KR101317513B1 - 대장암 또는 난소암 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법 - Google Patents

대장암 또는 난소암 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장암 또는 난소암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 유전자 마커를 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 CK7(cytokeratin 7), CK20(cytokeratin 20), CDX2(caudal type homeobox transcription factor 2) 및 MUC2(mucin 2)로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자는 대장암 또는 난소암에서 그 발현 양상이 상이한 특징이 있으므로 이들 유전자를 대장암과 난소암을 구별하여 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 상기 유전자들 중에서 2개 이상의 유전자 조합으로 구성된 복합 마커를 사용할 경우에는 대장암과 난소암을 조기에 정확하게 구별하여 진단할 수 있는 특징이 있으므로 진단의 신뢰도를 높일 수 있는 효과가 있고 따라서 신속한 치료가 가능하게 하여 대장암 또는 난소암 환자의 생존율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

대장암 또는 난소암 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법{Composition, kit and method for diagnosing colorectal cancer or ovarian cancer}
본 발명은 대장암 또는 난소암 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 대장암 또는 난소암을 진단할 수 있는 마커로서 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자를 이용한 대장암 또는 난소암 진단용 조성물, 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.
현재 우리나라에서 대장암 발생율은 현저하게 증가하고 있으며, 대장암에 의한 사망은 남성의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 4위를 차지하고 있고, 여성의 경우도 이와 유사하다. 대장암의 발병 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조사되고 있으며, 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 잇고 있다.
이러한 대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다.
한편, 과학기술의 발전에 힘입어 최근에는 대장암의 발병과 관련된 유전자들이 밝혀지고 있으며, 이러한 유전자들을 이용하여 대장암을 조기에 발견하고 치료하는 방법들이 연구되고 있는데, 대장암의 경우 다른 종류의 암 유전자, 종양 억제유전자 등 다양한 유전자 변화가 관여하는 것으로 밝혀지고 있다.
실제 대장암은 발암과정에서 일어나는 유전적 변화가 가장 많이 밝혀진 암 중의 하나로서, 대장암은 한 개의 암 유전자 또는 종양억제 유전자의 변화가 단독으로 암을 유발시킬 수 있는 것이 아니고 정상 대장 점막세포가 선종의 단계를 거쳐 대장암으로 진행되기 위해서는 수년에 걸친 긴 세월을 통해 여러 개의 암 관련 유전자의 변화가 축적되어야 하는데 이를 대장암 발생에 있어서 유전자의 다단계적 변화라고 하며, 이러한 변화는 각 단계에서의 유전자 변화 순서가 아니라 궁극적으로 누적되는 유전자들의 변화의 총합을 말한다.
대장암을 일으키는 유전자들에 대한 지속적인 연구결과, 대장암 발생과정에 관여하는 유전적 변화로서 K-ras, APC, MCC, DCC, p53, 및 DNA의 메틸화 이상이 관여하는 것으로 밝혀졌고, 이 외에도 hMSH2, hMSH1, hPMS1, hPMS2 등의 돌연변이가 관련되어 있다는 사실이 밝혀졌다. 이와 같이, 암의 형성은 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 발현 및 조절 기작이 복합적으로 연관되어 진행되므로 최근에는 다량의 유전자가 탑재된 올리고 칩을 이용하여 암 관련 유전자들의 발현율을 비교함으로써 암의 새로운 진단이나 치료 마커를 발굴하기 위한 연구들이 이루어지고 있다.
특히, 암세포에서 발현이 증가하거나 감소하는 유전자들의 경우, 세포분열, 세포신호전달, 세포골격, 세포운동, 세포방어, 유전자 및 단백질의 발현, 세포 내 물질 대사 등 여러 부분에 관여하고 있어서 환자 조직에 따라 동일한 발현변화를 보이는 유전자가 있는 반면 다른 발현 변화를 보이는 유전자들이 존재한다. 또한, 각각 환자들에 따른 특이성도 다른 발현 패턴을 보이는 원인이 될 수 있으므로 연구하는 대상의 환자 조직에 대한 정확한 병리학적 소견과 분류에 따라야 하며 보다 정확한 진단을 위해서는 많은 유전자들에 의한 진단 및 확인이 필요하다.
이는 암 진단에 있어서 한 종류의 표지 물질을 사용하는 경우, 민감도 및 특이도가 여러 표지 물질을 사용하는 경우보다 상대적으로 낮아 오류를 범할 확률이 상대적으로 높으며, 발굴된 암세포 또는 조직에 특이적인 표지물질이 조기 진단에 사용되기 위해서는 몇 가지 제약 조건이 있는데, 우선 표지물질의 농도에 대한 조건으로서, 암 조직에서 발현된 표지 물질이 혈장 또는 척수액 같은 용액에 방출되면 지나치게 희석되어 진단표지 물질로 사용하는데 있어 어려움이 있다. 따라서 조직에서 발견된 표지 물질을 체액에서 검출하기는 무리가 따르고, 조직 자체를 조사할 경우 표지 물질의 의미를 상당히 상실하게 된다. 또한 체액에서 발현의 차이를 보이는 물질과 암 혹은 다른 병변 조직에서 변화하는 물질과 일치하지 않을 가능성이 있다. 또한, 조직 내의 변화가 캐스케이드(cascade)에 따라 체액에 도달하면 전혀 다른 표지 물질로 나타날 수도 있고, 서로 다른 암 조직이라도 공통의 표지 물질을 나타낼 수 있다. 따라서 한 가지의 마커를 이용하여 암을 진단하는 것에 비해 다중 바이오마커(multiplex biomarker)를 이용한 암의 진단은 보다 정확한 진단을 위한 대책이 될 수 있다.
나아가, 난소암의 5~30%는 전이성 악성 종양으로서 각 나라별 다양한 암으로 전이되어 각종 암이 발병되는 것으로 알려져 있는데, 우리나라의 경우, 대장암이 난소의 이차적인 암 중의 하나로 알려져 있다(Bae JH 등, J Korean Med Sci, 24, 114~119, 2009). 따라서 대장암을 진단할 경우 이를 난소암으로 오진하는 확률이 높으며, 그 결과 환자에게 잘못된 치료법이 사용되는 문제점이 발생하고 있어, 난소암과 대장암을 정확하게 진단할 수 있는 새로운 진단방법의 개발이 시급한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 신속하고 정확하게 대장암 또는 난소암을 진단하기 위해 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자를 이용한 대장암 또는 난소암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 조성물을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 대장암 또는 난소암을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 하기 표에 기재된 1 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자 조합의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함할 수 있다:
Figure 112010031591598-pat00001
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 물질은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 물질은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2으로 이루어진 군 중에서 선택되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 생물학적 시료에 존재하는 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 유전자 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 또는 난소암을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CK7 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양이 정상대조군 시료에 비해 증가되고, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양은 정상대조군 시료에 비해 감소된 경우, 난소암이 발병한 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CK7 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양이 정상대조군 시료에 비해 감소되고, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양은 정상대조군 시료에 비해 증가된 경우, 대장암이 발병한 것으로 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자는 대장암 또는 난소암에서 그 발현 양상이 상이한 특징이 있으므로 이들 유전자를 대장암과 난소암을 구별하여 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 상기 유전자들 중에서 2개 이상의 유전자 조합으로 구성된 복합 마커를 사용할 경우에는 대장암과 난소암을 조기에 정확하게 구별하여 진단할 수 있는 특징이 있으므로 진단의 신뢰도를 높일 수 있는 효과가 있고 따라서 신속한 치료가 가능하게 하여 대장암 또는 난소암 환자의 생존율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 원발성 난소 상피암(POMA) 조직에서 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자의 발현정도를 면역조직화학법을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, A:CK7, B:CK20, C:CDX2 및 D:MUC2 항체를 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 전이성 대장암(MCAO) 조직에서 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자의 발현정도를 면역조직화학법을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, A:CK7, B:CK20, C:CDX2 및 D:MUC2 항체를 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 대장암 또는 난소암을 구별하여 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 제공함에 그 특징이 있으며, 보다 구체적으로 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 대장암과 난소암을 구별하여 정확하게 진단할 수 있는 새로운 진단마커를 개발하기 위해 CK7(cytokeratin 7), CK20(cytokeratin 20), CDX2(caudal type homeobox transcription factor 2) 및 MUC2 유전자에 주목하였는데, 상기 사이토케라틴류에 속하는 CK7(cytokeratin 7) 또는 CK20(cytokeratin 20) 유전자는 대부분의 상피세포의 표면에 발현되는 항원 단백질로서 이러한 단백질의 발현은 혈액내의 상피세포가 존재함을 가리키며, 특히 상피세포 근원의 암세포에서는 사이토케라틴 단백질이 발현되고 있어 CK7(cytokeratin 7) 또는 CK20(cytokeratin 20)는 상피세포 근원의 암을 진단하는데 사용되고 있다.
또한, 상기 CDX2(caudal type homeobox transcription factor 2)는 초파리에서 처음 발견된 cadual 유전자와 상동유전자로 homeobox transcription factor를 암호화하며, 인체에서 소장과 대장의 상피세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 알려져 있고, 정상 상피세포의 증식과 분화에 중요한 역할을 하며 종양억제 유전자로서의 기능도 있다는 사실이 알려져 있으며, 최근에는 CDX2가 대장암 세포에서 발현이 소실된다고 알려짐에 따라 대장암을 진단하기 위한 마커로도 사용되고 있다.
상기 MUC2 유전자는 뮤신 유전자의 한 종류로서, 특히 분비성 뮤신에 속하는 유전자이다. 뮤신(mucin)은 점액성 물질의 주요한 구성 성분으로 소화기 계통의 상피세포, 기도 등의 호흡기관에 점액성 물질을 분비하여 각 기관의 기계적인 손상과 화학적인 자극으로부터 상피조직인 장내 표면을 보호하는 역할과 소화운동의 윤활제 역할을 하며, 이러한 기능을 수행하는 뮤신 유전자는 현재까지 20종류가 밝혀져 있고, 기능에 따라 크게 분비성 뮤신과 막 결합성 뮤신으로 나눌 수 있다. 특히 MUC2 유전자가 속하는 분비성 뮤신 유전자는 정상적인 상태에서는 서로 다른 기관에서 점액성 물질을 분비하여 각 기관과 장을 보호하지만, 유전자의 조절이나 유전자에 이상이 있는 경우에는 과다분비가 나타난다. 이러한 과다분비로 인하여 기관지의 경우에는 천식을 유발하거나 염증성 질병을 동반하고, 위암의 경우에는 과다점액이 여러 병원균에 대한 허용을 높이게 되어 위암의 발생 빈도를 증가시킨다고 보고되고 있다. 그러나 MUC2 유전자를 대장암 또는 난소암을 진단할 수 있는 마커로 사용한 내용에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 대장암 또는 난소암을 구별하여 진단할 수 있는 바이오마커로서 사용된 상기 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 경우, 일부 특정 암세포에서 그 발현정도가 정상세포와 차별화되는 특징이 있어 상기 유전자들을 각각 암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있으나, 암의 발생에는 다양한 유전자들이 관여하고 있으므로 한 종류의 표지 물질을 사용하는 경우, 낮은 민감도 및 특이도로 인해 오류를 범할 확률이 높은 문제점이 있을 수도 있다.
이에, 본 발명에서는 종래 사용하던 암 진단 마커의 낮은 민감도와 특이도를 개선하기 위해 대장암과 난소암을 구별하여 진단할 수 있는 바이오마커로서 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자를 2개 이상 포함한 복합 마커를 사용할 경우, 대장암 또는 난소암을 높은 정확도로 진단할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
일반적으로 난소와 관련된 전이성 암의 종류 중 대표적인 것이 대장암인데, 이러한 대장암은 원발성 난소암과 증상 등이 유사하여 대장암을 난소암으로 오진하는 경우가 빈번하며, 이러한 오진으로 인해 대장암에 대한 치료법 대신 난소암에 대한 치료법을 시행하여 궁극적으로 환자의 고통을 증가시키는 결과가 초래되고 있다.
따라서 대장암과 난소암을 초기에 확실히 구별할 수 있는 새로운 진단방법이 필요한 현 시점에서, 본 발명자들은 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자 중 2개 이상의 복합 바이오 마커를 사용하였을 경우, 대장암과 난소암을 확실히 구별하여 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 대장암과 난소암 조직에서 단백질의 발현이 차별적인 유전자를 선별하기 위해 원발성 난소 상피성 종양(POMA:primary ovarian mucinous adenocarcinoma) 및 전이성 대장암(MCAO:metastatic colorectal adenocarcinoma) 환자들로부터 암 조직을 각각 수득한 후, 조직 어레이 블럿을 제조하였고, 발명자들은 일차적으로 선별한 후보 마커 유전자들의 발현을 검출할 수 있는 항체를 사용하여 면역조직화학분석법을 수행하여, 상기 후보 마커 유전자들의 발현정도를 비교 분석하였다.
그 결과, CK7, CK20, CDX2, CEA, MUC2, MUC5AC 및 AMACR 유전자의 발현은 원발성 난소 상피성 종양의 경우, MUC2 및 CDX2 유전자는 거의 발현되지 않는 것으로 나타났고, CK20 및 CEA는 국소적 양성 발현인 것으로 나타났으며, CK7 및 MUC5AC는 양성발현인 것으로 나타났다. 한편, 전이성 대장암의 경우에는 MUC5AC는 발현되지 않는 것으로 나타났고, CK7 또한 음성 발현인 것으로 나타났으며, CDX2 및 MUC2는 국소적 양성발현으로 나타났고, CK20 및 CEA는 확산적 양상, 즉 과다 발현되어 있는 것으로 나타났다(실시예 1 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 대장암 및 난소암에서 각각 발현양상이 상이한 CK7, CK20, CDX2, CEA, MUC2, MUC5AC 및 AMACR 유전자들을 상기 암들의 발병을 예측 또는 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 대장암과 난소암에서 차별발현을 보이는 CK7, CK20, CDX2, CEA(carcinoembryonic antigen), MUC2, MUC5AC(mucin 5 subtype A and C) 및 AMACR(α-methylacyl-CoA racemase) 유전자들을 대상으로 통계학적인 계산을 통해 각 암에서의 민감성, 특이성, 양성 또는 음성 발현 예상 수치를 확인하였는데, CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자가 상기 특징들에 대하여 우수한 값을 갖는 것으로 나타났다(실시예 2 참조).
이에 본 발명자들은 상기 선별된 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자를 사용하여 대장암과 난소암을 구별하여 진단할 수 있는지를 확인하기 위해, 대장암 조직 및 난소암 조직을 대상으로 상기 4개의 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학 분석 방법을 수행하여 각 암 조직에서 상기 단백질들의 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 원발성 난소 상피성 암의 경우, CK7은 양성 발현인 것으로 나타난 반면, CK20, CDX2 및 MUC2 모두는 음성 발현, 즉 단백질이 거의 발현되지 않는 것으로 나타났다. 또한 전이성 대장암의 경우에는 원발성 난소 상피성 암의 결과와는 반대로 CK7은 음성 발현 양상을 보였고, CK20, CDX2 및 MUC2 모두는 양성 발현 패턴을 보이는 것으로 나타났다.
이로써 본 발명자들은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자를 사용할 경우, 상기 유전자의 발현 정도를 확인하는 간단한 방법을 통해 종래 문제가 되던 대장암과 난소암의 오진 발생을 감소시키면서 대장암과 난소암을 명확하게 구별하여 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 유전자들을 이용하여 대장암과 난소암의 진단율을 보다 높일 수 있는 방법을 고안하던 중, CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자 중에서 2개 이상의 유전자를 조합한 복합 마커를 사용할 경우, 진단율을 향상시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 4개의 유전자들을 이용하여 2개의 유전자로 구성된 복합마커, 3개의 유전자로 구성된 복합마커 및 4개의 유전자로 구성된 복합마커를 이용하여 난소암 및 대장암의 진단 정확도를 분석한 결과, 2개의 유전자를 이용한 경우, 약 50~70%의 정확도를 나타내었고, 3개의 유전자를 이용한 경우에는 70~85%의 정확도를 나타내었으며, 4개의 유전자를 모두 사용한 경우에는 87.3%의 높은 정확도를 나타내었다.
또한, 상기 4개의 유전자 이외에도 대장암 및 난소암에서 차별 발현을 보였던 CEA, MUC5AC 및 AMACR을 포함하는 7개의 유전자를 모두 사용하였을 경우에도 74.6%의 높은 정확도를 나타내었다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자를 2개 이상 조합하여 복합 마커로서 사용할 경우, 대장암 및 난소암을 매우 정확하게 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 상기와 같은 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질로 이루어지는 대장암 또는 난소암 진단용 마커를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 대장암 또는 난소암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 대장암 또는 난소암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 대장암 또는 난소암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 대장암 또는 난소암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 대장암 또는 난소암의 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 대장암 또는 난소암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 대장암 또는 난소암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 대장암 또는 난소암에서 차별발현되는 유전자 또는 단백질로서, CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개이상의 유전자 또는 단백질 일 수 있다. 바람직하게, 상기 CK7은 서열번호 1로 기재된 염기서열을 가질 수 있으며, CK20은 서열번호 2, CDX2는 서열번호 3 및 MUC2는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
한편, 질병을 진단하는 진단 마커는 유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용이 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는데 매우 중요한 인자로 작용하는데, 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 대장암 또는 난소암을 진단할 수 있는 상기 마커들의 경우, 대장암 또는 난소암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 증가 또는 감소하는 유전자들로서 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 유의성 있는 차이를 보이므로 잘못된 결과를 보일 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.
또한, 본 발명은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 수준 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 대장암 또는 난소암 진단용 조성물은 바람직하게 하기 표 1에 기재된 1 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자 조합의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함할 수 있으며, 가장 바람직한 상기 유전자 조합은 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자로 이루어진 조합일 수 있다.
난소암 또는 대장암을 진단할 수 있는 유전자 조합
유전자 조합 유전자 조합
1 CK7/MUC2 5 CK7/CDX2/MUC2
2 CK20/MUC2 6 CK20/CDX2/MUC2
3 CDX2/MUC2 7 CK7/CK20/CDX2/MUC2
4 CK7/CK20/MUC2 8 CK7/CK20/CDX2/CEA/MUC2/MUC5AC/AMACR
본 발명에서 상기 유전자의 수준은, 바람직하게 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 전체 또는 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 대장암 또는 난소암 진단할 수 있는 마커 단백질로서 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 대장암 또는 난소암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 대장암 또는 난소암 진단용 키트에 포함되는 대장암 또는 난소암 진단용 조성물은 앞서 기술한 바와 같이 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함할 수 있다. 상기 유전자의 mRNA를 측정할 수 있는 물질로는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있고, 상기 단백질을 측정할 수 있는 물질로는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 대장암 또는 난소암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 대장암 또는 난소암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 상기 본 발명에서 제작될 수 있는 키트의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 대장암 또는 난소암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 또는 난소암 진단용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 단백질, 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명에 따른 대장암 또는 난소암 진단용 마커 유전자의 발현수준을 측정하여 대장암 또는 난소암을 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 생물학적 시료에 존재하는 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 유전자 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 대장암 또는 난소암 진단용 마커 유전자, 즉, CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 대장암 또는 난소암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
또한, 상기 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 단백질 수준 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 단백질과 이에 특이적인 항체 결합물은, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학법, 면역침전분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 정상대조군 샘플에서의 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 대장암 또는 난소암 환자 또는 상기 암으로 의심되는 환자에서의 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2로 이루어진 군 중에서 선택되는 2개 이상의 유전자 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 대장암 또는 난소암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 상기 대장암 또는 난소암의 예측 및 진단방법은 상기 본 발명에 따른 진단 마커를 이용하여 대장암과 난소암을 구별하여 진단할 수 있는 특징이 있는데, 즉, 상기 CK7, CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자들 중에서 CK7 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양이 정상대조군 시료에 비해 증가되어 있고, 반면 CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양은 정상대조군 시료에 비해 감소된 경우, 이를 난소암이 발병한 것으로 판정할 수 있다.
또한, 상기 CK7 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양이 정상대조군 시료에 비해 감소되어 있고, 반면 CK20, CDX2 또는 MUC2 유전자의 발현양 또는 단백질의 발현양은 정상대조군 시료에 비해 증가된 경우, 이를 대장암이 발병한 것으로 판정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
대장암 및 난소암 특이적인 유전자의 발현 분석
<1-1> 샘플 수득
서울 메리 병원으로부터 1996년 1월부터 2008년 7월까지 난소와 관련되어 점액성 차별을 보이는 22개의 원발성 난소 상피성 종양(POMA) 샘플 및 44개의 전이성 대장암(MCAO) 샘플을 수득하였고, 상기 점액성 차별은 종양세포에서 세포내 뮤신 소구체(globule)의 국소 분위의 존재에 의해 결정되었으며, 상기 샘플들은 2003 WHO의 지침에 따라 재분석 및 재분류하였다. 또한, 이때 경계성 점액성 종양 및 마이크로침윤 점액성 종양을 제외시켰으며, 상기 수득한 종양 샘플들의 환자의 평균 나이는 42세였고, 대장으로부터 전이성 점액 종양을 갖는 환자의 평균 나이는 47세였다. 또한, 상기 원발성 난소 상피성 종양 샘플들의 경우, 한 개의 샘플을 제외하고 다른 샘플들은 모두 수술 단계에서 얻은 샘플들로서, 13개의 샘플은 단계 1에 해당하고, 2개의 샘플은 단계 2, 5개의 샘플은 단계 3 및 1개의 샘플은 단계 4에 해당되었다. 또한, 22명의 원발성 난소 상피성 종양 환자들 중에서 19명은 수술 및 약물 처치를 수행한 환자였고, 3명의 환자들은 수술만 수행한 환자였다.
<1-2> 조직 어레이
상기 <1-1>에서 수득한 암 조직 샘플들을 대상으로 조직 어레이 블럿(tissue microarray block)을 제조하였는데, 즉, 정밀 기기(Micro Digital Co, Gunpo-si, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 파라핀으로 종양 조직을 임베드 시키고 수령 파라핀 블럿상에 조립하여 3mm의 코어 생검을 제조하였다. 이후 상기 조직을 4um 섹션으로 절단한 후, 당업계에서 사용되고 있는 방법인 헤마토크실렌-에오신을 이용한 염색법을 통해 조직 분석을 수행하였다.
<1-3> 면역조직화학 분석
상기 <1-2>에서 제조한 파라핀-임베드된 조직어레이의 4um 섹션을 탈파라핀화 시키고 알콜을 이용하여 재수화시켰으며, pH 6.0의 시트레이트 용액에서 10분간 초음파를 처리하였다. 이후 0.3% 과산화수소를 이용하여 조직내의 퍼옥시다제의 활성을 억제시켰다. 조직 어레이는 이후 DAKO ChemMateTM EnvisionTM 시스템(DAKO, Carpinteria, CA, USA)의 표준 방법에 따라 자동 면역조직 염색 기기를 이용하여 면역조직화학법을 수행하였다. 이때 사용한 항체들은 다음과 같다. 사이토케라틴 7(CK7)(1:50, OV-TL 12/30, DAKO), 사이토케라틴 20(CK20)(1:50, Ks20.8, DAKO), CEA(1:50, Il-7, DAKO), CDX2(1:100, CDX2-88, BioGenex, San Ramon, CA, USA), MUC2(1:100, Ccp58, Novocastra, Newcastle, UK), MUC5AC(1:100, CLH2, Novocastra) 및 알파-메틸아실-CoA 라세마제(AMACR)(1:100, rabbit polyclonal. Biocare medical. Walnut creek, CA, USA)를 사용하였다. 또한, 상기 섹션은 3-3‘디아미노벤지딘을 이용해서 가시화하였으며, 조직 어레이는 Mayer's 헤마토크실린을 이용하여 대비염색 하였다. 또한, 각 조직에서 발현된 CK7, CK20, CDX2, CEA, MUC2, MUC5AC 및 AMACR는 종양 세포 분획에서 나타나는 양성 세포질 염색 정도를 기초로 하여 분류하였으며, 즉, 1~10%의 염색정도는 그 발현이 음성인 것으로 판정하고, 11~50%는 국소적 양성인 것으로 판정하였으며, 50%를 초과할 경우에는 확산적 양성인 것으로 판정하였다.
또한, 본 실시예에서 수행한 모든 통계적 분석은 SPSS 버전 15.0(Systat, 시카고, 미국)을 이용하여 수행하였으며, x2 테스트는 POMA 및 MCAO의 면역조직화학분석 결과를 비교하는데 사용하였고, 생존 지속시간 분석은 수술시간부터 사망에 이르는 시간까지를 정의하였다. 또한 생존 곡선은 Kaplan 및 Meier 방법을 이용하여 플롯화하였고, 통계적 의미는 log-rank 테스트에 따라 결정하였으며, p value <0.05인 것을 유의적인 것으로 결정하였으며, 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112010031591598-pat00002
그 결과, 원발성 난소 상피성 종양(POMA) 및 전이성 대장암(MCAO) 조직 샘플을 대상으로 면역조직화학 분석을 통한 상기 암 조직에서 발현되는 CK7, CK20, CDX2, CEA, MUC2, MUC5AC 및 AMACR 유전자의 발현정도는 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, POMA의 경우, MUC2는 거의 발현되지 않는 것으로 나타났고(즉, 음성 100%), CK20(음성 54.5%) 및 CEA(음성 77.3%)는 국소적 양성인 것으로 나타났으며, CK7(음성 9.1%) 및 MUC5AC(음성 50%)는 양성인 것으로 나타났다. 한편, MCAO의 경우, MUC5AC는 항상 음성(음성 97.6%)인 것으로 나타났고, CK7은 대체적으로 음성(음성 82.9%)인 것으로 나타났으며, CDX2(음성 26.8%, 양성 73.2%) 및 MUC2(음성 48.8%, 양성 51.2%)는 국소적 양성인 것으로 나타났고, CK20(음성 24.4%, 양성 75.6%) 및 CEA(양성 41.5%)는 확산적 양상의 발현 패턴을 보이는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 환자로부터 수득한 조직 샘플에서 CK7 및 MUC5AC 유전자는 발현되지 않음과 동시에 CK20 및 CEA는 확산적 양성 발현을 보이고, CDX2, MUC2 및 AMACR 유전자도 양성 발현을 보일 경우, 이를 대장암이 발병된 것으로 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 상기 유전자들의 발현 양상 분석을 통해 대장암과 난소암을 구별하여 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 2>
난소암과 구별될 수 있는 대장암 특이적 발현양상을 보이는 유전자의 선별 나아가 본 발명자들은 상기 결과들을 토대로 원발성 난소 상피성 종양(POMA)과는 발현 양상이 상이한 전이성 대장암(MCAO) 특이적인 발현 양상을 보이는 유전자들을 선별하였고, 선별된 유전자들의 민감성, 특이성, 양성 발현 예상 수치 및 음성 발현 예상 수치를 통계학적 계산을 통해 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112010031591598-pat00003
그 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 대장암에서 특이적으로 발현 패턴을 보이는 유전자들 중, CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자가 각 대장암 조직에서 민감성과 특이성이 우수하고 발현 예상 수치가 우수하여 상기 유전자들을 난소암과 구별하여 대장암을 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
대장암 특이적 발현양상을 보이는 유전자들의 대장암 및 난소암에서의 발현분석
상기 실시예 2에서 선별된 대장암 특이 유전자인 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자들을 대상으로 대장암(MCAO) 조직 및 난소암 조직(POMA)에서 각각의 발현 양상을 비교하기 위해 상기 유전자들의 발현을 검출할 수 있는 항체들, 즉, 상기 실시예 1에서 사용된 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2에 대한 항체들을 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 원발성 난소 상피성 암 조직의 경우, CK7은 확산된 양성 발현 양상을 나타내었으며, 반면 CK20, CDX2 및 MUC2 모두는 음성 발현, 즉 단백질의 발현을 거의 확인할 수 없었다.
한편, 도 2에 나타낸 바와 같이, 전이성 대장암 조직의 경우, CK7은 음성 발현 양상을 보였고, CK20, CDX2 및 MUC2 모두는 확산된 양성 발현 패턴을 보이는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 선별한 상기 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자들을 난소암 및 대장암을 구별하여 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었으며, 특히 CK20, CDX2 및 MUC2 유전자가 동시에 발현되고 CK7 유전자는 발현되지 않을 경우, 대장암이 발병된 것 또는 대장암의 전이가 진행되고 있음을 예측 또는 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
선별된 유전자들의 조합에 따른 암 진단율 분석
나아가 본 발명자들은 상기 본 발명에서 선별한 대장암을 진단할 수 있는 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 유전자들에 대해 상기 유전자들을 조합하여 조합된 유전자를 마커로 사용하였을 경우, 각 조합에 따른 진단율을 분석함을 통해 대장암의 발병 정도를 가장 정확하게 진단할 수 있는 유전자 조합을 조사하였다. 이를 위해 암 샘플들은 상기 실시예 1에서 수득한 총 63개의 암 조직을 대상으로 실시하였고, 유전자의 조합은 하기 표 3과 같이 총 12개의 조합으로 구성하였으며, 각각의 암 조직에서 조합 유전자의 발현 양상을 분석하여 측정한 진단율 조사는 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 2003 WHO 지침서에 따라 수행하였다. 또한, 조사 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112010031591598-pat00004
그 결과, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 선별한 유전자들 중 하나 이상의 조합을 이용하여 MCAO의 진단율을 조사한 결과, 2개의 유전자 조합을 사용하였을 경우, CK7/CDX2이 71.4%의 정확도를 나타내어 2개의 다른 유전자 조합에 비해 가장 높은 진단율을 나타내었으며, 3개의 유전자 조합을 사용하였을 경우에는 CK7/CDX2/MUC2가 3개의 대른 유전자 조합을 사용한 경우에 배해 우수한 진단율(82.5%)를 나타내었다. 또한, 모든 유전자 조합의 경우에서 가장 높은 진단율을 나타낸 것은 CK7/CK20/CDX2/MUC2의 4개 유전자 조합을 사용한 경우에서 나타났으며(87.%), 반면 7개의 유전자를 모두 사용한 유전자 조합, 즉, CK7/CK20/CDX2/CEA/MUC2/MUC5AC/AMACR의 경우는 상기 4개의 유전자 조합에 비해 오히려 낮은 진단율(74.6%)을 보였다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 선별한 4개의 유전자인 CK7/CK20/CDX2/MUC2 유전자 모두를 사용할 경우 대장암의 발병을 효과적으로 예측 및 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 상기 유전자들을 난소암과 대장암을 구별할 수 있는 마커로도 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 CK7(cytokeratin 7) 유전자, 서열번호 2로 표시되는 CK20(cytokeratin 20) 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 CDX2(caudal type homeobox transcription factor 2) 유전자 및 서열번호 4로 표시되는 MUC2(mucin 2) 유전자로부터 발현되는 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2 단백질들의 수준을 측정하는 물질을 포함하고, 대장암 진단에 대해 87.3%의 정확도를 갖는 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 물질은 서열번호 1로 표시되는 CK7(cytokeratin 7) 유전자, 서열번호 2로 표시되는 CK20(cytokeratin 20) 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 CDX2(caudal type homeobox transcription factor 2) 유전자 및 서열번호 4로 표시되는 MUC2(mucin 2) 유전자로부터 발현되는 각각의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (a) 대장암으로 의심되는 환자의 생물학적 시료에 존재하는 서열번호 1로 표시되는 CK7(cytokeratin 7) 유전자, 서열번호 2로 표시되는 CK20(cytokeratin 20) 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 CDX2(caudal type homeobox transcription factor 2) 유전자 및 서열번호 4로 표시되는 MUC2(mucin 2) 유전자로부터 발현되는 단백질들의 양을 모두 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2의 단백질 양을 대장암이 발생하지 않은 정상대조군 시료에 존재하는 CK7, CK20, CDX2 및 MUC2의 단백질 양과 비교하는 단계를 포함하며;
    대장암으로 의심되는 환자의 생물학적 시료에서 CK7 단백질의 발현양이 정상대조군 시료에 비해 감소되고, CK20, CDX2 및 MUC2 단백질의 발현양은 정상대조군 시료에 비해 증가된 경우, 대장암이 발병한 것으로 판정하고,
    대장암에 대해 87.3%의 정확도를 갖는 것을 특징으로 하는,
    대장암을 예측 및 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대장암을 예측 및 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 측정은 면역조직화학법(immunohistochemistry)인 것을 특징으로 하는 대장암을 예측 및 진단하기 위하여 정보를 제공하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102316178B1 (ko) 2020-04-14 2021-10-22 서울대학교병원 난소암 환자의 암 재발율 또는 생존율 예측용 조성물
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8969372B2 (en) 2003-11-14 2015-03-03 Aptose Boisciences Inc. Aryl imidazoles and their use as anti-cancer agents
KR101171716B1 (ko) * 2011-12-14 2012-08-09 배재대학교 산학협력단 티오레독신 １을 유효성분으로 하는 난소암 또는 폐렴 진단용 조성물 및 이의 이용
US20150191791A1 (en) * 2012-07-05 2015-07-09 Lsip, Llc Fgfr2 fusion gene
US20150104392A1 (en) 2013-10-04 2015-04-16 Aptose Biosciences Inc. Compositions, biomarkers and their use in the treatment of cancer
WO2016123446A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 The Johns Hopkins University Label-free mr imaging of tumor malignancy
CA3081261A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Aptose Biosciences Inc. Aryl imidazoles for the treatment of cancer
US20200011871A1 (en) * 2018-07-05 2020-01-09 Edp Biotech Corporation Kits and methods for detecting markers
CN109734805B (zh) * 2019-01-03 2021-09-10 福州迈新生物技术开发有限公司 抗ck20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
KR102398735B1 (ko) * 2019-07-02 2022-05-18 연세대학교 산학협력단 면역분석을 이용한 대장암의 분자적 분류방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arch Pathol Lab Med., Vol. 123, No. 10, pages 909-916 (1999.10.) *
Hum Pathol., Vol. 31, No. 6, pages 672-677 (2000.06.) *
Mod Pathol., Vol. 18, No. 1, pages 19-25 (2005.01.) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102316178B1 (ko) 2020-04-14 2021-10-22 서울대학교병원 난소암 환자의 암 재발율 또는 생존율 예측용 조성물
KR20230159796A (ko) 2022-05-12 2023-11-22 서울대학교병원 세포외 소포체 유래 miRNA를 검출하는 제제를 포함하는 난소암 진단용 조성물

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