ITTO20080313A1 - Anticorpo monoclonale isolato o suo frammento legante l'antigene specifico di membrana della prostata, suoi coniugati e suoi usi - Google Patents

Anticorpo monoclonale isolato o suo frammento legante l'antigene specifico di membrana della prostata, suoi coniugati e suoi usi Download PDF

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Description

D E S C R I Z I O N E
La presente invenzione è relativa ad anticorpi monoclonali e loro frammenti leganti 1'antigene, di seguito definiti scFv, come reagenti per la diagnosi ed il trattamento di tumori alla prostata e 1'eradicazione/visualizzazione di cellule esprimenti alti livelli dell'antigene specifico di membrana della prostata (Prostate Specific Membrane Antigen), di seguito chiamato PSMA.
Il carcinoma prostatico è la forma più frequente di cancro nel sesso maschile (seguito dal carcinoma polmonare) e rappresenta la seconda causa di morte per tumore .
Il carcinoma prostatico è all'esordio un tumore organo-confinato; nel trattamento di questa forma del tumore, la terapia chirurgica di asportazione della prostata e delle vescicole seminali e la radioterapia sono efficaci.
Tuttavia qualora il tumore venga diagnosticato in stadio avanzato e nei casi in cui la patologia evolve verso forme più aggressive, metastatiche ed androgenoindipendenti , l'utilizzo di diversi approcci farmacologici è inefficace.
Pertanto in questi casi possono risultare quindi utili, al fine del trattamento di queste forme avanzate e metastatiche di carcinoma prostatico, le nuove strategie terapeutiche basate sull'immunoterapia passiva e specificamente sugli anticorpi monoclonali (moAb).
Per l'applicazione di tale terapia occorre individuare antigeni tumore-associati (TAA) , cioè molecole espresse in modo specifico dal tessuto neoplastico, potenzialmente utilizzabili come target per la terapia immunologica.
Recenti studi suggeriscono che 1'antigene specifico di membrana della prostata (PSMA, ProstateSpecific Membrane Antigen), per alcune sue caratteristiche, possa rappresentare il bersaglio antigenico ideale nel carcinoma della prostata.
Il PSMA è una glicoproteina di circa 100 kD con un corto dominio intracellulare (aminoacidi 1-18), un dominio transmembrana (aminoacidi 19-43) e un dominio extracellulare (aminoacidi 44-750). E' espresso dalle cellule epiteliali prostatiche, sia normali che cancerose, ma con un livello di espressione notevolmente aumentato nel carcinoma prostatico; questo livello tende ad aumentare con la gravità e l'avanzare della patologia.
Al contrario, tessuti normali extraprostatici , come ad esempio i tubuli prossimali del rene, il duodeno e il colon, presentano una limitata espressione dell'antigene PSMA.
Come bersaglio delle immunoterapie antitumorali, il PSMA presenta il vantaggio di essere prevalentemente espresso a livello della prostata e di essere una proteina transmembrana presente sulla superficie cellulare che viene internalizzata dalla membrana cellulare attraverso vescicole endocitiche rivestite di clatrina. Tali caratteristiche rendono il PSMA sfruttabile per la terapia con immunotossine.
Vantaggiosamente, il legame ài anticorpi o frammenti anticorpali al dominio extracellulare favorisce questo processo di endocitosi.
Sono noti numerosi anticorpi monoclonali in grado di legare il PSMA. Ad esempio il 7E11, approvato dalla FDA per lo studio di metastasi esprimenti PSMA, è un anticorpo monoclonale in grado di legare la porzione intracellulare del PSMA. Svantaggiosamente però il 7E11 non è in grado di legare cellule vitali, ma solo cellule necrotiche o apoptotiche all'interno di una massa tumorale.
Successivamente sono stati prodotti anticorpi monoclonali quali J591, J415, J533 ed E99 in grado di riconoscere epitopi presenti nel dominio extracellulare del PSMA e quindi capaci di legare anche cellule vitali .
In particolare il J591 è stato utilizzato per numerosi studi in vitro e in modelli animali sia a livello diagnostico che terapeutico ed è tuttora in fase di sperimentazione clinica.
In ultimo, EP1726650 descrive un ulteriore anticorpo monoclonale ed il suo frammento scFv in grado di legare PSMA.
Nel seguito con il termine "frammento dell'anticorpo legante 1'antigene" si intende uno o più frammenti di tale anticorpo che mantiene la capacità di legare specificamente il PSMA.
Per una migliore comprensione della presente invenzione, essa viene ora descritta anche con riferimento alle figure allegate che illustrano:
- la Figura 1 un Western Blotting eseguito su un U sato di cellule LNCaP (PSMA+) e PC-3 (PSMA-), utilizzando il moAb D2/B e come controllo 1'anticorpo J591 già ampiamente descritto in letteratura;
- la figura 2 un saggio Western Blotting condotto su lisato di cellule LNCaP (PSMA+) su PC-3, cellule prive del bersaglio antigenico PSMA, impiegando scFv D2/B;
- le figura 3 a-d citofluorimetrie di D2/B e scFv D2/B su cellule PSMA+;
- la figura 4 a-d citofluorimetrie di D2/B e scFv D2/B su cellule PSMA-;
- la figura 5 confronto della capacità di legame a cellule LNCaP (PSMA+) di Ab J591, Ab D2/B, scFv D2/B;
la figura 6 imaging in vivo con Ab D2/B coniugato al fluoroforo Cy5.5.
Scopo della presente invenzione è quindi quello di trovare nuovi anticorpi monoclonali per il trattamento del carcinoma prostatico, che siano selettivi per le cellule tumorali, che consentano una diagnosi più precoce ed accurata e che costituiscano opzioni terapeutiche che permettano realmente di incidere sulla biologia della malattia in fase avanzata e metastatica in modo da fronteggiare con maggior successo una problematica socio-sanitaria di dimensioni sempre crescenti e dalle incerte prospettive di soluzione con i presidi terapeutici attuali.
Secondo la presente invenzione tale scopo viene raggiunto mediante un anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante 1'antigene secondo la rivendicazione 1, un suo coniugato secondo la rivendicazione 5, una composizione farmaceutica comprendente lo stesso secondo la rivendicazione 8. Viene inoltre fornito l'uso dell'anticorpo e del suo frammento, del coniugato e della composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11.
Sulle cellule prostatiche il PSMA è espresso con una specifica struttura terziaria e quaternaria e gli anticorpi ottenuti con un PSMA isolato e denaturato non riconoscono in modo efficiente il PSMA espresso sulle cellule tumorali. Vantaggiosamente gli anticorpi e i loro frammenti secondo la presente invenzione sono in grado di legare con alta affinità il PSMA nella sua forma nativa e possono quindi essere usati efficacemente sia in terapia che in diagnostica. In particolare, gli anticorpi monoclonali e i loro frammenti secondo l'invenzione sono in grado di legare PSMA in modo selettivo riducendo così gli effetti collaterali di una terapia non selettiva.
I frammenti di anticorpo utilizzati sono frammenti di anticorpo a singola catena (scFv) che hanno dimensioni e immunogenicità inferiori rispetto al corrispondente anticorpo. Tuttavia grazie alla piccola dimensione e alla minore affinità per 1'antigene, hanno dimostrato un aumento della permeabilità nel microcircolo e una più facile interazione con 1'antigene nel sito di legame dell'anticorpo.
Gli anticorpi monoclonali o i loro frammenti comprendono una seq. nucleotidica e aminoacidi ca peculiare a livello delle regioni variabili VH e VK che ne determinano specificità e affinità. Le sequenze nucleotidiche del moAb D2/B e del suo frammento scFV sono riportate come SEQ. ID. No: 1, 2, 3, 4. La sequenza specificata codifica per un frammento anticorpale dotato di buone capacità di legame all'antigene bersaglio PSMA
L' anticorpo monoclonale o un suo frammento come sopra descritti possono essere coniugati con un principio attivo per ottenere composti utilizzabili per radio immunoterapia o imaging o ancora immunotossine ricombinanti .
Preferibilmente il principio attivo è un agente di marcatura, più preferibilmente un radionuclide selezionato tra<188>Re,<131>I,<125>I,<123>I,<187>Re,<m>ln,<90>Y, 99m 177
Tc, Lu o nanoparticelle fluorescenti.
Alternativamente 1' anticorpo monoclonale o un suo frammento possono essere coniugati con un agente citotossico, preferibilmente selezionato tra PE40, catena A della ricina, diantina, saporina.
Infine 1'anticorpo monoclonale o un suo frammento possono essere coniugati con biotina per sfruttare l'alta affinità dell'interazione avidina-biotina o con altre coppie molecolari che permettano protocolli terapeutici a piu' step. In particolare, il coniugato con la biotina trova applicazione in tecniche di direzionamento in caso di trattamenti che prevedono l'uso di radioisotopi. Infatti vari studi preclinici hanno evidenziato la superiorità del pretargentig rispetto al targeting diretto; ad esempio Goldenberg D.M. et al. (J. Clin. Oncol., 24:823-834, 2006)
Si è evidenziato che la somministrazione di un coniugato dell'anticorpo secondo l'invenzione o di un suo frammento con biotina, prima della somministrazione di un radiofarmaco (Streptavidina e poi Biotinaradiomarcata), consente una migliore distribuzione al sito tumorale del radiofarmaco riducendone così gli effetti collaterali.
L'anticorpo monoclonale, i suoi frammenti e i suoi coniugati possono essere formulati in composizioni farmaceutiche con opportuni eccipienti e possono essere utilizzati per la preparazione di un medicamento per il trattamento o la diagnosi di tessuti tumorali overesprimenti 1'antigene PSMA, un tumore, preferibilmente il tumore della prostata.
Per ottenere anticorpi monoclonali si procede con: immunizzazione di topi di ceppo Balb/c, fusione delle cellule presenti nella milza dell'animale immunizzato con cellule di ibridoma, selezione in terreno HAT, identificazione degli ibridomi policlonali riconoscenti 1'antigene di interesse, clonaggio, ricaratterizzazione per specificità/affinità degli ibridomi ora monoclonali, adattamento in terreni di crescita privi di HAT. Gli anticorpi sono poi purificati dal terreno di coltura dell'ibridoma mediante tecniche biochimiche standard (cromatografia di affinità) .
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi.
ESEMPI
Gli anticorpi monoclonali e gli scFv dell'invenzione sono stati caratterizzati mediante citof luorimetria a flusso e con western blot sulle seguenti linee cellulari di CaP umano, fornite dalla ATCC (American Type Colture Collection, Rockville, MD) : metastasi linfonodale di CaP (LNCaP), metastasi cerebrale di CaP (DU145) , metastasi ossea di CaP (PC-3). Tali linee cellulari sono state mantenute in RPMI 1640 arricchito con siero fetale bovino (FBS) 10%, glutamina 2 mM, penicillina e streptomicina 100 U/ml. La temperatura di incubazione è stata di 37°C ed è stata usata C02ad una concentrazione del 5%. Le cellule sono state ripiastrate 2-3 volte alla settimana, staccandole con una soluzione di PBS/EDTA 0,02% o PBS/Tripsina 0,05%/EDTA 0,02%.
Nel seguito si farà riferimento agli anticorpi secondo l'invenzione con 1'acronimo "D2/B" e "scFv D2/B" .
ESEMPIO 1
Preparazione dei moAb
L'anticorpo è stato ottenuto previa immunizzazione di topi Balb/c con U sati di membrana di cellule esprimenti 1'antigene PSMA e con la forma ricombinante dello stesso antigene, mediante la tecnologia dell 'ibridoma. Cellule ricavate dalla milza degli animali immunizzati comprendenti linfociti B sono state fuse con cellule di mieloma. Gli ibridomi prodotti, clonati per diluizione limite, caratterizzati per specificità ed affinità, crescono in opportuno terreno senza siero fetale. Gli anticorpi sono purificati dal sovranatante di coltura mediante cromatografia di affinità .
ESEMPIO 2
Test Elisa
Il test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) è una tecnica immunochimica utilizzata per rilevare la presenza di una molecola mediante il suo riconoscimento con anticorpi specifici.
Questo test è stato utilizzato per determinare 1'isotipo dei moAb anti-PSMA precedentemente prodotti. Il kit usato (Hybridoma Subisotyping Kit, Calbiochem) ha permesso di identificare 1'isotipo anticorpale tra le sottoclassi igGl, lgG2a, lgG2b, lgG3 , igM ed igA; per l'esecuzione del test si rimanda alla scheda di utilizzo del prodotto.
I risultati, che sono riportati nella Tabella 1, mostrano come l'anticorpo D2/B sia una IgGl; la riga 2 della tabella (IgGl) presenta un valore di assorbanza di 4,0, contro un valore del controllo negativo (solo terreno di coltura) di 0,8. Il valore di assorbanza del D2/B, relativo alle altre sottoclassi di IgG è paragonabile a quello del controllo negativo. Nel test come controllo positivo è stato utilizzato siero murino che, come si evince dalla terza colonna, possiede anticorpi di quasi tutti gli isotipi.
Tabella 1
ESEMPIO 3
Dal moAb al scFv D2/B e relativa produzione.
Estratto mediante TRIzol (Gibco BRL) l'RNA totale dell 'ibridoma D2/B, si è proceduto alla sintesi del cDNA utilizzando il kit SuperScript cDNA Synthesis (Invitrogen) . Mediante PCR con opportuni primers Forward e Revers atti ad identificare le combinazioni capaci di amplificare le regioni variabili VH e VK del moAb D2/B, si sono identificate le coppie utili e quindi si è proceduto al clonaggio delle VH e VK in un vettore plasmidico che introduce all'N-terminale della proteina un Tag di 6 istidine. Il sequenziamento del vettore ha permesso di identificare la sequenza delle regioni VH e VK (SEQ ID 1, 2).
La produzione del scFv D2/B avviene in batteri E.Coli ceppo HB2151 cresciuti a 37°C in agitazione (225 rpm) in terreno 2xTY addizionato di ampicillina 10C^g/ml, glucosio 0,1% ed indotti, raggiunta un'assorbanza a 600nm di 0,8, con IPTG ImM finale per 3h a 37°C. I batteri raccolti mediante centrifugazione a 5.000 rpm 4°C per 10 min. sono trattati per Ih con il tampone Tris-HCl 30 mM pH=8,0+EDTA ImM+saccarosio 20%; ottenuto per separazione in centrifuga il sovranatante che è la frazione periplasmatica si procede alla purificazione del scFv D2/B mediante cromatografia su resina NiNTA (Novagen) eluendo con Tris 20mM pH=8, 0+250 mM Imidazolo .
La purezza della proteina è stata verificata in SDS-PAGE.
ESEMPIO 4
Western Blotting
Al fine di verificare la potenzialità di riconoscimento in Western Blot dell 'anticorpo D2/B è stato eseguito un SDS-PAGE su gel di poliacrilamide 10% dei lisati cellulari di LNCaP PSMA+ e PC-3 PSMA-. La lisi è stata precedentemente effettuata mediante sonicazione in una soluzione di Tris 20 mM, NaCl pH 8,0 150 mM, TRITRON X 100 1% e inibitori delle proteasi (Complete Protease Inhibitor Cocktail, Roche). In ogni pozzetto sono stati caricati χ μΐ di lisato corrispondenti a circa 100 pg di proteine totali; per la procedura di esecuzione del gel e le condizioni di separazione delle proteine ci si riferisce al protocollo di Laemmli. Successivamente le proteine separate sul gel sono state trasferite mediante un campo elettrico su una membrana di nitrocellulosa (procedura definita, Western Blot).
Per verificare il riconoscimento dell'antigene PSMA si è proceduto all'incubazione per tutta la notte a 4°C in leggera agitazione della membrana in presenza dell 'anticorpo primario anti-PSMA D2/B e dell'Ab di controllo J591 entrambi alla concentrazione di 10-20 pg/ml in soluzione al 5% di latte scremato in TBST. L'eccesso di anticorpo è stato eliminato mediante 4 lavaggi in TBST.
E' stato poi utilizzato un anticorpo secondario anti-topo HRP diluito 1:1.000 in latte scremato al 5% in TBST; l'incubazione ha avuto una durata di 1 ora a temperatura ambiente in agitazione.
Dopo 3 lavaggi in TBST e 1 lavaggio in PBS, il segnale è stato rilevato tramite sviluppo con chemioluminescenza (ECL Amersham Biosciences, UK).
La Figura 1 mostra un Western Blotting condotto su U sato di cellule LNCaP (PSMA+) e PC-3 (PSMA-), utilizzando come controllo 1'anticorpo J591 già ampiamente descritto in letteratura; come si può osservare il D2/B riconosce 1'antigene presente nel lisato cellulare come il J591 (corsie 1 e 2 rispettivamente) . Si può inoltre vedere che su lisato di cellule antigene-negative (PC-3) non vi è segnale (corsie 3 e 4 per D2/B e J591, rispettivamente).
Similmente è stata verificata la funzionalità di riconoscimento in Western Blot del scFv D2/B, utilizzando gli stessi lisati cellulari, ma impiegando in questo caso come anticorpo secondario un anti-myc Tag ottenuto in coniglio (Sigma) e come anticorpo terziario un anti-coniglio-HRP (Sigma). Il scFv D2/B riconosce PSMA nel U sato di LNCaP e non da' segnale se saggiato su lisato di PC-3, cellule prive del bersaglio antigenico PSMA. (Figura 2)
ESEMPIO 5
Immunofluorescenza
La linea cellulare LNCaP (PSMA+) è stata fatta crescere su vetrino coprioggetto polilisinato in una piastra da 24 pozzetti. Al momento di procedere con 1'immunofluorescenza è stato aspirato il terreno e sono stati eseguiti 2 lavaggi con PBS.
Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 2%, applicata per 10 minuti a temperatura ambiente e sono stati eseguiti 3 ulteriori lavaggi con PBS per eliminare l'eccesso di fissante.
Le cellule sono state incubate a temperatura ambiente per 1 ora in presenza dell'anticorpo primario α-PSMA alla concentrazione di 10 pg/ml. Sono stati utilizzati 1'anticorpo D2/B, il 7E11 per un confronto con un anticorpo già studiato, un α-MHC di classe I come controllo positivo e un controllo isotipico, come controllo negativo.
L'eccesso di anticorpo è stato eliminato mediante 4 lavaggi con una soluzione di BSA 0.2% in PBS.
L'incubazione con 1'anticorpo secondario a-mouse FITC (fluoresceina, Beckman Coulter, USA) diluito 1:200 è avvenuta per 1 ora a temperatura ambiente.
Dopo 2 ulteriori lavaggi con PBS sono state aggiunte 2 gocce di PBS/glicerolo 1:1 ed il vetrino è stato montato e sigillato.
Il risultato è stato osservato al microscopio a fluorescenza Axioskopo 20 (Cari Zeis, Germania).
Il monoclonale D2/B è in grado di riconoscere specificamente cellule LnCAP (PSMA+) ma non evidenzia segnale utilizzando cellule prive dell'antigene PSMA (es. linea cellulare DU145).
ESEMPIO 6
Immunoistochimica su sezioni paraffinate
Sezioni di CaP umano paraffinate sono state utilizzate per valutare la capacità di riconoscimento di tessuti tumorali del moAb D2/B in confronto al già noto anticorpo J591. Le sezioni sparaffinate in stufa a 60°C (30'-60'), trattate con Xilolo 4' per 5 volte, reidratate sequenzialmente in etanolo: 100%, 95%, 75% 3' per 2 volte ciascuno ed immerse in H20 per 5' sono state incubate per smascherare 1'antigene PSMA in pentola a pressione in tampone citrato lOmM PH 6 per 15' a 95°C. Dopo 3 lavaggi in PBS 5', una incubazione in PBS 3% H202per 6' ed ulteriori 3 lavaggi in PBS 5', si sono saturati i preparati con PBS+BSAl% 30-40 min; l'incubazione con Ab primario (D2/B o J591, entrambi 2μρ/πι1) è stata condotta O/N a 4°C; dopo 3 lavaggi con PBS 5' è stato utilizzato il kit EnVision Detection System HRP/DAB (Dako) seguendo le istruzioni riportate dalla ditta.
La controcolorazione è stata eseguita con Ematossilina di Gill per 5", lavando poi con abbondante H20, successivamente con una scala alcolica sequenziale di etanolo al 75%, 80%, 95%, 100% e poi con Xilolo 5'per 4 volte. I vetrini sono stati montati con resina ed osservati al microscopio ottico.
ESEMPIO 7
Citofluorimetria
La citofluorimetria è una metodica che permette di valutare alcuni parametri fisici e chimici di particelle contenute in una sospensione. Tramite l'uso di una luce laser e di rilevatori ottici, il sistema raccoglie la fluorescenza emessa da un fluorocromo (sostanza organica in grado di emettere una fluorescenza se opportunamente eccitata) legato ad un anticorpo monoclonale specifico per molecole espresse sulla superficie e/o nel citoplasma della cellula in esame. Il segnale raccolto viene quindi convertito in un segnale analogico/digitale.
Questa metodica è stata utilizzata per verificare alcuni parametri molto importanti quali:
1) La specificità, cioè la capacità dei moAb prodotti (D2/B e scFv D2B) di legare 1'antigene sulla membrana di cellule positive e di non legarsi in maniera aspecifica a cellule negative;
2) La concentrazione saturante i siti anticorpali espressi su cellule LNCaP, rispetto ad un anticorpo di controllo il J591.
Cellule LNCaP e PC-3 in incubazione a 37°C sono state staccate con Tripsina/EDTA per circa 4 minuti a 37°C, neutralizzate con terreno completo, lavate 2 volte con 10 mi di una soluzione fredda di PBS/BSA 0,2%, centrifugando sempre a 1000 rpm, per 5 min. a 4°C ed alla fine incubate in numero di 200.000-300.000/0 .5ml con D2/B, J591 ed un controllo isotipico per 1 ora a 4°C. Dopo 2 lavaggi con 3 mi di PBS/BSA 0,2% alla temperatura di 4°C per eliminare l'eccesso di anticorpo primario, le cellule, risospese in 100 μΐ di PBS/BSA 0,2%, sono state incubate per 30 minuti a 4°C in presenza di una concentrazione saturante (circa 1 yg/100 μΐ) di anticorpo secondario, IgG di capra anti-IgG di topo, marcato con FITC (fluoresceina).
Finita l'incubazione, eseguito un ulteriore lavaggio e risospe le cellule in 500 pi di PBS/BSA 0,2% si è proceduto all'analisi con un citofluorimetro (BD FACSCanto) . Per evidenziare il legame di scFv D2/B come anticorpo secondario si è invece usato un anti-myc Tag di mouse e poi come anticorpo terziario IgG di capra anti-IgG di topo, marcato con FITC,
I parametri presi in considerazione analizzando i dati sono stati: la fluorescenza media della popolazione cellulare (MFI) e la percentuale di cellule che si posizionavano nei canali compresi tra i valori di fluorescenza 500 e 256.000, considerando positive le cellule entro questo range.
Per verificare la capacità di legame del moAb, le cellule LNCaP sono state incubate con concentrazioni scalari degli anticorpi anti-PSMA D2/B e scFvD2B e con l'anticorpo J591 di cui è nota l'affinità. In base ai valori di MFI ottenuti è stata costruita una curva di binding nella quale il valore del 100% di saturazione dei siti antigenici è stato fatto corrispondere alla concentrazione in cui si è registrato il massimo valore di fluorescenza.
Come si può evincere dalle Figure 3.A e 3.B gli anticorpi D2/B e scFv D2/B riconoscono 1'antigene espresso sulla membrana della linea cellulare LNCaP con un valore di MFI di circa 8.000 e 1.500 rispettivamente. Le Figure 3.C e 3.D sono i rispettivi controlli negativi. Con la stessa metodica, si è valutata anche la specificità dei moAb andando ad analizzare il legame aspecifico a cellule antigenenegative, PC-3 (metastasi ossea di CaP); i risultati, riassunti nelle Fig. 4.A e 4.B evidenziano la mancanza di legame di moAb D2/B e di scFv D2/B, rispettivamente. Le Fig. 4.C e 4.D sono i rispettivi controlli negativi.
La misura della concentrazione di J591, D2/B e scFv D2/B saturante i siti antigenici (PSMA) presenti su cellule LNCaP è riportata in Figura 5.
ESEMPIO 8
Sintesi delle immunotossine coniugate chimicamente alla RTA
Lo schema di sintesi delle immunotossine prodotte è stato il seguente.
L'anticorpo D2/B da coniugare è stato fatto passare su una colonna di affigel blu per eliminare quella frazione di moAb capace di legarsi alla resina che contaminando la preparazione della Immunotossina ne inficierebbe i test di citotossicità . Il D2/B dializzato in PBS, è stato coniugato allo SMPT(4-succinimidilossicarbonil-a-metil-a- (2-piridiltio) toluene, Pierce, Rockford IL) disciolto alla concentrazione 10 inM in dimetilf ormamide anidra, utilizzando un rapporto IgG:derivatizzante 1:2,5 circa.
L'eccesso di cross-linker è stato poi eliminato mediante gel filtrazione su colonnine PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Svezia) .
Il numero dei gruppi SH inseriti, corrispondenti al numero di possibili legami anticorpo-tossina è stato determinato in base al fatto che il DTT, riducendo i gruppi tiolici, libera il piridin-2-tione la cui quantità è valutata spettrofotometricamente mediante lettura a 343 nm. Questo valore risultava essere compreso tra 1,2 e 1,5.
La RTA ricombinante, prodotta e purificata secondo il protocollo descritto da Chignola et al. (J.Biol .Chem. , 270:23345-51, 1995) è stata trattata con DTT (ditiotreitolo) 25 mM a temperatura ambiente per 2 ore per ridurre le cisteine e renderle reattive per la coniugazione .
Il DTT è stato successivamente eliminato mediante colonnine PD-10 e la tossina, ridotta e purificata, è stata concentrata con Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA).
La reazione di coniugazione tra 1'anticorpo D2/B derivatizzato e la RTA è stata fatta avvenire per 48 ore a temperatura ambiente.
L'immunotossina così ottenuta è stata purificata mediante gel filtrazione su una colonna TSK3000SW (Beckman, San Ramon, CA), con flusso 0,5 ml/min. e PBS come eluente.
I picchi corrispondenti ai PM 180-150 (D2/B+1 RTA)e 240-210 kDa (Ab+2/3 RTA) sono stati ulteriormente purificati su affigel blu, utilizzando un gradiente salino da 150 mM a 1 M di NaCl in tampone fosfato 5 mM. Questo perché la sola tossina ha un peso di 30 kDa, mentre 1'anticorpo di 150 kDa.
E' stata quindi utilizzata una colonnina di affigel blu perché la sua matrice è capace di legare enzimi che utilizzano come coenzima il NAD o che hanno come substrato sequenze nucleotidiche, come la RTA; per questi motivi essa è in grado di legare in modo specifico la RTA coniugata al D2/B e di lasciar passare 1'anticorpo libero.
Le frazioni contenenti proteina sono state riunite, concentrate su Centricon-10, dializzate contro PBS. La concentrazione è stata stimata allo spettrofotometro e quindi i vari pool sono stati sterilizzati per filtrazione .
ESEMPIO 9
Produzione delle immunotossine di fusione genica scFv D2/B-PE40 (la sequenza nucleotidica SEQ. ID. No. 5.
La sequenza del scFv D2/B è stata clonata in un vettore pETlld tra i siti Nco I e Hind III; a valle del sito Hind III nel vettore è inserita la sequenza genica della tossina PE40.
La proteina di fusione viene prodotta in batteri E.coli ceppo BL21(DE3)pLysS precedentemente trasformati con il vettore plasmidico codificante per la Immunotossina; i batteri cresciuti a 37°C sotto agitazione (225rpm) in terreno LB addizionato di glucosio 5%, MgS040,05% ampicillina 100μg/ml, d oramienicolo 34μg/ml sono indotti, raggiunta un'assorbenza a 600nm di 0,8, con IPTG ImM finale. Dopo 3h i batteri raccolti mediante centrifugazione a 5.000 rpm sono lisati mediante incubazione e sonicazione in tampone di lisi (Tris 20mM pH=7,5+EDTA 10mM+Triton-Xl00 1%) addizionato di lisozima 0,lmg/ml, PMSF 0,1 mM, inibitori di proteasi (Roche). Mediante centrifugazione a 10.000 rpm a 4°C si raccolgono i corpi di inclusione (CI) che vengono lavati 2 volte nello stesso tampone di lisi e poi solubilizzati alla concentrazione di 20mg/ml in tampone CAPS 50mM pH=ll addizzionato di N-laurilsarcosina 0,8-1% finale e DTT ImM. Eliminati per centrifugazione eventuali residui insolubili, la proteina è rifoldata mediante dialisi ripetute. Dialisi I e II sono di 12h a 4°C in Tris 20mM pH=8,5+DTT 0,lmM+PMSF 0,1 mM, dialisi III e IV sono di 12h in Tris 20mM pH=8,5+PMSF 0,1 mM, dialisi V 24h in Tris 0,1 M pH=8,0+L-glutatione ridotto 5mM+L-glutatione ossidato 0,5 mM+L-Arginina 0,4 M+PMSF 0,1 mM, dialisi VI 24h in Tris 2OmM pH=7,4+PMSF 0,lmM.
La proteina è stata quindi purificata mediante 2 passaggi su colonne QAE da 10ml (Bio-Rad) utilizzando un cromatografo FPLC (Bio-Rad) ed impiegando un gradiente lineare di NaCl da 0 a 0,5 M in Tris 2OmM pH=7,4 della duarata di 200 mi al flusso di 1 mi/min, con frazioni raccolte del volume di 2,5 mi.
La purezza della proteina è stata valutata in SDS-PAGE e l'identificazione è stata confermata mediante Western Blot.
ESEMPIO 10
Citotossicità su cellule in monostrato
E' stato valutato l'effetto citotossico dell 'immunoconiugato prodotto in cellule PSMA positive e negative a livello di inibizione della proliferazione cellulare, anche a confronto con gli effetti della sola tossina ,
Le cellule LNCaP e PC-3 sono state distribuite in piastre da 96 pozzetti in terreno completo a concentrazioni tali da raggiungere, nei pozzetti di controllo, dopo le 32 ore del test, una condizione dì subconfluenza .
Alcuni pozzetti sono stati trattati con concentrazioni scalari delle immunotossine D2/B-RTA (ottenuta per coniugazione chimica mediante SMPT) o scFv D2/B-PE40 (ottenuta mediante fusione genica) o come controllo della immunotossina J591-RTA (ottenuta per coniugazione chimica mediante SMPT), altri con la sola RTA, PE o la PE40, il solo moAb D2/B o scFv D2/B per un tempo di incubazione di 22 ore a 37°C.
Ad ogni pozzetto è stato addizionato 1 pCi [metil-3H]-timidina (61,7 Ci/mmlo, NEN DuPont) e la piastra è stata incubata per ulteriori 10 ore sempre a 37°C.
Le cellule sono state raccolte su filtri con un cell-harvester e la radioattività è stata misurata mediante scintillazione liquida con un β-counter.
L'effetto citocida è stato espresso in termini di incorporazione di timidina triziata rispetto ad un controllo di cellule non trattate; i risultati sono stati rielaborati in termini di percentuale di inibizione della proliferazione. Quanto minore era l'entità dell'emissione radioattiva, minore incorporazione di timidina triziata, tanto maggiore poteva essere considerata l'inibizione della crescita cellulare .
E' stata quindi calcolata la IC50, cioè la concentrazione di farmaco in grado di inibire del 50% la proliferazione cellulare; misura che poteva essere facilmente comparata con la IC50 relativa alle altre molecole utilizzate nel saggio di citotossicità.
TABELLA 2
ESEMPIO 11
scFv D2/B monobiotinilati
scFv D2/B monobiotinilati sono stati ottenuti clonando tra i siti NcoI-NotI lo scFv; nel vettore in posizione 3' rispetto al sito Noti sono state inserite in sequenza: una sequenza peptidica ricavata dalla regione "cerniera" delle IgA, una regione peptidica definita BAD (Biotin Acceptor Domain) ed una regione clivabile riconosciuta dalle proteasi Enterochinasi e Fattore X. La regione "cerniera" delle IgA funge da spacer tra lo scFv e la regione BAD, che viene monobiotinilata in una reazione catalizzata dall'enzima BirA. La produzione della proteina biotinilata è stata condotta in batteri trasformati con il plasmide di interesse e capaci di biotinilare il sito BAD; mediante induzione con IPTG ed aggiunta di biotina al terreno di coltura si ottengono le proteine di interesse comprendenti ciascuna la porzione scFv con la desiderata specificità unitamente ad una molecola di biotina.
La proteina scFv-biotina è stata purificata su resina NiNTA in condizioni parzialmente denaturanti per meglio facilitare l'esposizione del Tag N terminale di 5 Istidine (His) e quindi il legame alla colonna. La purezza della proteina ottenuta è stata analizzata mediante SDS-PAGE mentre la corretta identità è stata confermata in Western Blot mediante utilizzio di Ab anti-scFv, Ab anti-His Tag e di streptavidina-HRP.
E' stata quindi valutata la funzionalità del scFvbiotinilato da noi sintetizzato, mediante analisi al FACS condotta su cellule PSMA+ (LNCaP) e PSMA- (PC-3). La MIF su LNCaP è di 161, 728 e 314 rispettivamente per il controllo negativo (solo Avidina-FITC), l'Ab D2/B biotinilato chimicamente ed il scFv-D2/B biotinilato enzimaticamente, mentre i rispettivi valori su PC-3 sono 132, 151, 180.
ESEMPIO 12
Esempio di imaging in vivo con D2/B marcato con tracccianti fluorescenti
Riguardo alla possibilità di utilizzare metodiche di immuno-imaging in vivo basati sull'uso di D2/B o scFv D2/B marcati con tracers fluorescenti topi SCID immunodeficienti sono stati iniettati con cellule LNCaP premarcate in vitro un D2/B legato al fluorocromo Cy5.5 secondo il protocollo del produttore. Tale metodica ci ha consentito di rilevare un impianto s.c. di 7,5*10<6>cellule PSMA+, ma si pensa di poter arrivare a sensibilità maggiori (IO<6>cellule).Figura 6
ESEMPIO 13
Esempio di coniugazione con un isotopo radioattivo
La scelta del chelante da coniugare all'Ab è subordinata alla scelta dei radionuclidi che si intendono impiegare; inoltre il chelante deve possedere un gruppo funzionale disponibile per il legame all'Ab. Ad esempio il DOTA può' coniugarsi direttamente per mezzo di uno dei 4 carbossili liberi; l'Ab concentrato, lavato con 1% DTPA (pH=5,0), dializzato in tampone fosfato 0,1M pH=7,0 e fatto reagire con esteri in forma attiva del DOTA. Gli esteri attivi si ottengono solubilizzando DOTA 0,361 mmol (146 mg) assieme a 0,313 mmol (36 mg)di N-idrossisuccinimide in 2 mi di H20, aggiustando a pH=7,3 con NaOH prima di aggiungere 10 mg di l-etil-3- (dimetilaminopropil)carbodiimide. La miscela viene incubata per 1 h in ghiaccio prima di aggiungere l'Ab da derivatizzare. L'eccesso di DOTA è eliminato o per gel filtrazione (colonne PD-10)o per centrifugazione (concentratori Amicon) , usando una soluzione di ammonio acetato 0,3 M. La marcatura con<m>In viene condotta aggiungendo<1:L1>InC13 in 0,01M HCl alla soluzione 0,3 M in ammonio acetato del DOTA-Ab. Dopo 20 min. a 37°C la miscela di reazione è separata su colonne Biogel-Ρβ equilibrate in 1%HSA-PBS. La quantità di radioisotopo libero ancora presente viene valutata mediante cromatografia TLC.
SEQUENCE LISTING
<110> Università di Verona
<120> ANTICORPO MONOCLONALE ISOLATO 0 SUO FRAMMENTO LEGANTE L'ANTIGENE
SPECIFICO DI MEMBRANA DELLA PROSTATA, SUOI CONIUGATI E SUOI USI
<130> 840-07
<160> 6
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> Mouse
<220>
<221> v_region
<222> (1) ..(366)
<223> Ab D2/B variable heavy chain
<220>
<221> misc_feature
<222> (97).. (114)
<223> CDRHl
<220>
<221> misc_feature
<222> (157).. (204)
<223> CDRH2
<220>
<221> misc_feature
<222> (301).. (336)
<223> CDRH3
<400> 1
atggccgagg tgaagctcca ggagtcagga cctggcctcg ttaaaccttc tcagtctctg 60 tctctcacct gctctgtcac tggctactcc atcaccagtg gttattactg gaactggatc 120 cggcagtttc caggaaacaa actggagtgg atgggctcca taagtttcga cggtaacaat 180 aactacaacc catctctcag aaatcgaatc tccatcactc gtgacacatc taagaaccag 240 ttttttctga agttgaattc tgtgactact gaagacacag ctacatatta ctgtgcaaga 300 gagggagatt actacggtag tagcttcttt acttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctcg 366
<210> 2
<211> 327
<212> DNA
<213> Mouse
<220>
<221> v_region
<222> (1)..(327)
<223> Ab D2/B variable Tight chain
<220>
<221> misc_feature
<222> (76) ..(108)
<22B> CDRLl
<220>
<221> misc_feature
<222> (154).. (174)
<223> CDRL2
<220>
<221> misc_feature
<222> (271).. (294)
<223> CDRL3
<400> 2
gcactcgaca ttgtgatgac tcagtctcca gcttcactgt ctgcatctgt gggagaaact 60
gtcaccctca catgtggagc aagtgagaat atttacggtg ctttaaattg gtatcagcgg 120
aaacagggaa aatctcctca actcctgatc tatggagcaa ccaacttggc agatggcatg 180
tcatcgaggt tcagtggcag cggatctggt agacagtatt ctctcaagat cagtagcctg 240
catcctgacg atgttgcaac gtattactgt caaaatgtgt ttcgtactta cacgttcgga 300
ggggggacaa agttggaaat aaaacgg 327
<210> 3
<211> 822
<212> DNA
<213> Mouse
<220>
<221> CDS
<222> (1) ..(822)
<223> scFv D2/B
<220>
<221> V_region
<222> (1) ..(366)
<223> SCFV D2/B variab!e heavy chain
<220>
<221> V_region
<222> (415).. (741)
<223> SCFV D2/B vari abl e T i ght chai n
<400> 3
atg gcc gag gtg aag ctc cag gag tea gga cct ggc ctc gtt aaa cct 48 Met Ala Giu Val Lys Leu Gin Giu Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro 1 5 10 15
tet cag tet ctg tet ctc acc tgc tet gtc act ggc tac tee atc acc 96 Ser Gin ser Leu ser Leu Thr cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser ile Thr
20 25 30
agt ggt tat tac tgg aac tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg 144 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
35 40 45
gag tgg atg ggc tee ata agt ttc gac ggt aac aat aac tac aac cca 192 Giu Trp Met Gly ser ile ser Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro
50 55 60
tet ctc aga aat ega atc tee atc act cgt gac aca tet aag aac cag 240 Ser Leu Arg Asn Arg ile Ser ile Thr Arg Asp Thr ser Lys Asn Gin
65 70 75 80
ttt ttt ctg aag ttg aat tct gtg act act gaa gac aca gct aca tat 288 Phe Phe Leu Lys Leu Asn ser Val Thr Thr Giu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
tac tgt gca aga gag gga gat tac tac ggt agt agc ttc ttt act tac 336 Tyr Cys Ala Arg Giu Gly Asp Tyr Tyr Gly ser ser Phe Phe Thr Tyr
100 105 110
tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tcg agt ggt gga ggc ggt tea 384 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
ggc gga ggt ggc tct gga ggt ggc ggt agt gca ctc gac att gtg atg 432 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Ala Leu Asp Ile vai Met
130 135 140
act cag tct cca gct tea ctg tct gca tct gtg gga gaa act gtc acc 480 Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala ser Val Gly Giu Thr vai Thr
145 150 155 160
ctc aca tgt gga gca agt gag aat att tac ggt gct tta aat tgg tat 528 Leu Thr Cys Gly Ala Ser Giu Asn ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
cag cgg aaa cag gga aaa tct cct caa ctc ctg atc tat gga gca acc 576 Gin Arg Lys Gin Gly Lys ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Gly Ala Thr
180 185 190
aac ttg gca gat ggc atg tea tcg agg ttc agt ggc agc gga tct ggt 624 Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
aga cag tat tct ctc aag atc agt agc ctg cat cct gac gat gtt gca 672 Arg Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp Asp vai Ala
210 215 220
acg tat tac tgt caa aat gtg ttt cgt act tac acg ttc gga ggg ggg 720 Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn Val Phe Arg Thr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
aca aag ttg gaa ata aaa cgg gcg gcc gca cat cat cat cac cat cac 768 Thr Lys Leu Giu ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His
245 250 255
ggg gcc gca gaa caa aaa ctc atc tea gaa gag gat ctg aat ggg gcc 816 Gly Ala Ala Giu Gin Lys Leu ile ser Giu Giu Asp Leu Asn Gly Ala
260 265 270
gca tag 822 Ala
<210> 4
<211> 273
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 4
Met Ala Giu vai Lys Leu Gin Giu ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro
1 5 10 15
Ser Gin ser Leu Ser Leu Thr cys Ser vai Thr Gly Tyr Ser ile Thr
20 25 30
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45
Giu Trp Met Gly ser ile Ser Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro 50 55 60
Ser Leu Arg Asn Arg ile Ser ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin 65 70 75 80 Phe Phe Leu Lys Leu Asn ser vai Thr Thr Giu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Giu Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Thr Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125
Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Ala Leu Asp Ile vai Met 130 135 140
Thr Gi n Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Giu Thr Val Thr 145 150 155 160 Leu Thr cys Gly Ala Ser Giu Asn ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gin Arg Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Gly Ala Thr 180 185 190
Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205
Arg Gin Tyr Ser Leu Lys ile Ser ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala 210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn vai Phe Arg Thr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Giu ile Lys Arg Ala Ala Ala His His Hi s HÌ S HÌS HÌ S
245 250 255
Gly Ala Ala Gi u Gin Lys Leu ile Ser Giu Giu Asp Leu Asn Gly Ala 260 265 270
Ala
<210> 5
<211> 1830
<212> DNA
<213> Mouse and Bacteria
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1830)
<223> scFv D2/B-PE40
<220>
<221> V_region
<222> (1)..(738)
<223> SCFV D2/B variable heavy and light chain region
<220>
<221> misc_feature
<222> (739). .(1830)
<223> PE40 Toxin sequence
<400> 5
atg gcc gag gtg aag ctc cag gag tea gga cct ggc ctc gtt aaa cct 48 Met Ala Giu Val Lys Leu Gin Giu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
tet cag tet ctg tet ctc acc tgc tet gtc act ggc tac tee atc acc 96 Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr cys ser Val Thr Gly Tyr ser ile Thr
20 25 30
agt ggt tat tac tgg aac tgg atc cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg 144 ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
35 40 45
gag tgg atg ggc tee ata agt ttc gac ggt aac aat aac tac aac cca 192 Giu Trp Met Gly Ser ile Ser Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro
50 55 60
tet ctc aga aat ega atc tee atc act cgt gac aca tet aag aac cag 240 Ser Leu Arg Asn Arg ile Ser ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin
65 70 75 80
ttt ttt ctg aag ttg aat tet gtg act act gaa gac aca get aca tat 288 Phe Phe Leu Lys Leu Asn ser vai Thr Thr Giu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
tac tgt gca aga gag gga gat tac tac ggt agt agc ttc ttt act tac 336 Tyr Cys Ala Arg Giu Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser ser Phe Phe Thr Tyr
100 105 110
tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc teg agt ggt gga ggc ggt tea 384 Trp Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr Val Ser ser Gly Gly Gly Gly ser
115 120 125
ggc gga ggt ggc tet gga ggt ggc ggt agt gca ctc gac att gtg atg 432 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Asp ile Val Met
130 135 140
act cag tet cca get tea ctg tet gca tet gtg gga gaa act gtc acc 480 Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Giu Thr Val Thr
145 150 155 160
ctc aca tgt gga gca agt gag aat att tac ggt get tta aat tgg tat 528 Leu Thr Cys Gly Ala ser Giu Asn ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
cag cgg aaa cag gga aaa tet cct caa ctc ctg atc tat gga gca acc 576 Gin Arg Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Gly Ala Thr
180 185 190
aac ttg gca gat ggc atg tea teg agg ttc agt ggc agc gga tet ggt 624 Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Ary Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
aga cag tat tct ctc aag atc agt agc ctg cat cct gac gat gtt gca 672 Arg Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Ser ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala
210 215 220
acg tat tac tgt caa aat gtg ttt cgt act tac acg ttc gga gag gag 720 Thr Tyr Tyr cys Gin Asn Val Phe Arg Thr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
aca aag ttg gaa ata aaa gct ttc ggc ggc agc ctg gcc gcg ctg acc 768 Thr Lys Leu Giu ile Lys Ala Phe Gly Gly ser Leu Ala Ala Leu Thr
245 250 255
gcg cac cag gct tgc cac ctg ccg ctg gag act ttc acc cgt cat cgc 816 Ala His Gin Ala cys His Leu Pro Leu Giu Thr Phe Thr Arg His Arg
260 265 270
cag ccg cgc ggc tgg gaa caa ctg gag cag tgc ggc tat ccg gtg cag 864 Gin Pro Arg Gly Trp Giu Gin Leu Giu Gin cys Gly Tyr Pro Val Gin
275 280 285
cgg ctg gtc gcc ctc tac ctg gcg gcg cgg ctg tcg tgg aac cag gtc 912 Arg Leu vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Val
290 295 300
gac cag gtg atc cgc aac gcc ctg gcc agc ccc ggc agc ggc ggc gac 960 Asp Gin vai ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp
305 310 315 320
ctg ggc gaa gcg atc cgc gag cag ccg gag cag gcc cgt ctg gcc ctg 1008 Leu Gly Giu Ala Ile Arg Giu Gin Pro Giu Gin Ala Arg Leu Ala Leu
325 330 335
acc ctg gcc gcc gcc gag agc gag cgc ttc gtc cgg cag ggc acc ggc 1056 Thr Leu Ala Ala Ala Giu Ser Giu Arg Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly
340 345 350
aac gac gag gcc ggc gcg gcc aac gcc gac gtg gtg agc ctg acc tgc 1104 Asn Asp Giu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val ser Leu Thr Cys
355 360 365
ccg gtc gcc gcc ggt gaa tgc gcg ggc ccg gcg gac agc ggc gac gcc 1152 Pro vai Ala Ala Gly Giu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala
370 375 380
ctg ctg gag cgc aac tat ccc act ggc gcg gag ttc ctc ggc gac ggc 1200 Leu Leu Giu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Giu Phe Leu Gly Asp Gly
385 390 395 400
ggc gac gtc agc ttc agc acc cgc ggc acg cag aac tgg acg gtg gag 1248 Gly Asp vai Ser Phe ser Thr Arg Gly Thr Gin Asn Trp Thr Val Giu
405 410 415
cgg ctg ctc cag gcg cac cgc caa ctg gag gag cgc ggc tat gtg ttc 1296 Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Giu Giu Arg Gly Tyr Val Phe
420 425 430
gtc ggc tac cac ggc acc ttc ctc gaa gcg gcg caa agc atc gtc ttc 1344 vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Giu Ala Ala Gin Ser ile vai Phe
435 440 445
ggc ggg gtg cgc gcg cgc agc cag gac ctc gac gcg atc tgg cgc ggt 1392 Gly Gly vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala ile Trp Arg Gly
450 455 460
ttc tat atc gcc ggc gat ccg gcg ctg gcc tac ggc tac gcc cag gac 1440 Phe Tyr ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp
465 470 475 480
cag gaa ccc gac gca cgc ggc cgg atc cgc aac ggt gcc ctg ctg cgg 1488 Gi n Gi u Pro Asp Ala Arg Gly Arg ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg
485 490 495
gtc tat ccg cgc tcg agc ctg ccg ggc ttc tac cgc acc agc ctg 1536 vai Tyr Pro Arg Ser ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr ser Leu
500 505 510
acc ctg gcc gcg ccg gag gcg gcg ggc gag gtc gaa cgg ctg atc ggc 1584 Thr Leu Ala Ala Pro Gi u Ala Ala Gly Giu Val Giu Arg Leu Ile G ly
515 520 525
cat ccg ctg ccg ctg cgc ctg gac gcc atc acc ggc ccc gag gag gaa 1632 Hi s Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala ile Thr Gly Pro Giu Giu Giu
530 535 540
ggc cgc ctg gag acc att ctc ggc tgg ccg ctg gcc gag cgc acc 1680 Gly Arg Leu Giu Thr ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Giu Arg Thr
545 550 555 560
gt att ccc tcg gcg atc ccc acc gac ccg cgc aac gtc ggc 1728 va ile Pro Ser Ala ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn vai Gly
565 570 575
gac ctc gac ccg tee agc atc ccc gac aag gaa cag gcg atc agc gcc 1776 Asp Leu Asp Pro ser ser ile Pro Asp Lys Giu Gin Ala ile ser Ala
580 585 590
ctg ccg gac tac gcc agc cag ccc ggc aaa ccg ccg cgc gag gac ctg 1824 Leu Pro Asp Tyr Ala ser Gi n Pro Gly Lys Pro Pro Arg Giu Asp Leu
595 600 605
aag taa 1830 Lys
<210> 6
<211> 609
<212> PRT
<213> Mouse and Bacteria
<400> 6
Met Ala Gi u Val Lys Leu Gin Giu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 1 5 10 15
Ser Gi n ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser ile Thr
20 25 30
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
35 40 45
Giu Trp Met Gly ser ile Ser Phe Asp Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Leu Arg Asn Arg ile Ser ile Thr Arg Asp Thr ser Lys Asn Gin
65 70 75 80
Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser vai Thr Thr Giu Asp Thr Ala Thr Tyr
Tyr Cys Ala Arg Giu Gly Asp Tyr Tyr Gly ser ser Phe Phe Thr Tyr 100 105 110
Trp Gly Gi n Gly Thr Leu Val Thr vai Ser ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Asp ile vai Met 130 135 140
Thr Gin ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala ser Val Gly Giu Thr vai Thr 145 150 155 160 Leu Thr Cys Gly Ala Ser Giu Asn ile Tyr Gly Ala Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gin Arg Lys Gin Gly Lys ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Gly Ala Thr 180 185 190
Asn Leu Ala Asp Gly Met ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205
Arg Gin Tyr ser Leu Lys ile Ser Ser Leu Hi s Pro Asp Asp Val Ala 210 215 220
Thr Tyr Tyr cys Gin Asn vai Phe Arg Thr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Giu ile Lys Ala Phe Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr
245 250 255
Ala Hi s Gin Ala cys His Leu Pro Leu Giu Thr phe Thr Arg Hi s Arg 260 265 270
Gin Pro Arg Gly Trp Giu Gin Leu Giu Gin cys Gly Tyr Pro Val Gin 275 280 285
Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu ser Trp Asn Gin Val 290 295 300
Asp Gin Val ile Arg Asn Ala Leu Ala ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp 305 310 315 320 Leu Gly Giu Ala Ile Arg Giu Gin Pro Giu Gin Ala Arg Leu Ala Leu
325 330 335
Thr Leu Ala Ala Ala Giu Ser Giu Arg Phe Val Arg Gin Gly Thr Gly 340 345 350
Asn Asp Gi u Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp vai vai Ser Leu Thr cys Pro Val Ala Ala Gly Giu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala 370 375 380
Leu Leu Giu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Gi u Phe Leu Gly Asp Gly 385 390 395 400 Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gin Asn Trp Thr Val Giu
405 410 415
Arg Leu Leu Gi n Ala Hi s Arg Gin Leu Giu Gi u Arg Gly Tyr Val Phe 420 425 430
Val Gly Tyr Hi s Gly Thr Phe Leu Giu Ala Ala Gin ser ile Val Phe 435 440 445
Gly Gly vai Arg Ala Arg ser Gin Asp Leu Asp Ala ile Trp Arg Gly 450 455 460
Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp 465 470 475 480 Gin Giu Pro Asp Ala Arg Gly Arg ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg
485 490 495
vai Tyr Val Pro Arg Ser ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu 500 505 510
Thr Leu Ala Ala Pro Gi u Ala Ala Gly Gi u vai Giu Arg Leu ile Gly 515 520 525
Hi s Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala ile Thr Gly Pro Giu Giu Giu 530 535 540
Gly Gly Arg Leu Gi u Thr ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Giu Arg Thr 545 550 555 560 Val Val ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn vai Gly Gly
565 570 575
Asp Leu Asp Pro Ser ser ile Pro Asp Lys Giu Gin Ala ile Ser Ala 580 585 590
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Giu Asp Leu 595 600 605
Lys

Claims (14)

  1. R I V E N D I C A Z I O N I 1. Anticorpo monoclonale D2/B isolato legante 1'antigene specifico di membrana della prostata (PSMA) caratterizzato dal fatto di comprendere la sequenza nucleotidica delle regioni variabili VH e Vk (SEQ. ID. No. 1, 2.
  2. 2. Frammento anticorpale scFv D2/B legante 1'antigene secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere una seq. di almeno 741 nucleotidi consecutivi, che ne caratterizzano le regioni variabili VH e VL leganti 1'antigene, di SEQ. ID . No. 3.
  3. 3 . Anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante 1'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di legare PSMA nella sua forma nativa presente sulla superficie di cellule tumorali.
  4. 4. Anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante 1'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di legare selettivamente PSMA.
  5. 5 . Coniugato principio attivo-anticorpo comprendente un anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante 1'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti coniugato con un principio attivo selezionato nel gruppo costituito da agente di marcatura, un agente citotossico o un agente veicolante .
  6. 6. Coniugato secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detto agente di marcatura è un radionuclide o nanoparticelle fluorescenti.
  7. 7. Coniugato secondo la rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto che detto agente di marcatura è selezionato nel gruppo costituito da<188>Re,<131>I,<125>I,<123>I,<187>Re,<m>ln,<90>Y,<99m>Tc,<177>LU .
  8. 8. Coniugato secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detto agente citotossico è PE40, catena A della ricina, saporina e diantina.
  9. 9. Coniugato scFv D2/B-PE40 costituito dalla SEQ. ID. No. 5.
  10. 10. Coniugato secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto agente veicolante è biotina o nanoparticelle.
  11. 11. Composizione farmaceutica comprendente un anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante 1' antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 od un coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 10.
  12. 12 . Uso di un anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante 1'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o di un coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 10 o di una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 per la preparazione di un medicamento per il trattamento o la diagnosi di un tumore.
  13. 13. Uso secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detto tumore è un tumore alla prostata.
  14. 14. Uso di un anticorpo monoclonale isolato o un suo frammento legante l'antìgene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o di un coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 10 o di una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 per la vascolatura PSMA+ di tumori di qualunque istotipo .
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