CN106132436B - 通过诱导对trop-2表达细胞的免疫应答的疾病疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双特异性抗体的组合物和使用方法，所述双特异性抗体包含针对Trop‑2(EGP‑1)的至少一个结合位点和针对CD3的至少一个结合位点。所述双特异性抗体可用于诱导针对Trop‑2表达的肿瘤的免疫应答，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌或前列腺癌。所述方法可包括单独施用所述双特异性抗体或与一种或多种治疗剂诸如抗体‑药物缀合物、干扰素(优选地干扰素‑α)和/或检查点抑制剂抗体一起施用。所述双特异性抗体能够靶向效应子T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞以诱导Trop‑2⁺癌细胞的白细胞介导的细胞毒性。所述细胞毒性免疫应答通过共同施用干扰素、检查点抑制剂抗体和/或ADC而增强。

Description

通过诱导对TROP-2表达细胞的免疫应答的疾病疗法

相关申请的交叉引用

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2014年2月21日提交的临时美国专利申请号61/942,752和2014年9月12日提交的临时美国专利申请号62/049,826的权益。每个优先权申请都以引用的方式整体并入本文。

序列表

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领域

本发明涉及能够针对Trop-2表达细胞诸如Trop-2⁺癌细胞诱导免疫应答的靶向Trop-2和CD3的双特异性抗体的组合物及其使用方法。优选地，将双特异性抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，所述其他治疗剂诸如抗体-药物缀合物、干扰素诸如诸如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ或检查点抑制剂抗体。更优选地，双特异性抗体是与干扰素-α组合施用的抗-Trop-2x抗-CD3抗体。最优选地，抗-Trop-2抗体是hRS7抗体。组合物和方法是用于治疗Trop-2⁺肿瘤，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、乳房癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和前列腺癌，更优选地胰腺癌或胃癌。在优选实施方案中，双特异性抗体制备为DOCK-AND-LOCK^TM复合物，其中使用来自人蛋白激酶A(PKA)调控亚单位的二聚化和对接结构域(DDD)部分与来自AKAP(A-激酶锚定蛋白质)的锚定结构域(AD)部分之间的结合相互作用来将组分连接在一起。然而，制造双特异性抗体复合物的其他方法是已知的并且可使用。双特异性抗体将效应子T细胞、单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞重定向至患病靶细胞或组织并且诱导针对靶的免疫应答。

背景

使用双特异性抗体(bsAb)重定向效应子T细胞以便靶向杀死肿瘤细胞已经显示出了可观的临床前和临床前景(参见，例如，Topp等人，2012,Blood 120:5185-87；Bargou等人，2008,Science 321:974-77)。迄今为止所开发的双特异性抗体含有对用于T-细胞募集和活化的CD3具有特异性的第一结合位点和所靶向的疾病相关联抗原如CD19的第二结合位点(Bassan,2012,Blood 120:5094-95)。双特异性抗体使CD3⁺T细胞与所靶向的疾病细胞直接接触并且诱导细胞介导的细胞毒性(Bassan,2012)。已经报告抗-CD3X抗-CD 19双特异性抗体可在患有MRD⁺ALL的大约70％成年患者中以极低浓度来产生完全并且持久的分子缓解(Topp等人，2012,Blood 120:5185-87)。识别T细胞上的神经胶质瘤和CD3表位的双特异性抗体已经成功用于治疗人患者的大脑肿瘤(Nitta等人Lancet 1990；355:368-371)。

白细胞重定向bsAb不限于T细胞。包含针对NK细胞抗原CD16和肿瘤相关的抗原(例如，CD19、CD22、CD33)的scFv的双特异性杀灭衔接子(BiKE)也显示出有效的抗癌活性(例如，Miller,Hematology Soc Hematol Educ Pogram 2013:247-53)。其他替代方案包括三特异性杀灭衔接子(TriKE)，诸如抗-CD16x抗-CD19x抗-CD22(Miller,2013；Gleason等人，2012,Mol Cancer Ther 11:2674-84)。使用抗-CD16x抗-CD33BiKE治疗AML和骨髓增生异常综合征(Miller，2013；Wiernik等人，2013,Clin Cancer Res 19:3844-55)。在难治性AML中，CD16x CD33BiKE通过NK细胞使得肿瘤细胞被有效杀死并且细胞因子产生。抑制ADAM17增强CD16x CD33BiKE反应(Miller，2013)。已报道了例如抗CD16/CD19/HLA-DR的其他三特异性三价构建体(Schubert等人，2012,mAbs 4:45-56)。

产生双特异性抗体的许多方法是已知的(参见，例如美国专利号7,405,320)。双特异性抗体可通过四价体瘤方法产生，所述方法包括使两种不同杂交瘤融合，每种杂交瘤产生识别不同的抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello,Nature 1983；305:537-540)。融合的杂交瘤能够合成两个不同重链和两个不同轻链，其可随机缔合以得到具有10个不同抗体结构的异源群体，其中只有一种(占总抗体分子的1/8)具有双特异性，并且因此必须进一步从其他形式中纯化。融合杂交瘤的细胞基因稳定性通常弱于亲本杂交瘤，使得生产细胞系的产生更成问题。

产生双特异性抗体的另一种方法使用异双官能交联剂来化学系拴两个不同单克隆抗体，以使得所得混合缀合物结合至两个不同靶标(Staerz等人Nature 1985；314:628-631；Perez等人Nature 1985；316:354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上是两个IgG分子的异源偶联物，其缓慢扩散至组织中并且从循环中快速移除。双特异性抗体也可通过将两个亲本单克隆抗体中的每一个还原成相应的半分子，然后混合并允许再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1453-1457)。替代方案包括使用适当连接子使两种或三种经过单独纯化的Fab'片段化学交联。所有这些化学方法由于较高制造成本、繁重的生产过程、大量的纯化步骤、产量低(<20％)和不均匀的产物而对于商业开发是不合需要的。

通过重组DNA技术产生的抗体的离散V_H和V_L域可彼此配对以形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利号4,642,334)。然而，这类非共价缔合分子在生理条件下稳定不足以具有任何实际用途。可将同源V_H和V_L结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽连接子连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。通过改变连接子长度来制造基于scFv的多价多特异性的药剂的方法公开于美国专利号5,844,094、美国专利号5,837,242和WO98/44001。常常与产生基于scFv的多价多特异性的药剂相关联的常见问题是较低表达水平、不均匀产物、在溶液中不稳定从而产生聚集体、在血清中的不稳定和削弱的亲和力。

靶向CD3和CD19的若干双特异性抗体正在临床开发中。被称为

的基于scFv的双特异性抗体构建体(双特异性T-细胞衔接子)使用含有2个抗原结合特异性的单个多肽，每个抗原结合特异性由经由挠性连接子以串联方式连接的同源VH和VL贡献(参见，例如，Nagorsen等人，2009,Leukemia&Lymphoma 50:886-91；Amann等人，2009,J Immunother32:453-64；Baeuerle和Reinhardt,2009,Cancer Res69:4941-44)。被称为

的另一种双特异性抗体(双亲和力再靶向)利用二硫化物稳定的双功能抗体设计(参见，例如，Moore等人，2011,Blood 117:4542-51；Veri等人，2010,Arthritis Rheum 62:1933-43)。

和

由于其尺寸较小(约55kDa)而展现快速血液清除率，从而需要频繁施用以保持双特异性抗体的治疗水平。

干扰素在抗肿瘤和抗微生物宿主防御中起重要作用，并且作为癌症和传染病的治疗剂已经得到广泛研究(Billiau等人，2006,Cytokine Growth Factor Rev 17:381-409；Pestka等人，2004,Immunol Rev202:8-32)。尽管用I和II型干扰素(IFN-α/β和γ)进行了大量研究，其在临床环境中的使用由于在患者体内的短循环半衰期、全身毒性和次优响应而受到限制(Pestka等人，2004,Immunol Rev 202:8-32；Miller等人，2009,Ann N Y AcadSci 1182:69-79)。在2003年初IFN-λ家族的发现带来了开发这些未满足的临床适应症的替代IFN剂的令人兴奋的新机会(Kotenko等人，2003,Nat Immunol 4:69-77；Sheppard等人，2003,Nat Immunol 4:63-8)。

迄今为止已经通过批准IFN-α2用于治疗毛细胞白血病、慢性髓性白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AIDs相关卡波西肉瘤和慢性乙型和丙型肝炎；IFN-β用于治疗多发性硬化；和IFN-γ用于治疗慢性肉芽肿疾病和恶性骨硬化而验证了IFN的疗效。尽管存在关于这一组自分泌和旁分泌细胞因子的大量文献，但仍阐述其在健康和疾病中的功能，包括临床引入的更有效和更新颖的形式(Pestka,2007,J.Biol.Chem 282:20047-51；Vilcek,2006,Immunity25:343-48)。基于各种干扰素与抗体的组合的效应的疗法还在研究之中。

抗体-药物缀合物(ADC)是一类有效的治疗构建体，其允许将细胞毒性剂靶向递送到靶细胞诸如癌细胞。由于靶向功能，相比于相同的全身递送的药剂，这些化合物显示出显著更高的治疗指数。已经开发出完整的抗体或抗体片段(诸如scFv)的ADC。抗体或片段经由连接子连接至药物的一个或多个拷贝上，该连接子在生理条件下是稳定的，但是一旦在靶细胞内可能裂解。批准用于治疗用途的ADC包括用于AML的吉姆单抗奥佐米星(后来从市场退出)、用于ALCL和霍奇金淋巴瘤的贝伦妥单抗维多汀以及用于HER2阳性转移性乳腺癌的曲妥单抗安坦辛(trastuzumab emtansine)(Verma等人，2012,N Engl J Med 367:1783-91；Bross等人，2001,Clin Cancer Res 7:1490-96；Francisco等人，2003,Blood 102:1458-65)。目前许多其他候选ADC正在进行临床试验中，诸如伊珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)(Pfizer)、格巴妥莫单抗维多汀(glembatumomab vedotin)(Celldex Therapeutics)、SAR3419(Sanofi-Aventis)、SAR56658(Sanofi-Aventis)、AMG-172(Amgen)、AMG-595(Amgen)、BAY-94-9343(Bayer)、BIIB015(Biogen Idee)、BT062(Biotest)、SGN-75(Seattle Genetics)、SGN-CD19A(Seattle Genetics)、伏司妥珠单抗马佛多汀(vorsetuzumab mafodotin)(Seattle Genetics)、ABT-414(AbbVie)、ASG-5ME(Agensys)、ASG-22ME(Agensys)、ASG-16M8F(Agensys)、IMGN-529(ImmunoGen)、IMGN-853(ImmunoGen)、MDX-1203(Medarex)、MLN-0264(Millenium)、RG-7450(Roche/Genentech)、RG-7458(Roche/Genentech)、RG-7593(Roche/Genentech)、RG-7596(Roche/Genentech)、RG-7598(Roche/Genentech)、RG-7599(Roche/Genentech)、RG-7600(Roche/Genentech)、RG-7636(Roche/Genentech)、抗-PSMA ADC(Progenics)、洛妥珠单抗默坦辛(lorvotuzumabmertansine)(ImmunoGen)、米拉珠单抗-阿霉素(Immunomedics)、IMMU-130(Immunomedics)、IMMU-132(Immunomedics)以及pro-2-吡咯啉并阿霉素的抗体缀合物。(参见，例如，Li等人,2013,Drug Disc Ther 7:178-84；Firer&Gellerman,J Hematol Oncol5:70；Beck等人，2010,Discov Med 10:329-39；Mullard,2013,Nature Rev DrugDiscovery 12:329，临时美国专利申请61/761,845.)。由于ADC用作具有减小的全身性毒性的有效的抗癌剂的潜力，它们可单独或作为辅助疗法使用来减少肿瘤负荷。

免疫疗法的另一个有前景的方法涉及使用针对免疫检查点蛋白质的拮抗性抗体(例如，Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer12:252-64)。免疫检查点作为用于免疫系统功能的内源性抑制途径起作用，该内源性抑制途径用以保持自体耐受性并且调节对抗原刺激的免疫应答的持续时间和程度(Pardoll,2012)。然而，看起来肿瘤组织和可能某些病原体可指派(co-opt)检查点系统以降低宿主免疫应答的有效性，从而导致肿瘤生长和/或慢性感染(参见，例如，Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-64；Nirschl&Drake,2013,Clin CancerRes 19:4917-24)。检查点分子包括CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)、PD1(程序性细胞死亡蛋白1)、PD-L1(程序性细胞死亡配体1)、LAG-3(淋巴细胞活化基因-3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3)以及若干其他物质(Pardoll,2012,NatureReviews Cancer 12:252-64；Nirschl&Drake,2013,Clin Cancer Res 19:4917-24)。针对若干检查点蛋白质(CTLA4、PD1、PD-L1)的抗体正进行临床试验并且针对耐受标准治疗的肿瘤已显示意料不到的功效。

需要可产生具有更长T_1/2、较好药代动力学性质、增加的体内稳定性和/或改善的体内功效的改进的双特异性抗体复合物的方法和组合物。存在对组合疗法的进一步的需要以改善涉及针对各种疾病诸如Trop-2⁺癌诱导免疫应答的治疗的功效。

发明概要

本发明涉及使用双特异性抗体治疗有关Trop-2+细胞诸如Trop-2⁺癌细胞的疾病。Trop-2在多种类型实体肿瘤中过表达，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠和直肠癌、膀胱癌、乳房癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌和前列腺癌。优选地，使用双特异性抗体治疗胃癌或胰腺癌。施用双特异性抗体诱导为Trop-2⁺的细胞的免疫应答。虽然Trop-2也在一些正常组织中过表达(例如，Stepan等人，2011,J Histochem Cytochem 59:701-10)，但以下实例展示可在动物模型系统和人受试对象两者中，以仅可耐受的毒性体内施用抗-Trop-2抗体。在其他优选实施方案中，将双特异性抗体施用到受试对象诱导针对Trop-2⁺癌细胞的免疫应答，而将细胞因子产生增加至能够诱导细胞因子释放综合征(CRS)的水平。在另选的优选实施方案中，双特异性抗体诱导Trop-2⁺癌细胞与T细胞之间细胞表面抗原的胞啃(trogocytosis)。

在优选实施方案中，双特异性抗体含有用于Trop-2和用于CD3的结合位点。然而，除CD3之外，可靶向其他T细胞或白细胞抗原。示例性T-细胞抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69以及CD90。在NK细胞上表达的示例性抗原选自由以下组成的组：CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM17、KIR以及CD137。示例性单核细胞抗原选自由以下组成的组：CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64以及CD89。示例性嗜中性粒细胞抗原选自由以下组成的组：CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b以及SLC44A2。优选地，T-细胞抗原是CD3或NK细胞抗原是CD16。

在另选的实施方案中，可靶向除Trop-2之外的其他肿瘤相关的抗原。可被靶向的肿瘤相关的抗原包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体特异的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD 18、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD 138、CD 147、CD 154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸盐受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚单位、HER2/neu、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-γ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、胰腺癌粘蛋白、PD1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希(Thomson-Friedenreich)抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、致癌基因标记物以及致癌基因产物致癌基因(参见，例如，Sensi等人,Clin Cancer Res 2006,12:5023-32；Parmiani等人,J Immunol 2007,178:1975-79；Novellino等人.Cancer Immunol Immunother 2005,54:187-207)。

可用的示例性抗-TAA抗体包括但不限于hA19(抗-CD19，美国专利号7,109,304)、hRl(抗-IGF-1R，美国专利申请序列号12/722,645，提交于10/3/12)、hPAM4(抗-MUC5ac，美国专利号7,282,567)、hA20(抗-CD20，美国专利号7,251,164)、hIMMU31(抗-AFP，美国专利号7,300,655)、hLL1(抗-CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗-CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗-CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗-HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14(抗-CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗-CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗-EGP-1，美国专利号7,238,785)、hMN-3(抗-CEACAM6，美国专利号7,541,440)、Ab124和Ab125(抗-CXCR4，美国专利号7,138,496)，每个引用的专利或申请的实施例段落以引用的方式并入本文。

可用于治疗各种疾病状态的替代的抗体包括但不限于，阿昔单抗(抗-糖蛋白IIb/IIIa)、阿伦单抗(抗-CD52)、贝伐单抗(抗-VEGF)、西妥昔单抗(抗-EGFR)、吉姆单抗(抗-CD33)、替伊莫单抗(抗-CD20)、帕尼单抗(抗-EGFR)、利妥昔单抗(抗-CD20)、托西莫单抗(抗-CD20)、曲妥单抗(抗-ErbB2)、兰利珠单抗(lambrolizumab)(抗-PD 1受体)、尼鲁单抗(抗-PD1受体)、伊匹单抗(抗-CTLA4)、阿巴伏单抗(抗-CA-125)、阿德目单抗(抗-EpCAM)、阿利珠单抗(抗-IL-6受体)、贝那利珠单抗(抗-CD 125)、奥妥珠单抗(GA101、抗-CD20)、CC49(抗-TAG-72)、AB-PG1-XG1-026(抗-PSMA，美国专利申请11/983,372，作为ATCC PTA-4405和PTA-4406寄存)、D2/B(抗-PSMA、WO2009/130575)、托珠单抗(抗-IL-6受体)、巴利昔单抗(抗-CD25)、达克珠单抗(抗-CD25)、依法利珠单抗(抗-CD 11a)、GA101(抗-CD20；GlycartRoche)、那他珠单抗(抗-α4整合素)、奥玛珠单抗(抗-IgE)；抗-TNF-α抗体诸如CDP571(Ofei等人，2011，Diabetes 45:881-85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303(Thermo Scientific,Rockford,IL)、英夫利昔单抗(Centocor,Malvern,PA)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(UCB,Brussels,Belgium)、抗-CD40L(UCB,Brussels,Belgium)、阿达木单抗(Abbott,Abbott Park,IL)、

(Human Genome Sciences)；抗-CD38抗体诸如MOR03087(MorphoSys AG)、MOR202(Celgene)、HuMax-CD38(Genmab)或达拉木单抗(Johnson&Johnson)。

优选地，双特异性抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，诸如抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、化疗剂、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料以及放射性同位素。更优选地，另外的治疗剂是抗体-药物缀合物，干扰素诸如诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ或拮抗性检查点抑制剂抗体。最优选地，治疗剂是干扰素-α。

在以下实施例中公开的用于白细胞重定向的bsAb的示例性设计将抗-CD3scFv与抗-CD19F(ab)₂组合以形成特异性靶向B细胞的称为(19)-3s的构建体。在下文更详细地论述的将抗-CD3与针对其他肿瘤相关联抗原的抗体片段组合的其他bsAb用于各种实体肿瘤的靶向白细胞免疫疗法中。此设计的优势包括二价结合至肿瘤细胞、杜绝快速肾清除率的较大尺寸(约130kDa)和有效白细胞介导的细胞毒性。bsAb介导白细胞与同源靶细胞之间的免疫突触的形成、诱导在靶细胞存在下的白细胞活化和增殖、重定向体外靶细胞的有效白细胞介导杀灭并且抑制体内人肿瘤的生长。

优选实施方案涉及产生为三价DNL^TM复合物的白细胞重定向的双特异性抗体，其具有更长T_1/2、更好药代动力学性质和增加的体内稳定性。产生并使用DNL^TM复合物的方法是熟知的，该复合物包括结合至来自AKAP的AD部分的来自人PKA调控亚单位RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的DDD部分的二聚体(参见，例如，美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787；7,666,400；7,906,118；7,901,680；8,003,111和8,034,352，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。)通过将不同效应子部分如抗体或抗体片段连接至DDD和AD部分，可构建并使用实际上包括效应子的任何组合的DNL^TM复合物。

有用的抗体可为各种同种型，优选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选地包括人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可为嵌合人-小鼠、人源化(人框架和鼠高变(CDR)区域)或完全人，以及其变化，如半IgG4抗体(被称为“单抗体”)，如由van der NeutKolfschoten等人(Science 2007；317:1554-1557)所述。更优选地，抗体或其片段可设计或选择以包括属于特定同种异型的人恒定区序列，从而可在施用至人受试者时导致减小的免疫原性。施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，诸如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型。

其他优选实施方案涉及白细胞重定向复合物与一种或多种检查点抑制剂抗体组合的组合物和/或使用。这种抗体对于检查点抑制剂功能具有拮抗性。许多这种抗体在本领域中是已知的，诸如兰利珠单抗(MK-3475,Merck)、尼鲁单抗(BMS-936558,Bristol-MyersSquibb)、皮地珠单抗(pidilizumab)(CT-011，CureTech公司)、AMP-224(Merck)、MDX-1105(Medarex)、MEDI4736(Medlmmune)、MPDL3280A(Genentech)、BMS-936559(Bristol-MyersSquibb)、伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)以及曲美目单抗(tremelimumab)(Pfizer)。抗-KIR抗体诸如利利单抗(lirlumab)(Innate Pharma)和IPH2101(Innate Pharma)可在NK细胞中执行类似的功能。任何已知的检查点抑制剂抗体均可与一种或多种其他药剂组合使用。已报道具有免疫刺激抗体的组合疗法增强例如针对肿瘤细胞的功效。Morales-Kastresana等人.(2013,Clin Cancer Res 19:6151-62)显示抗-PD-L1(10B5)抗体与与抗-CD137(1D8)和抗-OX40(OX86)抗体的组合在肝细胞癌转基因小鼠模型中提供增强的效力。还报告了抗-CTLA4和抗-PD1抗体的组合是高度有效的(Wolchok等人，2013,N Engl J Med369:122-33)。利妥昔单抗与诸如利利单抗(Innate Pharma)或IPH2101(Innate Pharma)等抗-KIR抗体的组合对造血肿瘤也更有效(Kohrt等，2012)。普通技术人员应认识到目标组合疗法可以包括与作为免疫刺激性抗肿瘤或抗感染剂的多种抗体的组合。

可以组合使用的另一种药剂是干扰素。可用的干扰素在本领域中是已知的并且可包括干扰素-α,干扰素-β、干扰素-λ1、干扰素-λ2或干扰素-λ3。优选地，干扰素是干扰素-α。目标干扰素可作为游离干扰素、PEG化干扰素、干扰素融合蛋白质或缀合至抗体的干扰素来施用。

在另选的实施方案中，以上所论述的一种或多种免疫调节剂可以与抗体-药物缀合物(ADC)组合使用。ADC对于在无显著系统毒性的情况下减少肿瘤负担特别有效，并且可以用于提高由白细胞重新靶向bsAb、干扰素和/或检查点抑制剂抗体所诱导的免疫应答的有效性。有用的示例性ADC可以包括批准用于治疗性用途的ADC，包括用于AML的吉妥珠单抗(后来从市场退出)、用于ALCL和霍奇金淋巴瘤的贝伦妥单抗维多汀以及用于HER2阳性转移性乳腺癌的曲妥单抗安坦辛(Verma等人，2012,N Engl J Med 367:1783-91；Bross等人，2001,Clin Cancer Res 7:1490-96；Francisco等人,2003,Blood102:1458-65)。目前多个其他候选ADC正在进行临床测试，诸如伊珠单抗奥佐米星(Pfizer)、格巴妥莫单抗维多汀(Celldex Therapeutics)、SAR3419(Sanofi-Aventis)、SAR56658(Sanofi-Aventis)、AMG-172(Amgen)、AMG-595(Amgen)、BAY-94-9343(Bayer)、BIIB015(Biogen Idec)、BT062(Biotest)、SGN-75(Seattle Genetics)、SGN-CD19A(Seattle Genetics)、伏司妥珠单抗马佛多汀(vorsetuzumab mafodotin)(Seattle Genetics)、ABT-414(AbbVie)、ASG-5ME(Agensys)、ASG-22ME(Agensys)、ASG-16M8F(Agensys)、IMGN-529(ImmunoGen)、IMGN-853(ImmunoGen)、MDX-1203(Medarex)、MLN-0264(Millenium)、RG-7450(Roche/Genentech)、RG-7458(Roche/Genentech)、RG-7593(Roche/Genentech)、RG-7596(Roche/Genentech)、RG-7598(Roche/Genentech)、RG-7599(Roche/Genentech)、RG-7600(Roche/Genentech)、RG-7636(Roche/Genentech)、抗-PSMA ADC(Progenics)、洛妥珠单抗默坦辛(ImmunoGen)、米拉珠单抗-阿霉素(Immunomedics)、IMMU-130(Immunomedics)以及IMMU-132(Immunomedics)。(参见，例如，Li等人，2013,Drug Disc Ther 7:178-84；Firer&Gellerman,J Hematol Oncol 5:70；Beck等人，2010,Discov Med 10:329-39；Mullard,2013,Nature Rev Drug Discovery 12:329)。优选地，在ADC与免疫调节剂组合使用的情况下，ADC是在免疫调节剂之前施用。

目标药剂可与一种或多种其他免疫调节剂组合施用以增强免疫响应。免疫调节剂可包括但不限于细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子-α(TNF)、TNF-β、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、称为“S1因子”的干细胞生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳激素、胎盘催乳素、OB蛋白质、苗勒氏管氏管抑制物质、小鼠促性腺素相关联肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管稳定蛋白、血小板反应蛋白、内皮抑素，或淋巴细胞毒素。在某些实施方案中，白细胞重定向的双特异性抗体或抗体片段可连接至免疫调节剂，如细胞因子。细胞因子复合物公开于例如美国专利号7,906,118和8,034,3522中，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。

附图简述

以下附图形成本说明书的一部分并包括在内以进一步展现本发明的某些实施方案。实施方案可通过参考这些附图中的一个或多个以及在本文中呈现的具体实施方案的详细说明来更好理解。

图1.包含抗-CD19F(ab)₂x抗-CD3scFv的DOCK-AND-LOCK^TM复合物的形成的示意图。

图2A.由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。新鲜分离的T细胞以2.5:1的E:T比率与Daudi细胞组合。细胞在室温下用0μg/mL、1μg/mL或5μg/mL的(19)-3s处理30分钟，然后通过流式细胞术分析。抗-CD20-FITC和抗-CD7-APC分别用于识别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20⁺/CD7⁺事件的％。用(19)-3s处理之后，45.5％流动事件是CD20/CD7双重阳性的，指示Daudi与T细胞联会。

图2B.条件如图2(A)中，但不存在(19)-3s抗体。与图2(A)相比，在无抗体的情况下，仅2％的流动事件是无抗体的CD20/CD7双阳性的。

图2C.加入(19)-3s导致>90％的Daudi与T细胞缔合。

图3A.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1:1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s处理30分钟并且用抗-CD20-FITC染色，然后通过荧光显微术分析。

图3B.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1:1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s处理30分钟并且用抗-CD20-FITC和抗-CD3-PE染色，然后通过荧光显微术分析。

图3C.图3A和3B的合并图像揭示绿色染色Daudi与红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。

图3D.在不存在(19)-3s的情况下，突触形成不明显。

图4.对(19)-3s介导的Daudi和Jurkat细胞的细胞与细胞缔合随(19)-3s浓度增加而变化的剂量反应分析。

图5A.由

和DART^TM介导的细胞与细胞缔合的比较。

和DART^TM的数据从Moore等人(2011,Blood 117:4542-4551获得。

图5B.由(19)-3s介导的细胞与细胞缔合的比较。

图6A.由(19)-3s对照bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。

图6B.由(M1)-3s MUC5AC bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。

图6C.由(E1)-3s TROP-2靶向bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。

图7A.由(19)-3s活化的T-细胞。CD69表达的上调是T-细胞活化中的较早事件。与PBMC组合的Daudi细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。Daudi细胞与相等数目PBMC的组合产生1.6％CD69+T细胞。添加3ng/mL(19)-3s诱导27％CD69+T细胞。包含与非靶向F(ab)₂融合的Okt3-scFv-AD2模块的对照构建体[(M1)-3s]和hA19-Fab-DDD2模块都不诱导T-细胞活化。

图7B.由(19)-3s活化的T-细胞。与纯化T细胞组合的Daudi细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。与未经处理的细胞混合物相比，用(M1)-3s或hA19-Fab-DDD2处理Daudi和纯化的T细胞未增加CD69+T细胞的数目(<4％)。交替地，(19)-3s诱导稳健的T-细胞活化，产生80％CD69+细胞。

图7C.由(19)-3s活化的T-细胞。将仅纯化的T细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。在不添加Daudi(靶)细胞的情况下，(19)-3s未诱导CD69表达和T-细胞活化。这些结果证明(19)-3s-介导的T细胞与靶细胞之间的突触形成对于T-细胞活化是需要和足够的。

图8A.通过(19)-3s诱导T-细胞增殖。与IL-2/PHA阳性对照和(14)-3s(非靶结合对照)相比，PBMC与3nM或30pM(19)-3s一起孵育。

图8B.通过(19)-3s诱导T-细胞增殖。在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖，指示靶细胞(B细胞)为T-细胞活化和增殖所需要。

图9A.(19)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。对于(19)-3sDNL^TMbsAb复合物来确定Nalm-6、Raji、Ramos和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图9B.(19)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。对于(14)-3s(非靶向)DNL^TMbsAb复合物来确定Nalm-6、Raji、Ramos和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图9C.使用从两个不同供体和Nalm-6癌细胞获得的PBMC或T细胞观察到一致结果。

图10A.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb诱导的Namalwa细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图10B.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb诱导的Jeko细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图10C.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb诱导的Daudi细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11A.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(14)-3s bsAb的LS174T结肠腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11B.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(E1)-3s bsAb的Capan-1胰腺腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11C.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(E1)-3s和(15)-3s bsAb的NCI-N87胃癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图12.癌细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性数据的概述。

图13A.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。以未经处理的细胞作为对照。

图13B.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用130μg单次剂量处理细胞。

图13C.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量43μg将细胞处理3次。

图13D.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量26μg将细胞处理5次。

图14A.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。NOD/SCID小鼠异种移植物如图13的图例中指示来制备。如箭头所指示来施用(19)-3s。图14A显示未经处理的对照。

图14B.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量130μg(19)-3s静脉内施用将细胞处理2次。

图14C.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量130μg(19)-3s皮下施用将细胞处理2次。

图14D.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量65μg(19)-3s静脉内施用将细胞处理4次。

图14E.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量43μg的(19)-3s，静脉内施用将细胞处理6次。

图14F.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量43μg的对照(M1)-3s，静脉内施用将细胞处理6次。

图15A.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌来制备。只向小鼠施用T细胞而没有bsAb。

图15B.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌来制备。如指示，小鼠用(E1)-3s bsAb治疗。

图15C.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。只向小鼠施用PBMC而没有bsAb。

图15D.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。如指示，小鼠用(14)-3s bsAb治疗。

图16A.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下，小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗。干扰素-α以TROP-2靶向DNL^TM复合物形式添加。

图16B.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3s DNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下，小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗。干扰素-α以可购得

(聚乙二醇干扰素α-2a)形式来添加。

图17.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未被治疗或用单独干扰素-α治疗。

图18.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制，与TF12对照进行比较。在添加或不添加干扰素-α(以

形式加入)的情况下，NOD/SCID小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗，与未经处理的对照、TF12对照或单独

相比较。

图19.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的NOD/SCID小鼠的存活曲线

对照未经处理或经单独

或单独TF12处理。

图20.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3s DNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制，与TF12对照进行比较。在添加或不添加干扰素-α(以

形式加入)的情况下，NOD/SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌异种移植物用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗，与未经处理的对照、TF12对照或单独

相比较。

图21.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s处理的具有NCI-N87胃癌异种移植物的NOD/SCID小鼠的存活曲线

对照未经处理或经单独

或单独TF12处理。

图22.初期E1-3多肽的示意图。LP，在成熟蛋白质中被除去的前导肽；VH，重链可变区，VK,κ轻链可变区，L1，连接子肽1；L2，连接子肽2；L3，连接子肽3；6H，六组氨酸。

图23A.BxPC3人胰腺癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图23B.Capan-1人胰腺癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图23C.NCI-N87人胃癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图24.NOD-SCID小鼠中NCI-N87胃癌的体内T细胞重定向疗法

图25.(E1)-3s介导的免疫突触形成和双定向胞啃。使纯化的T细胞与BxPC3细胞以5:1比率混合并且与0.1nmol/L的指示bsAb温育60分钟，然后用抗-Trop-2MAb C518和GAM-Fc-FITC染色。使用由前向散射对侧向散射首先选通的未缀合的T细胞和BxPC3细胞，通过流式细胞术分析细胞。通过检测T细胞上的Trop-2，具体地与(E1)-3s的细胞混合物中，显示为Trop-2-阳性未缀合的T细胞的百分比，来自BxPC3细胞的Trop-2对T细胞的胞啃很明显。

图26.(E1)-3s介导的免疫突触形成和双定向胞啃。使纯化的T细胞与BxPC3细胞以5:1比率混合并且与0.1nmol/L的指示bsAb温育60分钟，然后用抗-Trop-2MAb C518和GAM-Fc-FITC染色。使用由前向散射对侧向散射首先选通的未缀合的T细胞和BxPC3细胞，通过流式细胞术分析细胞。胞啃导致了BxPC3细胞上Trop-2的减少，示为几何MFI。

图27A.细胞因子诱导。使(A)PBMC(6x 10⁶细胞/孔)与Raji(5x 10⁵细胞/孔)混合并且使用0.1nM 19-3BiTE(网纹)、(19)-3s(黑色)处理20小时或在无bsAb的情况下温育(白色，未针对D-5测试)。使用商业ELISA试剂盒确定上清液流体中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6以及IL-10的浓度。D-1到D-8是独立的血液供体，其中仅D-5同时用于A和B两者中。

图27B.在24孔板中将NCI-N87细胞(5x 10⁵细胞/0.5mL/孔)培育过夜以允许细胞连接。将PBMC添加到含有连接的NCI-N87细胞的孔中(比率10:1)并且使用0.1nM的(E1)-3s(黑色)、聚乙二醇干扰素α-2a(白色)、(E1)-3s加聚乙二醇干扰素α-2a(网纹)处理20小时或不处理(灰色)。使用商业ELISA试剂盒确定上清液流体中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6以及IL-10的浓度。D-l到D-8是独立的血液供体，其中仅D-5同时用于A和B两者中。

图28A.体外细胞毒性。使用0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(▲，虚线)、0.1nM 20*-2b(·,灰色)或介质(■，黑色)将从第一供体分离的纯化的CD8⁺T细胞预处理24小时，然后与PKH-67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率混合。使用(E1)-3s的滴定将细胞混合物处理两天，然后通过流式细胞术计数存活NCI-N87细胞的数目。针对每个样品，使用下式，计算溶解百分比的非线性回归分析(S形剂量反应)：[l-(A₁/A₂)]x 100，其中A₁和A₂分别代表测试和未经处理的样品中活靶细胞的数目对(E1)-3s的摩尔浓度的对数。

图28B.体外细胞毒性。使用0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(▲，虚线)、0.1nM 20*-2b(·,灰色)或介质(■，黑色)将从第二供体分离的纯化的CD8⁺T细胞预处理24小时，然后与PKH-67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率混合。使用(E1)-3s的滴定将细胞混合物处理两天，然后通过流式细胞术计数存活NCI-N87细胞的数目。针对每个样品，使用下式，计算溶解百分比的非线性回归分析(S形剂量反应)：[l-(A₁/A₂)]x 100，其中A₁和A₂分别代表测试和未经处理的样品中活靶细胞的数目对(E1)-3s的摩尔浓度的对数。

图29A.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a存在(虚线)或不存在(实现)的情况下，CD69-阳性CD4⁺(·)或CD8⁺(■)T细胞百分比对(E1)-3s的摩尔浓度的对数的非线性回归分析(S形剂量反应)。

图29B.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。直方图示出了在NCI-N87细胞的存在下，抗-CD69-APC染色的之后使用0.1nM(E1)-3s(点线)、0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(灰色)或两种试剂的组合(黑色)处理的CD8⁺T细胞。

图29C.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在不存在或存在NCI-N87靶细胞(T)的情况下，在与0.1nM(E1)-3s(E)和/或0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(P)温育后CD69阳性CD8⁺T细胞百分比。各种处理测定进行三次。误差线，S.D.*,P<0.001。

图29D.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在不存在或存在NCI-N87靶细胞(T)的情况下，与0.1nM(E1)-3s(E)和/或0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(P)温育后，CD69⁺细胞的几何平均荧光。各种处理测定进行三次。误差线，S.D.*,P<0.001。

图30A.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有人T细胞和Capan-1胰腺癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μg TF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图30B.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有人T细胞和Capan-1胰腺癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μg TF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图30C.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有NCI-N87胃癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μg TF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs 6:381-91)中的图6C。

图31.E1-3诱导的细胞因子产生。PBMC以5:1比率与BxPC-3细胞混合并且使用E1-3的滴定处理24小时。使用Single-AnalyteELISArray试剂盒(Qiagen)测量细胞因子浓度。在不存在E1-3的情况下，所有细胞因子水平<10pg/mL。

图32.胰腺和胃癌细胞系的体外重定向T细胞杀灭。将纯化的CD8⁺T细胞(1.2x 10⁵/孔)以6:1与靶细胞(2x 10⁴/孔)混合并且在96孔板中使用E1-3的滴定处理。在48小时后，洗涤以除去T细胞并且使用MTS测定测量存活靶细胞密度。针对若干T细胞供体中的一个的结果的示例。

图33A.人胃肿瘤异种移植物的体内疗法。PBMC以2:1与NCI-N87细胞混合并且使用基质胶皮下注射到NOD-SCID小鼠。在第0天和第3天静脉内向动物给予50μg的E1-3。针对肿瘤生长物的迹象，每日监测小鼠，之后在端值测量>1.0cm³的情况下一周两次测量肿瘤。在176后，E1-3治疗组中8个小鼠中7个未达到端值，其中6个动物保持没有肿瘤。

图33B.人胃肿瘤异种移植物的体内疗法。PBMC以2:1与NCI-N87细胞混合并且使用基质胶皮下注射到NOD-SCID小鼠。在第0天和第3天静脉内向动物给予50μg的E1-3。针对肿瘤生长物的迹象，每日监测小鼠，之后在端值测量>1.0cm³的情况下一周两次测量肿瘤。仅包含PBMC和NCI-87的对照组中的肿瘤达到端值，其中中值时间为39.5天。

详述

定义

除非另有说明，否则“一个(种)”表示“一个(种)或多个(种)”。

如本文所使用的，术语“和”与“或”可用来指连词或反意连词。也就是说，这两个术语应该被理解为相当于“和/或”，除非另有说明。

“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料，和放射性同位素。

如本文使用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。“抗体”包括单克隆、多克隆、双特异性、多特异性、鼠、嵌合、人源化和人抗体。

“裸抗体”是未与治疗剂或诊断剂连接的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可提供效应因子功能，如补体固定和ADCC(参见，例如，Markrides,Pharmacol Rev 50:59-87,1998)。裸抗体诱导细胞死亡的其他机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton,AnnAllergy Asthma Immunol 81:105-119,1998.)。

“抗体片段”是完整抗体的一部分，如F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv、dAb等。无论结构怎样，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。举例来说，术语“抗体片段”包括由可变区组成的经分离片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链和重链可变区由肽连接子连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。“单链抗体”通常缩写为“scFv”，由多肽链组成，其包含相互作用以形成抗原结合位点的V_H和V_L域。V_H和V_L域通常通过1至25个氨基酸残基的肽来连接。抗体片段还包括双功能抗体、三抗体和单结构域抗体(dAb)。

“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其含有的可变结构域包括来源于一种物种的抗体(优选地啮齿动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的那些恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其他物种，如猫或狗的恒定结构域。

“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中来自一种物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链可变区和轻链可变区转移至人重链可变结构域和轻链可变结构域(包括人构架区(FR)序列)中。抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。为了保持结合活性，来自亲本(例如，鼠)抗体的有限数目的FR氨基酸残基可被取代为相应人FR残基。

“人抗体”是从转基因小鼠中获得的抗体，该转基因小鼠已经被基因工程化以响应于抗原激发而产生特异性人抗体。在此技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件引入至来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，该胚胎干细胞系含有内源重链基因座和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可以合成对人抗原有特异性的人抗体，并且小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等,Nature Genet.7:13(1994)、Lonberg等,Nature 368:856(1994)以及Taylor等,Int.Immun.6:579(1994)描述。人抗体还可以通过基因转染或染色体转染方法以及噬菌体呈现技术来构建，所有方法和技术是本领域中已知的。(参见，例如McCafferty等人，1990,Nature348:552-553，公开了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系(repertoire)体外产生人抗体及其片段)。在此技术中，将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上呈现为功能性抗体片段。因为丝状粒颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质进行选择也导致选择编码呈现所述性质的抗体的基因。以此方式，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。可以在各种形式下呈现噬菌体，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3:5564-571(1993)。还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275)。

如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白”是重组产生的抗原结合分子，其中抗体或抗体片段被连接至另一种蛋白质或肽，如相同的或不同的抗体或抗体片段或DDD肽或AD肽。融合蛋白可以包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可以另外地包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地为重组RNA酶。优选免疫调节剂可为干扰素，如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ。

“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两个具有相同或不同结构的靶标的抗体。价态表明抗体对单个抗原或表位具有多少个结合臂或位点；即，一价、二价、三价或多价。抗体的多价性意味着抗体可以使用多种相互作用结合抗原，从而增加结合抗原的亲合力。特异性表明抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但该抗体是单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性的、多价的抗体是含有多于一个具有不同特异性的结合位点的构建体。

“双特异性抗体”是可以同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可具有特异性结合至例如T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞的至少一个臂，和特异性结合至由患病细胞、组织、器官或病原体产生或与其相关联的抗原(例如肿瘤相关联抗原)的至少一个其他臂。可以使用分子工程来产生各种双特异性抗体。

如果所施用的量具有生理学显著性，则本文描述的抗体制剂或组合物被认为以“治疗有效量”来施用。如果试剂的存在导致受体受试者的生理学方面产生可检测变化，那么其具有生理学显著性。在具体实施方案中，如果抗体制剂的存在引起抗癌反应或缓解传染病状态的体征和症状，则其具有生理学显著性。生理学上显著的效应也可为在受体受试者中引起体液和/或细胞免疫应答，从而导致靶细胞的生长抑制或死亡。

抗-Trop-2抗体

在优选实施方案中，目标双特异性抗体包括结合Trop-2的至少一种抗体或其片段。在更优选实施方案中，抗-Trop-2抗体可以是人源化RS7抗体(参见，例如，美国专利号7,238,785，全文以引用方式并入本文)，其包含轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ IDNO:115)；CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO:116)；以及CDR3(QQHYITPLT，SEQ ID NO:117)和重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO:118)；CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO:119)以及CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO:120)。

RS7抗体是是抗人原发肺鳞状细胞癌的粗制膜制备物而产生的鼠IgG₁。(Stein等人，Cancer Res.50:1330,1990)。RS7抗体识别46kDa-48kDa糖蛋白，特征为聚簇13。((Stein等人，Int.J.CancerSupp.8:98-102,1994)。该抗原被命名为EGP-1(上皮糖蛋白-1)，但也称为Trop-2。

Trop-2是I型跨膜蛋白并且已从人(Fomaro等人，Int J Cancer1995；62:610-8)和小鼠细胞(Sewedy等人，Int J Cancer 1998；75:324-30)克隆。除了其作为肿瘤相关钙信号转导蛋白(transducer)的功能(Ripani等人，Int J Cancer 1998；76:671-6)外，已显示人Trop-2的表达是结肠癌细胞的肿瘤发生和侵袭力所必需的，该肿瘤发生和侵袭力可被抗Trop-2的细胞外域的多克隆抗体有效减少(Wang等人，Mol Cancer Ther 2008；7:280-5)。

Trop-2作为实体癌的治疗性靶的日益增加的兴趣(Cubas等人，Biochim BiophysActa 2009；1796:309-14)通过另外报导得以证明，该报导记录了过表达的Trop-2在乳房((Huang等人，Clin Cancer Res2005；11:4357-64)、结肠直肠(Ohmachi等人,Clin CancerRes 2006；12:3057-63；Fang等人,Int J Colorectal Dis 2009；24:875-84)和口腔鳞状细胞(Fong等人，Modem Pathol 2008；21:186-91)癌中的临床意义。表达高水平的Trop-2的前列腺基底细胞因体外和体内干细胞样活性而富集的最新证据是特别值得注意的(Goldstein等人，Proc Natl Acad Sci USA 2008；105:20882-7)。

流式细胞术和免疫组织化学染色研究已表明RS7MAb检测多种类型肿瘤上的抗原，而有限结合到正常人组织(Stein等人，1990)。Trop-2主要由癌诸如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及前列腺癌表达。在动物模型中使用放射性标记鼠RS7MAb进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向性和治疗效力(Stein等人，1990；Stein等人，1991)。

已表明在来自肺、乳、膀胱、卵巢、子宫、胃以及前列腺的肿瘤中存在RS7强染色。(Stein等人，Int.J.Cancer 55:938,1993)。肺癌病例包括鳞状细胞癌和腺癌两者。(Stein等人，Int.J.Cancer 55:938,1993)。两种细胞类型均强染色，指示RS7抗体不能从非小细胞肺癌的组织学分类上区分。

RS7MAb被快速内在化至靶细胞(Stein等人，1993)。RS7MAb的内在化速度常数介于其他两种快速内在化MAb的内在化速度常数之间，其他两种快速内在化已经被证明可用于免疫毒素制备。同上。已大量记载免疫毒素缀合物的内在化对抗-肿瘤活性是必须的。(Pastan等人，细胞47:641,1986)。药物免疫缀合物的内在化也已经被描述为抗-肿瘤效能中的主要因素。(Yang等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:1189,1988)。因此，RS7抗体表现出治疗应用的若干重要特性。

虽然hRS7抗体是优选的，但其他抗-Trop-2抗体是已知的并且/或可公开获得，并且在另选的实施方案中，可在目标ADC中使用。

虽然对于减少免疫原性，人源化或人抗体是优选的，但在另选的实施方案中，可使用嵌合抗体。如上所论述，抗体人源化的方法是本领域已知的并且可用于将可获得的鼠或嵌合抗体转化为人源化形式。

抗-Trop-2抗体可购自多个来源并且包括LS-C126418、LS-C178765、LS-C126416、LS-C126417(LifeSpan BioSciences公司，Seattle,WA)；10428-MM01、10428-MM02、10428-R001、10428-R030(Sino Biological公司，中国北京)；MR54(eBioscience,San Diego,CA)；sc-376181、sc-376746，Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)；MM0588-49D6，(Novus Biologicals,Littleton,CO)；ab79976和ab89928(

Cambridge,MA)。

专利文献中公开了其他抗-Trop-2抗体。例如，美国公布号2013/0089872公开了抗-Trop-2抗体K5-70(保藏编号FERM BP-11251)、K5-107(保藏编号FERM BP-11252)、K5-116-2-1(保藏编号FERM BP-11253)、T6-16(保藏编号FERM BP-11346)以及T5-86(保藏编号FERM BP-11254)，其保藏在日本筑波的国际专利生物保藏机构。美国专利号5,840,854公开了抗-Trop-2单克隆抗体BR110(ATCC号HB11698)。美国专利号7,420,040公开了以保藏编号141205-05保藏在IDAC(加拿大温尼伯加拿大国际保藏机构)的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的抗-Trop-2抗体。美国专利号7,420,041公开了以保藏编号141205-03保藏在IDAC的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的抗-Trop-2抗体。美国公布号2013/0122020公开了抗-Trop-2抗体3E9、6G11、7E6、15E2、18B1。编码代表性抗体的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，保藏编号PTA-12871和PTA-12872。美国专利号8,715,662公开了以保藏号PD08019、PD 08020和PD08021保藏在AID-ICLC(意大利热那亚)的杂交瘤产生的抗-Trop-2抗体。美国专利申请公布号20120237518公开了抗-Trop-2抗体77220、KM4097和KM4590。美国专利号8,309,094(Wyeth)公开了通过序列表识别的抗体A1和A3。在这个段落里以上引用的每个专利或专利申请的实施例部分以引用方式并入本文。非专利公布Lipinski等人(1981,Proc Natl.Acad Sci USA,78:5147-50)公布了抗-Trop-2抗体162-25.3和162-46.2。

多个抗-Trop-2抗体在本领域是已知的和/或可公开获得的。如以下所论述，用于制备针对已知抗原的抗体的方法在本领域中是常规的。人Trop-2蛋白质的序列在本领域中也是已知的(参见，例如，GenBank保藏编号CAA54801.1)。用于产生人源化、人或嵌合抗体的方法也是已知的。根据本领域中的常识，阅读本公开内容的普通技术人员将能够制作和使用目标ADC中的抗-Trop-2抗体种类。

抗-CD3抗体

可用于要求保护的方法和组合物中的针对CD3的各种抗体是公开已知的且/或可购得，如从LSBio(目录号LS-B6698、LS-B8669、LS-B8765、LS-C96311、LS-C58677等)；

(目录号ab5690、ab16669、ab699、ab828、ab8671等)；Santa CruzBiotechnology(目录号sc-20047、sc-20080、sc-19590、sc-59008、sc-101442等)；和许多其他供应商。

在一个优选实施方案中，用作DNL^TM复合物一部分的抗-CD3部分的氨基酸序列如以下在SEQ ID NO:96至SEQ ID NO:101中公开。然而，本领域普通技术人员将认识到任何已知抗-CD3抗体可用于要求保护的方法和组合物中。优选地，有用的抗体部分是人源化或人抗体。

白细胞重定向双特异性抗体复合物

在优选实施方案中，目标双特异性抗体包含抗-CD3x抗-Trop-2抗体。如以上所论述，针对CD3或Trop-2的多种抗体是本领域已知的并且可使用这种已知抗体。然而，在另选的实施方案中，可使用针对除CD3之外的其他白细胞抗原或针对除Trop-2之外的其他疾病相关的抗原的抗体。

示例性T-细胞抗原包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69以及CD90。其他示例性抗原，用于NK细胞可选自CD8、CD 16、CD56、CD57、ADAM 17以及CD 137；用于单核细胞，可选自CD74、HLA-DRα链、CD 14、CD 16、CD64以及CD89；以及用于嗜中性粒细胞，可选自CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b以及SLC44A2嗜中性粒细胞。优选地，抗-T-细胞抗体结合至CD3或抗-NK抗体结合至CD16。如以下所论述，疾病相关的抗原的许多实例，诸如肿瘤相关的抗原(TAA)是已知的。示例性优选的TAA是Trop-2。

某些另选的实施方案可涉及抗-CD3x抗-CD 19双特异性抗体。各种双特异性抗-CD3x抗-CD 19抗体在在本领域中为已知的并且目前在临床开发中，如

(双特异性T-细胞衔接子)(例如，Nagorsen等人，2009,Leukemia&Lymphoma 50:886-91；Amann等人，2009,J Immunother 32:453-64；Baeuerle和Reinhardt,2009,Cancer Res69:4941-44)和

(参见，例如，Moore等人，2011,Blood117:4542-51；Veri等人，2010,ArthritisRheum 62:1933-43)。布利莫单抗(Blinatumomab)是包含用5-氨基酸连接子连接的V_H和V_L域抗-CD3和抗-CD19抗体片段的

抗体，并且表达为粘接至本身以形成抗原结合位点的单一多肽链。认为布利莫单抗起作用的方式是使T-细胞-特异性CD3和B-细胞特异性CD19抗原紧密接近，以引发针对并置B细胞的T-细胞毒性响应，其不需要癌细胞的T-细胞特异性(例如，Portell等人，2013,Clin Pharmacol 5(增刊1):5-11)。由于它的较短半衰期，布利莫单抗需要连续静脉内输注以便有效，(Portell等人，2013)。患有持续或复发最小残留疾病的B-细胞ALL患者的II期试验报告大约80％的全面缓解率(Portell等人，2013)。

低至0.005mg/m²/天的布利莫单抗剂量报告可有效消除非霍奇金淋巴瘤患者的癌细胞(Bargou等人，2008,Science 321:974-77)。从0.015mg剂量水平开始观察到部分和完全缓解并且在0.06mg剂量下测试的全部六个患者经历肿瘤消退(Bargou等人，2008)。在体外，布利莫单抗在10pg/mL浓度下诱导MEC-1细胞的50％细胞溶解(Topp等人，2012,Blood120:5185-87；Bassan等人，2012,Blood 120:5094-95)。

布利莫单抗的抗-CD 19部分来源于HD37杂交瘤(参见，例如，美国专利号7,575,923，其实施例部分以引用方式并入本文)，该杂交瘤可公开获得(例如，Santa CruzBiotechnology目录号sc-18894)。布利莫单抗的抗-CD3部分来源于TR66杂交瘤(美国专利号7,575,923；Traunecker等人，1991,EMBO J.10:3655-59)，该杂交瘤也可公开获得(例如，Enzo Life Sciences，目录号ALX-804-822-C100)。

针对CD19的各种抗体是公开已知的且/或可购得，如从Santa CruzBiotechnology(目录号sc-390244、sc-373897、sc-18894、sc-18896等)；

(目录号ab25232、ab134114、ab140981、ab1255等)；ABBIOTEC^TM(目录号252262、252248、250585、251063等)和许多其他供应商。

在一个优选实施方案中，抗-CD 19抗体部分是人源化A19抗体，其包括轻链CDR序列CDR1KASQSVDYDGDSYLN(SEQ ID NO:90)、CDR2DASNLVS(SEQ ID NO:91)和CDR3QQSTEDPWT(SEQ ID NO:92)和重链CDR序列CDR1SYWMN(SEQ ID NO:93)、CDR2QIWPGDGDTNYNGKFKG(SEQID NO:94)和CDR3RETTTVGRYYYAMDY(SEQ ID NO:95)。

其他抗-CD3x抗-CD 19双特异性抗体是已知的，诸如

，其也并入HD37的抗-CD 19Fv序列和TR66的抗-CD3Fv序列(Moore等人，2011,Blood 117:4542-51；Veri等人,2010,Arthritis Rheum62:1933-43)。Moore等人(2011)报告与具有pg/mL范围内的EC₅₀值的带有相同抗-CD19和抗-CD3可变区序列的单链、双特异性抗体

相比，

双特异性抗体更有效诱导B细胞溶解(Moore等人，2011)。已经报告除

和

之外的其他抗-CD3x抗-CD19双特异性抗体(参见，例如，Wei等人，2012,Cell Oncol35:423-34；Portner等人，2012,Cancer Immunol Immunother61:1869-75；Zhou等人，2012,Biotechnol Lett.34:1183-91)。在某些实施方案中，任何已知抗-CD3x抗-CD19双特异性抗体可用于诱导针对疾病相关联细胞的免疫应答。

卡妥索单抗是抗-CD3x抗-EpCAM双特异性抗体，其在欧洲已经批准其用于治疗与转移的癌症相关的恶性腹水(Chames&Baty，2009，MAbs 1:539-47)。在小鼠模型系统中，卡妥索单抗在10pM的浓度范围下能够杀死肿瘤细胞，并且据报告产生了黑素瘤肿瘤的总体根除(Chames&Baty，2009)。伴随恶性腹水的卵巢癌患者的人类临床试验也显示了统计上显著的效力(Chames&Baty，2009)。然而，大鼠/小鼠杂合bsAb的高免疫原性可能限制经静脉内施用抗体(Chames&Baty，2009)。抗肿瘤bsAb的使用不限于抗-CD3x抗-CD 19，还可包括抗-HER2x抗-CD64(MDX-210、MDX-H210)、抗-EGFR x抗-CD64(MDX-447)、抗-CD30x抗-CD 16(HRS-3/A9)、抗-HER2x抗-CD3(Her2Bi)、抗-CD20x抗-CD3(CD20Bi、Bi20)、抗-EpCAM x抗-CD3(卡妥索单抗、MT110)、抗-HER2x抗-CD3(厄妥索单抗)以及抗-NG2x抗-CD28(rM28)(Chames&Baty,2009)。

本领域普通技术人员将认识到目标白细胞重定向双特异性抗体不限于抗-CD3x抗-Trop-2构建体，而是可包括连接至抗-CD3抗体部分的针对任何已知疾病相关联抗原的抗体。另选地，还可以使用针对除CD3以外的其他T细胞抗原或NK细胞、单核细胞或嗜嗜中性粒细胞细胞上所表达的其他抗原的抗体。示例性T-细胞抗原包括但不限于，CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。对于NK细胞，其他示例性抗原可选自CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM 17、KIR以及CD137；对于单核细胞，CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64以及CD89；以及对于嗜中性粒细胞，CEACAM6、CEACAM8、CD 16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b以及SLC44A2。针对各白细胞抗原的抗体是公开已知的和/或公开可获得的(参见例如

目录号ab131276、ab139266、ab8360、ab51312、ab846、ab133616、ab75877、ab133255、ab109217、ab93278、ab17147、ab115851、ab128955、ab13463、ab85986；Santa Cruz Biotechnology目录号sc-46683、sc-59047；Enzo LifeSciences公司目录号ALX-805-037-C100；Sino Biological公司目录号12211-RP02、11150-R074；Millipore目录号04-1102、04-1102、MAB1406)。这些和许多其他抗白细胞抗体是公开可获得的，并且可以用于目标白细胞重定向bsAb。如以下所论述，许多针对多种疾病相关抗原的抗体是公开是已知的和/或市售的，并且可用于目标白细胞重定向双特异性抗体。可能使用的其他示例性白细胞重定向的bsAb包括FBTA05(抗-CD20x抗-CD3)和TRBS07(抗-GD2x抗-CD3)。

干扰素疗法

在各种实施方案中，目标双特异性抗体可与一种或多种干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ，优选干扰素-α组合使用。人干扰素在本领域中是熟知的并且人干扰素的氨基酸序列可容易地从公开的数据库获得(例如，GenBank登录号AAA52716.1；AAA52724；AAC41702.1；EAW56871.1；EAW56870.1；EAW56869.1)。人干扰素还可商业上从各种供应商获得(例如，Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA；Genentech,South SanFrancisco,CA；EMD Millipore,Billerica,MA)。

已经报告干扰素-α(IFNα)在癌症的动物模型(Ferrantini等人，1994,J Immunol153:4604-15)和人癌症患者(Gutterman等人，1980,Ann Intern Med 93:399-406)中具有抗肿瘤活性。IFNα可发挥各种直接抗肿瘤效应，包括下调致癌基因、上调肿瘤抑制因子、经由增加肿瘤表面MHC I类蛋白质的表达来增强免疫识别、增强细胞凋亡和对于化学治疗剂敏感化(Gutterman等人，1994,PNAS USA 91:1198-205；Matarrese等人，2002,Am J Pathol160:1507-20；Mecchia等人，2000,Gene Ther7:167-79；Sabaawy等人，1999,Int J Oncol14:1143-51；Takaoka等人，2003,Nature 424:516-23)。对于一些肿瘤，IFNα可经由活化STAT1而具有直接和有效的抗增殖效应(Grimley等人，1998Blood91:3017-27)。干扰素-α2b在体外和体内与抗肿瘤抗体(如hL243抗-HLA-DR抗体)缀合并且耗竭淋巴瘤和骨髓瘤细胞(Rossi等人，2011,Blood 118:1877-84)。

间接地，IFNα可抑制血管生成(Sidky和Borden,1987,Cancer Res47:5155-61)并且刺激宿主免疫细胞，这对于总体抗癌反应可为极其重要的但是很大程度上被低估(Belardelli等人，1996,Immunol Today17:369-72)。IFNα通过对骨髓细胞(Raefsky等人，1985,J Immunol135:2507-12；Luft等人，1998,J Immunol 161:1947-53)、T-细胞(Carrero等人，2006,J Exp Med 203:933-40；Pilling等人，1999,Eur J Immunol29:1041-50)和B-细胞(Le等人，2001,Immunity 14:461-70)的作用而对于免疫响应具有多效性影响。作为先天免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树突状细胞的快速分化和活化(Belardelli等人，2004,Cancer Res64:6827-30；Paquette等人，1998,J Leukoc Biol 64:358-67；Santini等人，2000,J Exp Med 191:1777-88)并且增强NK细胞的细胞毒性、迁移、细胞因子产生和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等人，1999,Ann Rev Immunol 17:189-220；Brunda等人1984,Cancer Res44:597-601)。

已经报告干扰素-β可有效治疗各种实体肿瘤。每周两次用6百万单位的IFN-β治疗36个月的患者显示在患有HCV-相关肝癌的患者中完全切除或摘除原发肿瘤之后肝细胞癌的复发降低(Ikeda等人，2000,Hepatology 32:228-32)。用干扰素-β的基因疗法诱导神经胶质瘤、黑素瘤和肾细胞癌的细胞凋亡(Yoshida等人，2004,Cancer Sci95:858-65)。已观察到内源性IFN-β通过抑制体内血管生成而抑制肿瘤生长(Jablonska等人，2010,J ClinInvest.120:1151-64。)

被称为III型干扰素的IFN-λ是由IFN-λ1、2、3(也分别称为白介素-29、28A和28B)组成的一组新描述的细胞因子，其由位于染色体19上的三个不同基因来编码(Kotenko等人，2003,Nat Immunol4:69-77；Sheppard等人，2003,Nat Immunol 4:63-8)。在蛋白质层面下，IFN-λ2和-λ3是高度同源的，具有96％氨基酸同一性，而IFN-λ1与IFN-λ2和-λ3共有大约81％同源性(Sheppard等人，2003,Nat Immunol4:63-8)。IFN-λ经由与I型IFN诱导的途径类似的JAK/STAT途径来启动信号转导，包括活化JAK1和TYK2激酶、磷酸化STAT蛋白质和活化IFN-刺激基因因子3(ISGF3)的转录复合物(Witte等人，2010,Cytokine Growth FactorRev 21:237-51；Zhou等人，2007,J Virol81:7749-58)。

III型与I型IFN系统之间的主要差异是其相应受体复合物的分布。IFN-α/β经由两种广泛表达的I型干扰素受体来信号转导，并且与IFN-α/β施用相关联的所得系统毒性限制其作为治疗剂的使用(Pestka等人，2007,J Biol Chem 282:20047-51)。相比之下，IFN-λ经由独特的IFN-λ受体1(IFN-λR1)和IL-10受体2(IL-10R2)组成的异源二聚体受体复合物来信号传导。如以前报告(Witte等人，2009,Genes Immun 10:702-14)，IFN-λR1具有非常有限的表达模式，其中在上皮细胞、黑素细胞和肝细胞中水平最高，并且在原代中枢神经系统(CNS)细胞中水平最低。血液免疫系统细胞表达较高水平的能抑制IFN-λ作用得短IFN-λ受体剪接变异体(sIFN-λR1)。神经元细胞和免疫细胞的有限反应性意味着在IFN-λ情况下可能不存在或显著减少往往与IFN-α疗法相关联的严重毒性(Witte等人，2009,GenesImmun10:702-14；Witte等人，2010,Cytokine Growth Factor Rev 21:237-51)。最近出版物报告了尽管IFN-α和IFN-λ在肝细胞中诱导一组常见ISG(干扰素刺激的基因)的表达，但是不同于IFN-α，IFN-λ的施用在经纯化的淋巴细胞或单核细胞中不诱导STAT活化或ISG表达(Dickensheets等人，2013,J Leukoc Biol.93，于12/20/12线上公布)。据建议，对于治疗慢性HCV感染，IFN-λ可优于IFN-α，因为它不太可能诱导通常与IFN-α疗法相关联的白细胞减少(Dickensheets等人，2013)。

IFN-λ显示与IL-10-相关细胞因子类似的结构特征，但是在功能上具有I型IFN样抗病毒和抗增殖活性(Witte等人，2009,Genes Immun 10:702-14；Ank等人，2006,J Virol80:4501-9；Robek等人，2005,J Virol 79:38514)。已经证明IFN-λ1和-λ2可减少各种病毒的病毒复制或细胞病变效应，包括DNA病毒(乙型肝炎病毒(Robek等人，2005,J Virol 79:3851-4,Doyle等人，2006,Hepatology 44:896-906)和单纯性疱疹病毒2(Ank等人，2008,JImmunol 180:2474-85))、ss(+)RNA病毒(EMCV；Sheppard等人，2003,Nat Immunol 4:63-8)和丙型肝炎病毒(Robek等人，2005,J Virol 79:3851-4,Doyle等人，2006,Hepatology44:896-906；Marcello等人，2006,Gastroenterol 131:188798；Pagliaccetti等人，2008,JBiol Chem 283:30079-89)、ss(-)RNA病毒(水泡性口炎病毒；Pagliaccetti等人，2008,JBiol Chem 283:30079-89)和流感-A病毒(Jewell等人，2010,J Virol 84:11515-22)和双链RNA病毒如轮状病毒(Pott等人，2011,PNAS USA 108:7944049)。IFN-λ3已经从基因研究中被识别为HCV感染中的关键细胞因子(Ge等人，2009,Nature461:399-401)，并且也展示相对于EMCV的有效活性(Dellgren等人，2009,Genes Immun 10:125-31)。据报导，鼻病毒诱导的IFN-λ产生缺陷与鼻病毒诱导的哮喘恶化的严重程度高度相关(Contoli等人，2006,Nature Med 12:1023-26)并且已经建议IFN-λ疗法是治疗变应性哮喘的新方法(Edwards和Johnston,2011,EMBO Mol Med 3:306-8；Koltsida等人，2011,EMBO Mol Med 3:348-61)。

已经在若干种人类癌细胞系中确定了IFN-λ的抗增殖活性，包括神经内分泌癌瘤(Zitzmann等人，2006,Biochem Biophys Res Commun344:1334-41)、成胶质细胞瘤LN319(Meager等人，2005,Cytokine，31:109-18)、永生化角质细胞HaCaT(Maher等人，2008,Cancer Biol Ther 7:1109-15)、黑素瘤F01(Guenterberg等人，2010,Mol Cancer Ther9:510-20)以及食道癌TE-11(Li等人，2010,Eur J Cancer 46:180-90)。在动物模型中，IFN-λ经由先天和适应性免疫应答来诱导肿瘤细胞凋亡和破坏，表明IFN-λ的局部递送可能是治疗人恶性肿瘤中的有用辅助策略(Numasaki等人，2007,J Immunol 178:5086-98)。Fab连接的干扰素λ显示在靶细胞中具有有效的抗肿瘤和抗病毒活性(Liu等人，2013,PLoS One 8:e63940)。

在临床环境中，PEG化IFN-λ1(PEG-IFN-λ1)已经临时用于患有慢性丙型肝炎病毒感染的患者。在阶段Ib研究(n＝56)中，当将PEG-IFN-λ1施用至在IFN-α疗法之后复发的基因型1HCV患者时，在所有剂量水平(0.5-3.0μg/kg)下观察到抗病毒活性，并且病毒负载减少2.3至4.0个对数(Muir等人，2010,Hepatology 52:822-32)。IIb期研究(n＝526)示出与PEG-IFN-α相比，具有HCV基因型1和4的患者对于使用PEG-IFN-λ1的治疗具有显著更高反应率。同时，与PEG-IFN-α相比，通常与I型干扰素治疗相关联的不良事件比率对于PEG-IFN-λ1是较低的。很少观察到嗜中性白细胞减少和血小板减少并且流感样症状、贫血和肌肉骨骼症状的比率降低至在PEG-IFN-α治疗时所发现的比率的约1/3。然而，严重不良事件、抑郁症和其他常见不良事件(≥10％)的比率在PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α之间是相似的。与PEG-IFN-α相比，在最高剂量PEG-IFN-λ1中发现较高比率的肝毒性(“InvestigationalCompound PEG-Interferon Lambda Achieved Higher Response Rates with Fewer Flu-like and Musculoskeleta lSymptomsand Cytopenias Than PEG-Interferon Alfa inPhase IIb Study of 526Treatment-Naive Hepatitis C Patients,”2011年4月2日，来自Bristol-Myers Squibb新闻公报)。

在各种实施方案中，目标白细胞重定向双特异性抗体、ADC和/或检查点抑制剂mAb可以与一种或多种干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λl、干扰素-λ2,或干扰素λ3组合使用。当与其他药剂一起使用时，干扰素可在其他药剂之前、同时或之后施用。当同时施用时，干扰素可与其他药剂偶联或分开。

检查点抑制剂抗体

使用检查点抑制剂抗体用于癌症疗法的研究已经在先前认为对癌症治疗具有抗性的癌症中产生了前所未有的反应率(参见，例如，Ott&Bhardwaj,2013,Frontiers inImmunology 4:346；Menzies&Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-64；Mavilio&Lugli,)。利用针对诸如CTLA4、PD1和PD-L1的免疫系统检查点的拮抗性检查点阻断抗体的疗法是用于癌症和其他疾病的免疫疗法的最有前景的新手段之一。与大多数抗癌剂相反，检查点抑制剂不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体，以提高免疫系统的内源性抗癌活性。(Pardoll,2012,NatureReviews Cancer 12:252-264)因为此类抗体主要通过调节对患病细胞、组织或病原体的免疫应答起作用，所以它们可以与其他治疗形态组合使用，诸如目标白细胞重定向双特异性抗体、ADC和/或干扰素，以提高此类药剂的抗肿瘤效果。

现在已经清楚，肿瘤可以通过强占某些免疫检查点途径而逃避免疫监测，特别是在肿瘤抗原特异性T细胞中(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。因为许多此类免疫检查点由配体-受体相互作用引发，所以它们可以通过针对所述配体和/或其受体的抗体被容易地阻断(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。虽然针对CTLA4、PD1和PD-L1的检查点抑制剂抗体是临床上最先进的，但其他潜在检查点抗原是已知的，并且可以用作诸如诸如LAG3、B7-H3、B7-H4以及TIM3的治疗抗体的靶标(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。

程序性细胞死亡蛋白1(PD1，也称为CD279)编码B细胞和NK细胞中所表达的免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白(Shinohara等人,1995,Genomics 23:704-6；Blank等人,2007,Cancer Immunol Immunother 56:739-45；Finger等人,1997,Gene 197:177-87；Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。PD1的主要作用在于限制响应于感染的发炎期间在周围组织中的T细胞活性以及限制自体免疫性(Pardoll,2012,NatureReviews Cancer 12:252-264)。在活化的T细胞中诱导PD1表达，并且PD1与其内源性配体之一结合通过抑制刺激性激酶而起抑制T细胞活化的作用(Pardoll,2012,Nature ReviewsCancer 12:252-264)。PD1还起抑制TCR“停止信号”的作用(Pardoll,2012,Nature ReviewsCancer 12:252-264)。PD1高度表达于T_reg细胞上，且可在配体存在下增加其增殖(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。

抗PD1抗体已用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤及肾细胞癌(Topalian等人，2012,N Engl J Med 366:2443-54；Lipson等人，2013,Clin Cancer Res 19:462-8；Berger等人，2008,Clin CancerRes14:3044-51；Gildener-Leapman等人，2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies&Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85)。因为PD1/PD-L1及CTLA4通过不同的途径起作用，所以利用针对各抗原的检查点抑制剂抗体的组合疗法可以提供增强的免疫应答是有可能的。

示例性抗-PDl抗体包括兰利珠单抗(MK-3475，MERCK)、尼鲁单抗(BMS-936558，BRISTOL-MYERS SQUIBB)、AMP-224(MERCK)以及皮地珠单抗(CT-011，CURETECH公司)。抗-PDl抗体可从例如

(AB137132)、

(EH12.2H7，RMP1-14)以及AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(J105，J116，MIH4)商购获得。

程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274及B7-H1)是在活化的T细胞、B细胞、骨髓细胞和巨噬细胞上发现的PD1的配体。虽然PD1存在两种内源性配体，PD-L1和PD-L2，但抗肿瘤疗法已经集中于抗-PD-Ll抗体。PD1和PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞增殖且减少免疫应反应(Topalian等人，2012,N Engl J Med 366:2443-54；Brahmer等人，2012,N Eng JMed 366:2455-65)。抗-PD-Ll抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌以及血液恶性肿瘤(Brahmer等人，N Eng J Med366:2455-65；Ott等人，2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等人，2013,Clin Cancer Res19:5541；Menzies&Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等人,2008,ClinCancer Res 14:13044-51)。

示例性抗-PD-L1抗体包括MDX-1105(MEDAREX)、MEDI4736(MEDIMMUNE)MPDL3280A(GENENTECH)以及BMS-936559(BRISTOL-MYERS SQUIBB)。抗-PD-Ll抗体还可从例如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)商购获得。

细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4，也被称为CD 152)也是专门表现在T细胞上的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA4起抑制T细胞活化的作用，并且据报告能抑制辅助T细胞活性和提高调节T细胞免疫抑制活性(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。虽然CTL4-A的确切作用机制仍在研究中，但已经提出其通过在竞争结合CD80和CD86方面胜出CD28以及积极向T细胞递送抑制信号而抑制T细胞活化(Pardoll,2012,Nature ReviewsCancer 12:252-264)。抗CTL4A抗体已用于临床试验中用于治疗黑素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(Robert&Ghiringhelli,2009,Oncologist14:848-61；Ott等人，2013,Clin Cancer Res 19:5300；Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等人，2013,JTransl Med 11:89)。抗CTL4A的显著特征是抗肿瘤效应的动力学性质，其中生理反应所需的初步治疗后停滞期多达6个月(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer12:252-264)。在一些情况下，治疗开始之后肿瘤尺寸实际上可能增加，随后可见减小(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。

示例性抗-CTLA4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和曲美目单抗(PFIZER)。抗-PD 1抗体可从例如

(AB134090)、SINO BIOLOGICAL公司(11159-H03H，11159-H08H)和THERMO SCIENTIFIC PIERCE(PA5-29572、PA5-23967、PA5-26465、MA1-12205、MA1-35914)商购获得。伊匹单抗最近已经接到FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等人，2013,J Transl Med 11:89)。

本领域技术人员应认识到，确定检查点抑制剂抗体单独或与一种或多种其他药剂组合施用于需要其的患者的最佳剂量的方法可以通过本领域中熟知的标准剂量-反应和毒性研究来确定。在一个示例性实施例中，检查点抑制剂抗体可优选地以约0.3mg/kg-10mg/kg或最大耐受剂量施用，约每三周或约每六周施用一次。替代地，检查点抑制剂抗体可以通过升高的剂量方案施用，包括施用约3mg/kg的第一剂量、约5mg/kg的第二剂量和约9mg/kg的第三剂量。另选地，逐步升高的剂量方案包括施用检查点抑制剂抗体约5mg/kg的第一剂量和约9mg/kg的第二剂量。另一个逐步升高的剂量方案施用可以包括施用检查点抑制剂抗体约3mg/kg的第一剂量、约3mg/kg的第二剂量、约5mg/kg的第三剂量、约5mg/kg的第四剂量以及约9mg/kg的第五剂量。在另一个方面，逐步升高的剂量方案可以包括施用5mg/kg的第一剂量、5mg/kg的第二剂量和9mg/kg的第三剂量。检查点抑制剂mAb的示例性报告剂量包括3mg/kg伊匹单抗，每三周施用一次，持续四个剂量；10mg/kg伊匹单抗，每三周一次，持续八个循环；l0mg/kg，每三周一次，持续四个循环，随后每12周一次，总计三年；10mg/kg MK-3475，每两周或每三周一次；2mg/kg MK-3475，每三周一次；15mg/kg曲美目单抗，每三个月一次；0.1、0.3、1、3或10mg/kg尼鲁单抗，每两周一次持续多达96周；0.3、1、3或10mg/kgBMS-936559，每两周一次，持续多达96周(Kyi&Postow，2013年10月23日，FEBS Lett[印刷前电子版]；Callahan&Wolchok,2013,J Leukoc Biol 94:41-53)。

刺激针对肿瘤及/或病原体的免疫应答的这些和其他已知药剂可以与单独或进一步与干扰素诸如干扰素α和/或用于改良癌症疗法的抗体-药物缀合物组合的白细胞重定向双特异性抗体组合使用。可以组合使用的其他已知共刺激途径调节剂包括但不限于阿托莫德、贝拉西普、布利莫单抗、CD40配体、抗-B7-l抗体、抗-B7-2抗体、抗-B7-H4抗体、AG4263、依立托仑、抗-OX40抗体、ISF-154以及SGN-70；B7-1、B7-2、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD48、LFA-3、CD30配体、CD40配体、耐热抗原、B7h、OX40配体、LIGHT、CD70以及CD24。

在某些实施例中，抗KIR抗体也可以与白细胞重定向bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制剂抗体组合使用。当被抗体活化时NK细胞通过自发性细胞毒性和通过ADCC介导抗肿瘤和抗感染剂活性(Kohrt等人，2013,Blood,[印刷前电子版12/10/13])。细胞毒性反应程度由NK细胞接到的抑制信号与活化信号的平衡来决定(Kohrt等人，2013)。杀灭细胞免疫球蛋白样受体(KIR)介导降低NK细胞反应的抑制信号。抗KIR抗体，诸如利利单抗(InnatePharma)和IPH2101(Innate Pharma)，已在多发性骨髓瘤中显示抗肿瘤活性(Benson等人,2012,Blood 120:4324-33)。在体外，抗KIR抗体防止NK细胞与靶细胞的致耐受性相互作用，并且增加NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性反应(Kohrt等人，2013)。在体内，在与利妥昔单抗(抗CD20)组合时，抗KIR抗体在0.5mg/kg的剂量下诱导的针对淋巴瘤的NK细胞介导的利妥昔单抗依赖性细胞毒性有所增强(Kohrt等，2013)。抗KIR mAb可以与ADC、白细胞重定向bsAb、干扰素和/或检查点抑制剂抗体组合以加强对肿瘤细胞或病原生物体的细胞毒性。

一般抗体技术

用于制备实际上针对任何靶抗原的单克隆抗体的技术为本领域中熟知的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256:495(1975)和Coligan等人(编著)，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简单地说，单克隆抗体可通过以下方式获得：将包含抗原的组合物注入小鼠，移除脾以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆，培养产生针对该抗原的抗体的克隆，并且从杂交瘤培养物中分离抗体。

可通过多种已确立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、体积排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等人，“Purification ofImmunoglobulin G(IgG),”于METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第10卷，第79-104页(TheHumana Press,Inc.1992)。

初始产生了针对免疫原的抗体之后，可对抗体进行测序并随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。使用从人源化、嵌合或人抗体衍生的抗体组分能回避与鼠恒定区免疫原性相关联的潜在问题。

嵌合抗体

嵌合抗体是一种重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)。嵌合抗体在施用至受试者时显示降低的免疫原性和增强的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开例如于Orlandi等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:3833(1989)。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。举例来说，Leung等人，Hybridoma 13:469(1994)通过将编码鼠类抗CD22抗体LL2的V_K和VH结构域的DNA序列与相应人κ和IgG₁恒定区结构域组合产生了LL2嵌合体。

人源化抗体

产生人源化MAb的技术在本领域中是熟知的(参见，例如，Jones等人，Nature 321:522(1986),Riechmann等人，Nature 332:323(1988),Verhoeyen等人，Science 239:1534(1988),Carter等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4285(1992),Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)，和Singer等人，J.Immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自于小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要进行额外修饰以恢复鼠抗体的初始亲和力。此举可通过将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠对应物以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等人，Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239:1534(1988)。总体上，不同于其鼠对应物并且接近或接触一个或多个CDR氨基酸残基而定位的那些人FR氨基酸残基是取代候选物。

人抗体

使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全人抗体的方法在本领域中为已知的(例如，Mancini等人，2004,New Microbiol.27:315-28；Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117-26；Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Phamacol.3:544-50)。还可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体，所有方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如McCafferty等人，Nature348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体表现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。在某些实施方案中，所要求保护的方法和工序可以使用由此类技术产生的人抗体。

在一个替代方案中，可使用噬菌体呈现技术来产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等人，2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。人抗体可由正常人或由表现特定疾病病况(如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等人，2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体谱系可能偏向针对疾病相关抗原的抗体。

在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体呈现文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ以及κ链抗体谱系克隆重组Fab并且将其插入至噬菌体呈现文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-97)。根据Andris-Widhopf等人(2000，于：PHAGEDISPLAY LABORATORY MANUAL,Barbas等人(编)，第1版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY第9.1至9.22页)来进行文库构建。用限制性核酸内切酶消化最终Fab片段并插入噬菌体基因组中以制备噬菌体呈现文库。这类文库可通过如在本领域中已知的标准噬菌体呈现方法来筛选(参见，例如，Pasqualini和Ruoslahti,1996,Nature 380:364-366；Pasqualini,1999,The Quart.J.Nucl.Med.43:159-162)。

噬菌体展示可以多种格式执行，关于其综述，请参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全文以引用方式并入本文中。熟练技术人员将认识到，这些技术是作为示例并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。

在另一替代方案中，可使用已进行基因工程改造以产生人抗体的转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，Nature Genet.7:13(1994)、Lonberg等人，Nature 368:856(1994)以及Taylor等人，Int.Immun.6:579(1994)公开。这类系统的非限制性实例是

(例如，Green等人，1999,J.Immunol.Methods231:11-23)，其来自Abgenix(Fremont,CA)。在

和类似动物中，已使小鼠抗体基因失活并置换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。

将

用含有部分人IgH和Igκ基因座，包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的生殖系构型YAC(酵母人工染色体)转化。人可变区谱系可以用来获得产抗体的B细胞，所述B细胞可以通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的

将通过正常免疫应答产生人抗体，其可收集和/或通过上文所论述的标准技术进行制造。可获得

的多种品系，其各自能够产生不同类别的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等人，1999)。熟练技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用

系统，而是可利用已进行基因工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。

抗体克隆和产生

各种技术，如制造嵌合或人源化抗体，可能涉及抗体克隆和构建的程序。感兴趣的抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和V_H(可变重链)序列可通过各种分子克隆工序获得，如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增来克隆并且测序。为了证实其真实性，可以将克隆的V_L和V_H基因在细胞培养物中表达为嵌合抗体，如由Orlandi等(Proc.Natl Acad Sci,USA,86:3833(1989))所描述。基于V基因序列，然后可以设计并且构建人源化抗体，如由Leung等(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所述。

可以通过一般分子克隆技术从产生鼠类抗体的任何已知杂交瘤细胞系或经过转染的细胞系制备cDNA(Sambrook等人，Molecular Cloning,A laboratory manual,第二版(1989))。可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人,1989)或由Leung等人(BioTechniques,15:286(1993))描述的延伸引物组来扩增抗体的Vκ序列。V_H序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989)或Leung等人(Hybridoma,13:469(1994))所述的退火成鼠IgG恒定区的引物进行扩增。可如Leung等人(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所述通过组合长寡核苷酸模版合成和PCR扩增来构建人源化V基因。

可以将Vκ的PCR产物亚克隆进入阶段载体，如基于pBR327的阶段载体(VKpBR)，其含有Ig启动子、信号肽序列以及适宜的限制位点。V_H的PCR产物可亚克隆到类似阶段载体中，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和V_H序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并且分别连接到适当的表达载体中，如pKh和pG1g(Leung等人,Hybridoma,13:469(1994))。可以将表达载体共转染进入适当的细胞并且监测上清液中嵌合、人源化或人抗体的产生。或者，可切除Vκ和V_H表达盒并亚克隆至单一表达载体如pdHL2中，如由Gillies等人描述。(J.Immunol.Methods 125:191(1989)并且也示于Losman等人，Cancer,80:2660(1997)中)。

在一替代实施方案中，可将表达载体转染至已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；其各自的实施例部分以引用方式并入本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增所转染的基因序列并且预先适应无血清细胞系以供蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。

抗体片段

可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab')₂、Fab'、F(ab)₂、Fab、Fv、scFv等。F(ab')₂片段可通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生，而Fab'片段可通过还原F(ab')₂片段的二硫键桥而产生。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速且容易地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab'片段。可通过抗体的木瓜蛋白酶消化来产生F(ab)₂片段。

单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合形成靶标结合位点。这两个结构域由肽连接子(L)进一步共价连接。用于制造scFv分子和设计合适肽连接子的方法描述于美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；Raag和Whitlow,FASEB9:73-80(1995)以及Bird和Walker,TIBTECH,9:132-137(1991)中。

产生单结构域抗体(DAB或VHH)的技术也在此项技术中已知的，如例如在以引用方式并入本文的Cossins等人(2006,Prot Express Purif 51:253-259)中所公开。可以例如采用标准免疫技术从骆驼、羊驼或美洲驼中获得单结构域抗体。(参见例如Muyldermans等人，TIBS26:230-235,2001；Yau等人，J Immunol Methods 281:161-75,2003；Maass等人，JImmunol Methods 324:13-25,2007)。该VHH可以具有强大的抗原结合能力，并可以与常规VH-VL对所不可及的新表位相互作用。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG含有约50％仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。羊驼可用已知抗原(如TNF-α)免疫并且可分离结合并中和靶抗原的VHH(Maass等,2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并可以将其用来构建羊驼VHH噬菌体呈现文库，可利用所述文库通过本领域熟知的标准生物淘选技术(Maass等人，2007)分离抗体片段。在某些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可用于要求保护的组合物和方法中。

抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或者在大肠杆菌或另一种宿主中表达编码片段的DNA来制备。可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得抗体片段。这些方法由例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647和其中包含的参考文献来描述。还参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959),Edelman等人，于METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)，和Coligan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。

抗体同种异型

治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性反应的持续时间减少相关(Baert等人，2003,N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可以部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等人，2011,Genes and Immunity 12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变化相关。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976,J Immunol 117:1056-59)。

对于常见的IgG1人抗体而言，最普遍的同种异型是G1m1(Stickler等,2011,Genesand Immunity 12:213-21)。然而，G1m3同种异型也常常发生于白种人中(Stickler等人，2011)。已经报道了当向非G1m1(nG1m1)受体(如G1m3患者)施用时，G1m1抗体含有倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(Stickler等人，2011)。非G1m1同种异型抗体在施用至G1m1患者时并不同样具有免疫原性(Stickler等人，2011)。

人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型两者均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且该同种异型有时称为DEL和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO：85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：86)，显示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。

利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO：85)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K

维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO：86)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVETVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWENGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Jefferis和Lefranc(2009，mAb 1：1-7)综述了作为IgG同种异型的序列变化特征和其对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同种异型中的Kabat 214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变异体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道了κ轻链恒定区中的同种异型变异体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1，2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。

对于治疗性抗体而言，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是用于治疗多种血液恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病的针对抗CD20的人源化和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(G1m17,1)是DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat位置214(重链CH1)上具有额外序列变化。已经报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人，2009,J Clin Oncol 27:3346-53；Goldenberg等人，2009,Blood 113:1062-70；Robak&Robak,2011,BioDrugs 25:13-25)，这种作用已经被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM与DEL同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的更低免疫原性。

表1.利妥昔单抗对维妥珠单抗的同种异型

为了减小治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，需要选择的抗体同种异型对应于G1m3同种异型，其特征在于Kabat 214上的精氨酸；和nG1m1,2无效同种异型，其特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，发现重复皮下施用G1m3抗体经过很长一段时间并不会导致明显的免疫应答。在替代实施方案中，与G1m3同种异型一样的人IgG4重链具有Kabat 214上的精氨酸、Kabat 356上的谷氨酸、Kabat 359上的甲硫氨酸以及Kabat 431上的丙氨酸。因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。G1m3IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可以是对治疗性施用有用的。

已知的抗体

靶抗原和示例性抗体

在一个优选实施方案中，使用能识别和/或结合至抗原的抗体，该抗原以高水平表达于靶细胞上并且主要或仅表达于患病细胞上而非正常组织上。用于例如癌症治疗的示例性抗体包括但不限于LL1(抗-CD74)、LL2或RFB4(抗-CD22)、维妥珠单抗(hA20、抗-CD20)、利妥昔单抗(抗-CD20)、奥妥珠单抗(GA101、抗-CD20)、兰利珠单抗(抗-PD1)、尼鲁单抗(抗-PD1)、MK-3475(抗-PD1)、AMP-224(抗-PD1)、皮地珠单抗(抗-PD1)、MDX-1105(抗-PD-L1)、MEDI4736(抗-PD-L1)、MPD13280A(抗-PD-L1)、BMS-936559(抗-PD-L1)、伊匹单抗(抗-CTLA4)、曲维珠单抗(抗-CTL4A)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1，也被称为TROP-2))、PAM4或KC4(均为抗-粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也被称为CD66e或CEACAM5)、MN-15或MN-3(抗-CEACAM6)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu 31(抗-甲胎蛋白)、R1(抗-IGF-1R)、A19(抗-CD19)、TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗-PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗-PSMA二聚体)、D2/B(抗-PSMA)、G250(抗-碳酸酐酶IX MAb)、L243(抗-HLA-DR)阿伦单抗(抗-CD52)、贝伐单抗(抗-VEGF)、西妥昔单抗(抗-EGFR)、吉姆单抗(抗-CD33)、替伊莫单抗(抗-CD20)；帕尼单抗(抗-EGFR)；托西莫单抗(抗-CD20)；PAM4(克里伏单抗，抗粘蛋白)、BWA-3(抗-组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗-组蛋白H3)、MRA12(抗-组蛋白HI)、PR1-1(抗-组蛋白H2B)、LG 11-2(抗-组蛋白H2B)、LG2-2(抗-组蛋白H2B)以及曲妥单抗(抗-ErbB2)。这类抗体在本领域中为已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；和美国专利申请公布号20050271671；20060193865；20060210475；20070087001；其实施例部分各自以引用方式并入本文。)有用的具体已知的抗体包括hPAM4(美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专利号7,109,304)、hIMMU-31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号7,387,773)、hL243(美国专利号7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，其保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)和D2/B(WO2009/130575)，关于附图和实施例部分，每一个列举的专利或申请的文本以引用的方式并入本文。

可以使用所描述的缀合物靶向的其他可用抗原包括碳酸酐酶IX、B7、CCCL19、CCCL21、CSAp、HER-2/neu、BrE3、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20(例如，C2B8、hA20、1F5MAbs)、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、CTLA4、甲胎蛋白(AFP)、VEGF(例如，

纤连蛋白剪接变异体)、ED-B纤连蛋白(例如，LI9)、EGP-1(TROP-2)、EGP-2(例如，17-1A)、EGF受体(ErbB1)(例如，

)、ErbB2、ErbB3、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、Ga 733、GRO-β、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF)、HM1.24、HER-2/neu、胰岛素样生长因子(ILGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、IGF-1R、Ia、HM1.24、神经节苷脂、HCG、L243结合的HLA-DR抗原、CD66抗原即CD66a-d或其组合、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、胎盘生长因子(P1GF)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA、PAM4抗原、PD1受体、NCA-95、NCA-90、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、间皮素、S100、腱生蛋白、TAC、Tn抗原、托马斯-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、肿瘤血管生成抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、TROP-2、VEGFR、RANTES、T101以及癌症干细胞抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5以及致癌基因产物。

如通过流式细胞术所示并且可作为选择免疫疗法的合适抗体的指导的造血恶性细胞上的合适抗原(群集指定，或CD)靶标的综合分析是于2008年1月15日在线预公布的Craig和Foon,Blood；DOL10.1182/Blood-2007-11-120535。

CD66抗原由分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和CEA编码的具有类似结构的五种不同糖蛋白CD66a-e组成。这些CD66抗原(例如，CEACAM6)主要表达于粒细胞、消化道的正常上皮细胞和各种组织的肿瘤细胞中。合适的癌症靶标还包括癌症睾丸抗原，如NY-ESO-1(Theurillat等人，Int.J.Cancer 2007；120(11):2411-7)，以及骨髓性白血病(Kozlov等人，Cancer Genet.Cytogenet.2005；163(1):62-7)以及B-细胞疾病中的CD79a，和非霍奇金氏淋巴瘤的CD79b(Poison等人，Blood 110(2):616623)。许多前述抗原公开于2002年11月15日提交的名称为“Use of Multi-specific,Non-covalent Complexesfor Targeted Delivery of Therapeutics”的美国临时申请序号60/426,379中。归于治疗抗性更大的前体恶性细胞群体(Hill and Perris,J.Natl.Cancer Inst.2007；99:1435-40)的癌症干细胞具有在某些癌症类型中可靶向的抗原，诸如前列腺癌中(Maitland等人，Ernst Schering Found.Sympos.Proc.2006；5:155-79)、非小细胞肺癌(Donnenberg等人，J.Control Release 2007；122(3):385-91)和成胶质细胞瘤(Beier等人，CancerRes.2007；67(9):4010-5)中的CD133，和结直肠癌(Dalerba等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2007；104(24)10158-63)、胰腺癌(Li等人，Cancer Res.2007；67(3):1030-7)和头颈部鳞状细胞癌(Prince等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007；104(3)973-8)中的CD44。

抗癌症抗体已经显示在一些情况下结合于组蛋白。Kato等人(1991,HumAntibodies Hybridomas 2:94-101)报告了肺癌特异性人类单克隆抗体HB4C5结合至组蛋白H2B。Garzelli等人.(1994,Immunol Lett 39:277-82)观察到经过埃-巴二氏病毒转化的人B淋巴细胞产生针对组蛋白的天然抗体。在某些实施方案中，针对组蛋白的抗体可用于目标组合中。已知的抗组蛋白抗体包括但不限于BWA-3(抗-组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗-组蛋白H3)、MRA12(抗-组蛋白H1)、PR1-1(抗-组蛋白H2B)、LG11-2(抗-组蛋白H2B)以及LG2-2(抗-组蛋白H2B)(参见，例如，Monestier等人,1991,Eur J Immunol 21:1725-31；Monestier等人,1993,Molec Immunol 30:1069-75)。

对于多发性骨髓瘤疗法，已经描述针对例如CD38和CD138(Stevenson,Mol Med2006；12(11-12):345-346；Tassone等人，Blood 2004；104(12):3688-96)、CD74(Stein等人，ibid.)、CS1(Tai等人，Blood 2008；112(4):1329-37和CD40(Tai等人，2005；CancerRes.65(13):5898-5906)的合适的靶向抗体。

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和细胞凋亡的重要调节因子。已经报告CD74是MIF的内源性受体(Leng等人，2003,J Exp Med 197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗效果可用于治疗多种疾病状态，诸如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌以及慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等人,2004,BMC Cancer 12:34；Shachar&Haran,2011,LeukLymphoma 52:1446-54)。米拉珠单抗(hLL1)是用于治疗MIF介导疾病的治疗用途的示例性抗-CD74抗体。

最优选抗体/抗原对的实例是LL1，抗-CD74MAb(不变链，II类-特异性伴侣蛋白，Ii)(参见，例如，美国专利号6,653,104；7,312,318；其各自的实施例部分以引用方式并入本文)。CD74抗原高度表达于B-细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T-细胞淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、胶质母细胞瘤和某些其他癌症中(Ong等人，Immunology98:296-302(1999))。在癌症中使用CD74抗体的综述包含于Stein等人，Clin CancerRes.2007年9月15日；13(18Pt2):5556s-5563s中，其以引用方式并入本文。优选地用抗-CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏疾病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。

在各种实施方案中，要求保护的方法和组合物可利用在本领域中已知的各种抗体中的任何一种。有用的抗体可从许多已知来源商业上获得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得。针对包括但不限于肿瘤相关抗原的各种疾病靶标的大量抗体已经保藏在ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可用于要求保护的方法和组合物中。参见，例如，美国专利号7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040；6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文中。这些只是示例性的并且多种其他抗体和其杂交瘤在本领域中为已知的。本领域技术人员将认识到针对几乎任何疾病相关联抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤细胞可通过针对所关注的选定疾病相关联靶标的抗体来简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库而获得。所克隆抗体的抗原结合结构域可使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、连接至表达载体中、转染至适应宿主细胞中以及用于蛋白质产生(参见例如美国专利号7,531,327；7,537,930；7,608,425和7,785,880，其实施例部分以引用方式并入本文)。

在其他实施方案中，抗体复合物结合至MHC I类、MHC II类或辅助分子，如CD40、CD54、CD80或CD86。抗体复合物也可结合至白细胞活化细胞因子，或细胞因子介体，如NF-κB。

在某些实施方案中，两个不同的靶标中的一个可以是癌细胞受体或癌症相关抗原，特别选自以下的抗原：B细胞系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGF、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盘生长因子(PlGF)、腱生蛋白、HER-2/neu、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM1、CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘连分子6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、结肠特异性抗原-p(CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰岛素样生长因子(IGF)和IGF受体、KS-1、Le(y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Prl、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、S100、T101、TAC、TAG72、TRAIL受体以及碳酸酐酶IX。

免疫缀合物

在某些实施方案中，抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂和/或诊断剂缀合。治疗剂不需要相同，而是可不同，例如药物和放射性同位素。举例来说，¹³¹I可并入抗体或融合蛋白质的酪氨酸中并且药物连接至赖氨酸残余物的ε氨基。治疗剂和诊断剂还可连接至例如经过还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制造治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白质的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中为已知的并且可利用任何这类已知方法。

治疗剂或诊断剂可以通过二硫键的形成而连接在还原抗体组分的铰链区。替代地，此类试剂可使用异双官能交联剂(如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等人，Int.J.Cancer 56:244(1994)。用于此类缀合的一般技术是本领域中众所周知的。参见例如，Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press1991)；Upeslacis等,"Modification of Antibodies by Chemical Methods,"MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等人(编著)，第187-230页(Wiley-Liss公司，1995)；Price,"Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,"MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION,Ritter等人(编著),第60-84页(Cambridge University Press 1995)。替代地，可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分缀合治疗剂或诊断剂。碳水化合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同治疗剂或诊断剂。

经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Shih等人，Int.J.Cancer 41:832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46:1101(1990)；和Shih等人美国专利号5,057,313，其通过引用方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能的载体聚合物反应。此反应产生初始希夫碱(亚胺)键联，其可通过还原成仲胺而稳定以形成最终缀合物。

在免疫缀合物的抗体组分是抗体片段的情况下可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154:5919(1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995),Leung等人，美国专利号6,254,868，这些文献均以引用方式整体并入本文。使用经过工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。

在一些实施方案中，螯合剂可连接至抗体、抗体片段或融合蛋白质和用于螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合并使用螯合剂或其他配体来将金属连接至蛋白质的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，美国专利号7,563,433，其实施例部分以引用方式并入本文)。

在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有长尾部的试剂反应来连接至蛋白质或肽，该尾部可连接有多个螯合基团用于结合离子。这样的尾部可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，诸如聚赖氨酸、多糖或其他衍生化链或可衍生链，该螯合基团为，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。

螯合物可直接连接至抗体或肽，例如如美国专利4,824,659中公开，其以引用方式整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围为60keV至4,000keV的诊断同位素一起用于放射成像，该同位素为诸如¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹⁸F、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc、^94mTc、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁶Br。相同的螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时可用于MRI。如NOTA、DOTA以及TETA的巨环螯合剂可与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。本发明包括其他环类型的螯合物如大环聚醚，它们对于稳定地结合核素如用于RAIT的²²³Ra有价值。

最近，已经公开了用于PET扫描技术中的¹⁸F-标记方法，例如通过F-18与金属或其他原子如铝反应。¹⁸F-Al缀合物可与直接连接至抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向构建体的螯合基团，如DOTA、NOTA或NETA复合。这类F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，其实施例部分以引用方式并入本文。

在特定优选实施方案中，免疫缀合物可以是抗体-药物缀合物(ADC)。用于ADC生产中的两种示例性药物是SN-38和前药形式的2-吡咯啉并阿霉素(P2PDox)。产生SN-38-缀合的ADC的组合物和方法在例如美国专利号7,999,083；8,080,250；8,741,300；8,759,496中有所公开，这些专利中每个的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。产生P2PDox ADC的组合物和方法在例如美国专利号8,877,101中有所公开，这些专利的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。

产生双特异性抗体的方法

在各种实施方案中，目标组合疗法可以利用一种或多种双特异性抗体(bsAb)，诸如白细胞重定向bsAb。如本文中所使用的双特异性抗体是含有针对两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同表位的结合位点的抗体。尽仅可结合至单一抗原上的单一表位的抗体是单特异性的，不考虑抗体分子上的抗原结合位点数目。

双特异性抗体构建的早期尝试利用化学交联或杂合杂交瘤或四价体瘤以便将两种不同的抗体的两半接合在一起(例如，Staerz等人，1985,Nature 314:628-31；Milstein和Cuello,Nature 1983；305:537-540；Karpovsky等人，1984,J Exp Med 160:1686-701)。虽然这些技术用于制造bsAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标bsAb、低产率、生产费用等。

最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一bsAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNL^TM的基元的异源二聚(Chames&Baty,2009,Curr Opin Drug Discov Devel 12:276-83；Chames&Baty,mAbs1:539-47)。

三功能单抗(Triomab)是四价体瘤方法的变化形式，与大鼠/大鼠或小鼠/小鼠四价体瘤中常见的随机配对相比，其使用小鼠IgG2a与大鼠IgG2b抗体的组合以优先产生重组抗体(Chames&Baty,mAb1:539-47)。由此技术产生的抗-CD3x抗-EpCAM bsAb(卡妥索单抗)能够有效地征募巨噬细胞和NK细胞且活化T细胞(Chames&Baty,mAbs 1:539-47)。如上文所论述，欧洲已批准卡妥索单抗用于治疗EpCAM阳性癌瘤患者的恶性腹水(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。令人惊讶的是，据报告重组bsAb在人类中仅诱导中度抗小鼠和抗大鼠反应(Chames&Baty,mAbs 1:539-47)，大概至少部分是由于腹膜腔内施用于腹水的途径。厄妥索单抗是靶向HER2的另一种三功能单抗，其可用于转移性乳腺癌。Bi20是靶向CD20的另一种三功能单抗。在体外，Bi20展现来自CLL患者的B细胞的有效溶解(Chames&Baty,mAbs 1:539-47)。

是指由短肽连接子接合的串联scFv(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。布利莫单抗是抗-CD19x抗-CD3

，其在极低浓度下在诸如非霍奇金氏淋巴瘤和ALL的血液学癌症中具有所报告的效力(Nagorsen等人,2009,Leukemia&Lymphoma 50:886-91；Chames&Baty,mAbs 1:539-47；Topp等人，2012,Blood 120:5185-87；Bargou等人,2008,Science 321:974-77)。对EpCAM具有特异性的另一种

已经用于胃肠癌、卵巢癌、结肠直肠癌以及肺癌(Amann等人,2009,J Immunother 32:452-64；Chames&Baty,mAbs 1:539-47)。已经提出靶向CEACAM5的另一种

(MEDI-565)用于黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌和乳腺癌(Sanders等人,1994,J Pathol 172:343-8)。已经报告了

在皮摩尔或甚至飞摩尔浓度下展现抗肿瘤活性(Chames&Baty,mAbs 1:539-47)。

涉及组装来源于两种不同的之前存在的抗体的两个重链和两个轻链的另一种bsAb形成方法是基于钮入穴法(knobs-into-holes)，其有助于异源二聚体形成且防止同源二聚体形成(Schaefer等人,2011,ProcNatl.Acad SciUSA 108:11187-92)。“CrossMab”技术进一步涉及交换双特异性抗体中一半的Fab内的重链和轻链结构域，从而产生两个不同所以不会发生轻-重链错配的臂(Schaefer等人,2011)。钮入穴法将具有庞大侧链的氨基酸引入一个重链的CH3结构域中，从而配合另一个重链的CH3结构域中适当设计的穴。方法组合预防重链与重链和重链与轻链相互作用错配，从而主要产生单一产物。所产生的针对血管生成素-2(Ang-2)和VEGF-A的最初CrossMab展现与亲本mAb相当的结合特征，具有强效的抗血管生成和抗肿瘤活性(Schaefer等人,2011,Proc Natl.Acad Sci USA 108:11187-92；Kienast等人,Clin Cancer Res，2013年10月25日，印刷前电子版)。

除上文所论述的DART^TM技术以外，其他bsAb产生方法包括四价IgG-scFv融合(Dong等人，2011,MAbs 3:273-88)；双作用Fab(DAF)抗体(Bostrom等人,2009,Science 323:1610-14)；Igg样双可变结构域抗体(DVD-Ig)(Wu等人,2007,Nat Biotechnol 25:1290-97)；和使用IgG4分子之间的动态交换(van der Neut Kolfschoten等人,2007,Science317:1554-57)。虽然优选以下所论述的DNL^TM技术用于形成白细胞重定向bsAb，但本领域技术人员应认识到，其他类型bsAb也可用于要求保护的方法和组合物中。

DOCK-AND-LOCK^TM(DNL^TM)

在一些实施方案中，单独或另外复合至一种或多种效应因子如细胞因子的双特异性抗体形成为DOCK-AND-LOCK^TM(DNL^TM)复合物(参见，例如，美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,901,680；7,906,118；7,981,398；8,003,111，其实施例部分各自以引用方式并入本文。)通常，该技术利用了在cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA)调节(R)亚单位的二聚化和对接结构域(DDD)序列与来源于多种AKAP蛋白中任一种的锚定结构域(AD)序列之间发生的特异性和高亲和性结合相互作用(Baillie等人,FEBSLetters.2005；579:3264.Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5:959)。DDD和AD肽可连接至任何蛋白质、肽或其他分子。因为DDD序列自发二聚化并结合至AD序列，所以该技术允许在可连接至DDD或AD序列的任何选定分子之间形成复合物。

虽然标准DNL^TM复合物包括的两个DDD连接至一个AD连接的分子的三聚体，但是复合结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他多聚体。在一些实施方案中，DNL^TM复合物可包括结合至同一抗原决定子或两个或更多个不同抗原的两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白质。DNL^TM复合物还可包括一种或多种其他效应因子，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白质、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂或任何其他分子或聚合体。

1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在受到最彻底研究的由第二信使cAMP结合R亚单位而触发的信号转导途径之一中起关键作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243:3763)。全酶的结构由两个通过R亚单位保持为非活性形式的催化亚单位组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989；264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚单位(RI和RII)，并且每种类型具有α和β同种型(Scott,Pharmacol.Ther.1991；50:123)。因此，PKA调控亚单位的四个同种型是RIα、RIβ、RIIα和RIIβ，其各自包括DDD部分氨基酸序列。R亚单位仅分离为稳定二聚体并且显示二聚化结构域由RIIα的前44个氨基端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6:222)。如下论述，其他调控亚单位的氨基酸序列的类似部分涉及二聚化和对接，其分别位于调控亚单位的N-末端附近。cAMP结合R亚单位造成用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚单位释放，该活性催化亚单位通过PKA的区室化经由其与AKAP对接而面向所选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。

自从1984年表征了第一种AKAP(微管相关的蛋白质-2)(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81:6723)，已在酵母至人范围内的物种中鉴定出具有多样性结构的多于50种AKAP，其定位至各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体以及内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5:959)。AKAP中针对PKA的AD是具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266:14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间十分不同，其中针对RII二聚体所报导的结合亲和力在2至90nM范围内(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003；100:4445)。AKAP仅结合二聚R亚单位。对于人RIIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott,Trends CellBiol.1999；6:216)。因此，人RIIα的二聚化域和AKAP结合域两者均位于同一N-末端的44个氨基酸序列内(Newlon等人,Nat.Struct.Biol.1999；6:222；Newlon等人,EMBO J.2001；20:1651)，其在本文中称为DDD。

我们已发展出一种平台技术，其利用人PKA调控亚单位的DDD和AKAP的AD作为一对优良的连接子模块用于对接任何两个实体(在下文称为A与B)于非共价复合物，该复合物可通过在DDD与AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为DNL^TM复合物。该途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建实体A，产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a₂构成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，产生下文称为b的第二组分。a₂中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点，由此促进a₂与b容易地缔合形成由a₂b构成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后经由二硫桥共价固定两个实体的反应而加以稳定，这基于有效局部浓度的原则而非常有效地发生，因为初始的结合相互作用会使置于DDD和AD两者上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001；98:8480)从而位点特异性地连接。通过使用连接子、衔接子模块和前体的各种组合，可产生并使用不同化学定量关系的各种各样的DNL^TM构建体(参见例如U.S.No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400。

通过远离两个前体的官能团连接DDD和AD，还预期所述位点特异性连接将保留两个前体的原始活性。此方法在本质上是模块化的并且可能应用于位点特异性共价连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其他效应子部分。利用构建以下实施例中所述的AD和DDD缀合效应子的融合蛋白法，实际上可将任何蛋白质或肽并入DNL^TM构建体中。然而，该技术并不具限制性并且可利用其他缀合方法。

已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将该双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL，第2版,1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员将认识到，AD或DDD部分与效应子部分的连接位点可根据效应子部分的化学性质和效应子部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应子部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行，如使用二价交联试剂和/或其他化学缀合技术。

Dock-and-Lock^TM(DNL^TM)技术用于产生不同格式的多种复合物(Rossi等人，2012,Bioconjug Chem 23:309-23)。通过将与二聚化和对接结构域(DDD)融合的经稳定的(Fab)₂与含有附接于每个重链C-末端的锚定结构域(AD)的IgG组合(C_H3-AD2-IgG)来构建基于维妥珠单抗(抗-CD20)和依帕珠单抗(抗-CD22)的双特异性六价抗体(bsHexAb)(Rossi等人，2009,Blood 113,6161-71)。与其亲本mAb的混合物相比，这些基于Fc的bsHexAb，以下称为“Fc-bsHexAb”，诱导独特信号转导事件(Gupta等人，2010,Blood 116:3258-67)，并且在体外展示有效的细胞毒性。然而，Fc-bsHexAb从小鼠循环中清除的速率比亲本mAb快大约两倍(Rossi等人，2009,Blood 113,6161-71)。虽然Fc-bsHexAb离体高度稳定，但是在体内可能发生一定程度的解离，例如通过细胞内加工。此外，Fc-bsHexAb缺乏CDC活性。

基于Fc的免疫细胞因子还已组装成DNL^TM复合物，其包含融合至C_H3-AD2-IgG Fc的C-末端的二或四分子的干扰素-α2b(IFNα2b)(Rossi等人，2009,Blood 114:3864-71；Rossi等人，2010,Cancer Res 70:7600-09；Rossi等人，2011,Blood 118:1877-84)。Fc-IgG-IFNα维持接近于重组IFNα的高特异性活性、并且在体外和在体内对抗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)异种移植物显著有效。Fc-IgG-IFNα在小鼠中的T_1/2长于PEG化的IFNα，但为亲本mAb的一半长。与Fc-bsHexAb相似，Fc-IgG-IFNα在体内随着时间的推移而解离并且展示降低的CDC，但是ADCC增强。

AD和DDD部分中的结构功能关系

对于不同类型的DNL^TM构建体，可利用不同AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。

DDD1

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)

DDD2

CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO；2)

AD1

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID No：3)

AD2

CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：4)

熟练的技术人员将认识到，DDD1和DDD2是基于蛋白激酶A的人RIIα同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如以下DDD3、DDD3C和AD3所例示。

DDD3

SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：5)

DDD3C

MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：6)

AD3

CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：7)

在其它替代实施方案中，在DNL^TM复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的其它序列变异体。例如，人PKADDD序列仅存在四种变异体，对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKA DDD序列示于下文。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(注意DDD1的序列相对人PKARIIα DDD部分稍有改变。)

PKA RIα

SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQ ID NO：8)

PKA RIβ

SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO：9)

PKA RIIα

SHIQIPPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO：10)

PKA RIIβ

SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO：11)

已对AD和DDD结构域的结构功能关系进行了研究。(参见，例如，Burns-Hamuro等人，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001，J Biol Chem 276：17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，Biochem.J 396：297-306；Stokka等人，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等人，2006，MolCell24：383-95；Kinderman等人，2006，MolCell24：397-408，这些文献的整个正文以引用的方式并入本文。)

例如，Kinderman等人(2006，Mol Cell 24：397-408)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人DDD序列含有许多在二聚体形成或AKAP结合重要的保守氨基酸残基，在下面SEQ ID NO：1中加下划线标出。(参见Kinderman等，2006的图1，以引用的方式并入本文)。熟练技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)

如以下更详细论述，已对于二十个常见L-氨基酸中的每一种表征保守氨基酸取代。因此，基于Kinderman(2006)的数据和保守氨基酸取代，基于SEQ ID NO：1的潜在替代性DDD序列示于表2。在制定表2中，仅考虑高度保守氨基酸取代。举例来说，带电残基仅取代相同电荷的残基，具有较小侧链的残基经类似大小的残基取代，羟基侧链仅经其他羟基取代等。因为脯氨酸对于氨基酸次级结构具有独特的效应，因此没有其他残基取代脯氨酸。有限数目的此类潜在替代DDD部分序列示于以下SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:31中。本领域技术人员将认识到DDD部分种类内的替代物质可通过标准技术来构建，例如使用市售肽合成器或熟知的定点诱变技术。氨基酸取代对于AD部分结合的效应还可通过标准结合测定容易地确定，例如，如Alto等人(2003,Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50)中所公开。

表2.DDD1(SEQ ID NO:1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO:87。

THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)

SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)

SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：14)

SHINIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：15)

SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：16)

SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：17)

SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：18)

SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：19)

SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：20)

SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：21)

SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：22)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：23)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：24)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：25)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：26)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：27)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：28)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：29)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：30)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA(SEQ ID NO：31)

Alto等人(2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析，以设计被称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQ ID NO：3)，其对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列被设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在SEQ ID NO：3中加下划线示出。熟练技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对于DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。表3示出了AKAP-IS(AD1，SEQ ID NO：3)序列中的潜在保守氨基酸取代，类似于以上表2中的对于DDD1(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸取代。

有限数目的此类潜在替代性AD部分序列示于以下SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：49中。另外，基于Alto等人(2003)的数据，可能的AD部分序列种类内的其他物质可由熟练技术人员制备、测试并使用。应注意Alto(2003)的图2示出了可基于实际结合实验在保留对DDD部分的结合活性的同时进行的多个氨基酸取代，。

AKAP-IS

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)

表3.AD1(SEQ ID NO：3)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO：88。

NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：32)

QLEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：33)

QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：34)

QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)

QIEFLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：36)

QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：37)

QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：38)

QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：39)

QIEYVAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：40)

QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：41)

QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQ ID NO：42)

QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQ ID NO：43)

QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQ ID NO：44)

QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQ ID NO：45)

QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQ ID NO：46)

QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQ ID NO：47)

QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQ ID NO：48)

QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQ ID NO：49)

Gold等人(2006，Mol Cell 24：383-95)利用结晶学和肽筛选开发SuperAKAP-IS序列(SEQID NO：50)，其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代位置，该氨基酸取代增强与RIIα的DDD部分的结合。在此序列中，N-末端Q残基编号为第4号残基并且C-末端A残基为第20号残基。可进行取代以影响对RIIα的亲和性的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-ISAD部分序列来制备DNL^TM构建体。可用来取代AKAP-IS AD序列的其他替代序列示于SEQ ID NO：51-53中。相对于AKAP-IS序列的取代以下划线出示。预期如同SEQ ID NO：4中所示的AD2序列，AD部分还可包括额外N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。

SuperAKAP-IS

QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：50)

替代性AKAP序列

QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：51)

QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：52)

QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：53)

Gold等人的图2公开了来自以下所示的各种AKAP蛋白质的额外DDD结合序列。

RII-特异性AKAP

AKAP-KL

PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：54)

AKAP 79

LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：55)

AKAP-Lbc

LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：56)

RI-特异性AKAP

AKAPce

alyqfadrfselviseal(SEQ ID NO:57)

riad

leqvanqladqiikeat(SEQ ID NO:58)

pv38

feelawkiakmiwsdvf(SEQ ID NO:59)

双特异性AKAP

akap7

elvrlskrlvenavlkav(SEQ ID NO:60)

map2d

taeevsarivqwtaeav(SEQ ID NO:61)

dakap1

qikqaafqlisqvileat(SEQ ID NO:62)

Dakap2

lawkiakmivsdvmqq(SEQ ID NO:63)

Stokka等人(2006,Biochem J 400:493-99)也开发了AKAP结合PKA的肽竞争剂，其示于SEQ ID NO:64-66中。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ ID NO:64)、RIAD(SEQ ID NO:65)和PV-38(SEQ ID NO:66)。Ht-31肽对PKA的RII同种型显示较高亲和力，而RIAD和PV-38对RI显示较高亲和力。

Ht31

DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO:64)

RIAD

LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO:65)

PV-38

FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO:66)

Hundsrucker等人(2006,Biochem J 396:297-306)开发了AKAP与PKA结合的其他肽竞争剂，与PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等人的表1中，复制于下文表4中。AKAPIS代表一种合成RII亚单位结合肽。所有其他肽都来源于所指定AKAP的RII结合结构域。

表4.AKAP肽序列

肽序列

在下文通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO：35)以下划线显示在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基。残基与Alto等人(2003)所观察的相同，其中添加C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用方式并入本文。)对RII DDD序列有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的那些序列。

AKAP-IS

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)

Carr等人(2001，J Biol Chem 276：17332-38)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度，并且鉴别出DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。这些残基在下文通过参考SEQ ID NO：1的人PKA RIIαDDD序列以下划线示出。特别保守的残基进一步以斜体表示。残基与Kinderman等人(2006)提出的对于结合AKAP蛋白质至关重要的那些残基重叠但是不相同。熟练的技术人员将认识到，在设计DDD的序列变异体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体)，并且优选还避免改变保守残基(加下划线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)

基于Carr等人(2001)的数据，DDD1(SEQ ID NO：1)序列的一组修饰的保守氨基酸取代示于表5中。即使在这一组经取代序列有所减少的情况下，本领域技术人员也在不进行过度实验的情况下产生、测试并使用了超过65,000个可能的替代性DDD部分序列。熟练技术人员可容易获得此类替代DDD氨基酸序列，如以上公开于表2和表3。

表5.DDD 1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO：89。

熟练技术人员将认识到使用本领域中标准的技术以及仅常规的实验，DDD或AD氨基酸序列中的这些和其他氨基酸取代可用于产生AD或DDD部分种类内的替代物质。

氨基酸取代

在替代实施方案中，所公开的方法和组合物可涉及产生和使用具有一个或多个取代氨基酸残基的蛋白质或肽。举例来说，用于制备DNL^TM构建体的DDD和/或AD序列可如以上论述来修饰。

熟练技术人员应意识到，一般来说，氨基酸取代典型地涉及将氨基酸置换为具有相对类似性质的另一种氨基酸(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的性质和氨基酸取代对于蛋白质结构和功能的效应是在本领域中的广泛研究和知识的主题。

举例来说，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte&Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157:105-132)。氨基酸的相对亲水性质有助于蛋白质的次级结构合成，进而限定蛋白质与其他分子的相互作用。已经基于其疏水性和电荷特性来指定每一种氨基酸的亲水性指数(Kyte&Doolittle,1982)，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。在进行保守取代中，使用其亲水性指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内是更优选的，并且在±0.5内甚至是更优选的。

氨基酸取代还可考虑到氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号4,554,101)。已指定这些氨基酸残基的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。将氨基酸置换为具有类似亲水性的其他氨基酸是优选的。

其他考虑因素包括氨基酸侧链的大小。举例来说，用紧凑侧链(如甘氨酸或丝氨酸)、用具有庞大侧链的氨基酸(例如，色氨酸或酪氨酸)来置换氨基酸总体上并非优选的。还考虑了各种氨基酸残基对于蛋白质次级结构的效应。通过实验研究，已经确定不同的氨基酸残基对于蛋白质结构域采用α-螺旋、β-薄片或反转次级结构的倾向性的效应并且在本领域中是已知的(参见，例如，Chou&Fasman,1974,Biochemistry,13:222-245；1978,Ann.Rev.Biochem.,47:251-276；1979,Biophys.J.,26:367-384)。

基于此类考虑因素和广泛实验研究，已经构建了保守氨基酸取代的表格且在本领域中是已知的。举例来说：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。替代地:Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gin、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gin；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gin(Q)glu、asn；Glu(E)gin、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gin、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gin、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。

氨基酸取代的其他考虑因素包括是否残基位于蛋白质内部或是暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见，例如PROWL网站rockefeller.edu)对于溶剂暴露残基，保守取代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已经构建了有助于选择氨基酸取代的各种矩阵，如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。

在确定氨基酸取代中，还可考虑分子间或分子内键的存在，如形成带正电荷的残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷的残基(例如，Asp、Glu)之间的离子键(盐桥)或相邻半胱氨酸残基之间的二硫键。

将任何氨基酸取代为所编码的蛋白质序列中的任何其他氨基酸的方法对于熟练技术人员是熟知的并且实际上是常规实验，例如通过定点诱变技术或合成并组装编码氨基酸取代的寡核苷酸并且剪接至表达载体构建体中。

治疗剂

在替代实施方案中，可使用治疗剂如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其他药剂，其与目标bsAb、ADC和/或抗体缀合，或在bsAb、ADC和/或抗体之前、同时或之后个别地施用。所使用的药物可具有选自由以下组成的组的药学性质：抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷基化剂、抗代谢物剂、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂和其组合。

有用的示例性药物可以包括但不限于：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定(aplidin)、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、坎托替康(camptothecan)、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、埃罗替尼、雌氮芥、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟脲苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替比(ganetespib)、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉利司、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC的水溶液形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839。

所使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如豹蛙酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。

有用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β以及IP-10。

在某些实施方案中，可以使用抗血管生成剂，如血管抑素、杆抑素(baculostatin)、血管能抑素；乳腺丝抑蛋白；抗VEGF抗体；抗PlGF肽和抗体；抗血管生长因子抗体；抗Flk-1抗体；抗Flt-1抗体和肽；抗Kras抗体；抗-cMET抗体；抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体；层粘连蛋白肽；纤连蛋白肽；纤溶酶原激活物抑制剂；组织金属蛋白酶抑制剂；干扰素；白介素-12；IP-10；Gro-β；血小板反应蛋白；2-甲氧基雌二醇；增殖蛋白相关的蛋白质；羧胺三唑；CM101；马立马司他；戊聚糖多硫酸盐；血管生成素-2；干扰素-α；除莠霉素A；PNU145156E；16K催乳素片段；利诺胺(罗喹美克)；沙利度胺；己酮可可碱；染料木黄酮；TNP-470；内皮抑素；紫杉醇；蛇毒解离素(accutin)；血管抑素；西多福韦；长春新碱；博来霉素；AGM-1470；血小板因子4或米诺环素。

所使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别有用的是：淋巴细胞毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，如白介素(IL)；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ；以及干细胞生长因子，如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。细胞因子中包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)以及促黄体激素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关的肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞生长素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT。

有用的放射性核素包括但不限于-¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³³P、⁴⁷Sc、¹¹¹Ag、⁶⁷Ga、¹⁴²Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、²¹²Pb、²²³Ra、²²⁵Ac、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁹Mo、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁶⁹Er、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹Pb以及²²⁷Th。治疗性的放射性核素优选具有在20keV至6,000keV范围内的衰变能量，针对俄歇(Auger)发射体，优选地在60keV至200keV范围内；针对β发射体，在100keV至2,500keV范围内；以及针对α发射体，在4,000keV至6,000keV范围内。适用β粒子发射核素的最大衰变能优选为205,000keV，更优选为100keV-4,000keV，并且最优选为500keV-2,500keV。实质上随俄歇发射粒子衰变的放射性核素也是优选的。举例来说，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的发射β粒子的核素的衰变能量优选地<1,000keV，更优选地<100keV，并且最优选地<70keV。实质上随着α粒子产生而衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000keV-10,000keV，更优选为3,000keV-8,000keV，并且最优选为4,000keV-7,000keV。额外的潜在可用放射性同位素包括¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁵Br、¹⁹⁸Au、²²⁴Ac、¹²⁶I、¹³³I、⁷⁷Br、^113mIn、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁰⁵RU、¹⁰⁷Hg、²⁰³Hg、^121mTe、^122mTe、^125mTe、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁹⁷Pt、¹⁰⁹Pd、¹⁰⁵Rh、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁹⁹Au、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵¹Cr、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、²⁰¹T1、²²⁵Ac、⁷⁶Br、¹⁶⁹Yb等。一些可用的诊断核素可包括¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu,⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁴Tc、^94mTc、^99mTc或¹¹¹In。

治疗剂可以包括光活性剂或染料。荧光组合物(如荧光染料)和其他色原体或染料(如对可见光敏感的卟啉)已经通过将适合的光引导至损伤而用来检测并治疗损伤。在治疗中，这已经被称为光辐射、光照疗法或光动力学疗法。参见Jori等人(编),PHOTODYNAMICTHERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto1985)；van den Bergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外，已经将单克隆抗体与光活化的染料偶联用于实现光照疗法。参见Mew等人，J.Immunol.(1983),130:1473；同上Cancer Res.(1985),45:4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744；同上Photochem.Photobiol.(1987),46:83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471；Tatsuta等人，LasersSurg.Med.(1989),9:422；Pelegrin等人，Cancer(1991),67:2529。

其他适用治疗剂可包括寡核苷酸，尤其优选地针对致癌基因和致癌基因产物如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式是siRNA。熟练技术人员将认识到任何siRNA或干扰RNA种类可以连接至抗体或其片段用于递送至靶向组织。针对多种靶标的许多siRNA物质在本领域中是已知的，并且在所要求保护的方法和组合物中可利用任何所述已知siRNA。

有可能使用的已知siRNA物质包括对以下具有特异性的那些：IKK-γ(美国专利7,022,828)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453)；CDC20(美国专利7,550,572)；转导蛋白(β)样蛋白3(美国专利7,576,196)；KRAS(美国专利7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利7,579,457)；补体组分3(美国专利7,582,746)；白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利7,592,443)；存活蛋白(美国专利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专利7,632,938)；MET原癌基因(美国专利7,632,939)；淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)(美国专利7,635,771)；IGF-1R(美国专利7,638,621)；ICAM1(美国专利7,642,349)；补体因子B(美国专利7,696,344)；p53(7,781,575)和载脂蛋白B(7,795,421)，各参考专利的实施例部分以引用的方式并入本文。

其他siRNA物质可从已知商业来源获得，如Sigma-Aldrich(St Louis,MO)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)、Ambion(Austin,TX)、Dharmacon(Thermo Scientific,Lafayette,CO)、Promega(Madison,WI)、Mirus Bio(Madison,WI)和Qiagen(Valencia,CA)以及许多其他来源。siRNA物质的其他可公开获得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、位于博得研究院的RNAi联合shRNA文库和位于NCBI的探针数据库。例如，在NCBI探针数据库中存在30,852种siRNA物质。熟练技术人员将认识到，对于任何目标基因，或者已对siRNA物质进行了设计，或者其可容易地使用可公开获得的软件工具进行设计。任何所述siRNA物质都可使用目标DNL^TM复合物进行递送。

治疗性治疗的方法

各种实施方案涉及治疗受试者，诸如哺乳动物，包括人、驯养或伴侣宠物，诸如犬和猫的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的细胞毒性剂和/或免疫调节剂的组合。

施用细胞毒性bsAb、ADC和/或检查点抑制剂抗体可补充以同时或依序施用治疗有效量的与靶细胞表面上的另一个抗原结合或反应的另一种抗体。优选额外MAb包括选自由以下组成的组的至少一种人源化、嵌合或人MAb：与CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、致癌基因产物或其组合发生反应的MAb。所使用的各种抗体，如抗CD19、抗CD20和抗CD22，为本领域的技术人员所已知。参见，例如，Ghctic等人，Cancer Res.48:2610(1988)；Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32:364(1991)；Longo,Curr.Opin.Oncol.8:353(1996)，美国专利号5,798,554；6,187,287；6,306,393；6,676,924；7,109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,501,498；7,612,180；7,670,804；以及美国专利申请公布号20080131363；20070172920；20060193865；以及20080138333，其实施例部分各自以引用方式并入本文。

组合疗法可进一步补充以同时或依序施用至少一种其他治疗剂。例如，“CVB”(1.5g/m²环磷酰胺、200mg/m²-400mg/m²依托泊苷和150mg/m²-200mg/m²亚硝脲氮芥)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.51:18(1993)。其他合适的组合化疗方案是本领域技术人员熟知的。参见例如Freedman等人，“Non-Hodgkin'sLymphomas,”CANCER MEDICINE,第2卷,第3版,Holland等人(编),第2028-2068版(Lea&Febiger 1993)。作为例子，用于治疗中度非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。适用第二代化学治疗方案为m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而适合第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其他适用药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。

治疗剂组合可根据已知方法进行配制以制备药学上可用的组合物，由此将bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体与药学上合适的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其他合适赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea&Febiger 1990)和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。

目标bsAb、ADC、干扰素和/或抗体可配制成用于通过例如推注或连续输注进行静脉内施用。优选地，bsAb、ADC和/或抗体输注持续少于约4个小时的时间，并且更优选持续少于约3个小时的时间。举例来说，第一推注可在30分钟，优选地甚至15分钟内输注，并且其余部分在后续2-3小时内输注。注射制剂可以呈单位剂型提供，例如，在安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。组合物可采用诸如于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液等形式，并且可含有配制剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，活性成分可呈在使用前用适合媒剂(例如无菌无热原质水)复原的粉末形式。

可以采用另外的药学方法控制治疗组合物的作用持续时间。可以通过使用聚合物以复合或吸附待施用的药剂来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-醋酸乙烯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology10:1446(1992)。从这类基质释放的速率取决于治疗剂的分子量、基质内的药剂的量以及分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55:163(1989)；Sherwood等人，同上。其他固体剂型描述于以下文献中：Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger 1990)和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES,第18版(MackPublishingCompany 1990)，及其修订版。

bsAb、干扰素和/或检查点抑制剂抗体还可皮下地或甚至通过其他肠胃外途径，如静脉内、肌肉内、腹膜内或血管内来施用至哺乳动物。ADC可以经静脉内、腹膜内或血管内施用。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。优选地，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体输注持续少于约4个小时的时间，并且更优选持续少于约3个小时的时间。

更一般来说，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。可能需要为接受者提供在约1mg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉输注的bsAb、ADC和/或抗体的剂量，但如情况需要也可以施用较低或较高的剂量。例如，对于70kg患者，1mg/kg-20mg/kg的剂量为70mg-1,400mg，或对于1.7-m患者，为41mg/m²-824mg/m²。需要时剂量可重复，例如每周一次持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中，需要时其还可以较低频率给予，如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。

替代地，bsAb、ADC和/或检查点抑制剂抗体可以按照每2周或3周一个剂量施用，总共重复至少3个剂量。或者，该组合可以每周施用2次，持续4至6周。如果使剂量降至约200mg/m²-300mg/m²(对于1.7-m患者为每剂340mg，或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。或者，给药时程可减少，即每2或3周一次持续2-3个月。然而已经确定，甚至可通过缓慢静脉内输注，根据重复给药循环施用甚至更高的剂量，如20mg/kg每周一次或每2-3周一次。给药时程可任选地以其他时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和时程进行适当调整下通过各种胃肠外途径给予。

本领域普通技术人员应认识到，尽管上文所论述的给药计划表是关于ADC、bsAb和/或mAb，但干扰素药剂应以实质上较低的剂量施用以避免系统毒性。干扰素(诸如PEGINTERFERON)用于人类的剂量更典型地在微克范围内，例如可以使用180μg皮下注射，每周一次，或100μg至180μg，或135μg，或135μg/1.73m²，或90μg/1.73m²，或250μg皮下注射，每隔一天一次，视干扰素类型而定。

尽管bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制剂抗体可以周期性推注形式施用，但在另选的实施方案中，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体可以通过连续输注来施用。为了增加Cmax并且延伸治疗剂在血液中的PK，连续输注可例如通过留置导管来施用。这类设备在本领域中为已知的，如

或

导管(参见，例如，Skolnik等人，Ther Drug Monit32:741-48,2010)并且可使用任何这类已知留置导管。各种连续输注泵在本领域中也是已知的并且可使用任何这类已知输注泵。连续输注的剂量范围可在0.1与3.0mg/kg/天之间。更优选地，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体可通过在2至5小时，更优选地2-3小时的相对较短周期内静脉内输注来施用。

在优选的实施方案中，药剂的组合对癌症的治疗是有用的。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。此类癌症的更特定实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。有益于本发明的治疗方法的癌症涉及表达、过表达或异常表达IGF-1R的细胞。

癌症或恶性病的其他实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃部癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发灶隐匿性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、转移性原发灶隐匿性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行迁移细胞癌、移行迁移肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤和位于以上所列出的器官系统中的除赘瘤以外任何其他过度增生性疾病。

本文描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状以及用于预防发展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些病症。指示此类用途在已知的或怀疑先前进展至瘤形成或癌症的病状中，具体来说，其中非瘤性细胞生长由过度增生、化生组成，或最具体来说，出现发育异常(针对此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell,BASIC PATHOLOGY.第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,第68-79页(1976))。

发育异常常常是癌症的前兆，并且主要发现于上皮中。其是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。可治疗的发育异常病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质结构不良、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。

可治疗的其他赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道异常增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病、农夫皮肤(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。

在优选实施方案中，使用本发明的方法抑制癌症，特别是上文所列癌症的生长、发展和/或转移。

其他过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性病和相关病症的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

表达载体

其他实施方案可涉及包括编码抗体、抗体片段、细胞因子或如DNL^TM构建体的bsAb组成融合蛋白质的核酸的DNA序列。融合蛋白质可包括连接至例如AD或DDD部分的抗体或片段或细胞因子。

各种实施方案涉及包括编码DNA序列的表达载体。载体可含有编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区和铰链区的序列，其可连接嵌合、人源化或人可变区序列。载体可另外含有在选定宿主细胞中表达所编码的蛋白质的启动子、增强子和信号或前导序列。尤其适用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地同种异型位置中的至少一个氨基酸更换成在不同IgG1同种异型中发现的氨基酸，并且其中任选地基于EU编号系统的EU的重链的氨基酸253可置换成丙氨酸。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63:78-85(1969)。在其他实施方案中，IgG1序列可转化成IgG4序列。

本领域技术人员将认识到基因工程化表达构建体并且插入宿主细胞中以表达工程化蛋白质的方法在本领域中是熟知的并且只需常规实验。宿主细胞和表达克隆抗体或片段的方法描述于例如美国专利号7,531,327、7,537,930、7,785,880、8,076,410、8,153,433和8,372,603中，其实施例部分各自以引用方式并入本文。

试剂盒

各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有如本文中所描述的一种或多种bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成通过消化道递送，如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其他途径递送试剂盒组分的装置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置是注射器，其用于将组合物注射至受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，治疗剂可以含有无菌、液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射笔形式提供。

试剂盒组分可包装于一起或分隔于两个或多个容器中。在一些实施方案中，容器可为容纳适于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有一种或多种适于复原和/或稀释其他试剂的缓冲液。可使用的其他容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装和保持于容器中。可以包括的另一种组件是提供给试剂盒使用者的说明书。

实施例

提供以下实施例来说明，但是不限制本发明的权利要求书。

实施例1.T-细胞重定向双特异性抗体DOCK-AND-LOCK^TM(DNL^TM)复合物

一些种类的示例性白细胞重定向双特异性抗体制备为DNL^TM复合物，如下所述。该复合物有效诱导针对适当靶细胞的免疫应答，该靶细胞包括但不限于Trop-2⁺癌细胞。

材料和方法

用于制备并使用DOCK-AND-LOCK^TM(DNL^TM)复合物的一般技术描述于以下实施例中。具有CD3和CD19的结合位点的示例性白细胞重定向双特异性抗体制备为DNL^TM复合物，其被称为(19)-3s(图1)。通过在Fd链的羧基末端的二聚化和对接结构域(DDD2)的重组融合来构建抗-CD19F(ab)₂DNL模块。在添加锚定结构域(AD2)的情况下从Okt3 mAb来设计抗-CD3-scFv模块，并且以格式V_H-L1-V_K-L2-6H-L3-AD2(公开为SEQ ID NO：105的“6H”)组装，其中经由柔性肽连接子来融合V结构域并且AD2肽前面是6-His连接子(SEQ ID NO：105)。抗-CD3可变区、连接子和AD2的序列如以下所示。

抗-CD3 scFv的V_H序列

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：96)

L1连接子

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：97)

抗-CD3 scFv的V_K序列

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO：98)

L2连接子

GGGGS(SEQ ID NO：99)

聚-His-L3连接子

HHHHHHGGGSG(SEQ ID NO：100)

AD2

CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：101)

表达载体和DNL^TM模块-构建包括连接至抗-CD3抗体部分的针对各种疾病相关联抗原的抗体部分的DNL^TM复合物，其一般缩写为(X)-3s bsAb。对于用于制备(X)-3s bsAb的每个DNL^TM模块，在SpESFX-10小鼠骨髓瘤细胞中开发独立生产细胞系(Rossi等人，2011，Biotechnol Prog 27：766-75)。合成编码Okt3scFv-AD2多肽的cDNA序列(SEQ ID NO：96-101)并且经由5’Xba I和3’Eag I限制位点来克隆至pdHL2表达载体中。构建体包含scFv中的V_L融合的V_H结构域，其具有结构V_H-L1-V_K-L2-6H-L3-AD2(公开为SEQ ID NO：105的“6H”)。所表达的蛋白质具有来自原始Okt3 mAb的两个氨基酸取代。将CDR-H3中的半胱氨酸残基变成丝氨酸(Kipryanov，1997，J Immunol Methods 200：69-77)。将V_L的倒数第二个残基从天冬氨酸变成赖氨酸。

将Okt3scFv-AD2模块与各种C_H1-DDD2-Fab模块组合以产生一组(X)-3s三价bsAb(表6)。如先前对于类似构建体所述来构建C_H1-DDD2-Fab-pdHL2表达载体(Rossi等人，2008，Cancer Res68：8384-92)。简单地说，通过用Sac II和Eag I限制酶切除C_H1-铰链-C_H2-C_H3域的编码序列并且置换成用相同酶从C_H1-DDD2-Fab-hA20-pdHL2表达载体(Rossi等人，2008，Cancer Res68：8384-92)上切下的C_H1-DDD2的507bp编码序列而由相应的IgG-pdHL2表达载体产生编码C_H1-DDD2-Fab的表达载体。C_H1-DDD2-Fab模块来源于人源化mAb hA19(抗-CD19)、拉贝珠单抗(hMN-14，抗-CEACAM5)、克里伏单抗(clivatuzumab)(hPAM4，抗-粘蛋白)、hMN-15(抗-CEACAM6)、hRS7(抗-TROP-2)、维妥珠单抗(hA20，抗-CD20)、hL243(抗-HLA-DR)和依帕珠单抗(hLL2，抗-CD22)。被称为hA19的mAb是由小鼠抗-CD19mAb B43人源化(Uckun等人，1988,Blood 71:13-29)。每个表达载体通过用Sal I限制酶消化来进行线性化并且用于通过电穿孔来转染SpESFX-10细胞。

在含有0.2μM甲氨喋呤(MTX)的培养基中选择克隆并且通过ELISA筛选蛋白质表达。将Okt3scFv-AD2捕获于Ni-NTA HisSorb板(Qiagen)上并且用抗-AD2mAb检测。用山羊-抗人-κ链捕获C_H1-DDD2-Fab模块并且用山羊-抗人-F(ab’)₂-HRP检测。通过逐步地增加MTX浓度直到3μM来扩增蛋白质表达的生产力。通过亲和色谱法，分别使用

和κ-选择树脂将Okt3scFv-AD2和C_H1-DDD2-Fab模块从滚瓶培养物的肉汤中纯化至均质。使用DNL^TM方法经由摩尔当量Okt3scFv-AD2和C_H1-DDD2-Fab模块的位点特异性缀合来组装(X)-3s bsAb。举例来说，通过将22mg Okt3scFv-AD2与80mg C_H1-DDD2-Fab-hA19组合来产生大约100mg(19)-3s。在室温下用1mM还原型谷胱甘肽将混合物还原过夜，然后添加2mM氧化谷胱甘肽。通过使用κ-选择和

的连续亲和色谱法从反应混合物中纯化(19)-3s。遵循类似方法，以不同规模来组装额外的(X)-3s构建体。

表6.(X)-3s DNL^TM构建体

分析方法-使用具有BIOSUITE^TM 250、4-μm UHR SEC柱的Alliance HPLC系统(Waters Corp)来执行体积排阻高性能液相色谱(SE-HPLC)。利用1200-系列HPLC耦接6210TOF MS(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)来执行电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)液相色谱/质谱法(LC-MS)。在60℃下，使用0.1％甲酸水溶液中的30％-80％乙腈14分钟梯度、使用Aeris widepore 3.6μm C4柱(Phenomenex)，通过反相HPLC(RP-HPLC)来拆分(19)-3s。对于TOF MS，毛细管和碰撞电压分别设定为5500和300V。

细胞系和试剂-Raji、Ramos、Daudi、LS174T和Capan-1细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,MD)并且Nalm-6细胞购自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellinien(DSMZ,Braunchweig,Germany)。除了Capan-1以外，所有细胞系保持于含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和1％MEM非必需氨基酸的RPMI-1640中。用20％FBS来保持Capan-1细胞。所有细胞培养基和补充物购自LifeTechnologies(Carlsbad,CA)。

PBMC和T细胞分离-使用UNI-SEP_MAXI试管(Novamed,Ltd,Jerusalem,Israel)从供体全血(NJ血站,East Orange,NJ)纯化人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商方案，通过使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)进行阴性选择而从PBMC中分离CD3-阳性T细胞。在用抗-CD3-PE抗体将经过富集的T细胞染色之后，通过FACS评估T细胞分离效率。在一些情况下，还用CD-19和CD-14进行进一步染色来识别污染细胞。

T细胞活化-将分离的T细胞以2.25x 10⁶个细胞/孔的最终密度涂覆于6-孔组织培养板中。将Daudi细胞以1.5x 10⁶个细胞/孔的最终密度添加至一些孔，其他孔保持只含有T细胞。替代地，将PBMC以6x 10⁶个细胞/孔的最终细胞密度添加至6-孔组织培养板。使每个孔的体积达到3mL。向适当的孔中添加3ng/mL的(19)-3s、(M1)-3s或(19)-DDD2。在37℃下孵育过夜之后，移除1mL的每个样品。将细胞球团化并且在冰上用CD69-APC和CD3-PE标记20分钟。用含1％BSA的PBS将细胞洗涤2次并且使用FACSCALIBER^TM流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)进行分析。

T细胞增殖-将PBMC以1x 10⁶个细胞/毫升的浓度播种于含有指定试剂的T25烧瓶中。对于B细胞耗竭的烧瓶，根据制造商方案通过使用得自Miltenyi的B细胞分离试剂盒进行阴性选择来移除B细胞。在选择当天，从每个烧瓶中取出100μL培养基，在冰上用抗-CD7-APC标记20分钟，洗涤一次并且再悬浮于含有7-AAD的300μL1％BSA/PBS中。对于每个样品，使用FACSCALIBER^TM流式细胞仪来分析总体积。每个样品重复计数两次。使用FlowJo软件来进行分析。对于每个样品，去除死亡(7-AAD+)细胞和残骸(基于前向相比于侧向分散)。最后，选择活的CD7+细胞并且使用Prism软件来作图。

细胞结合测定(Jurkat/Capan-1)-根据制造商方案用PKH26红色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来将Jurkat细胞染色。根据制造商方案用5μM CFSE(羧基荧光素双醋酸酯琥珀酰亚胺基酯，LifeTechnologies)来将Capan-1细胞染色。将经过标记的Capan-1细胞添加至8-孔腔室载玻片(ThermoWaltham,MA)并且允许连接过夜。第二天，取出培养基并且加入处于含有0.1μg/mL(E1)-3s、(M1)-3s或(19)-3s的培养基中的经PKH26-标记的Jurkat细胞。在37℃下孵育1小时之后，用PBS洗涤载玻片以移除任何未结合细胞并且通过荧光显微术来观察。

细胞结合测定(Jurkat/Daudi)-Jurkat和Daudi细胞分别用抗-CD3-PE和抗-CD20-FITC来标记。然后，在室温下，经过标记的细胞以2.5:1比率与0.1μg/mL(19)-3s共孵育30分钟。然后，等分试样的细胞通过荧光显微术来观察。

细胞毒性测定(血液肿瘤细胞系)-根据制造商方案用PKH67绿色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来标记靶细胞。简言之，使5x 10⁶个靶细胞再悬浮于250μL稀释剂C中。在第二试管中，将1μL PKH26染料添加至250μL稀释剂C。然后，将细胞悬浮液添加至染料溶液，充分地混合并且在室温下孵育2分钟。通过添加相等体积FBS来淬灭反应物。然后，用完整RPMI将经过标记的细胞洗涤3次。在未刺激的情况下，使用经分离的T细胞作为效应细胞。将效应细胞和PKH67标记的靶细胞以10:1比率组合并且涂覆于含有(19)-3s或(14)-3s的连续稀释液的48孔板中。每个孔含有5x 10⁴个靶细胞和5x10⁵个效应细胞。在20％RPMI中进行Jeko-1测定。在含有5％CO₂的37℃孵育箱中将板孵育18-24小时。在孵育之后，将所有细胞从48孔板中移入流式细胞仪管中并且再悬浮于含有1ug/mL 7AAD(以区分活细胞与死细胞)和30,000个COUNTBRIGHT^TM绝对计数珠粒(Life Technologies)的1％BSA/PBS中。在FACSCALIBER^TM流式细胞仪上分析细胞。对于每个样品，8,000个COUNTBRIGHT^TM珠粒计数作为标准化参考。使用FlowJo软件(Treestar,Inc.,Ashland,OR)来分析数据。对于每个样品，将死细胞和残骸排除并且对总活靶细胞计数。

细胞毒性测定(实体肿瘤细胞系)-遵循与用PKH23染色相同的程序，用PKH67绿色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来标记靶细胞。所使用的效应细胞如下：对于Capan-1测定，使用从CD8+富集柱(R&D Systems,Minneapolis,MN)纯化之后的CD8+富集T细胞。对于LS174T细胞：使用在含有25U/mL IL-2和50ng/mL Okt3Mab的培养基将PBMC孵育5天之后，随后在含有单独25U/mL IL-2的培养基中孵育2天的经过刺激的T细胞。将效应细胞和经PKH67-标记的靶细胞以3:1比率组合(5x10⁴个靶细胞和1.5x10⁵个效应细胞/孔)并且涂覆于含有(E1)-3s、(14)-3s或(19)-3s的连续稀释液的48孔板上。在20％RPMI中进行Capan-1测定。在含有5％CO₂的37℃孵育箱中将板孵育42-48小时。孵育之后，将悬浮细胞与来自所有孔的经胰酶消化的连接细胞组合并且转移至流式细胞仪管。将细胞洗涤一次并且再悬浮于含有1ug/mL 7AAD(以区分活细胞与死细胞)和30,000个COUNTBRIGHT^TM绝对计数珠粒的1％BSA/PBS中。在FACSCALIBER^TM流式细胞仪上分析细胞。对于每个样品，8,000个COUNTBRIGHT^TM珠粒计数为标准化参考。使用FlowJo软件(Treestar,Inc.,Ashland,OR)来分析数据。对于每个样品，将死细胞和残骸排除并且将总活靶细胞计数。

体内效力-8周龄雌性NOD/SCID小鼠购自Charles River(Wilmington,MA)。向小鼠皮下注射的Raji(1x10⁶)和人PBMC(5x10⁶细胞)与基质胶1:1混合的混合物。1小时后开始治疗。每个实验中的处理方案、剂量和动物数目描述于结果中。每日监测动物的肿瘤长出迹象。一旦肿瘤出现，则对其每周测量两次。通过使用卡尺进行二维测量来确定肿瘤体积(TV)，体积定义为：L x w²/2，其中L是肿瘤的最长尺寸并且w是最短的。使用PrismGraphPad软件(v5；LaJolla,CA)通过对数秩检验在Kaplan-Meier曲线上使用存活替代端点作为达到1.0cm³的肿瘤进展时间(TTP)来确定效力。在P<0.05时认为显著。

结果

白细胞重定向双特异性抗体的构建和生物化学分析。使用DNL^TM方法产生一组白细胞重定向bsAb即(X)-3s用于靶向各种肿瘤相关联抗原(包括CD19、CD20、HLA-DR、TROP-2、CEACAM5和MUC5AC)、。通过SE-HPLC和SDS-PAGE分析来证明这些结构的纯度，其中仅代表三种组成多肽(Okt3scFv-AD2、hA19-Fd-DDD2和hA19κ)的条带是明显的(数据未示出)。LC-MS分析识别单一RP-HPLC峰，其具有与来自它的推断氨基酸序列的(19)-3s的计算质量(137432.37Da)一致(质量精确度＝11ppm)的解卷积质谱，包括Okt3scFv-AD2和两个C_H1-DDD2-hA19Fd链中的每一个上的预测氨基末端焦谷氨酸盐(数据未示出)。未指示额外翻译后修饰，包括糖基化。

由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。检查白细胞重定向(19)-3s DNL^TM复合物对效应子T细胞靶向CD19⁺淋巴瘤细胞的效应(图2)。将新鲜分离的T细胞以2.5:1的E:T比率与Daudi细胞组合。在室温下用0、1μg/mL或5μg/mL的(19)-3sDNL^TM复合物处理细胞30分钟，然后通过流式细胞术分析。分别使用抗-CD20-FITC和抗-CD7-APC来识别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20⁺/CD7⁺事件的％。用(19)-3s处理之后，45.5％流动事件是CD20/CD7双阳性的，表明Daudi与T细胞形成突触(图2A)，与对不含抗体的混合细胞所测量的2％(图2B)形成对比。添加(19)-3s导致>90％的Daudi与T细胞缔合(图2C)。这些结果表明(19)-3s DNL^TM复合物可有效地将T细胞引导至表达目标抗原的淋巴瘤细胞。

通过荧光显微术来证明T细胞与靶淋巴瘤细胞之间的突触形成(图3)。将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1:1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s DNL^TM复合物处理30分钟并且用抗-CD20-FITC(图3A)和抗-CD3-PE(图3B)染色，然后通过荧光显微术来分析。合并的图像(图3C)显示经绿色染色Daudi与经红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。在不存在(19)-3s的情况下突触形成不明显(图3D)。图3C显示靶淋巴瘤细胞与目标T细胞直接接触。

对于(19)-3s介导的T细胞与示例性B-细胞淋巴瘤细胞系的缔合，进行剂量反应系列(图4)。如图4中所示，在此实验的条件下，(19)-3s-介导的T细胞与靶细胞的细胞至细胞缔合在0.037与0.111μg/ml之间的DNL^TM复合物浓度下达到饱和。

图5示出了

(图5A)、DART^TM(图5A)和DNL^TM(图5B)抗-CD3x抗-CD19复合物将T细胞重定向至目标CD19⁺B细胞的相对效力的对比。

和DART^TM的数据从Moore等人(2011,Blood117:4542-51)获得。在0.0005μg/ml最低测试浓度下，(19)-3s DNL^TM复合物比

或DART^TM更有效地将T细胞靶向B-细胞淋巴瘤(图5)。与相当的

和DART^TM复合物相比，(19)-3s DNL^TM复合物也诱导稍微较高最大水平的细胞与细胞缔合(图5A)。虽然难以从对于(19)-3s DNL^TM复合物产生的单个数据点来推断，

DART^TM和DNL^TM的EC₅₀水平似乎是相似的(图5)。

(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3s介导的T细胞与靶肿瘤细胞的细胞-细胞缔合。为了评估T-细胞重定向BsAb促进T细胞与其靶肿瘤细胞缔合的能力，将Jurkat T细胞与含有(X)-3s的靶肿瘤细胞共孵育并且通过流式细胞术和荧光显微术来评估。Jurkat T细胞是CD4+T细胞白血病细胞系，针对其在各种浓度的(19)-3s的存在下显示T细胞结合而不耗竭FITC标记Daudi细胞的能力来选择并且通过流式细胞术分析，以检测指示T细胞-B细胞缔合复合物的双阳性(CD3+CD20+)群体。在用0.5ng/mL(19)-3s处理之后，可见明显表观细胞-细胞缔合，并且用0.1μg/mL处理之后，超过25％的细胞群体存在于细胞-细胞缔合中(图5)。荧光显微术支持此数据，因为在用0.1μg/mL(19)-3s处理之后，免疫突触是明显的(图4)。在不存在(19)-3s的情况下，未见突触形成(数据未示出)。

在胰腺肿瘤细胞系Capan-1中也观察到了此细胞-细胞缔合(图6)。Capan-1表达高水平的TROP2和中度水平的MUC5AC。因此，将TROP2-靶向bsAb(E1)-3s(图6C)，和MUC5AC靶向bsAb(M1)-3s(图6B)与非靶向对照bsAb(19)-3s(图6A)相比较。在这些bsAb存在下将经CFSE标记的Capan-1细胞与经PKH26标记的Jurkat共孵育。如预期，荧光显微术显示由(E1)-3s介导的较大T-细胞/Capan复合物，随后为由(M1)-3s介导的较小但大量的复合物，以及(19)-3s处理之后的相对较低的复合物形成(图6)。

(19)-3s特异性诱导T细胞活化和增殖。在PBMC中(图7A)，或在与Daudi B细胞共孵育的T细胞中(图7B)，通过测量CD69(一种T细胞活化的早期标记物)的表达水平来评估(19)-3s活化T细胞的能力。用3ng/mL(19)-3s处理在与Daudi B细胞共孵育的T细胞中诱导T细胞活化，如与非靶向对照抗体(19)-DDD2和(M1)-3s，以及在没有Daudi靶细胞的情况下用(19)-3s处理的T细胞相比较，CD69表达增加>50倍所指示(图7B)。在抗体与含有T和B细胞的PBMC一起孵育时，观察到相似结果；(19)-3s刺激CD69表达水平比非靶向对照高>20倍(图7A)。在不存在靶细胞的情况下，用(19)-3s处理的纯化T细胞不显示活化(图7C)。

在用各种CD3-靶向抗体处理PBMC之后评估T细胞增殖作为T细胞活化的另一个指示。(19)-3s在3nM或30pM下诱导的T细胞增殖类似于阳性对照IL-2/PHA(图8A)。非靶向对照抗体(14)-3s在最高(3nM)浓度下显示一些非特异性T细胞增殖(图8A)。然而，在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖(图8B)，表明靶细胞是特异性(19)-3s诱导的T细胞增殖必不可少的。

(X)-3s重定向的T-细胞介导的杀灭恶性肿瘤细胞系。每个白细胞靶向分子的细胞毒性通过其介导特异性肿瘤靶细胞的溶解的能力来评估。对于血液肿瘤细胞系，在18-24小时测定中，使用未刺激、富集T细胞群体作为效应细胞的10:1E:T比率显示最佳测定条件。CD19靶向bsAb(19)-3s诱导相对较低CD19表达的细胞系Ramos(IC₅₀＝0.17pM，溶解_最大＝79％)、Daudi(IC₅₀＝1pM，溶解_最大＝60％)和Nalm6(IC₅₀＝6pM，溶解_最大＝93％)的最有效特异性杀灭(图9A)。有意思的是，高CD19表达细胞系Namalwa(IC₅₀＝63pM，溶解_最大＝60％)和Raji(IC₅₀＝3nM，溶解_最大＝41％)对于(19)-3s的敏感性最小(图9A)。非靶向(14)-3s DNL^TM构建体在所测试的任何细胞系中具有极小的细胞毒性效应(图9B)。通过从两个不同供体获得的PBMC来获得(19)-3s构建体对于Nalm-6ALL细胞系的一致细胞毒性效应(图9C)。

在多个细胞系中测定(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效应(图10)。CD22靶向bsAb(22)-3s在CD22阳性Daudi细胞系中显示有效的(IC₅₀＝5pM，溶解_最大＝60％)特异性T-细胞介导的溶解(图10C)，但是在CD22阴性Namalwa细胞中不显示(图10A)。

与较低CD20-表达Namalwa细胞系(IC₅₀＝30pM，溶解_最大＝53％)(图10A)相比，CD20-靶向bsAb(20)-3s在较高表达CD20细胞系Daudi(IC₅₀＝<0.3pM，溶解_最大＝90％)(图10C)和Jeko(IC₅₀＝1pM溶解_最大＝90％)中显示最高效力(图10B)形成比较。

在表达HLA-DR的Jeko-1细胞系(IC₅₀＝20pM，溶解_最大＝88％)中进行测试HLA-DR-靶向bsAb(C2)-3s(图10B)。

在10:1的E:T比率下，使用分离的T细胞作为效应细胞，bsAb在各种B细胞恶性肿瘤中诱导有效T细胞介导的细胞毒性，包括伯基特淋巴瘤(Daudi,Ramos,Namalwa)、套细胞淋巴瘤(Jeko-1)和急性淋巴细胞性白血病(Nalm-6)(表7)。非肿瘤结合对照(14)-3s在>10nM下仅诱导中度T-细胞杀灭。抗原/表位的性质(尤其是其尺寸和与细胞表面的接近程度)对于T-细胞重新靶向的效力似乎比抗原密度更重要(表7)。可能(20)-3s始终比(19)-3s和(C2)-3s更有效，即使在CD19或HLA-DR的表达大大高于CD20时也是如此，如分别对于Namalwa和Jeko-1所发现(表7)。这可能是因为CD20表位包括紧密接近细胞表面的较小细胞外环。当使用Daudi直接比较时，(22)-3s具有最低有效性。与CD19和CD20相比，以最低密度表达的CD22是快速内在化抗原，并且其表位更远离细胞表面。这些因素中的每一个都可造成其效力下降。最后，对T-细胞重新靶向杀灭的敏感性具有细胞系依赖性，如使用(19)-3s所观察到，其中Raji(IC₅₀>3nM)很大程度上无反应的，然而Ramos(IC₅₀＝2pM)是高敏感性的，虽然前者表达较高CD19抗原密度(表7)。

总之，(19)-3s、(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s同时结合至T细胞和靶B细胞并且在体外诱导T-细胞介导的杀灭。DNL方法的模块化性质允许快速产生多个相关缀合物以便重定向白细胞杀灭各种B细胞恶性肿瘤，而不需要额外重组工程设计和蛋白质产生。CD20细胞外表位与细胞表面的紧密接近性导致(20)-3s的效力最高。

表7.体外重定向的T-细胞灭杀

¹BL，伯基特淋巴瘤；ALL，急性淋巴细胞性白血病；MCL，套细胞淋巴瘤。

²通过流式细胞术测定表达水平且相对于Daudi的表达水平进行标准化。³IC₅₀，实现50％靶细胞杀灭的皮摩尔浓度。

白细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效应也在实体肿瘤细胞中确定(图11)。对于实体肿瘤细胞系，最佳测定条件确定为在42–48小时测定中使用经过刺激的T细胞的3:1E:T比率。每个bsAb诱导肿瘤靶细胞的特异性T-细胞介导的溶解。在用(14)-3s处理之后，表达CEACAM5的人结肠腺癌细胞系LS-174T显示有效特异性溶解(IC₅₀＝2pM)(图11A)。(E1)-3s介导了表达Capan-1人胰腺癌细胞系的TROP2的有效特异性溶解(IC₅₀＝29pM)(图11B)。表达高水平的CEACAM6和TROP2的胃癌细胞系NCI-N87对T-细胞靶向分子(15)-3s和(E1)-3s显示非常有效的特异性溶解(分别IC₅₀＝3pM和0.85pM)(图11C)。对于Capan-1和LS 174T，非靶向对照抗体(19)-3s在>1nM的浓度下诱导较低(<20％)非特异性溶解，并且在NCI-N87细胞中诱导中度(约40％)非特异性溶解(图11A-C)。各种白细胞重定向bsAb在各种肿瘤细胞系中的体外细胞毒性数据的汇总示于图12。各种构建体显示目标肿瘤细胞的最大细胞溶解高达90％或更大，其中表达目标抗体的细胞系的IC₅₀值一般在较低皮摩尔范围内(图12)。

实施例2.白细胞重定向DNL^TM复合物的体内研究

较小(<60kDa)基于scFv的构建体如

和DART^TM的一个潜在限制是需要通过长期连续输注来施用，这归因于其毒性和从循环中的快速清除。因为DNL^TM bsAb的分子尺寸高于通常与肾清除率相关联的阈值，所以它应展现从循环中的较慢清除。在单次静脉内推注5mg/kg(19)-3s bsAb之后，我们测量小鼠的药代动力学参数(数据未示出)。观察到两阶段清除，t1/2α和t1/2β分别是1.1和5.1小时，从而产生1880pmol*h/mL的曲线下面积(数据未示出)，比在相同摩尔浓度下施用的MT103(抗-CD 19x抗-CD3

)所报告的结果大几乎6倍(美国专利US2010/0303827A1)。主要差异显然是(19)-3s的t1/2α更长(数据未示出)。因为(19)-3s的潜在有利性质，我们评估使用较低频率的给药方案而非通常在动物研究中用于

的每日给药的可能性。

在用人PBMC重构的NOD/SCID小鼠中使用Raji人伯基特淋巴瘤异种移植物来进行前瞻性研究(图13，图14)。将Raji细胞(1x 10⁶个细胞/小鼠)与来自单一健康供体的新鲜分离的PBMC(5x 10⁶个细胞/小鼠)组合，与基质胶1:1混合，并且在第0天经SC注入研究中的所有动物体内。5只小鼠的群组接受静脉内注射的(19)-3s，共计在第0天130μg作为单次剂量(图13B)，三个剂量的43μg(第0、2和4天)(图13C)或五个每日剂量的26μg(第0–5天)(图13D)。用相同细胞混合物接种但是未接受(19)-3s的未经处理的组(图13A)具有31天的中值存活时间(MST)。每个治疗方案改善存活(P≤0.05)，其中三个剂量(每隔一天)方案提供最大的存活益处(MST＝91天；P＝0.0018，通过对数秩分析)。

开始随访研究以确定较低频率给药的效力(图14)。9只NOD/SCID小鼠的群组以与上述类似的方式用Raji和PBMC接种。在此项研究中，与第一个研究中的一周相比，治疗延长两周。群组接受静脉内注射(19)-3s共计360μg，作为2x 130-μg(图14B)、4x65-μg(图14D)或两周内6x 43-μg剂量(图14E)。经SC而非静脉内给药向另一群组施用2x 130-μg剂量(图14C)。为了比较，制备未经处理的小鼠(图14A)或经非靶向(M1)-3s抗体处理的小鼠(图14F)的对照组。截至第28天，每个(19)-3s治疗组具有比未治疗的对照显著更小的AUC(P<0.05)。意外地，经由SC途径的两个每周剂量显然地与更大频率静脉内给药一样有效。

还使用实体肿瘤来进行体内研究(图15)。对于LS174T结肠腺癌(图15A，图15B)或Capan-1胰腺癌(图15C，图15D)，如上所述来制备NOD/SCID小鼠异种移植物。在每个情况下，与对照相比，施用靶向(E1)-3s(图15B)或(14)-3s(图15D)bsAb DNL^TM构建体的小鼠显示改善的存活时间。

总之，白细胞重新靶向bsAb(包括(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3sDNL^TM构建体)经由分别与CD3和CD19的一价和二价结合来介导T细胞分别与B细胞、结肠腺癌或胰腺癌细胞之间的突触形成。通过在pM浓度下的DNL^TM bsAb在离体环境中诱导T-细胞活化、增殖和靶细胞杀灭。与在动物模型中每日静脉内施用并且在临床中连续输注的

或DART^TM构建体相比，DNL^TM bsAb的有利性质，包括二价肿瘤结合和较慢清除，将允许较低频率给药和可能经SC施用。DNL^TM方法的模块化性质允许快速产生很多相关缀合物以便重定向白细胞杀灭各种恶性肿瘤，而不需要额外重组工程设计和蛋白质产生。

本领域普通技术人员将认识到结合至CD3或其他白细胞抗原的抗体以及结合至Trop-2或其他疾病相关的抗原的其他抗体在本领域中为已知的并且任何此类抗体可用于使用本领域中熟知的技术制备F(ab)₂、scFv或其他抗体片段。此类替代抗体或其片段可用于本方法和组合物中。如下论述，制造DOCK-AND-LOCK^TM(DNL^TM)复合物的方法可用于将任何已知抗体或抗体片段并入稳定、生理活性复合物中。

实施例3.干扰素-α增强抗-Trop-2x抗-CD3双特异性抗体的细胞毒性

针对由hRS7和OKT3制备为DNL^TM复合物的抗人Trop-2x抗人CD3双特异性抗体((E1)-3s)在与人T-细胞混合并且注入小鼠中时延迟Capan-1人胰腺腺癌肿瘤细胞的肿瘤生长的能力来测试其治疗效力。还评估干扰素-α(呈E1*-2b或

形式)在与此疗法组合时的效应。

方法

向五周龄雌性NOD/SCID小鼠皮下注射Capan-1(5x10⁶个)和人T-细胞(2.5x10⁶个细胞)与基质胶1:1混合的的混合物(E:T比率为1:2)。存在六个不同治疗组，各有8只小鼠。治疗由在施用Capan-1/T-细胞混合物之后1小时开始每天静脉内接收47μg(E1)-3s历时五天的一个群组组成。两个群组用等摩尔量的IFN治疗，一组接受由IFN-α2b-DDD2-CK-hRS7IgG1制备的DNL分子(E1*-2b；每周皮下2.5μg x 4周)，同时另一组接受

(Roche；每周皮下0.6μg x 4周)。其他两组接受(E1)-3s加上E1*2b或(E1)-3s加上

的组合。最后一组对照组保持未经处理。表8总结各个治疗组。

表8.(E1)-3s疗法的治疗组

每日监测小鼠的肿瘤长出迹象。一旦肿瘤开始出现，所有动物的肿瘤每周测量两次。如果其肿瘤体积大小超过1.0cm³，将小鼠安乐死以获得疾病进展。

结果

各个组的平均肿瘤体积示于图16。为了清楚，含有

组的数据(图16B)与E1*2b组分开示于图中(图16A)。直至第29天，在与未治疗小鼠相比时，所有治疗就曲线下面积(AUC)而言在控制肿瘤生长方面显著较好，在第29天，将未治疗组中的第一只小鼠安乐死以获得疾病进展(P<0.0009；AUC_29天)。(E1)-3s与

的组合在肿瘤长出方面引起最佳总体抗肿瘤反应(图16B)。此治疗显著比任何个别治疗显著更好(P<0.042；AUC)并且优于(E1)-3s加上E1*-2b的组合(P＝0.0312；AUC_53天)(图16A)。在与单独E1*2b或

相比时，(E1)-3s加上E1*2b的组合可显著控制肿瘤生长(P<0.0073；AUC_46天)但是在与单独(E1)-3s相比时则不然(图16A-B)。用(E1)-3s、

或E1*-2b治疗的小鼠之间没有显著差异(图16A-B)。

就存活时间而言，在与未治疗的小鼠相比时，所有治疗均提供显著存活益处(P<0.012；对数秩)(图17)。截至第81天，在经(E1)-3s加上E1*-2b的组合治疗的小鼠与经(E1)-3s加上

治疗的小鼠之间不存在中值存活时间(MST)的显著差异(分别MST＝79.5和>81天)(图17)。与任何个别治疗相比，经(E1)-3s加上

治疗的小鼠具有显著改善的存活结果(P<0.0237)(图17)。经(E1)-3s加上E1*2b治疗的小鼠在与经单独E1*-2b治疗的小鼠相比时具有存活益处(MST＝53天；P<0.0311)，但是在与仅经(E1)-3s或

治疗的小鼠相比时则不然(MST分别＝68天和53天)(图17)。经(E1)-3s治疗在与经E1*-2b治疗的小鼠相比时显著改善存活时间(P＝0.0406)，但是在与经单独

治疗的小鼠相比时则不然(图17)。在仅经E1*2b治疗的小鼠与经单独

治疗的小鼠之间没有显著差异(图17)。

结果证明添加干扰素-α在与白细胞重定向bsAb组合时大幅增加存活时间以及削弱肿瘤生长。本领域普通技术人员将认识到添加I型或III型干扰素(干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ)的情况下所观察到的改善效力不限于特异性(E1)-3s bsAb，而是在制备为DNL^TM复合物或其他形式如

或DART^TM的其他白细胞重定向bsAb的情况下都将观察到。

实施例4.对含白细胞重定向双特异性抗体的干扰素-α组合疗法的进一步研究

在以上实施例中，(E1)-3s加上

的组合被证明在控制肿瘤生长方面是非常有效的治疗。为了证实这些结果且对其进行延伸，进行了研究，其中加入两个新群组。首先包括(E1)-3s对照组，其中向动物施用等摩尔量的TF12。TF12由与一个非靶向679Fab(抗HSG)连接的两个hRS7-Fab分子组成。另外，因为Capan-1对IFN敏感，所以加入另一组，其中在不利用T细胞的情况下评估

对Capan-1肿瘤生长的效应。

在给小鼠(40)注射Capan-1/T细胞混合物之后，将其随机分成五个治疗组。一个小时后，一个11只小鼠的群组每天静脉内接受47μg(E1)-3s，肿瘤细胞注射后1h开始且再持续连续四天(qdx5)。一个7只动物的群组每周经皮下接受呈

形式的干扰素持续四周。另一组接受静脉内(E1)-3s加皮下

的组合。未经处理的对照动物接受Capan-1/T细胞但无治疗。另一对照组接受用量以摩尔数计相当于(E1)-3s的TF12(57μgqdx5)。第6组小鼠(8只动物)接受单独注射仅Capan-1细胞(即，无T细胞)且经

治疗。所有疗法注射都是以100μL的体积进行。表9汇总了各个组。

表9.(E1)-3s和TF12疗法的治疗组

每日监测小鼠的肿瘤生长的迹象。一旦肿瘤开始出现，每周两次测量所有动物的肿瘤。如果其肿瘤体积大小超过1.0cm³，将小鼠安乐死以获得疾病进展。

结果

示出了平均肿瘤生长(图18)和存活曲线(图19)。尽管彼此并无不同，但当与TF12和未治疗对照组相比时经(E1)-3s、

或

(无T细胞)治疗的小鼠显示了显著的抗肿瘤效应(P＜0.0102；AUC)。在本实验结束当天(第59天)，经(E1)-3s加

组合治疗的小鼠的平均肿瘤体积是0.083±0.048cm³。总体上，此处理组在与所有其他治疗组相比时显示显著的抗肿瘤效应(P＜0.0072；AUC)。

与TF12和未经处理对照组相比，每个个别治疗(

无T细胞和(E1)-3s)显著提高了存活时间(P＜0.0059；对数秩)(图18、图19)。除了(E1)-3s加

组合，所有群组都达到了它们相应的MST。在此组合组中，未对动物施以安乐死以获得疾病进展(TV＞1.0cm³)。重要的是，当与所有其他治疗相比时，(E1)-3s加

组合提供显著的存活效益(P＜0.0007；对数秩)(图18、图19)。

实施例5.含T细胞重定向双特异性抗体的干扰素-α组合疗法在人胃癌中的效应

使用前两个实施例中所公开的方法和组合物来研究单独或与干扰素-α

组合的白细胞重定向bsAb在IFN难治性NCI-N87人胃肿瘤细胞系中的效应。对小鼠皮下注射与基质胶混合的5×10⁶个NCI-N87细胞+2.5×10⁶个T细胞(1∶2E∶T比)且在1h后开始治疗。治疗组示于表10中。

表10.(E1)-3s和TF12疗法的治疗组

人胃癌异种移植物(NCI-N87)在NOD-SCID小鼠中的(E1)-3s疗法

单独或与干扰素组合的白细胞重定向bsAb(E1)-3s的效应示于图20和图21中。(E1)-3s bsAb有效减缓胃癌的肿瘤生长并且增加存活时间。与干扰素-α组合甚至显著增强了白细胞重定向bsAb甚至在干扰素抗性肿瘤中的效应。组合疗法比单独添加任一药剂更有效。与未经处理的动物相比，经单独或与干扰素-α组合的TF12bsAb治疗的小鼠对照显示对肿瘤生长或死亡率具有极小的效应。

实施例6.抗体-药物缀合物(ADC)在人胰腺癌或结肠癌的临床前模型中的体内治疗性用途

如先前所描述来制备CL2A-SN-38抗体缀合物(参见例如美国专利号7,999,083和8,080,250)。将带有皮下人类胰腺或结肠肿瘤异种移植物的免疫受损无胸腺裸鼠(雌性)用特定CL2A-SN-38缀合物或对照缀合物治疗，或保持未经处理。观察特定缀合物的治疗效力。在Capan1胰腺肿瘤模型中，与对照hA20-CL2A-SN-38缀合物(抗CD20)和未经处理的对照(未示出)相比，hRS7(抗TROP2)、hPAM4(抗MUC5ac)和hMN-14(抗CEACAM5)抗体的特定CL2A-SN-38缀合物显示更好的效力。类似地，在人胰腺癌的BXPC3模型中，与对照治疗(未示出)相比，特定hRS7-CL2A-SN-38显示更好的治疗效力。同样，在人结肠癌的侵袭性LS174T模型中，用特定hMN-14-CL2A-SN-38治疗比不治疗(未示出)更有效。

实施例7.使用ADC hMN-14-[CL2-SN-38]、IMMU-130在体内治疗裸鼠中的GW-39人结肠肿瘤肺转移

通过静脉内注射GW-39人结肠肿瘤悬浮液在裸鼠中建立结肠癌的肺转移模型，并且在14天后开始治疗。使用不同的剂量，以q4dx8剂量方案注射特定抗CEACAM5抗体缀合物hMN14-CL2-SN-38以及非靶向抗CD22MAb对照缀合物hLL2-CL2-SN-38和hMN14与SN-38的等剂量混合物。在hMN-14ADC情况下观察选择性治疗效应(未示出)。在250μg剂量下，使用hMN14-CL2-SN-38治疗的小鼠显示大于107天的中值存活时间。经不特异性靶向肺癌细胞的对照缀合抗体hLL2-CL2-SN-38治疗的小鼠显示77天的中值存活时间，而经未缀合hMN14IgG和游离SN-38治疗的小鼠显示45天的中值存活时间，与未经处理的生理盐水对照(43.5天)相当。实质上比未缀合抗体和单独游离化学治疗剂更有效的缀合癌细胞靶向抗体-SN-38缀合物的有效性的显著且令人惊讶的增加清楚可见(未示出)。还观察到了缀合抗体的治疗效应的剂量反应性(未示出)。这些结果显示在同一体内人类肺癌系统中SN-38抗体缀合物与未缀合抗体和游离SN-38的组合效应相比具有明显的优越性。

实施例8.ADC(IMMU-132或hRS7-SN-38)用于治疗疗法难治性转移性结肠癌(mCRC)的用途

患者是患有mCRC的62岁妇女，其最初在2012年1月呈现转移性疾病。她在诊断后数周进行了腹腔镜回肠横向结肠切除术作为第一疗法，且随后在新辅助情形下接受4个循环的FOLFOX(甲酰四氢叶酸、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂)化学疗法，随后在2012年3月进行了右侧肝切除术以去除右肝叶中的转移性病变。这之后在2012年6月恢复辅助FOLFOX方案，持续总计12个FOLFOX循环。8月份由于神经毒性加剧而从所述方案中减去奥沙利铂。她的最后一个5-FU循环是在2012年09月25日。

2013年1月进行的CT显示转移至肝脏。她随后被评估为参与IMMU-132(hRS7-SN-38)调查研究的良好候选人。她的病历中的并存病包括哮喘、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、心杂音、食管裂孔疝、甲状腺机能减退、腕管综合征、青光眼、抑郁、不宁腿综合征以及神经病。她的手术史包括输卵管结扎(1975年)、甲状腺切除术(1983年)、胆囊切除术(2001年)、腕管解除(2008年)以及青光眼手术。

在进入本疗法时，她的目标病变是左肝叶中的3.1cm肿瘤。非目标病变包括肝脏中的若干个低衰减块。她的基线CEA为781ng/mL。

按照每周一次的方案通过输注连续2周给予IMMU-132，随后停止一周，由此构成治疗循环。在耐受时重复这些循环。第一次IMMU-132输注(8mg/kg)开始于2013年2月15日，且在无值得注意的事件的情况下完成。她在第一个循环过程中经历了恶心(2级)和疲劳(2级)，且继续治疗，从那以后没有重大不利事件。她在2013年3月报告了脱发和便秘。通过计算机断层扫描(CT)，2013年4月8日进行(在6个剂量之后)的第一次反应评估显示目标病变收缩29％。2013年3月25日，她的CEA水平降至230ng/mL。在2013年5月23日的第二次反应评估(10个剂量之后)中，目标病变收缩39％，因而根据RECIST标准构成部分响应。她继续治疗，接受了由12个剂量的8mg/kg hRS7-SN-38(IMMU-132)构成的6个循环。她的总体健康状况和临床症状自开始该调查型研究开始得到了相当大的改良。

实施例9.IMMU-132用于转移性实体癌症的ADC疗法

IMMU-132是包含通过pH值敏感性连接子与hRS7抗Trop-2人源化单克隆抗体缀合的CPT-11活性代谢物SN-38的ADC(平均药物-抗体比＝7.6)，当与Trop-2结合时，其展现快速内在化。IMMU-132靶向以高流行率和特异性表达于许多癌瘤中的I型跨膜蛋白Trop-2。此本实施例报告了在3种(中值)先前治疗(一些包括拓扑异构酶I和拓扑异构酶II抑制药物)失败后的25名不同的转移性癌症(胰腺癌，7例；三阴性乳腺癌[TNBC]，4例；结肠直肠癌[CRC]，3例；胃癌，3例；食道癌、前列腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌[SCLC]、肾癌、扁桃体癌、膀胱癌，各1例)患者的I期临床试验。

IMMU-132以重复21天循环施用，在第1天和第8天给予各治疗。在3+3试验设计中，起始剂量为8mg/kg/剂量(即，16mg/kg/循环)，并且升高至18mg/kg直至遇到剂量限制性中性粒细胞减少症。疲劳、脱发和偶尔轻度至中度腹泻是较常见的非血液学毒性中的一些，其中2名患者还报告了皮疹。通过CT，在各种转移性癌症中，24名可评估患者中超过80％具有稳定的疾病或肿瘤收缩(SD和PR)作为最佳反应。通过RECIST，三名患者(CRC、TNBC、SCLC)具有PR；所有患者的中值TTP＞18周，不包括胰腺癌患者。通过剂量减至8-10mg/kg/剂量(16-20mg/kg/循环)来控制中性粒细胞减少症。

免疫组织化学显示Trop-2强表达于大部分存档患者肿瘤中，但在血清中未检测到它。血液肿瘤标记物效价(例如CEA、CA19-9)的相应降低体现了肿瘤反应。尽管重复给药，但未检测到抗-抗体或抗SN-38抗体。血清中IMMU-132浓度的峰和谷评估值显示缀合物在7天内完全清除，这是基于体外研究的意料之中的发现，所述研究显示每天在血清中释放50％的SN-38。这些结果表明，以介于16-24mg/kg/循环范围内的剂量给予的这种新颖ADC在多样性转移性实体癌症中显示高治疗指数。

实施例10.MMU-130(靶向CEACAM5的SN-38ADC)在转移性结肠直肠癌(mCRC)中具有治疗活性

IMMU-130(由pH值敏感性连接子(7.6平均药物-抗体比)缀合于人源化抗CEACAM5抗体(拉贝珠单抗)的SN-38的ADC)正在完成两个I期试验。在两者中，要求患有晚期mCRC的合格患者进行过失败/复发标准治疗，即拓扑异构酶I抑制药物CPT-11(伊立替康)且具有升高的血浆CEA(＞5ng/mL)。

在第一种方案(IMMU--130-01)中，每14天(EOW)以始于2.0mg/kg的剂量施用IMMU-130。在24mg/kg下，三分之二的患者中出现了发热性中性粒细胞减少症；另外，在≤16mg/kg下，在7名患者中观察到中性粒细胞减少症(≥2级)，其中一名还经历血小板减少症。一名患者[在接受≥4个剂量(2个循环)的8名患者中]显示肝脏(起始于7cm)和肺目标病变在4.7个月内减少40.6％(PR，通过RECIST)，无重大毒性，耐受总计18个16mg/kg剂量。该研究以12mg/kg EOW继续进行。

因为SN-38在S期细胞中最有效，所以进一步延长暴露可以提高效力。因此，在第二个I期试验(IMMU-130-02)中，给药加强至每周两次，在3+3试验设计中，起始于6mg/kg/剂量持续2周(4个剂量)，停止1周，作为一个治疗循环。中性粒细胞减少症和易控制腹泻是主要副作用，直至剂量减至4.0mg/kg每周两次，其中早期结果表明充分耐受多个循环。目前，在完成≥4个剂量(1个循环)的6名患者中，3名患者中出现了肿瘤收缩，其中1名继续PR(-46％，通过RECIST)。在两个试验中，CEA血液效价与肿瘤反应相关，且高水平不干扰疗法。基于ELISA测试，还没有抗抗体或抗SN-38抗体反应。在各研究中，ADC在前24h内被清除50％，哎哎暴露比亲本分子CPT-11的典型剂量长得多。这些结果表明，以平均～16mg/kg/循环-24mg/kg/循环的不同方案给予的这种新颖ADC在晚期mCRC患者中显示高治疗指数。因为CEACAM5在乳腺癌和肺癌以及其他上皮细胞肿瘤中的表达有所升高，所以它也可能是其他癌症的可用靶标。

实施例11.单独或与抗-Trop-2x抗-CD3bsAb、IFN-α或抗-Trop-2ADC组合的检查点抑制剂抗体

为了确定示例性检查点抑制剂抗体伊匹单抗(抗CTLA4)的抗肿瘤活性是与其他治疗剂协同还是因加入其他治疗剂而受到抑制，在鼠类肿瘤模型中评估了单独或与示例性T细胞重定向bsAb(E1)-3s、与干扰素-α

或与示例性ADChRS7-SN-38(IMMU-132)组合的CTLA4mAb。基于对各种药剂和CTLA4封锁的不同敏感性而选择了M109肺癌、SA1N纤维肉瘤和CT26结肠癌模型。将人T细胞与所述抗体共同施用。

所有化合物均在其最佳剂量和时程下进行测试。当组合使用时，在IMMU-132、(E1)-3s或干扰素-α的第一个剂量之后一天开始CTLA4mAb。使用肿瘤生长抑制百分比和达到目标肿瘤尺寸的天数来评估效力。抗肿瘤活性评分为：完全消退(CR；非可感知肿瘤)或部分消退(PR；肿瘤体积减小50％)。协同定义为抗肿瘤活性显著(p＜0.05)优于各药剂的单一疗法的活性。

在对CTLA4封锁敏感且对(E1)-3s、干扰素-α和IMMU-132适度敏感的SA1N纤维肉瘤肿瘤模型中，界线协同作用在CTLA4mAb与(E1)-3s组合的情况下是明显的，而在干扰素-α下未观察到效应。IMMU-132单一疗法不产生显著的SA1N抗肿瘤活性。然而，，组合IMMU-132与CTLA4mAb产生协同作用。在M109肺转移模型和CT26结肠癌模型中，在CTLA4mAb与IMMU-132、(E1)-3s和干扰素-α中的每一者组合时检测到协同作用。

总之，向干扰素-α、IMMU-132或(E1)-3s中加入CTLA4mAb产生了模型依赖性协同活性。在不考虑肿瘤的免疫原性和仅当至少一种疗法具有活性时观察到了协同作用。所有组合方案都被充分耐受并且组合疗法看似不抑制CTLA4mAb活性。在对单独CTLA4mAb无反应的肿瘤中观察到协同作用，表明其他治疗剂可能诱导免疫原性细胞死亡。

实施例12.用于治疗难治性转移性非小细胞肺癌的使用抗-Trop-2ADC(IMMU-132)和干扰素-α

的组合疗法

患者是经诊断患有非小细胞肺癌的60岁男性。给予该患者卡铂、贝伐单抗的化学疗法方案持续6个月，且显示了反应，且随后在进展之后，接下来的2年内接受含卡铂、依托泊苷、

吉西他滨的其他化学疗法疗程，偶然反应持续不超过2个月。该患者随后呈现测量为6.5cm x 4cm的左纵隔块和胸腔积液。

在签署知情同意书之后，每隔一周以18mg/kg的剂量给予该患者IMMU-132。在治疗第一周之后，给予该患者含IMMU-132和

的组合疗法。在前两次注射期间，经历了短期中性粒细胞减少症和腹泻，在4小时内有4次排便，但这些在2天内被对症用药解决或作出反应。在总计6次IMMU-132输注和

5次输注之后，指数病变的CT评估显示22％减少，刚好在部分反应部分响应以下但存在明确的肿瘤收缩。患者再继续该疗法两个月，此时通过CT注意到指数病变直径总和的45％肿瘤收缩的部分反应，因而根据RECIST准则构成部分反应。与分开施用两种药剂相比，组合疗法看似提供了协同反应。

实施例13.用于治疗晚期结肠癌的使用ADC(IMMU-130)和T细胞重定向bsAb(MT100)的组合疗法

患者是初步诊断为患有转移性结肠癌(IV期)的75岁妇女。她进行了右部半结肠切除术和小肠切除术，且随后接受FOLFOX、FOLFOX+贝伐单抗、FOLFIRI+雷莫芦单抗和FOLFIRI+西妥昔单抗疗法持续一年半，此时她显示疾病进展，疾病扩散至后穹窿、网膜，骨盆中出现腹水且胸腔右侧出现胸腔积液。就在此疗法之前，她的基线CEA效价是15ng/mL。她被连续2周每周两次给予6mg/kgIMMU-130(抗CEACAM5-SN-38)，然后休息一周(3周的周期)。在第一个循环之后，给予该患者含IMMU-132和白细胞重定向bsAbMT110的组合疗法，按照同样的3周循环通过连续输注施用。在耐受性非常良好而无任何主要血液学或非血液学毒性的5个循环之后，她的血浆CEA效价适度降至1.3ng/mL，但在8周评估中，她显示了指数肿瘤病变的21％收缩，这在13周时增至27％收缩。令人惊讶的是，此时患者的腹水和胸腔积液均减少(后者消失)，因而显著改良了患者的总体状态。与分开施用两种药剂相比，组合疗法看似提供了协同反应。

实施例14.用于治疗具有IV期转移性疾病的胃癌患者的使用ADC(IMMU-130)、抗-Trop-2x抗-CD3bsAb((E1)-3s)和干扰素-α的组合疗法

患者是由于与进食相关的胃部不适和疼痛持续约6年且在过去的12个月期间伴随体重损失而求医的52岁男性。对胃部区域的触诊显示硬块，随后进行胃镜检查，显示他的胃下部存在溃疡块。对此进行活组织检查且诊断为胃腺癌。实验室测试显示无特定异常变化，但在肝功能测试中，LDH和CEA升高，后者是10.2ng/mL。本专利随后进行了全身PET扫描，除胃部肿瘤以外，还显露了左腋下和右肝叶中的转移性疾病(2个小转移)。切除患者的胃部肿瘤，且随后获得他的转移性肿瘤的基线CT测量值。手术后四周，他接受3个疗程的由顺铂和5-氟尿嘧啶(CF)方案组成的组合化学疗法，但对此耐受不良，所以转而用多西他赛治疗。基于CT扫描，看起来疾病稳定了约4个月，随后患者主诉又出现体重损失、腹痛、食欲不振和极度疲劳导致重复CT研究，显示转移尺寸增加合计20％且在原始胃切除术部位出现位点疑似病变。

随后按照8mg/kg的每周方案给予患者含IMMU-130(抗CEACAM5-SN-38)的实验治疗。在第一周之后，开始使用IMMU-130、(E1)-3s和干扰素-α的组合疗法。患者在随后的4周内未展现腹泻或中性粒细胞减少症的证据。随后对患者进行CT研究以测量其转移性肿瘤尺寸和察看原始胃切除术区域。根据RECIST准则，放射科医师测量转移性病变总和与治疗前基线相比减少23％。原始胃切除术区域内似乎不存在任何明确的病变。此时患者的CEA效价是7.2ng/mL，相对于基线值14.5ng/mL大幅降低。患者继续每周一次组合疗法，且在总计13次输注之后，他的CT研究显示一个肝脏转移已经消失且所有转移性病变的总和减少41％，从而构成部分反应(通过RECIST)。患者的一般状况得到改善，且恢复其日常活动，同时继续每三周接受维持疗法。在最后一次测量血液CEA时，值是4.8ng/mL，这对于吸烟者(这是该患者的情况)来说在正常范围内。

实施例15.DOCK-AND-LOCK^TM的一般技术

以下论述的一般技术可用于使用所公开的方法和组合物来产生具有连接至任何抗体或抗原结合抗体片段的AD或DDD部分的DNL^TM复合物。

表达载体

已使用质粒载体pdHL2来产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等人，JImmunol Methods(1989),125:191-202；Losman等人，Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列基本上相同，仅有的差异存在于可变结构域(V_H和V_L)序列中。使用本领域的技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。

为了产生Fab-DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基连接子和DDD部分例如人RIIα的前44个残基的序列(称为DDD1，SEQ ID NO:1)替代。为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、具有15个残基的连接子和诸如使用生物信息学和肽阵列技术产生并显示以非常高的亲和性(0.4nM)结合RIIα二聚体的具有17个残基的合成AD(称为AKAP-IS)的AD部分(称为AD1，SEQ ID NO：3)的序列置换。参见Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体向Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体的转化，如下文所述。

CH1的制备

使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5′)端和SacII限制性核酸内切酶位点(其为CH1编码序列的5′)组成。右侧引物由编码铰链(PKSC，SEQ ID NO：102)前4个残基的序列组成，随后是4个甘氨酸和丝氨酸，其中最后两个密码子(GS)包含BamHI限制位点。将410bp PCR扩增引物克隆到

PCR克隆载体(

Inc.)中，并针对T7(5’)方向的插入片段来筛选克隆。

合成双链寡核苷酸，以编码DDD1的氨基酸序列，该氨基酸序列前面是连接子肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。所编码的多肽序列于下文示出。

GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：103)

合成在其3’端有30个碱基对重叠的两个寡核苷酸(命名为RIIA1-44顶部和RIIA1-44底部)，并对它们进行组合从而包含174bp DDD1序列的中心154个碱基对。使该寡核苷酸退火并用Taq聚合酶进行引物延伸反应。引物延伸后，通过PCR扩增双链体。将该扩增引物克隆到

中，并针对T7(5’)方向的插入片段进行筛选。

合成双链寡核苷酸，以编码AD1的氨基酸序列，该氨基酸序列前面是连接子肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。所编码的多肽序列于下文示出。

GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：104)

合成编码上述肽序列的两个互补重叠的寡核苷酸(命名为AKAP-IS顶部和AKAP-IS底部)，并使其退火。通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆到

载体中并针对T7(5’)方向的插入片段进行筛选。

连接DDD1与CH1

用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190bp片段从

中切除，并接着连接至

中的相同位点中以产生穿梭载体

连接AD1与CH1

利用BamHI和NotI从

中切除含有AD1序列的110bp片段，然后将其连接到

中的相同位点处从而产生穿梭载体

利用这种模块设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1并入到pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2移除SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)并将其置换为从相应

穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI限制性片段将整个重链恒定结构域置换为上述构建体之一。

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有DDD2(SEQID NO：2)的二聚化和对接结构域序列，该DDD2经由14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子附接至hMN-14的Fd羧基末端。所分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起的两个相同拷贝的hMN-14Fab构成。

表达载体如下进行工程改造。合成制备包含部分连接子肽和DDD2的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。使该寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，从而在5’和3’端产生适合于与分别用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。

将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体

连接以产生穿梭载体

用SacII和EagI从

中切除507bp片段，并将其与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似技术来产生多种不同人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。

h679-Fd-AD2-pdHL2

h679-Fab-AD2经设计与C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于CH1结构域的羧基末端的AD2的锚定结构域序列(SEQ ID NO:4)。AD2在AD1的锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基并且在其后具有另一个半胱氨酸残基。

表达载体如下进行工程改造。合成制备包含AD2和部分连接子序列的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2顶部和AD2底部)。将该寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，从而在5'和3'端上产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的悬突。

将双链体DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载体

中以产生穿梭载体

利用SacII和EagI限制酶从该穿梭载体中切除含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段，并将其连接到通过用这些相同的酶消化制备的h679-pdHL2载体中。最终表达载体为h679-Fd-AD2-pdHL2。

TF2DNL^TM构建体的产生

通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得三聚DNL^TM构建体，命名为TF2。如下以>90％产率产生TF2的试验批次。将经蛋白质L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1的摩尔比混合。总蛋白质浓度为于含1mM EDTA的PBS中1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP 291亲和色谱。在添加TCEP前，SE-HPLC未显示任何a₂b形成的迹象。添加5mM TCEP快速引起与针对二元结构预期的157kDa蛋白质一致的a₂b复合物形成。通过IMP 291亲和色谱将TF2纯化至接近均质(未示出)。IMP 291是含有679Fab结合到其上的HSG半抗原的合成肽(Rossi等人，2005,ClinCancer Res 11:7122s-29s)。IMP291未结合部分的SE-HPLC分析证明a₄、a₂和游离κ链从产物的移除(未示出)。

通过

测定法测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a₂b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原a₂和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)并流经固定有HSG的感测芯片。TF2的反应约为两个对照样品的反应的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分结合并保留于感测芯片上。随后注入的WI2IgG、针对hMN-14的抗独特型抗体证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分，如另外的信号响应所指示的。由WI2与固定于感测芯片上的TF2结合引起的反应单位的额外增加与各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚单位促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF2结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。

TF10DNL^TM构建体的产生

使用类似方案产生包含C-DDD2-Fab-hPAM4的两个拷贝和C-AD2-Fab-679的一个拷贝的三聚TF10DNL^TM构建体。使用针对产生(抗CEA)₂×抗HSG bsAb TF2所公开的方法，如上所述产生TF10双特异性([hPAM4]₂×h679)抗体。TF10构建体带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。

在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)。组合组织培养上清液，得到两倍摩尔过量的hPAM4-DDD。反应混合物在室温下在使用1mM还原型谷胱甘肽的温和还原性条件下孵育24小时。还原后，DNL反应通过使用2mM氧化型谷胱甘肽轻微氧化而完成。通过亲和色谱使用IMP291-affigel树脂分离TF10，该树脂以高特异性结合h679Fab。

实施例16.从多个抗体产生AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白

采用前述实施例中描述的技术，构建表11中示出的IgG和Fab融合蛋白，并将其并入到DNL^TM构建体中。该融合蛋白保留了亲本抗体的抗原结合特征，并且DNL^TM构建体表现出所并入抗体或抗体片段的抗原结合活性。

表11.包含IgG或Fab的融合蛋白

实施例17.NK靶向的白细胞-重定向bsAb的用途

使用bsAb重新靶向白细胞不限于针对T细胞的抗体。在替代的实施方案中，结合于单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞的bsAb也可以用于重新靶向目的。

CD16是针对由NK细胞的CD56^dim子集高度表达的IgG的活化低亲和力Fc-γ受体(Gleason等人，2012,Mol Cancer Ther 11:2674-84)。除其在NK细胞重新靶向方面的用途以外，包含抗CD16抗体组分的bsAb能够通过CD16的直接信号转导来活化NK介导的细胞毒性，从而诱导溶解性颗粒定向分泌和靶细胞死亡的能力(Gleason等人，2012)。

使用如先前所报告的DNA改组和连接技术(Vallera等人，2005，Clin Cancer Res11：3879-88)，根据Gleason等人，2012，Mol CancerTher11：2674-84)制备CD16/CD19双特异性杀灭细胞衔接子(BiKE)和CD16/CD19/CD22三特异性杀灭细胞衔接子(TriKe)。通过相继进行离子交换和尺寸排阻柱色谱法来纯化所表达的BiKE和TriKE。在CD16/CD19BiKE或CD16/CD19/CD22TriKE存在(10μg/mL)下将其余PBMC暴露于原发性ALL和CLL肿瘤细胞。与无重新靶向抗体时的细胞相比，在BiKE或TriKE存在下观察到对肿瘤细胞的细胞毒性显著增加。肿瘤细胞在不存在PBMC的情况下暴露于BiKE或TriKE时未观察到效应。相对于BiKE，TriKE对肿瘤细胞毒性具有较大作用，表明与额外肿瘤细胞抗原结合可以增强重新靶向效应。使用经过纯化的NK细胞代替PBMC观察到了类似的结果。

如Wiernik等人(2013)，Clin Cancer Res 19：3844-55中所公开来制备CD16/CD33BiKE。将BiKE施用于已注入与人PBMC共同施用的人HL60早幼粒细胞性白血病异种移植细胞的裸鼠。与经对照bsAb治疗的小鼠相比，经BiKE治疗的小鼠显示死亡率和肿瘤生长率降低。加入抗CD33-SN-38ADC进一步增强了BiKE的细胞毒性效应。

实施例18.用于治疗性用途的三价抗体

如专利EP1309795B1中所描述来制作三价三特异性细胞靶向构建体，包括：(i)对如专利US 618728中所描述的衍生出EP1309795的技术方案1的Fab的小鼠抗CD16mab进行嵌合或人源化；(ii)构建由US 7,238,785中所描述的人源化抗HLA-DR抗体的Fv构成的单链抗体，且通过连接子将所述scFv接合于(i)的抗CD 16Fab的轻链的羧基末端；和(iii)构建由US8486395中所描述的人源化抗CD19抗体的Fv构成的单链抗体，且通过连接子将所述scFv接合于(ii)的抗CD16Fab的CH1的羧基末端。

将该三价构建体与IMMU-132组合施用于患有转移性胰腺癌的受试者。观察到部分反应并且肿瘤显示尺寸消退，持续12个月。

实施例19.抗-Trop-2x抗-CD3双特异性抗体

双特异性抗体(bsAb)经由将CD3结合至肿瘤细胞(尤其癌)通过Trop-2靶向针对重定向T细胞作为串联单链可变片段产生。Trop-2是对于靶向各种上皮癌可以高度有效的肿瘤相关的抗原(TAA)。然而，针对T细胞重定向的疗法，已在任何bsAb形式中进行研究。Trop-2是35kDa跨膜糖蛋白，其在各种人癌症(包括胰腺癌和胃癌)中相对于正常组织过表达，其中表达增加与不良预后有关(Fong等人，2008,BrJ Cancer 99:1290-5；Iacobuzio-Donahue等人，2002,Am J Pathol160:1239-49；Kapoor,2013,Tumour Biol 34:1967-8；Muhlmann等人，2009，J Clin Pathol 62：152-8；Stein等人，1993，Int J Cancer 55：938-46；Stein等人，1993，Int J Cancer 55：938-46)。可变结构域(VH和VK)来源于hRS7，初始鼠抗-Trop-2mAb(RS7)的人源化版本与鼠抗-CD3mAb Okt3的可变结构域组合以生成E1-3bsAb。

用于哺乳动物细胞中E1-3的表达的质粒载体的构建

合成双链DNA序列(SEQ ID NO：106)并且组装到pUC57质粒载体中。通过用Xba I和Eag I限制性内切核酸酶消化将SEQ ID NO：106从pUC57切除并且连接到通过用相同的酶消化制备的pdHL2哺乳动物表达载体中。编码序列指向包含前导肽的单个多肽(SEQ ID NO：107)、hRS7VK(SEQ ID NO：108)、LI(SEQ ID NO：109)、hRS7VH(SEQ ID NO：110)、L2(SEQ IDNO：111)、Okt3VH(SEQ ID NO：112)、L3(SEQ ID NO：113)、Okt3VK(SEQ ID NO：114)以及6-His(SEQ ID NO：105)的合成。串联scFv E1-3的示意图在图22中示出。

包含E1-3插入物的合成DNA序列

tctagacacaggccgccatcatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgacattcagctgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtattgctgtagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctactcggcatcctaccggtacactggagtccctgataggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcagtttattactgtcagcaacattatattactccgctcacgttcggtgctgggaccaaggtggagatcaaaggtggaggagggtccggtggaggagggtctggtggaggagggagccaggtccagctgcagcaatctgggtctgagttgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggatacaccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggcccctggacaagggcttaaatggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatactgatgacttcaagggacggtttgccttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctccagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtgtatttctgtgcaagaggggggttcggtagtagctactggtacttcgatgtctggggccaagggtccctggtcaccgtctcctcaggtggcggagggtccgatatcaagctgcagcagtctggagcagagctcgctcgaccaggagctagtgtgaagatgtcatgtaaaacaagtggctatactttcacccggtacactatgcactgggtcaagcagcgcccaggacagggtctggaatggatcggctacattaaccccagcaggggatataccaactacaatcagaagttcaaggataaagccaccctgactaccgacaagtcctctagtacagcttatatgcagctgtcaagcctcacttccgaggactctgcagtgtattactgcgccagatattacgacgatcattattgtctggattactggggccagggaacaactctcacagtgtcctctgtcgaaggtggcagtggagggtcaggtggcagcggagggtccggtggagtggacgatatccagctgacccagtctcctgccattatgagcgcttccccaggcgagaaggtgacaatgacttgccgggccagttcaagcgtcagctatatgaattggtatcagcagaagtctggaaccagtcctaaacgatggatctatgacacatctaaagtggcaagcggggtcccatacaggttctctgggagtggttcaggcactagctattccctgaccatttcctctatggaggccgaagatgcagccacctattactgtcagcagtggagttcaaatccactcaccttcggagcaggcactaaactggaactcaagcaccaccaccaccaccactaaggcggccg(SEQ IDNO：106)

推导的E1-3的氨基酸序列

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH(SEQ ID NO：107)

hRS7 VK的氨基酸序列

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSTTCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTSSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIK(SEQ ID NO：108)

连接子L1的氨基酸序列

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：109)

氨基酸序列hRS7VH

QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO：110)

连接子L2的氨基酸序列

GGGGS(SEQ ID NO：111)

Okt3VH的氨基酸序列

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：112)

连接子的L3氨基酸序列

VEGGSGGSGGSGGSGGVD(SEQ ID NO：113)

Okt3VK的氨基酸序列

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE(SEQ ID NO：114)

SpESF骨髓瘤细胞中稳定产生克隆的开发

通过使用Sal I限制性内切核酸酶消化使E1-3-pdHL2载体线性化，并且使用850V和10μF的脉冲通过电穿孔，使用30μg稳定地转染1x 10⁷个SpESFX骨髓瘤细胞(Rossi等人，2011，Biotechnol Prog27：766-75)。从用0.2μM甲氨蝶呤(MTX)来补充选择和产生培养基。在96孔组织培养板中选择转染的克隆并且使用Ni-NTA 96孔板通过ELISA针对E1-3表达进行筛选。使用

树脂，通过固相金属亲和力色谱法(IMAC)，之后通过尺寸排除高效液相色谱法(SE-HPLC)将E1-3蛋白从滚瓶的培养基肉汤纯化。通过SDS-PAGE将纯化产物分解为单SE-HPLC峰值(未示出)和单个多肽带(未示出)，其中相对运动性符合其所计算的分子尺寸53,423Da。

实施例20.活体外Trop-2表达实体瘤细胞的重定向T细胞杀灭

从两个健康供体的血液标本(NJ血站)的血沉棕黄层制备外周血单核细胞(PBMC)并且用于分离CD8⁺T细胞(Miltenyi)。将Capan-1(胰腺癌，157,000Trop-2/细胞)、BxPC3(胰腺癌，500,000Trop-2/细胞)和NCI-N87(胃癌，247,000Trop-2/细胞)细胞系(ATCC)用作表达低、高和中等水平的Trop-2的靶细胞。BxPC3和NCI-N87保持在RPMI1640培养基中，该培养基补充有10％FBS，而将Capan-1细胞保持在20％FBS/RPMI1640中。CD8⁺T细胞(1.2x 10⁵细胞/孔)与靶细胞(2x 10⁴细胞/孔)以6∶1的比率在96孔组织培养基板中混合。将E1-3和(E1)-3s滴定添加到测定板。在37℃下在48小时温育后，使用PBS将板洗涤两次以除去T细胞，然后将补充有30％MTS试剂(CELLTITER

Aqueous One Solution，Promega)的150μL的新鲜培养基添加到每个孔。在1-2小时后于37℃下，使用ENVISION

测量490nm处的吸光度。

使用针对每个细胞系来自三个供体的T细胞，比较在三个Trop-2-表达的细胞系(BxPC3、Capan-1和NCI-N87)中，E1-3双特异性抗体与等同的DNL构建体(E1)-3s的体外效力(图23)。基于IC₅₀值(表12)，当与来自相同供体的T细胞比较时，在所有细胞系中，E1-3比(E1)-3s至少强效5倍，它对E1-3的相对敏感度看起来与Trop-2-抗原密度有关。然而，在所使用的供体T细胞中，效力是变化的。体外，E1-3介导了BxPC3[IC₅₀＝0.09(±0.04)pM]、Capan-1[IC₅₀＝1.2(±l.l)pM]和NCI-N87[IC₅₀＝1.2(±1.2)pM]靶细胞的高强效的T-细胞溶解。

表12.使用E1-3和(E1)-3s的Trop-2⁺癌细胞系的体外T细胞重定向杀灭的IC₅₀值

IC₅₀值＝导致50％杀灭的pM浓度。

*未实现50％杀灭。针对每个供体，供体1和2是相同的。供体3、4和5是独立的供体。

实施例21.E1-3对(E1)-3s的实体瘤的体内疗法

将混合有等体积的

的PBMC和NCI-N87(2:1)的混合物皮下注射施用到4-8周龄的NOD/SCID雌性小鼠。疗法由在第1到4天静脉内注射50μg的E1-3或在第1到5天每天注射47μg的(E1)-3s组成。未治疗的组接受NCI-N87和PBMC但无bsAb的混合物。每周两次，通过使用卡尺进行二维测量来确定肿瘤体积(TV)，体积定义为：L x W²/2，其中L是肿瘤的最长尺寸并且W是最短尺寸(图24)。肿瘤生长的统计分析基于曲线下面积(AUC)。通过线性弯曲建模获得单个肿瘤生长的图。使用F检验以确定生长曲线的统计分析前，组之间的方差等式。对生存数据的重要的Z检验鉴定从最终数据分析审查的P<0.05的给定的治疗组的任何异常值。使用双尾t检验评估除未治疗的对照的各个治疗组合和对照之间的统计显著性，对于除未治疗的对照，使用了单尾t检验。另外，功效使用Prism软件在使用存活替代端点作为达到1.0cm3的肿瘤进展时间(TTP)的Kaplan-Meier曲线上通过对数秩来确定。对于所有比较，显著性被认为P≤0.05。

E1-3(P)和(E1)-3s均显著地延缓了NCI-N87肿瘤的生长(P≤0.001；AUC_第25天)(图24)。E1-3优于(E1)-3s(P＝0.0324,AUC_第36天)(图24)。三天，体内两次分开给予50μg剂量的E1-3治愈具有NCI-N87异种移植物的全部小鼠(N＝8)(P＝0.0005；数秩)。在第39.5天，对照组(仅PBMC)中的肿瘤达到端值(TV>1cm³)。在78天后，E1-3组中所有小鼠都没有肿瘤。

实施例22.由抗-CD3x抗-Trop-2双特异性抗体诱导的胞啃

Trop-2在正常组织中存在受限，但在各种不同的上皮癌中高度表达。如以上实施例所论述，(E1)-3s是T细胞重定向三价双特异性抗体(bsAb)

复合物，其包含共价连接到Trop-2靶向的Fab的稳定二聚体的抗-CD3scFv。我们在此第一次显示bsAb介导的双向胞啃发生在靶细胞与T细胞之间并且涉及免疫突触的形成。

方法

BxPC3细胞与胰蛋白酶(不影响Trop-2)分离并且与纯化的T细胞混合。在37℃下，用0.1nmol/L bsAb将细胞混合物处理1小时。使用以下中任一个对细胞进行染色：(i)抗-Trop-2MABC518，然后GAM-FITC或(ii)抗-Trop-2-PE克隆MR54和抗-CD4-APC。通过前向和侧向散射以及Trop-2和CD4，从细胞缀合物荧光门控单个BxPC3和T细胞。

结果

(E1)-3s诱导T细胞与靶细胞之间免疫突触的形成。这使用Capan-1胰腺癌细胞示出(Rossi等人，2013,MAbs 6:381-91)。在此，将0.1μg/mL(E1)-3s分别添加到使用红色和绿色荧光膜标记的纯化的CD8⁺T细胞和NCI-N87胃癌细胞的混合物，导致缀合物的形成，这通过荧光显微法显而易见(未示出)。在(19)-3s(未示出)或TF12(未示出)存在的情况下，未观察到分别仅结合T细胞或NCI-N87的缀合物。将载玻片浸入盐水中洗掉含有(19)-3s或TF12的孔中的大部分T细胞，然而许多T细胞保持结合至使用(E1)-3s处理的孔中的粘着的NCI-N87细胞。

使用(E1)-3s处理的BxPC3(500,000Trop-2/细胞)和纯化的T-细胞混合物特别地诱导胞啃，由此Trop-2从BxPC3转移到T细胞(图25)。然而，在不存在BxPC3细胞的情况下，在使用仅结合Trop-2(TF12)或CD3[(20)-3s]的对照bsAb或使用(E1)-3s处理后，(E1)-3s处理导致40％Trop-2⁺T细胞，<T细胞的5％在Trop-2⁺门中被计数。T细胞对Trop-2的摄取与其在BcPC3细胞上的减少一致(图26)。在短暂的温育时间期间，T细胞(97.5％活)和BxPC3(94.5％活)保持在高存活下，从而表明T细胞通过胞啃并且不通过粘附到死细胞的膜片段获得肿瘤抗原(未示出)。由(E1)-3s介导的胞啃是双向的，因为T-细胞膜组分转移到BxPC3细胞，如针对CD4显示(数据未示出)。

实施例23.双特异性抗-CD3x抗-Trop-2抗体和细胞因子释放

如以上实施例中所论述，我们研究了干扰素-α(IFNα)对人胃和胰腺癌细胞系的(E1)-3s-介导的T-细胞杀灭的影响。使用外周血单核细胞(PBMC)或T细胞体外评估T-细胞活化、细胞因子诱导和细胞毒性，其中NCI-N87胃癌作为靶细胞。在靶细胞和PBMC的存在下，(E1)-3s未引起细胞因子过量产生。当与(E1)-3s混合时，单独不增加T-细胞活化或在基线上提升细胞因子水平的聚乙二醇干扰素α-2a增加了CD69表达但未显著地增加细胞因子诱导。IFNα增强了(E1)-3s的治疗功效而不将其他细胞因子的产生增加至可诱导细胞因子释放综合症(CRS)的水平。与IFNα或其他细胞因子的辅助疗法可普遍适用于增强T-细胞免疫疗法的功效。

方法

使用允许连接过夜的5x 10⁵个细胞/0.5mL/孔的NCI-N87或Raji体外测量细胞因子释放。将刚分离的PBMC(5x 10⁶个细胞/0.4mL/孔)添加到每个孔。针对每个试剂，将包含(19)-3s、19-3BiTE、(E1)-3s、聚乙二醇干扰素α-2a或(E1)-3s加上聚乙二醇干扰素α-2a的治疗物(100μL，l0x)添加到0.1nmol/L。另选地，对于剂量反应研究，使用1pmol/L至10nmol/L范围内的滴定。在37℃下20小时轻柔摇动温育后，上清液流体以1:2(或当需要时更大)稀释并且根据制造商的方案，使用Single-Analyte ELISArray试剂盒(Qiagen)测量TNFα、IFNg、IL2、IL6以及IL10的浓度。

结果

Trop-2x CD3BiTE(或等同物)不能与(E1)-3s相比较。然而，具有与(E1)-3s相同的(X)-3s分子构型的(19)-3s和具有与CD19x CD3BiTE布利莫单抗相同的氨基酸序列的19-3BiTE两者的可用性使头对头比较变得可能以评估两种bsAb形式的相对细胞因子-诱导效力。

初始，将(19)-3s和19-3BiTE的滴定添加到PBMC(两个独立供体)和Raji NHL细胞的混合物并且在20小时后测量TNFα、IFNγ和IL6的水平(未示出)。从单独PBMC检测最小细胞因子水平，即使是在添加bsAb的情况下。然而，由于Raji与供体PBMC之间发生的混合淋巴细胞反应(对于供体A更强)，针对TNFα(200pg/mL和50pg/mL)、IFNγ(600pg/mL和200pg/mL)和IL6(190pg/mL和220pg/mL)中的每一个，未经处理的细胞混合物中的细胞因子水平升高。仅在≥1nmol/L(19)-3s下，TNFα和IL6的水平增加到未治疗的水平以上。显而易见，在较低浓度下，(19)-3s抑制TNFα和IL6产生。相比之下，在所测试的19-3BiTE的所有浓度下(≥1pmol/L)，TNFα和IL6评估为>1,000pg/mL。通过(19)-3s，IFNγ的水平未增加，然而19-3BiTE显示了剂量依赖性增加到>2,000pg/mL。

对于所有进一步比较，在0.1nmol/L下测试试剂，这与在使用BiTE的类似研究中所使用的近似(Brandi等人，Cancer Immunol Immunother 2007,56:1551-63)。使用4个不同的供体，我们比较由来自混合有PBMC的Raji的0.1nmol/L(19)-3s或19-3BiTE诱导的TNFα、IFNγ、IL2、IL6以及IL10的水平(图27A)。对于4个供体中的每一个，相比于(19)-3s，使用19-3BiTE的五种细胞因子中每一个的水平都显著更高。使用19-3BiTE的平均TNFα浓度(2,284pg/mL±1,483pg/mL)比(P＝0.0001)使用(19)-3s的平均TNFα浓度(280±188pg/mL)高8倍。对于19-3BiTE，相比于(19)-3s，使用19-3BiTE治疗使得IFNγ(3,002pg/mL±560pg/mL对416pg/mL±169pg/mL)、IL2(13,635pg/mL±2,601pg/mL对1,024pg/mL±598pg/mL)、IL6(981pg/mL±364pg/mL对168pg/mL±96pg/mL)和IL10(4,006pg/mL±2,520pg/mL对493pg/mL±242pg/mL)的水平高7倍、13倍、6倍以及8倍(对于每个，P<0.0001)。这些结果表明(X)-3s bsAb形式在细胞因子释放的诱导者方面效力远低于BiTE形式。

一般来讲，在PBMC和靶细胞的存在下，(E1)-3s比(19)-3s引起甚至更少的细胞因子产生，因为不存在淋巴细胞反应以升高基线水平(图27B)。5个供体中的4个，对于IFNγ(<100pg/mL)、TNFα(<100pg/mL)和IL2(<250pg/mL)的促炎细胞因子水平保持较低。5个供体中的3个，IL6水平低(<400pg/mL)，并且供体D-2和D-5水平中等(800-1,100pg/mL)。对于IFNγ(1,000pg/mL)和TNFα(190pg/mL)，供体D-2还比其他更多地响应于(E1)-3s。5个供体中的3个，通过(E1)-3s，IL10，抗炎细胞因子显著(P<0.0001)提升至>1,200pg/mL。值得注意的是，在使用(E1)-3s处理后，具有独特强效促炎反应的供体D-2产生了相对低水平的IL10(230pg/mL)。相比于背景，仅聚乙二醇干扰素α-2a不增加任何细胞因子的水平。将聚乙二醇干扰素α-2a添加到(E1)-3s一贯地比仅(E1)-3s增加IFNγ(约1.5-3倍)。对于剩余细胞因子，使用组合存在明显中度增加产生的趋势；然而，未观察到持续影响。

实施例24.由双特异性抗-CD3x抗-Trop-2抗体诱导的体外细胞毒性

进行进一步研究以检查由抗-CD3x抗-Trop-2双特异性抗体诱导的体外细胞毒性。

方法

使新鲜分离的CD8⁺T细胞与0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a、0.1nM 20*-2b或仅培养基温育24小时。治疗或未治疗T细胞和PKH67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率(5x 10⁴个靶细胞和2.5x 10⁵个效应细胞/孔)在含有(E1)-3s的系列稀释液的48孔板中混合，一式三份。在合适的细胞混合物中，聚乙二醇干扰素α-2a或20*-2b保持在0.1nM。板在37℃孵育48小时。除去悬浮液细胞，并且使用胰蛋白酶-EDTA分离连接的细胞，并且与对应的悬浮液混合。洗涤细胞并且重悬在含有30,000COUNTBRIGHT^TM绝对计数珠(Absolute CountingBeads)(Life Technologies)和1μg/mL的7-AAD的1％BSA-PBS中。通过流式细胞术计数总存活靶细胞(7-AAD^-/PPKH67⁺)。对于每个样品，8,000个COUNTBRIGHT^TM珠粒计数为标准化参考。使用下式计算具体溶解(％)：[1-(A₁/A₂)]x 100，其中A₁和A₂分别代表测试中存活靶细胞的数目和未经处理的样品。针对IC₅₀(导致50％溶解的浓度)、EC₅₀(50％有效浓度和溶解^最大(最大靶细胞溶解)，使用Prism软件通过F检验在非线性回归(S形剂量反应)曲线上确定统计显著性(P≤0.05)。

结果

评估Trop-2-表达肿瘤细胞的重定向的T-细胞杀灭，在存在或不存在IFN-α2(0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a或20*-2b)的情况下，将CD8⁺T细胞与NCI-N87细胞连同(E1)-3s的滴定混合(图28)。在供体中，在T-细胞效力中观察到相当多的变化(图28A，图28B)。在供体的非常活性的T细胞的情况下，(E1)-3s介导了NCI-N87细胞的高度强效(IC₅₀＝0.37pM；溶解^最大＝77.1％)T-细胞溶解并且聚乙二醇干扰素α-2a的包括增强了其活性，从而将IC₅₀(0.14pM；P＝0.0001)改进超过2.5倍并且增加了溶解^最大(84.0％；P<0.0001)(图28A)。NCI-N87仅对IFN-α(聚乙二醇干扰素α-2a IC₅₀＝>10nM，数据未示出)的直接作用敏感性较差并且在不存在(E1)-3s的情况下，通过0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a抑制<10％。由通过

融合至二价抗-CD20mAb的4IFN-α分子组成的IFNα的更强效的形式，20*-2b，将(E1)-3s的效力增强7倍以上(IC₅₀＝0.05pM；P<0.0001)。在0.1nM下，在不存在(E1)-3s的情况下，20*-2b将NCI-N87抑制了12.6％。包括20*-2b仅是为了显示另一种(更强效)形式IFN-α的增强的活性并且该影响不限于聚乙二醇干扰素α-2a。在此实验中，抗-CD20mAb部分是非功能性的。在使用非常弱的供体T细胞的类似的测定中，(E1)-3s的功效非常小(EC₅₀＝39pM；溶解^最大＝21％)；然而，添加聚乙二醇干扰素α-2a将效力增强>25倍(EC₅₀＝1.4pM；P＝0.0008)(图28B)。针对人胰腺癌系BxPC3,也观察到了强效的(E1)-3s-介导的T-细胞杀灭(IC₅₀＝0.4pM)；然而，未使用此细胞系对添加IFN-α的影响进行评估(未示出)。

实施例25.通过抗-CD3x抗-Trop-2双特异性抗体的T细胞活化的剂量反应曲线

添加0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a中度而非显著地增强了使用(E1)-3s处理的T细胞上的CD69上调。对于测量CD69⁺T细胞％的(E1)-3s剂量反应实验，在IFN-α的存在下，针对CD4⁺T细胞，EC₅₀从26pM降低至16pM(P＜0.0001)，针对CD8⁺T细胞，从11pM降低至6pM(P＝0.0204)(图29A)。与(E1)-3s混合的聚乙二醇干扰素α-2a产生更多CD69⁺细胞(图29B，图29C，P＜0.0001)，并且同样，使用IFN-α活化细胞具有显著更高的CD69表达(图29B,图29D；MFI＝907对726；P＜0.0001)。在不存在(E1)-3s的情况下，聚乙二醇干扰素α-2a诱导的CD69表达最小。同样，在不存在靶细胞的情况下，(E1)-3单独或与聚乙二醇干扰素α-2a组合未活化T细胞。

实施例26.使用IFN-α增强了使用(E1)-3s的扩展体内存活

将以上实施例3中报告的体内存活的初步数据进一步扩展至长达126天。如以下所示，(E1)-3s与IFN-α的组合为具有Trop-2⁺异种移植物肿瘤的动物提供最大的益处。

方法

向4-8周龄NOD/SCID雌性小鼠(Charles River,Wilmington,MA)皮下注射混合有等体积的基质胶的5x 10⁶个肿瘤细胞(Capan-1或NCI-N87)与T细胞(2.5x 10⁶)的混合物。根据BiTE方法学，通过静脉内注射，1小时后开始治疗(Dreier等人，2003,J Immunol170:4397-402)。每个实验中的处理方案、剂量和动物数目描述于图例中。每周两次，通过使用卡尺进行二维测量来确定肿瘤体积，体积定义为：L x w,²/2，其中L是肿瘤的最长尺寸并且w是最短尺寸。

肿瘤生长的统计分析基于曲线下面积(AUC)。通过线性弯曲建模获得单个肿瘤生长的图。使用F检验试以确定生长曲线的统计分析前，组之间的方差等式。对生存数据的重要的Z检验鉴定从最终数据分析审查的P≤0.05的给定的治疗组的任何异常值。使用双尾t检验评估除未治疗的对照的各个治疗组合和对照之间的统计显著性，对于除未治疗的对照，使用了单尾t检验。另外，功效使用Prism软件在使用存活替代端点作为达到1.0cm³的肿瘤进展时间的Kaplan-Meier曲线上通过对数秩来确定。对于所有比较，显著性被认为P≤0.05。

结果

使用Capan-1异种移植物评估对人胰腺癌的体内功效。在第一个研究中，使用(E1)-3s与聚乙二醇干扰素α-2a[中值存活时间(MST)>59天]的组合治疗优于所有其他治疗(P<0.0007，数秩)，包括单独(E1)-3s(MST＝50天)或聚乙二醇干扰素α-2a(MST＝53天)(图30A)。甚至在省略T细胞的情况下，聚乙二醇干扰素α-2a扩展了存活率(MST＝45天，P＝0.0059对盐水，数秩)，从而指示对肿瘤细胞的直接作用。然而，在T细胞的存在下，聚乙二醇干扰素α-2a更有效(P＝0.0260,AUC)，从而表明IFN-α对T细胞的刺激。TF12，其结合靶标而非T细胞，不影响肿瘤生长或存活。使用来自不同供体的T细胞，重复实验证实第一研究的结果(图30B)。继续第二研究，直到所有组达到它们的MST。如在初始实验中，在肿瘤生长抑制和总体存活方面，(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a(MST＝119.5天)的组合优于所有其他组(P＝0.0475对仅(E1)-3s；P＜0.0001对所有其他组；数秩)。(E1)-3s(MST＝68天)优于(P＝0.0373，29天后AUC)具有T细胞的聚乙二醇干扰素α-2a(MST＝53天)并且优于仅T细胞(MST＝37.5天；P＝0.0014数秩)。

对于NCI-N87胃癌异种移植物模型(图30C)，(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a的组合(MST>88天)优于仅(E1)-3s(MST＝49天；P＝0.0007,数秩)。相比于仅具有T细胞的对照组(MST＝32天)，具有T细胞的仅聚乙二醇干扰素α-2a提供较小但显著的存活优势(MST＝35天；P＝0.0276)。(E1)-3s加上聚乙二醇干扰素α-2a但无T细胞未显著改善存活。

针对NCI-N87[247,000(±65,000)Trop-2/细胞]和Capan-1[157,000(±37,000)Trop-2/细胞]测量的抗原密度无显著不同。通过聚乙二醇干扰素α-2a，Capan-1细胞比NCI-N87对直接抑制的敏感度>5倍(IC₅₀＝2nM对>10nM)体外(未示出)。(E1)-3s不与小鼠Trop-2或CD3交联反应(未示出)，并且NOD-SCID小鼠T-细胞不足。

讨论

此部分讨论实施例23-26中呈现的结果。在以上实施例1和2中，我们使用若干示例构建体，讨论了用于造血和实体瘤两者的重定向T细胞介导的疗法的(X)-3s bsAb形式的用途，该构建体包括(E1)-3s、(19)-3s和(20)-3s。在根据那个研究的一个体内实验中，使用(E1)-3s在该实验中处理Capan-1异种移植物，我们包括了具有聚乙二醇干扰素α-2a的组，因为先前(未公布)数据显示Capan-1被IFN-α抑制。添加IFN-α所观察的突出增强促使进一步探索，从而产生了现在的研究。本文报告了使用T细胞重定向双特异性抗体与聚乙二醇干扰素α-2a组合的研究结果。扩展研究直到所有组达到它们的MST，从而证实了IFN-α可增强IFN-α敏感性细胞系的T-细胞杀灭的体内功效。IFN-α还可增强对IFN-α的直接作用不敏感的细胞系的T细胞介导的杀灭。在包括给药和方案的方法后进行这些体内研究，通常与BiTE构建体一起使用。

Flieger及同事展示使用IFN-α或IL-2增强了CD3⁺CD56⁺NK-T细胞的体外杀灭，该CD3⁺CD56⁺NK-T细胞被体外扩展并且使用EpCAMxCD3BiTE(MT110)重定向(Flieger等人，2000,Cancer Immunol Immunother 49:441-8)。然而，甚至在不存在bsAb的情况下，IFN-α显著抑制靶细胞。因为缺少评估IFN-α对靶细胞的可能直接效应的对照，所有不能确定相比于靶细胞的直接抑制，由于IFN-α，NK-T细胞受刺激的增强的细胞毒性的程度。因此，我们测量了在存在和不存在pan-T细胞的两种情况下，靶细胞和仅具有聚乙二醇干扰素α-2a的被包括的组对IFN-α的敏感性。对于体外对IFN-α更敏感的Capan-1肿瘤，聚乙二醇干扰素α-2a在不存在T细胞的情况下改善了存活率并且甚至在存在T细胞的情况下更是如此，从而表明在此模型中IFN-α在Capan-1以及T细胞中起作用。在不存在T细胞的情况下，聚乙二醇干扰素α-2a未改善具有NCI-N87异种移植物的小鼠的存活率，所述NCI-N87异种移植物对IFN-α体外不敏感，从而指明使用IFN-α的增强主要是因为其对T细胞的作用。所观察的通过IFN-α的T-细胞增强的机制尚不清楚。归因于IFN-α的CD69表达的增强是中度但显著的，从而表明细胞因子可加强使用bsAb诱导的T-细胞活化。另外，IFN-α明确地增加了(最高达3倍)IFN-γ的释放，其被认为是由细胞毒性T细胞产生的主要细胞毒性细胞因子，而所测量的其他细胞因子都未持续增加。

未临床或甚至在动物模型中探索使用IFN-α与T细胞-重定向bsAb的组合疗法。然而，在临床试验中，IL-2与抗-CD3/EpCAM四价体瘤的F(ab’)₂片段混合(Kroesen等人，1997,Cancer Immunol Immunother 45:203-6)，但是由于最可能由第二细胞因子的诱导产生的大量毒性(被称为CRS或细胞因子风暴)，治疗受到限制。已知系统性施用IL-2诱导细胞因子风暴(Panelli等人，2004,J Transl Med 2:17)，并且与CRS有关，诸如与TGN1412灾难性的试验有关的不利事件的烈度与IL-2释放相关(Eastwood等人，2013,Br J ClinPharmacol76:299-315)。虽然具有副作用，但是使用不是由T细胞产生的IFN-α的免疫疗法通常与细胞因子风暴无关。

CRS是与使用任何T-细胞定向的mAb(例如，Okt3)或bsAb(包括BiTE)的免疫疗法有关的风险(Klinger等人，2012,Blood119:6226-33)。然而，不是所有bsAb形式都不可避免地具有相同的风险。Brandi等人报告了使用布利莫单抗的细胞因子诱导，其中在供体之中，IL-2、IL-6、IFN-γ以及TNF-α的反应水平是变化的并且通常达到>1ng/mL的峰值，其中一些供体达到的水平高达5ng/mL(Brandi等人，2007,Cancer Immunol Immunother 56:1551-63)。我们缺少合适的BiTE或等同构建体以用于与(E1)-3s直接比较。然而，使用CD19XCD3BiTE(与布利莫单抗相同的序列)和由

制备的(19)-3s，我们能够比较(X)-3s与BiTE形式之间的相对细胞因子诱导效力。在类似的条件下，19-3BiTE诱导如Brandi及其同事报告的类似的细胞因子水平。对于19-3BiTE，测量的五种细胞因子的水平比(19)-3s的那些水平高7-13倍。使用外来淋巴瘤细胞(Raji)引起混合淋巴细胞反应，这增加了基线细胞因子水平，尤其对于IL-2。BiTE而非(19)-3s，将细胞因子水平增加为远高于淋巴细胞基线水平。将NCI-N87胃癌细胞用作(E1)-3s的靶标不增加基线细胞因子水平。我们在对(E1)-3s的供体反应中观察到预期的变化；然而，所得细胞因子水平甚至低于由(19)-3s诱导的那些细胞因子水平，尤其是对于TNF-α和IFN-γ，其<100pg/mL。然而，五个供体中的一个升高了IFN-γ和IL-6的水平(约1ng/mL)。将IFN-α(聚乙二醇干扰素α-2a)添加到(E1)-3s将IFN-γ增加了2-3倍，但未持续低影响其他细胞因子的水平。这些结构表明，相比于其他构建体诸如BiTE，(X)-3s bsAb形式较少可能诱导CRS，并且将IFN-α添加到治疗方案不增加这种风险。

我们观察到供体T细胞的效力的相当大的变化。图28中示出的体外结果代表我们所测试的具有最大活性和最小活性的T细胞，其中用于杀死NCI-N87的效力相差100倍(IC₅₀＝0.37pM对39pM)；然而，IC₅₀＝1-5pM是最优代表性的(>10个供体)并且低活性T细胞是非典型的。值得注意的是，通过IFN-α的使用较弱的T细胞的溶解比使用强效T细胞的溶解加强得更多。

EpCAM是广泛利用的在许多癌中过表达的TAA。然而，癌中EpCAM的异源表达和EpCAM不是肿瘤特异性的事实(因为它在大多数正常上皮中表达)产生向EpCAM定向的免疫疗法可具有严重副作用的担忧(Balzar等人，1999,J Mol Med(Berl)77:699-712；Momburg等人，1987,Cancer Res 47:2883-91)。类似EpCAM，Trop-2在多种癌中高度表达，但它在正常组织中的表达仍有争议。若干报告指出，与肿瘤细胞相比，不管正常组织中的基线表达，成人身体细胞显示很少或不显示Trop-2表达，这在肿瘤中不变地上调(Wang等人，2008,MolCancer Ther 7:280-5；Zhang等人，1997,Science 276:1268-72)。然而，最近迹象指示若干正常组织的上皮的Trop-2的表达(Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33)。尽管如此，在施用与SN-38缀合成抗体-药物缀合物(ADC)的高剂量的hRS7后(人源化抗-Trop-2)，食蟹猴中Trop-2的表达未产生毒性(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res17:3157-69)。此外,在使用这种抗-Trop-2ADC的临床研究中，除易控制的中性粒细胞减少症和痢疾外，在治疗剂量下，未从药物(依立替康的代谢物)观察到预期增加的正常组织毒性(Starodub等人，Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association forCancer Research.2014(摘要CT206))。因此，相比于靶向EpCAM的类似的方案，期望将Trop-2用作肿瘤靶向的免疫疗法(包括T细胞重定向疗法)具有类似或更大的治疗指数。

这是由bsAb介导的靶肿瘤与T细胞之间的胞啃的第一份报告。此发现展示了使用(E1)-3s诱导的靶/T-细胞缀合物具有功能性免疫突触。我们在B细胞与T细胞之间观察到类似的双向胞啃，这由(19)-3s(未公布数据)介导并且认为这可能是使用T-细胞重定向bsAb的常见现象。

实施例27.对E1-3双特异性抗体的进一步研究

发明内容

使用hRS7(人源化抗-Trop-2mAb)和Okt-3(抗-CD3mAb)的可变结构域，T-细胞重定向双特异性串联scFv，E1-3如以上实施例19中所述产生。此实施例中报告的研究延续并且扩展实施例20-25中示出的结果。马上报告的结果与实施例20-25中显示的结果之间任何矛盾均基于另外收集的数据。使用PBMC或纯化的T细胞体外评估T-细胞活化、增殖、细胞因子诱导和细胞毒性，其中将人胰腺(Capan-1和BxPC-3)和胃(NCI-N87)癌细胞系用作靶细胞。使用皮下接种的NCI-N87异种移植物，在具有两倍数目的人PBMC和基质胶的混合物中测定体内活性。

结果

在靶细胞和PBMC的存在下，E1-3强效地诱导T-细胞活化、增殖、IL-2(>2ng/mL)、IL-6(>1ng/mL)、IL-10(>7ng/mL)、TNF-α(>1ng/mL)以及IFN-γ(>50ng/mL)的剂量依赖性细胞因子产生。使用3-5个不同的T细胞供体，E1-3T-细胞介导了BxPC-3[IC₅₀＝0.09(±0.04)pM]、Capan-1[IC₅₀＝1.2(±1.1)pM]和NCI-N87[IC₅₀＝1.2(±1.2)pM]靶细胞体外高度强效的T细胞溶解。体内两次分开给予50μg剂量的E1-3治愈具有NCI-N87异种移植物的8个小鼠中的六个(P＜0.0001；数秩)。在39.5天的中值，对照组(仅PBMC)中的肿瘤达到端值(TV>1cm³)。8个动物中7个未达到端值，其中当实验在176天后终止时，在E1-3组中，小鼠中的6个保持不具有肿瘤。

T-细胞活化和增殖-纯化的CD8⁺T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合，使用0.01nM E1-3处理18小时并且通过流式细胞术分析。在靶细胞的存在下通过E1-3上调CD69(未示出)。省略E1-3或NCI-N87靶细胞的处理未诱导CD69表达(未示出)。另外，在存在E1-3和靶细胞的情况下培育后，T细胞经历前向(FSC)散射和侧向散射(SSC)并且增加(未示出)。三天后，T-细胞增殖是显而易见的(P<0.005，数据未示出)。

细胞因子释放-确定作为剂量的函数的诱导细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6以及IL-10的释放的E1-3双特异性串联scFv的能力。如图31中所示，在皮摩尔浓度范围内，E1-3双特异性抗体有效地诱导细胞因子释放。

体外T-细胞介导的杀灭-在存在纯化的CD8⁺T细胞的情况下(1.2x 10⁵/孔)，确定E1-3诱导靶胰腺和胃癌细胞的T-细胞介导的杀灭的能力。使用来自代表性供体的T-细胞的示例性剂量反应曲线在图32中示出。在此实验中，针对Capan-1，E1-3的IC₅₀值为0.6pM，针对BxPC-3，0.1pM并且针对NCI-N87，0.3pM。

E1-3的体内抗肿瘤效应-分三天给予两个50μg剂量的E1-3来治疗具有NCI-N87异种移植物的裸鼠。治疗(图33A)治愈了具有人胃癌异种移植物的8个小鼠中的6个(P<0.0001；数秩)。相比于对照组的肿瘤(仅使用PBMC治疗)，其在39.5天的中值达到端值(TV>1cm³)(图33B)。在176天研究终止后，E1-3组中8个动物中的7个未达到端值。

结论

以上研究显示Trop-2是用于胰腺、胃和其他上皮癌的T介导的杀灭的有吸引力的靶标。E1-3抗-Trop-2x抗-CD3双特异性抗体诱导T-细胞活化和细胞因子产生。E1-3在体外和体内杀灭实体瘤方面是高度有效的。

* * *

按照本公开内容，不需要过度的实验就可以制备和实行本文公开和要求保护的所有组合物和方法。虽然组合物和方法已经在优选实施方案方面描述，但是本领域技术人员显而易见的是，变化可用于组合物和方法以及本文描述方法的步骤或步骤序列而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，化学和生理相关的某些试剂可取代本文描述的试剂，同时获得相同或类似结果。对本领域技术人员来说显而易见的是所有此类相似的替代和修改被认为在如由随附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (20)

1.双特异性抗体在制备用于诱导针对Trop-2表达的癌症的免疫应答的组合物中的用途，其包括向患有Trop-2表达的癌症的受试者施用双特异性抗体，所述双特异性抗体包含至少一个针对Trop-2的结合位点和至少一个针对CD3的结合位点，其中所述双特异性抗体由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成。

2.如权利要求1所述的用途，所述组合物还包含至少一种治疗剂，所述治疗剂选自由以下组成的组：(i)选自由干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ1、干扰素-λ2以及干扰素-λ3组成的组的干扰素；以及(ii)检查点抑制剂抗体。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述干扰素是干扰素-α。

4.如权利要求2所述的用途，其中所述检查点抑制剂抗体选自由以下组成的组：兰利珠单抗(MK-3475)、尼鲁单抗(BMS-936558)、皮地珠单抗 (CT-011)、AMP-224、MDX-1105、MEDI4736、MPDL3280A、BMS-936559、伊匹单抗、利利单抗、IPH2101以及曲美目单抗。

5.如权利要求2所述的用途，其中所述检查点抑制剂抗体结合至选自由CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3、B7-H3、B7-H4、KIR以及TIM3组成的组的抗原。

6.如权利要求2所述的用途，其中所述双特异性抗体和所述治疗剂同时或按顺序施用。

7.如权利要求3所述的用途，其中所述干扰素是作为游离干扰素、PEG化干扰素、干扰素融合蛋白质或缀合至抗体的干扰素来施用。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述Trop-2表达的癌是食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌或前列腺癌。

9.如权利要求1所述的用途，所述组合物还包含选自由以下组成的组的治疗剂：第二抗体或其抗原结合片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA、硼化合物以及放射性同位素。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述药物选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、Cox-2抑制剂、伊立替康、SN-38、卡铂、克拉屈滨、坎托替康、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表阿霉素葡糖苷酸、埃罗替尼、雌氮芥、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟脲苷、3',5'-O-二油酰基-氟脲苷、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替比、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉利司、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、Pro-2-P-Dox、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱以及ZD1839。

11.如权利要求9所述的用途，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1- β以及IP-10。

12.如权利要求9所述的用途，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、造血因子、集落刺激因子、干扰素、促红细胞生成素和血小板生成素。

13.如权利要求9所述的用途，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素、促甲状腺激素、促黄体激素、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关的肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素、神经生长因子、神经生长因子-β、血小板生长因子、转化生长因子、转化生长因子-α、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生长素(EPO)、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-λ、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及淋巴细胞毒素。

14.如权利要求1所述的用途，其中所述双特异性抗体诱导针对Trop-2表达的癌的免疫应答，而不将细胞因子产生增加至能够诱导细胞因子释放综合征的水平。

15.如权利要求1所述的用途，其中所述双特异性抗体诱导Trop-2表达癌细胞与T细胞之间细胞表面抗原的胞啃。

16.一种双特异性抗体，其包含至少一个针对Trop-2的结合位点和至少一个针对CD3的结合位点，其中所述双特异性抗体由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成。

17.如权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体当施用到患有Trop-2表达的癌的受试者时，能够诱导针对Trop-2表达的癌的免疫应答。

18.如权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述Trop-2表达的癌是食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌或前列腺癌。

19.如权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体能够诱导对Trop-2表达的癌的免疫应答，而不诱导细胞因子释放综合征。

20.如权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体诱导Trop-2表达癌细胞与T细胞之间细胞表面抗原的胞啃。

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