KR102606022B1 - 암의 진단 및 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 바이오마커를 이용하는 치료 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료 요법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료에 대한 개체의 반응을 예측하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

암의 진단 및 치료
(관련 출원의 상호 참조)
본 출원은 2017년 6월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/524,116의 우선권 및 이익을 주장하며, 이 내용은 전체가 여기에 포함된다.
본 발명은 암 마커(cancer marker)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 진단, 연구 및 치료 요법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료에 대한 개체의 반응을 예측하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
개인화된 약물에 대한 관심의 증가는 암 생물학에 대한 지식의 증가와 함께 암 치료에서 바이오마커의 높은 잠재력을 보여주었다. 다양한 바이오마커의 스펙터(specter)가 이미 임상 실습에 포함되어 환자의 생존을 예측하고, 치료 효능을 평가하거나 질병 진행을 모니터링한다(Bailey et al, Discovery medicine, 2014, 17:101-114). 표적화된 암 치료제의 높은 비용은 치료로부터 가장 이익이 될 것 같은 환자를 선택하기 위해 바이오마커의 개발을 위한 강력한 원동력이다. 이를 위해, 규제 당국은 임상 평가 하에서 새로운 요법에 대한 예측 바이오마커를 포함하는 것을 점점 더 요구하고 있다(Marton & Weiner, Biomed Res Int. 2013; 2013 : 891391).
유방암은 미국 여성들 사이에서 두 번째로 가장 일반적인 암의 형태이며, 여성들 사이에서 암으로 인한 사망의 두 번째 원인이다. 1980년대에는 새로운 유방암 사례가 급격히 증가했지만, 현재는 그 수가 안정화된 것으로 보인다. 유방암으로 인한 사망률의 하락은 아마도 더 많은 여성들이 유방 촬영술을 받고 있다는 사실에 기인한다. 조기에 검출되면, 유방암을 성공적으로 치료할 가능성이 훨씬 향상된다.
수술, 방사선 요법, 화학 요법 및 호르몬 요법으로 치료되는 유방암은 초기 단계에서 검출될 때 가장 흔히 치료할 수 있다. 유방 촬영술은 유방암의 조기 검출을 위한 가장 중요한 선별 기법이다. 유방암은 다양한 하위 유형으로 분류되지만, 현재는 이들 중 소수만이 치료의 예후 또는 선택에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 유방암의 초기 의심 후 환자 관리는 일반적으로 진단 확인, 질병 단계 평가 및 치료 선택을 포함한다. 진단은 흡인 세포 검사(aspiration cytology), 비침습적 병변(nonpalpable lesion)에 대한 주촉성(stereotactic) 또는 초음파 기술을 이용한 코어 바늘 생검(core needle biopsy) 또는 절개 또는 절제 생검(incisional or excisional biopsy)에 의해 확인될 수 있다.
예후는 환자의 연령, 질병의 단계, 종양 조직에서 종양 괴사, 에스트로겐-수용체 (ER) 및 프로게스테론-수용체 (PR)의 수준을 포함하는 1차 종양의 병리학적 특성, HER2 과발현 상태 및 증식 용량 측정에 의해, 및 폐경 상태 및 일반적인 건강 상태에 의해 영향을 받는다. 과체중 환자는 예후가 나쁠 수 있다 (Bastarrachea et al., Annals of Internal Medicine, 120: 18 [1994]). 또한, 예후는 인종에 따라, 백인보다 더 빈약한 예후가 있는 흑인 및 더 낮은 정도로 히스패닉에서 달라질 수 있다(Elledge et al., Journal of the National Cancer Institute 86: 705 [1994]; Edwards et al., Journal of Clinical Oncology 16: 2693 [1998]).
유방암의 3가지 주요 치료는 수술, 방사선, 및 약물 치료이다. 모든 환자에게 적합한 치료법은 없으며, 종종 둘 이상을 필요로 한다. 선택은 환자의 연령과 그 여성의 폐경 상태, 암의 유형 (예를 들어, 관형(ductal) 대 소엽(lobular)), 병의 단계, 종양이 호르몬-수용성인지 아닌지, 및 이의 침습성 수준을 포함하는 다수의 요인에 의해 결정된다.
유방암 치료는 국소적 또는 전신적으로 정의된다. 수술과 방사선은 종양, 유방, 림프절 또는 기타 특정 부위를 직접 치료하기 때문에 국소 요법으로 간주된다. 약물 치료는 그 효과가 널리 퍼지기 때문에 전신 요법이라고 한다. 약물 요법에는 고전적인 화학 요법 약물, 호르몬 차단 치료 (예를 들어, 아로마타제 억제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 및 에스트로겐 수용체 하향 조절제), 및 단일 클론 항체 치료 (예를 들어, HER2에 대한)가 포함된다. 이들은 별도로 또는 가장 자주, 다른 조합으로 사용될 수 있다.
HER2 (ERBB2)는 유방암에서 검증된 바이오마커이며, HER2 유전자 증폭 또는 단백질 과발현은 새로 진단된 유방암 환자의 ~ 20 %에서 발견된다(Slamon, et al., Science, 1989, 244, 707-712; Hernandez-Blanquisett, et al, Breast (Edinburgh, Scotland), 2016, 29, 170-177). HER2는 HER2-표적화 모노클로날 항체 (mAbs) (트라스투주맙(trastuzumab) 및 페르투주맙(pertuzumab)) 및 티로신 키나아제 억제제 (TKI) (라파티닙(lapatinib) 및 아파티닙(afatinib))로 치료하기 위한 치료용 바이오마커로서 사용된다(Hernandez-Blanquisett, et al, Breast (Edinburgh, Scotland), 2016, 29, 170-177). HER2-표적 mAbs와 TKI의 약리학적 효과는 약물-표적 상호작용의 직접적인 결과이고, 항체 매개 세포 세포독성(ADCC)(mAbs), HER2 억제 조절 및 성장 촉진 신호의 억제를 포함한다(Rimawi, et al, Annual review of medicine, 2015, 66, 111-128; Clynes, et al, Nature medicine, 2000, 6, 443-446; Harbeck, et al, Breast care, 2013, 8, 49-55). 또한, 수용체-매개 세포 내 이입(endocytosis)을 겪는 HER2의 능력은 이러한 막 횡단(transmembrane) 단백질이 세포 독성제를 암 세포 내로 전달하기 위한 후보가 되도록 한다. 이는 실제로 2013년에 전이성 유방암 치료에 대한 FDA 승인을 받은 항체-약물 접합체 (ADC) 트라스투주맙 엠탄신 (T-DM1)으로 예시되었다(Lewis Phillips, et al, Cancer research, 2008, 68, 9280-9290; Verma, et al, The New England journal of medicine, 2012, 367, 1783-1791; Barok, et al, Breast cancer research, 2011, 13, R46).
T-DM1은 티오에테르 (N-말레이미도메틸 시클로헥산-1-카르복실레이트 (N-maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate, MCC))에 의해 세포 독성이 높은 메이탄신(maytansine)-유래 약물인 DM-1에 결합된 트라스투주맙으로 구성된다(Baron, et al, Journal of oncology pharmacy practice, 2015, 21, 132-142). 투여 시에, T-DM1은 HER2에 결합하고, HER2-매개 세포 내 이입에 의해 세포 내로 흡수된다. 엔도/리소좀 경로 내에서 트라스투주맙-성분의 단백질 분해는 DM1의 세포질 방출을 위한 메커니즘이고, 추후에 미세 소관 불안정화 및 세포 사멸을 유도한다(Erickson, et al, Cancer research, 2006, 66, 4426-4433; Martinez, et al, Critical reviews in oncology/hematology, 2016, 97, 96-106). 따라서, T-DM1은 트라스투주맙-성분에 의해 생성된 약리학적 효과 이외에 세포 내에서 세포 독성 메커니즘을 유도한다.
약물-수송체로서 HER2를 사용하기 위한 또 하나의 다른 실험적인 접근법은 I형 리보좀-불활성화 단백질 독소 젤로닌에 유전적으로 융합된 HER2-결합 단일 쇄 가변 단편 MH3-B1로 구성된 MH3-B1/rGel과 같은 HER2-표적 융합 독소를 사용하는 것이다(Cao, et al, Cancer Res., 2009, 69, 8987-8995; Cao, et al, Mol.Cancer Ther., 2012, 11, 143-153). MH3-B1/rGel은 HER2-매개 세포 내 이입을 통해 흡수되고, 이어서 리보좀에 결합하여 번역을 억제하는 사이토졸로 방출된다(Stirpe, et al, J Biol . Chem ., 1980, 255, 6947-6953). 따라서, MH3-B1/rGel 또한 HER2에 대한 이의 결합 효과 이외에 세포 내부의 세포 독성 효과를 유도한다.
세포 내 작용점을 갖는 HER2-결합 약물의 메커니즘은 HER2-표적화 mAb 및 TKI에 비해 명백히 더 복잡하며, 이는 약물-반응을 예측하는데 사용되는 바이오마커에 반영되어야 한다(Ritchie, et al, mAbs, 2013, 5, 13-21). 그러나, T-DM1 효능에 대한 바이오마커의 평가는 HER3뿐만 아니라 HER2 및 이의 다운 스트림 신호 전달에 중점을 두었고(Baselga, et al, Clinical cancer research, 2016, 22, 3755-3763; Kim, et al, Int J Cancer, 2016, 139, 2336-2342), 세포 내 이입, 세포 내 운반체 이동(endocytic vesicle transport) 및 세포 외 배출(exocytosis)에 관여하는 단백질의 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. HER2 및 다른 표적화 수용체를 표적하는 항체 약물 접합체 및 면역 독소의 예측 값을 개선하기 위해 추가적인 바이오마커가 필요하다. 본 연구는 HER2-표적화 ADC 및 면역 독소의 치료 효과에 대한 가능한 바이오마커로서 Rab GTPase 패밀리 (Stenmark, Nature reviews. Molecular cell biology, 2009, 10, 513-525)에서의 단백질 및 HER2 세포 내 이입에 특이적으로 관련된 단백질을 평가하는 것을 목표로 했다.
본 발명은 암 바이오마커를 이용하는 치료 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료 요법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료에 대한 개체의 반응을 예측하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
표적 치료제는 치료로부터 가장 이익이 될 것 같은 환자를 선택하기 위해 검증된 바이오마커에 크게 의존한다. HER2는 이미 HER2에 대해 지시된 몇몇 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 모노클로날 항체(mAbs)에 대한 치료적 바이오마커로서 작용한다. 그러나, HER2는, 예를 들어 HER2-표적 항체 약물 접합체(ADC) 및 항체 독소 접합체(면역 독소)에 의해 세포독성제(cytotoxic agent)를 세포의 사이토졸(cytosol)로 전달하기 위해 수송 게이트(transport gate)로도 사용될 수 있다. 이러한 약물의 치료적 바이오마커는 TKIs 및 mAbs의 바이오마커와 비교할 때, 이들은 표적으로 작용하는 바이오마커 이외에 세포내 작용 및 약물 흡수의 메커니즘을 반영할 수 있기 때문에 더욱 복잡할 수 있다.
HER2-양성 유방암 및 난소암 세포주의 패널을 본 연구에서 하기 2개의 HER2-표적화 약물에 대한 민감성에 대해 평가했다; ADC 트라스투주맙-엠탄신(T-DM1) 및 항체 독소 접합체 MH3-B1/rGel. 약물 민감성은 HER3 및 EGFR과 조합하여 HER2의 발현 수준과 상관되었으며, 이는 세포 내 수송(trafficking)에 관여하는 Rab4, Rab5, Rab11 및 HSP90 뿐만 아니라 약물의 표적화 모이어티의 약리학에 영향을 미칠 수 있으며, 독성 모이어티의 약리학에 영향을 미칠 수 있다. 초기 엔도좀 마커 Rab5 및 초기 재순환 마커 Rab4는 T-DM1 및 MH3-B1/rGel 모두에 대해 가능한 치료적 바이오마커로 지시되었다. 또한, MH3-B1/rGel의 독성은 HSP90 및 Rab11 (반대)에 의존하는 것으로 나타났다. 본 결과는 처음으로 HER2-표적화된 ADC 및 항체 독소 접합체뿐만 아니라 일반적으로 ADC 및 표적화된 항체 독소 접합체에 대해 가능한 바이오마커로서 세포 내 수송에 관여하는 단백질을 포함한다. 또한, 다양한 기여 인자를 갖는 바이오마커의 조합을 검증하기 위한 수학적 접근법이 제공된다.
따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체로 암으로 진단된 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, a) 상기 환자의 생물학적 샘플에서 항체 약물 또는 독소 접합체 및 Rab5, Rab4, Rab11 및 HSP90으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 단백질 마커의 항체 성분의 수용체의 노멀라이징된(normalized) 발현 수준을 결정하는 단계; b) 수용체 및 마커의 단백질 발현의 수준의 화합물 발현 지수(expression index)를 생성하는 단계; 및 c) 상기 화합물 발현 지수를 기준으로 상기 항체 약물 또는 독소 접합체로 환자를 치료하는 단계;를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 RAB5 이외에 HER2의 단백질 발현의 증가된 수준의 발현 지수가 결정되는 경우 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 Rab5 및 Rab4 이외에 HER2의 단백질 발현의 증가된 수준의 발현 지수가 결정되는 경우 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 Rab5 및 Rab4 이외에 HER2의 단백질 발현의 증가된 수준의 발현 지수가 결정되는 경우 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 RAB5, RAB4 및 HSP90 이외에 HER2의 단백질 발현의 증가된 수준의 발현 지수가 결정되는 경우 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 환자의 생물학적 샘플은 수술 종양 샘플(surgical tumor sample), 생검 샘플(biopsy sample) 또는 혈액 샘플이다. 일부 양태에서, 암은 유방암, 결장 직장암, 폐암, 전립선암, 흑색종(melanoma), 교모세포종(glioblastoma), 췌장암, 신장 암종, 난소암, 방광암, 자궁 내막암, 위장암, 중피종(mesothelioma), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia) 및 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's Lymphoma)이다.
일부 양태에서, 항체 약물 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine, T-DM1, Kadcyla), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin, SGN-35), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin, CMC-544), 피나투주맙 베도틴(pinatuzumab vedotin, RG-7593), 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin, RG-7596), 리파스투주맙 베도틴(lifastuzumab vedotin, DNIB0600A, RG-7599), 그렘바투주맙 베도틴(glembatuzumab vedotin, CDX-011), 콜투시맙 라브탄신(coltuximab ravtansine, SAR3419), 로보투주맙 머탄신(lorvotuzumab mertansine, IMGN-901), 인다투시맙 라브탄신(indatuximab ravtansine, BT-062), 사시티주맙 고비티칸(sacitizumab govitican, IMMU-132), 라베투주맙 고비티칸(labetuzumab govitican, IMMU-130), 밀라투주맙 도소루비신(milatuzumab doxorubicin, IMMU-110), 인두사투맙 베도틴(indusatumab vedotin, MLN-0264), 바다스투시맙 탈리린(vadastuximab talirine, SGN-CD33A), 데닌투주맙 마포도틴(denintuzumab mafodotin, SGN-CD19A), 엔포투맙 베도틴(enfortumab vedotin, ASG-22ME), 로발피투주맙 테시린(rovalpituzumab tesirine, SC16LD6.5), 반도투주맙 베도틴(vandortuzumab vedotin, DSTP3086S, RG7450), 미르베툭시맙 소라브탄신(mirvetuximab soravtansine, IMGN853), ABT-414, IMGN289, 또는 AMG595이다.
일부 양태에서, 항체 독소 접합체는 MH3-B1/rGel, 데닐류킨 디피톡스(denileukin diftitox, DAB389IL2), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox, CAT-8015), 오포투주맙 모노톡스(oportuzumab monotox, VB4-845), 레시뮨(resimmune), LMB-2, DT2219ARL, HuM195/rGel, RG7787, MOC31PE 또는 D2C7-IT이다. 일부 양태에서, 결정하는 단계는 면역 검정(immunoassay)을 포함한다.
추가 양태는 작용의 치료 경로를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, a) 상기 환자의 생물학적 샘플에서 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체 및 RAB5, RAB4, RAB11 및 HSP90으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 단백질 마커의 항체 성분의 수용체의 노멀라이징된 발현 수준을 결정하는 단계; b) 수용체 및 마커의 단백질 발현의 수준의 화합물 발현 지수를 생성하는 단계; 및 c) 상기 화합물 발현 지수를 기준으로 작용의 치료 경로를 추천하는 단계;를 포함한다.
추가적인 양태는 암을 진단받은 환자의 생물학적 샘플에서 화합물 발현 지수를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, a) 상기 환자의 생물학적 샘플에서 항체 약물 접합체 또는 항체 독소 접합체 및, 예를 들어 RAB5, RAB4, RAB11 및 HSP90으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 단백질 마커의 항체 성분의 리간드의 노멀라이징된 발현 수준을 결정하는 단계; 및 b) 리간드 및 마커의 단백질 발현의 수준의 화합물 발현 지수를 생성하는 단계;를 포함한다.
또 다른 양태는 키트를 제공하고, 상기 키트는, 예를 들어 HER2, HER3, 및 EGFR로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 마커에서 단백질 발현 수준을 검출하기 위한 적어도 하나의 제1 시약 및 예를 들어 RAB5, RAB4, RAB11 또는 HSP90로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 마커에서 발현 수준을 검출하기 위한 적어도 하나의 제2 시약을 포함한다. 일부 양태에서, 시약은 항체이다.
또 다른 양태는 하기를 포함하는 시스템을 제공한다: a) 예를 들어 HER2, HER3, 및 EGFR로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 마커의 발현 수준을 검출하기 위한 적어도 하나의 제1 시약 및 예를 들어 RAB5, RAB4, RAB11 또는 HSP90로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 마커의 발현 수준을 검출하기 위한 적어도 하나의 제2 시약; 및 b) 발현 수준을 기준으로 화합물 발현 지수를 산출하기 위한 컴퓨터 프로세서 및 컴퓨터 소프트웨어.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자의 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 시험관 내 검정(in vitro assay)에 의해 상기 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 암 세포 샘플에서 RAB5의 발현 수준이 소정의 기준 수준과 비교하여 증가된 경우 상기 암 세포의 표면 항원(surface antigen)을 표적하는 면역 접합체(immunoconjugate)의 유효량을 투여하거나; 또는 상기 암 세포 샘플에서 RAB5의 발현 수준이 소정의 기준 수준과 비교하여 감소된 경우 약물 또는 독소를 포함하지 않는 상기 암 세포의 표면 항원을 표적하는 항원 결합 단백질(antigen binding protein)을 투여하는 단계;를 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계는 RAB5 mRNA의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계는 RAB5 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 RAB5는 RAB5A이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 RAB5는 RAB5B이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 RAB5는 RAB5C이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준을 검정하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은, RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준을 RAB5 발현 수준을 갖는 발현 지수에 포함시키고, 발현 지수가 소정의 기준 수준과 비교하여 증가하는 경우에 암 세포의 표면 항원을 표적하는 면역 접합체의 유효량을 투여하는 단계를 더 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 암 세포는 수술 종양 샘플(surgical tumor sample), 생검 샘플(biopsy sample) 또는 혈액 샘플로부터 수득된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 HER2, HER3, EGFR, CD3ε, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, CD56, CEA (CD66e), CD74, CD79a, CD138, NaPi2b, gpNMB, TROP-2, GUCY2C, Nectin-4, SC-16, STEAP1, FRα, IL-2R, EpCAM, 및 MSLN으로 이루어진 군에서 선택되는 항원에 결합된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin), 피나투주맙 베도틴(pinatuzumab vedotin), 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin), 리파스투주맙 베도틴(lifastuzumab vedotin), 그렘바투주맙 베도틴(glembatuzumab vedotin), 콜투시맙 라브탄신(coltuximab ravtansine), 로보투주맙 머탄신(lorvotuzumab mertansine), 인다투시맙 라브탄신(indatuximab ravtansine), 사시티주맙 고비티칸(sacitizumab govitican), 라베투주맙 고비티칸(labetuzumab govitican), 밀라투주맙 도소루비신(milatuzumab doxorubicin), 인두사투맙 베도틴(indusatumab vedotin), 바다스투시맙 탈리린(vadastuximab talirine), 데닌투주맙 마포도틴(denintuzumab mafodotin), 엔포투맙 베도틴(enfortumab vedotin), 로발피투주맙 테시린(rovalpituzumab tesirine), 반도투주맙 베도틴(vandortuzumab vedotin), 미르베툭시맙 소라브탄신(mirvetuximab soravtansine), ABT-414, IMGN289, 및 AMG595로 이루어진 군에서 선택되는 항체 약물 접합체이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 MH3-B1/rGel, 데닐류킨 디피톡스(denileukin diftitox), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 오포투주맙 모노톡스(oportuzumab monotox), 레시뮨(resimmune), LMB-2, DT2219ARL, HuM195/rGel, RG7787, MOC31PE 및 D2C7-IT로 이루어진 군에서 선택되는 면역 독소(immunotoxin)이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포는 유방암 세포, 결장 직장암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 흑색종 세포(melanoma cell), 교모세포종 세포(glioblastoma cell), 췌장암 세포, 신장 세포 암종 세포, 난소암 세포, 방광암 세포, 자궁 내막암 세포, 위장암 세포, 중피종 세포(mesothelioma cell), 다발성 골수종 세포, 급성 골수성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포(acute lymphoblastic leukemia cell) 및 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's Lymphoma)으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은 암 세포 상의 표면 항원의 발현을 검정하는 단계를 더 포함한다.
일부 특히 바람직한 양태에서, 암 세포는 유방암 세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 표면 항원은 표피성장인자수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, HER1), HER2, HER3 및 이들의 조합 중 적어도 하나로 이루어진 군에서 선택되고, 항체 약물 접합체 또는 면역 독소는 상기 표면 항원에 표적된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 항체 약물 접합체 또는 면역 독소는 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1), ABT-414, IMGN289, AMG595, 및 AMG595로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 표면 항원은 HER2이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1)이다.
일부 바람직한 양태에서, 본 발명은 환자의 암의 치료 방법에서 사용되는 표면 항원을 표적하는 면역 접합체를 제공하고, 상기 환자로부터 수득한 암 세포는 상기 항원을 발현하고, 소정의 기준 수준과 비교하여 시험관 내 발현 검정에 의해 검정되는 바와 같이 RAB5의 증가된 발현 수준을 보인다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 환자의 암의 치료 방법에서 사용되는 약물 또는 독소에 접합되지 않는 항원 결합 단백질을 제공하고, 상기 환자로부터 수득한 암 세포는 상기 항원을 발현하고, 소정의 기준 수준과 비교하여 시험관 내 발현 검정에 의해 검정되는 바와 같이 RAB5의 감소된 발현 수준을 보인다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 시험관 내 발현 검정은 RAB5 mRNA 검정이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 시험관 내 발현 검정은 RAB5 단백질 검정이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 RAB5는 RAB5A이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 RAB5는 RAB5B이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 RAB5는 RAB5C이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 HER2, HER3, EGFR, CD3ε, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, CD56, CEA (CD66e), CD74, CD79a, CD138, NaPi2b, gpNMB, TROP-2, GUCY2C, Nectin-4, SC-16, STEAP1, FRα, IL-2R, EpCAM, 및 MSLN로 이루어진 군에서 선택되는 항원에 결합한다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin), 피나투주맙 베도틴(pinatuzumab vedotin), 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin), 리파스투주맙 베도틴(lifastuzumab vedotin), 그렘바투주맙 베도틴(glembatuzumab vedotin), 콜투시맙 라브탄신(coltuximab ravtansine), 로보투주맙 머탄신(lorvotuzumab mertansine), 인다투시맙 라브탄신(indatuximab ravtansine), 사시티주맙 고비티칸(sacitizumab govitican), 라베투주맙 고비티칸(labetuzumab govitican), 밀라투주맙 도소루비신(milatuzumab doxorubicin), 인두사투맙 베도틴(indusatumab vedotin), 바다스투시맙 탈리린(vadastuximab talirine), 데닌투주맙 마포도틴(denintuzumab mafodotin), 엔포투맙 베도틴(enfortumab vedotin), 로발피투주맙 테시린(rovalpituzumab tesirine), 반도투주맙 베도틴(vandortuzumab vedotin), 미르베툭시맙 소라브탄신(mirvetuximab soravtansine), ABT-414, IMGN289, 및 AMG595로 이루어진 군에서 선택되는 항체 약물 접합체이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 MH3-B1/rGel, 데닐류킨 디피톡스(denileukin diftitox), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 오포투주맙 모노톡스(oportuzumab monotox), 레시뮨(resimmune), LMB-2, DT2219ARL, HuM195/rGel, RG7787, MOC31PE 및 D2C7-IT로 이루어진 군에서 선택되는 면역 독소이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포는 유방암 세포, 결장 직장암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 흑색종 세포, 교모세포종 세포, 췌장암 세포, 신장 세포 암종 세포, 난소암 세포, 방광암 세포, 자궁 내막암 세포, 위장암 세포, 중피종 세포, 다발성 골수종 세포, 급성 골수성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포 및 비호지킨 림프종으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포는 유방암 세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 표면 항원은 표피성장인자수용체(HER1), HER2, HER3 및 이들의 조합 중 적어도 하나로 이루어진 군에서 선택되고, 항체 약물 접합체 또는 면역 독소는 상기 표면 항원에 표적된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 항체 약물 접합체 또는 면역 독소는 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1), ABT-414, IMGN289, AMG595, 및 AMG595로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 표면 항원은 HER2이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 면역 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1)이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 인간 암 세포가 암 세포 상의 표면 항원에 표적하는 면역 접합체에 반응하는지를 결정하는 시험관 내 방법을 제공하고, 상기 방법은, 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 및 시험관 내 검정에 의해 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하고, 소정의 기준 수준과 비교하여 증가된 RAB5 발현 수준은 상기 면역 접합체에 대한 반응성(responsiveness)을 나타낸다.
일부 바람직한 양태에서, 시험관 내 발현 검정은 RAB5 mRNA 검정이다. 일부 바람직한 양태에서, 시험관 내 발현 검정은 RAB5 단백질 검정이다. 일부 바람직한 양태에서, RAB5는 RAB5A이다. 일부 바람직한 양태에서, RAB5는 RAB5B이다. 일부 바람직한 양태에서, RAB5는 RAB5C이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준을 검정하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준을 RAB5 발현 수준을 갖는 발현 지수에 포함시키는 단계를 더 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포는 수술 종양 샘플, 생검 샘플 또는 혈액 샘플로부터 수득된다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포는 유방암 세포, 결장 직장암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 흑색종 세포, 교모세포종 세포, 췌장암 세포, 신장 세포 암종 세포, 난소암 세포, 방광암 세포, 자궁 내막암 세포, 위장암 세포, 중피종 세포, 다발성 골수종 세포, 급성 골수성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포 및 비호지킨 림프종으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 암 세포는 유방암 세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은 암 세포 상의 표면 항원의 발현을 검정하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 상기 표면 항원은 표피성장인자수용체(HER1), HER2, HER3 및 이들의 조합 중 적어도 하나로 이루어진 군에서 선택되고, 항체 약물 접합체 또는 면역 독소는 표피성장인자수용체(HER1), HER2, 및 HER3 중 하나에 표적된다. 일부 특히 바람직한 양태에서, 상기 표면 항원은 HER2이다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은 RAB5의 발현 수준이 기준 RAB5 발현 수준과 비교하여 증가된 경우 개체에 면역 접합체를 투여하는 단계를 더 포함한다.
일부 바람직한 양태에서, 상기 방법은, RAB5의 발현 수준이 기준 RAB5 발현 수준과 비교하여 감소된 경우 개체에 약물 또는 독소를 포함하지 않는 항체를 투여하는 단계를 더 포함한다.
추가 양태가 본 명세서에 기재된다.
도 1: A: SK-BR-3, SKOV-3, HCC1954, AU-565, MDA-MB-435 및 MDA-MB-231 세포에서의 HER2 및 γ-튜불린(tubulin) 발현의 웨스턴 블롯. B: 명시된 약물을 이용한 72시간 동안의 치료 후, SK-BR-3, SKOV-3, AU-565, HCC1954 및 MDA-MB-435의 상대 생존도(MTT). 시그모이드 곡선 피팅 모델(sigmoidal curve fit model)인 a/(1　+　exp(-(x　-　x 0)　/　b))를 T-DM1에 대해서 이용했다. 데이터 지점(data point)들은 3개의 독립적인 실험[트라스투주맙(trastuzumab), 오차 막대(error bar): SE] 또는 적어도 3개의 별도의 실험(T-DM1 및 MH3-B1/rGel, 오차 막대: SD) 중 하나의 대표적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 2: A: 트라스투주맙 및 HER2-표적 세포 내 활성 치료제에 대한 세포 민감도의 도식적인 설명(schematic presentation). B: SK-BR-3, SKOV-3, AU-565, HCC1954 및 MDA-MB-435 세포들 사이에서, 트라스투주맙, T-DM1 및 MH3-B1/rGel에 대한 세포 민감도. IC50: 세포의 생존도를 50% 억제하는 약물 농도. TI: IC50(rGel) / IC50(MH3-B1/rGel). SK-BR-3, SKOV-3, AU-565, HCC1954 및 MDA-MB-435 세포에서의 HER2 (D1), HER3 (D2), EGFR (D3) 및 γ-튜불린 발현의 대표적인 (C) 및 정량된 (D) 웨스턴 블롯(n=2). HER2와 T-DM1 민감도 (1/IC50(T-DM1)) (E1) 또는 MH3-B1/rGel 민감도 (TI)(E2) 사이의 선형 회귀분석 곡선(Linear regression analysis curve).
도 3: HER2와 함께, T-DM1(A 및 B)과 MH3-B1/rGel (C, D 및 E) 민감도에 대한 HER3 및 EGFR 발현의 영향. A 및 B: 좌측 패널은 5종의 세포주에서의 HER3 (A1) 또는 EGFR (B1) 발현과 T-DM1 민감도 사이의 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. 중앙의 패널은 선형 회귀로부터의 R2 값을 5종의 세포주에서의 T-DM1 민감도에 대한 HER2 발현의 기여 인자(contribution factor)에 더하여, HER3 (A2) 또는 EGFR (B2) 발현으로부터의 기여 인자(contribution factor)의 함수로 도시한다. A3은, T-DM1 민감도가 HER2와 HER3 발현(기여 인자: 0.2) 모두에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. B3은 선형 회귀로부터 비롯된 R2 값을 5종의 세포주에서의 T-DM1 민감도에 대한 HER2 발현과 HER3 발현(기여 인자 0.2)의 영향 인자(factor of influence)에 더하여, EGFR 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. C 및 D: 좌측 패널은 5종의 세포주에서의 HER3 (C1) 또는 EGFR (D1) 발현과 MH3-B1/rGel 민감도 사이의 선형 회귀분석을 나타낸다. 중앙의 패널은 선형회귀로부터 비롯된 R2 값을 5종의 세포주에서의 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 HER2 발현의 기여에 더하여, HER3 (C2) 또는 EGFR (D2) 발현으로부터의 기여의 함수로 도시한다. 우측 패널은, MH3-B1/rGel 민감도가 HER2 및 HER3 발현 (기여 인자: 0.4) (C3), 또는 HER2 및 EGFR 발현 (기여 인자: 0.3) (D3) 모두에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. E1은 선형 회귀로부터 비롯된 R2 값을 5종의 세포주에서의 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 HER2 및 EGFR 발현(기여 인자 0.3)의 영향 인자에 더하여, HER3 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. E2는 MH3-B1/rGel 민감도가 HER2, EGFR (기여 인자 0.3) 및 HER3 발현 (기여 인자: 0.4)에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다.
도 4: SK-BR-3, SKOV-3, AU-565, HCC1954 및 MDA-MB-435 세포에서의 Rab5, Rab4, HSP90, Rab11및 γ-튜불린 발현의 대표적인 (A) 및 정량된 (B-E) 웨스턴 블롯(n=2).
도 5: HER2와 함께, T-DM1 민감도에 대한 Rab5, Rab4, HSP90 및 Rab11 발현의 영향. 좌측 패널은 5종의 세포주에서의 Rab5 (A1), Rab4 (B1), HSP90 (C1) 또는 Rab11 (D1) 발현과 T-DM1 민감도 사이의 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. 중앙의 패널은 선형 회귀로부터 비롯된 R2 값을 5종의 세포주에서의 T-DM1 민감도에 대한 HER2 발현의 영향 인자에 더하여, Rab5 (A2), Rab4 (B2), HSP90 (C2) 또는 1/Rab11 (D2) 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. 우측 패널은, T-DM1 민감도가 HER2 및 Rab5 (기여 인자: 0.3) (A3), Rab4 (기여 인자: 0.4) (B3) 또는 1/Rab11 (기여 인자: 0.2) (D3) 발현 모두에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다.
도 6: HER2와 함께, MH3-B1/rGel 민감도에 대한 Rab5, Rab4, HSP90 및 Rab11 발현의 영향. 좌측 패널은 5종의 세포주에서의 Rab5 (A1), Rab4 (B1), HSP90 (C1) 또는 Rab11 (D1) 발현과 MH3-B1/rGel 민감도 사이의 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. 중앙의 패널은 선형 회귀로부터의 R2 값을 5종의 세포주에서의 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 HER2 발현의 영향 인자에 더하여, Rab5 (A2), Rab4 (B2), HSP90 (C2) 또는 1/Rab11 (D2) 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. 우측 패널은, MH3-B1/rGel 민감도가 HER2 및 Rab5 (기여 인자: 0.3) 모두 (A3), Rab4 (기여 인자: 0.6) (B3), HSP90 (기여 인자: 1) (C3) 또는 1/Rab11 (기여 인자: 1) (D3) 발현에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다.
도 7: HER2와 함께, MH3-B1/rGel 민감도에 대한 Rab5, Rab4 및 HSP90 또는 1 / Rab11 발현의 결합의 영향. A1은 선형 회귀로부터의 R2 값을 5종의 세포주에서의 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 HER2 및 Rab5 발현 (기여 인자: 0.3)의 영향 인자에 더하여, Rab4 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. A2는, MH3-B1/rGel 민감도가 HER2, Rab5 (기여 인자: 0.3)와 Rab4 발현 (기여 인자: 0.6)에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. B1은 선형 회귀로부터의 R2 값을 5종의 세포주에서의 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 HER2, Rab5 (기여 인자: 0.3), 및 Rab4 (기여 인자: 0.6)의 영향 인자에 더하여, HSP90 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. B2는 MH3-B1/rGel 민감도가 HER2, Rab5 (기여 인자: 0.3), Rab4 발현 (기여 인자: 0.6) 및 HSP90 발현 (기여 인자: 0.8)에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다. C1은 선형 회귀로부터의 R2 값을 5종의 세포주에서의 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 HER2, Rab5 (기여 인자: 0.3), Rab4 (기여 인자: 0.6) 및 HSP90 (기여 인자: 0.8)의 영향 인자에 더하여, 1/Rab11 발현으로부터의 영향 인자의 함수로 도시한다. C2는 MH3-B1/rGel 민감도가 HER2, Rab5 (기여 인자: 0.3), Rab4 발현 (기여 인자: 0.6), HSP90 발현 (기여 인자: 0.8) 및 1/Rab11 발현 (기여 인자: 0.4)에 대해서 선형의 상관관계에 있는 최적화된 선형 회귀분석 곡선을 나타낸다.
도 8: T-DM1 (A) 또는 MH3-B1/rGel 민감도 (B)에 대한 HER2와 함께, HER3 및 EGFR (A1, B1) 또는 Rab5, Rab4, HSP90 및 1/Rab11 발현 (A2, B2)의 결합의 영향. 제시된 결과는 도 5, 6 및 7에서 보고된 바와 동일하나, 여기서는 동일한 도면에 포함된다. 본 보고서에서 T-DM1 및 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 기재된 바이오마커의 도식적인 설명(C). 화살표는 현재의 바이오마커가 제안된 약물을 나타내고, 화살표의 너비는 약물 민감도에 대한 단백질 영향을 도시한다. 원(circle)들은 결합에 제안된 바이오마커의 두 풀을 나타낸다.
도 9: 바이오마커 x 치료 상호작용(biomarker x treatment interaction)의 p 값을 최소화시키는 임계값을 확인하기 위한 몬테-카를로 2-폴드 교차 검증(Monte-Carlo 2-fold cross-validation) 절차의 결과.
도 10: RAB5A 발현에 관련된 베이즈 pCR 확률 곡선(Bayesian pCR probability curve).
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 단계는 하기로 정의된다:
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질(antigen binding protein)"은 항원에 결합하는 부분, 및 선택적으로 항원 결합 부분이 항원에 결합하는 항원 결합 단백질의 결합을 촉진시키는 입체 구조를 채택하게 하는 스캐폴드 또는 프레임 워크 부분을 포함하는 단백질을 말한다. 항원 결합 단백질의 예는 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항체의 항원 결합 부분), 항체 유도체 및 항체 유사체를 포함한다. 항원 결합 단백질은, 예를 들어 이식된 CDR 또는 CDR 유도체를 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 예를 들어 생체 적합성 폴리머를 포함하는 전체 합성 스캐폴드뿐만 아니라 항원 결합 단백질의 3차원 구조를 안정화시키기 위해 도입된 돌연변이를 포함하는 항체 유래 스캐폴드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단백질의 예는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody), 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 단일쇄 항체(single chain antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 미니 바디(minibody), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv-단편, 단일쇄 Fv-단편 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 접합체(immunoconjugate)"는 화학 결합 또는 펩티드 링커와 같은 약물 또는 독소와 같은 다른 제제에 결합되거나 연결된 항원 결합 단백질을 포함하는 분자를 말한다. 용어 "면역 접합체"는 항체 약물 접합체, 면역 독소 및 친화성 독소(affinitytoxin)를 포함한다. 분자의 항원 결합 단백질 부분은 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 항원 결합 유도체, 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, 인간화 항체, 미니 바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv-단편, 단일쇄 Fv-단편 등일 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질 부분은 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 단백질 리간드일 수 있다. 예를 들어, EGF는 세포 표면 상에서 발현된 EGF-수용체를 표적할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)"는 일반적으로 화학 결합을 통해 약물 분자에 연결되거나 그렇지 않으면 결합되는 항원 결합 단백질을 포함하는 분자를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 독소(immunotoxin)"는 보통 펩티드 링커를 통해 독소 분자에 연결되거나 그렇지 않으면 결합되는 항원 결합 단백질을 포함하는 분자를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "친화성 독소(affinitytoxin)"는 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 단백질 리간드를 포함하는 분자를 말하며, 여기서 단백질 리간드는 일반적으로 펩티드 링커를 통해 독소 분자에 연결되거나 그렇지 않으면 결합된다.
본 명세서에서 사용되는 암 세포는 면역 접합체와 세포의 접촉시 측정 가능한 독성 반응이 검출될 수 있는 경우 면역 접합체에 "반응성(responsive)"이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "검출하다(detect)", "검출하는(detecting)" 또는 "검출(detection)"은 조성물의 발견 또는 식별의 일반적인 행위 또는 특정 관찰을 기술할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 DNA 또는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 핵산 함유 분자를 말한다. 이 용어는 4-아세틸사이토신(4-acetylcytosine), 8-하이드록시-N6-메틸아데노신(8-hydroxy-N6-methyladenosine), 아지리디닐사이토신(aziridinylcytosine), 수도이소사이토신(pseudoisocytosine), 5-(카르복시하이드록실-메틸)우라실(5-(carboxyhydroxyl-methyl) uracil), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil), 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실(5-carboxymethyl-aminomethyluracil), 디하이드로우라실(dihydrouracil), 이노신(inosine), N6-이소펜테닐아디넨(N6-isopentenyladenine), 1-메틸아데닌(1-methyladenine), 1-메틸수도-우라실(1-methylpseudo-uracil), 1-메틸구아닌(1-methylguanine), 1-메틸이노신(1-methylinosine), 2,2-디메틸-구아닌(2,2-dimethyl-guanine), 2-메틸아데닌(2-methyladenine), 2-메틸구아닌(2-methylguanine), 3-메틸-사이토신(3-methyl-cytosine), 5-메틸사이토신(5-methylcytosine), N6-메틸아데닌(N6-methyladenine), 7-메틸구아닌(7-methylguanine), 5-메틸아미노메틸우라실(5-methylaminomethyluracil), 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실(5-methoxy-amino-methyl-2-thiouracil), 베타-D-만노실퀘오신(beta-D-mannosylqueosine), 5'-메톡시카르보닐메틸우라실(5'-methoxycarbonylmethyluracil), 5-메톡시우라실(5-methoxyuracil), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌(2-methylthio-N6-isopentenyladenine), 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르(uracil-5-oxyacetic acid methylester), 우라실-5-옥시아세트산(uracil-5-oxyacetic acid), 옥시부톡소신(oxybutoxosine), 수도우라실(pseudouracil), 퀘오신(queosine), 2-티오사이토신(2-thiocytosine), 5-메틸-2-티오우라실(5-methyl-2-thiouracil), 2-티오우라실(2-thiouracil), 4-티오우라실(4-thiouracil), 5-메틸우라실(5-methyluracil), N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르(N-uracil-5-oxyacetic acid methylester), 우라실-5-옥시아세트산(uracil-5-oxyacetic acid), 수도우라실(pseudouracil), 퀘오신(queosine), 2-티오사이토신(2-thiocytosine), 및 2,6-디아미노퓨린(2,6-diaminopurine)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체를 포함하는 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "증폭 올리고뉴클레오티드(amplification oligonucleotide)"는 표적 핵산 또는 이의 상보체에 혼성화 하고 핵산 증폭 반응에 참여하는 올리고 뉴클레오티드를 말한다. 증폭 올리고뉴클레오티드의 예는 주형(template) 핵산에 혼성화하고 증폭 과정에서 폴리머라제에 의해 연장되는 3' OH 말단을 함유하는 "프라이머(primer)"이다. 증폭 올리고뉴클레오타이드의 다른 예는 폴리머라제에 의해 연장되지 않지만(예를 들어, 3' 차단된 말단을 갖기 때문에), 증폭에 참여하거나 증폭을 촉진하는 올리고 뉴클레오티드이다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 선택적으로, 변형된 뉴클레오티드 또는 유사체, 또는 증폭 반응에 참여하지만 표적 핵산에 상보적이거나 표적 핵산 정보에 포함되지 않는 추가 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 또는 주형 서열에 상보적이지 않은 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 5' 영역은 표적 핵산에 상보적이지 않은 프로모터 서열("프로모터-프라이머(promoter-primer)"라고 함)을 포함할 수 있다. 당업자는 프라이머로서 기능하는 증폭 올리고뉴클레오티드가 5' 프로모터 서열을 포함하도록 변형되어 프로모터-프라이머로서 기능할 수 있음을 이해할 것이다. 마찬가지로, 프로모터-프라이머는 프로모터 서열을 제거하거나 제거하지 않고 변형될 수 있고 여전히 프라이머로서 기능할 수 있다. 3' 차단된 증폭 올리고뉴클레오티드는 프로모터 서열을 제공할 수 있고, 중합을 위한 주형("프로모터-제공자(promoter-provider)"라고 함)으로 작용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 정제된 제한 다이제스트(restriction digest)에서 자연적으로 발생하거나 합성적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 말하며, 이는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 놓일 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다 (예를 들어, 뉴클레오티드 및 유도제, 예를 들어 DNA 폴리머라제의 존재 하에 및 적합한 온도 및 pH에서). 프라이머는 증폭에서 최대 효율을 위해 단일 가닥인 것이 바람직하지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 먼저 연장 생성물을 제조하는데 사용되기 전에 가닥을 분리하도록 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재 하에서 연장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 소스 및 방법의 사용을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 정제된 제한 다이제스트에서 자연적으로 발생하거나 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되고, 목적하는 다른 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 혼성화할 수 있는 올리고 뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드의 서열)를 말한다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열의 검출, 동정 및 분리에 유용하다. 본 발명에 사용된 임의의 프로브는 임의의 "리포터 분자(reporter molecule)"로 표지되어, 효소 (예를 들어, ELISA 및 효소-기반의 조직 화학 분석), 형광, 방사성 및 발광 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 검출 시스템에서 검출될 수 있는 것으로 고려된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 라벨로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 양태에서, 리포터 분자는 "외인성 리포터 분자(exogenous reporter molecule)"이다.
용어 "외인성 리포터 분자(exogenous reporter molecule)"는 검출 시약 (예를 들어, 프로브, 핵산 또는 항체)과 관련하여 본질적으로 발견되지 않는 리포터 분자 또는 표지를 말한다. 예는 효소, 형광, 방사성 또는 발광 리포터 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"단리된 올리고뉴클레오티드(an isolated oligonucleotide)" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드(isolated polynucleotide)"에서와 같이, 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된(isolated)"은 일반적으로 자연적인 원천에서 회합된 하나 적어도 하나의 성분 또는 오염물로부터 동정 및 분리된 핵산 서열을 말한다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 다른 형태 또는 설정으로 존재한다. 대조적으로, DNA 및 RNA와 같은 핵산과 같은 비-단리된 핵산은 자연적으로 존재하는 상태로 발견된다. 예를 들어, 제공된 DNA 서열(예를 들어, 유전자)은 이웃하는 유전자에 근접한 숙주 세포 염색체에서 발견되며; 특정 단백질을 인코딩하는 특정 mRNA 서열과 같은 RNA 서열은 다수의 단백질을 인코딩하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 그러나, 제공된 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산은, 예를 들어 핵산이 천연 세포와 다른 염색체 위치에 있거나 자연에서 발견된 것보다 다른 핵산 서열에 의해 플랭크되는(flanked) 제공된 단백질을 일반적으로 발현하는 세포에서의 핵산을 포함한다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 발현하기 위해 이용되는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 최소한 센스 또는 코딩 가닥을 함유할 것이지만(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있지만), 센스 및 안티센스 가닥(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있음) 모두를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정제된(purified)" 또는 "정제하는(to purify)"은 샘플로부터 성분 (예를 들어, 오염물)의 제거를 말한다. 예를 들어, 항체는 비-면역글로불린 단백질의 오염을 제거함으로써 정제되고; 또한 이들은 표적 분자에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거에 의해 정제된다. 비-면역글로불린 단백질의 제거 및/또는 표적 분자에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거는 샘플에서 표적-반응성 면역글로불린의 퍼센트의 증가를 초래한다. 다른 예에서, 재조합 폴리펩티드는 박테리아 숙주 세포에서 발현되고, 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제되고; 이로써 재조합 폴리펩티드의 퍼센트가 샘플에서 증가된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플(sample)"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 어떤 의미에서, 생물학적 및 환경적 샘플뿐만 아니라 임의의 공급원으로부터 수득된 표본 또는 배양물을 포함하는 것을 의미한다. 생물학적 샘플은 동물 (인간을 포함함)로부터 수득할 수 있으며, 체액, 고형물, 조직 및 가스를 포함한다. 생물학적 샘플은 혈장, 혈청 등과 같은 혈액 생성물을 포함한다. 환경적 샘플은 표면 물질, 토양, 물, 결정 및 산업적 샘플과 같은 환경적인 물질이 포함된다. 그러나, 이러한 예는 본 발명에 적용 가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 암 바이오마커를 이용하는 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료 요법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료에 대한 개체의 반응을 예측하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
개인화된 약품에 대한 관심의 증가는 암 생물학에 대해 증가하는 지식과 함께 암 치료에 바이오마커를 사용할 수 있는 잠재력을 보여주었다. 환자 생존을 예측하고, 치료 효능을 평가하거나, 질병 진행 1 을 모니터링하기 위해 다양한 바이오마커 스펙트럼이 이미 임상 실무에 통합되어 있다. 예측 바이오마커는 특정 치료로 가장 혜택을 볼 수 있는 환자를 신중하게 선택할 수 있어, 현재와 미래의 고비용 표적 암 치료제를 합리적으로 활용하기 위해 이러한 지식이 중요하다.
따라서, 하나 이상의 단백질 마커의 발현에 기초하여 암(예를 들어, 유방암)을 갖는 개체에게 치료를 결정, 추천 및/또는 투여하기 위한 시스템 및 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 발명은 특정 마커로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 항체에 대한 항원(예를 들어, HER2, HER3, EGFR) 및 하나 이상의 추가적인 마커(예를 들어, RAB5 (바람직하게는 RAB5A), RAB4, RAB11 및 HSP90 또는 HER3 및 EGFR)의 조합은 단독으로 또는 조합하여 검출된다. 일부 양태에서, 조합 또는 마커의 발현 수준은 조합되어 화합물 발현 지수를 생성한다.
일부 바람직한 양태에서, 본 발명은 환자의 암의 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 환자로부터 암 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 시험관 내 검정(in vitro assay)에 의해 상기 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 암 세포 샘플에서 RAB5의 발현 수준이 소정의 기준 수준과 비교하여 증가된 경우 상기 암 세포의 표면 항원(surface antigen)을 표적하는 면역 접합체(immunoconjugate)의 유효량을 투여하거나; 또는 상기 암 세포 샘플에서 RAB5의 발현 수준이 소정의 기준 수준과 비교하여 감소된 경우 약물 또는 독소를 포함하지 않는 상기 암 세포의 표면 항원을 표적하는 항원 결합 단백질(antigen binding protein)을 투여하는 단계;를 포함한다. RAB5A, RAB5B 또는 RAB5C 또는 이들의 조합 중 어느 하나의 발현이 검정될 수 있다. 일부 특히 바람직한 양태에서, RAB5A의 발현이 검정된다.
기술되는 바와 같이, 일부 바람직한 양태에서, 독소 또는 약물에 접합되지 않은 면역 접합체 또는 항원 결합 단백질의 투여 여부에 대한 결정은 소정의 기준 또는 역치 수준과 비교하여 환자 샘플에서 RAB5, 바람직하게는 RAB5A의 측정된 발현의 비교에 기초한다. 당업자는 기준 또는 역치 수준이 적합한 환자 집단으로부터 수득된 발현 데이터에 적용되는 통계적 절차에 의해 결정될 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 다른 통계 절차도 이용될 수 있음을 인식할 것이지만, 적절한 통계적 방법이 실시예에 제공된다. 상이한 통계적 절차, 또는 동일한 절차가 상이한 또는 확장된 데이터 세트를 실행하는 것은 상이한 기준 또는 역치 수준을 생성할 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정 마커 (예를 들어, RAB5A) 또는 마커의 조합의 발현을 위한 임의의 특정 기준 또는 역치 수준의 사용으로 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준을 검정하는 것을 더 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 샘플에서의 발현 수준은 RAB5 발현 수준, 바람직하게는 RAB5A 발현 수준을 갖는 발현 지수에 포함되고, 발현 지수가 소정의 기준 수준과 비교하여 증가하는 경우 암 세포의 표면 항원을 표적하는 유효량의 면역 접합체의 유효량을 투여한다.
일부 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 환자 샘플은 암 세포를 포함한다. 세포를 함유하는 적합한 샘플은 생검, 수술 샘플 및 채혈 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 샘플은 하나 이상의 세포 표면 항원의 존재에 대해 미리 분석되었다. 일부 양태에서, 상기 방법은 샘플이 이전에 특성화되지 않은 경우, 하나 이상의 세포 표면 항원의 발현에 대해 샘플을 검정하는 단계를 더 포함한다. 본 발명은 임의의 특정 표면 항원의 검정으로 제한되지 않지만, 내재화(internalization)(예를 들어, 세포 내 이입에 의해)되기 쉬운 세포 표면 항원이 바람직하다. 내재화되기 쉬운 예시적인 세포 표면 항원은 HER2, HER3, EGFR, CD3ε, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, CD56, CEA (CD66e), CD74, CD79a, CD138, NaPi2b, gpNMB, TROP-2, GUCY2C, Nectin-4, SC-16, STEAP1, FRα, IL-2R, EpCAM, 및 MSLN을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 특히 바람직한 양태에서, 샘플은 유방암 세포를 함유한다. 이러한 양태에서, 유방암은 바람직하게는 표피성장인자수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, HER1), HER2, 및/또는 HER3의 발현을 특징으로 한다. 더욱 바람직한 양태에서, 샘플은 HER2 수용체에 대해 검정하거나, 또는 이전에 검정되고, HER2 수용체를 갖는 것으로 확인된다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 본 발명의 방법에서 이용된다. 본 발명은 임의의 특정 화합물 발현 지수를 사용하는 것에 제한되지 않는다. 적합한 화합물 발현 지수의 예는 다음과 같다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적(Relative) HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB5 발현) × 0.3) × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.6) × (1-(1-상대적 HSP90 발현) × 0.8) /(1-(1-(1/상대적 RAB11 발현)) × 0.4)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.6) × (1-(1-상대적 RAB5 발현) × 0.3) × (1-(1-상대적 HSP90 발현) × 0.8)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.6) × (1-(1-상대적 RAB5 발현) × 0.2) × (1-(1-상대적 HSP90 발현) × 0.6)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.4) × (1-(1-상대적 RAB5 발현) × 0.2)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB5 발현) × 0.3) × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.6)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB5 발현) × 0.3)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.4)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB4 발현) × 0.6)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 RAB11 발현) × 0.2)이다.
일부 양태에서, 화합물 발현 지수는 상대적 HER2 발현 × (1-(1-상대적 HSP90 발현)이다.
일부 양태에서, 발현은 단백질 발현이다. 일부 양태에서, 결정 단계는 면역 검정을 포함한다. 일부 양태에서, 발현은 mRNA 발현이다. 일부 양태에서, 결정 단계는 cDNA를 제공하기 위해 mRNA의 역전사 및 바이오마커에 특이적인 프라이머로 cDNA의 증폭을 포함한다. 일부 양태에서, 검출 기술은 RT-PCR이다.
본 발명에서 사용되는 발현 검정은 RAB5A와 같은 단일 바이오마커, 또는 바이오마커의 패널(예를 들어, RAB5A 및 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상; RAB5A 및 HER2; 또는 RAB5A, HER2 및 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상)을 이용할 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 패널 또는 검정은 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 또는 5개 미만의 바이오마커, 또는 다른 바람직한 양태에서, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 총 20개의 바이오마커를 포함한다.
일부 양태에서, 단백질 발현 수준은 개체의 샘플에서 검출된다. 일부 양태에서, 개체는 암(예를 들어, 유방암)으로 진단된다. 일부 양태에서, 샘플은 조직(예를 들어, 생검 조직), 혈액, 혈청, 소변 등이다.
단백질 마커를 검출하는 예시적인 방법은 하기에 제공된다. 그러나, 종양 마커 단백질을 검출하는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
면역 검정의 예시적인 비제한적인 예는 면역 침강법(immunoprecipitation); 웨스턴 블롯(Western blot); ELISA; 면역 조직 화학(immunohistochemistry); 면역 세포 화학(immunocytochemistry); 유세포 분석(flow cytometry); 및 면역-PCR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 알려진 다양한 기술(예를 들어, 비색법, 형광법, 화학 발광 또는 방사선)을 사용하여 검출 가능하게 표지된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 면역 검정에 사용하기에 적합하다.
면역 침강법은 항원에 특이적인 항체를 사용하여 용액에서 항원을 침전시키는 기술이다. 상기 공정은 복합체 내에 있는 것으로 여겨지는 단백질을 표적화함으로써 세포 추출물에 존재하는 단백질 복합체를 동정하는데 사용될 수 있다. 복합체는 단백질 A 및 단백질 G와 같은 박테리아로부터 초기에 단리된 불용성 항체-결합 단백질에 의해 용액으로부터 나온다. 또한, 항체는 용액으로부터 쉽게 단리될 수 있는 세파로오스 비즈(sepharose beads)에 결합될 수 있다. 세정 후, 침전물은 질량 분석, 웨스턴 블롯, 또는 복합체에서 구성물을 동정하기 위한 임의의 수의 다른 방법을 사용하여 분석될 수 있다.
웨스턴 블롯, 또는 면역 블롯(immunoblot)은 조직 파쇄액(homogenate) 또는 추출물의 제공된 샘플에서 단백질을 검출하는 방법이다. 이는 질량에 의해 변성된 단백질을 분리하기 위해 겔 전기 영동법(gel electrophoresis)을 사용한다. 그 후, 단백질은 겔 밖으로 및 막, 일반적으로 폴리비닐디플루오라이드(polyvinyldifluoride) 또는 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 상에서 전달되고, 이들은 목적하는 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로브된다. 결과적으로, 연구자들은 제공된 샘플에서 단백질의 양을 측정하고 몇 개의 그룹들 간의 수준을 비교할 수 있다.
효소 연결 면역 흡착 분석법 (Ezyme-Linked ImmunoSorbent Assay)의 줄임말 인 ELISA는 샘플에서 항체 또는 항원의 존재를 검출하는 생화학적 기술이다. 이는 최소 2개의 항체를 사용하는데, 이 중 하나는 항원에 특이적이고, 다른 하나는 효소에 결합되어 있다. 제2 항체는 발색성 또는 형광성 기질이 신호를 생성하게 할 것이다. 다양한 ELISA는 샌드위치(sandwich) ELISA, 경쟁적(competitive) ELISA, 및 ELISPOT를 포함한다. ELISA는 샘플에서 항체의 존재 또는 항원의 존재를 평가하기 위해 수행될 수 있기 때문에, 이는 혈청 항원 농도를 결정하고, 항원의 존재를 검출하기 위해 유용한 툴이다.
면역 조직 화학 및 면역 세포 화학은 이들의 각각의 항체에 결합하는 조직 또는 세포에서 항원의 원리를 통해 각각 조직 부분 또는 세포에서 단백질을 국소화 하는 방법을 말한다. 시각화(Visualization)는 색상 생성 또는 형광 태그(fluorescent tag)로 항체를 태깅(tagging)함으로써 가능하다. 색상 태그(color tag)의 일반적인 예는 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 및 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 형광단 태그(fluorophore tag)의 일반적인 예는 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC, fluorescein isothiocyanate) 또는 피코에리트린(PE, phycoerythrin)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
유세포 분석은 유체 스트림에 현탁되는 미세 입자(microscopic particle)를 계수, 조사 및 분류하기 위한 기술이다. 이는 광학/전자 검출 장치를 통해 유동하는 단일 세포의 물리적 및/또는 화학적 특성의 동시적인 다중 매개 변수적 분석을 가능하게 한다. 단일 주파수 또는 색상의 광의 빔(예를 들어, 레이저)은 유체의 유체 역학적으로 포커스된 스트림 상에 조사된다. 다수의 검출기는 스트림이 광 빔을 통과하는 지점으로 조준되고; 하나는 광선 (전방 산란(Forward Scatter) 또는 FSC)과 일직선이고 몇 개는 이에 수직이다(SSC (측면 산란(Side Scatter)) 및 하나 이상의 형광 검출기). 빔을 통과하는 각각의 현탁된 입자는 어떤 방식으로 광을 산란시키고, 입자 내의 형광 화학물질은 광원보다 낮은 주파수에서 광을 방출하도록 여기될 수 있다. 산란 및 형광의 조합은 검출기에 의해 포착되고, 각각의 형광 방출 피크마다 하나씩, 각각의 검출기에서 밝기의 변동을 분석함으로써, 각각의 개별 입자의 물리적 및 화학적 구조에 관한 다양한 사실을 추론할 수 있다. FSC는 세포 부피와 관련되고 SSC는 입자의 밀도 또는 내부 복잡성 (예를 들어, 핵의 모양, 세포질 과립의 양 및 유형 또는 막 조도)과 상관된다.
면역-중합 효소 연쇄 반응 (IPCR)은 핵산 증폭 기술을 이용하여 항체 기반 면역 분석에서 신호 생성을 증가시킨다. PCR의 단백질 동등성이 존재하지 않기 때문에, 즉 PCR 동안 핵산이 복제되는 것과 동일한 방식으로 단백질을 복제할 수 없기 때문에, 검출 감도를 증가시키는 유일한 방법은 신호 증폭에 의한 것이다. 표적 단백질은 올리고뉴클레오티드에 직접 또는 간접적으로 접합된 항체에 결합된다. 결합되지 않은 항체는 세척되고, 나머지 결합된 항체는 이들의 올리고뉴클레오티드가 증폭된다. 단백질 검출은 실시간 방법을 포함하여 표준 핵산 검출 방법을 사용하여 증폭된 올리고 뉴클레오티드의 검출을 통해 일어난다.
일부 양태에서, 면역 자기 검출(immunomagnetic detection)이 이용된다. 일부 양태에서, 검출은 자동화된다. 예시적인 면역 자기 검출법은 Veridex (뉴저지, 래리턴)에서 시판되는 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 컴퓨터 기반의 분석 프로그램은 검출 검정에 의해 생성된 미가공 데이터 (예를 들어, 마커 발현의 존재, 부재 또는 양)를 임상의를 위한 예측값 데이터 (예를 들어, 암 요법 또는 화합물 발현 지수의 선택)로 번역하는데 사용된다. 임상의는 임의의 적절한 수단을 사용하여 예측 데이터에 접근할 수 있다. 따라서, 일부 바람직한 양태에서, 본 발명은 유전학 또는 분자 생물학에 대해 훈련되지 않을 임상의가 미가공 데이터를 이해할 필요가 없다는 추가 이점을 제공한다. 데이터는 가장 유용한 형태로 임상의에게 직접 제공된다. 임상의는 환자의 치료를 최적화하기 위해 정보를 즉시 활용할 수 있다.
본 발명은 분석, 정보 제공, 의료 개인 및 개체를 수행하는 실험실로부터 정보를 수신, 처리 및 전송할 수 있는 임의의 방법을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 양태에서, 샘플 (예를 들어, 생검 또는 혈액 또는 혈청 샘플)은 개체로부터 수득되고, 프로파일링 서비스 (예를 들어, 의료 시설의 임상 실험실, 게놈 프로파일링 사업 등), 미가공 데이터를 생성하기 위해 전 세계 어느 곳에(예를 들어, 개체가 거주하거나 정보가 최종적으로 사용되는 국가와 다른 국가에) 위치하는 프로파일링 서비스로 보내진다. 샘플이 조직 또는 다른 생물학적 샘플을 포함하는 경우에, 개체는 의료 센터를 방문하여 샘플을 확보하여 프로파일링 센터로 보내거나, 개체는 샘플 자체(예를 들어, 소변 샘플)를 수집하여 직접 프로파일링 센터로 보낼 수 있다. 샘플이 소정의 생물학적 정보를 포함하는 경우에, 정보는 개체에 의해 프로파일링 서비스로 직접 전송될 수 있다 (예를 들어, 정보를 포함하는 정보 카드는 컴퓨터에 의해 스캐닝될 수 있고, 데이터는 전자 통신 시스템을 사용하여 프로파일링 센터의 컴퓨터로 전송될 수 있다). 프로파일링 서비스에 의해 수신되면, 샘플이 처리되고 개체에게 요구되는 진단 또는 예후 정보에 특정한 프로파일이 생성된다 (즉, 발현 데이터).
그 후, 프로파일링 데이터는 치료 임상의에 의한 해석에 적합한 형식으로 준비된다. 예를 들어, 미가공 데이터를 제공하는 대신에, 준비된 형식은 특정 치료 옵션에 대한 권고와 함께, 개체에 대한 진단 또는 위험 평가 (예를 들어, 암 치료의 성공 가능성은 성공적이거나 화합물 발현 지수임)를 나타낼 수 있다. 데이터는 임의의 적절한 방법에 의해 임상의에게 디스플레이될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 프로파일링 서비스는 임상의를 위해 (예를 들어, 치료 시점에) 인쇄되거나 컴퓨터 모니터에서 임상의에게 디스플레이될 수 있는 보고서를 생성한다.
일부 양태에서, 정보는 우선 치료 시점 또는 지역 설비에서 분석된다. 그 후, 미가공 데이터는 추가 분석을 위해 및/또는 미가공 데이터를 임상의 또는 환자에게 유용한 정보로 변환하기 위해 중앙 처리 설비로 보내진다. 중앙 처리 설비는 프라이버시 (모든 데이터는 중앙 지역 시설에 균일한 보안 프로토콜로 저장됨), 속도 및 데이터 분석의 균일성을 제공한다. 중앙 처리 설비는 대상의 치료 후 데이터의 운명을 제어할 수 있다. 예를 들어, 전자 통신 시스템을 사용하여, 중앙 설비는 임상의, 개체 또는 연구원에게 데이터를 제공할 수 있다.
일부 양태에서, 개체는 전자 통신 시스템을 사용하여 데이터에 직접 접근할 수 있다. 개체는 결과에 기초하여 추가 개입 또는 상담을 선택할 수 있다. 일부 양태에서, 데이터는 연구 용도로 사용된다. 예를 들어, 데이터는 특정 병태 또는 질병의 단계의 유용한 지표로서 마커의 포함 또는 제거를 추가로 최적화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 진단, 예방 및 치료 방법에 사용되는 조성물은 프로브, 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 조성물은 샘플에서 마커의 발현 수준의 존재를 검출한다.
단독으로 또는 본 발명의 다른 조성물과 조합하여 임의의 이러한 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 단일 표지된 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 항체 및 면역검정 성분의 쌍은 마커의 증폭 및 검출을 위한 키트로 제공될 수 있다. 키트는 적절한 대조군(controls) 및/또는 검출 시약을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브 및 항체 조성물은 어레이 또는 패널 검정(panel assay)의 형태로 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 시스템, 키트 및 작용의 치료 경로를 결정 및 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 다양한 암의 치료에의 용도를 발견했다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 유방암, 결장 직장암, 폐암, 전립선암, 흑색종, 교모세포종, 췌장암, 신장 암종, 난소암, 방광암, 자궁 내막암, 위장암, 중피종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 비호지킨 림프종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 기재되는 바와 같이, 바람직한 양태에서, 바이오마커의 발현 수준 또는 바이오마커의 조합이 기준 또는 역치 발현 수준 또는 화합물 발현 지수와 비교하여 환자 샘플에서 증가되는 경우, 세포는 환자에 면역 접합체를 투여하게 된다. 마찬가지로, 다른 바람직한 양태에서, 바이오마커의 발현 수준 또는 바이오마커의 조합이 기준 또는 역치 발현 수준 또는 화합물 발현 지수와 비교하여 환자 샘플에서 감소되는 경우, 세포는 환자에 약물 또는 독소에 접합되지 않는 항원 결합 단백질을 투여하게 된다. 일 양태에서, 면역 접합체의 투여가 요구되는 경우, 환자에서 종양 또는 암 세포에 의해 발현되는 표면 항원에 결합하는 면역 접합체가 선택된다. 면역 접합체가 지시될 수 있는 적합한 표면 항원은 HER2, HER3, EGFR, CD3ε, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, CD56, CEA (CD66e), CD74, CD79a, CD138, NaPi2b, gpNMB, TROP-2, GUCY2C, Nectin-4, SC-16, STEAP1, FRα, IL-2R, EpCAM, 및 MSLN을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 면역 접합체는 항체 약물 접합체이다. 적합한 항체 약물 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine, T-DM1, Kadcyla), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin, SGN-35), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin, CMC-544), 피나투주맙 베도틴(pinatuzumab vedotin, RG-7593), 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin, RG-7596), 리파스투주맙 베도틴(lifastuzumab vedotin, DNIB0600A, RG-7599), 그렘바투주맙 베도틴(glembatuzumab vedotin, CDX-011), 콜투시맙 라브탄신(coltuximab ravtansine, SAR3419), 로보투주맙 머탄신(lorvotuzumab mertansine, IMGN-901), 인다투시맙 라브탄신(indatuximab ravtansine, BT-062), 사시티주맙 고비티칸(sacitizumab govitican, IMMU-132), 라베투주맙 고비티칸(labetuzumab govitican, IMMU-130), 밀라투주맙 도소루비신(milatuzumab doxorubicin, IMMU-110), 인두사투맙 베도틴(indusatumab vedotin, MLN-0264), 바다스투시맙 탈리린(vadastuximab talirine, SGN-CD33A), 데닌투주맙 마포도틴(denintuzumab mafodotin, SGN-CD19A), 엔포투맙 베도틴(enfortumab vedotin, ASG-22ME), 로발피투주맙 테시린(rovalpituzumab tesirine, SC16LD6.5), 반도투주맙 베도틴(vandortuzumab vedotin, DSTP3086S, RG7450), 미르베툭시맙 소라브탄신(mirvetuximab soravtansine, IMGN853), ABT-414, IMGN289, 또는 AMG595를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 항체 독소 접합체는 MH3-B1/rGel, 데닐류킨 디피톡스(denileukin diftitox, DAB389IL2), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox, CAT-8015), 오포투주맙 모노톡스(oportuzumab monotox, VB4-845), 레시뮨(resimmune), LMB-2, DT2219ARL, HuM195/rGel, RG7787, MOC31PE 또는 D2C7-IT이다. 상기 논의되는 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체 약물 접합체의 선택은 어떤 특정 표면 항원이 개체의 암 세포에 의해 발현되는지에 따라 달라질 것이다.
일부 양태에서, 면역 접합체는 면역 독소이다. 적합한 면역 독소는 MH3-B1/rGel, 데닐류킨 디피톡스(denileukin diftitox, DAB389IL2), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox, CAT-8015), 오포투주맙 모노톡스(oportuzumab monotox, VB4-845), 레시뮨(resimmune), LMB-2, DT2219ARL, HuM195/rGel, RG7787, MOC31PE 또는 D2C7-IT를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다시, 상기 논의되는 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 면역 독소의 선택은 어떤 특정 표면 항원이 개체의 암 세포에 의해 발현되는지에 따라 달라질 것이다.
실험
하기 실시예는 본 발명의 어떤 양태들을 입증하고, 추가로 설명하기 위해 제시되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되는 것이 아니다.
[ 실시예 1]
재료 및 방법
세포 및 배양. 다음의 5종의 HER2-발현 인간 세포주를 본 연구에서 이용했다: 유방암 세포주인 SK-BR-3, AU-565 (CRL-2351), HCC1954 (CRL-2338) 및 MDA-MB-453 (HTB-131); 및 난소암 세포주인 SKOV-3 (HTB-77). HER2 음성 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 HER2 발현에 대한 음성 대조군으로 이용했다. 노르웨이, 오슬로 소재의 오슬로 대학교 병원(Oslo University Hospital), 노르웨이지안 라디움 병원(Norwegian Radium Hospital), 암연구소(Institute for Cancer Research)의 생화학부(Department of Biochemistry)가 호의로 제공한 SK-BR-3을 제외한 모든 세포주는 미국 표준균주 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국, 버지니아주, 머내서스 소재)으로부터 입수했다. 모든 세포주는 3 내지 25의 계대수(assage number)를 이용하여, 시간에 따른 세포주 특징의 변화를 방지했고, 세포를 마이코플라즈마 감염(mycoplasma infection)에 대해서 통상적으로 확인했다. SK-BR-3 및 SKOV-3 세포를 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A medium) 중에서; AU-565, HCC1954 및 MDA-MB-231 세포를 RPMI-1640 배지 중에서 (상기 두 배지는 모두 미국, 미주리주, 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich로부터 입수); 배양시킨 반면에, MDA-MB-453은 레이보비츠 L-15 배지(Leibovitz´s L-15 medium) (벨기에, 베르비에 소재, Lonza) 중에서 배양시켰다. 모든 배지는 이전에 기재된 대로 보충시켰다 19 .
세포독성 실험. 세포를 96-웰 플레이트(덴마크, 로스킬데 소재, Nunc)에 8x103 (SK-BR-3), 1.8x103 (SKOV-3), 6x103 (AU-565), 4x103 (HCC1954) 또는 1x104 세포/웰 (MDA-MB-453)로 씨딩했고(seeding), 밤새 부착되도록 했다. 이어서, 세포들을 트라스투주맙(trastuzumab)[스위스, 바젤 소재의 로슈(Roche), 허셉틴®(Herceptin®)], T-DM1 [미국, 캘리포니아주, 샌프란시스코 소재의 제넨테크(Genentech), 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine), 캐싸일라®(Kadcyla®)], MH3-B1/rGel 또는 rGel (이전에 기재된 대로 13 , 20 발현 및 정제함)과 함께, 농도를 증가시키며 72시간 동안 배양시킨 후에, 이전에 기재된 대로 21 세포 생존도를 MTT 검정에 의해 평가했다. 시그모이드 곡선 (피팅 모델: a/(1　+　exp(-(x　-　x0)　/　b))으로부터 IC50 값을 계산했다.
웨스턴 블롯 분석. 전체 세포 추출물을 수득하여, 이전에 기재된 대로 19 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (미국, 캘리포니아주, Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 단백질의 블롯 옮김(Blot transfer)을 수행했다. Cell Signaling Technology (미국, 매사추세츠주, 댄버스 소재)로부터 입수한 EGFR (#4267), HER2 (#2165), HER3 (#12708), HSP90 (#4877) 항체; 및 BD Biosciences (미국, 캘리포니아주, 산호세 소재)로부터 입수한 Rab5 (610281) 및 Rab11 (610656) 항체; 및 Sigma-Aldrich로부터 입수한 Rab4 (R5780) 항체를 이용하여 세포 단백질 발현을 검출했다. 단백질 발현은 γ-튜불린과 상관관계에 있었으며, 이는 Sigma-Aldrich로부터 입수한 항체 (#T6557)에 의해 검출되었다. Supersignal West Dura Extended duration Substrate (미국, 일리노이주, 록퍼드 소재, Thermo Scientific) 및 ChemiDoc™ 농도계(densitometer) (Bio-Rad)를 막 위의 단백질 밴드의 검출에 이용했다. ImageLab 4.1 (Bio-Rad) (소프트웨어)을 단백질 발현의 정량에 이용했다. 각 단백질의 발현을 가장 높은 발현 세포주에 상대적으로 계산했다.
상관관계 분석. 세포주에서의 HER2, HER3, EGFR, Rab4, Rab5, Rab11 및 HSP90의 상대적인 발현을, 1/IC50(T-DM1) 또는 표적 지표(targeting index) (TI) (MH3-B1/rGel)에 의해 측정된 2개의 HER2-표적 치료제에 대한 세포주 민감도에 대해서 플로팅했고, 선형 회귀를 평가했다. 몇몇 단백질들은 HER2와 함께, T-DM1 또는 MH3-B1/rGel 독성에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, HER2에 비교된 영향의 수준이 달라질 수 있다. 본 분석에서, HER2에 대해서 선형의 상관관계를 갖는 1/IC50(T-DM1) 또는 TI (MH3-B1/rGel)에 의해 수득된 R2 값이 다른 단백질(HER3, EGFR, Rab4, Rab5, Rab11 및 HSP90)의 상대적인 발현을 회귀에 포함시킴으로써 증가될 수 있는지를 계산했다. 다음의 식을 이용하여, HER2와 함께, 각 단백질에 대해서 1 내지 0의 범위에 이르는 기여 인자를 감소시키며 이들 회귀 곡선을 입증했다:
양의 기울기를 갖는 곡선에 대한, HER2 x (1-(1-Protein) x F); 및
음의 기울기를 갖는 곡선에 대한, HER2 / (1-(1-Protein) x F).
상기 두 식에서, "HER2"는 HER2의 상대적 발현이고, "Protein"은 목적하는 단백질의 상대적인 발현이며, "F"는 1 내지 0에 이르는 기여 인자이다.
R2 값을 각 단백질에 대한 기여 인자의 함수로 플로팅했다. HER2 단독으로 획득된 것에 비해서, R2의 증가를 야기하는, 속하는 기여 인자(belonging contribution factor)를 갖는 단백질을 T-DM1 및 MH3-B1/rGel 민감도에 대한 최종 회귀 곡선에 포함시켜, R2에 의해 측정된 T-DM1-민감도 및 MH3-B1/rGel-민감도에 대해서 가장 높은 상관관계를 갖는 발현 파라미터의 결합을 설정했다.
결과
T-DM1과 MH3-B1/ rGel의 효능은 트라스투주맙 민감도에 대해서 상관관계를 가지지 않는다. HER2 음성으로 보고된 MDA-MB-231에서의 낮은 발현에 비해서 강력한 HER2 발현을 본 연구에서 이용된 5종의 HER2 발현 세포주에서 실증했다 (도 1A) 22 . HER2-표적 mAb인 트라스투주맙, 및 세포 내 작용성(intracellular acting) HER2-표적 치료제인 T-DM1과 MH3-B1/rGel의 항-증식 효과(antiproliferative effect)를 5종의 HER2-양성 세포주에서 입증했다 (도 1B). 세포를 트라스투주맙, T-DM1 또는 MH3-B1/rGel로 72시간 동안 처리하는 것은 SK-BR-3 및 AU-565 세포가 3가지 치료제 모두에 매우 민감하다는 것을 드러낸 반면에, SKOV-3 세포는 대조적으로 트라스투주맙에 대해서 비-반응성인 것으로 밝혀졌고, T-DM1과 MH3-B1/rGel에 대해서 낮은 민감도를 보였는데, 이는 각각 1.2 μg/ml의 상대적으로 높은 IC50 및 2.4의 낮은 TI50에 의해 입증되었다 (도 1 및 2B). HCC1954와 MDA-MB-453 세포는 모두, 트라스투주맙 치료에 대해서 낮은 민감도 내지 중간의 민감도를 갖는 것으로 밝혀졌으나, T-DM1과 MH3-B1/rGel 모두에 높은 민감도를 보인 HCC1954 세포를 이용한 세포 내 작용성 HER2-표적 치료제에 대해서 상이하게 반응한 반면, MDA-MB-453 세포는 이들 두 약물에 대해서 낮은 민감도를 보였다 (도 1 및 2B). 그러므로, 5종의 세포주 사이에서, 트라스투주맙 민감도와 T-DM1 및 MH3-B1/rGel에 대한 민감도 사이에서 발견된 분명한 연관성은 존재하지 않았다 (도 1 및 2B). T-DM1과 MH3-B1/rGel이 세포 내에서 분명하게 별개인 작용점(action point)을 가지지만, 세포주 간 이들 두 치료제에 대한 민감도 사이에서 일관성(coherence)이 드러났는데, 두 치료제 중 하나에 대한 높은/낮은 반응은, 다른 하나에 대한 유사한 높은/낮은 반응을 예측하는 것으로 보였다.
이러한 발견에 기초하여, 세포주는 하기 3개의 카테고리로 분류되었다: (i) 트라스투주맙, T-DM1 및 MH3-B1/rGel에 대한 높은 민감도 (SK-BR-3 및 AU-565); (ii) 트라스투주맙, T-DM1 및 MH3-B1/rGel에 대한 낮은/중간의 민감도 (SKOV-3 및 MDA-MB-453); 및 (iii) 트라스투주맙에 대해서 낮은/중간의 민감도를 가지나, T-DM1 및 MH3-B1/rGel에 대한 높은 민감도 (HCC1954) (도 2A).
HER2 발현과 T-DM1 독성의 상관관계는 MH3-B1/ rGel 독성에 대해서 관찰된 것보다 강력하다. HER2 발현은 T-DM1과 MH3-B1/rGel 독성 모두에 필수적이다. 그러나, 세포 간 약물 처리(예, 흡수, 세포 내 수송 및 세포 내 약물 표적과의 상호작용)의 차이로 인해, 발현의 수준이 반드시 약물 민감도에 직접적인 상관관계를 가질 수 있는 것은 아니다. 5종의 세포주에서의 HER2 발현의 정량은 AU-565가 HER2의 가장 높은 발현 수준을 가지며, 곧이어 HCC1954 (0.9)와 SK-BR-3 (0.8) 순이라는 것을 나타냈다 (도 2C 및 D1). 50% 더 낮은 HER2 발현은 AU-565에 비해 SKOV-3 세포에서 발견되었고, MDA-MB-453은 패널에서 가장 낮은 HER2 발현(0.4)을 갖는 세포주로 나타났다 (도 2C 및 D1). 본원에서 보고된 HER2 발현의 수준은 최근의 보고서와 일치한다 22 , 23 . 더욱이, 선형 관계가 세포주 간 HER2 발현과 T-DM1 및 MH3-B1/rGel 민감도 사이에서 밝혀졌는데, 이는 T-DM1에 대한 0.926의 R2 값과 MH3-B1/rGel에 대한 0.800의 R2 값을 야기했다 (도 2E1 및 E2).
HER3은 T-DM1 민감도에 대한 HER2의 추가의 바이오마커로 작용할 수 있다. HER2는 EGFR 패밀리의 다른 구성원과 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이로 인해, HER3과 EGFR을 정량하여, T-DM1과 MH3-B1/rGel 독성 사이의 관계 및 EGFR 패밀리의 이들 두 구성원의 발현을 연구했다. 세포주의 선택된 패널은 HER3 및 EGFR 발현 모두의 이들의 수준에서 실질적으로 변하는 것으로 밝혀졌다 (도 2C, 2D2 및 2D3). 그러나, HER3 또는 EGFR의 수준과 T-DM1 (도 3A1 및 B1) 또는 MH3-B1/rGel (도 3C1 및 D1)에 대한 민감도 사이에서 발견되는 명확한 상관관계는 존재하지 않았다. HER2와 함께, EGFR과 HER3이 T-DM1-민감도 및 MH3-B1/rGel-민감도에 대해서 상관관계를 가질 수 있는지를 추가로 평가했다. 기여 인자를 증가시키며, HER3과 함께 1/IC50 (T-DM1) 및 HER2의 선형 회귀에 대한 R2 값을 규명하는 것은 HER2를 단독으로 사용하는 경우 (R2 = 0.926, 도 2E1)에 비해서, HER3 발현이 0.2의 기여 인자를 이용한 상관관계 분석에 포함되는 경우에 (도 3A2 및 3A3), 0.953의 더 큰 R2를 보였다. 영향 인자를 증가시키며, EGFR을 T-DM1 민감도와 HER2 발현 사이의 회귀 분석으로 포함시킴으로써 검출된 선형 상관관계의 증가는 존재하지 않았다 (도 3B2). 또한, T-DM1과 HER2 x HER3 사이의 회귀에서 EGFR 발현의 영향(기여 인자 0.2)을 평가했다. 또한, 본원에서 EGFR의 기여 인자가 증가함에 따라 R2 값은 HER2 및 HER3 (기여 인자 0.2) 단독으로 관찰된 것보다 모두 작은 것으로 밝혀졌다 (도 3B3).
HER3 및 EGFR은 MH3-B1/ rGel 민감도에 대한 HER2의 추가의 바이오마커로 작용할 수 있다. MH3-B1/rGel 민감도와 HER2 발현 사이의 회귀 분석에 EGFR과 HER3의 기여를 포함시키는 것은 HER2 발현 단독에 의해 획득되는 R2 값에 비해서(도 2E2, 3C2, 3C3, 3D2 및 3D3), 증가된 R2 값을 야기했다 (HER2 x 기여 인자 0.4를 갖는 HER3에 대한 R2=0.970; 및 HER2 x 기여 인자 0.3을 갖는 EGFR에 대한 R2 = 0.826). 기여 인자를 증가시키며, HER3 발현의 영향을 HER2와 EGFR (기여 인자 0.3) 및 MH3-B1/rGel-민감도 사이의 회귀에 추가하는 것은 증가된 상관관계를 나타냈으며, 이는 증가된 R2 값에 의해 측정되었는데, HER3 기여 인자 0.4로 최대값이 관찰되었다 (R2 = 0.997, 도 3E1 및 3E2).
HER2 -발현 세포주는 세포 내 이입 수송( endocytic trafficking)에 관여하는 단백질의 이들의 발현 수준에서 상이하다. T-DM1과 MH3B1/rGel이 내재화(internalization) 및 세포 내 수송에 의존하여, 이들의 작용의 세포 내 메커니즘을 발휘함에 따라, 세포 내 이입 기구(endocytic machinery)에 관여하는 단백질을 패널 세포주에서 정량했다. 이들 단백질은 원형질막으로부터 초기 엔도좀으로 카고(cargo)를 전달하는 것과 엔도좀 융합에 관여하는 Rab5 (도 4A 및 B); 초기 엔도좀으로부터 재활용하는 것(recycling)에 관여하는 Rab4 (도 4A 및 C); HER2 재활용을 조절하는 것으로 보고된 HSP90 (도 4A 및 D); 및 핵 주위 재활용 엔도좀(perinuclear recycling endosome) 및 원형질막-골지 수송(plasma membrane-Golgi traffic)을 통한 재활용에 관여하는 Rab11 (도 4A 및 E);을 포함했다 24 , 25 . 세포주 간 이들 단백질의 발현 수준은 큰 차이를 보였고, 발현 수준들 사이에서 발견된 단순한 연관성은 존재하지 않았다.
Rab5와 Rab4는 추가의 바이오마커로서 HER2에 작용하여, T-DM1 민감도를 예측할 수 있다. 세포 내 이입 기구에 관여하는 조사된 단백질 (도 4)이 세포주 사이에서 T-DM1 민감도에 대한 영향을 가지는지 추가로 평가했다. 패널 내 다른 세포주에 비해서, 2.5-3배 더 높은 Rab5의 발현 수준이 매우 T-DM1 민감성인 SK-BR-3과 AU-565 세포에서 발견되었다 (도 4A 및 B). 상대적으로 약한 상관관계가 T-DM1 독성과 Rab5 발현 사이에서 발견되었다 (R2 = 0.643) (도 5A1). Rab5 발현의 기여 인자를 증가시키며, T-DM1 독성과 HER2 발현에 대해서 선형 회귀곡선을 입증하는 것은 HER2와 함께, Rab5가 T-DM1 독성에 영향을 끼친다는 것을 나타냈다 (도 5A2). 0.3의 기여 인자와 함께, Rab5가 추가되는 경우에, HER2 및 Rab5에 대한 최대 R2 값이 발견되었는데 (도 5A2), Rab5로부터 30%의 기여를 포함함으로써, 0.926에서 0.986으로 증가한다 (도 5A3). Rab4 발현과 T-DM1 민감도 사이에서 발견된 선형 상관관계는 존재하지 않았다 (R2 = 0.088, 도 5B1). Rab4로부터 0.4의 기여 인자와 함께, T-DM1 민감도가 HER2에 대해서 상관관계를 가지는 경우에, R2 값의 약간의 증가가 발견되었다 (도 5B2 및 5B3). 또한, Rab4가 HER2와 함께 T-DM1 민감도에 대해서 역의 상관관계를 갖는지 조사했다. 그러나, 1/Rab4 발현을 회귀식(regression formula)에 포함시키는 경우에, HER2 단독으로 획득된 R2 값에 비해서 증가된 R2 값은 발견되지 않았다 (데이터 미도시). 또한, HSP90 발현 및 T-DM1 민감도의 선형 회귀는 0.266의 R2 값을 갖는 좋지 않은 상관관계를 나타냈고 (도 5C1), HSP90의 영향을 HER2를 이용한 회귀식에 포함시킴으로써 관찰될 수 있었던 HER2 단독으로 획득된 R2 값에 비해, R2 값의 증가는 없었다 (도 5C2). Rab11 발현과 T-DM1 민감도 사이에서 역-선형 상관관계 (R2 = 0.459)를 발견했다 (도 5D1). 1/Rab11 발현의 증가하는 기여 인자를 이용한, T-DM1 민감도와 HER2 사이의 선형 회귀는 HER2 단독으로 획득한 R2 값에 비해, R2 값의 증가를 거의 나타내지 않았다 (0.929 대 0.926, 도 5D2 및 5D3).
도 5에 도시한 대로, Rab5와 Rab4의 발현 수준을 HER2와 함께 T-DM1 민감도에 대한 가능한 바이오마커로서 하나 하나 나타냈다. 이어서, HER2와 함께, Rab5와 Rab4의 결합이 T-DM1 민감도에 대한 상관관계를 추가로 증가시키는지 평가했다. 그러나, Rab4의 영향을 회귀식에 포함시키는 경우에, HER2 x 0.3 Rab5로 관찰된 R2 값에 비해서 R2 값의 증가는 발견되지 않았다 (데이터 미도시). 전체적으로, T-DM1 민감도에 대한 최선의 선형 상관관계는 0.3의 영향 인자에서 Rab5 단독과 결합된 HER2를 이용하여 밝혀졌다 (R2 = 0.986, 도 5A3).
Rab5 , Rab4 , HSP90 및 Rab11은 모두 MH3-B1/ rGel 민감도에 대한 HER2의 추가의 바이오마커로 작용할 수 있다. Rab5, Rab4, HSP90 및 Rab11의 세포 발현수준 (도 4)을 TI에 의해 측정된 MH3-B1/rGel 민감도에 대해서 또한 플로팅했다 (도 6). Rab5와 TI의 선형 상관관계를 세포주 사이에서 검출했다 (R2 = 0.486, 도 6A1). 기여 인자를 증가시키며, Rab5를 HER2와 MH3-B1/rGel 독성에 대한 입증된 선형 회귀곡선에 포함시킨 것은 HER2와 함께 MH3-B1/rGel 독성에 영향을 미치는 Rab5를 나타냈고 (도 6A2), 이는 HER2를 단독으로 이용한 회귀(R2 = 0.800, 도 2E2)에 비해서 증가된 R2에 의해 시각화되었다. Rab5로부터 30%의 기여를 포함시킴으로써, 0.856의 가장 높은 R2 값을 발견했는데 (도 6A2 및 6A3), 이는 또한 T-DM1 상관관계에 대해서 관찰되었다 (도 5A3). Rab4 발현과 MH3B1/rGel 민감도 사이에서 발견된 상관관계는 존재하지 않았다 (R2 = 0.024, 도 6B1). 그러나, 영향 인자를 증가시키며 Rab4 발현을 HER2에 대한 추가의 바이오마커로 활용하는 것은 HER2 단독에 대한 선형 상관관계에 비해서, TI에 대한 선형 상관관계를 강화시켰다. HER2와 TI 회귀 분석에, 0.6의 영향 인자와 함께 Rab4를 추가함으로써, 0.930의 가장 큰 R2 값을 획득했다 (도 6B1 및 6B2). 또한, HSP90 및 1/Rab11은 MH3B1/rGel 민감도에 대해서 매우 강하지는 않지만, 상관관계를 갖는 것으로 나타났다 (HSP90에 대해서 R2 = 0.552 및 1/Rab11에 대해서 0.406, 도 6C1 및 D1). HSP90과 1/Rab11은 HER2 발현과 MH3B1/rGel 민감도의 상관관계를 하나 하나 증가시키는 것으로 추가로 나타났고, 최대 R2 값은 두 단백질에 대한 1의 기여 인자로 획득되었다 (도 6C2, C3, D2 및 D3).
도 6에 도시된 대로, Rab5, Rab4, HSP90 및 1/Rab11은 MH3B1/rGel 민감도에 대한 HER2와 함께, 하나하나 가능한 바이오마커로 모두 나타났다. HER2와 함께, 이들 4개의 바이오 마커의 결합이 MH3B1/rGel 민감도에 대한 상관관계를 추가로 증가시킬 것인지 추가로 연구했다. 회귀식으로 상이한 단백질을 결합시키는 순서는 Rab5 (세포 내 이입)로 시작한 후에, Rab4 (초기 재활용), HSP90 (초기 재활용) 및 1/Rab11 (후기 재활용)을 추가함으로써, 세포 내 이입 및 수송의 경로에 기초했다. 도 6A3에 도시된 대로, HER2와 함께 Rab5 (영향 인자 0.3)는 MH3B1/rGel 민감도와 상관관계를 잘 보였다 (R2 = 0.856). 그러나, 영향의 인자를 증가시키며 Rab4를 회귀분석에 추가하는 것은 R2 값을 증가시켰다. Rab4가 0.6의 기여 인자와 함께 HER2 및 0.3 x Rab5의 기여 인자에 추가되는 경우에, 0.938의 최대 R2 값이 도달되었다 (도 7A1 및 A2). HSP90 발현을 HER2, Rab5 및 Rab 4를 이용한 회귀 분석에 추가로 포함시켰다. HSP90으로부터의 80%의 기여를 MH3B1/rGel 민감도와 HER2, Rab5 (기여 인자 0.3) 및 Rab4 (기여 인자 0.6) 사이의 회귀 분석에 포함시킴으로써, 0.974의 최대 R2 값을 획득했다 (도 7B). 도 6D에 도시된 대로, 1/Rab11은 HER2와 함께 MH3B1/rGel 민감도와의 상관관계를 잘 보였다 (R2 = 0.894). 또한, 1/Rab11 발현의 영향을 MH3B1/rGel 민감도와 HER2, Rab5, Rab4 및 HSP90 발현 사이의 회귀 분석에 추가하는 것은 도 7C1에 나타낸 대로 R2 값을 증가시켰다. 다른 단백질 및 MH3B1/rGel 민감도와 함께, 1/Rab11 발현의 최선의 상관관계는 0.4의 영향 인자로 발견되었는데 (도 7C2), 이는 MH3B1/rGel 민감도가 HER2, Rab5 (기여 인자 0.3), Rab4 (기여 인자 0.6) 및 HSP90 (기여 인자 0.8)에 상관관계를 갖는 경우에, 0.993의 최대 R2 값을 야기한다 (도 7C2). 또한, MH3B1/rGel 민감도에 상관관계를 가지는 경우에 획득된 R2 값에 대한 임의의 주요한 영향 없이, 비-생물학적 순서로 상이한 단백질의 기여를 추가함으로써 회귀 분석을 수행했다 (데이터 미도시). 전반적으로, 생물학적 논리 순서(biological logic order)로 상이한 단백질의 기여를 추가한 경우에 입증된 MH3-B1/rGel 독성과 단백질 발현 수준 사이의 최선의 상관관계(R2 = 0.993) (도 7C2)는, TI을 다음에 대해서 플롯팅한 경우에 발견되었다:
상대적 HER2 발현 x
(1-(1-상대적 Rab5 발현) x 0.3) x
(1-(1-상대적 Rab4 발현) x 0.6) x
(1-(1-상대적 HSP90 발현) x 0.8) /
(1-(1-(1/상대적 Rab11 발현)) x 0.4).
바이오마커-유래 개인화 암 치료 요법(biomarker-driven personalized cancer therapy)의 분야는 임상적으로 승인된 표적 항암 치료제 수의 증가와 함께 빠른 속도로 성장해오고 있다. 전반적으로, 약물-기반 개인화 암요법의 효능은 예후(prognosis), 반응 및/또는 내성(resistance)의 예측을 위한 선택된 바이오마커의 신뢰도에 의존한다. HER2 양성으로 분류된 유방암 환자 (전체 유방암의 ~20%)가 통상적으로 트라스투주맙을 이들의 치료의 일환으로 수여 받음에 따라 26 , HER2-표적 mAb 트라스투주맙의 개발은 바이오마커-유래 개인화 암 치료 요법의 분야에서의 성공 스토리를 대표한다. 다른 예시는 이마티닙(imatinib)의 이용에 대한 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML)에서 BCR-ABL 융합, 또는 대장암(colorectal cancer)의 치료에서 세툭시맙(cetuximab)의 이용에 대한 EGFR 및 RAS 야생형 발현의 평가이다 27 .
현재 암의 치료에 승인된 표적 약물의 대부분은 약물 표적이 또한 작용의 메커니즘에 대한 표적을 제시하는 mAb 또는 소분자 억제제이다. 추가의 바이오마커가 내성 또는 낮은 내약성을 경험할 가능성이 높은 환자를 선택-해제(deselecting)하는데 필요할 수 있더라도, 표적 자체는 이들 약물을 이용한 치료에 대한 분명한 바이오마커를 제시한다. 그러나, 현재 암요법에서의 약물의 개발은 표적 모이어티; 및 세포 증식억제 약물 (cytostatic drug, ADC) 또는 독소 (표적 독소)와 같은 세포 독성 성분; 모두로 이루어진 더욱 복잡한 표적 치료제로 옮겨가고 있다. 이들 다기능성 치료제의 경우, 세포 내 수송 및/또는 작용의 세포독성 메커니즘에 관련된 다른 바이오마커가 치료 결과에 영향을 끼칠 가능성이 높다 15 . 이는 여기서, HER2 양성 세포주의 선택된 패널에서 트라스투주맙과 T-DM1/MH3-B1/rGel 민감도 사이의 일관성의 결여에 의해 나타난다.
여기서, 세포 HER2 발현과 T-DM1으로 향하는 반응 사이에서, 강력한 선형 상관관계가 보고되었다 (도 2E1). 이는, 중앙값 미만의 하위 그룹에 비해서, 중앙값을 초과하는 HER2 mRNA 수준을 갖는 환자에서 T-DM1의 더 높은 반응 속도를 입증한 몇몇 임상 연구들과 일치한다 16 , 17 , 28 . 약물 활성과 HER2 발현 사이의 상관관계는 여기서 MH3-B1/rGel에 비해 T-DM1에 대해서 더 강력한 것 - R2 값에 의해 측정됨 - 으로 나타났고 (도 2E2), 이는 이들 약물의 세포독성 성분의 차이에 의해 야기될 수 있다. T-DM1, (DM1)의 세포독성 성분은, 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle) 중 트라스투주맙 성분으로부터의 방출이 세포 내 이입 막(endocytic membrane)을 가로질러 세포질 - 성분이 미세소관에 이의 효과를 발휘하는 곳 - 로 확산될 수 있는 상대적으로 작고, 친유성인 약물(small and lipophilic drug)이다. 이는 세포질에 유입하기 위한 효과적인 수송 메커니즘은 없지만, 여전히 알려지지 않은 메커니즘에 의해 세포질에 유입하는 것을 다소 다루기 위한, 28 kDa의 친수성 I형 리보좀-불활성 단백질 독소 (겔로닌) [hydrophilic type I ribosome-inactivating protein toxin (gelonin)]인 MH3-B1/rGel의 세포독성 모이어티와 매우 대조적이다. MH3-B1/rGel과 HER2 발현의 R2 값에 비해, T-DM1과 HER2 발현의 상관관계 분석에 의해 획득된 더 높은 R2 값은 더 많은 장애물이 겔로닌 경로(gelonin pathway)에 제시된, 이들 두 약물 사이의 세포 내 이입 이탈(endocytic escape)에 대한 메커니즘의 차이를 아마도 반영한다. 또한, DM1에 비해서 겔로닌의 세포 내 방출의 더욱 복잡한 경로는 T-DM1에 대한 Rab5 및 Rab4에 비해서, MH3-B1/rGel 민감도에 대한 영향을 갖는 연구된 단백질(Rab5, Rab4, HSP90 및 Rab11)의 중요도(magnitude)에 반영된다.
여기서, T-DM1과 MH3-B1/rGel 모두에 대한 세포 민감도는 HER2에 더하여, HER3과 상관관계를 가지는 것으로 나타났다. 임상 3상 시험에서 T-DM1의 치료학적 효과는 HER3 발현 하위그룹에서 유사한 것으로 이전에 보고되었다 17 . 이는 HER3 발현 단독과 T-DM1 민감도 사이에서 상관관계가 발견되지 않은 여기서 제시된 데이터와 일치한다 (도 3A1). 그러나, 본 보고서는 수학적 접근법(mathematical approach)에 초점을 맞춰, 바이오마커와 상이한 기여 인자를 결합한다. 이들 계산은 HER2와 결합된 HER3가 HER2 단독에 비해, T-DM1 반응에 대한 더 좋은 바이오마커로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. HER3은 HER2에 대한 바람직한 이량체화 파트너(dimerization partner)로 인식되고, 이종 이량체(heterodimer)는 매우 활성인 티로신 키나아제 신호전달을 유도하는 것으로 보고된다 29 . 그러므로, T-DM1과 MH3-B1/rGel 민감도, 및 HER2와 함께 HER3 발현 사이의 상관관계는 HER2에 트라스투주맙 및 MH3-B1을 결합시키는 경우의 이들 이종 이량체의 간접적인 억제를 반영할 수 있다. T-DM1에서 전체 길이의 항체인 트라스투주맙에 비해서, MH3-B1/rGel은 단쇄 fv 단편으로 이루어진다. 따라서, 이종 이량체의 일부로서 HER2에 MH3-B1이 결합하는 것은 제외될 수 없다 (HER2/HER3과 HER2/EGFR 모두). 이는 T-DM1 (R2이 0.926에서 0.953으로 증가됨, 도 8A1)에 비해서, MH3-B1/rGel 민감도 (R2이 0.800에서 0.970으로 증가됨)와 HER2에 더하여 HER3 발현 사이의 명백히 더 강력한 상관관계(도 8B1); 및 MH-3B1/rGel 민감도가 HER2 및 HER3에 더하여 EGFR에 상관관계를 가지는 반면에, 이러한 상관관계가 T-DM1에 대해서는 발견되지 않는 경우(도 8A1 및 B1)의 R2 값의 소량의 증가;에 의해 추가로 제시된다.
Rab5는 초기 엔도좀에 국소화되고, 클래트린-코팅된 소포(clathrin-coated vesicle)의 세포 내 이입과 엔도좀 융합을 조절한다 18 . 여기서, T-DM1과 MH3-B1/rGel 민감도 모두가 HER2에 더하여 0.3의 기여 인자를 갖는 Rab5에 의존하는 것으로 나타났다 (도 5A3 및 6A3). HER2와 함께 ER2-표적 치료제 모두에 대한 Rab5의 유사한 영향 (도 8A2 및 B2)이 두 약물이 세포 내 이입에 대해서 동일한 HER2-매개 경로를 따를 가능성이 높은 세포 내 이입 및 후속적인 세포 내 이입 수송에서 Rab5의 초기 기능에 아마 관련있을 것이다. 또한, Rab4는 초기 엔도좀으로부터 재활용을 제어함으로써 세포 내 이입 경로에서 초기에 작용하고 30 , 여기서 HER2와 함께 T-DM1 및 MH3-B1/rGel 민감도와 상관관계에 있는 것으로 나타났다 (도 5B3 및 6B3). HER2의 신속한 재활용은 세포 약물 흡수를 증가시킬 것이나, 또한 약물을 세포 내에서 초기 엔도좀에 수동적으로 국소화시킬 것이다.
HER2와 함께 Rab4를 포함시키는 경우에, R2가 0.830에서 0.930으로 증가하는 것은 (도 8B2) MH3-B1/rGel에 대한 세포질 방출에 대한 메커니즘으로서, 초기 엔도좀으로부터의 세포질 이동 (cytosolic translocation)을 나타낸다. HER2에 더하여 Rab4의 T-DM1 민감도에 대한 소량의 기여 (R2가 0.926에서 0.944로 증가됨, 도 8A2)는 엠탄신(emtansine)이 또한 초기 엔도좀으로부터 다소 방출된다는 것을 나타내는데, 이는 이전의 보고서에서 제시된 바와 같이 7 , 10 , 엠탄신의 세포질 이동이 T-DM1의 트라스투주맙 모이어티의 리소좀 격리(lysosomal sequestration)에 단독으로 의존하지 않는다는 것으로 나타낸다. Rab5 발현이 유방암 환자에서 좋지 않은 결과를 예측한다는 것과 Rab5/Rab4 재활용이 세포 외 기질 침투 및 전이를 촉진한다는 것이 이전에 제시되었다 31 . 그러므로, 본 결과는 Rab5/Rab4 및 HER2 양성 유방암 환자를 T-DM1 및 MH3-B1/rGel 기반 요법에 대한 유망한 후보 물질로 나타낼 수 있다.
HSP90은 HER2 샤페론(chaperone)이고, 빠른 재활용을 포함하는 몇몇 메커니즘들에 의해 HER2 분해를 억제하는 것으로 주장되어 왔다 32 , 33 . 여기서, HSP90은 HER2와 함께 MH3-B1/rGel 독성과 상관관계를 가지는 것으로 나타났고 (도 8B2), 대조적으로 T-DM1에서는 이러한 상관관계가 발견되지 않았다 (도 8A2). Rab4 의존성의 차이에 대해서 언급된 대로, 이들 약물의 세포 독성에 대한 HSP90 영향의 차이는 세포질 이동에 대한 메커니즘의 차이를 반영할 수 있다. 또한, 상기 차이는 이들 약물들 사이의 상이한 HER2-표적 모이어티의 결과일 수 있다. 반면, Rab11은 세포 내 이입 재활용 구획(endocytic recycle compartment, ERC)에 국소화되고, 카고를 원형질막으로 다시 재활용함으로써, 후에 세포 내 이입 과정에 작용한다 34 . 여기서, 음의 상관관계는 MH3-B1/rGel 효능과 Rab11 발현 사이에서 발견되었는데 (도 6B), 이는 재활용과 후속적인 세포 외 유출(exocytosis)이 MH3-B1/rGel-효능을 억제하는 것을 나타낸다. T-DM1 독성에 대한 HER2와 함께 Rab11의 영향의 결핍(도 5D)은 아마 T-DM1 및 MH3-B1/rGel이 이들의 세포독성 모이어티의 화학적 특성에 따라, 별개의 세포 내 경로(intracellular pathway)를 따른다는 것을 나타낸다. DM1은 예를 들어, Rab11-양성 재활용 엔도좀의 축적 전에, 세포 내 이입 소포를 타당하게 이탈(escape)시킬 수 있다.
전체적으로, 6개의 단백질을 HER2와 함께 MH3-B1/rGel 및 T-DM1 반응에 대한 잠재적인 바이오마커로서 여기서 테스트했다. 테스트된 바이오마커는 여기서 HER2 표적 약물의 표적 모이어티(EGFR 및 HER3) 또는 약물의 세포 내 수송 성분(Rab5, Rab4, HSP90 및 Rab11) 중 하나를 반영하는 두 개의 그룹으로 구분된다 (도 8). 약물 민감도에 대한 최선의 상관관계는 이들 그룹에 속하는 바이오마커를 풀링함으로써 획득되었고, 바이오마커의 이들 두 그룹을 결합함으로써 나타난 약물 민감도에 대한 증가된 상관관계는 존재하지 않았다 (데이터 미도시). 이들 결과는 두 그룹에서의 단백질이 완전히 독립적인 것이 아니라는 것을 나타냈는데, 이는 약물의 세포 내 이입 수송이 세포 결합 및 세포 내 이입에 명백히 의존적임에 따라, 놀라운 것은 아니다. 따라서, 바이오마커로서 HER2는 HER3와 EGFR; 또는 Rab4, Rab5, HSP90 및 1/Rab11;과 결합되어, T-DM1 및 MH3-B1/rGel에 대한 세포 민감도를 예측할 수 있어야 한다 (도 8). 도 3, 5, 6 및 7은 HER2의 영향에 대한 기여 인자를 증가시키며, 6개의 단백질을 바이오마커로서 추가하는 것의 영향을 도시한다. 그러나, 상이한 단백질의 중요성은 동일한 도면에 포함된 두 그룹의 바이오마커에 대한 R2 상관관계 데이터인 도 8A 및 8B에 도시된 대로 비교될 수 있다. 약물 민감도에 대한 증가된 상관관계는 세포 외 단백질인 HER3 또는 세포 내 단백질인 Rab5와 Rab4의 발현을 바이오마커로서 HER2의 발현에 추가 함으로써, 두 HER2-표적 약물 모두에 대해서 발견되었으나, R2 값에 대한 상이한 영향이 존재했으며, 이는 도 8A, B 및 C에서 가시화되었다. 또한, MH3-B1/rGel 민감도를 HER2와 HER3에 더하여, EGFR 발현; 및 HER2, Rab5 및 Rab4에 더하여, HSP90 및 1/Rab11 발현에 어느 정도 의존적임을 나타냈다. T-DM1에 비해서 MH3-B1/rGel 민감도에 대해서 상관관계를 갖는 바이오마커의 더욱 복잡한 풀(pool)이 T-DM1에 비해서 MH3-B1/rGel에 대한 세포질 이동의 더 많은 장애물이 있는 경로에 의해 야기될 수 있고, 또한 이들 약물들 사이의 HER2-표적 모이어티의 차이를 반영할 수 있다.
결론적으로, 본 보고서는 최초로, 세포 내 이입 수송에 관여하는 단백질이 HER2에 더하여 이용되어, 세포 내 작용점(intracellular action point)을 갖는 HER2-표적 치료제에 대한 반응을 예측하는 데 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 상이한 단백질의 영향은 HER2-표적 모이어티와 약물의 세포 내 작용 요소 모두, 및 후속적인 세포 내 이입 수송 및 세포질 방출의 메커니즘에 관련된 것으로 보인다. ADC 및 작용의 세포 내 메커니즘을 갖는 다른 표적 약물의 향후 개발은 바이오마커의 약물-의존적 풀(drug-dependent pool)을 포함해야 하고, 오늘날 가장 많이 이용되는 표적 및 내성의 마커에 더하여, 흡수 및 세포 수송에 대한 마커를 포함해야 한다. 본원에서 이용된 수학적 접근법을 이용하여, 예후 및 치료학적으로 이용될 상이한 기여 인자를 갖는 바이오마커의 풀을 입증할 수 있다.
본원에 기재된 일반적인 발명 개념은 모든 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC) 및 항체 독소 접합체 (면역 독소)에 적용 가능하다. 본 방법에 따라 투여될 수 있는 몇몇 바람직한 약물이 표 1 (ADC) 및 표 2 (면역 독소)에 제시된다.
[표 1: 선도 임상단계(Leading clinical stage) ADC ]
[표 2: 선도 임상단계 면역 독소(Leading clinical stage immunotoxin )]
[ 실시예 2]
환자 집단. 치료-전 발현 및 병리학적 완전 관해(pathologic complete response, pCR) 데이터가 T-DM1+퍼투주맙(Pertuzumab) (TDM1+P) 군의 52명의 환자에 대해서 이용 가능했고, 트라스투주맙 대조 (TH) 군으로부터의 31명의 환자를 분석에 이용 가능했다. 진행되었고(progressed), 동의를 철회했으며, 치료 기관(treating institution)을 떠나거나, 또는 수술 전에 비-프로토콜 치료(non-protocol therapy)를 받았던 환자는 본 분석에 대해서 비-pCR인 것으로 고려된다. 아래의 표는 각 군 내 HR 하위 유형에 의한 pCR율 (pCR rate)을 나타낸다.
[표]
발현 데이터. 모든 I-SPY 2 샘플을 2개의 애질런트 커스텀 어레이(Agilent custom array) (15746 및 32627 디자인) 중 하나에서 분석했다. TDM1+P 군의 모든 샘플을 32627 어레이에서 검정한 반면, TH 군은 플랫폼 사이에서 나눴는데, 22개의 샘플은 더 오래된 15746 플랫폼에서, 9개의 샘플은 32627 어레이에서 검정했다. 두 디자인에 걸친 데이터를 결합하기 위해, 15746 플랫폼의 탐침 주석(probe annotation)을 업데이트했고 (2016년 9월); 다중 탐침(multiple probe)이 나타내는 유전자가 탐침들에 걸친 평균으로서 산출되도록, 각 플랫폼에 대해서, 평균화(averaging)시킴으로써 정규화된 발현 데이터를 축소시켰다(collapsing). 이어서, ComBat 알고리즘을 플랫폼-편향(platform-bias)에 적응하는 데 적용했고, 두 플랫폼들로부터의 데이터를 결합했다. 이 절차를 실험군과 관계 없는 제1 880 I-SPY 2 환자의 치료-전 데이터에 대해서 수행했다. 32627 및 업데이트된 15746 어레이 디자인에 대한 주석 파일과 함께, TH와 TDM1+P 군으로부터 비롯된 결합된, 플랫폼-조정된 데이터를 이 전달에 포함시킨다.
정성적 바이오마커 분석 (Qualifying biomarker analysis). RAB5A, RAB4A, RAB11A, 및 HSP90AA1의 정규화된, 플랫폼-보정된 치료-전 발현 수준을 정성적 바이오마커 평가 (qualifying biomarker evaluation, QBE) 계획에 따라서, TDM1+P에 대한 반응의 특정한 바이오마커로서 처음으로 개별적으로 테스트했다.
단계 1: TDM1 + P에 대한 반응의 특정한 예측 변수(predictor)로서 바이오마커의 평가
모델 1A: pCR ~ TDM1+P 군의 바이오마커
모델 1B: pCR ~ TH 군의 바이오마커
모델 1C: pCR ~ 치료 + 바이오마커 + 치료 x 바이오마커
모델 1D: pCR ~ 치료 + 바이오마커 + 치료 x 바이오마커 + HR 상태
평가된 바이오마커 중, RAB5A만 TDM1+P 군에서 반응과 관련 있으나 [우도비 (likelihood ratio, LR) 테스트 p = 0.012], 대조군에서는 그렇지 않았다 (LR 테스트 p = 0.242).
[표]
RAB5A 발현과 치료 사이의 상호 작용에 대한 p 값은 0.024이고, 이는 HR 상태에 대한 적용 후에 0.05 미만으로 유지된다. 상기 표는 평가된 4개의 바이오마커에 대한 결과를 요약한다.
RAB5A는 연속적인 정성적 바이오마커(continuous qualifying biomarker)로서 성공적이었고, QBE 단계 2에서 평가될 것이다.
단계 2: 이분 임계값(dichotomizing threshold)의 확인
몬테-카를로 2-폴드 교차 검증(Monte-Carlo 2-fold cross-validation) 절차를 이용하여, 바이오마커 x 치료 상호 작용의 p 값을 최소화하는 임계값을 확인했다. 구체적으로는, 100개의 상호작용에 대해서, 치료군과 pCR 상태에 대해서 균형을이루며 (balancing), 사례의 절반을 트레이닝 세트(training set)로 무작위로 선택하였다. 10번째 및 90번째 백분위수(percentile) 사이의 모든 값을 트레이닝 세트를 "고" RAB5A 발현군 vs. "저" RAB5A 발현군으로 이분하기 위한 잠재적인 임계값으로 고려했고; 일련의 로지스틱 회귀 모델을 피팅하여(fitting) 바이오마커 x 치료 상호작용(모델 1C)을 평가했다. 트레이닝 세트에서 상호작용 항 (interaction term)에 대한 LR 테스트 p 값을 최소화하는 임계값을 선택했고, 이 값을 테스트 세트를 이분하는데 이용하였으며, 테스트 세트에서 바이오마커 x 치료 상호 작용의 유의성을 평가했다. 이어서, 로짓법(logit method)을 이용하여 100개의 테스트 세트에 걸친 LR p 값을 결합했고; 최소한의 결합된 LR 테스트 p 값을 수득한 임계값을 선택했다.
이 절차를 이용하여, 9.76의 역치를 선택했다. 도 9를 참고한다. 이분 변수(dichotomous variable)로서, 높은 RAB5A 수준을 가지는 것은 또한 TDM1+P에서의 반응과 관련 있었으나 (OR = 5.99 (95% CI: 1.23 - 40.27), 피셔의 정확 검정(Fisher's Exact test) p = 0.01), 대조군에서는 그렇지 않았고(OR: 0 (95% CI: 0 - 1.74), 피셔의 정확 검정 p = 0.06); LR p = 0.001을 갖는 바이오마커 x 치료 상호작용 항을 가진다.
9.76이 이 절차에 의해 밝혀진 최적의 임계값이었으나, TH 군의 2명의 환자만 9.76 미만의 RAB5A 수준을 가질 수 있다. 이는 TH 군과 TDM1+P 군에서의 RAB5A발현의 차이에 의해 부분적으로 기인할 수 있는데, TDM1+P 군보다 TH 군에서 RAB5A 수준이 유의하게 더 높다. 어레이 디자인은 이 차이에 기여할 수 있다. TDM1+P 군 단독 (분석 계획에서 미리-특정된 바이오마커 x 치료 상호 작용을 평가하는 모델을 이용하기보다) 내에서 바이오마커 성능(biomarker performance)의 평가를 고려하는 것을 바랄 수 있다. 상기 기재된 것과 유사한 몬테 카를로 절차를 이용하여 (그러나, TDM1+P 단독에서 모델 1A를 피팅함), 선택될 최적의 임계값은 9.76을 유지한다.
단계 3: HER2 +등급화 시그니처 (graduating signature)의 맥락에서 RAB5A 군 내 베이즈 추정된 pCR율 ( pCR rate)
모델 2: pCR ~ HR + RAB5A + 치료 + HR x 치료 + RAB5A x 치료
환자를 RAB5A-고 (>=9.76) 군 및 RAB5A-저 (<9.76) 군으로 이분하는데, 확인된 최적의 임계값 (9.76)을 적용하는 경우에, 베이즈 추론된 pCR 확률은 RAB5A-고 환자에서의 대조군에서 24%인 것에 비해, TDM1+P 군에서 68%이다. 대조적으로, 추정된 pCR 확률은 TDM1+P 군 내 RAB5A-저 하위 집합에서 28%이고, TH 군에서는 42%이다. 비교를 위해 동일한 모델을 이용하면, 전체 HER2+ 군의 추정된 pCR 확률은 TDM1+P 군에서 61%이고, TH 군에서 27%이다. 베이즈 pCR 확률 곡선은 도 10에서 제시된다.
[ 실시예 3]
본 실시예는 1-SPY2 연구에서 HSP90, Rab11a, Rab4A 및 Rab5a 발현 프로필 및 TH- 및 T-DM1+P 군에 대한 치료 결과 사이의 상관관계의 가치평가(valuation)를 나타낸다. 1-SPY-2 데이터로부터 비롯된 RNA 발현 프로필을 T-트라스투주맙 + 화학요법 (TH) 또는 트라스투주맙-엠탄신+퍼투주맙+화학요법 (TDM1 + P)을 받은 두 치료군에서 HSP90, Rab11A, Rab4A 및 Rab5a의 발현 수준 및 pCR 사이의 상관관계에 대해서 평가했다. T-DM1+P 군 내 pCR 0 군과 pCR 1 군 사이에서 Rab5A 발현 수준의 유의한 차이가 존재한다. 두 군 중 어느 군에서 다른 단백질들 중 임의의 단백질에 대해서 발견된 유의한 차이는 존재하지 않았다.
[트라스투주맙 + 화학요법 ( TH )]
[트라스투주맙- 엠탄신 + 퍼투주맙 +화학요법]
참조 목록
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상기 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 수탁번호는 이의 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 양태와 관련하여 기재되었지만, 청구되는 본 발명은 이러한 특정 양태로 제한되어서는 안된다고 이해해야 한다. 실제로, 본 발명의 기재된 조성물 및 방법의 다양한 변형 및 변경은 당업자에게 명백할 것이며, 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (50)

  1. 인간 암 세포가 하기:
    (a) 암 세포 상에 표면 항원(surface antigen)을 표적하는 면역 접합체(immunoconjugate)로서, 상기 면역 접합체는 약물 또는 독소에 연결 또는 결합된 항원 결합 단백질인 것인, 면역 접합체; 또는
    (b) 암 세포 상에 표면 항원을 표적하는 항원 결합 단백질(antigen binding protein)로서, 상기 항원 결합 단백질은 약물 또는 독소에 연결 또는 결합되지 않은 것인, 항원 결합 단백질;에 반응하는지를 결정하는 시험관 내 방법(in vitro method)으로서:
    상기 방법은,
    시험관 내 검정에 의해 개체로부터 수득된 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 이분 임계값(dichotomizing threshold)와 비교하여 증가된 RAB5 발현 수준은 상기 면역 접합체에 대한 반응성(responsiveness)을 나타내고, 이분 임계값과 비교하여 감소된 RAB5 발현 수준은 약물 또는 독소에 연결 또는 결합되지 않은 상기 항원 결합 단백질에 대한 반응성을 나타내는 것인, 단계를 포함하고,
    RAB5는 RAB5A, RAB5B 및 RAB5C로 이루어진 군에서 선택적으로 선택되는 것인, 시험관 내 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암 세포에서 RAB5의 발현 수준을 측정하는 단계는 RAB5 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는 것인, 시험관 내 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준을 검정하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 상기 RAB4, RAB11 또는 HSP90 중 하나 이상의 발현 수준은 RAB5 발현 수준을 갖는 발현 지수에 포함되는 것인, 시험관 내 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암 세포는:
    (aa) 수술 종양 샘플(surgical tumor sample), 생검 샘플(biopsy sample) 또는 혈액 샘플로부터 수득됨;
    (bb) 유방암 세포, 결장 직장암 세포(colorectal cancer cell), 폐암 세포, 전립선암 세포, 흑색종 세포, 교모세포종 세포(glioblastoma cell), 췌장암 세포, 신장 세포 암종 세포(renal cell carcinoma cell), 난소암 세포, 방광암 세포, 자궁 내막암 세포, 위장암 세포, 중피종 세포(mesothelioma cell), 다발성 골수종 세포(multiple myeloma cell), 급성 골수성 백혈병 세포(acute myelogenous leukemia cell), 급성 림프구성 백혈병 세포(acute lymphoblastic leukemia cell) 및 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's Lymphoma)으로 이루어진 군에서 선택됨; 또는
    상기 (aa) 및 (bb) 조건 모두를 만족하는 것인, 시험관 내 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 암 세포 상의 표면 항원의 발현을 검정하는 단계를 더 포함하고; 선택적으로, 상기 표면 항원은 표피성장인자수용체(HER1), HER2, HER3 및 이들의 조합 중 적어도 하나로 이루어진 군에서 선택되고, 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate) 또는 면역 독소(immunotoxin)는 표피성장인자수용체(HER1), HER2, 및 HER3 중 하나에 표적되는 것인, 시험관 내 방법.
  6. 표면 항원을 발현하는 암 세포를 갖는 것으로 확인되고, 제1항의 이분 임계값과 비교하여 제1항에 기재된 시험관 내 방법에 의해 분석되는 바와 같이 증가된 RAB5의 발현 수준을 보이는 환자의 암의 치료 방법에서 사용되는, 암 세포의 표면 항원을 표적하는 면역 접합체로서,
    상기 면역 접합체는 약물 또는 독소에 연결 또는 결합된 항원 결합 단백질인 것인, 면역 접합체.
  7. 표면 항원을 발현하는 암 세포를 갖는 것으로 확인되고, 제1항의 이분 임계값과 비교하여 제1항에 기재된 시험관 내 방법에 의해 분석되는 바와 같이 감소된 RAB5의 발현 수준을 보이는 환자의 암의 치료 방법에서 사용되는, 암 세포의 표면 항원을 표적하는 항원 결합 단백질로서,
    상기 항원 결합 단백질은 약물 또는 독소에 연결 또는 결합되지 않은 것인, 항원 결합 단백질.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 면역 접합체는 HER2, HER3, EGFR, CD3ε, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, CD56, CEA (CD66e), CD74, CD79a, CD138, NaPi2b, gpNMB, TROP-2, GUCY2C, Nectin-4, SC-16, STEAP1, FRα, IL-2R, EpCAM, 및 MSLN으로 이루어진 군에서 선택되는 세포 표면 항원에 결합하는 것인, 면역 접합체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 항원 결합 단백질은 HER2, HER3, EGFR, CD3ε, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, CD56, CEA (CD66e), CD74, CD79a, CD138, NaPi2b, gpNMB, TROP-2, GUCY2C, Nectin-4, SC-16, STEAP1, FRα, IL-2R, EpCAM, 및 MSLN으로 이루어진 군에서 선택되는 세포 표면 항원에 결합하는 것인, 항원 결합 단백질.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 면역 접합체는,
    (a) 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin), 피나투주맙 베도틴(pinatuzumab vedotin), 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin), 리파스투주맙 베도틴(lifastuzumab vedotin), 그렘바투주맙 베도틴(glembatuzumab vedotin), 콜투시맙 라브탄신(coltuximab ravtansine), 로보투주맙 머탄신(lorvotuzumab mertansine), 인다투시맙 라브탄신(indatuximab ravtansine), 사시티주맙 고비티칸(sacitizumab govitican), 라베투주맙 고비티칸(labetuzumab govitican), 밀라투주맙 도소루비신(milatuzumab doxorubicin), 인두사투맙 베도틴(indusatumab vedotin), 바다스투시맙 탈리린(vadastuximab talirine), 데닌투주맙 마포도틴(denintuzumab mafodotin), 엔포투맙 베도틴(enfortumab vedotin), 로발피투주맙 테시린(rovalpituzumab tesirine), 반도투주맙 베도틴(vandortuzumab vedotin), 미르베툭시맙 소라브탄신(mirvetuximab soravtansine), ABT-414, IMGN289, 및 AMG595로 이루어진 군에서 선택되는 항체 약물 접합체; 또는
    (b) MH3-B1/rGel, 데닐류킨 디피톡스(denileukin diftitox), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 오포투주맙 모노톡스(oportuzumab monotox), 레시뮨(resimmune), LMB-2, DT2219ARL, HuM195/rGel, RG7787, MOC31PE 및 D2C7-IT로 이루어진 군에서 선택되는 면역 독소(immunotoxin);인 것인, 면역 접합체.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 암 세포는 유방암 세포, 결장 직장암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 흑색종 세포, 교모세포종 세포, 췌장암 세포, 신장 세포 암종 세포, 난소암 세포, 방광암 세포, 자궁 내막암 세포, 위장암 세포, 중피종 세포, 다발성 골수종 세포, 급성 골수성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포 및 비호지킨 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 면역 접합체.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 암 세포는 유방암 세포, 결장 직장암 세포, 폐암 세포, 전립선암 세포, 흑색종 세포, 교모세포종 세포, 췌장암 세포, 신장 세포 암종 세포, 난소암 세포, 방광암 세포, 자궁 내막암 세포, 위장암 세포, 중피종 세포, 다발성 골수종 세포, 급성 골수성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포 및 비호지킨 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항원 결합 단백질.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 표면 항원은 표피성장인자수용체(HER1), HER2, HER3 및 이들의 조합 중 적어도 하나로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 면역 접합체는 상기 표면 항원에 표적되는 것인, 면역 접합체.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 표면 항원은 표피성장인자수용체(HER1), HER2, HER3 및 이들의 조합 중 적어도 하나로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 항원 결합 단백질은 상기 표면 항원에 표적되는 것인, 항원 결합 단백질.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 면역 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1), ABT-414, IMGN289, AMG595, 및 AMG595로 이루어진 군에서 선택되는 항체 약물 접합체 또는 면역 독소인 것인, 면역 접합체.
  16. 제5항에 있어서,
    상기 표면 항원은 HER2인 것인, 시험관 내 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 표면 항원은 HER2인 것인, 면역 접합체.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 면역 접합체는 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1)인 것인, 면역 접합체.
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