prueba es medida una respuesta inmune celular por medio de la proliferación de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMs) incubadas con polipéptido(s) 11D10. Las células mononucleares sanguíneas periféricas son aisladas de la sangre después de un número requerido de administraciones de polipéptido(s) 11D10, y son incubadas con distintas concentraciones de polipéptido(s) 11D10. Si son utilizados ratones, las células T son obtenidas del bazo. Las células T pueden ser enriquecidas, por ejemplo, por medio de centrifugado en un gradiente como el Ficoll™. Un mitogén no específico, como el PHA, sirve como un control positivo; la incubación con un anticuerpo anti-idiotipo no emparentado sirve como un control negativo. Preferiblemente, las células estimuladoras son autólogas en relación con las células respondedoras, particularmente en términos de antígenos de histocompatibilidad de clase II. Después de la incubación de las PBMs durante un número de días apropiado como para permitir la proliferación, es medida la incorporación de [^{3}H]timidina. En muchos casos un tiempo adecuado es de cinco días. Si así se desea, la determinación de cuál es el subconjunto de células que están proliferando puede ser llevada a cabo utilizando citometría de flujo. Opcionalmente, las células T de bazo pueden ser privadas previamente de las células CD4^{+} o de las CD8^{+} antes del ensayo de proliferación, por medio de incubado con anticuerpo monoclonal RL.172 (anti-CD4^{+}) o mAb.168 (anti CD8^{+}) y complemento.

Otra forma de detectar la respuesta inmune celular es testar para determinar la actividad citotóxica de células T (CTL). En esta prueba, los linfocitos T (es decir, una población de células T enriquecidas) son aislados (usualmente de células de bazo) para su utilización como dianas en un ensayo estándar de liberación de Cr^{51}. Kantor et al. (1992) J. Natl. Cancer Inst. 84:1084-1091. Un ejemplo de un ensayo de liberación de Cr^{51} es el siguiente. Brevemente, células tumorales positivas al HMFG (usualmente 1-2 x 10^{6} células) son radiomarcadas como células diana con alrededor de 200 \muCi de Na_{2} Cr^{51}O_{4} (Amersham Corp., Arlington Heights, Ill.) durante 60 minutos a 37ºC, seguido de lavado a conciencia para eliminar los isótopos no incorporados. A continuación, las células T y las dianas (1 x 10^{4}/pocillo), ambas resuspendidas en medio de cultivo, son combinadas en distintas proporciones de efector-diana en placas con fondo en U de 96 pocillos (Costar Corp.). Las placas son centrifugadas a 100 xg durante 5 minutos para iniciar el contacto entre las células y son incubadas de 4 a 16 horas a 37ºC con CO_{2} al 5%. Después de la incubación, lo sobrenadantes son recogidos utilizando un Supernatant Collection System (Skatron, Inc., Sterling, VA) y la radioactividad será cuantificada en un contador gamma (Beckman Instruments). La liberación espontánea de Cr^{51} es determinada por medio de la incubación de las dianas en ausencia de efectores, mientras que la liberación máxima o total del Cr^{51} será determinada incubando las dianas en Triton 0,1% X-100. El porcentaje de liberación específica del Cr^{51} es determinado por medio de la siguiente ecuación:

\text{Porcentaje de liberación específica = [(experimental-espontánea) / (máxima-espontánea)]} \ X 100

Otra forma de caracterizar los polipéptidos 11D10 es testar su habilidad para mejorar, retrasar la progresión y/o reducir la extensión de los tumores asociados al HMFG. Tales pruebas pueden incluir indicadores de inflamación, radioescintigrafía o medición de los niveles de HMFG en circulación (tales ensayos se encuentran disponibles comercialmente).

Usos y Métodos de Utilización de los Polipéptidos 11D10

Los polipéptidos 11D10 tienen un cierto número de utilizaciones. Los polipéptidos 11D10 pueden ser utilizados para inducir una respuesta inmune en un individuo, preferiblemente una respuesta anti-HMFG. Pueden ser utilizados también para detectar y monitorizar los niveles de Ab3, o para purificar Ab3. Los polipéptidos 11D10 son útiles también para el tratamiento de enfermedades asociadas al HMFG, por ejemplo, cáncer colorectal, ciertos cánceres de pulmón (adenocarcinomas), cáncer gástrico, cánceres pancreáticos y ciertos cánceres de pecho.

De esta forma, la presente invención incluye métodos de inducción de una respuesta inmune en un individuo, comprendiendo la administración de un polipéptido 11D10 en una cantidad efectiva con el fin de inducir una respuesta inmune. Preferiblemente, el individuo tiene tumores asociados al HMFG. En este contexto, una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente como para provocar una respuesta inmune medible, humoral y/o celular. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones.

La invención abarca también métodos de detección de un anticuerpo que se una al 11D10 (es decir, el Ab3 y/o el Ab1) en una muestra biológica. Estos métodos son aplicables en el entorno clínico, por ejemplo, para monitorizar los niveles de Ab1 o Ab3 en un individuo, así como en el entorno industrial, en el cual se desea la producción comercial del Ab3. Estos métodos conllevan la puesta en contacto del Ab3 y/o del Ab1 en la muestra con un polipéptido 11D10, bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de un complejo estable entre el Ab3 y/o el Ab1 y el polipéptido 11D10, y la detección de un complejo estable formado, si es que existe. Son conocidos en este campo un número de métodos de inmunoensayo y han sido descritos aquí. Para una aclaración adicional, una muestra para prueba conteniendo potencialmente Ab3 y/o Ab1 puede ser mezclada con una cantidad predeterminada no limitadora del polipéptido 11D10, el cual usualmente se encuentra marcado detectablemente (como por ejemplo con un radioisótopo o enzima). En un ensayo en fase líquida, los agentes que no han reaccionado son eliminados por medio de una técnica de separación, como filtración o cromatografía. En estas técnicas de inmunoensayo, la cantidad de marcador asociado con el complejo se correlaciona positivamente con la cantidad del Ab3 y/o del Ab1 presente en la muestra. Pueden ser diseñados ensayos similares, en los cuales el Ab3 y/o el Ab1 en la muestra de prueba compiten con el anticuerpo marcado por la unión con una cantidad limitada del polipéptido 11D10. Aquí la cantidad de marcador se correlaciona negativamente con la cantidad del Ab3 y/o del Ab1 en la muestra. Las muestras adecuadas en las cuales medir los niveles de Ab3 y/o de Ab1 son las muestras biológicas, incluyendo suero o plasma, preferiblemente suero. Otras muestras incluyen muestras de tejido.

Además, la invención incluye también métodos de purificación del Ab3 (o del Ab1), comprendiendo la puesta en contacto de una muestra biológica conteniendo el Ab3 (y/o el Ab1) con un polipéptido 11D10, y la obtención de un complejo formado por los mismos, si es que existe. Usualmente, el polipéptido(s) 11D10 es acoplado a una matriz de afinidad para purificación mediante columna de afinidad. Tales métodos son rutinarios en este campo y no es necesaria su descripción aquí en detalle.

También se encuentran incluidos en esta invención métodos para el tratamiento de una enfermedad asociada al HMFG, tales como un tumor asociado al HMFG, comprendiendo la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido 11D10. Un "tumor asociado al HMFG" es un tumor que contiene HMFG, especialmente expresado en la superficie de las células tumorales, ejemplos de los cuales han sido descritos más arriba. En este contexto, una cantidad efectiva para el tratamiento es una cantidad suficiente como para paliar el estado de enfermedad. Una cantidad efectiva puede ser proporcionada en una administración o en más de una. El tratamiento de individuos con una cantidad efectiva del polipéptido 11D10 puede, por ejemplo, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, en comparación con individuos que no han sido tratados de esta forma.

En otra realización son proporcionados métodos para estimular una respuesta de células T en un individuo que tiene una enfermedad asociada al HMFG. Esta respuesta de células T puede ser manifestada como proliferación de células T y/o promoción de la actividad citotóxica de las células T utilizando polipéptidos 11D10, particularmente polipéptidos 11D10 que sean homólogos con el HMFG. Los polipéptidos 11D10 pueden ser administrados directamente (como polipéptidos o como plásmidos conteniendo polinucleótidos que codifican polipéptido(s) 11D10), o ser añadidos a un cultivo ex vivo de células adecuadas. Los polipéptidos 11D10 son añadidos, por ejemplo, a células mononucleares sanguíneas periféricas aisladas, en una cantidad efectiva para estimular la deseada actividad de células T. Las células T estimuladas son entonces reintroducidas en el individuo. La cantidad(es) de polipéptido(s) 11D10 añadido dependerá de distintos factores, tales como el estado del individuo, procedimientos de tratamiento previos y/o concurrentes, y otras substancias utilizadas.

Los polipéptidos de esta invención pueden ser utilizados solos o junto con otros agentes, los cuales promueven la actividad/objetivo deseados. Los polipéptidos 11D10 pueden ser utilizados también en varias combinaciones entre sí. En este contexto, un "agente" puede ser cualquiera de entre una variedad de substancias. Además, "junto con" significa que el agente puede ser utilizado concomitantemente, antes, o después del polipéptido(s). Además, el agente puede ser ligado covalentemente al polipéptido, como una proteína de fusión; o estar en proximidad física cercana al polipéptido. Una actividad deseada es cualquier actividad que facilite, mejore, promueva o module el objetivo deseado a la hora de utilizar los polipéptidos 11D10.

Los agentes que pueden ser utilizados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, las citoquinas, linfoquinas, adyuvantes y fármacos. El término agentes incluye también substancias que faciliten la administración de los polipéptidos, tales como los liposomas, o substancias que promuevan la administración de los polipéptidos a una diana determinada, por ejemplo, un receptor celular. Por ejemplo, pueden ser producidos uno o más polipéptidos 11D10 como una proteína(s) de fusión, la cual contiene también una citoquina, como la GM-CSF. Alternativamente, pueden ser administrados uno o más polipéptidos 11D10 con una citoquina, como la GM-CSF.

La invención abarca también métodos utilizando polipéptidos 11D10 para eliminar un marcador, por ejemplo radioactividad, de un individuo que ha recibido un anticuerpo (Ab1) anti-HMFG marcado, por ejemplo, para radioescintigrafía o radioterapia. Esta invención incluye también métodos de tratamiento, en los cuales es administrado en una dosis terapéutica un anticuerpo anti-HMFG radiomarcado, y seguido de un exceso molar de polipéptido 11D10.

La utilización del 11D10 para este propósito ha sido expuesta más arriba, y esos principios son aplicables de la misma manera a los polinucleótidos 11D10. Es escogida una cantidad de polipéptido 11D10 que se encuentre en un exceso molar suficiente en relación con el anti-HMFG marcado como para localizar y unirse a cualquier anti-HMFG que no se encuentre localizado en el sitio del tumor. El calendario de administración y la cantidad del polipéptido 11D10 dependerán de la naturaleza del anticuerpo radiomarcado, del tipo de radioisótopo utilizado, y del estado del individuo. Preferiblemente, la proporción molar del polipéptido 11D10 en relación con el anticuerpo anti-HMFG es de, al menos, alrededor de 5:1, más preferiblemente, alrededor de 25:1 a 200:1. Preferiblemente, el polipéptido 11D10 es administrado de 5 a 24 horas después de que el individuo haya recibido el anticuerpo anti-HMFG.

Para los polipéptidos 11D10 que se unen a un anticuerpo anti-HMFG, particularmente el MC-10, la detección de anti-HMFG en la superficie de una célula tumoral puede ser realizada al poner en contacto la célula tumoral con el polipéptido(s) 11D10 durante un tiempo suficiente como para permitir la unión con el anticuerpo anti-HMFG, y la detección de la presencia de cualquier 11D10 que no se encuentre unido al anticuerpo anti-HMFG. El desarrollo de parámetros experimentales (tales como la cantidad de polipéptido 11D10 o el tiempo de reacción) son determinaciones empíricas que se encuentran dentro del ámbito de este campo.

Composiciones farmacéuticas y vacunas comprendiendo el 11D10, polinucleótidos 11D10 y/o polipéptidos 11D10

La presente invención abarca composiciones farmacéuticas y vacunas conteniendo el 11D10, polinucleótido(s) 11D10 y/o polipéptido(s) 11D10. Tales composiciones/vacunas farmacéuticas son útiles a la hora de provocar una respuesta inmune, y/o para el tratamiento de una enfermedad asociada al HMFG, como un cáncer de pecho. Las composiciones/vacunas farmacéuticas pueden paliar o mejorar una enfermedad asociada al HMFG, bien solas o junto con otras formas de terapia, tales como la quimioterapia o la radioterapia. Estas composiciones farmacéuticas, compuestas por una cantidad efectiva del 11D10, de polinucleótido(s) 11D10 y/o de polipéptido(s) 11D10 en un excipiente farmacéuticamente aceptable, son adecuadas para las administraciones sistémicas a humanos y animales, en formas de dosificación unitaria, soluciones o suspensiones estériles parenterales, soluciones estériles no parenterales, o soluciones o suspensiones orales, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, y similares. Las formulaciones, o el suministro parenteral o no parenteral del fármaco, son conocidos en este campo y son explicados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Publishing (1990).

Un excipiente farmacéuticamente aceptable es una substancia relativamente inerte que facilita la administración de una substancia farmacológicamente efectiva. Por ejemplo, un excipiente puede conferir de forma o consistencia a una composición de vacuna, o actuar como un diluyente. Excipientes adecuados incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsificadores, sales para osmolaridad variable, agentes encapsulantes, tampones y mejoradores de la penetración dérmica. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) supra.

En una realización es utilizada una composición farmacéutica comprendiendo un polipéptido(s) 11D10 para estimular, por ejemplo, cultivos ex vivo de monocitos sanguíneos periféricos (PBMs) de un individuo. A continuación, los PBMs son reintroducidos en el individuo. La composición farmacéutica es utilizada sola o en combinación con otros modificadores de biorespuesta, como las linfoquinas.

Un tipo de composición farmacéutica es una vacuna. Por consiguiente, la presente invención incluye también vacunas comprendiendo una cantidad efectiva del 11D10, de polinucleótido(s) 11D10, de polipéptido(s) 11D10, o de combinaciones de los mismos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas vacunas pueden ser utilizadas, inter alia, para provocar una respuesta inmune en un individuo, particularmente en individuos con una enfermedad asociada al HMFG en estado avanzado, como tumores asociados al HMFG. Preferiblemente, la respuesta inmune incluye la producción de anticuerpo anti- glóbulo graso en leche humana. Estas vacunas son especialmente útiles para el tratamiento, modulación, y/o efecto paliativo sobre una enfermedad asociada al HMFG.

La administración de vacunas conteniendo el 11D10 ha sido explicada más arriba.

Las vacunas conteniendo los polinucleótidos 11D10 expuestos más arriba pueden ser utilizadas para la así llamada "inmunización genética", o vacunas de ADN, en las cuales los polinucleótidos codificando un polipéptido antigénico son introducidos dentro de células huésped con el fin de provocar una respuesta inmune protectora. Tang et al. (1992) Nature 356:152-154. Una vez que se encuentran en el núcleo celular, los plásmidos pueden persistir como episomes circulares no replicativos, dando lugar a una expresión dependiente de dosis y duradera. Spooner et al. (1995) Gene Therapy 2:173-180. La inmunización utilizando polinucleótidos ha demostrado que genera tanto respuestas celulares como humorales. Spooner et al. (1995); Wang et al. (1995) Human Gene Therapy 6:407-418. La inmunización genética posee muchas de las ventajas de los microorganismos vivos o atenuados como vehículos para provocar una respuesta inmune, sin el riesgo de infección.

Preferiblemente, los polinucleótidos 11D10 son introducidos como vectores plásmidos conteniendo secuencias de control apropiadas para la transcripción y traducción, tales como promotores, mejoradores y secuencias señal. Pueden ser utilizados uno o más polinucleótidos 11D10 dentro de un único vector de clonaje, y/o pueden ser utilizados múltiples vectores. Si son utilizados múltiples polinucleótidos 11D10, deben ser insertados en marco dentro del vector, o estar bajo el control de promotores separados. La longitud y/o tipo del polinucleótido 11D10 utilizado pueden variar y dependerán de distintos factores, tales como el objetivo clínico perseguido al administrar la vacuna, el estado del individuo y el perfil inmunológico del individuo. Además, pueden ser insertados también en el vector polinucleótidos codificando otras substancias que mejoren, faciliten y/o aumenten la respuesta inmune. Ejemplos de tales substancias, como la GM-CSF, han sido descritos más arriba.

Por ejemplo, en una realización, un polinucleótido codificando un scFv del 11D10 es insertado dentro de uno de los vectores de expresión (plásmidos) antes descritos. En otro ejemplo, polinucleótidos codificando los fragmentos de 11D10 representados en la Figura 19 son insertados dentro del vector de expresión para su administración como una vacuna. En otro ejemplo es insertado un polinucleótido codificando un fragmento inmunogénico del 11D10 dentro de un vector de expresión.

Otro tipo de vacuna empleando polinucleótidos 11D10 es la así llamada inmunización por librería de expresión, en la cual es utilizada una librería de expresión de polinucleótidos 11D10 (codificando varias partes del 11D10) para inmunizar un huésped. Barry et al. (1995) Nature 377:632-635. La vacuna multipartita no infecciosa resultante puede demostrar ser especialmente beneficiosa, ya que presenta múltiples péptidos como inmunogenes potenciales. La presentación de múltiples inmunogenes posee la ventaja añadida de que cada huésped particular (es decir, individuo), en el cual es administrada, es capaz de seleccionar los polipéptidos inmunológicamente efectivos, los cuales pueden variar de un individuo a otro. La librería de expresión utilizada para la expresión de los polipéptidos 11D10 puede ser comprensiva, es decir, que codifique colectivamente la molécula completa del 11D10, o puede ser parcial. La librería de expresión para inmunización es preparada por medio de los métodos recombinantes generales descritos más arriba, utilizando un sistema de vector adecuado. Usualmente, los polinucleótidos 11D10 son fusionados en marco con una secuencia señal que media la secreción.

La cantidad de polinucleótido 11D10 a ser administrada dependerá de varios factores, tales como el modo y ruta de administración (es decir, inyección directa contra cultivo ex vivo y transfección), el polipéptido 11D10 codificado por el polinucleótido 11D10, el estado del individuo (como el estado inmunológico y/o de enfermedad), y el objetivo deseado. Usualmente, si es administrada directamente, la cantidad por administración es de alrededor de 10 \mug a 1 mg, preferiblemente de 25 \mug a 500 \mug, más preferiblemente de 30 \mug a 250 \mug, aún más preferiblemente de 50 a 100 \mug.

En otra realización son utilizados polinucleótidos 11D10 en virus vivos o atenuados, o vectores virales, que puedan expresar un polipéptido(s) 11D10 codificado para formulaciones en vacuna. Los ejemplos incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, los adenovirus, los retrovirus adenoasociados (AAV) y el SV40. Preferiblemente, el virus es el vaccinia. El virus de vaccinia recombinante puede proporcionar un agente poderoso para copresentar de forma efectiva el polipéptido(s) 11D10 codificado por el polinucleótido(s) 11D10 junto con la partícula viral inmunogénica. La construcción de vectores de virus vaccinia ha sido descrita más arriba. Por lo general, los vectores virales recombinantes son añadidos en una cantidad suficiente como para provocar la infección in vivo de las células huésped. La cantidad dependerá del tipo de virus utilizado, de la naturaleza del polipéptido 11D10 codificado, del estado del individuo y del resultado deseado. La vaccinia recombinante (la cual puede codificar los polipéptidos 11D10 o variantes del 11D10 conteniendo polipéptidos 11D10, como el scFv) puede ser utilizada directamente para vacunación en alrededor de 107 a 108 unidades formadoras de placa por dosis. La vacuna puede ser administrada parenteralmente, por medio de inyección subcutánea o intramuscular, por ejemplo, así como a través de las membranas mucosas, como nasalmente, oralmente o por inhalación. Alternativamente, la vaccinia puede ser administrada a través de células infectadas con vaccinia. En esta técnica, células adecuadas, como células tumorales, son infectadas con vaccinia en cultivo. A continuación, las células infectadas son reintroducidas en el individuo. Han sido descritos métodos para infectar células con vaccinia y reintroducir estas células infectadas. Ver, por ejemplo, Moss (1991).

Las vacunas pueden ser preparadas también de uno o más polipéptidos 11D10. Los polipéptidos 11D10 pueden ser preparados por medio de cualquiera de los métodos descritos más arriba, especialmente por medio de purificación de un vector de expresión adecuado. En una realización las vacunas comprenden uno o más polipéptido(s) 11D10. Los polipéptidos 11D10 pueden ser formulados en una vacuna como formas neutras o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adicción ácidas (formadas por grupos amino libres del polipéptido 11D10) y las cuales están formadas por ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos hidroclórico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como el acético, oxálico, tartárico, maléico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden ser derivadas también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina y similares.

En otra realización son proporcionadas vacunas que contienen un polipéptido 11D10 fusionado con una partícula viral, como el antígeno de superficie de la hepatitis B.

La preparación de vacunas que contienen polinucleótidos o polipéptidos 11D10 como un ingrediente activo está comprendida dentro de la práctica estándar en este campo. Usualmente, tales vacunas son preparadas como inyectables, bien como soluciones líquidas o como suspensiones; pueden ser preparadas también formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido previamente a la inyección. La vacuna puede ser emulsificada también, o el polipéptido(s) y/o polinucleótido(s) 11D10 pueden ser asociados a liposomas.

El 11D10, los polipéptidos 11D10 y/o los polinucleótidos 11D10 en las vacunas pueden ser utilizados sin diluir, pero a menudo se encuentran mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada fisiológicamente, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Si así se desea, la vacuna puede contener también cantidades menores de substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificadores, agentes tamponadores de pH, estabilizadores y/o adyuvantes. Han sido descritos más arriba ejemplos de adyuvantes. Para uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales, pueden ser utilizados los componentes mitogénicos del adyuvante de Freund. La elección de un adyuvante dependerá, en parte, de la estabilidad de la vacuna en presencia del adyuvante, de la ruta de administración y de la aceptación reguladora del adyuvante, particularmente cuando es para uso humano. Por ejemplo, el alum es aprobado por la United States Food and Drug Administration (FDA) para su uso como adyuvante en humanos. Para aumentar la respuesta inmune utilizando una vacuna que contiene un polinucleótido 11D10, puede ser utilizada la encapsulación en lípidos catiónicos. Para la administración de polipéptidos 11D10 puede ser apropiada también la encapsulación en liposomas. Son conocidos en este campo los liposomas adecuados para el almacenamiento de polinucleótidos y/o polipéptidos para su administración a células.

El polipéptido(s) 11D10 puede opcionalmente ser tratado químicamente para mejorar su inmunogenicidad, especialmente si un polipéptido 11D10 comprende 100 aminoácidos o menos. Tal tratamiento puede incluir el reticulado, por ejemplo, con glutaraldehído; el ligado a un portador proteínico, como una hemocianina de la lapa californiana (KLH) o el toxoide tetánico.

Si se juzga que una respuesta inmune subóptima es debida a las células T supresoras inducidas por una vacuna de esta invención, puede ser administrada también intraperitonealmente ciclofosfamida (100 mg/kg por peso corporal).

Las vacunas de la presente invención son administradas usualmente de forma parenteral, por inyección por ejemplo, subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente o intradérmicamente. La administración puede ser también intranasal, intrapulmonar (es decir, por aerosol), oral e intravenosa. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. La ruta de administración dependerá del estado del individuo en tratamiento y del efecto clínico deseado.

Las administraciones pueden comenzar con un calendario semanal o bisemanal hasta que un parámetro deseado, medible, sea detectado, como la provocación de una respuesta inmune (humoral y/o celular). Entonces, la administración puede ser continuada con un calendario menos frecuente, como bisemanalmente o mensualmente. Para vacunas conteniendo el 11D10, las administraciones son realizadas preferiblemente bisemanalmente para las cuatro primeras administraciones, seguido de administraciones mensuales.

Las vacunas son administradas de una manera compatible con la formulación de la dosis, y en cantidad tal que sea profilácticamente y/o terapéuticamente efectiva. La cantidad a ser administrada depende del individuo a ser tratado, de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, de la ruta de administración y del grado de protección deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administradas pueden depender del criterio del médico y pueden ser particulares para el individuo. Los rangos de dosificación generales para el 11D10, los polinucleótidos 11D10 y los polipéptidos 11D10 han sido proporcionados más arriba.

Usualmente, la vacuna es administrada como una serie de dosis, comenzando con un grupo de dosis para iniciar la respuesta inmune, seguido de dosis más espaciadas "de mantenimiento". Por ejemplo, la vacuna puede ser administrada con carácter semanal para establecer una respuesta inmune, seguido de inyecciones cada dos semanas o mensuales para mantener la respuesta.

Los polipéptidos 11D10 y/o polinucleótidos 11D10 en las vacunas pueden ser proporcionados solos, en combinación con otros polipéptidos y/o polinucleótidos 11D10, en combinación con 11D10 intacto y/o en combinación con otras substancias, tales como linfoquinas y fármacos, que mejoran, facilitan o modulan el efecto deseado. Ejemplos de tales substancias han sido descritos con anterioridad. Los polipéptidos 11D10 pueden ser combinados preparando una mezcla de los polipéptidos 11D10 en solución, o por medio de la sintetización de una proteína de fusión.

Las vacunas de esta invención pueden ser administradas también junto con vaccinia recombinante conteniendo un polinucleótido que codifique el HMFG o un fragmento del mismo, y/o vaccinia recombinante conteniendo un polinucleótido que codifique una linfoquina como la GM-CSF. Además, se entiende que las vacunas de esta invención pueden ser utilizadas junto con otros modos de terapia, tanto los establecidos como los experimentales. Tal utilización es indicada, por ejemplo, cuando la administración de la vacuna mejora los resultados clínicos cuando son comparados con la administración de otro modo(s) de terapia sola, como la quimioterapia o la radioterapia.

La inmunogenicidad de una vacuna del 11D10 puede ser monitorizada midiendo los niveles del Ab3, y/o monitorizando el estado de la enfermedad. La detección y medición del Ab3 utilizando RIA o ELISA y la medición de la actividad de las células T (es decir, la proliferación y/o actividad citotóxica) han sido descritas con anterioridad. Como un ejemplo, el Ab3 puede ser cuantificado como sigue. Son recubiertas placas de microtítulo con MC-10 (Ab1) y hechas reaccionar con una cantidad fija del polipéptido 11D10 marcado con I^{125}. Es generada una curva estándar de inhibición utilizando MC-10 purificado como el inhibidor. Es testado el suero en diferentes diluciones para determinar la habilidad de inhibición de la reacción Ab1-Ab2, y es estimada la cantidad de Ab3 en el suero tomando la curva estándar de inhibición. Alternativamente, la respuesta de células T puede ser medida utilizando cualquiera de los ensayos anteriormente descritos. El estado de la enfermedad puede ser monitorizado utilizando técnicas estándar en este campo, tales como la medición de un marcador asociado a tumor, rayos X, escáner CT, y otras manifestaciones clínicas medibles.

Se reconoce que un número de composiciones alternativas de vacuna, no limitadas a las descritas aquí, pueden ser eficaces a la hora de inducir una respuesta inmune. Todas estas composiciones están representadas dentro de la presente invención, siempre que incluyan un polinucleótido o polipéptido 11D10 como un ingrediente activo.

Kits comprendiendo el 11D10, los polinucleótidos 11D10 y/o los polipéptidos 11D10

La presente invención comprende también kits conteniendo el 11D10, polinucleótido(s) 11D10 y/o polipéptido(s)
11D10, preferiblemente kits diagnóstico. Los procedimientos diagnóstico utilizando el 11D10, los polinucleótidos 11D10 y/o los polipéptidos 11D10 de esta invención pueden ser realizados por laboratorios diagnósticos, laboratorios experimentales, médicos o individuos privados. Los kits representados en esta invención incluyen aquéllos que permiten a alguien llevar a cabo un ensayo para determinar la actividad anti-HMFG o anti-11D10, como cualquiera de los aquí explicados, detectando y/o cuantificando de esta forma estas actividades. Los kits representados en esta invención incluyen también kits que permiten la detección de polinucleótidos 11D10 en, por ejemplo, células transfectadas
ex vivo o in vivo. Estos kits pueden ser utilizados para la detección o cuantificación de un polinucleótido que comprenda un polinucleótido codificando una región variable del 11D10 o una parte de la misma. Son especialmente adecuados los polinucleótidos 11D10 que pueden hibridizar (es decir, formar un híbrido estable) con regiones variables del 11D10, pero no con polinucleótidos de otras regiones variables (conocidos en el momento de la inscripción de esta solicitud), conforme son aquí descritos.

Por ejemplo, la presencia del Ab3 en una muestra biológica puede ser testada para utilizar un polipéptido 11D10. La muestra puede ser opcionalmente tratada previamente para el enriquecimiento del Ab3.

Los kits de esta invención comprenden el 11D10, el polinucleótido(s) y/o el polipéptido(s) 11D10 en un embalaje adecuado. El kit puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que sean útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, tampones, reactivos de captura, reactivos de desarrollo, marcadores, superficies de reacción, medios de detección, muestras de control, instrucciones e información interpretativa.

Los siguientes ejemplos son proporcionados para ilustrar, sin limitar, la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Generación y Caracterización del Anticuerpo Anti-idiotipo 11D10

La línea celular hibridoma productora del anticuerpo anti-idiotipo monoclonal 11D10 fue creada e identificada conforme a la siguiente descripción. Aspectos tanto del procedimiento de inmunización como del procedimiento de escrutinio fueron importantes a la hora de obtener un anticuerpo con la especificidad y funcionalidad deseadas. El 11D10 fue uno de entre un número de Ab2s que inicialmente fueron producidos, y fue identificado como el candidato con las características más deseables.

El anticuerpo inmunizador (Ab1) fue el anticuerpo monoclonal anti-HMFG murino MC-10, referido aquí en esta sección como BrE-1. Ya que el animal respondedor era también un ratón, era de esperar que los Ab2s generados se dirigieran contra las características idiotípicas del BrE-1. Sin embargo, únicamente una parte de éstos estaría dirigida contra el paratopo BrE-1, y una parte aún más pequeña sería inmunogénica y capaz de provocar un Ab3, y una parte aún más pequeña provocaría una reacción cruzada entre el Ab3 y el antígeno asociado a tumor.

Para transformar al BrE-1 en suficientemente inmunogénico en una especie autóloga, fue conjugado con el portador KLH, y emulsificado en adyuvante de Freund. Fue administrado repetidamente a los animales receptores con una frecuencia inusual, de únicamente 2 semanas entre dosis. Cinco ratones fueron inmunizados conforme a este programa. Las respuestas substanciales aparecieron en alrededor de 3 ratones únicamente después de la cuarta inmunización. Los animales respondedores fueron reinmunizados con una quinta dosis del BrE-1 intravenosa, fueron aisladas células del bazo y fueron preparados hibridomas separadamente de cada animal. Fue llevada a cabo la clonación conforme a técnicas estándar.

El procedimiento de escrutinio comprendió cuatro fases importantes: (1) Selección positiva para unión de anticuerpo con el BrE-1; (2) Selección negativa contra los determinantes isotípicos o alotípicos reconocedores del anticuerpo; (3) Selección positiva para una habilidad de inhibición de la unión del BrE-1 con el HMFG; (4) Selección positiva para una habilidad de inducción de una respuesta inmune humoral contra el antígeno original asociado a tumor (HMFG) tanto en ratones como en conejos. El resto de esta sección proporciona una descripción del procedimiento de escrutinio, la cual es proporcionada en más detalle en las secciones siguientes.

El escrutinio inicial fue llevado a cabo por medio de inmunoensayo, con el fin de determinar los clones que reaccionaban con el BrE-1 pero no con otros anticuerpos monoclonales diana compartiendo los mismos determinantes alotípicos o isotípicos. Un ensayo crucial fue un RIA de tipo sándwich en el cual el BrE-1 es unido a una fase sólida, cubierto con sobrenadante del cultivo y desarrollado con BrE-1 radioiodinado. Este ensayo precisa del anticuerpo en el sobrenadante del hibridoma para ser funcionalmente bivalente, y para ser capaz de durar entre la captura del BrE-1 y el desarrollo del BrE-1. Fueron seleccionados para estudio posterior varios clones que eran específicos del idiotipo y que proporcionaron una señal fuerte en este ensayo.

El subsiguiente escrutinio fue llevado a cabo por medio de ensayos de tipo competitivo, en los cuales se precisó que el Ab2 bloqueara la unión del BrE-1 con el HMFG. Esto estableció que el Ab2 reconoció el paratopo del BrE-1. Fue proporcionado el HMFG en forma de células MCF-7, una línea celular de cáncer de pecho humana expresando el HMFG en la superficie de la célula. La naturaleza del ensayo precisa que el Ab2 bloquee la interacción entre el BrE-1 y el antígeno tumoral en su manera particular de presentación en células tumorales. En un mínimo, se precisó que los Ab2s candidatos que habían pasado los test de escrutinio anteriores inhibieran la unión del BrE-1 con las células en, al menos, un 85%. Hubo alrededor de tres Ab2s que excedieron substancialmente el mínimo, con el 11D10 proporcionando alrededor del nivel más alto de inhibición.

El último test de escrutinio fue una determinación de si los Ab2s candidatos eran capaces de provocar un Ab3 de la especificidad deseada cuando son inyectados en un receptor. Fueron preparadas suficientes cantidades de Ab2 procedentes de ascites de ratón y fueron testadas en ratones y conejos. En primer lugar, el suero procedente de los animales de la prueba fue sometido a ensayo para determinar la presencia de Ab3 en un inmunoensayo de tipo sándwich, utilizando el mismo Ab2 marcado utilizado para la inmunización. A continuación, los sueros dando positivo fueron sometidos a ensayo para determinar la habilidad del Ab3 de reaccionar contra el antígeno asociado a tumor, es decir el HMFG. Una preparación semipura del HMFG fue utilizada para recubrir placas de microtítulo, fue recubierta con el suero de la prueba en diluciones en serie, y fue detectado el Ab3 que se unió, utilizando anti-inmunoglobulina marcada. El título de la unión del Ab3 con el HMFG definió la "calidad" del Ab2, como un reflejo de su capacidad como un inductor de anti-HMFG.

El anticuerpo monoclonal 11D10 emergió como el anti-idiotipo con la calidad más alta, y es la base de varios compuestos, composiciones y procedimientos representados en esta invención.

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Materiales y Métodos

Células: El compañero de fusión utilizado para producir las líneas hibridoma fue la línea celular de mieloma no secretora de ratón P3-653, ancestralmente emparentada con la P3X63Ag8.653, disponible de ATCC como Nº CRL-1580. Líneas celulares humanas establecidas fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con suero fetal de becerro 5%, conforme es descrito en otra parte (Seon et al. (1984) J. Immunol. 132:2089).

HMFG: fue proporcionado HMFG descremado por Roberto L. Ceriani, y fue preparado conforme a su protocolo (Ceriani et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:582-586). Brevemente, fue extraída dos veces la parte en crema lavada de la leche humana con dos volúmenes de cloroformo, y dos veces con 1 volumen de éter, y después fue liofilizada. La concentración proteínica fue determinada por medio del método de Lowry.

Anticuerpo BrE-1: El anticuerpo monoclonal murino BrE-1 (MC-10) fue generosamente proporcionado por el Dr. R.L. Ceriani, y es descrito en WO 89/07268. Fueron preparados ascites de hibridomas de BrE-1 inyectando intraperitonealmente ratones preparados con pristane individualmente con 2-10 x 10^{6} células viables. La fracción IgG fue aislada del ascites por medio de precipitado de sulfato de amonio saturado 45% y de la subsiguiente cromatografía en proteína A sefarosa™ CL-4B (Ey et al. (1978) Immunochemistry 15:429). La pureza del IgG aislado fue chequeada por medio de inmunodifusión, inmunoelectrofóresis y fraccionamiento por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Fueron utilizados como controles otros Ab1 y Ab2 no emparentados de diferentes isotipos.

Preparación de fragmentos F(ab')_{2} del BrE-1: Los fragmentos F(ab')_{2} fueron preparados por medio de digestión por pepsina estándar (Parham (1983) J. Immunol. 131:2895). Brevemente, la parte del IgG procedente del ascites de BrE-1 fue dializada contra 0,1 M de tampón citrato, pH 3,5, y digerida con pepsina (25 Tg/mg IgG) a 37ºC durante 8 horas. Después del clivaje, el pH fue ajustado a 7,0 con 3,0 M de tampón tris, pH 8,6, y la solución fue dializada contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) en frío. El digesto fue separado por medio de HPLC utilizando una columna de Sefarosa™ 6. La pureza del F(ab')_{2} aislado fue determinada por medio de inmunodifusión y por medio de reacción con reactivos anti-isotipo en un ELISA estándar.

Acoplamiento del anticuerpo con la KLH: El BrE-1 fue acoplado a la hemocianina de la lapa californiana (KLH) conforme al método descrito por Maloney et al. (1985) Hybridoma 4:191. Fue mezclada solución stock del anticuerpo (1 mg/ml) con KLH (1 mg/ml) en PBS, en presencia de solución de glutaraldehído de reciente dilución (concentración final 0,05%). La mezcla fue rotada sobre su eje vertical durante 1 hora a temperatura ambiente y, a continuación, dializada exhaustivamente contra PBS a 40ºC.

Inmunización de ratones BALB/c singenéicos: Hembras BALB/c fueron inmunizadas cuatro veces durante un período de 2 meses. La primera inyección fue proporcionada intraperitonealmente utilizando 100 Tg del BrE-1, emulsificado en adyuvante completo de Freund. Las siguientes dos inyecciones fueron puestas con 100 Tg del BrE-1 acoplado a la KLH en adyuvante incompleto de Freund, bien subcutánea o intraperitoneal. Los ratones fueron sangrados cada cierto tiempo, y los sueros fueron chequeados para detectar la actividad anti-idiotipo por medio de ELISA, en un ensayo de unión utilizando fragmentos F(ab')_{2} del BrE-1 e IgG procedente de suero reunido normalmente de ratón BALB/c,
como control. Tres días antes de la fusión, los ratones fueron reinyectados intravenosamente con el BrE-1 en PBS.

Producción de hibridomas anti-idiotipo

El compañero de fusión utilizado para producir las líneas hibridoma fue la línea celular de mieloma no secretora de ratón, P3-653, ancestralmente emparentada con la P3X63Ag8.653, disponible de ATCC como Nº CRL-1580. Fueron cultivadas líneas celulares humanas establecidas en RPMI 1640 suplementado con suero fetal de becerro 5%, conforme es descrito en otra parte (Seon et al. (1984) J. Immunol. 132:2089).

Los hibridomas fueron producidos esencialmente siguiendo el método de Oi y Herzenberg ((1980) Selected Methods of Cellular Immunology, Mishell & Shiigi eds., Freeman Publs., en 351-372). Células del bazo procedentes de ratones inmunizados fueron mezcladas con células P3-653, en una proporción de 1:1 a 10:1, en presencia de glicol de polietileno 50% (PEG, mw \sim4500). A continuación, las células fusionadas fueron lavadas y cultivadas. Los híbridos fueron seleccionados utilizando medio de hipoxantina-aminopterina-timidina.

Selección inicial de los clones hibridoma secretores del anticuerpo anti-idiotipo (Ab2)

El escrutinio inicial de los clones hibridoma fue realizado por medio de RIA. El BrE-1 purificado fue radioiodinado a través del método de cloramina-T (Hunter (1970) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133:989). El BrE-1, o anticuerpo de control (anticuerpos monoclonales de varios isotipos y especificidades no relacionadas e IgG normal de BALB/c), recubrió placas de PVC en cantidades de 500 ng/pocillo. Después de la incubación durante la noche a 40ºC, las placas fueron bloqueadas con albúmina sérica bovina 1% (BSA) en PBS. Las placas recubiertas fueron incubadas con diluciones en serie de sobrenadante del hibridoma durante 4 horas, y desarrolladas utilizando \sim50.000 cpm del BrE-1-I^{125}. El ensayo RIA es un test de especificidad riguroso para la detección del anticuerpo, y precisa también que el anticuerpo sea capaz de extenderse entre dos moléculas de BrE-1.

Además, fueron llevados a cabo ensayos ELISA con el fin de determinar la clase y subclase de cada clon. El ELISA fue llevado a cabo recubriendo pocillos de placa de microtítulos con el anticuerpo BrE-1 (o control) en una cantidad de 500 ng/pocillo. Después de la incubación durante la noche a 40ºC, las placas fueron bloqueadas con BSA 1% en PBS. 100 TI de sobrenadantes del cultivo hibridoma o concentrado 20x fueron incubados en el pocillo durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de lavado con PBS, las placas fueron incubadas adicionalmente durante 4 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 40ºC, con reactivos anti-isotipo marcados con fosfatasa alcalina, y desarrollados con el substrato. El anticuerpo de ciertas subclases del IgG es fácilmente purificado por medio de cromatografía en proteína A, y puede poseer funciones efectoras útiles.

Fueron inicialmente sometidos a escrutinio los sobrenadantes del cultivo procedentes de 1300 pocillos de fusión primaria. Fueron obtenidos cuarenta y dos hibridomas Ab2 que reaccionaron con el BrE-1 en el RIA, pero no lo hicieron con las inmunoglobulinas de control con isotipo o alotipo coincidente.

Emergieron de estos ensayos de escrutinio un número de líneas celulares secretoras del Ab2 monoclonal con las propiedades deseadas. Entre ellas se encontró el anticuerpo monoclonal 11D10.

Confirmación de que los Ab2 monoclonales son específicos para el idiotipo BrE-1

La especificidad idiotípica del Ab2 fue confirmada por medio de la unión directa con el Ab1. Varios Ab2 purificados fueron marcados con I^{125}, y testados para determinar la unión con placas recubiertas con un panel de Ab1 anti-TAA monoclonal. Los resultados para un experimento utilizando 11D10-I^{125} son mostrados en la Figura 6. Los resultados son presentados en cpm media (n=3, S.D. <10%). El 11D10 se unió casi exclusivamente con el BrE-1; no existió virtualmente reactividad cruzada con ninguno de los otros Ab1 testados.

La especificidad idiotípica del Ab2 fue confirmada también al revertir la posición del Ab1 y del Ab2. Las placas fueron recubiertas con 100 ng, 300 ng y 1000 ng de Ab2 purificado, y hechas reaccionar con varios Ab1s marcados. Fueron incluidos el BrE-1-I^{125} y el BrE-3-I^{125}. El BrE-3 es un IgG1 específico para otro epítope del HMFG asociado a tumor, y sirvió como un control. Los resultados de un experimento, en el cual fue testado por medio de este método el 11D10, son mostrados en la Tabla 1 y confirman la especificidad para el BrE-1.

TABLA 1 Unión de los mAb1 BrE-1 y BrE-3 con el anti-idiotipo (11D10)

	Concentración	BrE-1 (IgG2b)	BrE-3 (IgG1)
Ab2	cpm	cpm	cpm
	100 ng	6.149 \pm 301	263,0 \pm 43,4
11D10	300 ng	16.731 \pm 483	260,0 \pm 12,3
	1000 ng	44.177 + 1.392	374,3 + 23,8

La especificidad para el idiotipo BrE-1 fue establecida adicionalmente en experimentos de tipo competitivo. Varios Ab2s marcados fueron mezclados con miembros diferentes de un panel de competidores no marcados comprendiendo Ab2s, Ab1 y otras inmunoglobulinas murinas. A continuación, los Ab2s fueron testados para determinar la unión con las placas recubiertas de BrE-1. Para el mejor Ab2 fue observada una inhibición mayor del 90%, utilizando 250 ng de Ab2 o de BrE-1 no marcado como competidor. Virtualmente no se obtuvo inhibición, hasta una concentración de 10 Tg, utilizando las otras inmunoglobulinas como competidores potenciales. Resultados representativos, en los cuales el 11D10 fue el Ab2 testado, son mostrados en la Tabla 2 (cpm media, n=3, S.D. <10%).

TABLA 2 Inhibición de la Unión Idiotipo-Antiidiotipo

Inhibidor	cpm Unida	% Inhibición
Ninguno	37.071	0
11D10 (Ab2), 0,250 \mug	\; 1.853	95
BrE-1 (Ab1), 0,250 \mug	\; 2.594	93
SN2, 10 \mug	37.085	0
CLL-2, 10 \mug	37.482	0
4EA2, 10 \mug	38.904	0
RWP 1.1, 10 \mug	37.082	0
3F3, 10 \mug	38.132	0
MOPC, 10 \mug	37.161	0
1E3, 10 \mug	38.523	0
3A4, 10 \mug	38.064	0
F6/32, 10 \mug	37.904	0

Escrutinio para detección de anti-idiotipos dirigidos contra el paratopo BrE-1

Para determinar si los Ab2s estaban dirigidos contra el paratopo del BrE-1, los Ab2s fueron utilizados para competir por la unión del BrE-1 radiomarcado con el HMFG, según es expresado en las líneas celulares de carcinoma de pecho humano, MCF-7 y SKBR3.

Para llevar a cabo el ensayo, las células diana fueron cultivadas como monocapa confluyente en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Varias diluciones del Ab2 testado (procedente de sobrenadante del cultivo o de anticuerpo purificado) fueron mezcladas con el BrE-1 marcado y, a continuación, añadidas a cultivos celulares confluyentes en pocillos de placas de microtítulo. El porcentaje de inhibición del ensayo fue calculado conforme a la fórmula:

% \ inhibición = \left[1-\left(\frac{R_{T}-R_{C}}{R_{MAX}-R_{C}}\right)\right]x 100%

donde R_{T} es la cpm media del pocillo experimental con inhibidores; R_{C} es la cpm media de fondo; y R_{MAX} es el promedio de unión máxima sin ningún inhibidor.

La Figura 7 muestra los resultados de este tipo de experimento, llevado a cabo utilizando el 11D10 como el anticuerpo competitivo. 250 ng del Ab2 del 11D10 inhibieron la unión del BrE-1 marcado con las células expresoras del HMFG en más del 90% (Figura 7).

Alrededor de 24 de los 42 anticuerpos monoclonales testados en esta fase (incluyendo el 11D10) inhibieron la unión del BrE-1 marcado con las células expresoras del HMFG, o con el extracto de HMFG, en un ensayo de unión a placa, en cantidades tan bajas como de alrededor de 25 ng. Fue utilizado 3H1 purificado (un anticuerpo monoclonal murino de especificidad irrelevante) como un competidor de control, y no inhibió la unión del BrE-1 con las células. Por lo general, se consideró que había pasado esta fase en el proceso de escrutinio un Ab2 produciendo, al menos, un 85% de inhibición.

Confirmación de especificidad en la unión

Fueron realizados experimentos de confirmación para el más prometedor de los Ab2, con el fin de confirmar la especificidad de la unión con el BrE-1 utilizando HMFG.

Alrededor de 40.000 cpm de BrE-1-I^{125} fueron co-incubadas con una preparación semipurificada del HMFG. La mezcla de anticuerpo-Ag fue añadida a las placas recubiertas con Ab2 (500 ng/pocillo) y fue determinada la habilidad del HMFG para inhibir la unión. La cantidad del Ab2 no fue limitadora con respecto a la cantidad del BrE-1 que podía unir y, por lo tanto, fue un indicador sensible para pequeñas cantidades de HMFG competidor.

Seis de los 24 clones productores de anticuerpos que dieron positivo en los test de escrutinio descritos hasta ahora fueron utilizados para preparar ascites de ratón como una fuente del Ab2. Los Ab2s fueron purificados por medio de cromatografía utilizando una resina de afinidad de proteína A, por medio de técnicas estándar.

La unión del BrE-1 con el 11D10 fue inhibida por el HMFG.

Escrutinio para detectar anti-idiotipos capaces de provocar una respuesta inmune específica de tumor

Ya que un propósito principal de estos experimentos era el encontrar un anti-idiotipo capaz de provocar una respuesta inmune anti-HMFG, la siguiente fase de escrutinio fue testar su inmunogenicidad en modelos animales. El Ab2 no sólo tendría que ser inmunogénico, sino también capaz de originar un Ab3 que mostrara reacción cruzada contra el antígeno tumoral HMFG.

Por consiguiente, los Ab2s que dieron el resultado más fuerte en los experimentos de tipo competitivo con las células expresoras del HMFG fueron escogidos para testar en experimentos de inmunización.

Por cada Ab2 a ser testado, fueron inmunizados 5 ratones BALB/c y dos conejos blancos Nueva Zelanda. Para los ratones, el Ab2 fue conjugado con KLH. Fueron inyectadas 50 \mug por ratón y 200 \mug por conejo con una pauta bisemanal. Las inyecciones iniciales fueron preparadas en adyuvante completo de Freund, y las inyecciones subsiguientes fueron preparadas en adyuvante incompleto de Freund. Los sueros fueron recogidos regularmente para análisis. Inicialmente, los títulos de Ab3 fueron medidos en un radioinmunoensayo de tipo sándwich estándar, utilizando Ab2 tanto como anticuerpo de captura como de detección. La respuesta de anticuerpos contra el Ab2 alcanzó niveles substanciales después de la 5ª inmunización.

Seguidamente, fue llevado a cabo un ensayo en el cual las placas fueron recubiertas con la preparación de HMFG. Los sueros fueron incubados en el pocillo, y el anticuerpo unido fue detectado con anti-inmunoglobulina ligada a enzima. Este ensayo requiere que el anticuerpo se una al antígeno original asociado a tumor y establece que, al menos, una parte del Ab3 inducido por medio de inmunización con el anti-idiotipo sea específico del antígeno tumoral. El nivel de Ab3 específico del HMFG fue titulado por medio de dilución en serie, y definió la "calidad" del Ab2 inmunizador.

El anticuerpo monoclonal 11D10 emergió como el que tenía la más alta calidad de entre los candidatos testados.

Confirmación de que el Ab3 provocado por el 11D10 tenía la especificidad deseada

Ya que el objetivo terapéutico del 11D10 reside en su habilidad para provocar una respuesta reactiva contra el antígeno asociado a tumor, la especificidad del Ab3 obtenido fue confirmada en un número de experimentos subsiguientes.

Ab3 conteniendo suero (del que se ha eliminado la actividad anti-isotípica y anti-alotípica) inhibió casi por completo la unión del BrE-1 marcado con el 11D10 o vice versa. Esto indica que los anticuerpos Ab3 comparten idiotipos con el Ab1. Resultados similares fueron obtenidos tanto si los animales productores del Ab3 habían sido inmunizados con el 11D10 conjugado con KLH, como si lo habían sido con el 11D10 emulsificado en adyuvante de Freund.

Células del bazo procedentes de ratones inmunizados con el 11D10 fueron utilizadas para generar líneas celulares productoras de Ab3 monoclonal. Experimentos de tipo competitivo, similares a los descritos en el párrafo anterior, mostraron que el Ab3 monoclonal se unió al HMFG de una forma idéntica a como lo hace el BrE-1.

Fueron llevados a cabo experimentos de unión con el fin de determinar si el Ab3 inducido por el 11D10 era capaz de unirse al HMFG, según éste es expresado en líneas celulares tumorales. La Figura 8 muestra los resultados de la unión directa de varias preparaciones del Ab3 con la línea celular de carcinoma de pecho, SKBR3. Fueron preparados Ab3 murino policlonal, Ab3 de conejo policlonal y Ab3 murino monoclonal por medio de adsorción de inmunoglobulina murina, y fueron testados para determinar la unión en varias diluciones. Tanto el suero Ab3 policlonal como el monoclonal procedente de animales inmunizados con el 11D10 se unió a las líneas celulares que dieron positivo al HMFG, MCF-7 y SKBR3, pero no se unió a la línea celular de melanoma negativa para antígeno, M21/P6.

Fueron llevados a cabo varios experimentos de tipo competitivo con el fin de confirmar que el Ab3 inducido por el 11D10 tenía la especificidad deseada. Cultivos monocapa confluyentes de células SKBR3 en pocillos de microtítulo fueron hechos reaccionar con 50.000 cpm del BrE-1-I^{125} y varias diluciones del Ab3 como competidor. Fue utilizado como control negativo un anticuerpo monoclonal de especificidad no emparentada. Los resultados son mostrados en la Figura 9. Veinte \mug de un Ab3 monoclonal inhibieron la unión en un 25%. Sueros procedentes de ratón o de conejo conteniendo suero Ab3 policlonal diluido, en dilución 1/50, produjeron una inhibición del 38% y del 30%, respectivamente. Esto indicó que el Ab3 se une al mismo epítope del HMFG que el Ab1. La inhibición incompleta bajo estas condiciones sugiere que algunos Ab3 pueden poseer una afinidad y avidez menores por el HMFG que el Ab1.

Fueron utilizadas también células del bazo procedentes de ratones inmunizados con el 11D10 en un ensayo de proliferación de células T. Las células del bazo fueron cultivadas durante 5 días en presencia de HMFG semipurificado y, a continuación, fueron pulsadas con [^{3}H]timidina. Una mayor captación en células procedentes de animales inmunizados con el 11D10 en comparación con las de control es consistente con la presencia de una respuesta inmune celular específica de Id. Conejos inmunizados con 11D10-Alugel mostraron algunas reacciones dérmicas DTH contra la preparación semipurificada del HMFG, pero no contra CEA puro (un control negativo de especificidad). Ya que el HMFG abarca varios epítopes, y no se encuentra disponible en forma purificada, no podemos estar seguros acerca de la especificidad de la reacción.

Análisis Dot Blot del mAb1 y del mAb3

El antígeno HMFG en diferentes diluciones fue sometido a análisis transblot en filtros de nitrocelulosa y se le hizo reaccionar con el BrE-1 (Ab1) y con el mAb3 (Figura 10). Las franjas 1-3 fueron sometidas a transblot con HMFG e incubadas con BrE-1, 10 \mug/ml, IgG1 1E3 de control, 50 \mug/ml, e IgG1 mAb3, 50 \mug/ml, respectivamente. La reacción fue desarrollada utilizando IgG de cabra anti-ratón, reactivos de fosfatasa alcalina y substrato. La tinción fue idéntica pero más intensa con el Ab1, mientras que el anticuerpo de control dio negativo.

Experimento de coincidencia para idiotipo de reacción cruzada en pacientes con cáncer de pecho

Estudiamos suero procedente de 50 pacientes seleccionados al azar con cáncer de pecho, con el fin de determinar si alguno de ellos poseía idiotipo coincidente que fuera reconocido por el 11D10 Ab2. Placas de microtítulo fueron recubiertas con 250 ng/pocillo de fragmento F(ab’)_{2} purificado del 11D10 (Ab2), e incubadas con dilución 1:100 de suero procedente de pacientes, y desarrolladas con anticuerpos IgG de cabra anti-humanos marcados con enzima. La unión del suero con el Ab2 fue detectada utilizando anticuerpo IgG anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina (específico de cadena \gamma) y substrato.

Conforme es mostrado en la Figura 11, un pequeño número (8/50) de estos sueros procedentes de pacientes con cáncer de pecho poseen niveles elevados de anticuerpos reactivos al 11D10. El criterio selectivo en la terapia anti-Id se basa en la asunción de que la enfermedad por sí misma induce un estado de preparación de células B y células T en el huésped. Se ha jugado con la hipótesis de que en pacientes que expresan un correspondiente Id coincidente, la estimulación Ab2 sería entonces posible para estimular eficazmente tales células B y T ya preparadas. El descubrimiento de suero coincidente Id procedente de pacientes con cáncer de pecho sugiere que ellos pueden ser especialmente adecuados como candidatos potenciales para inmunoterapia anti-Id activa con el Ab2 11D10.

Estudio de Desaparición del BrE-1-In^{111} en Ratones Desnudos BALB/c Portadores de Tumor MX-1

Para determinar si el 11D10 sería adecuado como un segundo reactivo para unirse con un anticuerpo radiomarcado en exceso en radioinmunoterapia, llevamos a cabo un estudio de desaparición. Cada ratón desnudo BALB/c fue inyectado con 20 \muCi de 2,9 \mug del BrE-1-In^{111}. Después de 20 horas, fueron inyectadas 20 \mug de 11D10 anti-Id a un grupo de seis ratones a ser sacrificados en 30 minutos, y otro grupo a las 40 horas. Los grupos de control de los ratones no fueron inyectados con 11D10 anti-Id a los 30 minutos y a las 40 horas. Después de sacrificar a los ratones, la sangre y los órganos fueron retirados para medir los niveles de radioactividad. Los resultados son mostrados en la Tabla 3 y son expresados como porcentaje de dosis por gramo de BrE-1-In^{111}\pm SEM. Los valores son expresados como porcentaje medio SEM. A los 30 minutos y a las 40 horas hubo una desaparición significativa de la radioactividad en casi todos los órganos (especialmente en la sangre, riñón, músculo y pulmón) excepto en el hígado en grupos experimentales cuando se comparó con los de control. La retención del tumor no se vio afectada a los 30 minutos; sin embargo, después de 40 horas hubo cierta desaparición en el grupo tratado.

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TABLA 3 Porcentaje de dosis por gramo de BrE-1-In^{111} en Ratones Desnudos BALB/c con Tumor Mx-1

	BrE-1 de Control	BrE-1 + anti-idiotipo	BrE-1 de Control	BrE-1 + anti-idiotipo
	30 min	30 min	40 Horas	40 Horas
Sangre	11,38 \pm 1,57	6,92 \pm 1,74	6,01 \pm 1,13	1,34 \pm 0,83
Piel	2,90 \pm 0,36	3,11 \pm 0,54	2,49 \pm 0,14	2,28 \pm 0,39
Músculo	1,23 \pm 0,26	1,16 \pm 0,16	1,00 \pm 0,07	0,59 \pm 0,14
Pulmón	7,08 \pm 1,33	3,43 \pm 0,80	5,48 \pm 0,11	0,94 \pm 0,35
Riñón	3,59 \pm 0,62	2,10 \pm 0,31	3,27 \pm 0,29	0,97 \pm 0,26
Bazo	2,66 \pm 0,49	2,13 \pm 0,31	2,65 \pm 0,03	1,35 \pm 0,47
Hígado	3,73 \pm 0,78	8,74 \pm 3,33	3,63 \pm 0,11	9,12 \pm 1,24
Estómago	0,87 \pm 0,21	1,23 \pm 0,36	0,28 \pm 0,10	0,57 \pm 0,06
Intestino	1,01 \pm 0,16	0,81 \pm 0,02	0,80 \pm 0,03	0,46 \pm 0,07
Hueso	1,02 \pm 0,12	0,84 \pm 0,07	0,75 \pm 0,02	0,26 \pm 0,04
Médula	3,05 \pm 0,50	1,51 \pm 0,17	1,83 \pm 0,66	1,16 \pm 0,09
Tumor	3,28 \pm 0,22	4,13 \pm 0,66	4,35 \pm 0,27	2,51 \pm 0,36

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Ejemplo 2 Clonaje y Secuenciación del ADNc 11D10

A menos que sea especificado de otra forma, todas las técnicas de clonaje fueron esencialmente las descritas por Sambrook et al. (1989) y todos los reactivos fueron utilizados conforme a las instrucciones del fabricante.

Fue obtenida para el anticuerpo 11D10 la secuencia de polinucleótido por medio del aislamiento del ARN mensajero procedente de la línea celular productora del 11D10. El ARN mensajero fue preparado por medio de pasaje a través de dos ciclos de cromatografía en columnas de oligotimidilato-celulosa. La producción de ARNm fue de alrededor de 100 \mug. La primera hebra del ADNc fue sintetizada utilizando el kit de preamplificación SuperScript
(GIBCO/BRL).

Para secuenciar la región variable de la cadena pesada, fueron llevados a cabo PCRs en el ADNc utilizando un iniciador reverso (3') correspondiente a los aminoácidos 126 a 119 de la región constante \gamma1 murina:

\vskip1.000000\baselineskip

5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3'

(SEC. ID. Nº 36)

\newpage

y varias mezclas de iniciadores delanteros, correspondientes a las secuencias líder N-terminal de los subgrupos de región variable murinos. El iniciador delantero (5') que dio una reacción positiva fue:

5'-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT-3'

(SEC. ID. Nº 37)

correspondiendo a los aminoácidos -20 a -13 (I= inosina, R=A o G, Y=C o T, K=G o T, S=C o G, W=A o T).

El fragmento amplificado de ADNc fue subclonado en el plásmido pT7 y las células competentes NovaBlue fueron transformadas utilizando un protocolo proporcionado por el proveedor (Novagen). Las colonias recombinantes fueron seleccionadas por medio de selección de color y fue preparado ADN plásmido por medio de procedimiento miniprep. La secuencia de ADN del plásmido de hebra doble fue determinada utilizando un kit de Sequenase versión 2.0 (USB, Cleveland, Ohio). La secuencia del inserto de ADN en el plásmido fue determinada por medio de ambos enfoques, utilizando iniciadores específicos del plásmido, es decir, el iniciador promotor T7 (TAATACGACTCACTATAGGG - SEC. ID. Nº 38) y el iniciador U-19 (GTTTTCCCAGTCACGACGT - SEC. ID. Nº 39). Al menos fueron seleccionados 8 clones para determinación de la secuencia.

La secuencia de la región variable de la cadena ligera del 11D10 fue determinada de una manera similar. Los iniciadores delantero y reverso dando un resultado positivo en la PCR fueron:

5'-ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3'	(SEC. ID. Nº 40)
5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'	(SEC. ID. Nº 41)

correspondiendo a los aminoácidos -20 a -10 de la secuencia líder, y 122 a 116 de la región constante de cadena \kappa murina, respectivamente.

Con el fin de minimizar los porcentajes de error en la amplificación PCR, fue utilizada ADN polimerasa pfu (Stratagene, San Diego) para la amplificación en todos los experimentos siguientes. La frecuencia de mutación con esta ADN polimerasa termoestable es de 1/10 en comparación con la ADN polimerasa Taq.

La confirmación de que el ADNc aislado corresponde a las cadenas pesada y ligera del 11D10 fue obtenida por medio de secuenciación aminoacídica del N-terminal del anticuerpo aislado. Cincuenta \mug del anticuerpo 11D10 purificado son diluidas con tampón de carga de muestra (50 mM de Tris-HCl, pH 6,8, SDS 1%, glicerol 1%, \beta-mercaptoetanol 0,1%) y calendadas hasta los 100ºC durante 3 minutos. La proteína desnaturalizada fue cargada en un gel de poliacrilamida 7,5% (BioRad Miniprotean II Dual Slab Cell) conteniendo SDS, y fue sometida a electrofóresis a 200 V durante 1 hora. Las proteínas en los geles fueron transferidas a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) por medio del procedimiento descrito por Towbin et al. ((1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:4350-4354) a 150 mA durante la noche. El tampón de transferencia contiene 25 mM de Tris, 192 mM de glicina, metanol 20% (v/v). Las membranas fueron tintadas por inmersión rápida en azul brillante de Coomasie 0,1% en metanol 50%-ácido acético 50%, seguido de lavado en una solución conteniendo metanol 40% más ácido acético 10%. Después de secar la membrana a temperatura ambiente, las bandas de cadena pesada y ligera tintadas fueron cortadas con una hoja de afeitar limpia. Las proteínas en los trozos de membrana fueron sometidas a microsecuenciación N-terminal por medio de degradación de Edman automatizada, utilizando un secuenciador de proteínas Applied Biosystem Modelo 477A, empleando química líquida pulsada e identificación aminoacídica feniletioidantoin on-line. Cada proteína fue sometida a 10-15 ciclos degradativos, y fueron analizados por medio de HPLC en fase reversa los productos de clivaje resultantes procedentes de cada ciclo.

La secuencia de ácido nucleico y la correspondiente secuencia aminoacídica de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 11D10 son mostradas en las Figuras 1 y 2, respectivamente.

En la Figura 1 está claro que el tercer aminoácido de la secuencia líder (aminoácido -18) y el aminoácido 25º de la región marco 3 (aminoácido 81) son erróneos. Como es evidente para una persona experta en este campo, el aminoácido codificado por el triplete nucleotídico "GCC" es A, o alanina (para el aminoácido -18), y el aminoácido codificado por el triplete nucleotídico "GAA" es E, o ácido glutámico (aminoácido 81). De igual forma, en la Figura 3A, el aminoácido 81 (dentro de la región marco 3) es E, o ácido glutámico. La SEC. ID. Nº 58 representa la traducción aminoacídica incorrecta según es mostrada con los errores tipográficos en la hoja mecanografiada donde se lee "Figura 1", que ha sido presentada en esta exposición. La SEC. ID. Nº 2 representa la traducción aminoacídica correcta.

La secuencia de ácido nucleico fue obtenida conforme es descrito previamente en este ejemplo, por medio de amplificación PCR del ARN mensajero procedente de la línea celular productora del anticuerpo. La secuencia aminoacídica fue obtenida seguidamente por medio de la traducción de la secuencia de polinucleótido, utilizando el código genético. Los aminoácidos correctos son obvios debido al código genético. La secuencia aminoacídica correcta es inherente también a la línea celular productora del anticuerpo depositada en la ATCC bajo número de acceso HB-12020 como soporte de esta exposición.

El polinucleótido de cadena pesada y ligera y las secuencias aminoacídicas fueron comparados, utilizando el algoritmo BLAST en el National Center for Biotechnology Information, con secuencias disponibles en las bases de datos PDB, SwissProt, PIR, SPUpdate, GenPept y GPUpdate. La comparación fue realizada el 19 de enero de 1996.

Entre las 10 secuencias de ADN de la base de datos que más coincidían con la de la región variable de la cadena ligera del 11D10, ninguna fue idéntica. Existieron alrededor de 8 a 27 diferencias con la secuencia de ADN 11D10, correspondiendo a alrededor de 6 a 17 diferencias aminoacídicas. La sexta secuencia que coincidió (llamada >gb/M59920/MUSIQKAA3) fue una secuencia de tipo germinal VJ kappa murina, y probablemente representa el gen prototipo del cual fue derivada la cadena ligera del 11D10. Las secuencias ADN 11D10 difieren de la secuencia de línea germinal en 14 posiciones, correspondiendo a alrededor de 7 diferencias de punto aminoacídicas.

Entre las 10 secuencias de ADN de la base de datos que más coincidían con la de la región variable de la cadena pesada del 11D10, ninguna fue idéntica. 9 de las 10 secuencias eran de 3 a 12 pares de bases más largas, debido a diferencias de empalme dentro de la unión VDJ. Además, hubo alrededor de 15 a 43 diferencias de punto en comparación con la secuencia ADN 11D10 fuera de la unión, correspondiendo a alrededor de 11 a 23 diferencias aminoacídicas.

De esta forma, hubo, al menos, alrededor de 18 diferencias aminoacídicas entre las secuencias aminoacídicas codificadas por los ADNs 11D10 y aquéllas codificadas por los ADNs de la base de datos que más coincidían. Las diferencias de punto probablemente surgieron por mutación somática de las secuencias germinales durante el desarrollo de la célula productora del anticuerpo en el animal utilizado para generarla.

La Figura 4 muestra las diez secuencias de polinucleótido que más coincidieron con la secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera del 11D10. La Figura 5 muestra las diez secuencias de polinucleótido que más coincidieron con la secuencia codificadora de la región variable de la cadena pesada del 11D10.

Las secuencias aminoacídicas de la región variable de la cadena ligera y pesada fueron comparadas con otras secuencias conocidas utilizando algoritmo BLAST en el National Center for Biotechnology Information, con secuencias disponibles en las bases de datos PDB, SwissProt, PIR, SPUpdate, GenPept y GPUpdate. La comparación fue realizada el 19 de enero de 1996.

Las 15 secuencias aminoacídicas más próximas encontradas en la búsqueda BLAST tienen los identificadores mostrados en la Tabla 6.

TABLA 6

Secuencias aminoacídicas de inmunoglobulina coincidentes
Región Variable de la Cadena Ligera
1 gp|L41800|MUSIKCC_1	cadena kappa inmunoglobulina [Mus mu...
2 gp|J00550|MUSIGKAC2_1	variabl.. cadena kappa inmunoglobulina
3 sp|P01639|KV5G_RATON	reg. V-V precursora cadena kappa Ig
4 gp|V00808|MMIGK7_1	kappa inmunoglobulina [Mus musculus]
5 pir|PL0260|PL0260	región V cadena kappa Ig (anti-ADN,...
6 gp|M59920|MUSIGKAA3_1	cadena kappa Ig [Mus musculus]
7 pir|PL0259|PL0259	región V cadena kappa Ig (anti-ADN,...
8 gp|Z22118|MDIGKVBS_1	región variable inmunoglobulina [Mu...
9 gp|M36246|MUSIGLAFA_1	cadena kappa inmunoglobulina VK-1 [M...
10 pdb|2GFB|A	fragmento Fab Igg2a (Cnj206) >pdb]2...
11 gp|M64168|MUSIGKAFT_1	cadena kappa inmunoglobulina VK-1 [M...
12 pir|PL0262|PL0262	región V cadena kappa Ig (anti-ADN, ...
13 gp|X02177|MMIGGVJ1_1	... cadena ligera kappa inmunoglobulina G
14 gp|U25098|MMU25098_1	cadena ligera inmunoglobulina [Mus mu...
15 pir|B47271|B47271	a... específico de nitrofenil-fosfonato

TABLA 6 (continuación)

Región Variable de la Cadena Pesada
1 gp|X64805|MMAIDHCH_1	cadena pesada 114 mAB anti-Id, reg -V...
2 gp|M17953|MUSIGHXW_1	cadena pesada inmunoglobulina [Mus mu...
3 gp|Z22117|MDIGGVBC_1	región variable inmunoglobulina [Mu...
4 pir|S38950|S38950	cadena gamma Ig - ratón
5 gp|Z22034|MDIGGVAG_1	región variable inmunoglobulina [Mu...
6 gp|U40581|MMU40581_1	anticuerpo sFv [Mus musculus]
7 gp|A13735|A13735_1	anticuerpo monoclonal región V, cruzado...
8 pir|S41394|S41394	región V cadena pesada Ig - ratón
9 gp|Z22088|MDIGGVAR_1	región variable inmunoglobulina [Mu...
10 gp|L22747|MUSF_1	cadena pesada inmunoglobulina [Mus mu...
11 gp|M28251|MUSIGHMX_1	cadena gamma recolocada Ig de ratón (G...
12 gp|M36225|MUSIGHAEF_1	región V cadena pesada inmunoglobulina...
13 pir|S40295|S40295	cadena gamma-2a Ig (mAb735) - ratón
14 gp|L22749|MUSI_1	cadena pesada inmunoglobulina [Mus mu...
15 gp|M31287|MUSIGHAVA_1	producto génico IgG [Mus musculus]

Las Figuras 26 (A) y (B) son una representación comparativa de la secuencia aminoacídica de cadena ligera y pesada del 11D10, con las 15 secuencias que más coinciden encontradas en la búsqueda BLAST. El Panel (A) muestra la comparación de cadenas ligeras. El Panel (B) muestra la comparación de cadenas pesadas. Los residuos idénticos a las secuencias 11D10 son indicados con un punto (.). Los huecos introducidos para mejorar el alineamiento alrededor de la unión VDJ de la cadena pesada son indicados por medio de guiones (=).

Entre las 50 secuencias aminoacídicas de la base de datos que coincidieron más con la de la región variable de la cadena ligera del 11D10, ninguna fue idéntica. El 11D10 difirió de las 15 secuencias que más coincidían en un mínimo de 7, y una media de alrededor de 12, diferencias de substitución. Tuvo lugar un grupo de diferencias cerca del extremo de la CDR1. Otras diferencias tuvieron lugar en la CDR3 y en la región marco.

Entre las 50 secuencias aminoacídicas de la base de datos que coincidieron más con la de la región variable de la cadena pesada del 11D10, ninguna fue idéntica. Lo siguiente resume los puntos principales deducidos de la comparación.

La mayor semejanza fue con una región variable de la cadena pesada indicada por su designación en el GenBank como otro anti-idiotipo (nombre gp|X64805|MMAIDHCH_1). Había 11 substituciones entre los residuos 1 y 98 (antes de la unión VDJ), 7 diferencias de substitución después del residuo 98.

El 11D10 difirió en cuanto a longitud de las 40 de las secuencias de cadena pesada. Las otras secuencias fueron más largas en hasta 5 residuos, o más cortas por unos 2 residuos alrededor de la unión VDJ.

Excepto en las dos secuencias que más coincidieron, existieron, al menos, 18 diferencias de substitución, y una media de alrededor de 22, entre los residuos 1 y 98.

Una diversidad de genes de región D y J parecen ser utilizados con el gen V prototipo. Únicamente una de las 50 secuencias parecía estar utilizando la misma región D. Hubo una diferencia de punto dentro de la región D, y una diferencia de empalme de 3 residuos.

Para la más coincidente de entre las 50 secuencias, hubo un total de 18 diferencias de inserción, deleción y substitución. Las otras 49 secuencias tuvieron un total de, al menos, 25, y una media de alrededor de 30, diferencias de inserción, deleción y substitución.

Las diferencias aparecieron a lo largo de la región variable.

La Figura 26 (C) muestra secuencias aminoacídicas de consenso para las regiones variables de cadena ligera y pesada de las 15 secuencias que más coincidieron (SEC. ID. Nº 47 Y SEC. ID. Nº 48). Éstas representan prototipos del gen VJ de cadena ligera y del gen VDJ de cadena pesada ensamblados. Los residuos en la secuencia 11D10 que son idénticos a la secuencia consenso son indicados por medio de puntos (.). Las CDRs son indicadas por medio de asteriscos (*). También son mostrados fragmentos de globulina de la grasa de la leche humana (HMFG) en orientación N^{\rightarrow} C (caso superior) o C^{\rightarrow} N (caso inferior).

Pueden ser deducidos los siguientes puntos:

\bullet

El 11D10 posee, al menos, alrededor de 18 diferencias en relación con la secuencia consenso. 7 de éstas tienen lugar en la cadena ligera y 11 ocurren en la cadena pesada.

\bullet

Las diferencias de punto tienen lugar a lo largo de las secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada del 11D10. Ocho tienen lugar dentro de las CDRs y 10 ocurren fuera de las CDRs.

\bullet

El alineamiento de las secuencias 11D10 con los fragmentos de HMFG no depende de las mutaciones de punto.

Las secuencias fragmento de región variable, particularmente aquéllas que abarcan la unión VDJ de la cadena pesada, o cualquiera de las diferencias de punto mostradas en la Figura 26 (C), son de interés a la hora de desarrollar los polipéptidos de esta invención que poseen la actividad inmunológica del 11D10. Secuencias codificadoras alrededor de la unión VDJ, o cualquiera de las diferencias de punto, son de interés a la hora de desarrollar los polinucleótidos de esta invención.

Ejemplo 3 Inducción de una Respuesta Específica al Cáncer de Pecho por medio del 11D10 en Monos Líneas Celulares

La línea celular de carcinoma de pecho humano, MCF-7, la cual expresa el antígeno HMFG, fue cultivada en medio RPM1 1640 suplementado con FCS 10%, L-glutamina 1%, penicilina y estreptomicina, y fue utilizada para la detección de respuestas antitumorales. La línea celular de melanoma humano, M21/P6, (amablemente proporcionada por el Dr. Ralph Reisfeid, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) y la línea de células T, MOLT-4, siendo ambas negativas al HMFG, fueron cultivadas en el mismo medio y fueron utilizadas como controles negativos.

Anticuerpos

El mAb Ab1 MC-10 (IgG2b, \kappa), el cual reconoce un epítope distinto y específico en la molécula del HMFG de MW 400.000, fue utilizado para inmunizar ratones BALB/c singenéicos para la producción de mAb anti-Id 11D10 (IgG1-\kappa),
conforme es descrito en el Ejemplo 1. El mAb2 3H1 (IgG1-\kappa) es un mAb anti-Id murino, el cual está emparentado con el CEA humano (Bhattacharya- Chatterjee et al. (1990) J. Immunol. 14S:2758-2765) y fue utilizado como un control.

Adyuvante

Para aumentar la inmunogenicidad de la vacuna anti-Id se precisa de un adyuvante. El hidróxido de aluminio es aprobado por la United States Food and Drug Administration para su utilización con un adyuvante en humanos. Por lo tanto, nosotros inmunizamos monos en este estudio preclínico con Ab2 11D10 precipitado con hidróxido de aluminio, conforme es descrito más abajo.

Preparación del anticuerpo

El 11D10 fue obtenido conforme es descrito en el Ejemplo 1. El mAb2 3H1 (un IgG1-\kappa) es un mAb anti-Id murino, el cual está emparentado con el CEA humano (Bhattacharya- Chatterjee et al. (1990) J. Immunol. 14S:2758-2765) y fue utilizado como un control.

Precipitación del Hidróxido de Aluminio

Fue utilizado un adyuvante para aumentar la inmunogenicidad de la vacuna anti-Id. El hidróxido de aluminio es aprobado por la United States Food and Drug Administration para su utilización con un adyuvante en humanos. Por lo tanto, nosotros inmunizamos monos en este estudio preclínico con el Ab2 11D10. Brevemente, a alícuotas de 5 mg de mAb anti-Id purificado (Ab2) les fue añadido 1 ml de Alu-Gel S 2% (Serva Fine Biochem, Inc., Garden City, Long Island, NY). A continuación, el volumen fue ajustado a 10 ml con Dulbecco-PBS y la mezcla fue incubada en un vórtice durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, la mezcla fue centrifugada a 2000 rpm a 24ºC durante 10 minutos. Fue determinada la cantidad de mAb en la capa de gel midiendo espectrofotométricamente la cantidad de anticuerpo no unido en el sobrenadante. El anticuerpo precipitado en Alu-Gel fue almacenado a 4ºC hasta su utilización. Estos procedimientos fueron realizados asépticamente en una campana de flujo laminar, y el producto final fue estéril y claramente
marcado como Alu-Gel 11D10 anti-Id, y repartido en partes iguales en viales de cristal estéril libres de pirógenos.

Inmunización de Monos

Monos cinomolgus fueron inmunizados con el 11D10 o con el 3H1 de control. Los monos fueron albergados en los White Sands Research Institutes (Alamogordo, NM). Una pareja de monos macho y hembra, peso entre 3 y 4 kg, fue inmunizada con 2 mg de 11D10 o de 3H1, intracutáneamente, en cuatro sitios distintos los días 0, 14, 28 y 42, respectivamente. Solo dos monos fueron utilizados para cada anti-Id (Ab2) con una única dosis, debido a razones financieras. La dosis de 2 mg fue seleccionada basándonos en estudios previos clínicos y preclínicos con diferentes vacunas
anti-Id. Fueron recogidas muestras sanguíneas antes de la inmunización y 10 días después de cada inmunización.

Toxicidad

La inducción de respuestas Ab3 en monos no causó ningún efecto secundario aparente en los animales. Únicamente fueron observadas hinchazón ligera local e irritación en el lugar de la inyección como un resultado de múltiples inmunizaciones. Los monos fueron sometidos a chequeo rutinario por medio de exámenes físicos y mediciones de peso. No mostraron ningún signo de anormalidad.

Desarrollo de Inmunidad Humoral inducida por Inmunización con Precipitado de Hidróxido de Aluminio Ab2

Respuesta Ab3 específica al Ab2. Fueron testados sueros procedentes de monos inmunizados con el fin de determinar la presencia de anticuerpos anti-Id. Los sueros fueron pre-incubados con inmunoglobulina murina normal para bloquear los anticuerpos del mono contra los determinantes isotípicos y alotípicos y, a continuación, chequeados para determinar la presencia de anti-anti-Id (Ab3) por medio de reacción con el anti-Id inmunizador (11D10) recubriendo placas de microtítulo, por medio de RIA. El Ab2 no emparentado fue utilizado como el control. Después de su lavado, la reacción antígeno-anticuerpo fue marcada con la utilización de reactivo anti-Id marcado con I^{125} en un RIA tipo sándwich homogéneo. Fueron utilizados también en estos ensayos suero preinmune y suero procedente de monos inmunizados con Ab2 de control 3H1. Además, el Ab2 monoclonal 3H1 marcado con I^{125} fue utilizado como control.

Análisis de Idiotipo del Ab3. Si es obtenida una reacción positiva en el método anteriormente descrito, los sueros Ab3 procedentes de esos monos fueron chequeados para determinar su habilidad de inhibición de la unión del 11D10 marcado con I^{125} con BrE-1 (Ab1) unido a placas de microtítulo o vice versa (inhibición de la unión de BrE-1 radiomarcado con el 11D10 en la placa). Un sistema no emparentado Ab1-Ab2 fue utilizado como un control
(Bhattacharya-Chatterjee et al. (1990); Bhattacharya-Chatterjee et al. (1987) J. Immunol. 139:1354-13605). Esto demostró si los Ab3s en suero de mono comparten idiotipos con el BrE-1 (Ab1). Este ensayo de inhibición de la unión Ab1-Ab2 por suero Ab3 demuestra también si el Ab3 es un anti-anti-Id verdadero.

Unión del Ab3 al Antígeno Tumoral. Para determinar las respuestas inmunes humorales dirigidas contra antígenos diana nativos, sueros Ab3 de mono fueron testados para determinar la reactividad con líneas celulares conocidas expresoras del HMFG en un RIA. Además, los sueros fueron chequeados para determinar la reactividad contra una preparación semipurificada solubilizada de antígeno HMFG recubriendo placas de microtítulo. La reacción antígeno-anticuerpo fue detectada utilizando reactivos de inmunoglobulina anti-humana marcados con I^{125} o inmunoglobulina anti-humana marcada con fosfatasa alcalina en ELISA. El suero preinmune fue utilizado como un control. El CEA no emparentado fue utilizado también en este ensayo como un control. El isotipo de suero Ab3 de mono uniendo el antígeno HMFG fue determinado por medio de ELISA, utilizando reactivos específicos de isotipo anti-humanos.

La unión del Ab3 con las líneas celulares tumorales fue chequeada también por medio de citometría de flujo inmune. Células MCF-7 positivas a antígeno (1 x 10^{6} por pocillo) fueron hechas reaccionar con Ab1 (MC-10) y Ab3 a 100 \mul a 4ºC durante 60 minutos. Después de su lavado, las células fueron incubadas con anticuerpo marcado IgG-FITC F(ab')_{2} de cabra anti-humano o de cabra anti-ratón (Tago, Burlingame, CA) durante 30 minutos a 4ºC. A continuación, fueron lavadas dos veces, fijadas en paraformaldehído 2% y analizadas por medio de citometría de flujo inmune (FACStar, Becton Dickinson, San Jose, CA). Fueron utilizadas células MOLT-4 negativas a antígeno en este ensayo como un control.

Purificación del Anticuerpo Anti-anti-Id (Ab3) procedente de Suero de Mono Hiperinmunizado. Veinte ml de suero hiperinmune fueron pasados sobre una columna inmunoabsorvente consistente en inmunoglobulina anti-Id inmunizadora (11D10-IgG1) acoplada a Sefarosa 4B. Anticuerpos anti-anti-Id (Ab3) fueron eluídos con 0,1M de tampón glicina-ácido hidroclórico (pH 2,4) y neutralizados hasta pH 7,0 con 3M de Tris. A continuación, el anticuerpo eluído fue pasado sobre una columna inmunoabsorvente consistente en un mAb anti-Id emparejado a isotipo-alotipo no emparentado, acoplado a Sefarosa 4B, con el fin de eliminar reactividades anti-isotípicas y anti-alotípicas. El anticuerpo que pasó fue concentrado y utilizado como Ab3 purificado. El isotipo del Ab3 fue determinado por medio de ELISA, utilizando reactivos específicos de anti-isotipo humano (Tago).

Análisis de Epítope del Ab3. Para demostrar que los Ab3s generados en monos y el Ab1 (BrE-1) se unen a los mismos determinantes antigénicos, fue chequeada la inhibición de unión del BrE-1 con la línea celular tumoral positiva al antígeno, MCF-7, o con el antígeno HMFG por medio de Ab3 purificado a través de RIA según es descrito (Bhattacharya-Chatterjee et al.) (1990).

Análisis Slot Blot de Ab3 Purificado con HMFG. Fue activada una membrana de difluoruro de polivinilideno en metanol durante 5 minutos y transferida a 0,02 M de PBS, pH 7,0. Fueron absorbidas en la membrana diferentes concentraciones de proteínas (5 \mug, 2 \mug, 1 \mug) utilizando el instrumento Hybrislot (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD). A continuación, la membrana fue bloqueada con BSA 2% en PBS durante 2 horas con agitado, seguido de incubación con 5 ml de una solución de 20 \mug/ml de Ab1 o Ab3 durante 3 horas con agitado. Las membranas fueron después lavadas 5 veces con BSA 1% en PBS e incubadas con inmunoglobulina de cabra anti-humana marcada con fosfatasa alcalina, o inmunoglobulina de cabra anti-ratón (dilución 1:100) durante 90 minutos, lavada y desarrollada con substrato proporcionado en el kit Bio-Rad.

Ensayo para determinar la Respuesta Proliferativa Específica de Id

Células mononucleares sanguíneas periféricas frescas fueron aisladas por medio de métodos estándar de centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll-Hypague, y fueron incubadas 5 x 10^{3} células/pocillo con diferentes concentraciones de 11D10 y 3H1 de control (10 ng a 2 \mug) en medio RPMI 1640 con FCS 5% inactivado por calor, penicilina y estreptomicina. Fue utilizado el mitógeno no específico fitohemaglutinina P como un control positivo en 2 y 1 \mug/pocillo. Después de que las células fueran incubadas durante 5 días a 37ºC en una atmósfera conteniendo dióxido de carbono 5%, fueron pulsadas con [^{3}H]timidina (1 \muCi/pocillo) durante 20 horas. Los datos son expresados como las cuentas medias (pocillos triplicados)/min de incorporación de [^{3}H]timidina. El SD de los datos fue <10% para cada determinación.

Resultados

Inducción de Respuestas Anti-anti-Id (Ab3) en Monos. Los sueros procedentes de monos fueron obtenidos 10 días después de la cuarta inmunización, y analizados para detectar las respuestas Ab3 por medio de RIA tipo sándwich, y para determinar la inhibición de la unión del Ab2 con el Ab1 (Tabla 4). Para estos ensayos los sueros fueron pre-tratados con inmunoglobulina de ratón normal (500 \mug/ml) para bloquear reactividades anti-isotípicas y anti-alotípicas. Para el RIA tipo sándwich, el suero Ab3 obtenido después de la cuarta inmunización fue diluido en PBS conteniendo inmunoglobulina de ratón normal (500 \mug/ml). Los sueros fueron pre-incubados con IgG de ratón normal con anterioridad al ensayo. El Ab3, en una dilución de 1:40, fue incubado con mAb anti-Id 11D10 o 3H1, las placas de microtítulo fueron recubiertas con él y, a continuación, se le hizo reaccionar con 11D10 o 3H1 marcado con I^{125} (\sim50.000 cpm) en un ensayo tipo sándwich. Los resultados fueron expresados como cpm unida en un ensayo tipo sándwich. Los resultados son presentados como cpm media (n=3). El SD de los datos fue <10%. A continuación, testamos la unión del suero Ab3 de mono con el HMFG semipurificado. El suero Ab3 procedente de monos (PRO 723 y PRO 872) inmunizado con 11D10 se unió específicamente con el Ab2 inmunizador (11D10) con una reactividad mínima ante el Ab2 no emparentado (3H1). Los Ab3 de mono inhibieron también la unión del Ab2 radiomarcado con el Ab1 en un 91% y 95%, respectivamente, incluso con una dilución de 1:40 (Tabla 4). No hubo inhibición con el suero preinmune o con el suero obtenido de monos (PRO 541 y PRO 667) inmunizados con el Ab2 no emparentado 3H1. El 11D10 purificado fue utilizado para recubrir la placa (250 ng/pocillo), y la unión del BrE-1 radiomarcado (\sim500.000 cpm) con el 11D10 fue testada para determinar la inhibición en presencia de distintas diluciones de suero Ab3. En un experimento de control paralelo fue utilizado como control un sistema no emparentado Ab1-Ab2 (mAb 5019-3H1). Las cinéticas de la respuesta Ab3 son mostradas en la Figura 12 utilizando suero procedente del mono PRO 723, demostrando la inhibición de la unión del Ab1 radiomarcado con el Ab2. Una reactividad similar fue vista en el suero
procedente del mono PRO 872. Los resultados indican que el suero Ab3 de mono comparte idiotipos con el Ab1.

TABLA 4 Análisis de suero anti-anti-Id de mono generado con mAb anti-Id 11D10

100

Inducción de Respuesta Anticuerpo Celular Antitumoral. Para determinar si el suero de mono inmunizado con 11D10 se unió específicamente con las células carcinoma de pecho positivas al HMFG, fue testada por medio de ELISA la unión de suero Ab3 de mono con la línea celular de cáncer de pecho, MCF-7. Sueros Ab3, en diferentes diluciones, fueron añadidos a monocapas confluyentes de células cultivadas en placas de microtítulo de 96 pocillos, y desarrolladas con anticuerpos marcados con enzima IgG de cabra anti-humana (específico de cadena P y L). La absorbancia (OD) fue leída después de 1 hora. El mono PRO 872 fue inmunizado con Ab2 11D10. El mono PRO 667 fue inmunizado con Ab2 no emparentado de control (3H1). El suero de mono preinmune fue utilizado también como control. La unión de suero Ab3 de mono (.......) con la línea celular de melanoma, M21/P6, por medio de ELISA fue testada siguiendo el mismo protocolo. Los resultados son presentados como la absorbancia media a 405 nm (n = 3). El SD de los datos fue <10% para cada ensayo. Conforme es mostrado en la Figura 13, el suero Ab3 obtenido después de la cuarta inmunización en diferentes diluciones reaccionó con las células MCF-7, pero no lo hizo con la línea celular melanoma negativa a antígeno, M21/P6. A continuación, testamos la unión de suero Ab3 de mono con el HMFG semipurificado. Las placas fueron recubiertas con HMFG (2 mg/pocillo) y hechas reaccionar con suero Ab3 (dilución 1:100) procedente del mono (PRO 723) inmunizado con el Ab2 11D10 y procedente del mono (PRO 667) inmunizado con el Ab2 no emparentado, 3H1, del mismo isotipo y alotipo. Fueron utilizados también como controles suero preinmune y PBS-BSA. Los resultados se encuentran en la Figura 9 y son presentados como la absorbancia media (OD) a 405 nm. En un experimento de control paralelo, el mismo suero fue chequeado en una placa recubierta con CEA purificado. No hubo reactividad con el suero de mono inmunizado con 11D10; la absorbancia obtenida fue comparable a la obtenida con el FBS-BSA de control. Los resultados son presentados como la absorbancia media a 405 nm (n = 3). El SD de los datos fue <10%. Las diferencias existentes entre los valores experimentales y los de control fueron estadísticamente significativas. El suero Ab3 se unió también específicamente con el HMFG semipurificado que recubría las placas de microtítulo por medio de ELISA (Figura 14). El suero de control procedente de monos preinmunes o de monos inmunizados con Ab2 no emparentado (3H1) no mostró unión apreciable con el HMFG. En experimentos paralelos, los mismos
Ab3s procedentes del mono PRO 723 fueron comparados en una placa recubierta con CEA y dieron negativo.

Para determinar la reactividad con el HMFG de superficie celular fueron testadas células MCF-7 por medio de citometría de flujo inmune. Conforme es mostrado en la Figura 10, el Ab3 procedente de monos inmunizados con Ab2 mostró una unión distinta (Figura 15-A), que fue similar al patrón de unión obtenido con el Ab1 (no mostrado). No fue obtenida unión significativa con células MOLT-4, las cuales no expresan el HMFG (Figura 15-B).

A continuación, los anticuerpos Ab3 fueron purificados del suero, conforme es descrito más arriba. La reactividad del Ab3 purificado fue chequeada por medio de ELISA. La placa fue recubierta con HMFG (2 mg/ml, 100 ng/pocillo) e incubada durante la noche a temperatura ambiente. La placa fue bloqueada con BSA 1% en PBS y hecha reaccionar con Ab3 purificado (20 mg/ml) procedente de monos inmunizados con 11D10 o con Ab2 de control (3H1). El PBS-BSA fue utilizado como control negativo. En la placa recubierta con CEA fue utilizado mAb 8019 (anti-CEA) como un control positivo. Los resultados se encuentran en la Figura 16 y son presentados como la absorbancia media (OD) a 405 nm (n = 3). El SD de los datos fue <10%. El Ab3 de mono reaccionó específicamente con el HMFG que recubría las placas de microtítulo, mientras que no se obtuvo reactividad con las placas de control recubiertas de CEA.

La especificidad del Ab3 purificado para el HMFG fue confirmada adicionalmente por medio de análisis Slot blot (Figura 17). En la Figura 6, las Franjas 1 y 2 fueron recubiertas con HMFG semipurificado, y las Franjas 3 y 4 fueron recubiertas con CEA purificado. Las membranas fueron incubadas con Ab1 (franja 1), Ab3 purificado (franjas 2 y 3), y anti-CEA en mAb8019 (franja 4). Fue demostrada la reactividad con el HMFG y no con CEA.

Competición de Ab1 Murino y Ab3 de Mono por la Unión con la Célula MCF-7. Si el Ab3 posee un sitio de unión similar al del Ab1, éste debería competir con el Ab1 por la unión con el HMFG en células MCF-7. Monocapas confluyentes de células MCF-7 en placas de microtítulo fueron hechas reaccionar con diferentes concentraciones de Ab3 purificado y una cantidad fija de Ab1 marcado con I^{125} (\sim500.000 cpm). El porcentaje de inhibición fue calculado y ploteado contra el Inhibidor (mg de Ab3). Una cantidad fija de Ab1 radiomarcado fue co-incubada con diferentes cantidades de preparaciones de Ab3 purificado o de Ab3 de control y células MCF-7 (Figura 18). Cien ng de Ab3 purificado inhibieron la unión en un 60%, y 1 mg de Ab3 purificado dio una inhibición de alrededor del 80%, mientras que el Ab3 de control utilizado, en una concentración de 5 mg, no produjo ninguna inhibición. Estos resultados indican que el anticuerpo de mono inmune Ab2 se une al mismo antígeno que el Ab1; por lo tanto, la preparación de Ab3 contiene moléculas de anticuerpo con las propiedades del Ab1.

Respuestas celulares al Anti-Id. Fueron medidas las respuestas celulares inmunes por medio de la proliferación de células mononucleares sanguíneas periféricas incubadas con anticuerpo anti-Id (11D10) precipitado con hidróxido de aluminio, y anticuerpo anti-Id (3H1) precipitado con hidróxido de aluminio. Linfocitos sanguíneos periféricos (PBL) obtenidos de monos inmunizados fueron sometidos a ensayo para determinar su respuesta a la estimulación con 11D10-Alugel o 3H1-Alugel in vivo. Los PBL fueron cultivados durante 5 días con 11D10 Alugel™ (2 \mug a 100 ng) y 3H1-Alugel (2 \mug a 100 ng) y fue medida la proliferación por medio de la incorporación de ^{3}H-timidina. Células mononucleares sanguíneas periféricas obtenidas del mono PRO 723 fueron estimuladas in vitro con 11D10 (1 mg/ml); Ab2 no emparentado de control 3H1 (1 mg/ml). De forma similar, células mononucleares sanguíneas periféricas obtenidas del mono PRO 872 fueron estimuladas in vitro con 11D10 (1 mg/ml); Ab2 no emparentado de control 3H1 (1 mg/ml). La estimulación fue medida por el grado de incorporación de un pulso de [^{3}H]timidina. Fue utilizado también como un control medio de cultivo sin ningún antígeno. Células mononucleares sanguíneas periféricas post-inmunizadas fueron recogidas 10 días después de la tercera inmunización. Los resultados son mostrados en la Figura 19 y son expresados como la cpm media de los pocillos triplicados. El SD de los datos fue <10% para cada determinación. Las diferencias existentes entre los valores experimentales y los de control fueron estadísticamente significativas. Las respuestas proliferativas positivas fueron vistas tanto en los monos PRO 872 como en los PRO 723, que fueron casi comparables con las respuestas al mitogen fitohemaglutinina P. Las células pre-inmunes no tuvieron respuesta proliferativa al anticuerpo anti-Id, mientras que las células post-inmunes mostraron una respuesta significativa. Existió también una respuesta menor, pero significativa, al anticuerpo anti-Id 3H1 que coincidía isotípicamente, que fue significativamente menor que la de la respuesta 11D10. Esto probablemente representa una respuesta a los componentes no-Id de la molécula de inmunoglobulina. Las respuestas proliferativas fueron apreciadas por primera vez después de la tercera inyección, y fue obtenida una reactividad similar después de la cuarta inmunización. Debido a un suministro limitado de sangre, no pudimos testar la proliferación de células T en presencia del antígeno HMFG semipurificado y, de esta forma, establecer la especificidad antigénica de las respuestas inmunes celulares inducidas por los linfocitos, así como los fenotipos de estos linfocitos.

Ejemplo 4 Administración de 11D10 a humanos Inmunización con anti-Id 11D10 precipitado con alum en 1, 2, 4 u 8 mg de 11D10 por inyección

Los pacientes son seleccionados al azar para recibir una de las cuatro dosis de 11D10 por inyecciones intracutáneas en los días 0, 14, 28 y 42. Cada grupo de dosis incluye de 3 a 8 pacientes. Es realizado el precipitado de hidróxido de aluminio siguiendo el método de Herlyn, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84.805S. Brevemente, la vacuna consiste en 11D10 anti-Id después del precipitado con hidróxido de aluminio, conteniendo Alu-Gel S 0,2%. A alícuotas de 5 mg de anti-Id (Ab2) monoclonal purificado les es añadido 1 ml de Alu-Gel S 2% (Serva Fine Biochem, Inc., Garden City, Long Island, NY). A continuación, el volumen es ajustado a 10,0 ml con D-PBS y la mezcla es incubada en un vórtex durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, la mezcla es centrifugada a 2000 rpm a 24ºC durante 10 minutos. La cantidad de anticuerpo unido en la capa de gel es determinada por medio de la medición espectrométrica de la cantidad de anticuerpo no unido en el sobrenadante. El Ab precipitado en el Alu-Gel es almacenado a 4ºC hasta su utilización. Toda la operación es realizada asépticamente bajo una campana de flujo laminar. El producto final es estéril y claramente marcado como anti-Id 11D10-Alu-Gel y repartido en viales de cristal estériles libres de pirógenos. La actividad del idiotipo precipitado con hidróxido de aluminio es monitorizada testando la unión del Ab1 F(ab')2 en ELISA. Finalmente, la actividad biológica del conjunto es chequeada en el suero de animales pequeños después de la inmunización con los portadores del idiotipo según es descrito (Bhattacharya-Chatterjee et al. (1987) J. Immunol. 139:1354; Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) J. Immunol. 141:1398). El producto resultante final es testado en cerdos de guinea para detectar endotoxina, esterilidad y seguridad general. A continuación, el 11D10 precipitado con hidróxido
de aluminio es tratado por calor a 45º durante 30 minutos en un baño de agua con anterioridad a su administración.

Inmunidad Humoral

Es caracterizada la respuesta inmune humoral de los pacientes que desarrollan anticuerpos anti-anti-Id (Ab3). Los anticuerpos son evaluados para determinar (a) la unión con células tumorales o antígeno semipurificado aislado, con el fin de determinar si el Ab3 contiene realmente anticuerpos Ab1; (b) la actividad citotóxica contra las células de cáncer de pecho con células efectoras, o complemento como mediador de los efectos citotóxicos; (c) la caracterización isotípica con reactivos específicos isotípicos anti-humanos; (d) el análisis del idiotipo del Ab3 (es decir, el compartir idiotipos con el Ab1); y (e) el análisis del epítope del Ab3 (es decir, la unión al mismo epítope que el Ab1).

El desarrollo de la inmunidad humoral inducida por inmunización con Ab2 precipitado con alum es determinado al testar el suero obtenido de pacientes en diferentes momentos, conforme es indicado en el protocolo. El suero es testado inicialmente para determinar las respuestas totales anticuerpo antimurino humano (HAMA) (anticuerpos anti-iso/alotipo y anti-anti-idiotipo) por medio de RIA tipo sándwich. Brevemente, placas de microtítulo son recubiertas con 11D10 e incubadas con diferentes diluciones de suero de pacientes. Después de varios lavados, la reacción antígeno-anticuerpo es marcada utilizando 11D10 anti-Id marcado con I^{125} en un RIA tipo sándwich homogéneo. Debido a que el 11D10 es inyectado como IgG1 intacto, se espera que los pacientes monten respuestas HAMA.

(a) Respuesta Ab3 específica al Ab2: Sueros procedentes de pacientes inmunizados con respuestas positivas

\hbox{HAMA}

son testados para determinar la presencia de anticuerpos anti-anti-idiotípicos. Los sueros son pre-incubados con inmunoglobulina murina normal para bloquear anticuerpos humanos contra determinantes isotípicos y alotípicos y, a continuación, chequeados para determinar la presencia de anti-anti-Id (Ab3) por medio de reacción con el anti-Id (11D10) inmunizador que recubre las placas de microtítulo, por medio de RIA. El Ab2 no emparentado es utilizado como control. Después de varios lavados, la reacción antígeno-anticuerpo es marcada utilizando reactivo anti-Id marcado con I^{125} en un RIA tipo sándwich homogéneo, igual que más arriba. Son utilizados como control en estos ensayos suero no inmune, pre-tratamiento, y suero procedente de donantes normales.

(b) Análisis del idiotipo del Ab3: Si es obtenida una reacción positiva en el (a) anterior, el suero Ab3 procedente de los pacientes tratados es chequeado para determinar su habilidad para inhibir la unión del 11D10 marcado con I^{125} con el MC-10 (Ab1) unido a las placas de microtítulo o vice versa (inhibición de la unión del MC-10 radiomarcado con el 11D10 de la placa). Es utilizado como un control un sistema Ab1-Ab2 no emparentado. Esta prueba demuestra si el Ab3 en el suero de un paciente comparte idiotipos con el MC-10 (Ab1). Este ensayo de inhibición de la unión Ab1-Ab2 por medio de suero Ab3 demuestra también si el Ab3 es un verdadero anti-anti-idiotipo.

(c) Unión del Ab3 al antígeno tumoral: Para determinar las respuestas inmunes humorales dirigidas contra antígenos diana nativos es testado suero Ab3 procedente del paciente, con el fin de determinar la reactividad con líneas celulares de las que se sabe que expresan el HMFG, en un RIA. Además, el suero es chequeado para detectar la reactividad contra una preparación solubilizada semipurificada del antígeno HMFG que recubre las placas de microtítulo. La reacción antígeno-anticuerpo es detectada utilizando reactivos Ig anti-humana marcados con I^{125} o Ig anti-humana marcada con fosfatasa alcalina, en ELISA. Son utilizados como controles suero pre-inmune y antígeno no emparentado. El isotipo del suero Ab3 humano uniéndose con el antígeno HMFG es determinado por medio de

\hbox{ELISA,}

utilizando reactivos específicos de isotipo anti-humano. Para estos experimentos, el HMFG es obtenido como una proteína de fusión procedente del E. coli, conforme al método de Larocca et al. (1992) Hybridoma 11(2):191-201.

(d) Análisis del epítope del Ab3: Para demostrar que el Ab3 generado en pacientes tratados y el Ab1 (MC-10) se unen al mismo determinante antigénico, es chequeada por medio de RIA la inhibición de la unión del MC-10 con la línea celular tumoral Ag positiva, MCF-7, o con el antígeno HMFG por medio de suero Ab3.

(e) Actividades citotóxicas del Ab3: Si el Ab3 en el suero de un paciente se une específicamente con las células tumorales, la habilidad del Ab3 para lisar estas células junto con células efectoras y/o complemento es testada por medio de ADCC estándar (Cheresh et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:515), o por ensayos CMC (Herlyn et al. (1981) Int. J. Cancer 27:769). Sin embargo, la actividad citotóxica del Ab3 puede depender de su isotipo, siendo efectiva la IgG1 en ADCC, y IgG1, IgG2, IgG3 y IgM en CMC.

Determinación de los efectos de la inmunización con 11D10 en respuestas inmunes celulares de pacientes

Para testar si la inmunización de pacientes con cáncer de pecho en estado avanzado con 11D10-Alugel conduce a la activación de células T -algunas de las cuales podrían mostrar actividad citolítica contra sus propias células tumorales-, las células T de pacientes, si son activadas in vivo por el Ab2\beta, deberían responder a estimulación in vitro con Ab2\beta, antígeno o células tumorales autólogas, con proliferación y posiblemente inducción de CTL.

(a) La respuesta proliferativa de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de pacientes es testada en presencia de 11D10 anti-Id inmunizador, Ab2 de control o antígeno HMFG semipurificado. Alternativamente, las PMBCs son estimuladas con células tumorales irradiadas autólogas (criopreservadas durante la cirugía o mantenidas en cultivo a corto plazo, donde fue factible). Si las células proliferan son fenotipadas por medio de citometría de flujo para determinar el subtipo de células involucradas en la proliferación. La respuesta proliferativa es medida por medio de la incorporación de ^{3}H-timidina y comparada con el Índice de Estimulación de PBMC pre-terapia. Para este ensayo son recogidas muestras sanguíneas después de las inmunizaciones tercera y cuarta, y un mes después de la última terapia.

(b) Actividad Citotóxica In Vitro. El perfil inmune celular es determinado testando la actividad citotóxica in vitro de las células T para células cancerígenas autólogas (donde fue factible), o para células tumorales Ag positivas MC-10 alogenéicas, en un ensayo de liberación de Cr^{51}. Conforme es sugerido por Ertle et al., (22) la habilidad del anticuerpo anti-Id para inducir células T citotóxicas, las cuales no están restringidas al MHC a nivel de fase efectora, pueden superar la dificultad de utilizar células tumorales autólogas como dianas, y puede facilitar también la utilización de células tumorales alogenéicas. Las preparaciones de linfocito sanguíneo periférico procedentes de pacientes con cáncer de pecho y de donantes sanos son incubadas con diferentes dosis de anti-Id (rango de 10 ng a 100 \mug), insolubilizado en bio-partículas o recubriendo placas plásticas. Es cultivado el número óptimo de linfocitos en un disco de petri de 135 mm, con concentraciones óptimas de vacunas idiotópicas en 2 ml de medio de cultivo Mishell-Dutton. Las células son recolectadas de 5 a 6 días más tarde y utilizadas como células efectoras en un ensayo de citotoxicidad de liberación de Cr^{51} de 4 horas o de 18 horas, contra dianas marcadas con Cr^{51}, conforme es descrito (84). Siempre que es posible las células tumorales autólogas (criopreservadas durante el diagnóstico o antes de la terapia) son utilizadas como células diana. Podría ser factible poseer una fuente de células autólogas al propagar y mantener células tumorales frescas en ratones desnudos o en cultivo celular, al menos en algunos pacientes seleccionados. Son también testadas simultáneamente como dianas líneas celulares tumorales Ag positivas MC-10 alogenéicas. Si existe matanza de células tumorales, los siguientes experimentos caracterizan la especificidad:

(i)

si los linfocitos se vuelven citotóxicos para con las células tumorales de pecho, éstos son testados en el ensayo de citotoxicidad con un número de dianas que no expresan el antígeno (es decir, células linfoides, otras líneas celulares de carcinoma). La falta de citotoxicidad sugiere que la diana es, probablemente, Ag relacionado con cáncer de pecho.

(ii)

Los linfocitos son incubados con hibridoma anti-idiotípico no emparentado del mismo isotipo que el Ab2\beta utilizado y testado en el ensayo citotóxico con células tumorales diana marcadas con Cr^{51}. La falta de citotoxicidad muestra que el efecto del anti-Id es específico.

En experimentos separados, los linfocitos procedentes de un paciente son incubados con células tumorales irradiadas autólogas (donde es posible). Las células serán recolectadas de 5 a 6 días después y las células vivas son purificadas sobre medio de separación de linfocitos. La citotoxicidad es medida contra células tumorales diana autólogas marcadas con Cr^{51}.

\newpage

Este ensayo citotóxico in vitro utiliza PBMCs aisladas procedentes de sangre obtenida después de la terapia, después de la cuarta inmunización y un mes después de la última inmunización.

Determinación de la dosis óptima de 11D10

La dosis óptima para pruebas clínicas adicionales es seleccionada conforme a dos criterios:

(a) Es determinada la dosis de Ab2 que induce la máxima respuesta Ab3. Ésta puede ser determinada por medio de un ensayo de inhibición.

(b) La dosis de Ab2 que induce la máxima respuesta de unión Ab3 con el tumor (respuesta Ab1').

Cuantificación de la Respuesta Ab3 y de la Ab1'

La expresión del anticuerpo anti-anti-Id (Ab3) en el suero del paciente es cuantificada por medio de estudios de inhibición RIA, conforme sigue. Brevemente, son recubiertas placas de microtítulo con MC-10-IgG1 (Ab1) y hechas reaccionar con una cantidad fija de Ab2 marcado con I^{125}. Es generada una curva de inhibición estándar utilizando IgG1 MC-10 purificado como inhibidores. A continuación, suero del paciente sin actividad anti-isoalotípica es chequeado para determinar su habilidad para inhibir la reacción Ab1-Ab2 en diferentes diluciones, y es estimada la cantidad existente de anticuerpo de tipo Ab1 en el suero partiendo de la curva de inhibición estándar. La inducción de respuesta Ab3 así como la duración pueden ser comparadas entre diferentes niveles de dosis. Caso de que no exista diferencia estadística entre las respuestas Ab3 o la duración en un número de dosis, es comparado el título de la respuesta antitumoral específica (Ab1') en el suero por medio de ELISA contra el antígeno HMFG semipurificado que recubre las placas.

Estudios in vitro. Si se encuentran en circulación sueros positivos a Ab1' o a Ab3 procedentes de pacientes, esto puede indicar que pueden estar unidos a células tumorales de los pacientes, o a antígeno tumoral en circulación (aún cuando el Ag es secretado en la sangre en una cantidad mínima), o que son de baja afinidad. Las PBMCs de pacientes son estimuladas in vitro con antígeno o con Ab2 para la inducción de un anticuerpo específico de tumor. Para ello, células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) obtenidas de sangre recogida antes de la terapia y, a continuación, un mes después de la cuarta inmunización, son cultivadas con distintas concentraciones del 11D10, o con Ab2 no emparentado, o con antígeno HMFG (10 \mug a 110 ng) en un medio de cultivo Mishell-Dutton modificado (DeFreitas et al. (1985) Curr. Top Microbiol. Immunol. 119:75). Los sobrenadantes del cultivo son recolectados y chequeados en primer lugar para determinar la producción de inmunoglobulinas humanas específicas por medio de ensayo ELISA, y para determinar la unión a una preparación insolubilizada de Ab2 por medio de radioinmunoensayo. Además, los sobrenadantes son testados para determinar el contenido de molécula portadora de idiotipo por medio de su habilidad para inhibir la reacción entre el MC-10 (Ab1) marcado con I^{125} y el Ab2\beta. Los sobrenadantes son chequeados también para determinar su reactividad con las células de carcinoma de pecho humano Ag positivas MC-10, y con células linfoides Ag negativas, en un ensayo de unión con reactivos Ig anti-humana marcados con I^{125} por medio de ensayo RIA o ELISA (sensibilidad >1 ng) para la evaluación del anticuerpo Ab1'.

La especificidad del efecto del Ab2\beta es monitorizada por medio de la incubación de PMBC con Ab2 no emparentado del mismo isotipo. Ya que únicamente los pacientes Ab3 positivo serán incluidos en este estudio in vitro, la PBMC estimulada con el Ab2\beta debería secretar anticuerpos que se unan al Ab2\beta (11D10) y servir como un control positivo.

Posible inducción de respuesta Ab4

Conforme a la hipótesis de redes, los pacientes inmunizados con Ab2 pueden finalmente inducir también una respuesta Ab4 (anti-anti-anti-Id), la cual puede mimetizar la especificidad del Ab2. Para estudiar esta posibilidad, suero procedente de pacientes Ab3 positivo (sin anticuerpos anti-isoalotipo y anti-alotipo) es hecho reaccionar con MC-10 (Ab1) por medio de ELISA o RIA, según es descrito. Los controles positivo y negativo serán incluidos conforme es descrito para el ensayo Ab3. El suero para este ensayo será obtenido tres meses después de la última terapia.

Ejemplo 5 Análisis de Respuesta Inmune provocada por la Administración de 11D10 a Pacientes con Enfermedad Asociada al HMFG en Estado Avanzado

Obtuvimos un IND de la U.S. FDA para la prueba clínica de pacientes de cáncer de pecho con 11D10 anti-Id precipitado con alum (BB-IND nº 5745). Apuntamos a cinco pacientes a esta prueba en Fase Ib. Todos los pacientes tenían cáncer de pecho en estado avanzado, el cual había sido tratado previamente con terapia estándar, y sus células tumorales daban positivo al antígeno de cáncer de pecho, HMFG, según es definido por el anticuerpo monoclonal MC-10 (BrE-1). Los pacientes fueron seleccionados al azar para recibir dosis de 1mg, 2 mg, 4 mg u 8 mg de 11D10-Alugel (alum) por inyección. Fueron inmunizados intracutáneamente, bisemanalmente, para un mínimo de cuatro inyecciones. La terapia continuó con una frecuencia mensual hasta que la enfermedad del paciente progresó.

El primer paciente ha recibido ocho inmunizaciones de 8 mg hasta el momento; el segundo paciente ha recibido cuatro inmunizaciones de 4 mg; el tercer paciente ha recibido cuatro inmunizaciones de 2 mg. Los pacientes cuarto y quinto, recibiendo dosis de 1 mg y 4 mg, respectivamente, han entrado recientemente en el estudio.

Toxicidad

La toxicidad fue mínima, únicamente con reacciones a nivel local en el sitio de la inyección, con eritema leve e induración. El tratamiento con anti-Id no tuvo ningún efecto deletéreo sobre las células hematopoyéticas, función renal o hepática.

Respuestas Humorales al Anti-Idiotipo

El desarrollo de inmunidad humoral inducida por inmunización con 11D10 anti-Id precipitado con alum (preparado según es descrito en el Ejemplo 4) fue determinado testando suero procedente de pacientes antes de la terapia y después de cada tratamiento con la vacuna. El suero hiperinmune (después de la cuarta inmunización) procedente de los primeros tres pacientes mostró niveles significativos de respuestas totales anticuerpo humano anti-ratón, incluyendo respuestas anti-isoalotipo/anti-alotipo/anti-anti-idiotipo contra el 11D10 Ab2 inmunizador. Es mostrada información representativa procedente del primer paciente en la Figura 20. A continuación, el suero procedente de estos pacientes fue chequeado para determinar su habilidad para inhibir la unión del MC-10(Ab1)-I^{125} con el 11D10 Ab2 en la placa, por medio de radioinmunoensayo, o vice versa (la inhibición de la unión del Ab2 radiomarcado con el Ab1 en la placa). Estas reacciones fueron realizadas en presencia de Ig murina normal en exceso, para bloquear anticuerpos humanos contra determinantes isotípicos y alotípicos. La Figura 21 muestra información sobre el primer paciente. Fue obtenido alrededor del cuarenta por ciento de inhibición en suero con dilución 1:40, mientras que únicamente fue obtenido un 9% y un 22% de inhibición con el suero procedente del segundo y del tercer paciente, con la misma dilución. Después de la inmunización séptima, el primer paciente mostró una inhibición del 83% con el suero a una dilución de 1:40. El suero preinmune procedente de los tres pacientes no mostró ninguna inhibición. Estos resultados indican que el paciente nº 1 ha montado una cantidad significativa de anticuerpos anti-anti-idiotípicos (Ab3) y que los otros dos pacientes tuvieron alguna reactividad Ab3.

Seguidamente, investigamos si el 11D10 anti-Id podía inducir una respuesta de anticuerpo específica antígeno anti-tumor (HMFG) en pacientes inmunizados. Para ello, los sueros obtenidos después de cuatro inmunizaciones fueron testados contra antígeno HMFG (proteína de fusión obtenida del Dr. Ceriani; Larocca et al. (1992)) que recubría placas de microtítulo, por medio de un ensayo ELISA. Los resultados son mostrados en la Tabla 5 y son expresados como la media de los pocillos triplicados (S.D. <10%).

TABLA 5 Unión del suero Ab3 con el antígeno HMFG por ELISA

Dilución	Paciente nº 1	Paciente nº 2	Paciente nº 3
	Pre	Post	Pre	Post	Pre	Post
	O.D. 405 nm	O.D. 405 nm	O.D. 405 nm
1:10	1,05	2,82	1,47	1,67	0,96	2,05
1:40	0,28	0,72	1,0	0,92	0,48	1,33

Suero Ab3 procedente del paciente nº 1 y del paciente nº 3 mostró unión específica con el antígeno HMFG si se compara con el suero pre-inmune. Tanto el suero pre-inmune como el post-inmune procedente del paciente nº 2 mostró unión no específica con el HMFG, la cual no aumentó con la inmunización.

Respuestas Inmunes Celulares al anti-Idiotipo

Las respuestas inmunes celulares fueron medidas por medio de la proliferación de células mononucleares sanguíneas periféricas incubadas con 11D10 anti-Id precipitado con alum, y el isotipo y alotipo coincidieron con el 3H1 anti-Id de control. Fueron vistas respuestas proliferativas positivas únicamente en el paciente nº 1 (Figura 22), pero no en los otros dos pacientes. Células pre-inmunes procedentes del paciente nº 1 no mostraron respuesta proliferativa, mientras que células hiperinmunes tuvieron una respuesta significativa al 11D10 anti-Id. Hubo también una respuesta al 3H1 anti-Id de control; esta respuesta fue significativamente inferior a la de la respuesta 11D10, representando probablemente una respuesta a los componentes no idiotípicos de la molécula de inmunoglobulina murina.

Los resultados sugieren que el 11D10 anti-Id puede inducir respuestas inmunes tanto humorales como celulares en pacientes con cáncer de pecho en estado avanzado.

Ejemplo 6 Construcción de un Vector Vaccinia Recombinante Codificando un Fragmento de Polipéptido 11D10 Construcción del Plásmido y Producción de Virus de Vaccinia Recombinantes

El esquema para la construcción de un vector vaccinia general (rvv) es mostrado en la Figura 18. Recuperamos la secuencia completa del gen TK de la cepa WR de tipo salvaje del virus vaccinia (GenBank, número de acceso J02425), del National Center for Biotechnology Information (NCBI) por medio del programa BLAST. Aitschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Fueronsintetizados de los datos de la secuencia los iniciadores PCR delantero y reverso 5'-CAGATGGAAGGGCCCAAC (SEC. ID. Nº 42) y 5'-GATTGATGCATATCATTACC (SEC. ID. Nº 43), correspondiendo a los nucleótidos 22-39 y 727-708 respectivamente de la secuencia TK, Hruby et al. (1983) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 80:3411-3415. Fue introducido un sitio Apa I (subrayado) en el iniciador delantero, y un sitio Nsi I (subrayado) en el iniciador reverso, para la inserción dentro del plásmido pGEM-7Zf(+) (Promega). Fue aislado ADN de la cepa WR de tipo salvaje de vaccinia y el gen TK fue amplificado por medio de PCR. Fue obtenido por PCR un fragmento de ADN del tamaño esperado (alrededor de 700 pb). Este ADN fue separado por medio de electrofóresis en agarosa de bajo punto de fusión, y purificado por digestión con Gelasa (Epicentre Tech.). El fragmento de ADN TK fue ligado al pGEM-7Zf(+) después de digestión con Apa I más Nsi I. El plásmido resultante (pGEM-TK) fue amplificado por medio de técnicas de transformación estándar. La inserción fue verificada por medio de mapeo de restricción.

El promotor de 7,5 K fue amplificado del virus vaccinia de tipo salvaje por medio de PCR, utilizando el iniciador delantero 5'-GTTATCGATGTCGAATAGCC (SEC. ID. Nº 44) y el iniciador reverso 5'-TTGCTGCAGATTGAGTAC
TGTTCT (SEC. ID. Nº 45), correspondiendo a los nucleótidos 69-88 y 335-312 de la secuencia promotora de 7,5 K. Cochran et al. (1985) J. Virol. 54:30-37. Fueron incluidos en los iniciadores un sitio Cla I (delantero) y un sitio Pst I (reverso). El fragmento de ADN amplificado fue digerido con Pst I. Fue sintetizado un adaptador de polinucleótido siendo fosforilado el oligonucleótido más pequeño en el extremo 5' por la polinucleótido quinasa. El adaptador hemi-fosforilado fue ligado al fragmento de ADN promotor de 7,5 K amplificado por PCR digerido con Pst I. El producto fue digerido con el digesto Cla I/EcoR I, pGEM-TK.

Un inserto ADNc codificando un polipéptido 11D10 es insertado entre los sitios Nco I y Xmal (Smal) del pVV. Este plásmido contiene también la secuencia líder del V_{H} en el extremo 5' del ADNc scFv. Si se desea, puede ser construido un plásmido de control vaccinia conteniendo ADNc para E. coli \beta-galactosidasa.

Construcción del rvv

Los rvvs son construidos por recombinación homóloga de plásmidos vaccinia y cepa WR del tipo salvaje de virus vaccinia, conforme al procedimiento de Mackett et al. (DNA Cloning, Vol. II, D.M. Glover, ed., IRL Press 1985) utilizando células CV-1. Los clones virales recombinantes expresando la \beta-galactosidasa (controles) son seleccionados por medio de crecimiento en células 143B TK, en presencia de 5'-bromodesoxiuridina y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactosidasa (X-Gal). Virus recombinantes azules son recogidos por medio de pipetas pasteur y purificados en placa. Como un segundo paso en la selección clónica, es realizo "southern blot" del ADN extraído, utilizando ADNc 11D10 como la sonda. Es realizada una selección adicional del rvv por medio de ensayo de sobrenadantes de cultivo de la CV-1 infectada viralmente o de cualquier otra célula eucariótica, por medio de ELISA. Si el polipéptido 11D10 asociado a la célula se encuentra en el rvv (es decir, si la secuencia líder está suprimida) es ensayado el lisado celular. Es realizado también "western blotting" con MC-10 (Ab1) como sonda. Es determinada la actividad biológica del polipéptido 11D10 sintetizado por medio del virus vaccinia a través del ensayo de inhibición de unión celular, conforme es descrito más arriba. Los clones rvv conteniendo polinucleótidos 11D10 son seleccionados por medio de tinción con rojo neutro 0,1% y purificados por placa, de la misma forma que se ha realizado más arriba. Los clones virales son cultivados en un lisado con título alto utilizando técnicas estándar. Mackett et al (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419. Usualmente, es seleccionado para estudios adicionales un clon que produce la mayor cantidad de polipéptido 11D10.

Ensayo de Polipéptidos 11D10 (Proteínas Extranjeras) Expresados por el Virus Vaccinia Recombinante

Son propagadas células CV-1 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de becerro fetal 10% y 100 unidades de penicilina y 100 \mug de estreptomicina por ml, en matraces de 25 cm^{2} o matraces Cluster de 6 pocillos. Las células fueron inoculadas con rvv a una MOI de 30. Ser permitió que se absorbiera el virus durante 2 horas a 37ºC en un incubador de cultivo tisular, después de lo cual el inoculado es reemplazado por el medio de cultivo y se continuó con la incubación. El sobrenadante es eliminado después de la incubación por el tiempo indicado, y el polipéptido 11D10 secretado es sometido a ensayo. Es utilizado como un control el sobrenadante procedente de células falsamente infectadas. El ensayo de los polipéptidos 11D10 puede ser llevado a cabo testando para determinar la unión con el MC-10 (Ab1), por ejemplo, según es descrito en los Ejemplos 1 y 5. La \beta-D-galactopiranosida producida por el rvv-lacZ es sometida a ensayo conforme a Miller (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Pines 1972) con p-nitro-\beta-D-galactopiranosida como substrato. El sobrenadante del cultivo procedente de células infectadas con virus es tratado con \beta-propionato para inactivar el virus antes del ensayo, Corcoran et al. (1988) J. Parasit. 74:763. Fue utilizada como una medida de proliferación celular la incorporación de ^{3}H-timidina por las células NFS60, Jaffee et al. (1993) Cancer Res. 53:2221-2226. La radioactividad debido a la incorporación de la ^{3}H-timidina en presencia del sobrenadante procedente de las células CV-1 falsamente infectadas es restado considerándolo de fondo. Como control positivo y para determinar la actividad estándar y biológica, es utilizado 11D10 intacto. Alternativamente, pueden ser utilizadas soluciones estándar de GM-CSF.

Testando vacunas 11D10 vaccinia

Para la administración de vaccinia, es inyectado en un ratón un título de virus de 10^{4} a 10^{7} pfu. Las inyecciones pueden ser subcutáneas, intramusculares, intradérmicas o intraperitoneales. Las inmunizaciones son realizadas semanalmente. Los ratones son sangrados 7 días después de cada inmunización para la determinación del Ab3 (incluyendo el Ab1'). Las pruebas para determinar el desarrollo de la inmunidad de células T son realizadas 10 días después de la reinmunización. Los ratones pueden ser testados también por medio de estimulación tumoral, en la cual es monitorizada la supervivencia después de la inyección con células tumorales.

Para la administración de vaccinia a través de células tumorales infectadas viralmente, las células tumorales autólogas son mantenidas en medio Eagle conteniendo suero de becerro fetal 10% (vol/vol), 2mM de glutamina y gentamicina. Una monocapa de células confluyentes en un matraz de 75 cm^{2} es inoculada con (3 x 108) unidades formadoras de placa (pfu) del rvv. Después de 2 horas a 37ºC, el inóculo es reemplazado por DMEM y se continuó con la incubación durante otras 24 horas. Después de su examen bajo microscopio, las células fueron recolectadas por medio de raspado y lavadas dos veces con PBS y resuspendidas en PBS en una concentración deseada (10^{3} a 10^{5}/200 \mu1). Ratones hembra C57BL/6, de 6 a 8 semanas de edad, son comprados de Harlan Bioproducts para Science Inc., (IN). Los animales son inyectados subcutáneamente con la vacuna celular en el flanco posterior izquierdo y, dos semanas más tarde, las células tumorales son inyectadas en el flanco posterior derecho para estimulación. La supervivencia de los ratones después del estímulo tumoral y la presencia del tumor son monitorizadas diariamente. Si el tumor es medible, los tumores son medidos semanalmente por medio de un caliper en dos dimensiones y los volúmenes son calculados utilizando la fórmula (anchura^{2} x longitud)/2. Los tumores que son palpables pero demasiado pequeños para medir el volumen de forma precisa son anotados como volumen cero, pero la incidencia tumoral es anotada como positiva. Los volúmenes tumorales son promediados únicamente para aquéllos que realmente desarrollan tumores a lo largo del período de observación de 120 días. Los valores cero son incluidos para aquellos ratones que finalmente desarrollan tumores pero que no los tenían en un momento dado.

Evaluación Estadística

La evaluación estadística es realizada utilizando el programa SigmaStat (Jandel, Inc. San Rafael, CA, USA). Un valor P de <05 se considero que indicaba que era estadísticamente significativo.

Ejemplo 7 Construcción de Vectores de Expresión Codificando Proteínas de Fusión 11D10

ADNc codificando la región variable VDJ de la cadena pesada del 11D10 fue aislado del plásmido pUC911D10V y ligado en el vector mostrado en la Figura 25. En este vector, un fragmento de ADN codificando el péptido maduro de la GM-CSF murina o IL-2 fue ligado en posición 3' con el exón CH_{3}. Esto fue conseguido generando un sitio Cla I entre el último codón y el codón de terminación del exón CH_{3}, y un sitio Not I en posición 3' del codón de terminación. El ADNc codificando la cadena ligera del 11D10 fue incorporado en el plásmido de expresión pSV184-\DeltaHneo, conforme es mostrado en la Figura 25. El plásmido pSV184-\DeltaHneo fue previamente descrito por Shin et al. ((1989) Meth. Enzymol., 178:459-476).

Después de la primera transfección, el plásmido conteniendo la cadena ligera del 11D10 fue transfectado en las células anteriores por medio de electroporación, siguiendo un método modificado de Shin et al. (1989) como sigue. Las células fueron retiradas del medio de crecimiento por medio de centrifugado, y fueron lavadas dos veces con medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, GIBCO). Las células fueron resuspendidas en IMDM frío (sin suero) en una concentración de 4,5 x 10^{6}/ml. De esta suspensión, 0,9 ml (4 x 10^{6} células) fueron añadidos a una cubeta BioRad de 0,4 cm. Alrededor de 20 \mug de ADN de pSV211D10V_{H}-citoquina fueron linearizados con una enzima de restricción no presente entre los sitios EcoRI del pSV211D10V_{H}-citoquina, tales como el Pvu II. Después de la extracción por fenol/cloroformo y precipitado por etanol, el ADN fue suspendido en <50 \mul de IMDM y añadido a la suspensión celular. Después de enfriar la mezcla de suspensión celular-ADN en hielo durante 10 minutos, fue aplicado un pulso eléctrico a 200 voltios, capacitancia de 960 \muF, por medio de un aparato Gene Pulser Transfection de Bio-Rad. Después de la incubación en hielo durante 10 minutos, las células fueron suspendidas en 96 ml de IMDM conteniendo suero de becerro fetal 10% y distribuidas en ocho placas de 96 pocillos, 125 \mul/pocillo, con pipetas multicanal, proporcionando 5 x 10^{3} células/pocillo. Después de 2 días, fueron añadidas por pocillo 125 \mul de IMDM conteniendo suero de becerro fetal 10% y 25 \mug/ml de ácido micofenólico. Cuatro días más tarde, la mitad del medio fue eliminada de cada pocillo y fueron añadidas 125 \mul de medio 1x IMDM-ácido micofenólico. Después de que los clones se hicieron visibles (alrededor de 10 a 15 días) el sobrenadante del cultivo fue retirado para someterlo a ensayo con MC-10, para la detección de transfectomas.

La Tabla 6 muestra los varios plásmidos de expresión construidos. El mIL-2 y el mGM-CSF denotan IL-2 y GM-CSF murinas, respectivamente. El V_{H} y el V_{L} contenían los péptidos señal.

TABLA 6 Vectores de expresión eucarióticos para las cadenas pesada y ligera del 11D10

Nombre	Descripción
pSV-11D10_{H}-mIL-2	11D10 V_{H}-gamma humano CH1-H-CH2-CH3-mIL-2
pSV2-11D10V_{H}-mGM-CSF	11D10 V_{H}-gamma humano CH1-H-CH2-CH3-mGM-CSF
pSV184-11D10V_{L}	11D10 V_{L}-kappa humano CH

Para la detección de transfectomas de alta producción, las células son colocadas en placas de 96 pocillos después de dilución limitada (1 célula/pocillo). Cuando los clones en los micropocillos se vuelven visibles, pero aún siguen siendo pequeños, el sobrenadante cultivado será sometido a ensayo para detectar el anticuerpo funcional por medio de radioinmunoensayo de tipo sándwich. Placas de 96 pocillos son recubiertas con MC-10 y se permite que 50 \mul de sobrenadante del cultivo de los transfectomas reaccione con el anticuerpo que las recubre. La cantidad de anticuerpo funcional producido por cada transfectoma es determinada por medio de radioinmunoensayo con MC-10 marcado con I^{125}. Para llevar a cabo una evaluación adicional de los transfectantes con alta producción de anticuerpos son sometidas a ensayo, de forma similar, varias diluciones de sobrenadantes de cultivo procedentes de colones seleccionados.

Un plásmido conteniendo la GM-CSF de cadena pesada de fusión fue transfectado a células Sp2/0 por medio de fusión protoplástica, utilizando la técnica de Oi et al. (1986) BioTecnhiques 4:214-221. Fueron seleccionados clones altamente productivos para caracterización inicial bioquímica de las proteínas de fusión.

Fueron llevados a cabo dos ELISAs como sigue. En el Ensayo 1, placas de microtítulo fueron recubiertas con cadena ligera kappa de cabra anti-humana (Orgomon Teknika Corp., West Chester, PA) en concentraciones estándar, bloqueadas con BSA y lavadas. A continuación, sobrenadantes de los cultivos de células expresoras de varios constructos de la prueba fueron incubados en los pocillos. Después de su lavado, los pocillos fueron cubiertos con IgG1 de cabra anti-humana específica de cadena pesada conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma) y desarrollados de la manera usual. Una reacción positiva indicó que el sobrenadante contenía una inmunoglobulina con las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas del tipo esperado. El Ensayo 2 fue llevado a cabo de una manera similar, pero se desarrolló utilizando GM-CSF de rata anti-ratón conjugada con biotina (Pharmingen), seguido de conjugado de avidina-peroxidasa (Sigma). Un reacción positiva indicó que el sobrenadante contenía una inmunoglobulina con una cadena ligera humana y un componente GM-CSF, el cual se esperaba en el terminal C de la cadena pesada.

La Tabla 7 muestra los resultados de ensayos de sobrenadantes de 9 clones para determinar la presencia de la cadena ligera acoplada a la cadena pesada (Ensayo 1) y para determinar la actividad de la GM-CSF (Ensayo 2). Los resultados indican que han sido obtenidas un número de proteínas de fusión, las cuales contienen determinantes para la cadena ligera, la cadena pesada y la GM-CSF en la misma molécula.

Las proteínas de fusión fueron aisladas por medio de cromatografía de afinidad utilizando columnas de Sefarosa-proteína A, y son caracterizadas como sigue, utilizando los siguientes anticuerpos y estándares: IL-2 de ratón anti-humana monoclonal (Genzyme, código, DMA-1), IL-2 humana natural estándar (BRL cat. nº 13288-014); IL-2 anti-ratón monoclonal (UBl, cat. nº 05-115); IL-2 recombinante murina estándar (Sigma, cat. nº 4517); kit de ensayo GM-CSF humana con GM-CSF humana estándar (R&D system cat. DGM00); GM-CSF de rata anti-murina (BRL, cat.
nº 13306-014); GM-CSF recombinante de ratón estándar (UBl, cat nº 01-167).

TABLA 7 ELISA para la Proteína de Fusión GM-CSF Murina-11D10

Densidad Óptica
Clon	Ensayo 1	Ensayo 2
4	0,184	0,216
22	0,314	0,397
23	0,237	0,205
41	0,159	0,195
50	0,132	0,167
51	0,181	0,314
52	0,178	0,155
55	0,224	0,298
58	0,142	0,179
control	0,041	0,099

Proteínas quiméricas purificadas (es decir, de fusión) son analizadas por medio de electrofóresis en gel de poliacrilamida SDS, bajo condiciones reductoras y no reductoras. Se encuentran incluidos en este experimento los estándares de peso molecular y el 11D10 purificado. El efecto de la proteína de fusión purificada sobre la unión del MC-10 (Ab1) con el 11D10 (Ab2 original) y con el HMFG (el antígeno nominal) es estudiado por medio de RIA de inhibición, como lo es hecho previamente para la caracterización del Ab2, para establecer la especificidad de unión del Ab1 de la proteína de fusión. La inhibición de unión del Ab1 marcado con las células SKBR3 (líneas celulares de cáncer de pecho expresoras del HMFG) por medio de la proteína de fusión proporciona ayuda adicional para la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo. La actividad biológica de la IL-2 murina es determinada por medio de ensayo de proliferación celular, utilizando suspensiones de células T, CTLL-2. Las muestras y los estándares son diluidos en serie en medio RPMI-10 completo y son colocadas alícuotas de 50 \mul en pocillos de placas de 96 pocillos. Las células CTLL-2 son crecidas para activar la fase log y lavadas con RPMI-10 completo para eliminar IL-2 residuales. Las células son suspendidas en RPMI-10 completo en una concentración de 1 x 10^{5} células/ml. Las células son divididas en 3 grupos, un grupo recibiendo IL-2 anti-ratón monoclonal, un grupo recibiendo IgG anti-humano de cadena \gamma, y otro recibiendo la solución utilizada para la dilución de estos anticuerpos. Son añadidas a cada pocillo suspensiones celulares (50 \mul, 5 x 10^{3} células). Las células son incubadas a 37ºC en un incubador de CO_{2} durante 24 horas. Es añadida ^{3}H-timidina y se continúa con la incubación durante otras 24 horas, seguido de la recolección y determinación de la radioactividad incorporada. Cuentas diferenciales en pocillos con y sin anticuerpos son consideradas como la actividad neta biológica de la muestra o estándar. El 11D10 es incluido en estos ensayos también con el fin de determinar si el anticuerpo por sí mismo puede inducir la proliferación celular de las CTLL-2. La actividad biológica de la IL-2 humana es evaluada de forma similar con células CTLL-2, en presencia y ausencia del anticuerpo específico. Para el ensayo biológico de la GM-CSF son llevados a cabo ensayos de proliferación similares. Para la GM-CSF murina y humana son utilizadas, respectivamente, células NFS-60 (Holmes et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:6687-691) y células M-07e (Genetics Institute).

Interpretación de los datos, resultados esperados, problemas potenciales y estrategia alternativa. Se espera que el SDS-PAGE bajo condiciones reductoras muestre bandas de proteína alrededor de los 25 kd tanto para el 11D10 como para las proteínas de fusión; la banda de un peso molecular más alto indicará que el transfectoma ha producido la proteína de fusión citoquina-anticuerpo fusionada a la cadena pesada. Por medio de electrofóresis, bajo condiciones no reductoras, es posible el determinar si ha sido formada la inmunoglobulina tetramérica. En ese caso, la proteína de fusión producirá una única banda, cuyo peso molecular debería ser superior en una cantidad la cual es dos veces equivalente a la de la molécula de citoquina, es decir, la proteína de fusión es dimérica con respecto a la citoquina. El ELISA y los ensayos biológicos para las citoquinas indicarán si la molécula de citoquina está siendo expresada y es biológicamente activa. Un ensayo cuantitativo con la citoquina recombinante estándar indicará si la actividad biológica de la citoquina presente como la proteína de fusión es comparable, o mejora, a la citoquina libre. La inhibición de la actividad biológica de la citoquina por medio de su anticuerpo correspondiente comparada con un anticuerpo de control indica que la acción de la citoquina es específica. La inhibición de la actividad biológica de la citoquina, por medio del IgG anti-humano de cadena \gamma, demostrará que el resto de citoquina se encuentra presente como una molécula de fusión con el Ig.

Ejemplo 8 Expresión y Caracterización de un scFv 11D10

Es preparado un constructo de ADNc codificando V_{H}-(GGGS)_{3}-V_{L} (SEC. ID. Nº 46) para el 11D10. Un ADNc para este fragmento 11D10 es incorporado dentro del vector plásmido pET-22b(+) (Novagen, Madison, W) y es expresado en E. coli. Es realizado análisis secuencial para confirmar el constructo plásmido, el cual contiene el extremo carboxi del V_{H} ligado a la región marco de V_{L} y no contiene la región líder. El pET-22b(+) contiene un dominio de unión de ión níquel, consistente en 6 residuos de histidina secuenciales (His_{6}). El dominio His_{6} posee un alta afinidad por el níquel, lo cual es utilizado para la purificación del scFv 11D10 recombinante.

Es realizado un ensayo de tipo competitivo de unión celular con el fin de investigar si el scFv 11D10 retiene el mimetismo antigénico mostrado por el 11D10 intacto. MCF-7 o SKBR3 positivas al HMFG (1 x 10^{5} células/pocillo en 50 \mul de volumen) son colocadas en una placa de 96 pocillos. Las células son incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente con MC-10 (Ab1) marcado con I^{125}, 100.000 cpm, en ausencia y en presencia de concentraciones en aumento de 11D10 o del fragmento scFv 11D10. El porcentaje de inhibición es calculado conforme a la siguiente fórmula:

% \ inhibición = \left[1-\left(\frac{R_{T}-R_{C}}{R_{MAX}-R_{C}}\right)\right]x 100%

Donde R_{T} es la radioactividad media de un pocillo experimental; R_{MAX} es la radioactividad en ausencia de cualquier proteína, y R_{C} es la radioactividad de fondo.

\newpage

Ejemplo 9 Prueba de Vacunas de Polinucleótido 11D10 Recombinante en Ratones

Las vacunas candidatas de polinucleótido 11D10 recombinante son preparadas conforme es descrito aquí. Dos grupos de 10 a 15 ratones hembra C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) son inmunizados intramuscularmente con dosis de 50-100 \mug de plásmido purificado, el cual es acoplado a la KLH utilizando glutaraldehído, conforme es descrito por Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988).

Además, son comparadas varias rutas de administración, tales como la intramuscular, intradérmica, subcutánea e intraperitoneal.

Los ratones son sangrados 7 días después de cada inmunización para determinar la producción de Ab3 (incluyendo el Ab1'), según es descrito más arriba. Tres ratones son sacrificados de cada grupo para el aislamiento de los bazos para el ensayo de proliferación de células T 10 días después de una reinmunización.

Para determinar si cualquier efecto observado es específico, en contraposición a la inmunidad humoral o celular no específica (por medio de mecanismos indirectos, tales como producción de citoquinas inducida por el polinucleótido inyectado), son utilizados los siguientes controles: (a) plásmido sin inserto de polinucleótido 11D10; (b) plásmido con inserto de polinucleótido 11D10 en la orientación opuesta (es decir, antisentido); y (c) plásmido conteniendo un polinucleótido codificando un Ab2 no emparentado.

Ejemplo 10 Análisis Adicional de Respuesta Inmune provocada por la Administración del 11D10 a Pacientes con Enfermedad asociada al HMFG en Estado Avanzado

La Fase Ib U.S. FDA para la prueba clínica de pacientes con cáncer de pecho con 11D10 anti-Id precipitado con alum (BB-IND Nº 5745), conforme es descrito en el Ejemplo 5, fue ampliada para incluir a 12 pacientes. Todos los pacientes tenían cáncer de pecho en estado avanzado, el cual había sido tratado previamente con terapia estándar y sus células tumorales daban positivo al antígeno del cáncer de pecho, HMFG, conforme es definido por el anticuerpo monoclonal MC-10 (BrE1). Los pacientes fueron escogidos al azar para recibir dosis de 1 mg, 2 mg, 4 mg u 8 mg del 11D10-Alugel (alum) por inyección. Fueron inmunizados intracutáneamente, bisemanalmente, por un mínimo de cuatro inyecciones. La terapia continuó con una pauta mensual hasta que la enfermedad del paciente progresó. Los pacientes fueron monitorizados muy de cerca para vigilar la actividad de la enfermedad y han sido todos eliminados del estudio debido al avance de la enfermedad o a fallecimiento. Los detalles de los 12 pacientes de este estudio son proporcionados en la Tabla 8.

TABLA 8 Detalles de los Pacientes con Cáncer de Pecho en la Fase 1b del Estudio Clínico

Nº Paciente	Edad	Dosis en	Nº de Rx	Respuesta Humoral	Respuesta Celular (proliferación
		mg		(Ab3)	de células T)
1	68	8	10	+	+
2	48	4	4	-	-
3	41	2	4	-	-
4	41	1	3	sin datos	sin datos
5	83	4	6	+	+
6	51	1	4	+	+
7	54	2	4	+	-
8	54	8	4	-	-
9	72	2	4	-	-
10	47	1	2	sin datos	-
11	58	8	4	-	-
12	27	4	6	+	+

Toxicidad

La toxicidad fue mínima, únicamente con reacciones a nivel local en el sitio de la inyección, con eritema leve e induración. El tratamiento con anti-Id no tuvo ningún efecto deletéreo sobre las células hematopoyéticas, función renal o hepática.

Respuestas Humorales al Anti-Idiotipo

El desarrollo de inmunidad humoral inducida por inmunización con 11D10 anti-Id precipitado con alum (preparado según es descrito en el Ejemplo 4) fue determinado al testar el suero procedente de pacientes antes de la terapia y después de cada tratamiento con la vacuna. El suero hiperinmune (después de la cuarta inmunización) procedente de cinco de cada diez pacientes mostró niveles significativos de respuestas totales anticuerpo humano anti-ratón, incluyendo respuestas anti-isoalotipo/anti-alotipo/anti-anti-idiotipo contra el 11D10 Ab2 inmunizador. A continuación, el suero procedente de estos pacientes fue chequeado para determinar su habilidad para inhibir la unión del MC-10(Ab1)-I^{125} con el 11D10 Ab2 en la placa, por medio de radioinmunoensayo, o vice versa (la inhibición de la unión del Ab2 radiomarcado con el Ab1 en la placa). Estas reacciones fueron realizadas en presencia de Ig murina normal en exceso, para bloquear anticuerpos humanos contra determinantes isotípicos y alotípicos.

Las Figuras 27A y B muestran información de los 10 pacientes, incluyendo el paciente nº 1. (La información sobre el paciente nº 1 es expuesta también en el Ejemplo 5). El suero procedente de los pacientes nº 1, 5, 6, 7 y 12 mostró una inhibición significativa, incluso en una dilución de 1:100. El suero pre-inmune procedente de los pacientes nº 1, 5, 6, 7 y 12 no mostró ninguna inhibición. En resumen, estos resultados indican que los pacientes nº 1, 5, 6, 7 y 12 habían montado cantidades significativas de anticuerpos anti-anti-idiotípicos (Ab3), mientras que los otros pacientes (nº 2, 3, 8, 9 y 10) no crearon ninguna reactividad significativa Ab3.

Seguidamente, investigamos si el 11D10 anti-Id podía inducir una respuesta de anticuerpo específica de antígeno (HMFG) anti-tumor en pacientes inmunizados. Para ello, los sueros obtenidos después de la cuarta inmunización procedente de los pacientes nº 1, 6 y 12 fueron purificados por afinidad en una columna 11D10 anti-Id, y los Ab3 purificados fueron testados contra el antígeno HMFG (proteína de fusión obtenida del Dr. Ceriani; Larocca et al. (1992)) que recubría las placas de microtítulo, por medio de un ensayo ELISA.

Los resultados son mostrados en la Figura 28. El suero Ab3 purificado procedente de los pacientes nº 1, 6 y 12 mostró unión específica al antígeno HMFG en comparación con el Ab3 purificado obtenido de un paciente con cáncer de colon tratado con el 3H1 anti-Id de control. El isotipo del anticuerpo (Ab1') en suero de pacientes inmunizados con 11D10 fue en su mayoría IgG.

Respuestas Inmunes Celulares al anti-Idiotipo

Las respuestas inmunes celulares fueron medidas por medio de proliferación de células mononucleares sanguíneas periféricas incubadas con 11D10 anti-Id precipitado con alum, y el isotipo y alotipo coincidieron con el 3H1 anti-Id de control. Fueron vistas respuestas proliferativas positivas en los pacientes nº 1, 5, 6 y 12, pero no en los otros pacientes testados. Las Figuras 29A y 29B muestran información procedente de los pacientes nº 1 y nº 5, respectivamente. Las células pre-inmunes procedentes de pacientes no mostraron respuesta proliferativa, mientras que las células hiperinmunes tuvieron una respuesta significativa al 11D10 anti-Id. Hubo también una respuesta al 3H1 anti-Id de control; esta respuesta fue menor que la de la respuesta 11D10, representando probablemente una respuesta a los componentes no idiotípicos de la molécula de inmunoglobulina murina.

Los resultados confirman el hallazgo del Ejemplo 5 y sugieren que el 11D10 anti-Id puede inducir tanto respuestas inmunes humorales como celulares en pacientes con cáncer de pecho en estado avanzado (que han sido también fuertemente tratados con diferentes terapias).

Aunque la invención precedente ha sido descrita con cierto detalle por medio de ilustraciones y ejemplos a efectos de su mayor comprensión, será obvio para aquéllos expertos en este campo que serán practicados ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y ejemplos no deben ser interpretados como limitadores del ámbito de la invención, la cual es explicada en las reivindicaciones anexas.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC. ID. Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 2:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 3:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 4:

4

5

Claims (30)

1. Un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal 11D10 producido por la línea celular hibridoma ATCC nº 12020 o progenie de la misma, o un anticuerpo anti-idiotipo poseyendo una secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena ligera idéntica a la SEC. ID. Nº 2, y una secuencia aminoacídica de la región variable de la cadena pesada idéntica a la SEC. ID. Nº 4.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo adicionalmente un marcador capaz de producir una señal detectable.

3. Una línea celular hibridoma designada ATCC nº 12020 y progenie de la misma, o un hibridoma que produce un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal de la reivindicación 1.

4. Un polipéptido poseyendo la actividad inmunológica del anticuerpo anti-idiotipo monoclonal 11D10, siendo seleccionada dicha actividad de la habilidad para unirse el Ab1 y/o el Ab3, la habilidad para inhibir la unión del 11D10 con el Ab1, o del Ab1 con el glóbulo graso en leche humana (HMFG) de una forma específica, y la habilidad para provocar una respuesta inmune HMFG; en donde el polipéptido comprende, al menos, 5 aminoácidos contiguos de una región variable de la cadena ligera del 11D10 que posee la secuencia aminoacídica de la SEC. ID. Nº 2, o de una región variable de la cadena pesada del 11D10 que posee la secuencia aminoacídica de la SEC. ID. Nº 4; y en donde dicho polipéptido comprende, al menos, una región determinante de complementariedad (CDR) seleccionada de entre RASQDIGINLH, ATSSLGS, LQYASSPYT, SYNMH, NIFPGNGDTYYNQKFKG y GNWEGALDY.

5. El polipéptido de la reivindicación 4, el cual comprende las CDRs de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 11D10, o las CDRs de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 11D10.

6. El polipéptido de las reivindicaciones 4 o 5, cuyo polipéptido contiene una región que es homóloga al glóbulo graso en leche humana.

7. Un polipéptido de fusión comprendiendo el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 6.

8. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, comprendiendo adicionalmente una citoquina o una región constante de inmunoglobulina heteróloga.

9. El polipéptido de fusión de la reivindicación 8, en donde la citoquina es la GM-CSF o la IL-2.

10. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7 comprendiendo, al menos, 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena ligera representada dentro de la SEC. ID. Nº 2 y, al menos, 10 aminoácidos contiguos de la región variable de la cadena pesada representada dentro de la SEC. ID. Nº 4, unidas opcionalmente por medio de un polipéptido ligando de alrededor de 5 a 20 aminoácidos.

11. Un anticuerpo humanizado comprendiendo el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 10.

12. Un polipéptido 11D10 polimérico comprendiendo una pluralidad del polipéptido de la reivindicación 4.

13. Un polinucleótido aislado comprendiendo una secuencia codificando el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 6.

14. El polinucleótido de la reivindicación 13, en donde la secuencia codificadora es representada dentro de la SEC. ID. Nº 1 o de la SEC. ID. Nº 3.

15. El polinucleótido de las reivindicaciones 13 o 14 comprendiendo, al menos, 100 nucleótidos contiguos, representado dentro de la SEC. ID. Nº 1, o, al menos, 80 nucleótidos contiguos, representado dentro de la SEC. ID.
Nº 3.

16. Un polinucleótido aislado comprendiendo una región de, al menos, 15 nucleótidos contiguos, siendo capaz dicha región de formar un dúplex estable con un polinucleótido consistente en la secuencia codificadora de la región variable de cadena ligera o de cadena pesada de la SEC. ID. Nº 1 o de la SE. ID. Nº 3, respectivamente, bajo condiciones donde la región no forme un híbrido estable con la SEC. ID. Nº 5 a la SEC. ID. Nº 14, o con la SEC. ID. Nº 15 a la SEC. ID. Nº 32, respectivamente.

17. Un vector de clonaje o de expresión comprendiendo un polinucleótido conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16.

18. El vector de expresión de la reivindicación 17, el cual es el vector de expresión vaccinia.

19. Una célula huésped comprendiendo el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, o la cual ha sido transformada con el vector de expresión de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18.

20. Una composición farmacéutica comprendiendo una cantidad efectiva del anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11, el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, o el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 10, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

21. Una vacuna comprendiendo una cantidad efectiva del anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11, del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, del vector de expresión de las reivindicaciones 17 o 18, o del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 10, y un excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante.

22. La vacuna de la reivindicación 21, la cual es un virus vivo o un vector de expresión viral.

23. La utilización del anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11, o de la vacuna de las reivindicaciones 21 o 22, para la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune en un individuo con enfermedad asociada al glóbulo graso en leche humana, en estado avanzado.

24. La utilización de la reivindicación 23, en donde la enfermedad asociada al glóbulo graso en leche humana es el cáncer de pecho.

25. Un método para detectar la presencia de un anticuerpo anti-glóbulo graso en leche humana (HMFG) unido a una célula tumoral, comprendiendo las fases de puesta en contacto de la célula tumoral con el anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11 durante un tiempo suficiente como para permitir la unión con el anticuerpo anti-HMFG, y la detección de la presencia de cualquier 11D10 que se encuentre unido al anticuerpo anti-HMFG.

26. Un método in vitro para detectar una respuesta inmunológica anti- glóbulo graso en leche humana en un individuo, comprendiendo las fases de (a) puesta en contacto de una muestra biológica obtenida del individuo con el anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo estable entre el anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11 y un anticuerpo que se una con el 11D10; y (b) la detección de cualquiera de los complejos estables que se formen.

27. Un método in vitro para detectar en una muestra un anticuerpo que se una con el anticuerpo monoclonal 11D10, comprendiendo las fases de: (a) puesta en contacto del anticuerpo procedente de una muestra obtenida del individuo con el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 10, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo antígeno-anticuerpo estable; y (b) la detección del complejo estable formado en la fase (a), si es que existe.

28. La utilización del anticuerpo de las reivindicaciones 1 u 11 para la fabricación de un medicamento para paliar una enfermedad asociada al glóbulo graso en leche humana en un individuo que tiene una enfermedad asociada al glóbulo graso en leche humana en estado avanzado.

29. Un kit para la detección o cuantificación de un anticuerpo anti-glóbulo graso en leche humana, comprendiendo el anticuerpo de las reivindicaciones 1, 2 u 11, o el polipéptido 11D10 de cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 10, en un embalaje adecuado.

30. Un kit para la detección o cuantificación de un polinucleótido, comprendiendo un polinucleótido codificando una región variable del anticuerpo monoclonal 11D10 o una parte del mismo, comprendiendo dicho kit el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, en un embalaje adecuado.