ES2871815T3 - Nuevas proteínas de unión a antígeno y su utilización como producto de direccionamiento para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Nuevas proteínas de unión a antígeno y su utilización como producto de direccionamiento para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

Anticuerpo anti-AXL que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 7 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID nº 8.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas proteínas de unión a antígeno y su utilización como producto de direccionamiento para el tratamiento del cáncer
Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere a nuevas proteínas de unión a antígeno, en particular anticuerpos monoclonales, capaces de unión a la proteína Axl, así como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas. La presente divulgación se refiere particularmente a nuevas proteínas de unión a antígeno, o fragmentos de unión a antígeno, capaces de unión a Axl y, mediante inducción de internalización de Axl, que se internalizan en la célula. La divulgación se refiere además a la utilización de dichas proteínas de unión a antígeno como productos de direccionamiento (“addressing”) en conjugación con otros compuestos anticáncer, tales como toxinas, radioelementos o fármacos, y la utilización de los mismos para el tratamiento de determinados cánceres.
Antecedentes
"Axl" (asimismo denominado "Ufo", "Ark" o "Tyro7") se clonó a partir de pacientes con leucemia mieloide crónica como oncogén que induce la transformación al sobreexpresarse en NIH3T3 de ratón. Pertenece a la familia de las receptor tirosina cinasas (RTK) denominada familia TAM (Tyro3, Axl, Mer), que incluye Tyro3 (Rse, Sky, Dtk, Etk, Brt, Tif), Axl y Mer (Eyk, Nyk, Tyro-12) [Lemke G. et al. Nat. Rev. Immunol. 8, 327-336, 2008].
La proteína Axl humana es una proteína de 894 aminoácidos, la secuencia de la cual se representada en el listado de secuencias como SEC ID n° 29. Los aminoácidos 1 a 25 correspondientes al péptido de señal, la proteína humana Axl, sin dicho péptido de señal, se representa en el listado de secuencias como SEC ID n° 30.
Gas6, originalmente aislada como gen específico de parada del crecimiento, es el ligando común entre los elementos de la familia TAM [Varnum B.C. et al., Nature 373, 623-626, 1995]. Gas6 muestra la afinidad más elevada para Axl, seguido de Tyro3 y finalmente de Mer [Nagata K. et al., J. Biol. Chem. 271, 30022-30027, 1996]. Gas6 consiste en un dominio rico en Y-carboxiglutamato (Gla) que media en la unión a las membranas fosfolipídicas, cuatro dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico y dos dominios de tipo laminina G (LG) [Manfioletti G., Brancolini,C., Avanzi,G. y Schneider,C. Mol. Cell Biol. 13, 4976-4985, 1993]. Al igual que muchas otras RTK, la unión de ligando resulta en la dimerización del receptor y la autofosforilación de los residuos de tirosina (residuos de tirosina 779, 821 y 866 para el receptor de Axl), que sirven de sitios de enlace para una diversidad de moléculas de señalización intracelular [Linger R.M., Keating,A.K., Earp,H.S. y Graham,D.K. Adv. Cancer Res. 100, 35-83, 2008]. Además, el receptor de Axl puede activarse mediante un procedimiento independiente de ligando. Dicha activación puede producirse al sobreexpresarse el receptor de Axl.
Se ha mostrado que la señalización de Gas6/Axl regula diversos procesos celulares, incluyendo la proliferación, adhesión, migración y supervivencia celulares en una gran diversidad de células in vitro [Hafizi S. y Dahlback,B. FEBS J. 273, 5231-5244, 2006]. Además, los receptores de TAM participan en el control de la inmunidad innata; inhiben las respuestas inflamatorias a los patógenos en las células dendríticas (CD) y en los macrófagos. Asimismo controlan la fagocitosis de las células apoptóticas por dichas células inmunitarias y resultan necesarias para la maduración y eliminación de la actividad de las células asesinas naturales (NK) [Lemke G. et al., Nat. Rev. Immunol. 8, 327-336, 2008].
Se expresan débilmente sobre las células normales; se observan predominantemente en fibroblastos, células progenitoras mieloides, macrófagos, tejidos neurales, y músculo cardiaco y esquelético, donde proporciona soporte principalmente a la supervivencia celular. El sistema Gas6/Axl desempeña un papel importante en la biología vascular mediante la regulación de la homeostasis de las células de músculo liso vascular [Korshunov,V.A., Mohan,A.M., Georger,M.A. y Berk, B.C., Circ. Res. 98, 1446-1452, 2006; Korshunov, V.A., Daul, M., Massett, M.P. y Berk, B.C. Hypertension 50, 1057-1062, 2007].
En las células tumorales, Axl desempeña un papel importante en la regulación de la invasión y migración celular. La sobreexpresión de Axl está asociada no sólo a un mal pronóstico, sino asimismo a una invasividad incrementada de diversos cánceres humanos, según se informa para cáncer de mama, colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, de pulmón, melanoma, osteosarcoma, ovárico, prostático, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo y uterino endometrial [Linger R.M., Keating, A.K., Earp, H.S. y Graham, D.K., Adv. Cancer Res.
100:35-83, 2008 y Verma A. Mol. Cancer Ther. 10, 1763-1773, 2011, para una revisión]. En el cáncer de mama, Axl aparentemente es un efector fuerte de la transición epitelial a mesenquimal (TEM); el programa TEM contribuye activamente a la migración y diseminación de las células de cáncer en el organismo [Thiery J.P. Curr. Opin. Cell Biol. 15, 740-746, 2003].
Se ha mostrado que Axl asimismo regula la angiogénesis. En efecto, la inactivación de Axl en las células endoteliales perjudica la formación y migración de tubos [Holland S.J. et al., Cancer Res. 65, 9294-9303, 2005], así como las rutas específicas de señalización angiogénica [Li Y. et al. Oncogene 28, 3442-3455, 2009].
Más recientemente, varios estudios con un abanico de modelos celulares han descrito la participación de la sobreexpresión de Axl en los fenómenos de resistencias a fármacos. La tabla 1 a continuación resume estos estudios.
Tabla 1
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Las referencias completas que se citan en la tabla 1, anteriormente, son las siguientes:
• Macleod K. et al., Cancer Res. 65, 6789-6800, 2005.
• Mahadevan D. et al., Oncogene 26, 3909-3919, 2007.
• Lay J.D. et al., Cancer Res. 67, 3878-3887, 2007.
• Hong C.C. et al., Cancer Lett. 268, 314-324, 2008.
• Liu L. et al., Cancer Res. 69, 6871-6878, 2009.
• Keating A.K. et al., Mol. Cancer Ther. 9, 1298-1307, 2010.
• Ye X. et al., Oncogene 29, 5254-5264, 2010.
En dicho contexto, se considera que Axl RTK es una diana interesante en oncología. Actualmente se han sintetizado y descrito varios anticuerpos anti-Axl, notablemente anticuerpos bloqueadores (documentos WO 2011/159980, WO 2011/014457, WO 2010/131733 y WO 2010/130751), y varios grupos ya han desarrollado estrategias antitumorales con diana en el eje gas6/Axl, mediante la utilización de anticuerpos monoclonales desnudos o moléculas pequeñas dirigidas [Verma A., Mol. Cancer Ther. 10, 1763-1773, 2011].
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualesquiera otros aspectos o formas de realización proporcionadas en la presente memoria únicamente se proporcionan a título informativo.
Un primer objetivo de la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-AXL que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8.
En una primera forma de realización, dicho anticuerpo según la invención se caracteriza por que es el anticuerpo monoclonal 110D7 producido a partir del hibridoma I-3959 depositado en CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 2 de abril de 2008.
Según otra forma de realización, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
Según otra forma de realización, la región constante de la cadena ligera de dicho anticuerpo es la región lambda o kappa humana, y la región constante de la cadena pesada derivada del anticuerpo humano es la región gamma-1, gamma-2 o gamma-4 humana.
Un segundo objetivo de la invención se refiere a un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo según la invención conjugado con un agente citotóxico.
En una primera forma de realización, dicho agente citotóxico es un fármaco, un isótopo radiactivo o una toxina.
En una forma de realización, en el caso de que dicho agente citotóxico sea un fármaco, dicho fármaco se selecciona de entre el grupo de agentes alquilantes, tales como mostaza nitrogenada, alquil-sulfonatos, nitrosourea, oxazoforinas, aziridinas o imina-etilenos, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de la cromatina, agentes antiangiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos, agentes quelantes, estimulante de la absorción del hierro, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores del ADN, inhibidores de la síntesis del ADN, estimulantes de la apoptosis, inhibidores de timidilato, inhibidores de las células T, agonistas del interferón, inhibidores de la ribonudeósido-trifosfato reductasa, inhibidores de aromatasa, antagonistas de receptor de estrógeno, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores del ciclo celular, taxano, inhibidores de tubulina, inhibidores de la angiogénesis, estimulantes de macrófagos, antagonistas de receptor de neurocinina, agonistas de receptor canabinoide, agonistas de receptor de dopamina, agonistas de factor estimulante de granulocitos, agonistas de receptor de eritropoyetina, agonistas de receptor de somatostatina, agonistas de LHRH, sensibilizadores del calcio, VEGF, antagonistas de receptores, antagonistas de receptor de interleucina, inhibidores de osteoclastos, estimuladores de la formación de radicales, antagonistas de receptor de endotelina, alcaloides vinca, antihormonas e inmunomoduladores.
En otra forma de realización, en el caso de que dicho agente citotóxico sea un isótopo radiactivo, dicho isótopo radiactivo se selecciona de entre el grupo de At211, C13, N15, O17, F119, I123, I131, I125, In111, Y90, Re186, Re188, Sm153, tc99m, Bi212, P32, Pb212, isótopos radioactivos de Lu, gadolinio, manganeso o hierro.
En todavía otra forma de realización, en el caso de que dicho agente citotóxico sea una toxina, dicha toxina se selecciona de entre el grupo de cadena A diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, PAPI, PAPII, PAP-S, curcina, crotina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, dolastatinas, auristatinas y CC1065.
En otra forma de realización, dicho inmunoconjugado comprende además un ligador, preferentemente dicho ligador es un ligador escindible o un ligador no escindible.
En una forma de realización, dicho ligador escindible es un ligador lábil a ácidos, un ligador sensible a peptidasa, un ligador fotolábil, un ligador dimetilo o un ligador que contiene disulfuro.
En todavía otra forma de realización, dicho ligador que contiene disulfuro es SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP, (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno).
Otro objetivo de la presente invención se refiere a un inmunoconjugado según la invención, para la utilización en el tratamiento del cáncer, en el que la célula de cáncer expresa o sobreexpresa la proteína Axl en su superficie.
Otro objetivo de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de la invención y por lo menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objetivo de la invención es el hibridoma murino I-3959, depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 2 de abril de 2008.
Descripción detallada
En primer lugar, la divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que: i) se une a la proteína Axl humana, y ii) resulta internalizada tras su unión a dicha proteína Axl humana.
Más generalmente, la divulgación se refiere a la utilización de la proteína Axl para la selección de una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, capaz de resultar internalizada tras su unión a dicha diana Axl. Más particularmente, dicha diana es el dominio extracelular de Axl.
En particular, la presente divulgación se refiere a un método in vitro para el cribado de un compuesto, o un fragmento de unión del mismo, capaz de transportar o internalizar una molécula de interés en células de mamífero, en las que dicha molécula de interés se encuentra covalentemente unida a dicho compuesto, en el que dicho método comprende las etapas siguientes:
a) seleccionar un compuesto que es capaz de unión a la proteína Axl, o el dominio extracelular (DEC) de la misma, o un epítopo de la misma,
b) opcionalmente, unir covalentemente dicha molécula de interés, o una molécula de control, a dicho compuesto seleccionado en la etapa a), formando un complejo,
c) poner en contacto dicho compuesto seleccionado en la etapa), o dicho complejo obtenido en la etapa b), con una célula de mamífero, preferentemente una célula viable, que expresa en su superficie la proteína Axl, o un fragmento funcional de la misma,
d) determinar si dicho compuesto, o dicha molécula de interés o dicho complejo, se ha transportado intracelularmente o internalizado en dicha célula de mamífero, y
e) seleccionar dicho compuesto como un compuesto capaz de transportar o internalizar una molécula de interés en una célula de mamífero viable.
Preferentemente, dicho compuesto capaz de transportar o internalizar una molécula de interés en una célula de mamífero viable es una proteína (asimismo denominada en la presente memoria polipéptido o péptido) o un compuesto de tipo proteína que comprende una estructura peptídica, particularmente una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5, 10, 15 o más residuos aminoácidos, en el que dicho residuo o residuos aminoácidos pueden estar glucosilados.
En el caso de que dicho compuesto capaz de transportar o internalizar una molécula de interés en una célula de mamífero viable sea una proteína o un compuesto de tipo proteína, dicho compuesto asimismo se denomina en la presente memoria "proteína de unión a antígeno", dicha proteína de unión a antígeno o fragmento de unión de la misma puede:
i) unirse a la proteína Axl, preferentemente la proteína Axl humana, y
ii) internalizarse en una célula de mamífero tras su unión a dicha proteína Axl, en el caso de que dicha proteína Axl se exprese en la superficie de dicha célula de mamífero.
Preferentemente, dicha célula viable de mamífero es una célula humana, preferentemente una célula que expresa naturalmente el receptor de la proteína Axl.
En particular, las células viables de mamífero en la etapa c) son células de mamífero que expresan la proteína o proteínas Axl recombinantes en su superficie.
Preferentemente, dicha molécula de interés es una molécula citotóxica (asimismo denominada en la presente memoria agente citotóxico o citostático).
Preferentemente, dicha molécula de interés está unida covalentemente a dicho compuesto capaz de unión a la proteína Axl utilizando un ligador, más preferentemente un ligador peptídico, más preferentemente un ligador peptídico escindible, más preferentemente un ligador que puede ser cortado por compuestos intracelulares naturales contenidos en la célula de mamífero, particularmente en el citosol de dicha célula de mamífero.
Preferentemente, dicho compuesto capaz de unión a la proteína Axl es un anticuerpo, o fragmento de unión de la misma, que se dirige contra la proteína Axl, o contra un epítopo de la misma situado en el dominio DEC de Axl.
La etapa de selección de e) puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido por el experto en la materia para la evaluación del transporte intracelular o internalización. Los ensayos o pruebas capaces de mostrar o evaluar la presencia, ausencia o la actividad de dicho compuesto capaz de unirse específicamente a la proteína Axl, o de dicho complejo formado por dicho compuesto y dicha molécula de interés, o de dicha molécula de interés que está unida covalentemente a dicho compuesto, son bien conocidos por el experto en la materia (ver algunos ejemplos de dichas pruebas o ensayos dados a conocer posteriormente en la presente memoria, sin limitación de dichas pruebas a los ejemplos de ensayo, posteriormente).
Más particularmente, dichas pruebas o ensayos pueden llevarse a cabo mediante FACS, inmunofluorescencia, citometría de flujo, transferencia western, evaluaciones de citotoxicidad/citostática, etc.
La presente divulgación se refiere además a un método in vitro para la preparación de un complejo citotóxico o citostático capaz de transportar un compuesto citotóxico al interior de una célula de mamífero, preferentemente una célula viable, en el que dicho método comprende la etapa de:
• unir covalentemente un agente citotóxico a un compuesto que es:
i) capaz de unión a la proteína Axl, preferentemente la proteína Axl humana, y
ii) internalizado en una célula de mamífero tras su unión a dicha proteína Axl, en el caso de que dicha proteína Axl se exprese en la superficie de dicha célula de mamífero.
Preferentemente, dicho compuesto es una proteína de tipo proteína, más preferentemente un anticuerpo que está dirigido contra la proteína Axl, o contra un epítopo de la misma situado en el dominio DEC de Axl, o un fragmento de unión funcional de dicho anticuerpo.
Preferentemente, dicho agente citotóxico se une covalentemente a dicho anticuerpo anti-Axl o fragmento funcional del mismo, mediante la utilización de un ligador más preferentemente un ligador peptídico, más preferentemente un ligador peptídico escindible, más preferentemente un ligador que puede cortarse, a título de ejemplo no limitativo por compuestos intracelulares naturales.
Al igual que otros elementos de la familia de TAM, el dominio extracelular (DEC) de Axl presenta una organización cerrada a dichas moléculas de adhesión celular. El DEC de Axl se caracteriza por una combinación de dos dominios de tipo inmunoglobulina seguida de dos dominios contiguos similares a fibronectina de tipo III [O'Bryan J.P. et al. Mol. Cell Biol., 11, 5016-5031, 1991]. Los dos dominios de tipo inmunoglobulina n-terminales resultan suficientes para la unión de ligando de Gas6 [Sasaki T. et al., EMBO J. 25, 80-87, 2006].
El DEC de la proteína Axl humana es un fragmento de 451 aminoácidos, correspondiente a los aminoácidos 1 a 451 de la secuencia SEC ID n° 29, en el que la secuencia está representada en el listado de secuencias como SEC ID n° 31. Los aminoácidos 1 a 25 correspondientes al péptido de señal, el DEC de la proteína humana Axl sin el péptido de señal corresponden a los aminoácidos 26 a 451 de la secuencia SEC ID n° 29, representada mediante la secuencia SEC ID n° 32.
Hasta el momento se han identificado diferentes modos de internalización. Orientan las proteínas internalizadas o complejo de proteínas en la célula. Tras la endocitosis, la mayoría de proteínas o lípidos membranarios vuelve a la superficie celular (reciclado), aunque algunos componentes membranarios son transportados a endosomas tardíos o al aparato de Golgi [Maxfield F.R. y McGraw, T.E., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 121-132, 2004].
Preferentemente, la divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que: i) se une a la proteína Axl humana, y ii) resulta internalizada tras su unión a dicha proteína Axl humana.
Preferentemente, la divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que:
i) se une a la proteína Axl humana, preferentemente que presenta la secuencia SEC ID n° 29 o 30 o una secuencia variante natural de la misma, y
ii) se internaliza tras su unión a dicha proteína humana Axl.
Una "proteína de unión" o "proteína de unión a antígeno" es una cadena peptídica que presenta una afinidad específica o general para otra proteína o molécula (generalmente denominada antígeno). Se ponen en contacto las proteínas y forman un complejo en el caso de que resulte posible la unión. La proteína de unión a antígeno preferentemente puede ser, aunque sin limitación, un anticuerpo, un fragmento o un derivado de un anticuerpo, una proteína o un péptido.
La expresión "fragmento de unión a antígeno" de una proteína de unión a antígeno dada a conocer en la presente memoria pretende indicar cualquier péptido, polipéptido o proteína que conserva la capacidad de unirse específicamente a la diana (asimismo denominada generalmente antígeno) de la proteína de unión a antígeno y que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 10 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 15 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 20 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 25 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 40 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 50 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 60 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 70 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 80 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 90 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 100 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 125 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 150 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 175 residuos aminoácidos contiguos, por lo menos 200 residuos aminoácidos contiguos, o por lo menos 250 residuos aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo, dichos "fragmentos de unión a antígeno" se seleccionan de entre el grupo que consiste en los fragmentos Fv, scFv ('sc' es cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento del que la semivida se habría incrementado mediante modificación química, tal como la adición de poli(etilén)glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" por polietilenglicol), o mediante incorporación en un liposoma, en el que dichos fragmentos presentan por lo menos una de las CDR características del anticuerpo. Preferentemente, dichos "fragmentos de unión a antígeno" estará constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del que derivaron, en el que dicha secuencia parcial resulta suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del que proceden y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, en un modo más preferente por lo menos igual a 1/10, de la afinidad del anticuerpo del que procede, con respecto a la diana. Dicho fragmento funcional contendrá como mínimo 5 aminoácidos, preferentemente 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del que procede.
El término "epítopo" es una región de un antígeno que se une a una proteína de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subgrupo de los epítopos estructurales y presentan aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos asimismo pueden ser conformacionales, es decir, estar compuestos por aminoácidos no lineales. En particular, entre los epítopos pueden incluirse determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y puede presentar características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
Tal como se da a conocer en la presente memoria, el epítopo se localiza en el dominio extracelular de la proteína humana Axl.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma, se une específicamente a un epítopo localizado en el dominio extracelular de la proteína humana Axl, que preferentemente presenta la secuencia SEC ID n° 31 o 32 o una secuencia variante natural de la misma.
La expresión "de unión", "se une" o similar, significa que la proteína de unión a antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma, forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la diálisis de equilibrio, la resonancia del plasmón superficial, y similares.
En este sentido, "EC50" se refiere a la concentración eficaz al 50%. Más exactamente, la expresión concentración eficaz semimáxima (EC50) corresponde a la concentración de un fármaco, anticuerpo o tóxico que induzca una respuesta a mitad de camino entre la línea base y el máximo después de cierto tiempo de exposición especificado. Se utiliza comúnmente como medida de la potencia del fármaco. La EC50 de una curva de respuesta a dosis gradada representa, por lo tanto, la concentración de un compuesto a la que se observa el 50% de su efecto máximo. La EC50 de una curva de respuesta a dosis cuantal representa la concentración de un compuesto a la que 50% de la población muestra una respuesta, después de una duración de la exposición especificada. Las medidas de la concentración típicamente siguen una curva sigmoidal, crecientemente rápido a lo largo de un cambio relativamente pequeño de concentración. Lo anterior puede determinarse matemáticamente mediante derivación de la línea de ajuste óptimo.
Preferentemente, la EC50 determinada caracteriza la potencia de unión del anticuerpo en el DEC de Axl expuesto sobre las células tumorales humanas. El parámetro EC50 se determina mediante la utilización del análisis de FACS. El parámetro EC50 refleja la concentración de anticuerpo a la que se obtiene 50% de la unión máxima en Axl humano expresado sobre las células tumorales humanas. Cada valor de EC50 se calculó como el punto medio de la curva de dosis-respuesta mediante la utilización de un programa de ajuste de curvas de regresión de cuatro parámetros (Prism Software). Dicho parámetro se seleccionó como representativo de las condiciones fisiológicas/patológicas.
Según la divulgación, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, puede unirse a su epítopo con una EC50 de por lo menos 10-9 M, preferentemente de entre 10-9 y 10-12 M.
Además, la presente divulgación se refiere a un procedimiento o método para la selección de una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, capaz de ser internalizada intracelularmente en una célula de mamífero, preferentemente en una célula humana, preferentemente en una célula viable, que comprende las etapas de:
i) seleccionar la proteína de unión a antígeno que se une a Axl, preferentemente a su dominio DEC o a un epítopo del mismo, y
ii) seleccionar dicha proteína de unión a antígeno de la etapa anterior i) que se internaliza en una célula de mamífero tras su unión a una proteína Axl expresada en la superficie de dicha célula de mamífero.
En particular, dicha célula de mamífero expresa naturalmente el receptor de proteína Axl en su superficie o son células de mamífero que expresan una proteína Axl recombinante en su superficie, preferentemente células humanas.
Dicho método o procedimiento puede comprender las etapas de: i) seleccionar una proteína de unión a antígeno que se une a Axl con una EC50 de por lo menos 10-9 M y ii) seleccionar la proteína de unión a antígeno de la etapa anterior que se internalizará tras su unión a Axl. La etapa de selección de ii) puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido por el experto en la materia para la evaluación de la internalización. Más particularmente, pueden llevarse a cabo ensayos mediante FACS, inmunofluorescencia, citometría de flujo, transferencia western, evaluaciones de citotoxicidad, etc.
Otra característica de la proteína de unión a antígeno dada a conocer en la presente memoria es que no presenta ninguna actividad significativa sobre la proliferación de las células tumorales. Más particularmente, tal como se ilustra en los ejemplos, posteriormente, la proteína de unión a antígeno no presenta ninguna actividad in vitro significativa sobre la proliferación del modelo SN12C.
En oncología, existen múltiples mecanismos mediante los que los mAb pueden ejercer eficacia terapéutica, aunque con frecuencia su actividad no resulta suficiente para producir un beneficio duradero. Por lo tanto, se han utilizado varias estrategias para potenciar su actividad, particularmente mediante la combinación de las mismas con fármacos a modo de agentes quimioterápicos. Como alternativa eficiente a los protocolos de combinación, las inmunotoxinas se han convertido en una nueva opción terapéutica para el tratamiento del cáncer [Beck A. et al. Discov. Med. 10, 329-339, 2010; Alley S.C. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 330, 932-938, 2009]. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) representan un enfoque en el que la capacidad de aprovechar la especificidad de los MAb y dirigir el transporte de un agente citotóxico al tumor podría potenciar significativamente las actividades tanto de MAb como de los fármacos. Idealmente, el MAb se une específicamente a un antígeno con expresión sustancial sobre las células tumorales, aunque expresión limitada sobre las células normales.
La presente divulgación se centra en proteínas de unión anti-Axl y más particularmente en anticuerpos específicos anti-Axl, que presentan una capacidad elevada de ser internalizados tras la unión de Axl. Dichas proteínas de unión a antígeno resultan interesantes como uno de los componentes conjugados inmunofarmacológicos, para dirigir el citotóxico unido hasta el interior de las células de cáncer diana. Una vez internalizado, el citotóxico induce la muerte de la célula de cáncer.
Se cree que son claves importantes del éxito de la terapia con inmunoconjugados la especificidad del antígeno diana y la internalización de los complejos de proteína de unión a antígeno en las células de cáncer. Evidentemente los antígenos no internalizados resultan menos eficaces que los antígenos internalizados para el transporte de agentes citotóxicos. Los procedimientos de internalización son variables para diferentes antígenos y dependen de múltiples parámetros que pueden resultar influidos por las proteínas de unión. Las RTK de superficie celular son una familia interesante de antígenos para investigar dicho enfoque.
En la biomolécula, el citotóxico trae la actividad citotóxica y la proteína de unión a antígeno utilizada trae su especificidad contra las células de cáncer, así como un vector para la entrada en las células a fin de dirigir correctamente el citotóxico.
De esta manera, para mejorar la molécula de inmunoconjugado, la proteína de unión a portador debe mostrar una capacidad elevada de internalización en las células de cáncer diana. La eficiencia con la que las proteínas de unión median en la internalización difiere significativamente según el epítopo diana. La selección de potentes proteínas de unión anti-Axl internalizantes requiere diversos datos experimentales que estudian no sólo la regulación negativa de Axl, sino que asimismo realizan un seguimiento de las proteínas de unión anti-Axl al entrar en las células.
Preferentemente, la internalización de la proteína de unión a antígeno puede evaluarse mediante inmunofluorescencia (tal como se ejemplifica posteriormente en la presente memoria, en la presente solicitud) o cualquier método o procedimiento conocido por el experto en la materia específico para el mecanismo de internalización.
Preferentemente, al internalizar el complejo de Axl-proteína de unión a antígeno después de la unión de la proteína de unión al DEC de dicha Axl, se induce una reducción de la cantidad de Axl en la superficie de las células. Dicha reducción puede cuantificarse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia (transferencia Western, FACS, inmunofluorescencia, etc.).
Dicha reducción, que de esta manera refleja la internalización, puede medirse preferentemente mediante FACS y expresarse como la diferencia o delta entre la intensidad media de fluorescencia (IMF) medida en células no tratadas con medición de la IMF con células tratadas con la proteína de unión a antígeno.
A título de ejemplo no limitativo, dicha delta se determina basándose en las IMF obtenidas con células no tratadas y células tratadas con la proteína de unión a antígeno tal como se indica en el ejemplo 9, utilizando i) células SN12C de tumor renal humano tras un periodo de incubación de 24 horas con la proteína de unión a antígeno, y ii) un anticuerpo secundario marcado con Alexa488. Dicho parámetro se define según el cálculo con la fórmula a continuación:
A (IMF24 h células no tratadas - IMF24 h células tratadas con proteína de unión a antígeno)
Dicha diferencia entre las IMF refleja la regulación negativa de Axl ya que las IMF son proporcionales a la Axl expresada sobre la superficie celular.
Ventajosamente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, dada a conocer en la presente memoria puede consistir en un anticuerpo monoclonal, preferentemente un MAb aislado, que induce una A (IMF24h células no tratadas - IMF24h células tratadas) de por lo menos 200, preferentemente de por lo menos 300.
La proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma dado a conocer en la presente memoria, induce una reducción de la IMF de por lo menos 200.
Con mayor detalle, la delta anteriormente mencionada puede medirse según el procedimiento siguiente, que debe considerarse como ejemplo ilustrativo y no limitativo:
a) tratar e incubar células tumorales de interés con la proteína de unión a antígeno,
b) tratar las células tratadas de la etapa a) y, en paralelo, células no tratadas con la proteína de unión a antígeno,
c) medir la IMF (representativa de la cantidad de Axl presente en la superficie) para las células tratadas y no tratadas con un anticuerpo secundario marcado capaz de unión a la proteína de unión a antígeno, y
d) calcular la delta como la resta de la IMF obtenida con las células tratadas respecto de la IMF obtenida con las células no tratadas.
Los términos "anticuerpo", "anticuerpos" o "inmunoglobulina" se utilizan intercambiablemente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales, preferentemente MAb aislados (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada).
Más particularmente, dicha molécula consiste en una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región (o dominio) variable de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviado en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio: CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), entremezcladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo aminoterminal a extremo carboxiterminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
Entre los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria se incluyen además determinados fragmentos de anticuerpo. Dichos fragmentos de anticuerpo muestran la especificidad y afinidad de unión deseadas, con independencia de la fuente o tipo de inmunoglobulina (es decir, IgG, IgE, IgM, IgA, etc.), es decir, son capaces de unirse específicamente a la proteína Axl con una afinidad comparable a la de los anticuerpos de longitud completa dados a conocer en la presente memoria.
En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, resulta posible hacer referencia a técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, página 726, 1988) o a la técnica de preparación de los hibridomas indicados por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
La expresión "anticuerpo monoclonal" o "MAb" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula de anticuerpo que está dirigida contra un antígeno específico y que puede producirse mediante un clon individual de células B o hibridoma. Los anticuerpos monoclonales asimismo pueden ser recombinantes, es decir, producirse mediante ingeniería de proteínas. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diversos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes o epítopos, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único epítopo del antígeno. La divulgación se refiere además a anticuerpos aislados u obtenidos mediante purificación a partir de fuentes naturales u obtenidos mediante recombinación genética o síntesis química.
Preferentemente, la presente divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende o que consiste en un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 1,2 y 3 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 1,2 y 3, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6,
b) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 36, 37 y 38 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 36, 37 y 38, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 39, 40 y 41 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 39, n° 40 y n° 41,
c) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 64, 65 y 66 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 64, 65 y 66, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 67, 68 y 69 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69.
Más preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, consiste en un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera, tal como se define en el sistema de numeración IMGT, que comprenden las secuencias SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3, y tres CDR de cadena pesada, tal como se definen en el sistema de numeración IMGT, que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6,
b) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera, tal como se define en el sistema de numeración IMGT, que comprenden las secuencias SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38, y tres CDR de cadena pesada, tal como se definen en el sistema de numeración IMGT, que comprenden las secuencias SEC ID n° 39, n° 40 y n° 41,
c) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera, tal como se define en el sistema de numeración IMGT, que comprenden las secuencias SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66, y tres CDR de cadena pesada, tal como se definen en el sistema de numeración IMGT, que comprenden las secuencias SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69.
Preferentemente, por regiones CDR o las CDR se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas según se definen en IMGT. Sin contradicción, las CDR se definen en la presente memoria descriptiva según el sistema de numeración IMGT.
La numeración única de IMGT se ha definido para comparar los dominios variables, con independencia del receptor de antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509, 1997 / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136, 1999 /Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77, 2003]. En la numeración única IMGT, los aminoácidos conservados siempre presentan la misma posición, por ejemplo cisteína 23 (1st-CYS), triptófano 41 (CONSERVED-TRP), aminoácido hidrófobo 89, cisteína 104 (2nd-CYS), fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones marco (FR1-IMGT, posiciones 1 a 26; FR2IMGT: 39 a 55; FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como los huecos representan las posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre paréntesis y separadas por puntos, por ejemplo, [8.8.13]) se convierten en información crucial. La numeración única IMGT se utiliza en representaciones gráficas 2D, designadas como IMGT "Colliers de Perles" [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883, 2002 / Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30, 2007], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210, 2004].
Debe entenderse que, sin especificación contradictoria en la presente memoria descriptiva, las regiones determinantes de complementariedad o CDR se refieren a las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas tal como se definen según el sistema de numeración IMGT.
Sin embargo, las CDR asimismo pueden definirse según el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, y ediciones posteriores). Existen tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera. En la presente memoria, el término "CDR" se utiliza para indicar, dependiendo del caso, una o más, o incluso todas, las regiones que contienen la mayoría de los residuos aminoácidos responsables de la afinidad de unión a anticuerpo para el antígeno epítopo que reconoce.
Según el sistema de numeración de Kabat, la presente divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que consiste en un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera, tal como se define en el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEC ID n° 9, 10 y 11 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 9, n° 10 y n° 11, y tres CDR de cadena pesada, tal como se definen en el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEC ID n° 12, 13 y 14 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 12, n° 13 y n° 14,
b) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera, tal como se define en el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEC ID n° 44, 45 y 46 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 44, n° 45 y n° 46, y tres CDR de cadena pesada, tal como se definen en el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEC ID n° 47, 48 y 49 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 47, n° 48 y n° 49,
c) un anticuerpo que comprende tres CDR de cadena ligera, tal como se define en el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEC ID n° 72, 73 y 74 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 72, n° 73 y n° 74, y tres CDR de cadena pesada, tal como se definen en el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEC ID n° 75, 76 y 77 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 75, n° 76 y n° 77.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se refiere al porcentaje de nucleótidos o residuos aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que deben compararse, obtenido después de la alineación óptima, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando distribuidas las diferencias entre las dos secuencias aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos tradicionalmente se lleva a cabo mediante la comparación de las secuencias después de haberlas alineado óptimamente, pudiendo llevar a cabo dicha comparación por segmento o mediante la utilización de una "ventana de alineación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de comparando manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman [Ad. App. Math. 2:482, 1981], mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch [J. Mol. Biol. 48:443, 1970], mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988] o mediante software informático que utiliza dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o mediante el software de comparación BLAST NR o BLAST P).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se determina mediante comparación de las dos secuencias alineadas óptimamente en las que las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos para la comparación pueden presentar adiciones o deleciones en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que el aminoácido, nucleótido o residuo es idéntico en las dos secuencias, preferentemente entre las dos secuencias completas, dividiendo el número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de alineación y multiplicando el resultado por 100, para obtener el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.
Por ejemplo, el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., Lett. 174:247-250, 1999) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede utilizarse con los parámetros por defecto (particularmente los parámetros "penalización por hueco abierto": 5 y "penalización por extensión de hueco": 2; siendo la matriz seleccionada, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa); el porcentaje de identidad entre las dos secuencias comparadas es directamente calculado por el programa.
Para la secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, entre los ejemplos preferidos se incluyen los que contienen la secuencia de referencia, determinadas modificaciones, notablemente una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, el truncado o la extensión. En el caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, resultan preferidas las sustituciones en las que los aminoácidos sustituidos se sustituyen por aminoácidos "equivalentes". En la presente memoria, la expresión "aminoácidos equivalentes pretende indicar cualesquiera aminoácidos que es probable que sean sustituidos por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar, sin embargo, las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y los de ejemplos específicos definidos posteriormente.
Pueden determinarse los aminoácidos equivalentes basándose en su homología estructural con los aminoácidos a los que sustituyen o en los resultados de ensayos comparativos de actividad biológica entre las diversas proteínas de unión a antígeno que es probable que se generen.
A título de ejemplo no limitativo, la tabla 2, a continuación, resume las posibles sustituciones que es probable que se lleven a cabo sin resultar en una modificación significativa de la actividad biológica de la proteína de unión a antígeno modificada correspondiente; las sustituciones inversas son naturalmente posibles bajo las mismas condiciones.
Tabla 2
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La presente divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3, y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 8.
La presente divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 8.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprenden un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 8.
La expresión "cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 8" pretende designar la secuencia que muestra las tres CDR de cadena pesada, SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6 y, además, que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia completa SEC ID n° 8 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR, es decir, las SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 7, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6.
Preferentemente, la divulgación se refiere a la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 7 y las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 7.
La expresión "cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 7" pretende designar la secuencia que muestra las tres CDR de cadena ligera, SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3 y, además, que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia completa SEC ID n° 7 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR, es decir, las SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3.
Más preferentemente, la divulgación se refiere a la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 7 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 8.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 7 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 8.
La presente divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38, y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 43 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 43.
Preferentemente, la divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 43, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 43.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 43, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 43.
La expresión "cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 43" pretende designar la secuencia que muestra las tres CDR de cadena pesada, SEC ID n° 39, n° 40 y n° 41 y, además, que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia completa SEC ID n° 43 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR, es decir, las s Ec ID n° 39, n° 40 y n° 41.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 42 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 42, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 39, 40 y 41 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 39, n° 40 y n° 41.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 42 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 42 y las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 39, n° 40 y n° 41.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 42, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 42.
La expresión "cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 42" pretende designar la secuencia que muestra las tres CDR de cadena ligera, SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38 y, además, que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia completa SEC ID n° 42 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR, es decir, las SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 42 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 42 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 43 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 43.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 42, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 42 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 43, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 43.
La presente divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o a un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66, y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 71.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 71.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 71.
La expresión "cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 71" pretende designar la secuencia que muestra las tres CDR de cadena pesada, SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69 y, además, que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia completa SEC ID n° 71 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR, es decir, las SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 70 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 70, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 67, 68 y 69 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a las SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 70 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 70 y las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 70, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 70.
La expresión "cualquier secuencia que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 70" pretende designar la secuencia que muestra las tres CDR de cadena ligera, SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66 y, además, que muestra una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia completa SEC ID n° 70 fuera de las secuencias correspondientes a las CDR, es decir, las SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 70 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 70 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71 o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a la SEC ID n° 71.
Preferentemente, la proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 70, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 70 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71, o cualquier secuencia que muestre una identidad de por lo menos 80% respecto a SEC ID n° 71.
En aras de la claridad, las tablas 3a-3c a continuación resumen las diversas secuencias de aminoácidos correspondientes a las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en la presente memoria.
Tabla 3a
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Tabla 3b
Figure imgf000015_0002
Tabla 3c
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Además, la divulgación se refiere a un anticuerpo murino, o sus compuestos o fragmentos de unión a antígeno derivados, caracterizado por que dicho anticuerpo comprende además regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga respecto al ratón, especialmente el ser humano.
La divulgación se refiere además a un anticuerpo quimérico, o sus compuestos o fragmentos de unión a antígeno derivados, caracterizado por que dicho anticuerpo comprende además regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga respecto al ratón, especialmente el ser humano.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo humanizado, o a sus compuestos o fragmentos de unión a antígeno derivados, caracterizado por que las regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada derivadas del anticuerpo humano son, respectivamente, la región lambda o kappa y la región gamma-1, gamma-2 o gamma-4.
La divulgación se refiere además a una proteína de unión a antígeno que consiste en un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:
a) el anticuerpo monoclonal 110D7 derivado del hibridoma 1-3959 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 2 de abril de 2008, o un fragmento de unión a antígeno del mismo,
b) el anticuerpo monoclonal 1003A2 derivado del hibridoma 1-4499 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 28 de julio de 2011, o un fragmento de unión a antígeno del mismo,
c) el anticuerpo monoclonal 1024G11 derivado del hibridoma 1-4501 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 28 de julio de 2011, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Además, la divulgación se refiere a un hibridoma murino capaz de secretar una proteína de unión a antígeno según la divulgación, especialmente el hibridoma de origen murino presentada con la colección francesa de cultivos de microorganismo (CNCM, Pasteur Institute, Paris, Francia) el 2 de abril de 2008, bajo el número I-3959; 28 de julio de 2011 bajo el número 1-4499 o 28 de julio de 2011 bajo el número 1-4501.
Dicho hibridoma se obtuvo mediante la fusión de esplenocitos/linfocitos de ratones Balb/c inmunizados y células de la línea celular de mieloma Sp2/O-Ag 14.
Según otro aspecto, la divulgación se refiere a un hibridoma murino capaz de secretar un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprende las secuencias s Ec ID n° 1, n° 2 y n° 3, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6, presentando dicho hibridoma en la CNCM, Pasteur Institute, Paris, Francia, el 2 de abril de 2008, bajo el número I-3959.
Según otro aspecto, la divulgación se refiere a un hibridoma murino capaz de secretar un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprende las secuencias SEC ID n° 36, n° 37 y n° 38, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 39, n° 40 y n° 41, presentando dicho hibridoma en la CNCM, Pasteur Institute, Paris, Francia, el 28 de julio de 2008, bajo el número I-4499.
Según otro aspecto, la divulgación se refiere a un hibridoma murino capaz de secretar un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena ligera que comprende las secuencias SEC ID n° 64, n° 65 y n° 66, y tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 67, n° 68 y n° 69, presentando dicho hibridoma en la CNCM, Pasteur Institute, Paris, Francia, el 28 de julio de 2011, bajo el número I-4501.
Dicho hibridoma se obtuvo mediante la fusión de esplenocitos/linfocitos de ratones Balb/c inmunizados y células de la línea celular de mieloma Sp2/O-Ag 14.
Un hibridoma murino dado a conocer en la presente memoria se seleccionó de entre:
a) el hibridoma murino I-3959 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 2 de abril de 2008,
b) el hibridoma murino I-4499 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 28 de julio de 2011,
c) el hibridoma murino I-4501 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 28 de julio de 2011.
La proteína de unión a antígeno comprende además anticuerpos quiméricos o humanizados.
Un anticuerpo quimérico es uno que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie dada en combinación con regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga respecto a dicha especie dada.
Los anticuerpos, o fragmentos quiméricos de los mismos, pueden prepararse mediante la utilización de las técnicas de genética recombinante. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico pudo producirse mediante clonación de ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia codificante de la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, notablemente murino, y una secuencia codificante de la región constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico codificado por uno de dichos genes recombinantes podría ser, por ejemplo, una quimera ratón-ser humano, la especificidad de dicho anticuerpo puede estar determinada por la región variable derivada del ADN murino y determinar su isotipo a partir de la región constante derivada del ADN humano. Hacer referencia a Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988) para métodos de preparación de anticuerpos quiméricos.
Además, la divulgación describe una proteína de unión que consiste en un anticuerpo quimérico.
En particular, el anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7, y que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8,
b) un anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 42, y que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 43,
c) un anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 70, y que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 71.
Además, la divulgación describe una proteína de unión que consiste en un anticuerpo humanizado.
La expresión "anticuerpos humanizados" se refiere a un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano; las demás partes de la molécula de anticuerpo derivan de uno (o varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos del segmento de esqueleto (denominados FR) pueden modificarse para conservar la afinidad de unión (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).
Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante técnicas conocidas por el experto en la materia (tales como, por ejemplo, los indicados en los documentos Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992, y Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Dichos anticuerpos humanizados resultan preferidos para su utilización en métodos que implican diagnósticos in vitro o el tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización, asimismo conocidas por el experto en la materia, tales como, por ejemplo, la técnica de "injertación de CDR" descrita por PDL en las patentes EP 0451 261, EP 0682040, EP 0939127, EP 0566647 o US n° 5.530.101, US n° 6.180.370, US n° 5.585.089 y US n° 5.693.761. Asimismo pueden citarse las patentes US n° 5.639.641 o n° 6.054.297, n° 5.886.152 y n° 5.877.293.
Además, la divulgación se refiere además a anticuerpos humanizados producidos a partir de los anticuerpos murinos indicados anteriormente.
De una manera preferida, las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas del anticuerpo humano son, respectivamente, la región lambda o kappa y la región gamma-1, gamma-2 o gamma-4.
Un nuevo aspecto de la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado caracterizado por que se selecciona de entre los ácidos nucleicos siguientes (incluyendo cualquier código genético degenerado):
a) un ácido nucleico codificante de una proteína de unión a antígeno, o de un fragmento de unión a antígeno de la misma,
b) un ácido nucleico que comprende:
o una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n° 15 a n° 28, n° 50 a n° 63 y n° 78 a n° 91, o
o una secuencia de ácidos nucleicos que comprende las 6 secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID n° 15 a n° 20, o n° 50 a n° 55 y n° 78 a n° 83, o
o una secuencia de ácidos nucleicos que comprende las dos secuencias de ácidos nucleicos de SEC ID n° 21 y n° 22 o n° 56 y n° 57 o n° 84 y n° 85,
c) un ácido nucleico complementario a un ácido nucleico según se define en a) o b), y
d) un ácido nucleico, preferentemente que presenta por lo menos 18 nucleótidos, capaz de hibridarse bajo condiciones altamente restrictivas con una secuencia de ácidos nucleicos según se define en parte a) o b) o con una secuencia con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con una secuencia de ácidos nucleicos tal como se define en la parte a) o b).
Las tablas 4a-4c a continuación resumen las diversas secuencias de nucleótidos correspondientes a las proteínas de unión a dadas a conocer en la presente memoria.
Tabla 4a
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Tabla 4b
Figure imgf000018_0002
Tabla 4c
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Las expresiones "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "secuencia de ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido", "secuencia polinucleótida" y "secuencia de nucleótidos", utilizadas intercambiablemente en la presente descripción, se refieren a una secuencia precisa de nucleótidos, modificada o no, que define un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene nucleótidos no naturales o no, y que es un ADN de doble cadena, un ADN de una sola cadena o productos de transcripción de dichos ADN.
Las secuencias de la presente divulgación se han aislado y/o purificado, es decir, se han muestreado directa o indirectamente, por ejemplo mediante una copia, en el que su medio ha sido por lo menos parcialmente modificado.
Los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante genética recombinante mediante, por ejemplo, células hospedadoras, u obtenidos mediante síntesis química, asimismo deberían mencionarse en la presente memoria.
La expresión "secuencias nucleicas que muestran un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima, respecto a una secuencia preferida" se refiere a secuencias nucleicas que muestran, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, determinadas modificaciones tales como, en particular, una deleción, un truncado, una extensión, una fusión quimérica y/o una sustitución, notablemente puntual. Preferentemente, estas son secuencias que codifican para las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de referencia, estando relacionada esta con la degeneración del código genético, o secuencias de complementariedad que es probable que se hibriden específicamente con las secuencias de referencia, preferentemente bajo condiciones altamente restrictivas, notablemente las definidas posteriormente.
La hibridación bajo condiciones altamente restrictivas se refiere a que las condiciones relacionadas con la temperatura y fuerza iónica se seleccionan de manera que permitan mantener la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementarios. A título puramente ilustrativo, las condiciones altamente restrictivas de la etapa de hibridación para el propósito de definir los fragmentos polinucleótidos indicados anteriormente son ventajosamente las siguientes.
La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridación a 42°C durante tres horas en tampón de fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5X SSC (iX SSC corresponde a una solución de NaCl 0.15 M citrato sódico 0.015 M), formamida al 50%, dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, 10X solución de Denhardt, dextrán sulfato al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridación primaria durante 20 horas a una temperatura dependiente de la longitud de la sonda (es decir, 42°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud) seguido de dos lavados de 20 minutos a 20°C en 2X SSC SDS al 2%, un lavado de 20 minutos a 20°C en 0.1X SSC SDS al 0.1%. El último lavado se llevó a cabo en 0.1X SSC SDS al 0.1% durante 30 minutos a 60°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud. Las condiciones de hibridación altamente restrictivas indicadas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden ser adaptadas por el experto en la materia para oligonucleótidos más largos o más cortos, de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3a edición, 2001).
La divulgación se refiere además a un vector que comprende un ácido nucleico tal como se indica en la presente memoria.
La divulgación notablemente presenta como diana, vectores de clonación y/o expresión que contienen dicha secuencia de nucleótidos.
Los vectores dados a conocer en la presente memoria preferentemente contienen elementos que permiten la expresión y/o la secreción de secuencias de nucleótidos en una célula hospedadora dada. De esta manera, el vector debe contener un promotor, señales de inicio y terminación de la traducción, así como regiones de regulación de la transcripción adecuadas. Debe poderse mantener de una manera estable en la célula hospedadora y opcionalmente puede presentar señales específicas que especifican la secreción de la proteína traducida. Dichos diversos elementos son seleccionados y optimizados por el experto en la materia de acuerdo con la célula hospedadora utilizada. Con este fin, las secuencias de nucleótidos pueden insertarse en vectores autorreplicantes dentro del huésped seleccionado o ser vectores integrantes del huésped seleccionado.
Dichos vectores se preparan mediante métodos típicamente utilizados por el experto en la materia y los clones resultantes pueden introducirse en un hospedador adecuado mediante métodos estándares, tales como lipofección, electroporación, choque térmico o métodos químicos.
Los vectores son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o vírico. Se utilizan para transformar células hospedadoras a fin de clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de la divulgación.
La divulgación comprende además células hospedadoras aisladas transformadas o que comprenden un vector tal como se indica en la presente memoria.
La célula hospedadora puede seleccionarse de entre sistemas procarióticos o eucarióticos, tales como células bacterianas, por ejemplo, aunque asimismo células de levadura o células animales, notablemente células de mamífero (con la excepción de las humanas). Asimismo pueden utilizarse células de insecto o células vegetales.
La divulgación se refiere además a animales, aparte de seres humanos, que presentan una célula transformada dada a conocer en la presente memoria.
Además, la divulgación se refiere a un método para la producción de una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, caracterizado por que dicho método comprende las etapas siguientes: a) el cultivo en un medio bajo condiciones de cultivo adecuadas para una célula hospedadora, y
b) la recuperación de la proteína de unión a antígeno, o uno de sus fragmentos de unión a antígeno, producido de esta manera a partir del medio de cultivo o a partir de dichas células en cultivo.
Las células transformadas dadas a conocer en la presente memoria resultan de utilidad en métodos para la preparación de proteínas de unión a antígeno recombinantes. Los métodos para la preparación de proteínas de unión a antígeno en forma recombinante, caracterizados por que dichos métodos utilizan un vector y/o una célula transformada con un vector dado a conocer en la presente memoria, asimismo se encuentran comprendidos en la presente divulgación. Preferentemente, una célula transformada con un vector se cultivó bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión a antígeno anteriormente indicada y la recuperación de dicha proteína recombinante.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la célula hospedadora puede seleccionarse de entre sistemas procarióticos o eucarióticos. En particular, resulta posible identificar las secuencias de nucleótidos de la divulgación que facilitan la secreción en dicho sistema procariótico o eucariótico. De esta manera, puede utilizarse un vector portador de dicha secuencia ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes para la secreción. En efecto, la purificación de dichas proteínas recombinantes de interés resultará facilitada por el hecho de que se encuentren presentes en el sobrenadante del cultivo celular y no dentro de las células hospedadoras.
La proteína de unión a antígeno asimismo puede prepararse mediante síntesis química. Uno de dichos métodos de preparación asimismo es un objetivo de la divulgación. El experto en la materia conoce métodos para la síntesis química, tales como las técnicas en fase sólida (ver especialmente Steward et al., Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2a ed., páginas 71-95, 1984) o técnicas en fase sólida parcial, mediante condensación de fragmentos o mediante síntesis convencional en solución. Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química y capaces de contener los aminoácidos no naturales correspondientes asimismo se encuentran comprendidos en la divulgación.
La proteína de unión a antígeno, o los fragmentos de unión a antígeno de la misma, probablemente obtenidos mediante el método dado a conocer en la presente memoria asimismo se encuentran comprendidos en la presente divulgación.
En particular, la divulgación se refiere a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, tal como se ha indicado anteriormente, para la utilización como producto de direccionamiento para transportar un agente citotóxico hasta un sitio diana del huésped, en el que dicho sitio diana del huésped consiste en un epítopo localizado en el dominio extracelular de la proteína Axl, preferentemente el dominio extracelular de la proteína Axl humana, más preferentemente el dominio extracelular de la proteína Axl humana que presenta la secuencia SEC ID n° 31 o n° 32, o una secuencia variante natural de la misma.
Preferentemente, dicho sitio diana del huésped es un sitio diana de una célula de mamífero, más preferentemente de una célula humana, más preferentemente células que naturalmente o mediante recombinación genética expresan la proteína Axl.
La divulgación se refiere a un inmunoconjugado que comprende una proteína de unión a antígeno tal como se indica en la presente memoria descriptiva conjugado con un agente citotóxico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoconjugado" o "inmuno-conjugado" se refiere de manera general a un compuesto que comprende por lo menos un producto de direccionamiento físicamente unido a uno o más agentes terapéuticos, creando de esta manera un compuesto altamente dirigido.
Preferentemente, dichos agentes terapéuticos consisten en agentes citotóxicos.
La expresión "agente citotóxico" o "citotóxico" pretende referirse a un agente que, administrado en un sujeto, trata o previene el desarrollo de la proliferación celular, preferentemente el desarrollo de cáncer en el cuerpo del sujeto, mediante la inhibición o prevención de una función celular y/o causando la muerte celular.
Se han aislado o sintetizado muchos agentes citotóxicos y permiten inhibir la proliferación celular o destruir o reducir, si no definitivamente por lo menos significativamente, las células tumorales. Sin embargo, la actividad tóxica de dichos agentes no se encuentra limitada a las células tumorales, y las células no tumorales asimismo resultan afectadas y pueden resultar destruidas. Más particularmente, se observan efectos secundarios en células en renovación rápida, tales como células hematopoyéticas o células del epitelio, en particular de las membranas mucosas. A título ilustrativo, las células del tracto gastrointestinal resultan afectadas en gran medida por la utilización de dichos agentes citotóxicos.
Uno de los objetivos de la presente divulgación asimismo es poder proporcionar un agente citotóxico que permita limitar los efectos secundarios sobre las células normales, conservando simultáneamente una elevada citotoxicidad en células tumorales.
Más particularmente, el agente citotóxico puede consistir preferentemente en, aunque sin limitación, un fármaco (es decir, "conjugado de anticuerpo-fármaco"), una toxina (es decir, "inmunotoxina" o "conjugado de anticuerpotoxina"), un isótopo radiactivo (es decir, "radioinmunoconjugado" o "conjugado de anticuerpo-isótopo radiactivo"), etc.
Preferentemente, el inmunoconjugado consiste en una proteína de unión unida a por lo menos un fármaco o un medicamento. Dicho inmunoconjugado se denominado conjugado de anticuerpo-fármaco (o "CAF") en el caso de que la proteína de unión sea un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno de la misma.
Dichos fármacos pueden describirse con respecto a su modo de acción. A título de ejemplo no limitativo, pueden mencionarse agentes alquilantes, tales como mostaza nitrogenada, alquil-sulfonatos, nitrosourea, oxazoforinas, aziridinas o imina-etilenos, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de la cromatina, agentes antiangiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos, agentes quelantes, estimulante de la absorción del hierro, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores del ADN, inhibidores de la síntesis del ADN, estimulantes de la apoptosis, inhibidores de timidilato, inhibidores de las células T, agonistas del interferón, inhibidores de la ribonucleósido-trifosfato reductasa, inhibidores de aromatasa, antagonistas de receptor de estrógeno, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores del ciclo celular, taxano, inhibidores de tubulina, inhibidores de la angiogénesis, estimulantes de macrófagos, antagonistas de receptor de neurocinina, agonistas de receptor canabinoide, agonistas de receptor de dopamina, agonistas de factor estimulante de granulocitos, agonistas de receptor de eritropoyetina, agonistas de receptor de somatostatina, agonistas de LHRH, sensibilizadores del calcio, antagonistas de receptores de VEGF, antagonistas de receptor de interleucina, inhibidores de osteoclastos, estimuladores de la formación de radicales, antagonistas de receptor de endotelina, alcaloides vinca, antihormonas o inmunomoduladores, o cualquier otro fármaco nuevo que satisfaga los criterios de actividad de un citotóxico o una toxina.
Dichos fármacos se citan en, por ejemplo, Vidal (2010), en la página dedicada a los compuestos asociados a la columna "Citotóxicos" de cancerología y hematología; estos compuestos citotóxicos citados en referencia a dicho documento se citan en la presente memoria como agentes citotóxicos preferidos.
Más particularmente, aunque sin limitación, resultan preferidos los fármacos siguientes: meclorethamina, clorambucol, melfalán, clorhidrato, pipobromén, prednimustina, fosfato disódico, estramustina, ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida, ifosfamida, tiotepa, trietilenamina, altetramina, carmustina, estreptozocina, fotemustina, lomustina, busulfán, treosulfán, improsulfán, dacarbazina, cis-platino, oxaliplatino, lobaplatino, heptaplatino, hidrato de miriplatino, carboplatino, metotrexato, pemetrexed, 5-fluoruracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, citosina arabinósido, 6-mercaptopurina (6-MP), nelarabina, 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina, tegafur, pentostatina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina, procarbazina, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, topotecán, irinotecán, etopósido, valrubicina, hidrocloruro de amrubicina, pirarrubicina, acetato de eliptinio, zorrubicina, epirrubicina, idarrubicina y tenipósido, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, anastrozol, letrozol, exemestano, flutamida, nilutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, finastéride, cimitidina, bortezomid, Velcade, bicalutamida, ciproterona, flutamida, fulvestrán, exemestano, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, nilotinib, sorafenib, sunitinib, retinoide, rexinoide, metoxsaleno, metilaminolevulinato, aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox, interleucina-2, tasonermina, lentinano, sizofilán, roquinimex, pidotimod, pegademasa, timopentina, poli I:C, procodazol, Tic BCG, Corynebacterium parvum, NOV-002, ucraína, levamisol, 1311-chTNT, H-101, celmoleucina, interferón alfa2a, interferón alfa2b, interferón gamma la, interleucina-2, mobenaquina, Rexina-G, teceleucina, aclarrubicina, actinomicina, arglabina, asparaginasa, carzinofilina, cromomicina, daunomicina, leucovorina, masoprocol, neocarzinostatina, peplomicina, sarkomicina, solamargina, trabectedin, estreptozocina, testosterona, kunecatequinas, sinecatequinas, alitretinoína, hidrocloruro de belotecán, calusterona, dromostanolona, acetato de eliptinio, etinil estradiol, etopósido, fluoximesterona, formestano, fosfetrol, acetato de goserelina, aminolevulinato de hexilo, histrelina, hidroxiprogesterona, ixabepilón, leuprólido, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megesterol, metilprednisolona, metiltestosterona, miltefosina, mitobronitol, fenilpropionato de nadrolona, acetato de noretindrona, prednisolona, prednisona, temsirrolimus, testolactona, triamconolona, triptorelina, acetato de vapreótide, zinostatina estimalámero, amsacrina, trióxido de arsénico, hidrocloruro de bisantreno, clorambucilo, clortrianiseno, cis-diamina-dicloroplatino, ciclofosfamida, dietilestilbestrol, hexametilmelamina, hidroxiurea, lenalidomida, lonidamina, mecloretanamina, mitotano, nedaplatino, hidrocloruro de nimustina, pamidronato, pipobromán, porfímero sódico, ranimustina, razoxano, semustina, sobuzoxano, mesilato, trietilenmelamina, ácido zoledrónico, mesilato de camostat, HCl de fadrozol, nafoxidina, aminoglutetimida, carmofur, clofarabina, citosina arabinósido, decitabina, doxifluridina, enocitabina, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, ftorafur, mostaza de uracilo, abarelix, bexaroteno, raltiterxed, tamibaroteno, temozolomida, vorinostat, megastrol, clodronato disódico, levamisol, ferumoxitol, isomaltósido de hierro, celecoxib, ibudilast, bendamustina, altretamina, mitolactol, temsirolimus, pralatrexato, TS-1, decitabina, bicalutamida, flutamida, letrozol, clodronato disódico, degarelix, citrato de toremifeno, dihidrocloruro de histamina, DW-166HC, nitracrina, decitabina, hidrocloruro de irinotecán, amsacrina, romidepsina, tretinoína, cabazitaxel, vandetanib, lenalidomida, ácido ibandrónico, miltefosina, vitespén, mifamúrtide, nadroparina, granisetrón, ondansetrón, tropisetrón, alizaprida, ramosetrón, mesilato de dolasetrón, fosaprepitant dimeglumina, nabilona, aprepitant, dronabinol, TY-10721, hidrogenomaleato de lisúride, epiceram, defibrótide, etexilato de dabigatrán, filgrastim, pegfilgrastim, reditux, epoyetina, molgramostim, oprelvequina, sipuleucel-T, M-Vax, acetil L-carnitina, hidrocloruro de donepezilo, ácido 5-aminolevulínico, aminolevulinato de metilo, acetato de cetrorelix, icodextrina, leuprorelina, metbifenidato, octreótide, amlexanox, plerixafor, menatetrenona, anetol ditioletiona, doxercalciferol, hidrocloruro de cinacalcet, alefacept, romiplostim, timoglobulina, timalfasina, ubenimex, imiquimod, everolimus, sirolimus, H-101, lasofoxifeno, trilostano, incadronato, gangliósidos, pegaptanib octasódico, vertoporfina, ácido minodrónico, ácido zoledrónico, nitrato de galio, alendronato sódico, etidronato disódico, pamidronato disódico, dutastéride, estibogluconato sódico, armodafinilo, dexrazoxano, amifostina, WF-10, temoporfina, darbepoyetina alfa, ancestim, sargramostim, palifermina, R-744, nepidermina, oprelvequina, denileucina diftitox, crisantaspasa, buserelina, deslorelina, lanreótide, octreótide, pilocarpina, bosentán, caliqueamicina, maitansinoides y ciclonicato.
Para más información, el experto en la materia puede hacer referencia al manual editado por la "Association Frangaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique" titulado "traité de chimie thérapeutique, vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003".
Alternativamente, el inmunoconjugado consiste en una proteína de unión unida a por lo menos un isótopo radiactivo. Dicho inmunoconjugado se denominado conjugado de anticuerpo-isótopo radiactivo (o "CAI") en el caso de que la proteína de unión sea un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno de la misma.
Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Se encuentra disponible una diversidad de isótopos radioactivos para la producción de CAI, tales como, aunque sin limitación, At211, C13, N15, O17, Fl19, I123, I131, I125, In111, Y90, Re186, Re188, Sm153, tc99m, Bi212, P32, Pb212, isótopos radioactivos de Lu, gadolinio, manganeso o hierro.
Pueden utilizarse cualesquiera métodos o procedimientos conocidos por el experto en la materia para incorporar dicho isótopo radioactivo en el CAI (ver, por ejemplo, "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", Chatal, CRC Press 1989). A título de ejemplo no limitativo, pueden unirse tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 mediante un residuo de cisteína. Y90 puede unirse mediante un residuo de lisina. I123 puede unirse utilizando el método IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57, 1978).
Pueden mencionarse varios ejemplos para ilustrar los conocimientos del experto en la materia en el campo de los CAI, tales como Zevalin®, que es un CAI compuesto de un anticuerpo monoclonal anti-CD20 e isótopo radioactivo In111 o Y90 unido mediante un quelante de ligador tiourea (Wiseman et al., Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77, 2000; Wiseman et al., Blood 99(12):4336-42, 2002; Witzig et al., J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63, 2002; Witzig et al., J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69, 2002); o Mylotarg®, que está compuesto de un anticuerpo anti-CD33 unido a caliqueamicina (patentes (US n° 4.970.198; n° 5.079.233; n° 5.585.089; n° 5.606.040; n° 5.693.762; n° 5.739.116; n° 5.767.285 y n° 5.773.001). Más recientemente, asimismo puede mencionarse el CAF denominado Adcetris (correspondiente a brentuximab vedotina), que ha sido recientemente aprobado por la FDA en el tratamiento del linfoma de Hodgkin (Nature, vol. 476, páginas 380-381,25 de agosto, 2011).
Alternativamente, el inmunoconjugado consiste en una proteína de unión unida a por lo menos una toxina. Dicho inmunoconjugado se denomina conjugado de anticuerpo-toxina (o "CAT") en el caso de que la proteína de unión sea un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno de la misma.
Las toxinas son venenos eficaces y específicos producidos por los organismos vivos. Habitualmente consiste en una cadena de aminoácidos que puede variar en peso molecular entre un par de cientos (péptidos) y mil (proteínas). Asimismo pueden ser compuestos orgánicos de bajo peso molecular. Las toxinas son producidas por numerosos organismos, por ejemplo, bacterias, hongos, algas y plantas. Muchas de ellas resultan extremadamente venenosas, con una toxicidad que es varios órdenes de magnitud superior a la de los agentes nerviosos.
Entre las toxinas utilizadas en los CAT pueden incluirse, aunque sin limitación, todos los tipos de toxina que pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos que incluyen la unión a la tubulina, la unión al ADN o la inhibición de la topoisomerasa.
Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la cadena A diftérica, los fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, las proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de Saponaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos.
Las toxinas de molécula pequeña, tales como las dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de dichas toxinas que presentan actividad de toxina asimismo se encuentran contemplados en la presente memoria. Se ha mostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis del GTP y la división nuclear y celular, y presentan actividad anticancerosa y antifúngica.
El término "ligador", "unidad ligadora" o "enlace" se refiere a una fracción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente una proteína de unión a por lo menos un agente citotóxico.
Pueden prepararse ligadores mediante la utilización de una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (PSPD), ciclohexán-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (CCSM), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazonio-benzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilén-triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplificativo para la conjugación de agentes citotóxicos con el sistema de direccionamiento. Otros reactivos de entrecruzamientos pueden ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., EE.UU.).
El ligador puede ser "no escindible" o "escindible".
Preferentemente, consiste en un "ligador escindible" que facilita la liberación del agente citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un ligador lábil a ácidos, un ligador sensible a peptidasas, un ligador fotolábil, un ligador dimetilo o un ligador que contiene disulfuro. El ligador es, preferentemente, escindible bajo condiciones intracelulares, de manera que el corte del ligador libera el agente citotóxico respecto de la proteína de unión en el medio intracelular.
Por ejemplo, el ligador puede ser escindible con un agente de corte que se encuentra presente en el medio intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma, endosoma o vacuola). El ligador puede ser, por ejemplo, un ligador peptidilo que es cortado por una peptidasa o enzima proteasa intracelular, incluyendo, aunque sin limitación, una proteasa lisosómica o endosómica. Típicamente, el ligador peptidilo presenta una longitud de por lo menos dos aminoácidos o una longitud de por lo menos tres aminoácidos. Entre los agentes de corte pueden incluirse las catepsinas B y D y la plasmina, la totalidad de los cuales es conocido que hidroliza derivados de fármaco dipéptido que resulta en la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Por ejemplo, puede utilizarse un ligador peptidilo que es escindible por la proteasa dependiente de tiol catepsina-B, que se expresa a nivel elevado en el tejido canceroso (por ejemplo, un ligador Pheu-Leu o un ligador Gly-Phe-Leu-Gly). Específicamente, el ligador peptidilo escindible por una proteasa intracelular puede ser un ligador Val-Cit o un ligador Phe-Lys. Una ventaja de utilizar la liberación proteolítica intracelular del agente citotóxico es que el agente típicamente se encuentra atenuado en estado conjugado y las estabilidades en suero de los conjugados típicamente son altas.
Alternativamente, el ligador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a determinados valores del pH. Típicamente, el ligador sensible al pH es hidrolizable bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, puede utilizarse un ligador lábil a ácidos que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similar). Dichos ligadores son relativamente estables bajo condiciones de pH neutro, tales como las observadas en la sangre, aunque son inestables a pH inferior a 5.5 o 5.0, el pH aproximado del lisosoma. En particular, el ligador hidrolizable es un ligador tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace acilhidrazona).
Alternativamente, el ligador es escindible bajo condiciones reductoras (por ejemplo, un ligador disulfuro). Es conocida en la técnica una diversidad de ligadores disulfuro, incluyendo, por ejemplo, los que pueden formarse utilizando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP, (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB y SMPT.
A título de ejemplo no limitativo de ligadores no escindibles o "no reductibles", puede mencionarse el inmunoconjugado trastuzumab-DMI (TDM1), que combina trastuzumab con un agente quimioterápico unido, la maitansina (Cancer Research 68: (22), 15 de noviembre de 2008).
El inmunoconjugado dado a conocer en la presente memoria puede prepararse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia, tal como, aunque sin limitación, i) la reacción de un grupo nucleófilo de la proteína de unión a antígeno con un reactivo ligador bivalente, seguido de la reacción con el agente citotóxico, o ii) la reacción de un grupo nucleófilo de un agente citotóxico con un reactivo ligador bivalente seguido de la reacción con el grupo nucleófilo de la proteína de unión a antígeno.
Entre los grupos nucleófilos en la proteína de unión a antígeno se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, grupos de amina N-terminales, grupos de amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, grupos tiol de cadena lateral y grupos hidroxilo o amino de sacáridos en el caso de que la proteína de unión a antígeno se encuentre glucosilada. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en fracciones ligadores y reactivos ligadores, incluyendo, aunque sin limitación, ésteres activos, tales como ésteres de NHS, ésteres HOBt, haloformatos y hALUros de ácido; haluros de alquilo y bencilo, tales como grupos haloacetamidas; aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida. La proteína de unión a antígeno puede presentar disulfuros intercadena reductibles, es decir, puentes de cisteína. Las proteínas de unión a antígeno pueden convertirse en reactivos para la conjugación con reactivos ligadores mediante tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). De esta manera, cada puente de cisteína formará, en teoría, dos nucleófilos tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleófilos adicionales en la proteína de unión a antígeno mediante cualquier reacción conocida por el experto en la materia. A título de ejemplo no limitativo, pueden introducirse grupos tiol reactivos en la proteína de unión a antígeno mediante la introducción de uno o más residuos de cisteína.
Asimismo pueden producirse inmunoconjugados mediante modificación de la proteína de unión a antígeno para introducir fracciones electrófilas que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo ligador o agente citotóxico. Los sacáridos de la proteína de unión a antígeno glucosilada pueden oxidarse para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos ligadores o agente citotóxico. Los grupos de base de Schiff imina resultantes pueden formar un enlace estable o pueden reducirse para formar enlaces amina estables. En particular, la reacción de la parte carbohidrato de una proteína de unión a antígeno glucosilado con galactosa oxidasa o meta-peryodato sódico puede proporcionar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco. Las proteínas que contienen residuos N-terminales de serina o treonina pueden reaccionar con meta-peryodato sódico, resultando en la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido.
Preferentemente, la unidad de ligador puede presentar la fórmula general a continuación:
-Ta-Ww-Yy-
en la que:
-T- es una unidad ensanchadora,
a es 0 o 1,
-W- es una unidad de aminoácido,
w es, independientemente, un número entero comprendido entre 1 y 12,
-Y- es una unidad espaciadora,
y es 0, 1 o 2.
La unidad ensanchadora (-T-), en caso de hallarse presente, une la proteína de unión a antígeno a una unidad de aminoácido (-W-). Entre los grupos funcionales útiles que pueden encontrarse presentes en la proteína de unión a antígeno, naturalmente o mediante manipulación química, se incluyen sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato, y carboxilo. Son grupos funcionales adecuados los sulfhidrilo y amino. Pueden generarse grupos sulfhidrilo mediante reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de la proteína de unión a antígeno, en caso de hallarse presente. Alternativamente, pueden generarse grupos sulfhidrilo mediante reacción de un grupo amino de una fracción lisina de la proteína de unión a antígeno con 2-iminotiolano u otros reactivos generadores de sulfhidrilo. Específicamente, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo recombinante y se manipula para que porte una o más lisinas. Más preferentemente, la proteína de unión a antígeno puede manipularse para portar una o más cisteínas (ver los tioMAb).
La unidad ensanchadora puede formar un enlace con un átomo de azufre de la proteína de unión a antígeno. El átomo de azufre puede derivarse de un grupo sulfhidrilo (-SH) de una proteína de unión a antígeno reducida.
La unidad ensanchadora puede unirse a la proteína de unión a antígeno mediante un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la proteína de unión a antígeno y un átomo de azufre de la unidad ensanchadora.
El grupo reactivo de la unidad ensanchadora puede contener un sitio reactivo que puede ser reactivo con un grupo amino de la proteína de unión a antígeno. El grupo amino puede ser de una arginina o de una lisina. Entre los sitios reactivos de amina adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ésteres activados, tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.
Además, la función reactiva de la unidad ensanchadora contiene un sitio reactivo que es reactivo con un grupo carbohidrato modificado que puede encontrarse presente en la proteína de unión a antígeno. Específicamente, la proteína de unión a antígeno puede glucosilarse enzimáticamente para proporcionar una fracción carbohidrato (debe indicarse que, en el caso de que la proteína de unión a antígeno sea un anticuerpo, dicho anticuerpo generalmente está glucosilado naturalmente). El carbohidrato puede oxidarse levemente con un reactivo, tal como peryodato sódico, y la unidad carbonilo resultante del carbohidrato oxidado puede condensarse con una unidad ensanchadora que contenga una funcionalidad, tal como una hidrazida, una oxima, una amina reactiva, una hidrazina, una tiosemicarbazida, un carboxilato de hidrazina o una arilhidrazida.
La unidad aminoácido (-W-) une la unidad ensanchadora (-T-) a la unidad espaciadora (-Y-) en el caso de que la unidad espaciadora se encuentre presente, y une la unidad ensanchadora al agente citotóxico en el caso de que la unidad espaciadora se encuentre ausente.
Tal como se ha indicado anteriormente, -Ww- puede ser una unidad dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido.
En particular, la unidad de aminoácidos puede comprender residuos aminoácidos, tales como, aunque sin limitarse a ellos, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, prolina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con grupos tosilo o nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo, y citrulina. Entre los componentes ejemplificativos del ligador de aminoácidos se incluyen preferentemente un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido.
Entre los dipéptidos ejemplificativos se incluyen: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg.
Entre los tripéptidos ejemplificativos se incluyen: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.
Entre los tetrapéptidos ejemplificativos se incluyen: Gly-Phe-Leu-Gly (SEC ID n° 33), Ala-Leu-Ala-Leu (SEC ID n° 34).
Entre los pentapéptidos ejemplificativos se incluyen: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEC ID n° 35).
Entre los residuos aminoácidos que comprenden un componente ligador de aminoácidos se incluyen los presentes naturalmente, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos no naturales, tales como citrulina. Pueden diseñarse y optimizarse componentes ligadores de aminoácidos en su selectividad para el corte enzimático por un enzima particular, por ejemplo una proteasa asociada a tumor, catepsina-B, C y D o una proteasa de plasmina.
La unidad aminoácido del ligador puede cortarse enzimáticamente con un enzima, incluyendo, aunque sin limitación, una proteasa asociada a tumor, para liberar el agente citotóxico.
La unidad aminoácido puede diseñarse y optimizarse en su selectividad para el corte enzimático por una proteasa asociada a tumor particular. Las unidades adecuadas son aquellas cuyo corte está catalizado por las proteasas, catepsina B, C y D, y plasmina.
La unidad espaciadora (-Y-), en caso de hallarse presente, une una unidad aminoácido al agente citotóxico. Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales: autoinmolante y no autoinmunolante. Una unidad espaciadora no autoinmolante es una en la que parte o toda la unidad espaciadora se mantiene unida al agente citotóxico después del corte enzimático de una unidad aminoácida respecto del inmunoconjugado. Entre los ejemplos de una unidad espaciadora no autoinmolante se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, una unidad espaciadora de (glicinaglicina) y una unidad espaciadora de glicina. Para liberar el agente citotóxico, debe tener lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula diana para cortar el enlace de la unidad de glicina-fármaco.
Específicamente, una unidad espaciadora no autoinmolante (-Y-) puede ser -Gly-.
En particular, el inmunoconjugado puede no presentar una unidad espaciadora (y=0).
Alternativamente, un inmunoconjugado que contiene una unidad espaciadora autoinmolante puede liberar el agente citotóxico sin necesidad de una etapa separada de hidrólisis. De acuerdo con lo anterior, -Y- es un alcohol p-aminobencílico (PAB) que se une a -Ww- mediante el átomo de nitrógeno del grupo PAB y se conecta directamente a -D mediante un grupo carbonato, carbamato o éter.
Entre otros ejemplos de espaciadores autoinmolantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB, tales como derivados 2-aminoimidazol-5-metanol y orto- o para-aminobencilacetales. Pueden utilizarse espaciadores que experimentan una fácil ciclización con la hidrólisis del enlace amida, tales como amida de ácido 4-aminobutírico sustituida o no sustituida, sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico.
Alternativamente, la unidad espaciadora es una unidad bis(hdiroximetil)estireno (BHMS) ramificada, que puede utilizarse para incorporar agentes citotóxicos adicionales.
Finalmente, la divulgación se refiere a un inmunoconjugado tal como se ha indicado anteriormente, para la utilización en el tratamiento del cáncer.
Los cánceres pueden seleccionarse preferentemente de entre cánceres relacionados con Axl, incluyendo células tumorales que expresan o sobreexpresan la totalidad o una parte de la proteína Axl en su superficie.
Más particularmente, dichos cánceres son cáncer de mama, colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmonar, melanoma, osteosarcoma, ovárico, prostático, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo, cáncer uterino endometrial y cualesquiera fenómenos de resistencia farmacológica.
La presente divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado tal como se indica en la especificación.
Más particularmente, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado con por lo menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En la presente descripción, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" pretende indicar un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del compuesto o compuestos activos, un incremento en su tiempo de vida y/o en su eficacia en el cuerpo, un incremento en su solubilidad en solución o alternativamente una mejora en su conservación. Dichos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la materia en función de su naturaleza y del modo de administración del compuesto o compuestos activos seleccionados.
Preferentemente, dichos inmunoconjugados se administran por vía sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por vía oral. De una manera más preferida, la composición que comprende los inmunoconjugados se administran varias veces, de una manera secuencial. Sus modos de administración, dosis y formas farmacéuticas óptimas pueden determinarse según los criterios generalmente considerados en el establecimiento de un tratamiento adaptado al paciente, tal como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su condición general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios observados.
Leyendas de figura
Figuras 1A-C: ensayo de citotoxicidad in vitro utilizando anticuerpo secundario conjugado con Mab-zap en células SN12C para 110D7 (A), 1003A2 (B) y 1024G11 (C).
Figura 2A-2I: especificidad de la unión de anti-Axl de:
• 110D7 sobre las proteínas rhAxl-Fc (2A), rhDtk-Fc (2B) o rhMer-Fc (2C) inmovilizadas, según ELISA, • 1003A2 sobre las proteínas rhAxl-Fc (2D), rhDtk-Fc (2E) o rhMer-Fc (2F) inmovilizadas, según ELISA, • 1024G11 sobre las proteínas rhAxl-Fc (2G), rhDtk-Fc (2H) o rhMer-Fc (2I) inmovilizadas, según ELISA, Figura 3A-C: datos de respuesta a dosis 110D7 (A), 1003A2 (B) y 1024G11 (C) obtenidos mediante citometría de flujo en presencia de diversas líneas celulares tumorales humanas (Calu-1, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB435S, NCI-H125, Panc1 y SN12C).
Figura 4A-C: ELISA en la proteína rmAxl-Fc inmovilizada ("rm", por recombinante murina) para 110D7 (A), 1003A2 (B) y 1024G11 (C).
Figura 5A-C: unión de 110D7 (A), 1003A2 (B) y1024G11 (C) sobre células COS7 según determinación mediante un protocolo de marcaje indirecto utilizando el método de la citometría de flujo.
Figura 6A-C: ELISA competitiva de la unión de Gas6 utilizando los anticuerpos anti-Axl 110D7 (A), 1003A2 (B) y1024G11 (C).
Figura 7A-C: análisis de la unión a epítopos mediante transferencia western utilizando el lisado de células SN12C para 110D7 (A), 1003A2 (B) y 1024G11 (C). NH (sin calor); NR (sin reducción); H (calor); R (reducción). La detección de GAPDH confirma la carga correcta de las muestras en el gel.
Figura 8A-F: estudio de la regulación negativa de Axl tras la unión de 110D7, 1003A2 y 1024G11 sobre células SN12C mediante transferencia western con las figuras 8A (110D7), 8C (1003A2) y 8E (1024G11) - la imagen de la transferencia western es representativa de 3 experimentos independientes realizados (el análisis de transferencia western se llevó a cabo tras una incubación de 4 h y de 24 h del anticuerpo anti-Axl sobre células SN12C), y las figuras 8B (110D7), 8D (1003A2) y 8F (1024G11) - cuantificación de la densidad óptica de la película presentada utilizando el software "QuantityOne".
Figura 9A-I: microscopía de inmunofluorescencia de células SN12C tras la incubación con los anticuerpos anti-Axl 110D7, 1003A2 and 1024G11. Figuras 9A (110D7), 9D (1003A2) y 9G (1024G11) - Fotografías de las condiciones de IgG1_m de isotipo de control tanto para la membrana como para la tinción intracelular. Figuras 9B (110D7), 9E (1003A2) y 9H (1024G11) - Tinción de membranas. Figuras 9C (110D7), 9F (1003A2) y 9I (1024G11) - Tinción intracelular de los receptores de Axl mediante la utilización de los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11, respectivamente, y el marcador endosómico temprano EEA1. Las imágenes superpuestas se presentan a continuación y las colocalizaciones visualizadas se indican mediante las flechas.
Figura 10A-C: efecto de los anticuerpos 110D7 (A), 1003A2 (B) y 1024G11 (C) sobre la proliferación in vitro de las células SN12C en comparación con el efecto de un anticuerpo IgG1_m de control de isotipo.
Las figuras 11A-11K presentan el porcentaje de citotoxicidad en función de la concentración de inmunoconjugado de 110D7 obtenida en diferentes ensayos de citotoxicidad celular in vitro con células tumorales (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 o (k ) Panc1 tratadas con un abanico de concentraciones de inmunoconjugado de 117D7-saponina.
Las figuras 12A-12K presentan el porcentaje de citotoxicidad en función de la concentración de inmunoconjugado de 1003A2 obtenida en diferentes ensayos de citotoxicidad celular in vitro con células tumorales (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 o (k ) Panc1 tratadas con un abanico de concentraciones de inmunoconjugado de 1003A2-saponina.
Las figuras 13A-13K presentan el porcentaje de citotoxicidad en función de la concentración de inmunoconjugado de 1024G11 obtenida en diferentes ensayos de citotoxicidad celular in vitro con células tumorales (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 o (k ) Panc1 tratadas con un abanico de concentraciones de inmunoconjugado de 1024G11-saponina.
Ejemplos
En los ejemplos a continuación, el anticuerpo de control de isotipo utilizado consiste en una IgG1 murina denominada 9G4. Significa que, en los ejemplos a continuación, las expresiones IgG1_m de control y 9G4 son similares.
Ejemplo 1: intemalización de receptores de Axl
Debido a que un enfoque de inmunoconjugados resulta más eficiente en el caso de que el antígeno dirigido sea una proteína internalizante, se estudió la internalización de receptores de Axl mediante la utilización del ensayo de citotoxicidad de MAb-Zap en líneas celulares tumorales humanas. Más exactamente, el reactivo MAb-Zap es un conjugado químico de IgG de cabra antirratón purificado por afinidad y la proteína inactivadora de ribosomas saporina. En el caso de que se produzca la internalización del complejo inmunitario, la saporina se desprende del agente de transporte dirigido e inactiva los ribosomas, causando la inhibición de la proteína y, finalmente, la muerte celular. La determinación de la viabilidad celular tras 72 horas de incubación con los anticuerpos en células positivas para Axl permite concluir si se ha internalizado o no el receptor de Axl.
Para el presente ejemplo, se utilizaron células altamente positivas para Axl, según determinación mediante la utilización del reactivo Qifikit (Dako). Los datos se presentan en la tabla 5, a continuación.
Tabla 5
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En el ejemplo, posteriormente, se utilizaron células SN12C como ejemplo no limitativo. Podría utilizarse cualquier otra línea celular que expresase el nivel apropiado de receptor de Axl sobre su superficie celular.
Se preincubaron intervalos de concentración de los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 o el anticuerpo IgG1_m de control de isotipo 9G4, con 100 ng de anticuerpo secundario de MAb-Zap (Advanced Targeting Systems) en medio de cultivo celular durante 30 min a TA. Dichas mezclas se cargaron sobre células SN12C subconfluyentes sembradas en microplacas de 96 pocillos blancas. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37°C en presencia de 5% de CO2. Se determinó la viabilidad celular utilizando un método de proliferación celular Cell Titer Glo siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega). Se realizaron varios controles: se prepararon las condiciones i) sin ningún inmunoconjugado secundario y ii) sin anticuerpo primario. En paralelo, se llevaron a cabo ensayos con IgG1_m de control de isotipo.
Los resultados obtenidos se representan en las figuras 1A (110D7), 1B (1003A2) y 1C (1024G11).
El anticuerpo 110D7 muestra un efecto citotóxico máximo sobre las células SN12C de ~49%. El anticuerpo 1003A2 muestra un efecto citotóxico máximo sobre las células SN12C de ~37 %. El anticuerpo 1024G11 muestra un efecto citotóxico máximo sobre las células SN12C de ~40%.
No se observó efecto citotóxico en presencia del anticuerpo 9G4, considerado IgG1_m de control de isotipo en el experimento.
No se observó citotoxicidad en los pocillos que contenían únicamente anticuerpos primarios (datos no representados). De esta manera, el receptor de Axl aparentemente es un antígeno conveniente como diana para un enfoque de inmunoconjugado, ya que el complejo inmunitario que comprende Axl-110D7-MabZap, Axl-1003A2-MabZap o Axl-1024G11-MabZap induce una citotoxicidad eficaz de las células diana.
Ejemplo 2: generación de anticuerpos contra la proteína DEC de rhAxl.
2.1 Generación del anticuerpo de Axl 110D7.
Con el fin de generar anticuerpos monoclonales (MAb) murinos contra el dominio extracelular (DEC) humano del receptor de Axl, se inmunizaron 5 ratones BALB/c 3 veces s.c. con 5 a 15 |jg de la proteína rhAxl-Fc (R&D Systems, n° de cat. 154-AL). La primera inmunización se llevó a cabo en presencia de adyuvante de Freund completo (Sigma, St. Louis, MD, EE.UU.). Se añadió adyuvante de Freund incompleto (Sigma) para las siguientes inmunizaciones.
Tres días antes de la fusión, los ratones inmunizados recibieron un refuerzo de 15 jg de la proteína rhAxl-Fc (CIPF) por vía intraperitoneal (i.p.) con IFA.
Se prepararon esplenocitos y linfocitos mediante perfusión del bazo y mediante trituración de los ganglios linfáticos proximales, respectivamente, recolectados de 1 de cada 5 ratones inmunizados (seleccionados después de la titulación de los sueros) y se fusionaron con células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, Rockville, MD, Ee .UU.). El protocolo de fusión se describe en Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975. A continuación, las células fusionadas se sometieron a selección con HAT. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, resulta posible hacer referencia a técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, página 726, 1988).
Aproximadamente 10 días después de la fusión, se cribaron colonias de células híbridas. Para el cribado primario, se evaluaron los sobrenadantes de los hibridomas para la secreción de MAb generados contra la proteína rhAxl-Fc mediante la utilización de un ELISA. En paralelo, se llevó a cabo un análisis de FACS para seleccionar los MAb capaces de unirse a la forma celular de Axl presente sobre la superficie celular de las células de tumor prostético DU145 humanas (ATCC).
Tan pronto como resultó posible, se clonaron los hibridomas seleccionados mediante dilución limitante y a continuación se cribaron para su reactividad con la proteína DEC de Axl humana. A continuación, se isotiparon los MAb clonados mediante la utilización de un kit de isotipado (n° de cat. 5300.05, Southern Biotec, Birmingham, AL, EE.UU.). Se seleccionó un clon obtenido de cada hibridoma y se expandió.
Los sobrenadantes de hibridoma se sometieron a ensayo mediante ELISA para determinar su capacidad de unión al dominio DEc del receptor de Axl humano o a la proteína rhAxl-Fc. Al determinar el contenido de IgG en los sobrenadantes, se llevó a cabo la titulación partiendo de 5 pg/ml. A continuación, se llevó a cabo la dilución en serie 1/2 en las siguientes 11 filas. En caso contrario, se aplicaron los sobrenadantes puros. Brevemente, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos (Costar 3690, Corning, NY, EE.UU.) con 50 pl/pocillo de la proteína rhAxl-Fc (R&D Systems, n° de cat. 154-AL) a 2 pg/ml en PBS durante la noche a 4°C. A continuación, las placas se bloquearon con PBS que contenía gelatina al 0.5% (n° 22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) durante 2 h a 37°C. Una vez se había descartado el tampón saturante mediante agitación de las placas, se añadieron 50 pl de sobrenadantes celulares de hibridoma puros o 50 pl de una solución 5 pg/ml a las placas de ELISA y se incubaron durante 1 h a 37°C. Tras tres lavados, se añadieron 50 pl de IgG de cabra antirratón policlonal conjugado con peroxidasa de rábano picante (n° 115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, EE.UU.) a una dilución de 1/5000 en PBS que contenía gelatina al 0.1% y Tween-20 al 0.05% (p:p) durante 1 h a 37°C. A continuación, las placas de ELISA se lavaron 3 veces y se añadió el sustrato de TMB (n° UP664782, Uptima, Interchim, Francia). Tras una incubación de 10 min a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 1 M y se midió la densidad óptica a 450 nm.
Para la selección mediante citometría de flujo, se sembraron 100.000 células de cáncer de próstata humano DU145 que expresaban receptor de Axl sobre su superficie (ATCC) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en PBS que contenía BSA al 1% y azida sódica al 0.01% (tampón FACS) a 4°C. Tras centrifugar durante 2 min a 2000 rpm, se eliminó el tampón y se añadieron los sobrenadantes de hibridoma o MAb purificados (1 pg/ml) para ensayo. Tras 20 min de incubación a 4°C, las células se lavaron dos veces y se añadió anticuerpo de cabra antirratón conjugado con Alexa 488 diluido 1/500 en tampón FACS (n° A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, EE.UU.) y se Incubaron durante 20 min a 4°C. Tras un lavado final con tampón de FACS, las células se analizaron mediante FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) tras la adición de yoduro de propidio a cada tubo a una concentración final de 40 pg/ml. Se incluyeron como controles negativos pocillos que contenían células solas y células incubadas con anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488. Se utilizaron controles de isotipo en cada experimento (Sigma, ref. n° M90351MG). Se evaluaron por lo menos 5000 células para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia (IMF).
Més exactamente, se llevó a cabo la fusión con 310106 esplenocitos recolectados y 310106 células de mieloma (relación 1:1). A continuación, se sembraron doscientas células de la suspensión celular resultante a razón de 210 6 células/ml en 30 placas de 96 pocillos.
Un primer cribado (aproximadamente el día 14 después de la fusión) mediante ELISA en la proteína rhAxl-Fc y mediante análisis de FACS utilizando la línea de células tumorales DU145 permitió seleccionar 5 hibridomas que presentan densidades ópticas (DO) superiores a 0.5 en un recubrimiento de Axl-Fc y IMF superior a 40 en la línea celular de tumor prostático humano DU145.
Se expandieron dichos 5 hibridomas y se clonaron mediante dilución limitante. Se preparó una placa de 96 pocillos para cada código. Nueve días después de la siembra en placa, primero se cribaron los sobrenadantes de las placas de clonación mediante ELISA para su especificidad de unión al dominio dominio extracelular de la proteína rhAxl-Fc. A continuación, se llevó a cabo otro ensayo ELISA para eliminar los MAb anti-Fc utilizando la proteína Notch-Fc recombinante de rata inmovilizado. Además, los hibridomas se sometieron a ensayo para la reactividad sobre la línea celular de cáncer prostático humano DU145 mediante citometría de flujo. Se expandieron e isotiparon tres clones de cada código. Una vez producidos los anticuerpos anti-Axl, se estudiaron adicionalmente para su capacidad de ser internalizados tras la unión de Axl sobre la superficie celular.
2.2 Generación de los anticuerpos de Axl 1003A2 y 1024G11 (ejemplo ilustrativo).
Con el fin de generar anticuerpos monoclonales (MAb) murinos contra el dominio extracelular (DEC) humano del receptor de Axl, se inmunizaron 5 ratones BALB/c 4 veces por vía s.c. (subcutánea) con 20 pg de la proteína Axl monomérica humana (producto del laboratorio de los solicitantes). La primera inmunización se llevó a cabo en presencia de adyuvante de Freund completo (Sigma, St. Louis, MD, EE.UU.). Se añadió adyuvante de Freund incompleto (Sigma) para las siguientes inmunizaciones.
Tres días antes de la fusión, los ratones inmunizados recibieron un refuerzo de 20 pg de la proteína Axl monomérica (producto de los presentes solicitantes) por vía intraperitoneal (i.p.) con IFA.
Para generar células de hibridoma, se prepararon esplenocitos y linfocitos mediante perfusión del bazo y mediante trituración de los ganglios linfáticos proximales, respectivamente, recolectados de 1 de cada 5 ratones inmunizados (seleccionados después de la titulación de los sueros) y se fusionaron con células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). El protocolo de fusión se describe en Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975. A continuación, las células fusionadas se sometieron a selección con HAT. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, resulta posible hacer referencia a técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, página 726, 1988).
Aproximadamente 10 días después de la fusión, se cribaron las colonias de las células híbridas. Para el cribado primario, se evaluaron los sobrenadantes de los hibridomas para la secreción de MAb generados contra la proteína Axl monomérica humana (CIPF) mediante la utilización de un ELISA. En paralelo, se llevó a cabo un análisis de FACS para seleccionar los MAb capaces de unirse a la forma celular de Axl presente sobre la superficie celular de las células de tumor prostático DU145 humanas (ATCC).
Tan pronto como resultó posible, se clonaron los hibridomas seleccionados mediante dilución limitante y a continuación se cribaron para su reactividad con el receptor de Axl monomérico. A continuación, se isotiparon los MAb clonados mediante la utilización de un kit de isotipado (n° de cat. 5300.05, Southern Biotec, Birmingham, AL, EE.UU.). Se seleccionó un clon obtenido de cada hibridoma y se expandió.
Los sobrenadantes de hibridoma se sometieron a ensayo mediante ELISA para determinar su capacidad de unión al dominio DEC del receptor de Axl humano. Al determinar el contenido de IgG en los sobrenadantes, se llevó a cabo la titulación partiendo de 5 pg/ml. A continuación, se llevó a cabo la dilución en serie 1/2 en las siguientes 11 filas. En caso contrario, se aplicaron los sobrenadantes puros. Brevemente, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos (Costar 3690, Corning, NY, EE.UU.) con 50 pl/pocillo de una solución de DEC de Axl (CIPF) a razón de 2 pg/ml en PBS o 50 pl/pocillo de la proteína Axl-Fc (R&D Systems, n° de cat. 154-AL) a una concentración de 2 pg/ml en PBS durante la noche a 4°C. A continuación, las placas se bloquearon con PBS que contenía gelatina al 0.5% (n° 22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) durante 2 h a 37°C. Una vez se había descartado el tampón saturante mediante agitación de las placas, se añadieron 50 pl de sobrenadantes celulares de hibridoma puros o 50 pl de una solución 5 pg/ml a las placas de ELISA y se incubaron durante 1 h a 37°C. Tras tres lavados, se añadieron 50 pl de IgG de cabra antirratón policlonal conjugado con peroxidasa de rábano picante (n° 115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, EE.UU.) a una dilución de 1/5000 en PBS que contenía gelatina al 0.1% y Tween-20 al 0.05% (p:p) durante 1 h a 37°C. A continuación, las placas de ELISA se lavaron 3 veces y se añadió el sustrato de TMB (n° UP664782, Uptima, Interchim, Francia). Tras una incubación de 10 min a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 1 M y se midió la densidad óptica a 450 nm.
Para la selección mediante citometría de flujo, se sembraron 100,000 células de cáncer de próstata humano DU145 que expresaban receptor de Axl sobre su superficie (ATCC) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en PBS que contenía BSA al 1% y azida sódica al 0.01% (tampón FACS) a 4°C. Tras centrifugar durante 2 min a 2000 rpm, se eliminó el tampón y se añadieron los sobrenadantes de hibridoma o MAb purificados (1 pg/ml) para ensayo. Tras 20 min de incubación a 4°C, las células se lavaron dos veces y se añadió anticuerpo de cabra antirratón conjugado con Alexa 488 diluido 1/500 en tampón FACS (n° A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, EE.UU.) y se Incubaron durante 20 min a 4°C. Tras un lavado final con tampón de FACS, las células se analizaron mediante FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) tras la adición de yoduro de propidio a cada tubo a una concentración final de 40 pg/ml. Se incluyeron como controles negativos pocillos que contenían células solas y células incubadas con anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488. Se utilizaron controles de isotipo en cada experimento (Sigma, ref. n° M90351MG). Se evaluaron por lo menos 5000 células para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia (IMF).
Se llevó a cabo la fusión con 280 106 esplenocitos recolectados y 280 106 células de mieloma (relación 1:1). La Suspensión de células fusionadas resultante (2106 células/ml) a continuación se sembró en 30 placas de 96 pocillos.
Un primer cribado (aproximadamente el día 14 después de la fusión) mediante ELISA de la proteína DEC de Axl inmovilizada permitió seleccionar 69 hibridomas que presentaban densidades ópticas (DO) superiores a 1 en el recubrimiento de DEC de Axl. Un análisis de FACS complementario mediante la utilización de la línea celular de tumor DU145 limitó el número de hibridomas seleccionados. En esta etapa se reservaron 17 hibridomas que presentaban una IMF superior a 100 en la línea celular de tumor prostático humano DU145 y se clonaron mediante dilución limitante. Las placas de clonación se cribaron mediante la utilización de ELISA de Axl monomérica; los hibridomas seleccionados a continuación se expandieron y se caracterizaron adicionalmente para su especificidad de unión y su capacidad de ser internalizados.
Ejemplo 3: especificidad de unión de Axl.
En el presente ejemplo, se estudió la unión de los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11, respectivamente, a la proteína rhAxl-Fc. En segundo lugar, se estudió su unión a los dos otros elementos de la familia TAM: rhDtk-Fc y rhMer-Fc.
Brevemente, las proteínas recombinantes humanas Axl-Fc recombinante (R&D Systems, n° de cat. 154AL/CF), rhDtk (R&D Systems, n° de cat. 859-DK) o rh-Mer-Fc (R&D Systems, n° de cat. 891-MR) se utilizaron para recubrir durante la noche a 4°C placas de 96 pocillos Immulon II y, tras una etapa de bloqueo de 1 h con una solución de gelatina al 0.5%, se añadieron los anticuerpos 110D7, 1003A2 y1024G ll purificados, respectivamente, durante 1 h adicional a 37°C a la concentración inicial de 5 pg/ml (3.33 10'8M). A continuación, se llevaron a cabo diluciones en serie de 1/2 en 12 columnas. A continuación, las placas se lavaron y se añadió una IgG de cabra antirratón (Jackson) específica-HRP durante 1 h a 37°C. Se llevó a cabo el desarrollo de la reacción utilizando la solución de sustrato TMB. Asimismo se utilizó en paralelo el anticuerpo comercial anti-Axl MAb 154 (datos no representados). Se llevaron a cabo controles de recubrimiento en presencia de un suero policlonal de Fc de cabra anti-IgG humana marcado con HRP (Jackson, ref. n° 109-035-098) y/o en presencia de un anticuerpo anti-histidina acoplado a HRP (R&D Systems, n° ref. MAB050H). No se observó unión no específica en ausencia de anticuerpo primario (diluyente). Los resultados para 110D7 se representan en las figuras 2A, 2B y 2C, respectivamente. Los resultados para 1003A2 se representan en las figuras 2D, 2E y 2F, respectivamente. Los resultados para 1024G11 se representan en las figuras 2G, 2H y 2I, respectivamente.
El presente ejemplo muestra que los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 sólo se unen a la proteína rhAxl-Fc y no se unen a dos otros elementos de la familia TAM: rhDtk o rhMer. No se observó reactividad cruzada de los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 entre elementos TAM.
Ejemplo 4: detección de Axl sobre células tumorales humanas.
En primer lugar, se estableció el nivel de expresión de Axl de superficie celular sobre las células tumorales humanas mediante la utilización de un anticuerpo de Axl comercial (R&D Systems, n° ref. MAB154) en paralelo a perlas de calibración, para permitir la cuantificación del nivel de expresión de Axl. En segundo lugar, se estudió la unión de Axl de superficie celular mediante la utilización de 110D7, 1003A2 y 1024G11. En ambos casos, las condiciones experimentales fueron las brevemente indicadas posteriormente.
Para los estudios de unión a superficie celular, se prepararon diluciones en serie de dos veces de una solución de anticuerpo primario de 10 pg/ml (6.66 10'8 M) (110D7, 1003A2, 1024G11, anticuerpo comercial de Axl MAB154 IgG1_m control de isotipo MAb 9G4) en 11 puntos y se aplicaron a 2105 células durante 20 min a 4°C. Tras 3 lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con BSA al 1% y NaN3 al 0.01%, las células se incubaron con anticuerpo secundario de cabra antirratón-Alexa 488 (dilución 1/500) durante 20 minutos a 4°C. Tras 3 lavados adicionales en PBS complementado con BSA al 1% y NaN3 al 0.1%, las células se analizaron mediante FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Se evaluaron por lo menos 5000 células para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia.
Para la determinación cuantitativa de ABC utilizando el anticuerpo de Axl MAb154, se utilizaron perlas de calibración QIFIKIT®. A continuación, las células se incubaron en paralelo con las perlas QIFlKlT® con inmunoglobulinas de cabra policlonales antirratón/FITC, F(ab')2 de cabra, a concentración saturante. A continuación, se determinó el número de sitios antigénicos sobre las células de espécimen, mediante interpolación de la curva de calibración (la intensidad de fluorescencia de las poblaciones individuales de perla frente al número de moléculas de MAb sobre las perlas).
4.1. Cuantificación del nivel de expresión de Axl en la superficie celular.
Se determinó el nivel de expresión de Axl sobre la superficie de las células tumorales humanas mediante citometría de flujo utilizando un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (método QIFIKIT® (Dako, Dinamarca), un kit de citometría de flujo cuantitativa para evaluar los antígenos de superficie celular). Una comparación de la intensidad media de fluorescencia (IMF) de los niveles de antígeno conocidos de las perlas mediante un gráfico de calibración permite determinar la capacidad de unión de los anticuerpos (ABC) de las líneas celulares.
La tabla 6 presenta el nivel de expresión de Axl detectado sobre la superficie de diversas líneas celulares tumorales humanas (SN12C, Calu-1, A172, A431, DU145, MDA-MB435S, MDA-MB231, PC3, NCI-H226, NCI-H125, MCF7, Panc1) (ATCC, NCI) según determinación utilizando QIFIKIT® en presencia del anticuerpo comercial de Axl MAB154 (R&D Systems). Los valores se proporcionan como complejo de unión de antígeno (ABC).
Tabla 6
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Los resultados obtenidos con un anticuerpo Axl monoclonal comercial (MAB154) mostraron que el receptor de Axl se expresa a diversos niveles según la célula tumoral humana considerada.
4.2. Detección de Axl mediante la utilización de los anticuerpos110D7, 1003A2 y 1024G11 sobre células tumorales humanas.
Más específicamente, se estudió la unión de Axl mediante la utilización de los anticuerpos Axl 110D7, 1003A2 o 1024G11. Se aplicaron curvas de dosis-respuesta de anticuerpo de Axl. A continuación, se analizaron con el software Prism las IMF obtenidas mediante la utilización de las diversas células tumorales humanas. Los datos se presentan en las figuras 3A-3C.
Los datos indican que los tres anticuerpos de Axl se unen específicamente al receptor de Axl membranal, tal como confirman los perfiles de curva de saturación. Sin embargo, se observaron diferentes intensidades de marcaje, revelando niveles variables de receptor de Axl de superficie celular sobre las células tumorales humanas. No se observó unión de receptor de Axl utilizando la línea celular de tumor de mama humano MCF7.
Ejemplo 5: especificidad cruzada entre especies de los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11.
Para estudiar la especificidad cruzada en diferentes especies de los anticuerpos anti-Axl 110D7, 1003A2 y 1024G11, se consideraron 2 especies: el ratón y el mono. En primer lugar, se estudió la unión sobre el receptor de Axl de ratón recombinante (rm) mediante ELISA (figuras 4A a C). En segundo lugar, se llevaron a cabo experimentos de citometría de flujo utilizando células COS7 de mono, ya que estas células expresan el receptor de Axl sobre su superficie (figuras 5A a C). Se obtuvo la línea celular COS7 mediante inmortalización de una línea celular CV-1 derivada de células renales del mono verde africano con una versión del genoma de SV40 que puede producir antígeno T grande, aunque presenta un defecto de la replicación genómica.
5.1 ELISA de rmAxl-Fc
Brevemente, las proteínas Axl-Fc recombinantes de ratón (R&D Systems, n° de cat. 854-AX/CF) se utilizaron para recubrir durante la noche a 4°C placas de 96 pocillos Immulon II y, tras una etapa de bloqueo de 1 h con una solución de gelatina al 0.5%, se añadieron los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 purificados, respectivamente, durante 1 h adicional a 37°C a la concentración inicial de 5 pg/ml (3.33 10-8 M). A continuación, se llevaron a cabo diluciones en serie de 1/2 en 12 columnas. A continuación, las placas se lavaron y se añadió una IgG de cabra antiratón (Jackson) específica-HRP durante 1 h a 37°C. Se llevó a cabo el desarrollo de la reacción utilizando la solución de sustrato TMB. Asimismo se utilizó en paralelo el anticuerpo comercial anti-Axl MAb 154. Se llevaron a cabo controles de recubrimiento en presencia de un suero policlonal de Fc de cabra anti-IgG humana marcado con HRP (Jackson, ref. n° 109-035-098) y/o en presencia de un anticuerpo anti-histidina acoplado a HRP (R&D Systems, n° ref. MAB050H). No se observó unión específica en ausencia de anticuerpo primario (diluyente).
Los resultados se representan en las figuras 4A (110D7), 4B (1003A2) y 4C (1024G11).
La figura 4A muestra que el anticuerpo 110D7 es capaz de unirse al dominio DEC de Axl murino únicamente en presencia de una concentración elevada de anticuerpo (superior a 8.3 x 10'9 M).
La figura 4B muestra que el anticuerpo 1003A2 no se une al dominio DEC de Axl murino.
La figura 4C muestra que el anticuerpo 1024G11 no se une al dominio DEC de Axl murino.
5.2 FACS de COS7
Para 110D7, 1003A2 y 1024G11, con fines de unión celular se incubaron 2105 células en un intervalo de concentraciones de anticuerpos preparado mediante dilución en serie de 1/2 (12 puntos) de una solución de anticuerpo de 10 pg/ml (6.66-10-8 M) de 110D7, 1003A2 y 1024G11, o m9G4 (IgGl_m MAb de control de isotipo), durante 20 min a 4°C. Tras 3 lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con BSA al 1% y NaN3 al 0.01%, las células se incubaron con el anticuerpo secundario de cabra antirratón-Alexa 488 (dilución 1/500) durante 20 minutos a 4°C. Tras 3 lavados adicionales en PBS complementado con BSA al 1% y NaN3 al 0.1%, las células se analizaron mediante FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Se evaluaron por lo menos 5000 células para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia. Los datos se analizaron utilizando el software Prism.
Los resultados se representan en las figuras 5A (110D7), 5B (1003A2) y 5C (1024G11).
La curva de titulación establecida en células COS7 utilizando los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11, e IgG1_m de control de isotipo, confirmó que 110D7, 1003A2 y 1024G11 son capaces de reconocer la forma celular de mono del receptor de Axl expresada sobre la superficie de las células COS7.
Se alcanzó una meseta a concentraciones de anticuerpo 110D7 superiores a 156 pg/ml (10-9 M). Para el anticuerpo 1003A2 se alcanzó una meseta a concentraciones superiores a 0.07 pg/ml (5.210-10 M). Para el anticuerpo 1024G11 se alcanzó una meseta a concentraciones superiores a 0.07 pg/ml (5.210-10 M).
No se observó unión en presencia de IgG1_m de isotipo de control.
Ejemplo 6: experimentos competitivos de Gas6 realizados en presencia de los anticuerpos 110D7, 1003A2 y1024G11.
A fin de caracterizar adicionalmente los MAb anti-Axl, se llevaron a cabo ensayos de competición de Gas6. En dicho ensayo, se incubó la proteína rhAxl-Fc libre y el anticuerpo anti-Axl para formar complejo de antígenoanticuerpo y después los complejos se cargaron en una superficie recubierta con Gas6 en la placa de ensayo. Los complejos de anticuerpo-antígeno no unidos se eliminaron mediante lavado antes de añadir anticuerpo secundario unido a enzima contra la parte Fc humana de la proteína rhAxl-Fc. A continuación, se añadió el sustrato y a continuación pudo determinarse la concentración de antígeno a partir de la fuerza de la señal inducida por la reacción de enzima-sustrato.
Brevemente, la mezcla de reacción que comprendía la proteína rhAxl-Fc en presencia o no de los MAb para ensayo se preparó en una placa saturada (gelatina al 0.5% en PBS IX) separada. Serie 1: se realizaron 2 diluciones (partiendo de 80 pg/ml en 12 columnas) de anticuerpos de Axl murinos (110D7, 1003A2 y 1024G11). A continuación, se añadieron 0.5 pg/ml de la proteína rhAxl-Fc (R&D Systems, ref. n° 154AL/CF), excepto a la línea de control negativo, que contenía únicamente diluyente de ELISA (gelatina al 0.1%, Tween-20 al 0.05% en PBS IX). Tras la homogeneización, se cargaron las muestras de competición en placas recubiertas con Gas6 con una solución de rhGas66 pg/ml en PBS (R&D Systems, n° de cat. 885-GS-CS/CF). Tras la incubación y varios lavados, se detectaron las proteínas rhAxl-Fc unidas utilizando una IgG de cabra antihumana-HRP (Jackson, ref. n° 109­ 035-098). Una vez unidas, se añadió el sustrato TMB a las placas. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de ácido H2SO4 y las densidades ópticas obtenidas se leyeron a 450 nm utilizando un instrumento lector de microplacas.
El presente experimento (figuras 6A, 6B y 6C, respectivamente) muestra que 110D7, 1003A2 y 1024G11 son capaces de competir con la unión de rhAxl-Fc a su ligando inmovilizado. La competición con la unión de Gas6 se produce en presencia de concentraciones de anticuerpo 110D7 superiores a 2.5 pg/ml (1.6710-8 M). La competición con la unión de Gas6 se produce en presencia de concentraciones de anticuerpo 1003A2 superiores a 2.5 pg/ml (1.6710-8 M). No se produce más unión de rhAxl-Fc a Gas6 inmovilizado en presencia de una concentración de anticuerpo 1003A2 superior a 10 pg/ml (6.67-10'8 M). La competición con la unión de Gas6 se produce en presencia de concentraciones de anticuerpo 1024G11 superiores a 2.5 pg/ml (1.6710-8 M). No se produce más unión de rhAxl-Fc a Gas6 inmovilizado en presencia de una concentración de anticuerpo 1024G11 superior a 10 pg/ml (6.67-10'8 M).
Los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 bloquean la unión de Gas6 a rhAxl-Fc.
Ejemplo 7: reconocimiento de epítopos mediante transferencia Western.
Con el fin de determinar si los anticuerpos anti-AxI 110D7, 1003A2 y 1024G11 reconocen un epítopo lineal o conformacional, se llevó a cabo un análisis de transferencia Western mediante la utilización de lisados de células SN12C. Las muestras se trataron diferencialmente para encontrarse bajo condiciones reductoras o no reductoras. En el caso de que se visualizase una banda con la muestra reducida, el anticuerpo sometido a ensayo presenta como diana un epítopo lineal del dominio DEC; en caso contrario, se genera contra un epítopo conformacional del DEC de Axl.
Se sembraron las células SN12C en RPMI FBS al 10% inactivado por calor L-glutamina 2 mM a razón de 5104 células/cm2 en matraces T de 162 cm2 durante 72 h a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2. A continuación, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron con 1.5 ml de tampón de lisis helado Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), NaCl 150 mM, Nonidet P40 al 1%, desoxicolato al 0.5% y 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa completo más antifosfatasas al 1%]. Los lisados celulares se sometieron a agitación durante 90 min a 4°C y se clarificaron a 15,000 rpm durante 10 min. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando BCA. Se cargaron diversas muestras. En primer lugar, se prepararon 10 |jg de lisado de células completas (10 jg en 20 j l ) bajo condiciones reductoras (tampón para muestra 1x (BIORAd ) 1x agente reductor (BIORAD)) y se cargaron en un SDS-PAGE tras 2 min de incubación a 96°C. En segundo lugar, se prepararon dos otras muestras de 10 jg de lisado de células completas bajo condiciones no reductoras (en 1x tampón para muestras (BIORAD) únicamente). Antes de cargarlas en el gel de SDS-PAGE, una de estas dos últimas muestras se calentó durante 2 min, incubación a 96°C; la otra se mantuvo sobre hielo. Tras la migración, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron durante 1 h a TA con TBS-Tween-20 al 0.1% (TBST), leche desnatada al 5% y se sondearon con el anticuerpo 110D7, 1003A2 y 1024G11, respectivamente a una concentración de 10 jg/m l durante la noche a 4°C en TBST-leche desnatada al 5%. Los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con Tris-Tween-20 al 0.1% (v/v) (TBST) con leche seca desnatada al 1%. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilución 1/1000) durante 1 h a TA. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron con ECL (Pierce, n° 32209). Tras la visualización de Axl, se lavaron las membranas nuevamente una vez con TBST y se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1/200,000) en TBST-leche seca desnatada al 5%. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h a TA. Las membranas se lavaron y se reveló GAPDH utilizando ECL.
Los resultados se representan en las figuras 7A (110D7), 7B (1003A2) y 7C (1024G11).
Los anticuerpos anti-Axl 110D7, 1003A2 y 1024G11 reconocen un epítopo conformacional en forma de una banda específica que sólo se observa bajo condiciones no reductoras. No se observó ninguna banda bajo condiciones de migración desnaturalizantes del lisado de células SN12C.
Ejemplo 8: medición de la regulación negativa de Axl inducida por los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 mediante transferencia Western.
En el ejemplo a continuación, se seleccionó la línea celular de carcinoma de células renales humanas SN12C (ATCC) para estudiar la actividad de los anticuerpos sobre la expresión de receptor de Axl. La línea celular SN12C sobreexpresa el receptor de Axl. Se estudio la regulación negativa de Axl mediante transferencia Western de extractos de células completas en las figuras 8A-8B (110D7), 8C-8D (1003A2) y 8E-8F (1024G11).
Se sembraron las células SN12C en RPMI FBS al 10% inactivado por calor L-glutamina 2 mM a razón de 6104 células/cm2 en placas T de seis pocillos durante 48 h a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2. Tras dos lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se sometieron a ayuno de suero en un medio que contenía 800 ng/ml de ligando de gas6 de ratón recombinante (R&D Systems, ref. n° 986-GS/CF) o 10 jg/m l de anticuerpo IgG1_m de control de isotipo (9G4) o 10 jg/m l del anticuerpo anti-Axl y se incubaron durante 4 o 24 horas adicionales. A continuación, se eliminó el medio suavemente y se lavaron las células dos veces con PBS frío. Se lisaron las células con 200 j l de tampón de lisis helado [Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), NaCl 150 mM, Nonidet P40 al 1%, desoxicolato al 0.5% y 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa completo más antifosfatasas al 1%]. Los lisados celulares se sometieron a agitación durante 90 min a 4°C y se clarificaron a 15,000 rpm durante 10 min. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando BCA. Se separaron los lisados de células completas (10 jg en 20 j l ) mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron durante 1 h a TA con TBS-Tween-20 al 0.1% (TBST), leche desnatada al 5% y se sondearon con un anticuerpo anti-Axl comercial a una concentración de 0.5 jg/m l (AbNova H00000558-M02) durante la noche a 4°C en TBST-leche seca desnatada al 5%. Los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con Tris-Tween-20 al 0.1% (v/v) (TBST) con leche seca desnatada al 1%. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilución 1/1000) durante 1 h a TA. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron con ECL (Pierce, n° 32209). Tras la visualización de Axl, se lavaron las membranas nuevamente una vez con TBST y se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1/200000) en TBST-leche seca desnatada al 5%. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h a TA. Las membranas se lavaron y se reveló GAPDH utilizando ECL. Se cuantificó la intensidad de la banda mediante densitometría.
Los resultados presentados en las figuras 8A y 8B son representativos de 3 experimentos independientes y demuestran que 110D7 es capaz de regular negativamente Axl en una línea celular tumoral humana sobreexpresante de Axl. A las 4 h, el anticuerpo 110D7 induce una regulación negativa de 50% de Axl, y hasta 84% tras una incubación de 24 horas con el anticuerpo 110D7.
Los resultados presentados en las figuras 8C y 8D son representativos de 3 experimentos independientes y demuestran que 1003A2 es capaz de regular negativamente Axl en una línea celular tumoral humana sobreexpresante de Axl. A las 4 h, el anticuerpo 1003A2 induce una regulación negativa de 66 % de Axl, y hasta 89 % tras una incubación de 24 horas con el anticuerpo 1003A2.
Los resultados presentados en las figuras 8E y 8F son representativos de 3 experimentos independientes y demuestran que 1024G11 es capaz de regular negativamente Axl en una línea celular tumoral humana sobreexpresante de Axl. A las 4 h, el anticuerpo 1024G11 induce una regulación negativa de 68 % de Axl, y hasta 85 % tras una incubación de 24 horas con el anticuerpo 1024G11.
Ejemplo 9: estudio de citometría de flujo del efecto del anticuerpo anti-AxI sobre la expresión de Axl en la superficie celular.
La técnica de citometría de flujo permite el marcaje del receptor de Axl de superficie celular. La utilización de dicha técnica puede subrayar el efecto del anticuerpo sobre la expresión de Axl de membrana. En el presente ejemplo se utilizaron células de tumor renal humano SN12C que expresaban niveles elevados de Axl.
La línea celular tumoral SN12C se cultivó en RPMI1640 con L-glutamina al 1% y 10% de FCS durante 3 días antes del experimento. A continuación, las células se desprendieron utilizando tripsina y se sembraron en una placa de 6 pocillos en RPMI1640 con L-glutamina al 1% y FCS al 5%. Al día siguiente, se añadieron los anticuerpos de interés a una concentración de 10 pg/ml. Asimismo se incluyeron los pocillos no tratados. Las células se incubaron a 37°C en 5% de CO2. Veinticuatro horas después, las células se lavaron con PBS, se desprendieron y se incubaron con los mismos anticuerpos de interés en tampón FACS (PBS, BSA al 1% y azida sódica al 0.01%). Los pocillos no tratados asimismo se tiñeron con el mismo anticuerpo a fin de comparar la intensidad de la señal obtenida con el mismo MAb en células tratadas y no tratadas. Las células se incubaron durante 20 minutos a 4°C y se lavaron tres veces con tampón FACS. Se incubó un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con Alexa 488 durante 20 minutos y las células se lavaron tres veces antes del análisis de FACS en una población celular negativa para yoduro de propidio. La diferencia entre la tinción de un MAb en las células no tratadas y en la condición tratada con el mismo anticuerpo indicaron una regulación negativa de la proteína Axl sobre la superficie celular de las células.
Se determinaron dos parámetros: (i) el porcentaje de Axl remanente sobre la superficie celular, y (ii) la diferencia entre la señal fluorescente detectada sobre la superficie de células tratadas con 110D7, 1003A2 y 1024G11, respectivamente, en comparación con las células tratadas con IgG1_m en T24 h. El % de Axl remanente se calculó de la manera siguiente:
Figure imgf000035_0001
En la tabla 7 se presentan los datos de un experimento representativo. Se reprodujeron los resultados en tres experimentos independientes.
La diferencia de IMF entre la tinción de un MAb en las células no tratadas y en la condición tratada con el mismo anticuerpo reflejan la regulación negativa de la proteína Axl sobre la superficie de las células debido a la unión del MAb considerado. Las condiciones sin anticuerpo proporcionaron resultados similares en presencia del anticuerpo de control de isotipo (m9G4).
Tabla 7
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000036_0001
Los datos demuestran que la intensidad media de fluorescencia detectada sobre la superficie de las células tratadas con 110D7 durante 24 horas es reducida (-588) en comparación con las IMF obtenidas con células no tratadas marcadas con el anticuerpo 110D7. Tras una incubación de 24 h con el anticuerpo 110D7, 29.8% del receptor de Axl de superficie celular se mantiene en la superficie de las células SN12C.
Los datos demuestran que la intensidad media de fluorescencia detectada sobre la superficie de las células tratadas con 1003A2 durante 24 horas es reducida (-505) en comparación con las IMF obtenidas con células no tratadas marcadas con el anticuerpo 1003A2. Tras una incubación de 24 h con el anticuerpo 1003A2, 35 % del receptor de Axl de superficie celular se mantiene en la superficie de las células SN12C.
Los datos demuestran que la intensidad media de fluorescencia detectada sobre la superficie de las células tratadas con 1024G11 durante 24 horas es reducida (-478) en comparación con las IMF obtenidas con células no tratadas marcadas con el anticuerpo 1024G11. Tras una incubación de 24 h con el anticuerpo 1024G11, 45,5% del receptor de Axl de superficie celular se mantiene en la superficie de las células SN12C.
Ejemplo 10: estudio de intemalización de anticuerpo anti-AxI mediante la utilización de mareaje inmunocitoquímico fluorescente.
Se obtuvieron resultados de internalización complementarios mediante microscopía confocal mediante la utilización del método de marcaje fluorescente indirecto.
Brevemente, la línea celular tumoral SN12C se cultivó en RPMI1640 con L-glutamina al 1 % y FCS al 10% durante 3 días antes del experimento. A continuación, las células se desprendieron utilizando tripsina y se sembraron en un cubreobjetos que contenía una placa de 6 pocillos en RPMI1640 con L-glutamina al 1% y FCS al 5%. Al día siguiente, se añadieron los anticuerpos 110D7, 1003A2 y 1024G11 a una concentración de 10 pg/ml. Asimismo se incluyeron células tratadas con un anticuerpo irrelevante. A continuación, las células se incubaron durante 1 h y durante 2 h a 37°C con 5% de CO2. En T 0 h, las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C para determinar la unión de los anticuerpos a la superficie celular. Las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído durante 15 minutos. Se enjuagaron las células y se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón - Alexa 488 durante 60 minutos a 4°C para identificar el anticuerpo remanente sobre la superficie celular. Para realizar un seguimiento de la penetración de los anticuerpos en las células, se fijaron las células y se permeabilizaron con saponina. Se utilizó un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-Alexa 488 (Invitrogen) para teñir el anticuerpo tanto membranario como intracelular. Se identificaron los endosomas tempranos utilizando anticuerpo policlonal de conejo contra EEA1 revelado con un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-Alexa 555 (Invitrogen). Las células se lavaron tres veces y se tiñeron los núcleos con Draq5. Tras la tinción, las células se montaron en medio de montaje Prolong Gold (Invitrogen) y se analizaron mediante la utilización de un microscopio confocal Zeiss LSM 510.
Las fotografías se presentan en las figuras 9A-9C (110D7), 9D-9F (1003A2) y 9G-9I (1024G11).
Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía confocal. En presencia de IgG1_m de control de isotipo, no se observó ni tinción membranal ni intracelular (figuras 9A, 9D y 9G). Se observó una pérdida progresiva del marcaje anti-Axl membranal incluso tras sólo 1 h de incubación de las células SN12C con 110D7 (figura 9B), 1003A2 (figura 9E) y 1024G11 (figura 9H), respectivamente. La acumulación intracelular de los anticuerpos anti-Axl 110D7 (figura 9C), 1003A2 (figura 9F) y 1024G11 (figura 9I) era más pronunciada a las 2 h. El anticuerpo intracelular se colocalizaba con EEA1, un marcador de endosoma temprano. Dichas fotografías confirman la internalización de los MAb anti-Axl 110D7, 1003A2 y1024G11 en las células SN12C.
Ejemplo 11: actividad antitumoral mediada por anti-Axl in vitro.
Ensayo de proliferación de SN12C.
Se sembraron diez mil células SN12C en medio libre de FCS en placas de 96 pocillos durante la noche a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2. Al día siguiente, las células se preincubaron con 10 pg/ml de cada anticuerpo durante 1 h a 37°C. Las células se trataron con o sin rmGas6 (R&D Systems, n° de cat. 986-GS/CF), mediante adición del ligando directamente al pocillo y después se dejaron crecer durante 72 h. Se midió la proliferación tras la incorporación de timidina 3H.
Los resultados se presentan en las figuras 10A (110D7), 10B (1003A2) y 10C (1024G11). No se observó ningún efecto con 110D7, 1003A2 y 1024G11, que eran silenciosos al añadirlos a las células SN12C.
Ejemplo 12: potencia de la citotoxicidad de inmunoconjugados de m110D7-saporina, 1003A2-saproina y l024G11-saporina en diversas líneas de células tumorales humanas.
En el presente ejemplo, se documenta la potencia de la citotoxicidad de los anticuerpos 110D7, 1003A2 o 1024G11 acoplados con saporina. Con este fin, se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro mediante la utilización de un gran panel de líneas de células tumorales humanas (figuras 11A-11K). Dicho panel de líneas celulares tumorales humanas cubre diversas expresiones de Axl.
Brevemente, se sembraron 5000 células en placas de cultivo de 96 pocillos en 100 pl de medio de cultivo adecuado de FBS al 5%. Tras una incubación de 24 horas en una atmósfera con 5% de CO2 a 37°C, se aplicó a las células un abanico de concentraciones del inmunoconjugado (antic. de mAxl-saporina o m9G4-saporina). A continuación, las placas de cultivo se incubaron a 37°C en un incubador humidificado con 5% de CO2 durante 72 horas.
En D4, se evaluó la viabilidad celular utilizando el kit de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega Corp., Madison, Wisc.), que permite determinar el número de células viables en cultivo basándose en la cuantificación del ATP presente, un indicador de células metabólicamente activas. Se registraron las emisiones luminiscentes con un dispositivo luminómetro.
A partir de los resultados de luminiscencia se calculó el porcentaje de citotoxicidad mediante la utilización de la fórmula a continuación:
% de citotoxicidad = 100 - [ (URLantic.-sap x 100) / URLsin antic.]
Las figuras 11A-11K muestran que los inmunoconjugados 110D7-saporina, 1003A2-saporina y 1024G11-saporina indujeron citotoxicidad en estas diferentes líneas de células tumorales humanas. La potencia del efecto resultante de citotoxicidad depende de la línea de células tumorales humanas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo anti-AXL que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que es el anticuerpo monoclonal 110D7 producido a partir del hibridoma I-3959, depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 2 de abril de 2008.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
4. Anticuerpo según la reivindicación 1 o 3, en el que
• la región constante de la cadena ligera es la región lambda o kappa humana; y
• la región constante de la cadena pesada derivada del anticuerpo humano es la región gamma-1, gamma-2 o gamma-4 humana.
5. Inmunoconjugado que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 conjugado a un agente citotóxico.
6. Inmunoconjugado según la reivindicación 5, en el que dicho agente citotóxico es un fármaco, un radioisótopo o una toxina.
7. Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicho fármaco se selecciona en el grupo de agentes alquilantes tales como mostaza nitrogenada, alquil-sulfonatos, nitrosourea, oxazoforinas, aziridinas o imina-etilenos, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de función de cromatina, agentes antiangiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos, agentes quelantes, estimulante de absorción de hierro, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores de ADN, inhibidores de síntesis de ADN, estimulantes de apoptosis, inhibidores de timidilato, inhibidores de células T, agonistas de interferón, inhibidores de ribonucleósido-trifosfato reductasa, inhibidores de aromatasa, antagonistas de receptor de estrógeno, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de ciclo celular, taxano, inhibidores de tubulina, inhibidores de angiogénesis, estimulantes de macrófagos, antagonistas de receptor de neurocinina, agonistas de receptor canabinoide, agonistas de receptor de dopamina, agonistas de factor estimulante de granulocitos, agonistas de receptor de eritropoyetina, agonistas de receptor de somatostatina, agonistas de LHRH, sensibilizadores de calcio, antagonistas de receptores de VEGF, antagonistas de receptor de interleucina, inhibidores de osteoclastos, estimulantes de formación de radicales, antagonistas de receptor de endotelina, alcaloide Vinca, antihormonas e inmunomoduladores.
8. Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicho radioisótopo se selecciona en el grupo de At211, C13, N15, O17, Fl19, I123, I131, I125, In111, Y90, Re186, Re188, Sm153, tc99m, Bi212, P32, Pb212, isótopos radioactivos de Lu, gadolinio, manganeso o hierro.
9. Inmunoconjugado según la reivindicación 6, en el que dicha toxina se selecciona en el grupo de cadena A de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, PAPI, PAPII, PAP-S, curcina, crotina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, dolastatinas, auristatinas y CC1065.
10. Inmunoconjugado según la reivindicación 5, en el que dicho inmunoconjugado comprende además un ligador.
11. Inmunoconjugado según la reivindicación 10, en el que dicho ligador es un ligador escindible o un ligador no escindible.
12. Inmunoconjugado según la reivindicación 11, en el que dicho ligador escindible es un ligador lábil a ácido, un ligador sensible a peptidasa, un ligador fotolábil, un ligador dimetilo o un ligador que contiene disulfuro.
13. Inmunoconjugado según la reivindicación 12, en el que dicho ligador que contiene disulfuro es SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP, (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno).
14. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13 para la utilización en el tratamiento del cáncer, en el que la célula cancerosa expresa o sobreexpresa la proteína Axl en su superficie.
15. Composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado según las reivindicaciones 5 a 13 y por lo menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Hibridoma murino I-3959 depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Francia, el 2 de abril de 2008.
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