JP2014044092A - 犬リンパ腫の診断方法及び診断キット - Google Patents

Abstract

【課題】犬リンパ腫を特異的に検出することができる、犬リンパ腫様癌の有無を診断する方法を提供すること。
【解決手段】（ａ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ）非リンパ腫の犬対照から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量を測定する工程；（ｃ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量と、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量とを比較する工程；（ｄ）上記比較結果から犬被検体が犬リンパ腫に罹患しているかどうか判定する工程；を備える。
【選択図】なし

Description

本発明は、犬リンパ腫の診断方法や診断キットに関し、より詳しくは、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質を標的とした犬リンパ腫の診断方法や診断キットに関する。

ペットの長寿化に伴い、近年件数が急増しているのがペットの癌である。人間同様ペットの癌治療も進歩を遂げ、外科療法、放射線治療、化学療法（抗癌剤）の三大療法が積極的に行われている。犬は日本国内において約１３００万頭が飼われており、ペットの中での飼育率が高い。犬の罹患する悪性腫瘍疾患のうち、最もよく認められる犬リンパ腫は、全腫瘍中で７〜２４％、犬の造血系悪性腫瘍の８３％を占める［J-VET, (2008)3月号, p51（非特許文献１）］。
リンパ腫とは白血球の１種であるリンパ球が腫瘍性に増殖する悪性腫瘍であり、犬におけるリンパ腫の発生年齢は６ヶ月齢から１５歳齢と幅広い範囲で認められるが、一般的には中〜高齢（５〜１０歳齢）のころに発生し、性別差は無い。発生リスクの高い犬種はボクサー、ゴールデンレトリーバー、バッセトハウンドなどが挙げられている。リンパ腫は全身をめぐる血液の細胞である白血球が癌化するため、体のほぼすべての組織に発生する可能性がある。その発生する場所の違いにより症状や治療に対する反応、予後が異なる場合があるため、発生場所により、多中心型、胸腺型、消化器型、皮膚型、節外型などに分類される。

これまでに報告されている犬リンパ腫の遺伝子診断とは、ＰＣＲ法を用いたリンパ系腫瘍クローン性（クローナリティー）解析であり、被検体試料中に、特定の遺伝子再構成がおこった均一な細胞集団が含まれているかどうか、すなわち、リンパ系腫瘍であるか否かを判定するものである[Vet. Pathol. (2003)40: p32-41（非特許文献２）]。つまり、Ｔ細胞型リンパ腫であれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を増幅するプライマーでＰＣＲ法を行えば単一バンドが増幅され、Ｂ細胞型リンパ腫であれば、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子を増幅するプライマーでＰＣＲを行えば単一バンドが増幅され、Ｂ細胞型であるかＴ細胞型であるかが判定でき、リンパ腫の予後予測や治療方針の策定に有用である。
しかしながら、感染症などにより、ある抗原刺激に対してＢ細胞又はＴ細胞が反応性かつモノクローナルに増殖した場合にも、腫瘍ではないのにクローン性が検出されてしまう、偽陽性のケースが存在することから、この検査は犬リンパ腫の検出というよりは、病理組織学的検査に追加し、犬リンパ腫の型の判定に用いられるに過ぎない。

癌治療の成功は、一部に、個体における癌の早期発見及び早期診断にかかっている。ヒトを対象とした癌診断法おいては、ｃＤＮＡマイクロアレイ技術や定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等を用いた、腫瘍特異的に高発現するｍＲＮＡ測定検査に代表されるように、癌を早期かつ正確に診断するための研究開発が盛んである。獣医学領域においても、高度な獣医療に対するニーズが高まっていることから、犬の癌における信頼に足る遺伝子発現プロファイルの同定が求められている。また、患畜の負担を考慮すると、針生検材料などのごく少量の検体での検査が可能であり、かつ、検査結果がより鋭敏で正確な診断法が望ましい。

ＤＥＰＤＣ１Ｂ（DEP domain containing 1B）は、別名ではＢＲＣＣ３（breast cancer cell 3）とも呼ばれ、乳癌細胞の細胞分裂周期を制御する遺伝子として知られている［Int J Mol Med, (2007)Jan;19(1):29-39,（非特許文献３）］。また、ヒト乳癌組織に認められる染色体欠損部位にＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子が含まれていたという報告もあり［Int J Cancer, (2006)Sep 1;119(5):p1052-60（非特許文献４）］、ヒト乳癌とＤＥＰＤＣ１Ｂとの関連性が知られている。
一方、ＤＥＰＤＣ１遺伝子は、別名ではＤＥＰＤＣ１Ａ（DEP domain containing 1A）とも呼ばれ、ヒト膀胱癌において高発現していること、膀胱癌細胞の増殖にＤＥＰＤＣ１遺伝子発現が関与していることが知られている［Oncogene, (2007)Sep 27;26(44):p6448-55（非特許文献５）］ほか、ヒト乳管癌組織上でのＤＥＰＤＣ１過剰発現［Mol Cancer, (2011)Feb 11;10(1):15,（非特許文献６）］や、ヒト肺腺癌の一部のケースにおけるＤＥＰＤＣ１高発現と予後不良との相関も報告されており［Cancer Res, (2012)Jan 1;72(1):100-11,（非特許文献７）］、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子と同様、ＤＥＰＤＣ１遺伝子はヒトにおける癌との関連性が知られている。しかし、両遺伝子とも、犬における機能や性質、犬の腫瘍における発現の報告は、未だに例が無い。

癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける腫瘍細胞の検出や、癌悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となる。
ヒトにおいて顕著に進んでいる癌研究ではあるが、ヒトでの発症機序が全て犬に当てはまるわけではない。例えば、ヒトにおいては、肥満と動物性脂肪分の高い食餌は大腸癌のリスクを高めるが、犬において、多くの愛玩犬が高脂肪食を与えられ肥満であるにも関らず犬の大腸癌は稀であることから、罹患する癌の傾向や感受性が、ヒトと犬では異なることが説明できる［SCIENTIFIC AMERICAN, (2006)Dec;295(6):p94-101（非特許文献８）］。
したがって、本発明の一つの目的は、犬における固形癌の診断等に有効な固形癌細胞の測定技術、殊に固形癌の進行に相関する臨床的指標を利用した上記測定技術を提供することにあり、本発明の解決すべき課題とした。

大場恵典,（2008） J-VET;3月号: p51. Burnett RC et al., (2003)Vet. Pathol.; 40: p32-41 Boudreau HE et al., (2007)Int J Mol Med.; Jan; 19(1): 29-39 Hrefna K et al., (2006)Int J Cancer; Sep 1; 119(5): p1052-60 Kanehira M et al., (2007)Oncogene; Sep 27; 26(44): p6448-55 Kretschmer C et al., (2011) Mol. Cancer; Feb 11; 10(1): 15. Okayama H et al., (2012)Cancer Res.; Jan 1; 72(1): 100-11 Waters DJ et al., (2006)SCIENTIFIC AMERICAN; Dec;295(6): p94-101

本発明の課題は、犬リンパ腫を特異的に検出することができる、犬リンパ腫様癌の有無を診断する方法やそのためのキットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、犬リンパ腫特異的に高発現する遺伝子に着目して検討したところ、試行錯誤の末、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子やＤＥＰＤＣ１遺伝子が犬リンパ腫において有意に高発現することを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、（１）（ａ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量を測定する工程；（ｂ）非リンパ腫の犬対照から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量を測定する工程；（ｃ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量と、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量とを比較する工程；（ｄ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量が、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量に比して多い場合に、犬被検体が犬リンパ腫に罹患していると判定する工程；を備えたことを特徴とする犬リンパ腫の診断方法に関する。

また本発明は、（２）遺伝子の発現量として、ｍＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする上記（１）に記載の犬リンパ腫を診断する方法や、（３）遺伝子の発現量を、その遺伝子に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイを用いて測定することを特徴とする上記（１）または（２）に記載の犬リンパ腫を診断する方法に関する。

また本発明は、（４）遺伝子の発現量を、その遺伝子塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとしたリアルタイムＰＣＲ法により測定する、上記（１）または（２）に記載の犬リンパ腫を診断する方法や、（５）タンパク質の発現量を、そのタンパク質に対する抗体を用いて測定することを特徴とする上記（１）または（２）にいずれか記載の犬リンパ腫を診断する方法に関する。

また本発明は、（６）免疫組織化学染色又は蛍光免疫組織化学染色により測定することを特徴とする上記（５）記載の犬リンパ腫を診断する方法や、（７）犬被検体の犬リンパ腫悪性度又は犬リンパ腫分化度の程度を判定することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の診断する方法に関する。

さらに本発明は、（８）ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量の測定手段を備えた、犬リンパ腫の診断キットに関する。

本発明により、犬リンパ腫を特異的に検出することにより、犬リンパ腫の早期診断が可能となる。また、一般的に癌は高分化型よりも低分化の方が悪性度は高いことが知られているが、本発明によると、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子やＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現が、低〜中分化型犬リンパ腫組織に特異的に発現していることから、犬リンパ腫の悪性度又は進行度を診断することができる。

犬のＴ細胞型リンパ腫３症例より採取した細胞をリンパ腫試料とし、健常ビーグル犬３頭より採取したＣＤ３陽性Ｔリンパ球を対照試料とした、Agilent社のAgilent Whole Canine Genome Oligo Microarrays 4x44KによるｃＤＮＡマイクロアレイ結果でのヒートマップ図を示す図面である。 犬リンパ腫細胞株１２種類（１７−７１、３１３２、ＣＬ−１、ＣＬＢＬ−１、ＣＬＣ、ＣＬＧＬ−９０、ＣＬＫ、ＣＬＬ １３９０、Ｅｍａ、ＧＬ−１、Ｎｏｄｙ−１、及びＵＬ−１）、リンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞２２例、健常ビーグル犬由来のＴリンパ球とＢリンパ球各２例、健常犬由来脾臓組織４例における、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子とＤＥＰＤＣ１遺伝子のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。

本発明の犬リンパ腫の診断（判定）方法としては、例えば、犬リンパ腫に罹患又は発症しているかどうか不明な犬被検体や犬リンパ腫かどうか識別が困難な癌腫に罹患している犬被検体（患犬）から採取した判定用試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量を測定する工程（ａ）；非リンパ腫の犬対照から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量を測定する工程（ｂ）；犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量と、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量とを比較する工程（ｃ）；犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量が、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量に比して多い場合に、犬被検体が犬リンパ腫に罹患している、犬被検体の犬リンパ腫悪性度が高い、又は犬リンパ腫分化度が低い若しくは中程度であると判定する工程（ｄ）；を順次備えた方法であれば特に制限されず、ここで「悪性度が高い」又は「分化度が低い」犬リンパ腫とは、腫瘤の組織構築が瀰漫性で、構成細胞が大型の幼若リンパ芽球様細胞である犬リンパ腫のことをいい、また、「分化度が中程度」犬リンパ腫とは、「悪性度が高い」又は「分化度が低い」犬リンパ腫と、腫瘤の組織構築が濾胞性で、構成細胞は比較的成熟した小型のリンパ球である悪性度が低い又は分化度が高い犬リンパ腫との中間に位置する犬リンパ腫のことをいう。
なお、本発明の犬リンパ腫の診断方法には、犬リンパ腫の有無を判定する方法や、犬リンパ腫の有無を判定するためのデータを収集する方法や、犬リンパ腫治療の予後を予測するためのデータを収集する方法が含まれる。

本発明において、「犬リンパ腫」とは、リンパ節、肝臓、脾臓、骨髄などの組織・器官・臓器から発生するリンパ系細胞の悪性腫瘍のことを意味する。

本発明の犬被検体から採取した試料としては、犬リンパ腫が発生する可能性のあるリンパ系細胞を含むリンパ節、肝臓、脾臓などの組織・器官・臓器の非液性試料や、血液、骨髄液等の液性試料を例示することができる。例えば、上記非液性試料は、犬被検体より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。

本発明の非リンパ腫の犬対照から採取した試料としては、健常犬や獣医等当業者が通常用いる基準に照らして明らかにリンパ腫に罹患していないと判断される犬由来のリンパ系細胞を含むリンパ節、肝臓、脾臓などの組織・器官・臓器の非液性試料や、血液、骨髄液等の液性試料を例示することができる。また、これら対照試料は、採取された後に、犬被検体から採取した試料と同様の処理が施された対照試料であることが好ましい。

本発明のＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子やＤＥＰＤＣ１遺伝子（以下、これらを総称して「本件バイオマーカー遺伝子」という）の発現量を測定する方法としては、本件バイオマーカー遺伝子がコードするｍＲＮＡ又はその逆転写物（ｃＤＮＡ）の一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、犬被検体から採取した試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、該遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、犬被検体から採取した試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、該遺伝子のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、犬被検体から採取した試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、該遺伝子のｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。
なお、上記定量ＰＣＲ法を用いて検出する場合、ribosomal protein L32（ＲＰＬ３２）、β-アクチン、グリセルアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼ、リボソームタンパク質Ｐ１などのハウスキーピング遺伝子を内部標準として用いてもよい。

本発明のＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子としては配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質としては配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいはこれら配列と９５％以上の同一性を有する同効物を好適に挙げることができる。また、本発明のＤＥＰＤＣ１遺伝子の塩基配列情報やＤＥＰＤＣ１タンパク質のアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索し、適宜入手することができ、ＤＥＰＤＣ１遺伝子の塩基配列としては、Accession:ＸＭ_５３７１１６．３ ＧＩ：３４５８０２２３３（更新日；２０１１年１２月２日）として登録されたものを、ＤＥＰＤＣ１タンパク質のアミノ酸配列としては、Accession:ＸＰ_５３７１１６．２ ＧＩ：７３９６０１９０（更新日；２０１１年１２月２日）として登録されたものを、それぞれ具体的に例示することができる。

本発明のＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質やＤＥＰＤＣ１タンパク質（以下、これらを総称して「本件バイオマーカータンパク質」という）の発現量を測定する方法としては、本件バイオマーカータンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、本件バイオマーカータンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法も含まれるが、本件バイオマーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた方法が好ましく、具体的には、ウェスタンブロッティング法、Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）法、タンパク質アレイ（プロテインチップ）、免疫組織化学染色法、蛍光免疫組織化学染色法などを挙げることができる。
上記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イヌ抗体、キメラ抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）_２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。

逆に、犬被検体が犬リンパ腫に罹患していないと判定される場合とは、犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量が、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における、対応するＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量と比べ変化がない場合であり、ここで「変化がない」には統計学的有意差がないことも含まれる。

犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子又はＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質の発現量とＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量の両方が、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量よりも多いという比較結果が得られた場合（以下「重篤ケース」という）、犬被検体は犬リンパ腫に罹患している（罹患する）可能性が高い、犬被検体の犬リンパ腫悪性度が高い可能性が高い、又は被検組織の犬リンパ腫が低分化型若しくは中分化型のものである可能性が高いと判定することができる。他方、犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子又はＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質の発現量とＤＥＰＤＣ１遺伝子又はＤＥＰＤＣ１タンパク質の発現量とのどちらか一方のみが、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量よりも多いという比較結果が得られた場合、前記重篤ケースに比べて、犬被検体は犬リンパ腫に罹患している（罹患する）可能性が低い、犬被検体の犬リンパ腫悪性度が高い可能性が低い、又は被検組織の犬リンパ腫が低分化型若しくは中分化型のものである可能性が低いと判定することができる。

本発明の犬リンパ腫の診断キットとしては、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量の測定手段を備えたものであれば特に制限されず、本件バイオマーカー遺伝子の測定手段には、本件バイオマーカー遺伝子がコードするｍＲＮＡ又はその逆転写物（ｃＤＮＡ）の一部若しくは全部を特異的に検出できる手段、例えば、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドからなるプローブや該ヌクレオチドを固相化したマイクロアレイ、本件バイオマーカー遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとしたリアルタイムＰＣＲ法に用いられるプライマーセットを挙げることができ、本件バイオマーカータンパク質の測定手段には、本件バイオマーカータンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる手段、例えば、バイオマーカータンパク質を特異的に認識する抗体等を挙げることができる。かかる本発明のキットには、本件バイオマーカー遺伝子や本件バイオマーカータンパク質を測定することにより、犬リンパ腫が診断しうる旨の取扱説明書を含めることが好ましい。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

１．ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた犬リンパ腫バイオマーカーの探索
１−１ 犬被検体及び組織試料
リンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞は、山口大学動物医療センター又は東京大学動物医療センターに来院した犬のうち、細胞診又は病理組織学検査に基づいて高悪性度リンパ腫と診断された犬２３頭から腫瘍細胞を含む組織試料を採取することにより単離した。それぞれの犬から採取した腫瘍細胞を含む組織試料は直ちに凍結し、ＲＮＡ抽出を行うまで−８０℃で保存した。健常犬由来脾臓組織試料は、山口大学獣医内科学研究室において保存されている健常ビーグル由来脾臓組織試料を用いた。
１−２ リンパ球分離
山口大学動物医療センターにて飼育している健常ビーグル犬３頭より抗凝固剤（ＥＤＴＡ）を用いて末梢血液を採取し、Lymphoprepを用いた密度勾配遠心法により末梢血単核球を回収した。Ｔ細胞特異的な細胞分子マーカーＣＤ３に対する抗体（マウス抗イヌＣＤ３抗体（ＣＡ１７．２Ａ１２））や、Ｂ細胞特異的な細胞分子マーカーＣＤ２１に対する抗体（マウス抗イヌＣＤ２１抗体（ＣＡ２．１Ｄ６））や、かかる抗体に結合する抗マウス抗体マイクロビーズ(Miltenyi社製)を用いたMACS Separation Columns (Miltenyi社製)により、末梢血単核球からＣＤ３陽性分画及びＣＤ２１陽性分画をそれぞれ採取した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞やＣＤ２１陽性Ｂ細胞が分離できたことは、フローサイトメトリー（CyFlow Space、Partec社製）により確認した。
１−３ ＲＮＡ抽出
凍結保存したリンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞試料（３例）からTRI reagent又はISOGENIIを用いて使用法に従い、トータルＲＮＡを抽出した。なお、コントロールとして、上記実施例１の「２．リンパ球分離」の項目に記載の方法により単離した健常犬由来ＣＤ３陽性Ｔ細胞を用いた。
１−４ ｃＤＮＡマイクロアレイ
抽出したトータルＲＮＡを基に作製したｃＤＮＡを用い、マイクロアレイ（Agilent Whole Canine Genome Oligo Microarrays 4x44K）（Agilent社製）により、ｍＲＮＡの発現解析を定法にしたがって行った。
１−５ 結果
コントロールと比べｍＲＮＡの発現上昇が認められた３，３０３遺伝子のうち、８４遺伝子が３倍以上発現上昇しており、かかる８４遺伝子の中にはＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子とＤＥＰＤＣ１遺伝子が含まれていることが明らかとなった（図１）。この結果は、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子及びＤＥＰＤＣ１遺伝子は、犬リンパ腫に特異的に高発現する遺伝子であることを示している。

２．リアルタイムＰＣＲ法を用いたＤＥＰＤＣ１Ｂ及びＤＥＰＤＣ１遺伝子のｍＲＮＡの発現解析
さらに、ＤＥＰＤＣ１Ｂ及びＤＥＰＤＣ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を定量的に解析するために、リアルタイムＰＣＲ法による解析を行った。
２−１ 細胞株
本実施例において犬リンパ腫細胞株１２種類（１７−７１、３１３２、ＣＬ−１、ＣＬＢＬ−１、ＣＬＣ、ＣＬＧＬ−９０、ＣＬＫ、ＣＬＬ １３９０、Ｅｍａ、ＧＬ−１、Ｎｏｄｙ−１、及びＵＬ−１）を用いた。このうち犬リンパ腫細胞株４種類（１７−７１、３１３２、ＣＬＧＬ−９０、及びＣＬＬ １３９０）は、Ｉ１０培地（ＩＭＤＭに最終濃度１０％のFetal Bovine Serum（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ＆Ｓ）、L-glutamineを添加したもの）を用いて培養し、また、犬リンパ腫細胞株８種類（ＣＬ−１、ＣＬＢＬ−１、ＣＬＣ、ＣＬＫ、Ｅｍａ、ＧＬ−１、Ｎｏｄｙ−１、及びＵＬ−１）は、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ １６４０に最終濃度１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＰ＆Ｓ、５５μＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を添加したもの）を用いて培養した。また、培養は５％のＣＯ_２、３７℃インキュベーター内で行った。
２−２ リアルタイムＰＣＲ法
上記犬リンパ腫細胞株１２種類の他、上記実施例１で単離したリンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞２２例（上記実施例１のマイクロアレイに用いた２例を含む）から上記実施例１に記載の方法によりトータルＲＮＡを抽出し、Turbo DNA-free（Ambion社製）を用いてＤＮａｓｅ処理を行い、添付の使用マニュアルに従ってSuperscriptII（Invitrogen社製)を用いたｃＤＮＡ合成を行った。なお、コントロールとして、上記実施例１で単離した健常犬由来のＴリンパ球とＢリンパ球各２例の他、山口大学獣医内科学研究室において保存されている健常犬（ビーグル）由来リンパ節組織試料２例及び脾臓組織試料４例を用いた。各試料より合成したｃＤＮＡをQuantiTect SYBER Green PCR Kit（ＱＩＡＧＥＮ)を用いた定量的ＰＣＲ法に使用した。なお、定量ＰＣＲ法に用いるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子を増幅するプライマーセット（配列番号５及び６）やＤＥＰＤＣ１遺伝子を増幅するプライマーセット（配列番号３及び４）の他、内部標準として用いるハウスキーピング遺伝子（ribosomal protein L32［ＲＰＬ３２］）を増幅するプライマーセット（配列番号７及び８）は、イヌの塩基配列に基づいて設計した（表１参照）。９５℃１５分間のプレヒーティング後、９４℃１５秒間の熱変性、６０℃３０秒間のアニーリング、７２℃３０秒間の相補鎖合成を１サイクルとし、計４０サイクルに機器（Applied Biosystems StepOne PCR system［Applied Biosystems社製］）を設定しＰＣＲ反応を行った。得られたデータの解析は、StepOne software V.2.2.2.（life technologies社製）を用いて行った。
２−３ シークエンス解析
それぞれのリアルタイムＰＣＲ産物に対して、BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit（ＡＢＩ社製）を用いてシークエンス解析を行った。この解析にて、リアルタイムＰＣＲにおいて目的とする遺伝子（ＤＥＰＤＣ１ＢやＤＥＰＤＣ１遺伝子）が増幅されていることを確認した。
２−４ 結果
図２に示すように、ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ３２）と比較して健常犬由来Ｔリンパ球でのＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現量は１／５０、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子の発現量は１／２８、Ｂリンパ球でのＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現量は１／８５、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子の発現量は１／５９５、健常犬由来リンパ節組織試料でのＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現量は１／１９４、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子の発現量は１／１０９、脾臓組織試料でのＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子の発現量は１／２８７であり、脾臓組織試料においてＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現は認められなかった。一方、ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ３２）と比較して１２種類の犬リンパ腫細胞株でのＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現量は４．７倍、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子の発現量は６．９倍、リンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞でのＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現量は１／３．９、ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子の発現量は２．９倍と両遺伝子の著しい発現上昇が認められた。さらに、リンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞２２例のうち、低〜中分化型リンパ腫を示す２０例については、健常試料と比べすべてＤＥＰＤＣ１Ｂ及びＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現が高かったのに対して（図２中の四角で囲った部分）、リンパ腫罹患犬由来腫瘍細胞２２例のうち、高分化型リンパ腫を示す２例については、正常試料と同程度の発現量を示した（図２中の丸で囲った部分）。これらの結果は、上記実施例１のマイクロアレイの結果を支持するとともに、ＤＥＰＤＣ１ＢやＤＥＰＤＣ１遺伝子が低〜中分化型リンパ腫組織に特異的に発現することを示している。

本発明は、犬リンパ腫予防や早期発見に必要な犬リンパ腫の新規検査法の提供が期待される他、犬リンパ腫の早期の段階で診断・治療をうける患畜が増えることや、犬リンパ腫による死亡率を下げることが期待される。

Claims (8)

1. 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を備えたことを特徴とする犬リンパ腫の診断方法。
   （ａ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量を測定する工程；
   （ｂ）非リンパ腫の犬対照から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量を測定する工程；
   （ｃ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量と、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量とを比較する工程；
   （ｄ）犬被検体から採取した試料におけるＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量が、非リンパ腫の犬対照から採取した試料における対応する遺伝子又はタンパク質の発現量に比して多い場合に、犬被検体が犬リンパ腫に罹患していると判定する工程；
2. 遺伝子の発現量として、ｍＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする請求項１記載の犬リンパ腫を診断する方法。
3. 遺伝子の発現量を、その遺伝子に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイを用いて測定することを特徴とする請求項１又は２記載の犬リンパ腫を診断する方法。
4. 遺伝子の発現量を、その遺伝子塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとしたリアルタイムＰＣＲ法により測定する、請求項１又は２記載の犬リンパ腫を診断する方法。
5. タンパク質の発現量を、そのタンパク質に対する抗体を用いて測定することを特徴とする請求項１又は２のいずれか記載の犬リンパ腫を診断する方法。
6. 免疫組織化学染色又は蛍光免疫組織化学染色により測定することを特徴とする請求項５記載の犬リンパ腫を診断する方法。
7. 犬被検体の犬リンパ腫悪性度又は犬リンパ腫分化度の程度を判定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の診断する方法。
8. ＤＥＰＤＣ１Ｂ遺伝子、ＤＥＰＤＣ１Ｂタンパク質、ＤＥＰＤＣ１遺伝子及びＤＥＰＤＣ１タンパク質から選ばれる少なくとも１つの発現量の測定手段を備えた、犬リンパ腫の診断キット。