CN110998328A - 癌症的诊断与治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于癌症疗法的组合物和方法，包括但不限于用于利用癌症生物标志物的疗法。特别地，本发明涉及用于预测受试者对癌症疗法的反应的组合物和方法。

Description

癌症的诊断与治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年6月23日提交的美国临时申请No.62/524,116的优先权和权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于癌症诊断、研究和疗法的组合物和方法，包括但不限于癌症标志物。特别地，本发明涉及用于预测受试者对癌症疗法的反应的组合物和方法。
背景技术
对个性化医学的日益关注，加上我们对癌症生物学的不断了解，揭示了生物标志物在癌症治疗中的巨大潜力。多种不同生物标志物已经引入到临床实践中以预测患者存活、评价治疗功效或监测疾病进展(Bailey et al,Discovery medicine,2014,17:101-114)。靶向癌症疗法的高成本是开发生物标志物的强大动力，以便选择最可能从治疗中受益的那些患者。为此，监管机构越来越多地要求在临床评价中纳入用于新疗法的预测性生物标志物(Marton&Weiner,Biomed Res Int.2013；2013:891391。
乳腺癌是美国女性中第二大最常见的癌症形式，也是女性癌症死亡的第二大主要原因。20世纪80年代，乳腺癌新发病例数目急剧增加，但现在这一数字似乎已经稳定下来。乳腺癌死亡率的下降可能是由于越来越多的女性接受了乳房X光摄影。如果及早发现，则成功治疗乳腺癌的机会将大大提高。
在早期发现时，通过手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法治疗的乳腺癌，最通常是可治愈的。乳房X光摄影是早期发现乳腺癌最重要的筛查手段。乳腺癌被分为多种亚型，但是目前已知其中只有少数几种会影响预后或疗法选择。最初怀疑是乳腺癌之后的患者管理通常包括诊断的确认、疾病阶段的评估以及疗法的选择。可以通过针吸细胞学检查，针对无法触诊的病变的立体定向或超声技术的芯针穿刺活检，或切开或切除活检来确认诊断。
预后受患者的年龄、疾病分期、原发肿瘤的病理特点，包括肿瘤坏死的存在，肿瘤组织中的雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)水平，HER2过表达状态和增殖能力的测量值的影响，以及受更年期状态和总体健康的影响。超重患者的预后可能较差(Bastarrachea etal.,Annals of Internal Medicine,120:18[1994])。预后也随种族变化，黑人和较小程度上的西班牙裔人与白人相比预后更差(Elledge et al.,Journal of the NationalCancer Institute 86:705[1994]；Edwards et al.,Journal of Clinical Oncology 16:2693[1998])。
乳腺癌的三种主要治疗是手术、放射和药物疗法。没有适合每个患者的治疗方法，且通常需要两种或更多种治疗。选择取决于许多因素，包括患者的年龄和其更年期状态、癌症类型(例如导管型还是小叶型)、癌症分期、肿瘤是否能接受激素以及其浸润程度。
乳腺癌的治疗限定为局部或全身性。手术和放射被认为是局部疗法，因为它们直接治疗肿瘤、乳房、淋巴结或其他特定区域。药物治疗被称为全身疗法，因为其作用广泛。药物疗法包括经典的化学疗法药物、激素阻断治疗(例如，芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂和雌激素受体下调剂)以及单克隆抗体治疗(例如，针对HER2)。它们可以单独使用，或者最通常以不同组合使用。
HER2(ERBB2)是在乳腺癌中被验证过的生物标志物，且在～20％的新诊断的乳腺癌患者中发现了HER2基因扩增或蛋白质过表达(Slamon,et al.,Science,1989,244,707-712；Hernandez-Blanquisett,et al,Breast(Edinburgh,Scotland),2016,29,170-177)。HER2被用作治疗性生物标志物，用于使用靶向HER2的单克隆抗体(mAbs)(曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab))和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(拉帕替尼(lapatinib)和阿法替尼(afatinib))来治疗(Hernandez-Blanquisett,et al,Breast(Edinburgh,Scotland),2016,29,170-177)。靶向HER2的mAb和TKI的药理作用是药物-靶点相互作用的直接结果，且包括抗体介导的细胞毒性(ADCC)(mAb)、HER2下调和抑制生长促进信号传导(Rimawi,et al,Annual review of medicine,2015,66,111-128；Clynes,et al,Nature medicine,2000,6,443-446；Harbeck,et al,Breast care,2013,8,49-55)。HER2经历受体介导的内吞作用的能力也使这种跨膜蛋白成为将细胞毒性剂递送到癌细胞中的候选物。抗体-药物缀合物(ADC)曲妥珠单抗emtasine(T-DM1)确实已经例证了这一点(LewisPhillips,et al,Cancer research,2008,68,9280-9290；Verma,et al,The New Englandjournal of medicine,2012,367,1783-1791；Barok,et al,Breast cancer research,2011,13,R46)，其于2013年收到FDA批准用于治疗转移性乳腺癌。
T-DM1由通过硫醚(环己烷-1-羧酸N-马来酰亚胺基甲酯(MCC))与高细胞毒性的美登素衍生的药物DM-1连接的曲妥珠单抗组成(Baron,et al,Journal of oncologypharmacy practice,2015,21,132-142)。给药后，T-DM1与HER2结合，并通过HER2介导的内吞作用被带入细胞。胞内体/溶酶体途径内曲妥珠单抗-组分的蛋白水解降解推测为胞液释放DM1的机制，其随后诱导微管去稳定和细胞死亡(Erickson,et al,Cancer research,2006,66,4426-4433；Martinez,et al,Critical reviews in oncology/hematology,2016,97,96-106)。因此，除了由其曲妥珠单抗-组分产生的药理作用外，T-DM1还诱导细胞内的细胞毒性作用机制。
利用HER2作为药物转运体的另一种实验方法是通过使用靶向HER2的融合毒素，诸如MH3-B1/rGel，它由与I型核糖体失活蛋白毒素gelonin遗传融合的结合HER2的单链可变片段MH3-B1组成(Cao,et al,Cancer Res.,2009,69,8987-8995；Cao,et al,Mol.CancerTher.,2012,11,143-153)。MH3-B1/rGel通过HER2介导的内吞作用被摄取，并随后被释放到胞液，在胞液中其与核糖体结合并抑制翻译(Stirpe,et al,J Biol.Chem.,1980,255,6947-6953)。因此，MH3-B1/rGel除了对HER2的结合作用外，还诱导细胞内的细胞毒性作用。
相比于靶向HER2的mAb和TKI，有细胞内作用点的结合HER2的药物的机制显然更复杂，且这应该反映在用于预测药物-反应的生物标志物中(Ritchie,et al,mAbs,2013,5,13-21)。然而，用于T-DM1功效的生物标志物的评价已经除了聚焦于HER3之外，还聚焦于HER2及其下游信号传导(Baselga,et al,Clinical cancer research,2016,22,3755-3763；Kim,et al,Int J Cancer,2016,139,2336-2342)，而对参与内吞作用、内吞囊泡转运和胞吐作用的蛋白质的影响所知甚少。需要额外的生物标志物以改善靶向HER2和其他靶点受体的抗体药物缀合物和免疫毒素的预测价值。本研究旨在评价作为靶向HER2的ADC和免疫毒素的治疗效果的可能的生物标志物的Rab GTP酶家族中的蛋白质(Stenmark,Naturereviews.Molecular cell biology,2009,10,513-525)，以及具体参与HER2内吞作用的蛋白质。
发明内容
本发明涉及用于癌症疗法的组合物和方法，包括但不限于利用癌症生物标志物的疗法。特别地，本发明涉及用于预测受试者对癌症疗法的反应的组合物和方法。
靶向疗法强烈依赖于经过验证的生物标志物，以便选择最有可能从治疗中受益的患者。HER2已经用作多种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)和针对HER2的单克隆抗体(mAb)的治疗性生物标志物。然而，HER2也可以用作转运门，以便诸如通过靶向HER2的抗体药物缀合物(ADC)和抗体毒素缀合物(免疫毒素)将细胞毒性剂递送至细胞胞液中。与TKI和mAb的生物标志物相比，此类药物的治疗性生物标志物可能更复杂，因为它们不仅充当靶点，还可能反映药物摄取和细胞内作用的机制。
在本研究中，评估了一组HER2阳性乳腺癌和卵巢癌细胞系对两种靶向HER2的药物的敏感性；ADC曲妥珠单抗--美坦新(T-DM1)和抗体毒素缀合物MH3-B1/rGel。药物敏感性与HER2结合HER3和EGFR的表达水平相关，这可能会影响药物的靶向部分的药理作用，以及与参与内吞运输的Rab4、Rab5、Rab11和HSP90相关，其可能会影响毒性部分的药理作用。早期胞内体标志物Rab5和早期再循环标志物Rab4被指示为T-DM1和MH3-B1/rGel二者的可能的治疗性生物标志物。此外，还显示MH3-B1/rGel的毒性取决于HSP90和Rab11(反向)。本结果首次概述了通常作为靶向HER2的ADC和抗体毒素缀合物以及ADC和靶向抗体毒素缀合物的可能的生物标志物参与内吞运输的蛋白质。另外，提供了一种数学方法来验证具有不同贡献因子的生物标志物的组合。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了用抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物治疗诊断为癌症的患者的方法，包括：a)确定来自所述患者的生物样品中抗体药物或毒素缀合物的抗体组分的受体以及选自Rab5、Rab4、Rab11和HSP90的至少一种另外的蛋白质标志物的归一化的蛋白质表达水平；b)产生受体和标志物的蛋白质表达水平的复合表达指标；以及c)基于复合表达指标，用所述抗体药物或毒素缀合物治疗患者。在一些实施方式中，受体是HER2、HER3或EGFR。
在一些实施方式中，该方法包括当确定除了RAB5之外HER2的蛋白质表达水平也升高的表达指标时，给药抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物。在一些实施方式中，该方法包括当确定除了Rab5和Rab4之外HER2的蛋白质表达水平也升高的表达指标时，给药抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物。在一些实施方式中，该方法包括当确定除了Rab5和Rab4之外HER2的蛋白质表达水平也升高的表达指标时，给药抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物。在一些实施方式中，该方法包括当确定除了RAB5、RAB4和HSP90之外HER2的蛋白质表达水平也升高的表达指标时，给药抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物。
在一些实施方式中，来自所述患者的生物样品是手术肿瘤样品、活检样品或血液样品。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、胃肠道癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方式中，抗体药物缀合物是曲妥珠单抗-美坦新(Trastuzumabemtansine)(T-DM1，Kadcyla)、维汀-布仑妥昔单抗(Brentuximab vedotin)(SGN-35)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin)(CMC-544)、Pinatuzumab vedotin(RG-7593)、Polatuzumab vedotin(RG-7596)、Lifastuzumab vedotin(DNIB0600A、RG-7599)、Glembatuzumab vedotin(CDX-011)、Coltuximab ravtansine(SAR3419)、Lorvotuzumabmertansine(IMGN-901)、Indatuximab ravtansine(BT-062)、Sacitizumab govitican(IMMU-132)、Labetuzumab govitican(IMMU-130)、Milatuzumab doxorubicin(IMMU-110)、Indusatumab vedotin(MLN-0264)、Vadastuximab talirine(SGN-CD33A)、Denintuzumabmafodotin(SGN-CD19A)、Enfortumab vedotin(ASG-22ME)、Rovalpituzumab tesirine(SC16LD6.5)、Vandortuzumab vedotin(DSTP3086S、RG7450)、Mirvetuximab soravtansine(IMGN853)、ABT-414、IMGN289或AMG595。
在一些实施方式中，抗体毒素缀合物是MH3-B1/rGel、地尼白介素(denileukindiftitox)(DAB389IL2)、moxetumomab pasudotox(CAT-8015)、oportuzumab monotox(VB4-845)、Resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE或D2C7-IT。在一些实施方式中，确定包括免疫测定。
另外的实施方式提供了确定治疗作用过程的方法，该方法包括，包括：a)确定来自所述患者的生物样品中抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物的抗体组分的受体以及选自RAB5、RAB4、RAB11和HSP90的至少一种另外的标志物的归一化的蛋白质表达水平；b)产生受体和标志物的蛋白质表达水平的复合表达指标；以及c)基于复合表达指标推荐治疗作用过程。
另外的实施方式提供了用于确定来自诊断为癌症的患者的生物样品中的复合表达指标的方法，该方法包括：a)确定来自患者的生物样品中的抗体药物缀合物或抗体毒素缀合物的抗体组分的配体以及选自例如RAB5、RAB4、RAB11和HSP90的至少一种另外的标志物的归一化的蛋白质表达水平；以及b)产生配体和标志物的蛋白质表达水平的复合表达指标。
又另外的实施方式提供了试剂盒，其包括：用于检测选自例如HER2、HER3和EGFR的至少一种第一标志物的蛋白质表达水平的至少一种第一试剂，以及用于检测选自例如RAB5、RAB4、RAB11或HSP90的至少一种第二标志物的表达水平的至少一种第二试剂。在一些实施方式中，试剂是抗体。
还另外的实施方式提供了系统，其包括：a)用于检测选自例如HER2、HER3和EGFR的至少一种第一标志物的表达水平的至少一种第一试剂，以及用于检测选自例如RAB5、RAB4、RAB11或HSP90的至少一种第二标志物的表达水平的至少一种第二试剂；b)用于基于表达水平计算复合表达指标的计算机处理器和计算机软件。
在还其他的实施方式中，本发明提供了治疗患者癌症的方法，包括：从患者获得包含癌细胞的样品；通过体外测定来测量癌细胞中RAB5的表达水平；以及如果癌细胞样品中RAB5的表达水平与预定参考水平相比增加，则给药有效量的靶向癌细胞表面抗原的免疫缀合物；或者如果癌细胞样品中RAB5的表达水平与预定参考水平相比降低，则给药不包含药物或毒素的抗原结合蛋白。
在一些优选的实施方式中，测量癌细胞中RAB5的表达水平包括测量RAB5 mRNA的水平。在一些优选的实施方式中，测量癌细胞中RAB5的表达水平包括测量RAB5蛋白的水平。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5A。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5B。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5C。
在一些优选的实施方式中，该方法还包括测定RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平的步骤。在一些优选的实施方式中，该方法还包括以下步骤：将RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平并入具有RAB5表达水平的表达指标中，且如果表达指标与预定参考水平相比增加，则给药有效量的靶向癌细胞表面抗原的免疫缀合物。
在一些优选的实施方式中，癌细胞获自手术肿瘤样品、活检样品或血液样品。
在一些优选的实施方式中，免疫缀合物结合选自由以下组成的组的抗原：HER2、HER3、EGFR、CD3ε、CD19、CD22、CD25、CD30、CD33、CD56、CEA(CD66e)、CD74、CD79a、CD138、NaPi2b、gpNMB、TROP-2、GUCY2C、Nectin-4、SC-16、STEAP1、FRα、IL-2R、EpCAM和MSLN。在一些优选的实施方式中，免疫缀合物是选自由以下组成的组的抗体药物缀合物：曲妥珠单抗-美坦新、维汀-布仑妥昔单抗、奥英妥珠单抗、pinatuzumab vedotin、polatuzumab vedotin、lifastuzumab vedotin、glembatuzumab vedotin、coltuximab ravtansine、lorvotuzumabmertansine、indatuximab ravtansine、sacitizumab govitican、labetuzumabgovitican、milatuzumab doxorubicin、indusatumab vedotin、vadastuximab talirine、denintuzumab mafodotin、enfortumab vedotin、rovalpituzumab tesirine、vandortuzumab vedotin、mirvetuximab soravtansine、ABT-414、IMGN289和AMG595。在一些优选的实施方式中，免疫缀合物是选自由以下组成的组的免疫毒素：MH3-B1/rGel、地尼白介素、moxetumomab pasudotox、oportuzumab monotox、resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE和D2C7-IT。
在一些优选的实施方式中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、胰腺癌细胞、肾细胞癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、子宫内膜癌细胞、胃肠道癌细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、急性骨髓性白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤。
在一些优选的实施方式中，该方法还包括测定癌细胞上表面抗原的表达的步骤。
在一些特别优选的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞。在一些优选的实施方式中，表面抗原选自由表皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3中的至少一种及其组合组成的组，并且免疫缀合物靶向所述表面抗原。在一些优选的实施方式中，抗体药物缀合物或免疫毒素选自由曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)、ABT-414、IMGN289、AMG595和AMG595组成的组。在一些优选的实施方式中，表面抗原是HER2。在一些优选的实施方式中，免疫缀合物是曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)。
在一些优选的实施方式中，本发明提供了靶向表面抗原的免疫缀合物，用于在治疗患者癌症的方法中使用，其中来自所述患者的癌细胞表达所述抗原并表现出与预定参考水平相比增加的RAB5表达水平，如通过体外表达测定所测定的。在其他优选的实施方式中，本发明提供了不与药物或毒素缀合的抗原结合蛋白，用于在治疗患者癌症的方法中使用，其中来自所述患者的癌细胞表达所述抗原并表现出与预定参考水平相比降低的RAB5表达水平，如通过体外表达测定所测定的。
在一些优选的实施方式中，体外表达测定是RAB5 mRNA测定。在一些优选的实施方式中，体外表达测定是RAB5蛋白测定。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5A。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5B。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5C。
在一些优选的实施方式中，免疫缀合物结合选自由以下组成的组的抗原：HER2、HER3、EGFR、CD3ε、CD19、CD22、CD25、CD30、CD33、CD56、CEA(CD66e)、CD74、CD79a、CD138、NaPi2b、gpNMB、TROP-2、GUCY2C、Nectin-4、SC-16、STEAP1、FRα、IL-2R、EpCAM和MSLN。在一些优选的实施方式中，免疫缀合物是选自由以下组成的组的抗体药物缀合物：曲妥珠单抗-美坦新、维汀-布仑妥昔单抗、奥英妥珠单抗、pinatuzumab vedotin、polatuzumab vedotin、lifastuzumab vedotin、glembatuzumab vedotin、coltuximab ravtansine、lorvotuzumabmertansine、indatuximab ravtansine、sacitizumab govitican、labetuzumabgovitican、milatuzumab doxorubicin、indusatumab vedotin、vadastuximab talirine、denintuzumab mafodotin、enfortumab vedotin、rovalpituzumab tesirine、vandortuzumab vedotin、mirvetuximab soravtansine、ABT-414、IMGN289和AMG595。在一些优选的实施方式中，免疫缀合物是选自由以下组成的组的免疫毒素：MH3-B1/rGel、地尼白介素、moxetumomab pasudotox、oportuzumab monotox、resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE和D2C7-IT。
在一些优选的实施方式中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、胰腺癌细胞、肾细胞癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、子宫内膜癌细胞、胃肠道癌细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、急性骨髓性白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤。
在一些优选的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞。在一些优选的实施方式中，表面抗原选自由表皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3中的至少一种及其组合组成的组，并且抗体药物缀合物或免疫毒素靶向所述表面抗原。在一些优选的实施方式中，抗体药物缀合物或免疫毒素选自由曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)、ABT-414、IMGN289、AMG595和AMG595组成的组。在一些优选的实施方式中，表面抗原是HER2。在一些优选的实施方式中，免疫缀合物是曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)。
在还另外的优选实施方式中，本发明提供了用于确定人癌细胞是否对靶向癌细胞上的表面抗原的免疫缀合物有反应的体外方法，包括：从患者获得包含癌细胞的样品；以及通过体外测定来测量癌细胞中RAB5的表达水平，其中RAB5的表达水平与预定参考水平相比增加指示对所述免疫缀合物的反应性。
在一些优选的实施方式中，体外表达测定是RAB5 mRNA测定。在一些优选的实施方式中，体外表达测定是RAB5蛋白测定。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5A。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5B。在一些优选的实施方式中，RAB5是RAB5C。在一些优选的实施方式中，该方法还包括测定RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平的步骤。在一些优选的实施方式中，该方法还包括将RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平并入具有RAB5表达水平的表达指标中的步骤。
在一些优选的实施方式中，癌细胞获自手术肿瘤样品、活检样品或血液样品。在一些优选的实施方式中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、胰腺癌细胞、肾细胞癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、子宫内膜癌细胞、胃肠道癌细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、急性骨髓性白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤。
在一些优选的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞。在一些优选的实施方式中，该方法还包括测定癌细胞上表面抗原的表达的步骤。在一些优选的实施方式中，表面抗原选自由表皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3中的至少一种及其组合组成的组，并且抗体药物缀合物或免疫毒素靶向表皮生长因子受体(HER1)、HER2和HER3之一。在一些特别优选的实施方式中，表面抗原是HER2。
在一些优选的实施方式中，该方法还包括以下步骤：当RAB5的表达水平与参考RAB5表达水平相比增加时，向受试者给药免疫缀合物。
在一些优选的实施方式中，该方法还包括以下步骤：当RAB5的表达水平与参考RAB5表达水平相比降低时，向受试者给药不包含药物或毒素的抗体。
本文描述了另外的实施方式。
附图说明
图1：A：在SK-BR-3、SKOV-3、HCC1954、AU-565、MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中HER2和γ-微管蛋白表达的蛋白质印迹(Western blot)。B：用指定药物治疗72小时后，SK-BR-3、SKOV-3、AU-565、HCC1954和MDA-MB-435的相对生存力(MTT)。对T-DM1使用S型曲线拟合模型a/(1+exp(-(x-x0)/b))。数据点代表三个独立实验的平均值(曲妥珠单抗，误差棒：SE)或至少三个独立实验的一个代表值(T-DM1和MH3-B1/rGel，误差棒：SD)。
图2：A：对曲妥珠单抗和靶向HER2的细胞内作用治疗剂的细胞敏感性的示意图。B：SK-BR-3、SKOV-3、AU-565、HCC1954和MDA-MB-435细胞对曲妥珠单抗、T-DM1和MH3-B1/rGel的细胞敏感性。IC50：抑制50％细胞生存力的药物浓度。TI:IC50(rGel)/IC50(MH3-B1/rGel)。在SK-BR-3、SKOV-3、AU-565、HCC1954和MDA-MB-435细胞中HER2(D1)、HER3(D2)、EGFR(D3)和γ-微管蛋白表达的代表性(C)和定量(D)蛋白质印迹(n＝2)。HER2与T-DM1敏感性(1/IC50(T-DM1))(E1)或MH3-B1/rGel敏感性(TI)(E2)之间的线性回归分析曲线。
图3：HER3和EGFR表达与HER2一起对T-DM1(A和B)和MH3-B1/rGel(C、D和E)敏感性的影响。A和B：左小图示出了五个细胞系中HER3(A1)或EGFR(B1)表达与T-DM1敏感性之间的线性回归分析曲线。中间的小图示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2表达的贡献之外的HER3(A2)或EGFR(B2)表达对T-DM1敏感性的贡献因子的函数。A3代表优化的线性回归分析曲线，其中T-DM1敏感性与HER2和HER3表达(贡献因子：0.2)二者线性相关。B3示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2表达和HER3表达(贡献因子：0.2)的影响之外的EGFR表达对T-DM1敏感性的影响的因子的函数。C和D：左小图示出了五个细胞系中HER3(C1)或EGFR(D1)表达与MH3-B1/rGel敏感性之间的线性回归分析曲线。中间的小图示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2表达的贡献之外的HER3(A2)或EGFR(B2)表达对MH3-B1/rGel敏感性的贡献的函数。右小图代表优化的线性回归分析曲线，其中MH3-B1/rGel敏感性与HER2和HER3表达(贡献因子：0.4)二者(C3)或HER2和EGFR表达(贡献因子：0.3)(D3)线性相关。E1示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2和EGFR表达(贡献因子：0.3)的影响之外的HER3表达对MH3-B1/rGel敏感性的影响的因子的函数。E2代表优化的线性回归分析曲线，其中MH3-B1/rGel敏感性与HER2、EGFR(贡献因子：0.3)和HER3表达(贡献因子：0.4)线性相关。
图4：在SK-BR-3、SKOV-3、AU-565、HCC1954和MDA-MB-435细胞中的Rab5、Rab4、HSP90、Rab11和γ-微管蛋白表达的代表性(A)和定量(B-E)蛋白质印迹(n＝2)。
图5：Rab5、Rab4、HSP90和Rab11表达与HER2一起对T-DM1敏感性的影响。左小图示出了五个细胞系中Rab5(A1)、Rab4(B1)、HSP90(C1)或Rab11(D1)表达与T-DM1敏感性之间的线性回归分析曲线。中间的小图示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2表达的影响之外的Rab5(A2)、Rab4(B2)、HSP90(C2)或1/Rab11(D2)表达对T-DM1敏感性的影响的因子的函数。右小图代表优化的线性回归分析曲线，其中T-DM1敏感性与HER2和Rab5(贡献因子：0.3)(A3)、Rab4(贡献因子：0.4)(B3)或1/Rab11(贡献因子：0.2)(D3)表达二者线性相关。
图6：Rab5、Rab4、HSP90和Rab11表达与HER2一起对MH3-B1/rGel敏感性的影响。左小图示出了五个细胞系中Rab5(A1)、Rab4(B1)、HSP90(C1)或Rab11(D1)表达与MH3-B1/rGel敏感性之间的线性回归分析曲线。中间的小图示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2表达的影响之外的Rab5(A2)、Rab4(B2)、HSP90(C2)或1/Rab11(D2)表达对MH3-B1/rGel敏感性的影响的因子的函数。右小图代表优化的线性回归分析曲线，其中MH3-B1/rGel敏感性与HER2和Rab5(贡献因子：0.3)(A3)、Rab4(贡献因子：0.6)(B3)、HSP90(贡献因子：1)(C3)或1/Rab11(贡献因子：1)(D3)表达二者线性相关。
图7：Rab5、Rab4和HSP90或1/Rab11表达的组合与HER2一起对MH3-B1/rGel敏感性的影响。A1示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2和Rab5表达(贡献因子0.3)的影响之外的Rab4表达对MH3-B1/rGel敏感性的影响的因子的函数。A2代表优化的线性回归分析曲线，其中MH3-B1/rGel敏感性与HER2、Rab5(贡献因子：0.3)和Rab4表达(贡献因子：0.6)线性相关。B1示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2、Rab5(贡献因子0.3)和Rab4(贡献因子0.6)的影响之外的HSP90表达对MH3-B1/rGel敏感性的影响的因子的函数。B2代表优化的线性回归分析曲线，其中MH3-B1/rGel敏感性与HER2、Rab5(贡献因子0.3)、Rab4表达(贡献因子0.6)和HSP90表达(贡献因子0.8)线性相关。C1示出了线性回归的R2值，其是五个细胞系中除HER2、Rab5(贡献因子：0.3)、Rab4(贡献因子：0.6)和HSP90(贡献因子：0.8)的影响之外的1/Rab11表达对MH3-B1/rGel敏感性的影响的因子的函数。C2代表优化的线性回归分析曲线，其中MH3-B1/rGel敏感性与HER2、Rab5(贡献因子0.3)、Rab4表达(贡献因子0.6)、HSP90表达(贡献因子0.8)和1/Rab11表达(贡献因子0.4)线性相关。
图8：HER3和EGFR(A1、B1)或Rab5、Rab4、HSP90和1/Rab11表达(A2、B2)的组合与HER2一起对T-DM1(A)或MH3-B1/rGel敏感性(B)的影响。呈现的结果与图5、图6和图7中报道的相同，而此处合并在相同图中。在本报告(C)中为对T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性指示的生物标志物的示意图。箭头表示建议使用当前生物标志物的药物，且箭头的宽度说明该蛋白质对药物敏感性的影响。圆圈表示建议组合的生物标志物的两个库。
图9：蒙特卡洛(Monte-Carlo)2倍交叉验证程序的结果，以确定使生物标志物x处理相互作用的p值最小化的阈值。
图10：与RAB5A表达有关的贝叶斯(Bayesian)pCR概率曲线。
定义
为了促进对本发明的理解，下面定义了许多术语和短语：
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指包含与抗原结合的部分和任选地支架或框架部分的蛋白质，该支架或框架部分允许抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可包括例如具有接枝的CDR或CDR衍生物的替代蛋白支架或人工支架。此类支架包括但不限于包含引入以例如稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体衍生的支架，以及包括例如生物相容性聚合物的全合成支架。抗原结合蛋白的实例包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、微型抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链Fv片段等。
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指包含诸如通过化学键或肽接头与另一种试剂(诸如药物或毒素)连接或结合的抗原结合蛋白的分子。术语“免疫缀合物”涵盖抗体药物缀合物、免疫毒素和亲和毒素。分子的抗原结合蛋白部分可以是免疫球蛋白或抗原结合片段或其抗原结合衍生物，例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、微型抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链Fv片段等。抗原结合蛋白部分也可以是能够结合细胞表面抗原的蛋白配体。例如，EGF可以靶向在细胞表面上表达的EGF受体。
如本文所用，术语“抗体药物缀合物(ADC)”是指包含通常经由化学键与药物分子连接或以其他方式结合的抗原结合蛋白的分子。
如本文所用，术语“免疫毒素”是指包含通常经由肽接头与毒素分子连接或以其他方式结合的抗原结合蛋白的分子。
如本文所用，术语“亲和毒素”是指包含能够结合细胞表面抗原的蛋白质配体的分子，其中蛋白质配体通常经由肽接头与毒素分子连接或以其他方式结合。
如本文所用，当细胞与免疫缀合物接触时可检测到可测量的毒性反应时，癌细胞对免疫缀合物“有反应”。
如本文所用，术语“检测”、“检测”或“检测”可以描述发现或辨别的一般动作或对组成的特定观察。
如本文所用，术语“核酸分子”是指任何包含核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语涵盖的序列包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物，包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用，术语“扩增寡核苷酸”是指与目标核酸或其互补序列杂交并参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增寡核苷酸的一个实例是“引物”，其与模板核酸杂交并包含在扩增过程中被聚合酶延伸的3'OH末端。扩增寡核苷酸的另一个实例是不被聚合酶延伸的寡核苷酸(例如，因为其具有3'封闭的末端)，但参与或促进了扩增。扩增寡核苷酸可任选地包括修饰的核苷酸或类似物，或参与扩增反应但与目标核酸不互补或不包含在目标核酸中的其他核苷酸。扩增寡核苷酸可包含与目标或模板序列不互补的序列。例如，引物的5'区域可以包括与目标核酸不互补的启动子序列(称为“启动子-引物”)。本领域技术人员将理解，可以修饰充当引物的扩增寡核苷酸以包括5'启动子序列，并因此充当启动子-引物。类似地，可以通过去除启动子序列或在没有启动子序列的情况下合成来修饰启动子-引物，并且仍然起引物的作用。3'封闭的扩增寡核苷酸可提供启动子序列并用作聚合的模板(称为“启动子-提供物”)。
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，无论其以纯化的限制性消化物天然存在还是由合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时(例如，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)，该寡核苷酸能够充当合成的起始点。为了最大的扩增效率，引物优选是单链的，但替代地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物之前，首先对引物进行处理以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
如本文所用，术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论是以纯化的限制性消化物天然存在还是由合成、重组或通过PCR扩增产生，其能够与另外的感兴趣的寡核苷酸的至少一部分杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列。预期本发明中使用的任何探针都将被任何“报告分子”标记以便可在任何检测系统中检测到，包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。无意将本发明限制于任何特定的检测系统或标记。在一些实施方式中，报道分子是“外源报道分子”。
术语“外源报告分子”是指在天然状态下未发现与检测试剂(例如探针、核酸或抗体)连接的报告分子或标记。实例包括但不限于酶促、荧光、放射性或发光报告分子。
当与核酸有关使用时，术语“分离的”，如“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指被鉴别并与在天然来源中通常与其连接的至少一种组分或污染物分离的核酸序列。分离的核酸以与天然状态发现的核酸不同的形式或设置存在。相反，非分离的核酸，诸如DNA和RNA的核酸，以其天然存在的状态被发现。例如，在宿主细胞染色体上发现靠近邻近基因的给定DNA序列(例如基因)；在细胞中发现与编码多个蛋白质的许多其他mRNA一起作为混合物的RNA序列(诸如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)。然而，例如，编码给定蛋白质的分离的核酸包括，通常表达给定蛋白质的细胞中的此类核酸，其中该核酸处于与天然细胞中不同的染色体位置，或者两侧是与天然存在情况下不同的核酸序列。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表达蛋白质时，该寡核苷酸或多核苷酸将至少包含有义链或编码链(即该寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但可以同时包含有义和反义链(即寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。
如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中去除组分(例如污染物)。例如，通过去除污染的非免疫球蛋白来纯化抗体；也通过去除不与目标分子结合的免疫球蛋白来纯化它们。非免疫球蛋白的去除和/或不与目标分子结合的免疫球蛋白的去除导致样品中靶点反应性免疫球蛋白的百分比增加。在其他实例中，重组多肽在细菌宿主细胞中表达，并且通过去除宿主细胞蛋白来纯化多肽；因此，样品中重组多肽的百分比增加。
如本文所用，术语“样品”以其最广义使用。从某种意义上说，这意味着包括从任何来源获得的样品或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人类)获得，且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，诸如血浆，血清等。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。但是，这些实例不应被解释为限制了适用于本发明的样品类型。
具体实施方式
本发明涉及用于癌症治疗的组合物和方法，包括但不限于利用癌症生物标志物的疗法。特别地，本发明涉及用于预测受试者对癌症疗法的反应的组合物和方法。
对个性化医学的日益关注，加上我们对癌症生物学的日益了解，揭示了在癌症治疗中使用生物标志物的巨大潜力。一系列不同的生物标志物已被纳入临床实践中，以预测患者的存活率，评估治疗功效或监测疾病进展1。预测性生物标志物能够仔细选择最有可能从特定治疗中受益的患者，并因此，此类知识对于合理利用当前和未来的高成本靶向癌症疗法至关重要。
因此，本文提供了基于一种或多种蛋白质标志物的表达来确定患有癌症(例如乳腺癌)的受试者的治疗、向其推荐治疗和/或向其给与治疗的系统和方法。本发明不限于特定标志物。在一些实施方式中，单独或组合地检测抗体的抗原(例如，HER2、HER3、EGFR)和一种或多种其他标志物(例如，RAB5(优选RAB5A)、RAB4、RAB11和HSP90或HER3和EGFR)的组合。在一些实施方式中，组合该组合或标志物的表达水平以产生复合表达指标。
在一些优选的实施方式中，本发明提供了治疗患者癌症的方法，包括：从患者获得包含癌细胞的样品；通过体外测定来测量癌细胞中RAB5的表达水平；以及如果癌细胞样品中RAB5的表达水平与预定参考水平相比增加，则给药有效量的靶向癌细胞表面抗原的免疫缀合物；或者如果癌细胞样品中RAB5的表达水平与预定参考水平相比降低，则给药不包含药物或毒素的抗原结合蛋白。可以测定RAB5A、RAB5B或RAB5C中的任何一种或其组合的表达。在一些特别优选的实施方式中，测定RAB5A的表达。
如所描述的，在一些优选的实施方式中，给药免疫缀合物还是给药未与毒素或药物缀合的抗原结合蛋白的决定是基于将所测得的患者样品中RAB5(优选RAB5A)的表达与预定参考水平或阈值水平进行比较而做出的。本领域技术人员将认识到，参考水平或阈值水平可以通过应用于从合适的患者群体获得的表达数据的统计程序来确定。在实施例中提供了合适的统计方法，但本领域技术人员将认识到也可以利用其他统计程序。还将认识到，不同统计程序或相同程序运行不同或扩展的数据集，可能会产生不同的参考水平或阈值水平。因此，本发明不限于对任何特定标志物(例如，RAB5A)或标志物的组合的表达使用任何特定参考水平或阈值水平。在这方面，在一些实施方式中，本发明的方法还包括测定RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平。在一些优选的实施方式中，将RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的样品中的表达水平并入到具有RAB5表达水平(优选RAB5A表达水平)的表达指标中，以及如果表达指标与预定参考水平相比增加，则给药有效量的靶向癌细胞表面抗原的免疫缀合物。
在一些优选的实施方式中，用于本发明的方法的患者样品包含癌细胞。可以通过多种方法获得合适的含细胞样品，这些方法包括但不限于活检、手术样品和抽血样品。在一些优选的实施方式中，先前已经对样品中一种或多种细胞表面抗原的存在进行了测定。在一些实施方式中，该方法还包括如果样品先前未表征，则测定样品中一种或多种细胞表面抗原的表达。本发明不限于任何特定细胞表面抗原的测定，但是易于内化(例如通过内吞作用)的细胞表面抗原是优选的。易于内在化的示例性细胞表面抗原包括但不限于HER2、HER3、EGFR、CD3ε、CD19、CD22、CD25、CD30、CD33、CD56、CEA(CD66e)、CD74、CD79a、CD138、NaPi2b、gpNMB、TROP-2、GUCY2C、Nectin-4、SC-16、STEAP1、FRα、IL-2R、EpCAM和MSLN。
在一些特别优选的实施方式中，样品包含乳腺癌细胞。在这些实施方式中，优选对乳腺癌细胞的表皮生长因子受体(HER1)、HER2和/或HER3的表达进行表征。在甚至更优选的实施方式中，样品被测定为，或者先前已经测定并鉴定为具有HER2受体。
如上所述，在一些实施方式中，复合表达指标用于本发明的方法中。本发明不限于使用任何特定的复合表达指标。合适的复合表达指标的实例如下。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB5表达)x0.3)x(1-(1-相对RAB4表达)x 0.6)x(1-(1-相对HSP90表达)x 0.8)/(1-(1-(1/相对RAB11表达))x 0.4)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB4表达)x0.6)x(1-(1-相对RAB5表达)x 0.3)x(1-(1-相对HSP90表达)x 0.8)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB4表达)x0.6)x(1-(1-相对RAB5表达)x 0.2)x(1-(1-相对HSP90表达)x 0.6)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB4表达)x0.4)x(1-(1-相对RAB5表达)x 0.2)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB5表达)x0.3)x(1-(1-相对RAB4表达)x 0.6)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB5表达)x0.3)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB4表达)x0.4)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB4表达)x0.6)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对RAB11表达)x0.2)。
在一些实施方式中，复合表达指标为：相对HER2表达x(1-(1-相对HSP90表达)。
在一些实施方式中，该表达是蛋白质表达。在一些实施方式中，确定步骤包括免疫测定。在一些实施方式中，该表达是mRNA表达。在一些实施方式中，确定步骤包括mRNA的反转录以提供cDNA，并用生物标志物的特异性引物扩增cDNA。在一些实施方式中，检测技术是RT-PCR。
本发明中使用的表达测定可以利用单个生物标志物，诸如RAB5A，或一组生物标志物(例如，RAB5A以及RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种；RAB5A和HER2；或RAB5A、HER2以及RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种)。在一些实施方式中，本发明的组或测定包括少于100、75、50、25、20、15、10或五种生物标志物，或在其他优选的实施方式中，总共最多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20种生物标志物。
在一些实施方式中，检测来自受试者的样品中的蛋白质表达水平。在一些实施方式中，受试者已被诊断出患有癌症(例如，乳腺癌)。在一些实施方式中，样品是组织(例如，活检组织)、血液、血清、尿液等。
下面提供了检测蛋白质标志物的示例性方法。但是，可以使用检测肿瘤标志物蛋白的任何合适的方法。
免疫测定的说明性非限制性实例包括但不限于：免疫沉淀；蛋白质印迹；ELISA；免疫组织化学法；免疫细胞化学法；流式细胞术；以及免疫PCR。使用本领域普通技术人员已知的各种技术(例如比色、荧光、化学发光或放射性)可检测地标记的多克隆或单克隆抗体适合用于免疫测定。
免疫沉淀是使用对该抗原特异的抗体从溶液中沉淀出抗原的技术。通过靶向被认为以复合物存在的蛋白质，该方法可用于鉴定细胞提取物中存在的蛋白质复合物。通过最初从细菌中分离的不溶性抗体结合蛋白(诸如蛋白A和蛋白G)将复合物带出溶液。这些抗体还可以与可容易地从溶液中分离出的琼脂糖珠连接。洗涤之后，可以使用质谱、蛋白质印迹或任何多种其他方法对沉淀物进行分析，以鉴定复合物中的成分。
蛋白质印迹或免疫印迹是一种检测组织匀浆或提取物的给定样品中的蛋白质的方法。它使用凝胶电泳按质量分离变性蛋白质。然后将蛋白质从凝胶中转移出来并转移到膜上，通常是聚二氟乙烯或硝酸纤维素膜上，其中使用对感兴趣的蛋白质具有特异性的抗体对其进行探测。结果，研究人员可以检查给定样品中蛋白质的量，并比较几个组之间的水平。
ELISA是酶联免疫吸附测定的缩写，是一种生物化学技术，用于检测样品中抗体或抗原的存在。它利用至少两种抗体，其中一种对抗原具有特异性，而另一种与酶连接。第二抗体将导致发色或发荧光的底物产生信号。ELISA的变型包括夹心ELISA、竞争性ELISA和ELISPOT。因为可以进行ELISA来评估样品中抗原的存在或抗体的存在，所以它对于确定血清抗体浓度以及对于检测抗原的存在都是有用的工具。
免疫组织化学法和免疫细胞化学法是指通过组织或细胞中的抗原结合其各自抗体的原理分别将蛋白质定位在组织切片或细胞中的方法。通过使用产生颜色或发荧光的标签标记抗体，可以实现可视化。有色标签的典型实例包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。荧光团标签的典型实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)。
流式细胞术是一种用于计数、检查和分类悬浮在流体流中的微观颗粒的技术。它允许对流经光学/电子检测设备的单个细胞的物理和/或化学特性进行同时多参数分析。将单一频率或颜色的光束(例如激光)引导到流体动力学聚焦的流体流上。多个检测器瞄准流通过光束的点；一个与光束成直线(前向散射或FSC)，且几个与光束垂直(侧向散射(SSC)和一个或多个荧光探测器)。穿过光束的每个悬浮颗粒都会以某种方式散射光，且颗粒中的荧光化学物质可能会被激发以低于光源的频率发射光。散射光和荧光的组合由检测器拾取，并且通过分析每个检测器的亮度波动(每个荧光发射峰一个)，可以推断出有关每个单个颗粒的物理和化学结构的各种事实。FSC与细胞体积相关，而SSC与颗粒的密度或内部复杂性(例如，细胞核的形状、细胞质粒的数量和类型或膜的粗糙度)相关。
免疫聚合酶链反应(IPCR)利用核酸扩增技术来增加基于抗体的免疫测定中的信号产生。因为不存在与PCR等效的蛋白质，也就是说，不能以与PCR期间复制核酸相同的方式复制蛋白质，所以提高检测敏感性的唯一方法是通过信号放大。目标蛋白与直接或间接缀合至寡核苷酸的抗体结合。未结合的抗体被洗掉，且使剩余的结合抗体的寡核苷酸扩增。通过使用标准核酸检测方法(包括实时方法)检测扩增的寡核苷酸来进行蛋白质检测。
在一些实施方式中，利用免疫磁检测。在一些实施方式中，检测是自动化的。示例性免疫磁检测方法包括但不限于可从Veridex(Raritan，NJ)商购的那些。
在一些实施方式中，基于计算机的分析程序用于将由检测测定生成的原始数据(例如，标志物表达的存在、不存在或数量)转化为对临床医生具有预测价值的数据(例如，癌症疗法的选择或复合表达指标)。临床医生可以使用任何合适的方式使用预测数据。因此，在一些优选的实施方式中，本发明提供了另外的益处，即不太可能接受遗传学或分子生物学训练的临床医生不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医生。然后，临床医生能够立即利用该信息以优化受试者的护理。
本发明考虑了在进行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者之间能够接收、处理和传输信息的任何方法。例如，在本发明的一些实施方式中，样品(例如活检或血液或血清样品)获自受试者并提交给位于世界任何地方(例如，与受试者居住的国家或最终使用信息的国家不同的国家)的分析服务方(例如，医疗机构的临床实验室、基因组分析企业等)以生成原始数据。如果样品包含组织或其他生物样品，则受试者可以前往医疗中心以使样品被收集并发送到分析中心，或者受试者可以自己收集样品(例如尿液样品)并将其直接发送到分析中心。如果样品包含先前确定的生物学信息，则该信息可以由受试者直接发送到分析服务方(例如，包含信息的信息卡可以由计算机进行扫描，并且使用电子通讯系统将该数据传输至分析中心的电脑)。一旦由分析服务方接收，就处理样品并产生特异性针对受试者所需的诊断或预后信息的分析概况(即表达数据)。
然后以适合于由主治临床医生解读的格式来制备分析概况数据。例如，不是提供原始数据，而是制备格式可以代表受试者的诊断或风险评估(例如，癌症治疗成功的可能性或复合表达指标)，以及针对特定治疗选择的建议。可以通过任何合适的方法将数据显示给临床医生。例如，在一些实施方式中，分析服务方生成报告，该报告可以打印给临床医生(例如，在护理时)或在计算机监视器上显示给临床医生。
在一些实施方式中，首先在护理点或区域设备分析信息。然后将原始数据发送到中央处理设备以进行进一步分析和/或将原始数据转换为对临床医生或患者有用的信息。中央处理设备提供了以下优点：隐私(所有数据都使用统一的安全协议存储在中央设备中)、速度和数据分析的一致性。然后，中央处理设备可以在对受试者进行治疗之后控制数据的命运。例如，使用电子通信系统，中央设备可以向临床医生、受试者或研究人员提供数据。
在一些实施方式中，受试者能够使用电子通信系统直接访问数据。受试者可以根据结果选择进一步的干预或咨询。在一些实施方式中，数据被用于研究用途。例如，数据可用于进一步优化标志物的包含或去除，作为疾病特定状况或阶段的有用指标。
用于本发明的诊断、预后和治疗方法的组合物包括但不限于探针、扩增寡核苷酸和抗体。特别优选的组合物检测样品中标志物表达水平的存在。
任何这些组合物可以单独或与本发明的其他组合物组合，以试剂盒的形式提供。例如，单个标记的探针和成对的扩增寡核苷酸或抗体以及免疫测定组分可以以扩增和检测标志物的试剂盒提供。试剂盒还可以包含适当的对照和/或检测试剂。
本发明的探针和抗体组合物也可以以阵列测定或组测定的形式提供。
在一些实施方式中，本发明提供了用于确定和给予治疗作用过程的系统、试剂盒和方法。
本发明的方法可用于治疗多种癌症。根据本发明可以治疗的癌症包括但不限于乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌、胃肠道癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。如上所述，在优选的实施方式中，当与参考或阈值表达水平或复合表达指标相比，患者样品中生物标志物或生物标志物的组合的表达水平增加，则要求向患者给药免疫缀合物。同样，在其他优选实施方式中，如果与参考或阈值表达水平或复合表达指标相比，患者样品中生物标志物或生物标志物的组合的表达水平降低，则要求向患者给药未与药物或毒素缀合的抗原结合蛋白。在实施方式中，如果要求给药免疫缀合物，则选择与患者的肿瘤或癌细胞表达的表面抗原结合的免疫缀合物。免疫缀合物可针对的合适的表面抗原包括但不限于HER2、HER3、EGFR、CD3ε、CD19、CD22、CD25、CD30、CD33、CD56、CEA(CD66e)、CD74、CD79a、CD138、NaPi2b、gpNMB、TROP-2、GUCY2C、Nectin-4、SC-16、STEAP1、FRα、IL-2R、EpCAM和MSLN。
在一些实施方式中，免疫缀合物是抗体药物缀合物。合适的抗体药物缀合物包括但不限于曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1，Kadcyla)、维汀-布仑妥昔单抗(SGN-35)、奥英妥珠单抗(CMC-544)、Pinatuzumab vedotin(RG-7593)、Polatuzumab vedotin(RG-7596)、Lifastuzumab vedotin(DNIB0600A、RG-7599)、Glembatuzumab vedotin(CDX-011)、Coltuximab ravtansine(SAR3419)、Lorvotuzumab mertansine(IMGN-901)、Indatuximabravtansine(BT-062)、Sacitizumab govitican(IMMU-132)、Labetuzumab govitican(IMMU-130)、Milatuzumab doxorubicin(IMMU-110)、Indusatumab vedotin(MLN-0264)、Vadastuximab talirine(SGN-CD33A)、Denintuzumab mafodotin(SGN-CD19A)、Enfortumabvedotin(ASG-22ME)、Rovalpituzumab tesirine(SC16LD6.5)、Vandortuzumab vedotin(DSTP3086S、RG7450)、Mirvetuximab soravtansine(IMGN853)、ABT-414、IMGN289或AMG595。在一些实施方式中，抗体毒素缀合物是MH3-B1/rGel、地尼白介素(DAB389IL2)、moxetumomab pasudotox(CAT-8015)、oportuzumab monotox(VB4-845)、Resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE或D2C7-IT。如上所述，在本发明的方法中选择使用哪种抗体药物缀合物将取决于受试者中的癌细胞表达哪种特定的表面抗原。
在一些实施方式中，免疫缀合物是免疫毒素。合适的免疫毒素包括但不限于MH3-B1/rGel、地尼白介素(DAB389IL2)、moxetumomab pasudotox(CAT-8015)、oportuzumabmonotox(VB4-845)、Resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE或D2C7-IT。而且，如上所述，在本发明的方法中选择使用哪种免疫毒素将取决于受试者中的癌细胞表达哪种特定的表面抗原。
实验
提供以下实施例以说明和进一步举例本发明的某些实施方式，并且不应解释为限制其范围。
实施例1
材料和方法
细胞和培养。在这项研究中使用了五种表达HER2的人类细胞系；乳腺癌细胞系SK-BR-3、AU-565(CRL-2351)、HCC1954(CRL-2338)和MDA-MB-453(HTB-131)以及卵巢癌细胞系SKOV-3(HTB-77)。将HER2阴性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231用作HER2表达的阴性对照。除SK-BR-3之外，所有细胞系均获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Manassas,VA,USA)；SK-BR-3由挪威奥斯陆的奥斯陆大学医院挪威镭医院癌症研究所生物化学部(Department of Biochemistry,Institute for Cancer Research,Norwegian Radium Hospital,Oslo University Hospital,Oslo,Norway)友情提供。使用的所有细胞系都在第3至25代之间，以避免细胞系特性随时间变化，并常规检查细胞是否有支原体感染。SK-BR-3和SKOV-3细胞在McCoy's 5A培养基中培养，AU-565、HCC1954和MDA-MB-231细胞在RPMI-1640培养基中培养(两者均从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA获得)，而MDA-MB-453在Leibovitz's L-15培养基(Lonza,Verviers,Belgium)中培养。所有培养基如前所述地补充19。
细胞毒性实验。将细胞以8x103(SK-BR-3)、1.8x103(SKOV-3)、6x103(AU-565)、4x103(HCC1954)或1x104细胞/孔(MDA-MB-453)接种在96孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)中，并使其粘附过夜。然后将细胞与曲妥珠单抗(
Figure BDA0002371705290000301
Roche,Basel,Switzerland)，T-DM1(ado-曲妥珠单抗-美坦新，
Figure BDA0002371705290000302
Genentech,San Francisco,CA,USA)、MH3-B1/rGel或rGel(如前所述地表达和纯化13,20)在递增的浓度下一起温育72小时，然后通过MTT测定来评估细胞生存力，如前所述21。从S型曲线计算IC50值(拟合模型：a/(1+exp(-(x-x0)/b))。
蛋白质印迹分析。如前所述获得总细胞提取物并通过蛋白质印迹进行分析19。使用
Figure BDA0002371705290000303
TurboTM转移系统(Bio-Rad实验室，CA，USA)进行蛋白质印迹转移。使用来自Cell Signaling Technology(Danvers，MA，USA)的EGFR(#4267)、HER2(#2165)、HER3(#12708)、HSP90(#4877)抗体，来自BD Biosciences(San Jose,CA,USA)的Rab5(610281)和Rab11(610656)抗体，以及来自Sigma-Aldrich的Rab4(R5780)抗体检测细胞蛋白质表达。如通过来自Sigma-Aldrich的抗体(#T6557)所检测的，蛋白质表达与γ-微管蛋白相关。使用Supersignal West Dura Extended duration Substrate(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)和ChemiDocTM密度计(Bio-Rad)检测膜上的蛋白质条带。使用ImageLab 4.1(Bio-Rad)(软件)定量蛋白质表达。相对于最高表达的细胞系计算每种蛋白质的表达。
相关性分析。将细胞系中HER2、HER3、EGFR、Rab4、Rab5、Rab11和HSP90的相对表达相对于通过1/IC50(T-DM1)或靶向指标(TI)(MH3-B1/rGel)衡量的细胞系对两种HER2靶向疗法的敏感性作图，并且评估了线性回归。几种蛋白质可与HER2一起影响T-DM1或MH3-B1/rGel毒性。但是，与HER2相比，影响程度可能有所不同。在这里计算是否可以通过向回归中并入其他蛋白质(HER3、EGFR、Rab4、Rab5、Rab11和HSP90)的相对表达来提高由与HER2线性相关的1/IC50(T-DM1)或TI(MH3-B1/rGel)获得的R2值。将与HER2一起的每种蛋白质的贡献因子从1到0逐渐减小，使用如下公式来建立这些回归曲线：
对于具有正斜率的曲线，HER2 x(1-(1-蛋白质)x F)，以及
对于具有负斜率的曲线，HER2/(1-(1-蛋白质)x F)
其中HER2是HER2的相对表达，蛋白质是感兴趣的蛋白质的相对表达，并且F是范围为从1到0的贡献因子。
将R2值作为每种蛋白质的贡献因子的函数作图。将与单独使用HER2获得的R2相比，在某贡献因子处导致R2增加的蛋白质并入T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性的最终回归曲线中，以便设定与T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性具有最高相关性(通过R2衡量)的表达参数的组合。
结果
T-DM1和MH3-B1/rGel的功效与曲妥珠单抗敏感性无关。与如HER2阴性报道的MDA-MB-231中的低表达相比，本研究中使用的五种表达HER2的细胞系中记录到了HER2的强表达(图1A)22。建立了靶向HER2的mAb曲妥珠单抗和细胞内作用的靶向HER2的治疗剂T-DM1和MH3-B1/rGel在五个HER2阳性细胞系中的抗增殖作用(图1B)。用曲妥珠单抗、T-DM1或MH3-B1/rGel对细胞进行72小时处理后，发现SK-BR-3和AU-565细胞对所有三种治疗剂均高度敏感，然而相比之下发现SKOV-3细胞对曲妥珠单抗无反应，并且对T-DM1和MH3-B1/rGel表现出低敏感性，这分别由1.2μg/ml的相对高的IC50和2.4的低TI50所证明(图1和2B)。发现HCC1954和MDA-MB-453细胞对曲妥珠单抗治疗均具有低至中度的敏感性，但对细胞内作用的靶向HER2的治疗剂的反应不同，HCC1954细胞对T-DM1和MH3-B1/rGel两者均显示出高敏感性，而MDA-MB-453细胞对这两种药物显示出低敏感性(图1和2B)。因此，在五种细胞系中曲妥珠单抗敏感性与对T-DM1和MH3-B1/rGel的敏感性之间没有明确的联系(图1和2B)。即使T-DM1和MH3-B1/rGel在细胞内具有明显不同的作用点，但在细胞系中对这两种治疗剂的敏感性之间仍显示出一致性，其中对两种治疗剂之一的高/低反应似乎预测了对另一个的类似高/低反应。
基于这些发现，将细胞系分为三类；(i)对曲妥珠单抗、T-DM1和MH3-B1/rGel有高敏感性(SK-BR-3和AU-565)，(ii)对曲妥珠单抗、T-DM1和MH3-B1/rGel有低/中度敏感性(SKOV-3和MDA-MB-453)，(iii)对曲妥珠单抗有低/中度敏感性，但对T-DM1和MH3-B1/rGel有高敏感性(HCC1954)(图2A)。
HER2表达与T-DM1毒性的相关性强于与MH3-B1/rGel毒性的相关性。HER2表达对于T-DM1和MH3-B1/rGel毒性都至关重要。但是，由于细胞之间药物加工的差异(例如摄取、细胞内转运以及与细胞内药物靶点的相互作用)，表达水平可能不一定与药物敏感性直接相关。五个细胞系中HER2表达的定量表明AU-565具有最高的HER2表达水平，紧随其后的是HCC1954(0.9)和SK-BR-3(0.8)(图2C和D1)。与AU-565相比，SKOV-3细胞中的HER2表达降低了50％，且MDA-MB-453被认为是在该组中HER2表达最低的细胞系(0.4)(图2C和D1)。此处报道的HER2表达水平与最近的报道一致22,23。此外，在细胞系之间发现HER2表达与T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性之间存在线性关系，得出T-DM1的R2值为0.926，以及MH3-B1/rGel的R2值为0.800(图2E1和E2)。
对于T-DM1敏感性，HER3可以作为HER2的附加生物标志物。已知HER2与EGFR家族的其他成员复合。因此，对HER3和EGFR进行定量以检查T-DM1和MH3-B1/rGel毒性与EGFR家族的这两个成员的表达之间的关系。发现所选择的细胞系组在其HER3和EGFR表达水平上有很大不同(图2C、2D2和2D3)。但是，在HER3或EGFR的水平与对T-DM1(图3A1和B1)或MH3-B1/rGel(图3C1和D1)的敏感性之间未发现明显的相关性。进一步评估了与HER2一起EGFR和HER3是否可以与T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性相关。建立1/IC50(T-DM1)和HER2以及贡献因子不断增加的HER3的线性回归的R2值，显示出与单独使用HER2时相比(R2＝0.926，图2E1)，在以0.2的贡献因子将HER3表达包括到相关分析中时R2更高，为0.953(图3A2和3A3)。通过将影响因子不断增加的EGFR并入T-DM1敏感性和HER2表达之间的回归分析中，未发现线性相关性增加(图3B2)。还评估了EGFR表达在T-DM1和HER2 x HER3(贡献因子0.2)之间的回归中的影响。同样在这里，发现随EGFR贡献因子增加的R2值均小于仅使用HER2和HER3(贡献因子0.2)观察到的R2值(图3B3)。
对于MH3-B1/rGel敏感性，HER3和EGFR可以作为HER2的附加生物标志物。与仅通过HER2表达获得的结果相比，将EGFR和HER3的贡献并入MH3-B1/rGel敏感性和HER2表达之间的回归分析中会导致R2值增加(HER2 x贡献因子为0.4的HER3的R2＝0.970，以及HER2 x贡献因子为0.3的EGFR的R2＝0.826)(图2E2、3C2、3C3、3D2和3D3)。将贡献因子不断增加的HER3表达的影响并入HER2和EGFR(贡献因子0.3)与MH3-B1/rGel敏感性之间的回归中，显示相关性增加，如通过增加的R2值所衡量的，在HER3贡献因子为0.4时观察到最大值(R2＝0.997，图3E1和3E2)。
表达HER2的细胞系在其参与内吞运输的蛋白质的表达水平方面有所不同。由于T-DM1和MH3B1/rGel依赖于内化和细胞内运输，以便发挥其细胞内作用机制，因此对该组细胞系中参与内吞机制的蛋白质进行了定量。这些蛋白质包括Rab5(图4A和B)；涉及从质膜向早期胞内体递送货物以及胞内体融合，Rab4；涉及从早期胞内体再循环(图4A和C)，HSP90(图4A和D)，据报道其调节HER2再循环，以及Rab11；涉及通过核周再循环胞内体和质膜-高尔基体运输再循环(图4A和E)24,25。在细胞系之间，这些蛋白质的表达水平显示出很大差异，并且在表达水平之间没有发现简单的联系。
Rab5和Rab4可以作为HER2的附加生物标志物来预测T-DM1敏感性。进一步评估了所研究的参与内吞机制的蛋白质(图4)是否对这些细胞系中的T-DM1敏感性有影响。在高度T-DM1敏感的SK-BR-3和AU-565细胞中发现Rab5的表达水平为该组中的其他细胞系的2.5-3倍高(图4A和B)。在T-DM1毒性和Rab5表达之间发现相对弱的相关性(R2＝0.643)(图5A1)。建立T-DM1毒性与HER2表达和贡献因子不断增加的Rab5表达的线性回归曲线，表明Rab5与HER2一起影响T-DM1毒性(图5A2)。当添加的Rab5的贡献因子为0.3时，发现了HER2和Rab5的最大R2值(图5A2)，通过包括来自Rab5的30％贡献，R2从0.926增加到0.986(图5A3)。在Rab4表达与T-DM1敏感性之间未发现线性相关性(R2＝0.088，图5B1)。当T-DM1敏感性与HER2在Rab4的贡献因子为0.4的情况下相关联时，发现R2值略有增加(图5B2和5B3)。还研究了Rab4是否与HER2一起与T-DM1敏感性呈负相关。但是，与单独使用HER2获得的R2值相比，当将1/Rab4表达并入回归公式时未发现R2值增加(数据未显示)。HSP90表达和T-DM1敏感性的线性回归也显示R2值为0.266的较差相关性(图5C1)，且与单独使用HER2获得的R2值相比，通过将HSP90的影响并入HER2的回归公式中不能观察到R2值增加(图5C2)。发现Rab11表达与T-DM1敏感性之间呈负线性相关(R2＝0.459)(图5D1)。与单独用HER2获得的R2值相比，T-DM1敏感性与HER2和贡献因子不断增加的1/Rab11表达之间的线性回归显示R2值几乎没有增加(0.929和0.926，图5D2和5D3)。
如图5所示，Rab5和Rab4的表达水平逐一地与HER2一起被指示为T-DM1敏感性的可能的生物标志物。然后评价了将Rab5和Rab4组合与HER2一起是否进一步增加与T-DM1敏感性的相关性。但是，与用HER2 x 0.3 Rab5观察到的结果相比，当将Rab4的影响并入回归公式时没有发现R2值增加(数据未显示)。总之，在将HER2仅与影响因子为0.3的Rab5结合时，发现与T-DM1敏感性具有最佳线性相关性(R2＝0.986，图5A3)。
对于MH3-B1/rGel敏感性，Rab5、Rab4、HSP90和Rab11均可作为HER2的附加生物标志物。将Rab5、Rab4、HSP90和Rab11(图4)的细胞表达水平也相对于MH3-B1/rGel敏感性(通过TI衡量)做图(图6)。在细胞系之间检测到Rab5和TI的线性相关性(R2＝0.486，图6A1)。将贡献因子不断增加的Rab5并入到已建立的HER2与MH3-B1/rGel毒性的线性回归曲线中，表明Rab5与HER2一起对MH3-B1/rGel毒性产生影响(图6A2)，如与仅用HER2进行回归相比(R2＝0.800，图2E2)，R2值的增加所示出的。通过包括Rab5的30％贡献，发现最高R2值为0.856(图6A2和6A3)，也如对于T-DM1相关性所观察到的(图5A3)。在Rab4表达与MH3B1/rGel敏感性之间未发现相关性(R2＝0.024，图6B1)。然而，利用影响因子不断增加的Rab4表达作为HER2的附加生物标志物与仅HER2相比增强了与TI的线性相关性。通过将具有0.6的影响因子的Rab4加入到HER2与TI的回归分析中，获得了最大的R2值，为0.930(图6B1和6B2)。还显示出HSP90和1/Rab11与MH3B1/rGel敏感性相关，尽管不是很强(对于HSP90的R2＝0.552，且对于1/Rab11的R2＝0.406，图6C1和D1)。进一步示出HSP90和1/Rab11逐一提高HER2表达与MH3B1/rGel敏感性的相关性，两种蛋白质都在贡献因子为1时得到最大R2值(图6C2、C3、D2和D3)。
如图6所示，Rab5、Rab4、HSP90和1/Rab11逐一地与HER2一起都被指示为MH3B1/rGel敏感性的可能的生物标志物。进一步研究了这4种生物标志物的组合与HER2一起是否会进一步增加与MH3B1/rGel敏感性的相关性。将不同蛋白质组合到回归公式中的顺序基于内吞作用和运输的路径，从Rab5(内吞作用)开始，并然后加入Rab4(早期再循环)、HSP90(早期再循环)和1/Rab11(晚期再循环)。如图6A3所示，Rab5(影响因子0.3)和HER2一起与MH3B1/rGel敏感性良好相关(R2＝0.856)。然而，在回归分析中加入影响因子不断增加的Rab4表达增加了R2值。当向HER2和0.3x Rab5中以贡献因子0.6加入Rab4时，达到最大R2值，为0.938(图7A1和A2)。将HSP90表达进一步并入HER2、Rab5和Rab4的回归分析中。通过将HSP90的80％贡献并入MH3B1/rGel敏感性与HER2、Rab5(贡献因子0.3)和Rab4(贡献因子0.6)之间的回归分析中，获得了最大R2值，为0.974(图7B)。如图6D所示，显示1/Rab11和HER2一起与MH3B1/rGel敏感性良好相关(R2＝0.894)。在MH3B1/rGel敏感性与HER2、Rab5、Rab4和HSP90表达之间的回归分析中加入1/Rab11表达的影响，也增加了R2值，如图7C1所示。当MH3B1/rGel敏感性与HER2、Rab5(贡献因子0.3)、Rab4(贡献因子0.6)和HSP90(贡献因子0.8)相关联时，在影响因子为0.4的情况下发现1/Rab11表达和其他蛋白质一起与MH3B1/rGel敏感性之间的相关性最佳(图7C2)，产生最大R2值，为0.993(图7C2)。还通过以非生物学顺序加入不同蛋白质的贡献来进行回归分析，没有对当与MH3B1/rGel敏感性相关联时获得的R2值产生任何主要影响(数据未显示)。总体而言，当将TI相对于以下作图时，发现了在按生物学逻辑顺序加入不同蛋白质的贡献时建立的MH3-B1/rGel毒性与蛋白质表达水平之间的最佳相关性，(R2＝0.993)(图7C2)：
相对HER2表达x
(1-(1-相对Rab5表达)x 0.3)x
(1-(1-相对Rab4表达)x 0.6)x
(1-(1-相对HSP90表达)x 0.8)/
(1-(1-(1/相对Rab11表达))x 0.4)
生物标志物驱动的个性化癌症治疗领域正在与越来越多的临床批准的靶向抗癌治疗方法一起迅速发展。总体而言，基于药物的个性化癌症疗法的功效取决于所选生物标志物预测预后、反应和/或耐药性的可靠性。靶向HER2的mAb曲妥珠单抗的开发代表了生物标志物驱动的个性化癌症疗法领域中的成功故事，因为被归类为HER2阳性(占所有乳腺癌的～20％)的乳腺癌患者通常接受曲妥珠单抗作为其治疗的一部分26。另一个实例是评估慢性骨髓性白血病(CML)中的BCR-ABL融合用于伊马替尼的使用，或评估EGFR和RAS野生型表达用于结直肠癌治疗中西妥昔单抗的使用27。
当前批准用于治疗癌症的大多数靶向药物是mAb或小分子抑制剂，其药物靶点也代表了作用机制的靶点。靶点本身代表了使用这些药物治疗的明确生物标志物，即使可能需要其他生物标志物以取消选择可能经历耐药性或低耐受性的患者。但是，癌症疗法中的药物开发目前正在转向由靶向部分和细胞毒性成分(诸如抑制细胞生长的药物(ADC)或毒素(靶向毒素))两者组成的更复杂的靶向治疗剂。对于这些多功能治疗剂，与细胞内转运和/或细胞毒性作用机制相关的其他生物标志物可能会影响治疗效果15。本文中这是通过在选定的HER2阳性细胞系组中曲妥珠单抗与T-DM1/MH3-B1/rGel敏感性之间缺乏一致性来表明的。
本文报道了细胞HER2表达与对T-DM1的反应之间存在强线性相关性(图2E1)。这与几项临床研究一致，这些研究表明，与低于中位数亚组相比，HER2 mRNA水平高于中位数的患者中T-DM1的反应率更高16,17,28。本文指出与MH3-B1/rGel相比，对于T-DM1，药物活性与HER2表达之间的用R2值衡量的相关性更强，且这可能是由这些药物的细胞毒性成分的差异导致的。T-DM1(DM1)的细胞毒性成分是相对小的亲脂性药物，其一旦从内吞小泡中的曲妥珠单抗成分中释放出来，便能够扩散穿过内吞膜并进入胞液，在其中发挥对微管的作用。这与MH3-B1/rGel的细胞毒性部分形成鲜明对比，MH3-B1/rGel的细胞毒性部分是28kDa亲水性I型核糖体失活蛋白毒素(gelonin)，它缺乏进入胞液的有效转运机制，但通过尚不清楚的机制在某种程度上进入了胞液。与MH3-B1/rGel和HER2表达相比，通过T-DM1和HER2表达的相关性分析获得的更高的R2值可能反映了这两种药物之间内吞逃逸机制的差异，其中指示gelonin途径的障碍更多。与DM1相比，gelonin的细胞内释放途径更为复杂，这也体现在所研究的对MH3-B1/rGel敏感性有影响的蛋白的数量(Rab5、Rab4、HSP90和Rab11)，与之相比对于T-DM1只有Rab5和Rab4。
本文示出了对T-DM1和MH3-B1/rGel二者的细胞敏感性除了与HER2相关之外，还与HER3相关。先前已报道了在临床III期试验中T-DM1的治疗作用与在HER3表达亚组中相似17。这与此处显示的数据一致，其中在仅HER3表达与T-DM1敏感性之间没有发现相关性(图3A1)。但是，本报告侧重于数学方法，以便将具有不同贡献因子的生物标志物组合在一起。这些计算表明，与单独的HER2相比，HER3与HER2的组合可以作为T-DM1反应的更好的生物标志物。HER3被认为是HER2的优选的二聚伴侣，且据报道异二聚体可诱导高活性的酪氨酸激酶信号转导29。因此，T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性与HER3表达和HER2一起之间的相关性可能反映了曲妥珠单抗和MH3-B1与HER2结合后对这些异二聚体的间接抑制。与T-DM1中的全长抗体曲妥珠单抗相比，MH3-B1/rGel由单链fv片段组成。因此，不能排除MH3-B1与作为异二聚体的一部分的HER2的结合(HER2/HER3和HER2/EGFR二者)。这还被以下结果表明：与T-DM1相比(R2从0.926增加至0.953，图8A1)，MH-3B1/rGel敏感性与除HER2之外的HER3表达之间的相关性(图8B1)明显更强(R2从0.800增加至0.970)，以及当将MH3-B1/rGel敏感性与除HER2和HER3外的EGFR相关联时R2值略微增加，而对T-DM1则没有这种相关性(图8A1和B1)。
Rab5定位于早期胞内体，并调节网格蛋白包被的囊泡的内吞作用和胞内体融合18。本文示出，T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性均取决于除了HER2之外的贡献因子为0.3的Rab5(图5A3和6A3)。Rab5与HER2一起对两种靶向HER2的治疗剂的类似影响(图8A2和B2)可能与Rab5在内吞作用和随后的内吞运输中的早期功能有关，其中这两种药物很可能遵循相同的HER2介导的内吞途径。Rab4也通过控制从早期胞内体的再循环而在内吞途径的早期发挥作用30，并在本文中显示和HER2一起与T-DM1和MH3-B1/rGel敏感性相关(图5B3和6B3)。HER2的快速再循环可增加细胞的药物摄取，但也将药物被动地定位在细胞内的早期胞内体中。
当并入Rab4与HER2一起时，R2从0.830增加到0.930(图8B2)，表明从早期胞内体的胞液转位是MH3-B1/rGel的胞液释放的机制。除了HER2以外的Rab4对T-DM1敏感性的贡献很小(R2从0.926增加至0.944，图8A2)，表明从早期胞内体中也释放出了一定程度的-美坦新，这表明-美坦新的胞液转位并不是如先前报道中所述的完全依赖于T-DM1的曲妥珠单抗部分的溶酶体隔离7,10。先前已经证明，Rab5表达可预测乳腺癌患者的不良结果，并且Rab5/Rab4再循环可促进细胞外基质侵袭和转移31。因此，本结果可能表明Rab5/Rab4和HER2阳性乳腺癌患者是基于T-DM1和MH3-B1/rGel疗法的有希望的候选者。
HSP90是HER2分子伴侣，并被认为通过多种机制(包括快速再循环)抑制HER2降解32,33。本文示出HSP90和HER2一起与MH3-B1/rGel毒性相关(图8B2)，相比之下对T-DM1未发现这种相关性(图8A2)。如对Rab4依赖性的差异所评论的那样，HSP90对这些药物的细胞毒性影响的差异可能反映了胞液转位机制的差异。差异也可能是这些药物之间不同的靶向HER2的部分导致的。另一方面，Rab11定位于内吞再循环室(ERC)，并然后在内吞过程中通过将货物再循环回质膜起作用34。在此发现MH3-B1/rGel功效与Rab11表达之间存在负相关(图6B)，表明再循环和随后的胞吐作用抑制了MH3-B1/rGel功效。Rab11和HER2一起对T-DM1毒性的影响的缺乏(图5D)可能表明T-DM1和MH3-B1/rGel遵循不同的细胞内途径，这与其细胞毒性部分的化学性质一致。例如，DM1可能在于Rab11阳性再循环胞内体中积累之前合理地逃逸了内吞小泡。
本文总共测试了六种蛋白质与HER2一起作为MH3-B1/rGel和T-DM1反应的潜在生物标志物。此处将测试的生物标志物分为两组，分别反映了靶向HER2的药物的靶向部分(EGFR和HER3)或药物的细胞内转运成分(Rab5、Rab4、HSP90和Rab11)(图8)。通过在这些组中合并生物标志物获得与药物敏感性的最佳相关性，并且通过将这两组生物标志物组合未显示与药物敏感性的相关性增加(数据未显示)。这些结果表明两组中的蛋白质不是完全独立的，这并不奇怪，因为药物的内吞运输显然取决于细胞结合和内吞作用。因此，HER2作为生物标志物应与HER3和EGFR，或Rab4、Rab5、HSP90和1/Rab11组合，以预测对T-DM1和MH3-B1/rGel的细胞敏感性(图8)。图3、5、6和7说明了以相对于HER2不断增加的贡献因子来加入这六种蛋白质作为生物标志物的影响。然而，可以将不同蛋白质的重要性进行比较，如图8A和8B所示，其中两组生物标志物的R2相关性数据都包含在同一图中。通过将细胞外蛋白HER3或细胞内蛋白Rab5和Rab4的表达加入到HER2的表达作为生物标志物，发现对于两种靶向HER2的药物，药物敏感性的相关性都有提高，但对R2值的影响不同，如图8A、B和C所示。还显示出在一定程度上MH3-B1/rGel敏感性依赖于除HER2和HER3外的EGFR表达，以及依赖于除HER2、Rab5和Rab4外的HSP90和1/Rab11表达。与T-DM1相比，与MH3-B1/rGel敏感性相关的生物标志物的库更为复杂，可能是由于与T-DM1相比，MH3-B1/rGel的胞液转位途径有更大的障碍，且也可能反映了这些药物之间靶向HER2的部分的差异。
总之，本报告首次表明，除了HER2外，还可以使用参与胞吞运输的蛋白质来预测对具有细胞内作用点的靶向HER2的治疗剂的反应。但是，不同蛋白质的影响似乎与药物的HER2靶向部分和细胞内作用成分二者，以及随后的内吞运输和胞液释放机制有关。ADC以及具有细胞内作用机制的其他靶向药物的未来发展应包括药物依赖性生物标志物库，且除了目前最常用的靶向和耐药性标志物外，还应包括摄取和细胞转运的标志物。如本文所用，可以使用数学方法来建立具有不同贡献因子的生物标志物库，以用于预后和治疗。
本文描述的总体发明构思适用于所有抗体药物缀合物(ADC)和抗体毒素缀合物(免疫毒素)。表1(ADC)和表2(免疫毒素)中列出了一些可以按照这种方法给药的优选药物。
表1-领先的临床阶段ADC
Figure BDA0002371705290000411
表2-领先的临床阶段免疫毒素
Figure BDA0002371705290000421
实施例2
患者人群。T-DM1+帕妥珠单抗(TDM1+P)组的52例患者可获得治疗前表达和病理完全反应(pCR)数据，且曲妥珠单抗对照(TH)组的31例患者可进行分析。对于此分析，进展的、退出同意、离开治疗机构或在手术前接受非方案治疗的患者视为非pCR。下表示出了每个群组中HR亚型的pCR率：
HR-HER2+ HR+HER2+
TDM1+P 12/17 18/35
TH 5/12 3/19
表达数据。在两个安捷伦(Agilent)定制阵列(15746和32627设计)之一上分析了所有I-SPY 2样品。TDM1+P群组中的所有样品均在32627阵列上进行分析，而TH群组则在平台之间进行拆分，较旧的15746平台上有22个样品，而32627阵列中有9个样品。为了结合两种设计的数据，我们更新了15746平台的探针注释(2016年9月)；且对于每个平台，通过平均化折叠归一化的表达数据，使得计算由多个探针代表的基因作为探针的平均值。然后将ComBat算法应用于调整平台偏倚，并将来自两个平台的数据合并。不管实验群组如何，均对前880名I-SPY 2患者的治疗前数据进行此程序。TH和TDM1+P群组的组合的经过平台调整的数据以及32627和更新的15746阵列设计的注释文件都包含在此交付中。
合格生物标志物分析。首先根据合格生物标志物评价(QBE)计划分别测试归一化的平台校正的RAB5A、RAB4A、RAB11A和HSP90AA1的治疗前表达水平，作为对TDM1+P反应的特定生物标志物。
步骤1：评价生物标志物作为对TDM1+P反应的特定预测因子
模型1A：TDM1+P群组中的pCR
Figure BDA0002371705290000432
生物标志物
模型1B：TH群组中的pCR
Figure BDA0002371705290000433
生物标志物
模型1C：pCR
Figure BDA0002371705290000434
治疗+生物标志物+治疗x生物标志物
模型1D：pCR
Figure BDA0002371705290000435
治疗+生物标志物+治疗x生物标志物+HR状态
在评价的生物标志物中，只有RAB5A与TDM1+P群组中的反应相关(似然比(LR)测试p＝0.012)，而与对照群组无关(LR测试p＝0.242)。RAB5A表达与治疗之间相互作用的p值为0.024，其在调整HR状态后仍保持<0.05。下表总结了所评价的四种生物标志物的结果。
Figure BDA0002371705290000431
RAB5A成功作为连续合格的生物标志物，并且将在QBE步骤2中对其进行评价。
步骤2：确定二分法阈值
我们使用了蒙特卡洛2倍交叉验证程序来确定最小化生物标志物x治疗相互作用的p值的阈值。具体来说，对于100次迭代，我们随机选择了一半的案例，以治疗群组和pCR状态的平衡为训练集。我们认为介于第10和第90百分位之间的每个值都是将训练集二分为“高”与“低”RAB5A表达组的潜在阈值；并拟合了一系列逻辑回归模型来评估生物标志物x治疗相互作用(模型1C)。我们选择了使训练集中的交互作用项的LR测试p值最小化的阈值，使用它来将测试集二分，并评估生物标志物x治疗交互作用在测试集中的显著性。然后，我们使用logit方法将100个测试集中的LR p值合并在一起；然后选择产生最小组合LR测试p值的阈值。
使用此程序，选择了9.76的阈值。参见图9。作为二分变量，具有高RAB5A水平也与TDM1+P中的反应相关(OR＝5.99(95％CI：1.23–40.27)，Fisher精确检验p＝0.01)，但对照群组中不是这样(OR：0(95％CI：0-1.74)，Fisher精确检验p＝0.06)；并具有LR p＝0.001的生物标志物x治疗相互作用项。
尽管9.76是通过该程序确定的最佳阈值，但TH群组中只有2例患者的RAB5A水平<9.76。这可能部分归因于TH和TDM1+P群组中RAB5A表达的差异，其中TH群组中RAB5A水平显著高于TDM1+P群组。阵列设计可能会导致这种差异。我们不妨考虑仅在TDM1+P群组内评估生物标志物的性能(而不是使用分析计划中预先指定的评估生物标志物x治疗相互作用的模型)。使用类似于上述方法的蒙特卡洛程序(但仅在TDM1+P中拟合模型1A)，会被选择的最佳阈值仍为9.76。
步骤3：在HER2+毕业特征的情况下，RAB5A组内的贝叶斯估计的pCR率
模型2：pCR
Figure BDA0002371705290000441
HR+RAB5A+治疗+HR x治疗+RAB5A x治疗
当我们应用确定的最佳阈值(9.76)将患者二分为RAB5A-高(>＝9.76)和RAB5A-低(<9.76)组时，TCM1+P群组中贝叶斯估计的pCR概率为68％，而在RAB5A-高患者的对照群组中为24％。与之相比，在TDM1+P群组中的RAB5A-低子集中，估计的pCR概率为28％，且在TH群组为42％。为了进行比较，使用同一模型，整个HER2+组的估计的pCR概率在TDM1+P群组中为61％，而在TH群组中为27％。贝叶斯pCR概率曲线在图10中示出。
实施例3
此实施例示出了1-SPY2研究中TH-和T-DM1+P群组的HSP90、Rab11a、Rab4A和Rab5a表达谱与治疗结果之间的相关性评价。对来自1-SPY-2数据的RNA表达谱评价了在接受T-曲妥珠单抗+化学疗法(TH)或曲妥珠单抗-emtasin+培妥珠单抗+化学疗法(TDM1+P)的两个治疗群组中pCR与HSP90、Rab11A、Rab4A和Rab5a表达水平之间的相关性。在T-DM1+P群组中的pCR 0和pCR 1组之间，Rab5A表达水平存在显着差异。在两个群组中的任何一个中，任何其他蛋白质均无显著差异。
曲妥珠单抗+化学疗法(TH)
Figure BDA0002371705290000451
曲妥珠单抗-emtasin+帕妥珠单抗+化学疗法
Figure BDA0002371705290000452
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以上说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请和登录号均通过引用整体并入本文。尽管已经结合特定实施方式描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这些特定实施方式。实际上，所描述的本发明的组合物和方法的各种修改和变型对本领域普通技术人员而言将是显而易见的，并且意在落入所附权利要求的范围内。

Claims (50)

1.治疗癌症的方法，包括：
从受试者获得包含癌细胞的样品；
通过体外测定来测量所述癌细胞中RAB5的表达水平；以及
如果所述癌细胞样品中RAB5的表达水平与预定参考水平相比增加，则给药有效量的靶向所述癌细胞的表面抗原的免疫缀合物；或者如果所述癌细胞样品中的RAB5的表达水平与预定参考水平相比降低，则给药不包括药物或毒素的靶向所述癌细胞的表面抗原的抗原结合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述癌细胞中RAB5的表达水平包括测量RAB5mRNA的水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述癌细胞中RAB5的表达水平包括测量RAB5蛋白的水平。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述RAB5是RAB5A。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述RAB5是RAB5B。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述RAB5是RAB5C。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，还包括测定RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，还包括以下步骤：将RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平并入具有RAB5表达水平的表达指标中，且如果所述表达指标与预定参考水平相比增加，则给药有效量的靶向所述癌细胞的表面抗原的免疫缀合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述癌细胞是从手术肿瘤样品、活检样品或血液样品获得的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述免疫缀合物结合选自由以下组成的组的抗原：HER2、HER3、EGFR、CD3ε、CD19、CD22、CD25、CD30、CD33、CD56、CEA(CD66e)、CD74、CD79a、CD138、NaPi2b、gpNMB、TROP-2、GUCY2C、Nectin-4、SC-16、STEAP1、FRα、IL-2R、EpCAM和MSLN。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述免疫缀合物是选自由以下组成的组的抗体药物缀合物：曲妥珠单抗-美坦新、维汀-布仑妥昔单抗、奥英妥珠单抗、pinatuzumab vedotin、polatuzumab vedotin、lifastuzumab vedotin、glembatuzumabvedotin、coltuximab ravtansine、lorvotuzumab mertansine、indatuximab ravtansine、sacitizumab govitican、labetuzumab govitican、milatuzumab doxorubicin、indusatumab vedotin、vadastuximab talirine、denintuzumab mafodotin、enfortumabvedotin、rovalpituzumab tesirine、vandortuzumab vedotin、mirvetuximabsoravtansine、ABT-414、IMGN289和AMG595。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述免疫缀合物是选自由以下组成的组的免疫毒素：MH3-B1/rGel、地尼白介素、moxetumomab pasudotox、oportuzumabmonotox、resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE和D2C7-IT。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、胰腺癌细胞、肾细胞癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、子宫内膜癌细胞、胃肠道癌细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、急性骨髓性白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，还包括测定所述癌细胞上的表面抗原的表达的步骤。
15.根据权利要求1至14所述的方法，其中，所述癌细胞是乳腺癌细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述表面抗原选自由表皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3中的至少一种及其组合组成的组，并且所述抗体药物缀合物或免疫毒素靶向所述表面抗原。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述抗体药物缀合物或免疫毒素选自由曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)、ABT-414、IMGN289、AMG595和AMG595组成的组。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述表面抗原是HER2。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述免疫缀合物是曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)。
20.一种靶向表面抗原的免疫缀合物，用于在治疗患者癌症的方法中的用途，其中来自所述患者的癌细胞表达所述抗原并表现出与预定参考水平相比增加的RAB5表达水平，如通过体外表达测定所测定的。
21.根据权利要求20所述的用途的免疫缀合物，其中，所述体外表达测定是RAB5 mRNA测定。
22.根据权利要求20所述的用途的免疫缀合物，其中，所述体外表达测定是RAB5蛋白测定。
23.根据权利要求20至22所述的用途的免疫缀合物，其中，所述RAB5是RAB5A。
24.根据权利要求20至22所述的用途的免疫缀合物，其中，所述RAB5是RAB5B。
25.根据权利要求20至22所述的用途的免疫缀合物，其中，所述RAB5是RAB5C。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的用途的免疫缀合物，其中，所述免疫缀合物结合选自由以下组成的组的抗原：HER2、HER3、EGFR、CD3ε、CD19、CD22、CD25、CD30、CD33、CD56、CEA(CD66e)、CD74、CD79a、CD138、NaPi2b、gpNMB、TROP-2、GUCY2C、Nectin-4、SC-16、STEAP1、FRα、IL-2R、EpCAM和MSLN。
27.根据权利要求17至25中任一项所述的用途的免疫缀合物，其中，所述免疫缀合物是选自由以下组成的组的抗体药物缀合物：曲妥珠单抗-美坦新、维汀-布仑妥昔单抗、奥英妥珠单抗、pinatuzumab vedotin、polatuzumab vedotin、lifastuzumab vedotin、glembatuzumab vedotin、coltuximab ravtansine、lorvotuzumab mertansine、indatuximab ravtansine、sacitizumab govitican、labetuzumab govitican、milatuzumab doxorubicin、indusatumab vedotin、vadastuximab talirine、denintuzumab mafodotin、enfortumab vedotin、rovalpituzumab tesirine、vandortuzumab vedotin、mirvetuximab soravtansine、ABT-414、IMGN289和AMG595。
28.根据权利要求17至25中任一项所述的用途的免疫缀合物，其中，所述免疫缀合物是选自由以下组成的组的免疫毒素：MH3-B1/rGel、地尼白介素、moxetumomab pasudotox、oportuzumab monotox、resimmune、LMB-2、DT2219ARL、HuM195/rGel、RG7787、MOC31PE和D2C7-IT。
29.根据权利要求17至28中任一项所述的用途的免疫缀合物，其中，所述癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、胰腺癌细胞、肾细胞癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、子宫内膜癌细胞、胃肠道癌细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、急性骨髓性白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤。
30.根据权利要求28所述的用途的免疫缀合物，其中，所述癌细胞是乳腺癌细胞。
31.根据权利要求30所述的用途的免疫缀合物，其中，所述表面抗原选自由表皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3中的至少一种及其组合组成的组，并且所述抗体药物缀合物或免疫毒素靶向所述表面抗原。
32.根据权利要求31所述的用途的免疫缀合物，其中，所述抗体药物缀合物或免疫毒素选自由曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)、ABT-414、IMGN289、AMG595和AMG595组成的组。
33.根据权利要求30所述的用途的免疫缀合物，其中，所述表面抗原是HER2。
34.根据权利要求33所述的用途的免疫缀合物，其中，所述免疫缀合物是曲妥珠单抗-美坦新(T-DM1)。
35.用于确定人癌细胞是否对靶向所述癌细胞上的表面抗原的免疫缀合物有反应的体外方法，包括：
从患者获得包含癌细胞的样品；以及
通过体外测定来测量所述癌细胞中RAB5的表达水平，其中，与预定参考水平相比，RAB5的表达水平增加指示对所述免疫缀合物有反应性。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，测量所述癌细胞中RAB5的表达水平包括测量RAB5 mRNA的水平。
37.根据权利要求35所述的方法，其中，测量所述癌细胞中RAB5的表达水平包括测量RAB5蛋白的水平。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中，所述RAB5是RAB5A。
39.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中，所述RAB5是RAB5B。
40.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中，所述RAB5是RAB5C。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的方法，还包括测定RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平的步骤。
42.根据权利要求41所述的方法，还包括将RAB4、RAB11或HSP90中的一种或多种的表达水平并入具有RAB5表达水平的表达指标中的步骤。
43.根据权利要求35至42中任一项所述的方法，其中，所述癌细胞是从手术肿瘤样品、活检样品或血液样品获得的。
44.根据权利要求35至43中任一项所述的方法，其中，所述癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、胰腺癌细胞、肾细胞癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、子宫内膜癌细胞、胃肠道癌细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、急性骨髓性白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞和非霍奇金淋巴瘤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述癌细胞是乳腺癌细胞。
46.根据权利要求35至45中任一项所述的方法，还包括测定所述癌细胞上的表面抗原的表达的步骤。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述表面抗原选自由表皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3中的至少一种及其组合组成的组，并且所述抗体药物缀合物或免疫毒素靶向表皮生长因子受体(HER1)、HER2和HER3之一。
48.根据权利要求35至47中任一项所述的方法，其中，所述表面抗原是HER2。
49.根据权利要求35至48中任一项所述的方法，还包括以下步骤：当RAB5的表达水平与参考RAB5表达水平相比增加时，向所述受试者给药免疫缀合物。
50.根据权利要求35至48中任一项所述的方法，还包括以下步骤：当RAB5的表达水平与参考RAB5表达水平相比降低时，向所述受试者给药不包含药物或毒素的抗体。
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