ES2400082T3 - Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo de unión al antígeno de membrana específico de la próstata, sus conjugados y usos - Google Patents

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Abstract

Un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) que se une a un anticuerpo monoclonal D2/B aislado caracterizado porque comprende una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de las regiones variables VH y VK de la SEQ ID NO: 1 y 2.

Description

Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo de unión al antígeno de membrana específico de la próstata, sus conjugados y usos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a fragmentos de unión al antígeno de los mismos definidos como scFv a partir de ahora en el presente documento, como reactivos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores de próstata y la erradicación/detección de las células que expresan elevados niveles de antígenos de membrana específicos de próstata, denominados como PSMA a partir de ahora en el presente documento.
El cáncer de próstata es la forma más frecuente de cáncer en varones (seguido por el cáncer de pulmón) y representa la segunda causa de muerte debida a tumor.
Tras el inicio, el cáncer de próstata es un tumor confinado al órgano; la eliminación quirúrgica de la próstata y de las vesículas seminales y la radioterapia son eficaces en el tratamiento de esta forma de tumor.
Sin embargo, cuando el tumor se diagnostica en una etapa avanzada y en los casos en los que la enfermedad evoluciona a formas metastásicas más agresivas e independientes de andrógenos, el uso de diferentes soluciones farmacológicas no es eficaz.
En estos casos, pueden resultar por tanto útiles nuevas estrategias terapéuticas basadas en la inmunoterapia pasiva y en anticuerpos monoclonales específicos (moAbs) para tratar estas formas de cáncer de próstata avanzadas y metastásicas.
Para aplicar esta terapia, es necesario identificar los antígenos asociados a tumores (AAT), es decir, las moléculas que se expresan en exceso por el tejido neoplásico y que se pueden usar potencialmente como dianas para la terapia inmunológica.
Recientes estudios sugieren que el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) puede representar el antígeno ideal diana en el cáncer de próstata debido a sus características.
PSMA es una glicoproteína de aproximadamente 100 kDa con un dominio intracelular corto (aminoácidos 1-18), un dominio transmembrana (aminoácidos 19-43) y un dominio extracelular (aminoácidos 44-750). PSMA se expresa en células epiteliales prostáticas tanto normales como cancerosas, aunque con un nivel de expresión que está considerablemente aumentado en el cáncer de próstata; este nivel tiende a aumentar con la gravedad y progresión de la enfermedad.
Por otra parte, los tejidos extraprostáticos normales, tales como por ejemplo, los túbulos proximales del riñón, el duodeno y el colon tienen una expresión del antígeno PSMA limitada.
Como diana de inmunoterapias antitumorales, PSMA tiene la ventaja de expresarse principalmente en la próstata y de ser una proteína transmembrana presente sobre la superficie celular e internalizada desde la membrana celular a través de vesículas endocíticas revestidas con clatrina. Estas características permiten usar PSMA para la terapia con inmunotoxinas. De forma ventajosa, la unión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos al dominio extracelular promueve este proceso de endocitosis.
Antecedente de la técnica
Se conocen muchos anticuerpos monoclonales que se unen a PSMA. Por ejemplo, 7E11, que ha sido homologado por la FDA para el estudio de metástasis que expresa PSMA, es un anticuerpo monoclonal que se une a la porción intracelular de PSMA. Desafortunadamente, 7E11 no se une a células viables, sino solo a células necróticas o apoptóticas en el interior de una masa tumoral.
Se han producido posteriormente anticuerpos monoclonales tales como J591, J415, J533 y E99. Estos anticuerpos reconocen epítopos en el dominio extracelular de PSMA y se unen por tanto a células viables.
J591 se ha usado en particular para diversos estudios in vitro y en modelos animales de forma diagnóstica y terapéutica y sigue estando bajo estudio clínico experimental.
Finalmente, el documento EP1726650 da a conocer otro anticuerpo monoclonal y un fragmento scFv del mismo que se une a PSMA.
A partir de ahora en el presente documento, el término “fragmento del anticuerpo de unión al antígeno” indica uno o
más fragmentos de este anticuerpo que mantienen/mantiene la capacidad de unirse específicamente a PSMA.
Breve descripción de los dibujos
Para una mejor comprensión de la presente invención, esta se describe ahora también con referencia a las figuras que la acompañan, en las que:
-
La figura 1 muestra una transferencia Western llevada a cabo en un lisado de células LNCaP (PSMA+) y PC-3 (PSMA-), usando moAb D2/B y un anticuerpo J591 (dado ya ampliamente a conocer en la bibliografía) como control;
-
la figura 2 muestra una transferencia Western llevada a cabo en un lisado de células LNCaP (PSMA+) y células PC-3, que no expresan la diana antigénica del PSMA, usando scFv D2/B;
-
la figura 3a-d muestra los análisis citofluorimétricos de D2/B y scFv D2/B en células PSMA+;
-
la figura 4a-d muestra los análisis citofluorimétricos de D2/B y scFv D2/B en células PSMA-;
-
la figura 5 muestra una comparación de la capacidad de unión a células LNCaP (PSMA+) de Ab J591, Ab D2/B, scFv D2/B;
-
la figura 6 muestra la formación de imágenes in vivo con un Ab D2/B conjugado con el fluoróforo Cy5.5.
Divulgación de la invención
Es un objetivo de la presente invención encontrar nuevos anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cáncer de próstata que sean selectivos para células tumorales, permitan un diagnóstico más fácil y más preciso y representen opciones terapéuticas que permitan afectar verdaderamente la biología de la enfermedad en una etapa avanzada y metastásica con el fin de hacer frente más eficazmente a un problema social y médico cada vez mayor que tiene perspectivas de solución inciertas con las actuales medidas terapéuticas.
De acuerdo con la presente invención, este objetivo se consigue mediante un anticuerpo monoclonal aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, uno de sus conjugados de acuerdo con la reivindicación 5, una composición farmacéutica que comprende el mismo de acuerdo con la reivindicación 11. Se proporciona también el uso del anticuerpo y de uno de sus fragmentos, del conjugado y de la composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 12 y 14.
Descripción detallada de la invención
En las células prostáticas, PSMA se expresa con una estructura terciaria y cuaternaria específicas y los anticuerpos obtenidos con un PSMA aislado y desnaturalizado no reconocen eficazmente el PSMA expresado en las células tumorales. Los anticuerpos y sus fragmentos de acuerdo con la presente invención se unen ventajosamente a PSMA en su forma natural con una elevada afinidad y pueden por tanto usarse eficazmente en el tratamiento y el diagnóstico. En particular, los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de acuerdo con la invención se unen selectivamente a PSMA reduciendo de esta forma los efectos secundarios de un tratamiento no selectivo.
Los fragmentos de anticuerpos usados son fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) que tienen un tamaño más pequeño y una inmunogenicidad más baja comparados con el anticuerpo correspondiente. Sin embargo, en virtud del tamaño pequeño y de la afinidad más baja por el antígeno, muestran un aumento de la permeabilidad en la microcirculación y una mejor interacción con el antígeno en el sitio de unión del anticuerpo.
Los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos comprenden un nucleótido peculiar y una secuencia de aminoácidos en las regiones variables VH y VK que determinan la especificidad y la afinidad de los mismos. Las secuencias de nucleótidos del moAb D2/B y del fragmento scFv del mismo se indican como la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4. La secuencia especificada codifica un fragmento de anticuerpo que tiene una buena capacidad de unión con el antígeno PSMA diana.
El anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos, tal como se ha dado a conocer anteriormente, se puede conjugar con un principio activo para obtener compuestos que se pueden usar para radioinmunoterapia o formación de imágenes o también inmunotoxinas recombinantes.
El principio activo es preferiblemente un agente de marcado, de forma más preferible un radionucleido seleccionado entre 188Re, 131I, 125I, 123I, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, o nanopartículas fluorescentes.
Como alternativa, el anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos se puede conjugar con un agente citotóxico, seleccionado preferiblemente entre PE40, una cadena de ricina A, diantina, saporina.
Finalmente, el anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos se puede conjugar con biotina para aprovechar la elevada afinidad de la interacción avidina-biotina o con otras parejas moleculares que permiten protocolos terapéuticos de múltiples etapas. En particular, el conjugado con biotina se puede aplicar en técnicas de direccionamiento en el caso de tratamientos que incluyen el uso de radioisótopos. Concretamente, diversos estudios preclínicos han resaltado la superioridad del predireccionamiento con respecto al direccionamiento directo; por ejemplo; Goldenberg D.M. y col. (J. Clin. Oncol., 24: 823-834, 2006).
Se ha demostrado que la administración de un conjugado con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención o uno de sus fragmentos con biotina, antes de la administración de un agente radiofarmacéutico (estreptavidina y a continuación biotina radiomarcada) permite una mejor distribución del agente radiofarmacéutico en el sitio del tumor reduciendo de esta manera los efectos secundarios.
El anticuerpo monoclonal, sus fragmentos y sus conjugados se pueden formular en composiciones farmacéuticas con los excipientes adecuados y se pueden usar para la preparación de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de los tejidos tumorales que expresan en exceso el antígeno PSMA, un tumor, preferiblemente un tumor de la próstata.
El procedimiento para obtener anticuerpos monoclonales es como sigue:
Se inmunizaron ratones Balb/c, los esplenocitos de los animales se fusionaron con células de hibridoma, las células resultantes se seleccionaron en medio HAT, se identificaron los hibridomas policlonales que reconocían el antígeno diana, se clonaron y se caracterizaron de nuevo para evaluar la especificidad/afinidad de los nuevos hibridomas monoclonales, que se adaptaron finalmente para crecer en medio exento de HAT. Los anticuerpos se purificaron a continuación a partir del medio de cultivo del hibridoma por medio de técnicas bioquímicas normalizadas (cromatografía de afinidad).
Otras características de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente divulgación de algunas realizaciones proporcionadas por medio de ilustraciones no limitativas.
Ejemplos
Los anticuerpos monoclonales y los scFv de la presente invención se han caracterizado mediante citometría de flujo y transferencia Western en las siguientes líneas de células de PCa humano, proporcionadas por la ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD): metástasis linfonodales de PCa (LNCaP), metástasis cerebral de PCa (DU145), metástasis ósea de PCa (PC-3). Estas líneas de células se han mantenido en RPMI 1640 enriquecido con suero bovino fetal al 10 % (FBS), glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y estreptomicina. La temperatura de incubación fue de 37 ºC y la concentración de CO2 fue del 5 %. Las células se dividieron 2-3 veces por semana, separándolas con una solución de EDTA/PBS al 0,02 % o EDTA al 0,02 % y tripsina/PBS al 0,05 %.
Se hará referencia a partir de ahora en el presente documento a los anticuerpos de acuerdo con la presente
invención tales como “D2/B” y “scFv D2/B”.
Ejemplo 1
Preparación de anticuerpos moAb
Se obtuvo el anticuerpo tras la inmunización de ratones Balb/c con fracciones de membranas plasmáticas de células que expresaban el antígeno PSMA y con la forma recombinante de PSMA, siguiendo los protocolos establecidos que aprovechan la tecnología de los hibridomas. Poblaciones de esplenocitos que contenían linfocitos B de animales inmunizados se fusionaron con células de mieloma. Los hibridomas obtenidos, clonados mediante dilución limitante y caracterizados para evaluar la especificidad y la afinidad, se hicieron crecer en medio exento de suero adecuado. Los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad.
Ejemplo 2
Ensayo ELISA
El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es una técnica usada para detectar la presencia de una molécula por su reactividad con anticuerpos específicos.
Este ensayo se usó para determinar el isotipo de los moAb dirigidos contra PSMA anteriormente obtenidos. El kit usado (Hybridoma Subisotyping Kit, Calbiochem) ha permitido la identificación del isotipo del anticuerpo entre los subtipos de IgG1, IgG2, IgG2b, IgG3, IgM e IgA, el procedimiento del ensayo se describe en la hoja de información técnica anexa al kit ELISA usado.
Los resultados, notificados en la Tab. 1 muestran que el anticuerpo D2/B es un IgG1; el número de fila 2 de la tabla (IgG1) muestra un valor de la absorbancia de 4,0, en oposición a un control negativo (solo el medio de cultivo) de 0,8. Los valores de la absorbancia de D2/B de los otros subtipos de IgG corresponden al valor del control negativo. Como control positivo en el ensayo los inventores usaron suero de murino que, tal como se evidenció a partir de los datos notificados en el número de columna 3, contiene todos los isotipos de inmunoglobulinas.
Tabla 1
D2/B
Control negativo Suero de ratón
IgM
0,56 0,54 2,36
IgG1
4,00 0,81 1,75
IgG2a
0,41 0,32 2,42
IgG2b
0,30 0,25 1,84
IgG3
0,30 0,28 1,24
IgA
0,25 0,23 0,18
Ejemplo 3
Del anticuerpo monoclonal al fragmento D2/B scFv y su producción
Tras la extracción del ARN total del hibridoma D2/b con TRIzol (Gibco), se sintetizó el ADNc usando el kit de Síntesis de ADN Superscript (Invitrogen). Usando parejas adecuadas de cebadores inversos y directos y la PCR, los inventores identificaron las combinaciones de cebadores capaces de amplificar las regiones VH y Vk variables del D2/B moAb, se identificaron las combinaciones óptimas y las regiones VH y Vk se clonaron en un vector plasmídico adjunto a una etiqueta 6-His en el extremo N de la proteína. La secuenciación del vector ha permitido la identificación de las secuencias de VH y Vk (SEQ ID 1, 2).
La producción de scFv tiene lugar en células de E. coli (cepa HB2151) que se hacen crecer a 37 ºC con agitación (225 rpm) en medio 2xTY al que se adicionan 100 µg/ml de ampicilina, glucosa al 0,1 %, y se indujeron las bacterias a una D.O. de 0,8 (600 nm) con una concentración final de IPTG 1 mM durante 3 h a 37 ºC. Se cosecharon las células mediante centrifugación a 5000 rpm a 4 ºC durante 10 min y se expusieron durante 1 h a Tris-HCl 30 mM pH = 8,0 + EDTA 1 mM + sacarosa al 20 %; el sobrenadante (que contenía la fracción periplásmica) se recogió y el scFv D2/B se purificó mediante cromatografía usando una matriz NiNTA (Novagen) eluyendo con Tris 20 MM pH 0 8,0 + tampón imidazol 250 mM.
Se evaluó la pureza de la proteína mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 4
Transferencia Western
Para verificar el reconocimiento potencial del anticuerpo D2/B en las transferencias Western, se llevó a cabo un SDS-PAGE (poliacrilamida al 10 %) sobre células PSMA+ LNCaP y células PSMA- PC-3. Se llevó a cabo la lisis celular mediante sonicación de las células que se volvieron a suspender en una solución de Tris 20 mM, NaCl 150 mM pH 8,0 que contenía Triton X-100 al 1 % e inhibidores de la proteasa (Cóctel Completo Inhibidor de la Proteasa, Roche). Se cargaron las ranuras con 20 µl de lisado que correspondían aproximadamente a 100 µg de proteínas totales; se llevó a cabo el SDS-PAGE de acuerdo con el protocolo descrito por Laemmli. Posteriormente, las proteínas separadas mediante electroforesis en gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa aplicando un campo eléctrico /procedimiento establecido, transferencia Western).
Para verificar el reconocimiento del antígeno PSMA por el anticuerpo D2/B, la membrana de nitrocelulosa se incubó toda la noche a 4 ºC con agitación suave en presencia del anticuerpo primario D2/B o del anticuerpo J591 del control, usados ambos a la concentración de 10-20 µg/ml en una solución al 5 % de leche desnatada. Se eliminó el anticuerpo en exceso mediante 4 lavados usando el tampón TBST.
A continuación se usó un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón conjugado con HRP y diluido 1:1000 en leche desnatada al 5 % en TBST; la incubación duró 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
Después de 3 lavados en TBST y 1 lavado en PBS, la señal se detectó mediante una reacción quimioluminiscente (ECL Amersham Biosciences, Reino Unido).
La figura 1 muestra una transferencia Western llevada a cabo con un lisado de células LNCaP (PSMA+) y PC-3 (PSMA-), usando el anticuerpo J591, ya descrito en la bibliografía, como control positivo; tal como se muestra en la figura, el anticuerpo D2/B es capaz de reconocer el antígeno presente en el lisado celular así como el anticuerpo J591 (bandas 1 y 2, respectivamente). Se puede apreciar también que no se puede observar la señal usando un lisado de células negativas al antígeno (PC-3) (bandas 3 y 4 para el anticuerpo D2/B y el anticuerpo J591, respectivamente).
Igualmente, se evaluó la capacidad de reconocimiento del anticuerpo scFv D2/B en la transferencia Western usando los mismo lisados celulares que anteriormente, pero desvelando la unión de un anticuerpo de conejo dirigido contra la etiqueta myc (Sigma) seguido por un anticuerpo dirigido contra la IgG de conejo conjugado con HRP (Sigma). El scFv D2/B detectó PSMA en los lisados de células LNCaP, pero no se observó la señal con lisados de células PC-3, ya que carecen de la diana antigénica PSMA (Figura 2).
Ejemplo 5
Inmunofluorescencia
Se hicieron crecer células LNCaP (PSMA+) en cubreobjetos revestidos de polilisina en una placa de microvaloración de 24 pocillos. Antes de llevar a cabo el ensayo de inmunofluorescencia, se descartó el medio de cultivo celular y se lavaron las células dos veces con PBS.
A continuación se fijaron las células con paraformaldehído al 2 % durante 10 min a temperatura ambiente y las células se lavaron adicionalmente con PBS durante tres veces para deshacerse del fijador en exceso.
Seguidamente, las células se incubaron a temperatura ambiente en presencia de anticuerpo primario dirigido contra PSMA a la concentración de 10 µg/ml. Se usaron los siguientes anticuerpos: D2/B, 7E11 (usado como un anticuerpo de referencia bien conocido para un epítope intracelular de PSMA), un anticuerpo de tipo I dirigido contra MHC (como un control positivo para la tinción celular) y un control isotópico (control negativo).
Se eliminó el anticuerpo en exceso mediante 4 lavados como una solución de BSA al 0,2 % en PBS.
Se llevó a cabo la incubación con un anticuerpo secundario dirigido contra IgG de ratón etiquetado con FITC (fluoresceína) (Beckman Coulter, EE.UU.) diluido 1:200 durante 1 h a temperatura ambiente.
Después de 2 lavados más con PBS, se añadieron 2 gotas de PBS/glicerol y se montó el cubre sobre un porta de vidrio y se selló.
A continuación se observó la muestra mediante un microscopio de fluorescencia Axioskop 20 (Carl Zeiss, Alemania).
El anticuerpo D2/B monoclonal puede reconocer específicamente células LNCaP (PSMA+) pero no puede detectar células que carecen del antígeno PSMA (es decir, células DU145).
Ejemplo 6
Inmunohistoquímica de muestras de tejido incluidas en parafina
Se usaron secciones de carcinoma de próstata humano incluidas en parafina para evaluar la capacidad de reconocimiento de los tejidos tumorales humanos por el anticuerpo D2/B en comparación con la ya conocida y descrita del anticuerpo J591. Los tejidos incluidos en parafina se colocaron en un horno a 60 ºC (30 a 60 min), se trataron 5 veces con xilol durante 4 min cada vez, se rehidrataron secuencialmente dos veces en etanol al 100 %, 95 %, 75 % durante 3 min cada vez y se sumergieron en H2O durante 5 min; para no desenmascarar el antígeno PSMA, las muestras se colocaron seguidamente en un baño de vapor en tampón citrato 10 mM pH 6,0 durante 15 min a 95 ºC. Después de 3 lavados en PBS durante 5 min cada vez, incubación en PBS + H2O2 al 3 % durante 6 min y 3 lavados más en PBS durante 5 min cada vez, las muestras se trataron con PBS + BSA al 0,1 % durante 30-40 min para saturar los sitios de unión no específicos; se llevó a cabo la incubación con el anticuerpo primario (D2/B o J591, ambos a 2 µg/ml) toda la noche a 4 ºC; después de 3 lavados con PBS durante 5 min cada uno se usó el kit EnVision Detection System HRP/DAB (Dako), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se llevó a cabo la contratinción con hematoxilina Gill durante 5 s, seguida por lavados con H2O abundante, y posteriormente con soluciones al 75 %, 80 %, 95 %, 100 % secuenciales de etanol y a continuación con xilol durante 4 veces, 5 min cada vez. Seguidamente se montaron los portas con resina y se observaron mediante un microscopio óptimo normalizado.
Ejemplo 7
Citometría de flujo
La citometría de flujo permite la evaluación de importantes parámetros fisicoquímicos de partículas en suspensión. Usando una emisión laser y detectores ópticos, el sistema registra la luz fluorescente emitida por un fluorocromo (compuesto orgánico que emite luz fluorescente cuando se excita adecuadamente) unido a un anticuerpo monoclonal específico para las moléculas expresadas en la superficie y/o en el citoplasma de una célula bajo investigación. La señal emitida se convierte a continuación en señales analógicas/digitales.
Se usó esta técnica para evaluar parámetros importantes, tales como:
la especificidad, es decir, la capacidad de los anticuerpos obtenidos (D2/B y scFv D2B) para unirse selectivamente al antígeno relevante sobre la superficie de células positivas para el antígeno sin unirse específicamente a células negativas para el antígeno; la concentración del anticuerpo que satura los sitios del antígeno expresados en la superficie de células LNCaP, en comparación con el anticuerpo J591 del control.
Las células LNCaP y PC-3 cultivadas a 37 ºC se despegaron de las superficies plásticas con Tripsina/EDTA durante 4 min a 37 ºC, se neutralizaron con medio completo, se lavaron dos veces con 10 ml de una solución fría de PBS/BSA al 0,2 % mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 min a 4 ºC y finalmente se incubaron 2-3 x 105 células/0,5 ml con D2/B, J591 o un isótopo control durante 1 h a 4 ºC. Tras 2 lavados con 3 ml de PBS/BSA al 0,2 % a 4 ºC para eliminar el exceso de anticuerpo primario, las células que se volvieron a suspender en 100 µl de PBS/BSA al 0,2 % se incubaron durante 30 min a 4 ºC en presencia de una cantidad saturante de un anticuerpo secundario (aproximadamente 1 µg/100 µl), IgG de cabra dirigida contra IgG de ratón etiquetada con FITC (fluoresceína).
Al final del tiempo de incubación, tras un lavado adicional y resuspensión de las células en 500 µl de PBS/BSA al 0,2 %, se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo usando un citofluorímetro (BD FACSCanto). Para detectar la unión de scFv D2/B se usó un anticuerpo secundario de ratón dirigido contra la etiqueta myc seguido por un anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón etiquetado con FITC.
Los parámetros que se consideraron en el análisis fueron: intensidad promedio de la fluorescencia (MFI) de las células investigadas y el porcentaje de células encontradas en una ventana comprendida entre el canal 500 y el canal 256,000; las células comprendidas en este intervalo se consideraron positivas.
Para verificar la capacidad de unión de los anticuerpos, se incubaron células LNCaP con cantidades crecientes de anticuerpos D2/B o scFvD2b dirigidos contra PSMA o con el anticuerpo J591 del cual se conoce la afinidad de unión. Con los valores de MFI obtenidos se representó gráficamente una curva de unión en la que el valor que daba como resultado una saturación del 100 % de los sitios del antígeno corresponde a la concentración del anticuerpo para la que se registró el valor de la fluorescencia más elevado.
Tal como se ilustra en las Figuras 3.A y 3.B los anticuerpos D2/B y scFv D2/B reconocen el antígeno expresado en la membrana plasmática a un valor de MFI de aproximadamente 8000 y 1500, respectivamente. En las Figuras 3.C y
3.D se notifican los controles negativos. Usando la misma técnica, los inventores evaluaron también la especificidad del moAb analizando la unión no específica con las células negativas para el antígeno, PC-3 (metástasis ósea del carcinoma de próstata); los resultados, resumidos en las Figuras 4.A y 4.B, muestran la ausencia de unión del moAb D2/B y scFv D2/B, respectivamente. Las Figuras 4.C y 4.D muestran los respectivos controles negativos.
La concentración de J591, D2/B y scFv D2/B que satura los sitios del antígeno (PSMA) expresados en la superficie de las células LNCaP se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 8
Síntesis de inmunotoxinas, Reticulación química de RTA
Se ha llevado a cabo la síntesis de inmunotoxinas tal como se describe a continuación.
Antes de la conjugación, se cargó el anticuerpo D2/B en una columna de gel AffiBlue para eliminar la fracción de anticuerpos que podrían unirse a la matriz y que podrían contaminar las preparaciones de inmunotoxina y reducir su eficacia citotóxica. El D2/B eluido se dializó en PBS y se derivatizó con SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfametilalfa(2-piridilditio)tolueno) disuelto en una concentración 10 mM en dimetilformamida anhidra, con una relación de IgG:reticulante de aproximadamente 1:2,5.
Se eliminó el exceso de reticulante mediante filtración en gel en columnas PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Suiza).
Se determinó el número de grupos SH introducidos, que corresponden al número de posibles uniones que enlazan la toxina al anticuerpo basándose en el hecho de que DTT, por la reducción de los grupos tiol, libera el grupo piridina-2-tiona, que se puede cuantificar espectrofotométricamente a 343 nm. Este valor estaba comprendido entre 1,2 y 1,5.
Se trató RTA recombinante, producida y purificada de acuerdo con el protocolo descrito por Chignola y col. (J. Biol. Chem., 270: 23345-51, 1995) con DTT 25 mM (ditiotreitol) a temperatura ambiente durante 2 h para reducir cisteínas y convertirlas en disponibles para la conjugación.
Se eliminó posteriormente DTT mediante filtración en gel sobre columnas PD-10 y la toxina, reducida y purificada, se concentró mediante Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA).
Se llevó a cabo la reacción de conjugación para enlazar el anticuerpo D2/B derivatizado y RTA a temperatura ambiente durante 48 h.
La inmunotoxina resultante se purificó mediante filtración en gel en una columna TSK3000SW (Beckman, San Ramon, CA), con un flujo de 0,5 ml/min y PBS como tampón de elución.
Los picos que correspondían a las especies moleculares de 150-180 kDa (D2/B+1 RTA) y 210-240 kDa (Ab+2/3 RTA) se purificaron adicionalmente en gel AffiBlue, con un gradiente salino 150 nM – 1 M en tampón fosfato 5 mM. La toxina sola tiene un peso molecular de aproximadamente 3 kDa mientras que el anticuerpo tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa.
A continuación se usó una columna de gel AffiBlue debido a que su matriz se puede unir a enzimas que aprovechan NAD como coenzima o que tienen secuencias de nucleótidos como sustrato, análogamente al RTA, por estas razones, este gel puede unirse específicamente a RTA (y a los anticuerpos conjugados de RTA) permitiendo a la vez que el anticuerpo libre pase a su través.
Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron, se concentraron con Centricon-10, se dializaron frente a PBS. La concentración de la proteína se evaluó espectrofotométricamente y las diferentes combinaciones se esterilizaron mediante filtración.
Ejemplo 9
Obtención de la inmunotoxina scFv D2/B-PE40 mediante fusión génica 8secuencias de nucleótidos de la SEQ. ID Nº 5)
La secuencia de scFv D2/B se clonó en un vector pET11d entre los sitios de restricción Nco I y Hind III, en la
dirección 3’ con respecto a Hind III se insertó la secuencia de nucleótidos que codificaba la toxina PE40.
La proteína de fusión se produjo en la cepa BL21(DE3)pLysS de E. coli transformada anteriormente con el vector plasmídico que codificaba la inmunotoxina; la bacteria creció a 37 ºC con agitación (225 rpm) en medio LB al que se adicionó glucosa al 0,5 %, MgSO4 al 0,05 %, 100 µg/ml de ampicilina, 34 µg/ml de cloranfenicol, se indujeron a una absorbancia de 0,8 a 600 nm con IPTG 1 mM final. Tras 3 h de incubación las bacterias cosechadas mediante centrifugación a 5000 rpm se lisaron mediante incubación y sonicación en tampón de lisis (Tris 20 mM pH = 7,5 + EDTA 10 mM + Triton-X100 al 1 %) al que se agregaron 0,1 mg/ml de lisozima, PMSF 0,1 mM, inhibidores de la proteasa (Roche). Se cosecharon los cuerpos de inclusión (IB) mediante centrifugación a 10.000 rpm a 4 ºC, estos se lavaron dos veces en tampón de lisis y se solubilizaron a una concentración de 20 mg/ml en tampón CAPS 50 mM pH = 11 al que se adicionó N-laurilsarcosina a una concentración final de 0,8-1,0 % y DTT 1 mM. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación y la proteína se replegó mediante diálisis sucesivas. Se llevaron a cabo las diálisis I y II durante 12 h a 4 ºC en Tris 20 mM pH = 8,5 + DTT 0,1 mM + PMSF 0,1 mM, se llevaron a cabo las diálisis III y IV durante 12 h en Tris 20 mM pH = 8,5 + PMSF 0,1 mM, se llevó a cabo la diálisis V durante 24 h en Tris 0,1 M pH = 8,0 + l-glutatión 5 mM reducido + L glutatión 0,5 mM oxidado + L-arginina 0,4 M + PMSF 0,1 mM, se llevó a cabo la diálisis VI durante 24 h en Tris 20 mM pH = 7,4 + PMSF 0,1 mM.
A continuación se purificó la proteína en 2 ciclos mediante una columna QAE (Bio-Rad) con un gradiente lineal 00,05 M de 200 ml de NaCl en Tris 20 mM pH = 7,4, el volumen de las fracciones recuperadas fue de 2,5 ml.
La pureza de la proteína se evaluó en SDS-PAGE y se identificó mediante transferencia Western.
Ejemplo 10
Citotoxicidad en monocapas de células
Se evaluó el efecto citotóxico del inmunoconjugado en células positivas para PSMA y negativas para PSMA midiendo la inhibición de la proliferación celular, en comparación con la toxina en solitario.
Se sembraron células LNCaP p PC-3 en placas de microvaloración de 96 pocillos en medio completo en cantidades adecuadas hasta alcanzar la subconfluencia en los pocillos del control sin tratar a las 32 h del ensayo.
Algunos pocillos se trataron con cantidades crecientes de inmunotoxinas D2/B-RTA (obtenidas mediante conjugación química usando el reticulante SMPT) o scFv D2/B-PE40 (obtenidas mediante fusión génica) o con la inmunotoxina J591-RTA del control (obtenida mediante conjugación química con el reticulante SMPT), otros pocillos se trataron con RTA, PE o PE40 solamente, el moAb D2/B o scFv D2/B solamente, durante 22 h a 37 ºC.
Seguidamente se cosecharon las células sobre filtros de fibras mediante un cosechador de células y se midió la radioactividad incorporada mediante centelleo líquido en un contador β.
El efecto citocida se expresó como una función de la incorporación de la timidina tritiada en comparación con un control representado por las células sin tratar, los resultados se expresaron como un porcentaje de inhibición de la proliferación. Cuánto más pequeña es la emisión radiactiva, menor será la incorporación de la timidina tritiada, y mayor se considera por tanto la inhibición del crecimiento celular.
A continuación se calculó la CI50, es decir, la concentración del fármaco que es capaz de inhibir el 50 % de la proliferación celular; este valor puede compararse fácilmente con la CI50 medida usando diferentes moléculas en el ensayo de citotoxicidad.
Tabla 2
LNCap PSMA+ ng/ml
PC-3 PSMA- ng/ml
J591-smpt-RTA
7,4 > 1.260
D2/B-smpt-RTA
21 > 16.800
scFv D2/B-PE40
1,3 > 6.500
moAb D2/B
> 6.000 > 6.000
scFv D2/B
> 3.300 > 3.300
Toxina PE
2,4 3,4
Toxina PE40
1.950
Toxina RTA
12.000 9.000
Ejemplo 11
scFv D2/B monobiotinilado
Se obtuvieron scFv D2/B monobiotinilados clonando la molécula de scFv entre los sitios de restricción NcoI y NotI;
en el vector de clonación en 3’ con respecto al sitio NotI se clonaron sucesivamente; una secuencia de codificación
de un dominio derivado de la región bisagra de IgA, una secuencia de codificación de un tramo peptídico denominado (BAD) (Dominio Aceptor de Biotina) y una secuencia de codificación de un fragmento escindible reconocido por las proteasas enteroquinasa y Factor X. La región bisagra de IgA es un separador entre scFv y el dominio BAD, que fue monobiotinilado en una reacción catalizada por la enzima BirA. Se llevó a cabo la producción de proteínas biotiniladas en bacterias transformadas con el plásmido de interés y capaces de biotinilar el sitio BAD; mediante la inducción de IPTG y la adición de biotina libre al medio de cultivo se obtuvo la proteína en investigación, esto incluye el dominio scFv dotado con la especificidad deseada y una única molécula de biotina.
La proteína scFv-biotina se purificó sobre un gel NiNTA en condiciones parcialmente desnaturalizantes para facilitar la exposición de la etiqueta 5-His del extremo N y la unión a la columna. Se analizó la pureza de la proteína mediante SDS-PAGE a la vez que se confirmó su identidad mediante transferencia Western usando anticuerpos secundarios etiquetados con el scFv y con la etiqueta His.
A continuación se evaluaron las propiedades funcionales del scFv biotinilado mediante el análisis FACS llevado a cabo con células PSMA+ (LNCaP) y PSMA- (PC-3).
La MFI en células LNCaP es de 161, 728 y 314 para el control negativo (avidina-FITC solo), del anticuerpo D2/B químicamente biotinilados y el scFv-D2/B enzimáticamente etiquetado, respectivamente, mientras que los valores de MFI obtenidos con células PC-3 son de 132, 151 y 180, respectivamente.
Ejemplo 12
Ejemplo de la formación de imágenes in vivo usando el anticuerpo D2/B etiquetado con trazadores fluorescentes
Para abordar la posibilidad de aplicar las técnicas de formación de imágenes in vivo basadas en el uso de los anticuerpos D2/B o scFv D2/B etiquetados con trazadores fluorescentes, se inocularon ratones SCID inmunodeficientes con células LNCaP pretratadas in vitro con anticuerpo D2/B unido al fluorocromo Cy5.5, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo ha permitido trazar un implante s.c. de 7,5 x 106 células PSMA+, pero los inventores tienen indicaciones buenas de que se pueden identificar menores números de células (es decir, por debajo de 106 células). Figura 6
Ejemplo 13
Ejemplo de reticulación con un isótopo radioactivo
La elección del agente quelante usado para derivatizar un anticuerpo es dependiente de la elección de radionucleidos que necesitan conjugarse con el propio anticuerpo; adicionalmente, la sustancia quelante debe dotarse con un grupo funcional disponible que se puede desarrollar para unirse al anticuerpo. Por ejemplo, el compuesto DOTA se puede reticular directamente con el anticuerpo mediante uno de los 4 grupos carboxilo disponibles; el anticuerpo se concentró, se lavó con DTPA al 1 % (pH = 5,0), se dializó en tampón fosfato 0,1 M (pH = 7,0) y se hizo reaccionar con ésteres activos de DOTA. Los ésteres activos de DOTA se crearon disolviendo 0,361 mmol (146 mg) y 0,313 mmol (36 mg) de N-hidroxisuccinimida en 2 ml de H2O y ajustando el pH a pH = 7,3 con NaOH antes de la adición de 10 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. La mezcla de reacción se enfrió en hielo durante 1 h antes de añadirse al anticuerpo que se iba a derivatizar. El conjugado DOTA-anticuerpo resultante se separó del DOTA y resto de reactivos en exceso mediante filtración en gel (columnas PD-10) o mediante centrifugación (concentradores Amicon) usando una solución de acetato de amonio 0,3 M. El radiomarcado de DOTA con 111In se consiguió mediante la adición de 111ln13C en HCl 0,01 M a la solución 0,3 M de DOTA-Ab.
Tras 20 min, la mezcla de reacción se separó mediante columnas Biogl-P6 equilibradas con HSA-PBS al 1 %. La cantidad de radioisótopo libre se evaluó mediante cromatografía TLC.
Listado de secuencias
<110> Universidad de Verona
<120> ANTICUERPO MONOCLONAL AISLADO O FRAGMENTO DEL MISMO DE UNIÓN AL ANTÍGENO DE MEMBRANA ESPECÍFICO DE LA PRÓSTATA, SUS CONJUGADOS Y USOS
5 <130> 840-07
<160> 6
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 366 10 <212> ADN
<213> Ratón
<220>
<221> región_v
<222> (1)..(366) 15 <223> cadena pesada variable de Ab D2/B
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(114)
<223> CDRH1
20 <220>
<221> misc_feature
<222> (157)..(204)
<223> CDRH2
<220> 25 <221> misc_feature
<222> (301)..(336)
<223> CDRH3
<400> 1
30 <210> 2
<211> 327
<212> ADN
<213> Ratón
<220> 35 <221> región_v
<222> (1)..(327)
<223> cadena ligera variable de Ab D2/B
<220>
<221> misc_feature 40 <222> (76)..(108)
<223> CDRL1
<220>
<221> misc_feature
<222> (154)..(174) 5 <223> CDRL2
<220>
<221> misc_feature
<222> (271)..(294)
<223> CDRL3
10 <400> 2
<210> 3
<211> 822
<212> ADN 15 <213> Ratón
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(822)
<223> scFv D2/B
20 <220>
<221> región_v
<222> (1)..(366)
<223> cadena pesada variable de scFv D2/B
<220> 25 <221> región_v
<222> (415)..(741)
<223> cadena ligera variable de scFv D2/B
<400> 3
<210> 4
<211> 273
<212> PRT
<213> Ratón
<400> 4
<210> 5
<211> 1830
<212> ADN
<213> Ratón y Bacterias
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1830)
<223> scFv D2/B-PE40
<220>
<221> región_v
<222> (1)..(738)
<223> región variable de la cadena pesada y ligera de scFv D2/B
<220>
<221> misc_feature
<222> (739)..(1830)
<223> secuencia de la Toxina PE40
<400> 5
<210> 6
<211> 609
<212> PRT
<213> Ratón y Bacterias
<400> 6

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) que se une a un anticuerpo monoclonal D2/B aislado caracterizado porque comprende una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de las regiones variables VH y VK de la SEQ ID NO: 1 y 2.
  2. 2.
    Un fragmento de anticuerpo D2/B scFv que se une a un antígeno, caracterizado porque comprende una proteína codificada por una secuencia de al menos 741 nucleótidos consecutivos que caracteriza las regiones variables VH y VL de la SEQ ID NO: 3 que se unen a un antígeno.
  3. 3.
    El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el PSMA se une en su forma natural sobre la superficie de células tumorales
  4. 4.
    El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se une selectivamente al PSMA.
  5. 5.
    Un conjugado entre principio activo y anticuerpo que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado con un principio activo seleccionado entre el grupo que consiste en un agente de marcado, un agente citotóxico o un vehículo.
  6. 6.
    El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho agente de marcado es un radionucleido o nanopartículas fluorescentes.
  7. 7.
    El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque dicho agente de marcado se selecciona entre el grupo que consiste en 188Re, 131I, 125I, 123I, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu.
  8. 8.
    El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicho agente citotóxico es PE40, la cadena de ricina A, saporina y diantina.
  9. 9.
    El conjugado scFv D2/B-PE40 de la SEQ ID NO: 5.
  10. 10.
    El conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho vehículo es biotina o nanopartículas.
  11. 11.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
  12. 12.
    Uso de un anticuerpo monoclonal aislado o de un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de un tumor.
  13. 13.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque dicho tumor es un tumor de próstata.
  14. 14.
    Anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que se une a un antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para el uso en la angiogénesis de células PSMA+ de los tumores de cualquier histotipo.
ES09735635T 2008-04-22 2009-04-22 Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo de unión al antígeno de membrana específico de la próstata, sus conjugados y usos Active ES2400082T3 (es)

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