TW201427998A - 新穎的抗原結合蛋白及其作爲治療癌症之定址產物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於能夠結合至蛋白Axl之新穎的抗原結合蛋白，特別是單株抗體，以及編碼該蛋白之胺基酸和核酸序列。由一個態樣，本發明係有關於新穎的抗原結合蛋白或抗原結合片段，其能結合Axl以及，透過誘導Axl之內化，而被內化至細胞之內。本發明亦包含該抗原結合蛋白結合其他的抗癌化合物，例如毒素、放射性元素或藥物，來作為定址產物之用途，以及該抗原結合蛋白用於治療某些癌症之用途。

Description

新穎的抗原結合蛋白及其作為治療癌症之定址產物的用途

本發明係有關於能夠結合至蛋白Axl之新穎的抗原結合蛋白，特別是單株抗體，以及編碼該蛋白之胺基酸和核酸序列。由一個態樣，本發明係有關於新穎的抗原結合蛋白或抗原結合片段，其能結合至Axl以及，透過誘導Axl之內化，而被內化至細胞之內。本發明亦包含該抗原結合蛋白結合其他的抗癌化合物，例如毒素、放射性元素或藥物，來作為定址產物之用途，以及該抗原結合蛋白用於治療某些癌症之用途。

“Axl”(亦稱為“Ufo”、“Ark”或“Tyro7”)係從慢性骨髓性白血病的病人選殖出，為一致癌基因，其過度表現會觸發小鼠NIH3T3轉形。Axl屬於受體酪胺酸激酶(RTKs)家族，稱為TAM(Tyro3、Axl、Mer)家族，其包括Tyro3(Rse、Sky、Dtk、Etk、Brt、Tif)、Axl，以及Mer(Eyk、Nyk、Tyro-12)[Lemke G.等人，Nat.Rev.Immunol.(2008).8,327-336]。

人類蛋白Axl為894個胺基酸的蛋白，人類蛋白Axl序列係表示於序列辨識編號29所列出的序列之內。胺基 酸1-25對應於訊息胜肽，無訊息胜肽(peptide signal)之人類蛋白Axl係表示於序列辨識編號30所列出的序列之內。

起初單離為生長休止專一性基因(growth arrest-specific gene)之Gas6，為TAM家族成員常見的配體[Varnum B.C.等人，Nature(1995).373,623-626]。Gas6展現出最高的Axl親和性，接著是Tyro3以及最後是Mer[Nagata,K.等人，J.Biol.Chem.(1996).271,30022-30027]。Gas6由一個媒介結合至磷脂質之富含γ-羧基麩胺酸鹽領域(γ-carboxyglutamate(Gla)-rich domain)、四個類表皮生長因子領域，以及二個類層粘連蛋白G(laminin G-like)(LG)領域所組成[Manfioletti G.,Brancolini,C.,Avanzi,G.& Schneider,C.Mol.Cell Biol.(1993).13,4976-4985]。像許多其他的RTKs一樣，配體結合導致受體二聚體形成(dimerization)以及酪胺酸殘基之自磷酸化(Axl受體之酪胺酸殘基779、821及866)，其供用作為各種各樣的細胞內的訊息發送分子之嵌合(docking)位址[Linger R.M.,Keating,A.K.,Earp,H.S.& Graham,D.K.Adv.Cancer Res.(2008).100,35-83]。此外，Axl受體能通過配體不依賴性(ligant-independent)方法而予以活化。此活化可以在Axl受體過度表現時發生。

已經顯示出Gas6/Axl之訊息發送會於活體外大規模種類的細胞內調節各種各樣的細胞過程，包括細胞增殖、黏著、遷移以及存活[Hafizi S.& Dahlback,B.FEBS J.(2006).273,5231-5244]。此外，TAM受體涉及先天性免疫 的控制；其等抑制樹突細胞(DCs)以及巨噬細胞內對病原體的發炎反應。其等亦驅動細胞凋亡細胞經由此等免疫細胞之吞噬作用以及其等為自然殺手(NK)細胞成熟及殺傷活性需要的[Lemke G.等人，Nat.Rev.Immunol.(2008).8,327-336]。

Axl係微弱地表現於正常細胞，於纖維母細胞、骨髓前驅細胞、巨噬細胞、神經組織、心臟和骨骼肌內顯著地觀察到Axl，Axl於該處主要支持細胞的存活。Gas6/Axl系統透過調節血管平滑肌細胞體內恆定，而於血管生物學方面扮演重要的角色[Korshunov,V.A.,Mohan,A.M.,Georger,M.A.& Berk,B.C.Circ.Res.(2006).98,1446-1452；Korshunov,V.A.,Daul,M.,Massett,M.P.& Berk,B.C.Hypertension(2007).50,1057-1062]。

於腫瘤細胞方面，Axl於調節細胞侵入以及遷移方面扮演重要的角色。Axl之過度表現不僅與不良的預後有關而且還與各種各樣的人類癌症增高的侵襲性有關，像是乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神經膠質瘤、肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤、腎臟癌、甲狀腺癌以及子宮內膜癌報告的[Linger R.M.,Keating,A.K.,Earp,H.S.& Graham,D.K.Adv.Cancer Res.(2008).100,35-83以及Verma A.Mol.Cancer Ther.(2011).10,1763-1773，作為回顧]。於乳癌方面，Axl似乎為強大的上皮細胞間質轉化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)效應子(effector)；EMT程序促成生物內癌細胞之活躍 地遷移以及散播[Thiery J.P.Curr.Opin.Cell Biol.(2003).15,740-746]。

亦已顯示Axl可調節血管形成。更確切地內皮細胞之Axl敲除(knockdown)削弱了血管的形成及遷移[Holland S.J.等人，Cancer Res.(2005).65,9294-9303]以及妨礙特定的生成血管的(angiogenic)訊息發送之途徑[LiY.等人，Oncogene(2009).28,3442-3455]。

更近期，數個對於一系列的細胞模型之研究描述了Axl過度的表現涉及了抗藥性現象。下列的表1概述此等研究。

上文的表1引用之完整的參考文獻如下：

-Macleod K.等人，Cancer Res.(2005).65,6789-6800

-Mahadevan D.等人，Oncogene(2007).26,3909-3919

-Lay J.D.等人，Cancer Res.(2007).67,3878-3887

-Hong C.C.等人，Cancer Lett.(2008).268,314-324

-Liu L.等人，Cancer Res.(2009).69,6871-6878

-Keating A.K.等人，Mol.Cancer Ther.(2010).9,1298-1307

-Ye X.等人，Oncogene(2010).29,5254-5264

於此背景中，認為Axl RTK為有興趣的腫瘤學標的。數個小組已經發展了標定(targeting)gas6/Axl主軸之抗腫瘤策略，不論是使用裸的單株抗體或是標定的小分子[Verma A.Mol.Cancer Ther.(2011).10,1763-1773]。

於第一個具體例中，本發明係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其i)結合人類蛋白Axl，以及ii)在其結合該人類蛋白Axl以後被內化(internalized)。

更普遍而言，本發明係有關於蛋白Axl用於選擇抗原結合蛋白或其抗原結合片段之用途，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段能在結合至該標的Axl後被內化。更特別地，該標的為Axl之細胞外領域。

於此特定的態樣中，本發明從而針對一種活體外篩選化合物或其之結合片段的方法，該化合物或其之結合片段能遞送或內化有興趣的分子至哺乳動物細胞內，該有興趣的分子係共價連接該化合物，其中該方法包含下列步驟：a)選擇一化合物，該化合物能結合Axl蛋白，或其之細胞外領域(ECD)，或其抗原決定位； b)選擇性地共價連接該有興趣的分子，或對照分子，至步驟a)中選擇的該化合物以形成複合物(complex)；c)接觸步驟a)中選擇的該化合物，或步驟b)中得到的該複合物，與表面處表現Axl蛋白或其功能性片段之哺乳動物細胞，較佳為活細胞；d)判定是否該化合物，或該有興趣的分子或該複合物已經被細胞內遞送或內化至該哺乳動物細胞內；以及e)選擇該化合物作為能遞送或內化有興趣的分子至活的哺乳動物細胞內之化合物。

於一較佳具體例中，該能遞送或內化有興趣的分子至活的哺乳動物細胞內之化合物為一種蛋白質(於本文中亦稱作多肽或胜肽)或是類蛋白質化合物，其包含胜肽(peptidic)結構，特別為至少5、10、15個或更多個胺基酸殘基之胺基酸序列，該(等)胺基酸殘基可以為醣化的。

當該能遞送或內化有興趣的分子至活的哺乳動物細胞內之化合物為一種蛋白質或是類蛋白質化合物時，該化合物於本文中亦稱為“抗原結合蛋白”，該抗原結合蛋白，或其結合片段能：-i)結合蛋白Axl，較佳為人類蛋白Axl，-ii)當該蛋白Axl表現於哺乳動物細胞的表面處時，其在結合該蛋白Axl以後被內化至該哺乳動物細胞內。

於一較佳具體例中，該哺乳動物活細胞內為一種人類細胞，較佳為天然表現蛋白Axl受體之細胞。

於一特定的具體例中，步驟c)中的該哺乳動物活 細胞為其等之表面處表現重組型Axl蛋白的哺乳動物細胞。

於一同樣較佳的具體例中，該有興趣的分子為一種細胞毒性分子(於本文中亦稱作細胞毒性(cytoxic)或細胞增殖抑制劑)。

於一同樣較佳的具體例中，該有興趣的分子為使用一種連接子而共價連接至該能結合該蛋白Axl之化合物，更佳為一種胜肽(peptidic)連接子，更佳為一種可切割的胜肽(peptidic)連接子，更佳為一種連接子，其能由該哺乳動物細胞內含有的天然細胞內化合物予以切割，特別是在該哺乳動物細胞的胞質液(cytosol)內。

於一同樣較佳的具體例中，該能結合該Axl蛋白之化合物為一種抗體，或其結合片段，其係對抗該Axl蛋白，或對抗座落於Axl EDC領域內之抗原決定位。

e)之選擇步驟可以藉由熟悉此藝者已知的任何細胞內遞送或內化之評估方法來實行。能顯示或評估該能專一地結合該蛋白Axl之化合物，或由該化合物及該有興趣的分子形成的複合物，或共價連接至該化合物之該有興趣的分子，之存在或缺乏或是活性之分析或測試為熟悉此藝者熟知的(見下文內揭示的此測試或分析之一些實例，但不限制此等測試只為此等下列的測試實例)。

更特別地，此等測試或分析可以以FACS、免疫螢光法、流動式細胞測量術、西方墨點、細胞毒性/細胞增殖抑制評估，等等來實行。

於此態樣中，本發明亦針對一種活體外製備細胞 毒性或細胞增殖抑制複合物的方法，該細胞毒性或細胞增殖抑制複合物能遞送細胞毒性(cytoxic)化合物至哺乳動物細胞內，較佳為活細胞，該方法包含下列步驟：-共價連接細胞毒性劑至一化合物，該化合物為：-i)能結合該Axl蛋白，較佳為人類Axl蛋白，以及-ii)該Axl蛋白表現於哺乳動物細胞的表面處時，其在結合該Axl蛋白以後被內化至該哺乳動物細胞內。

較佳地，該化合物為一種類蛋白的蛋白質(protein-like protein)，更佳為一種抗體，其係對抗該蛋白Axl，或對抗座落於Axl EDC領域內之抗原決定位，或是該抗體之功能結合片段。

於較佳的具體例中，該細胞毒性劑係使用一種連接子而共價連接至該抗-Axl抗體或其之或功能性片段，更佳為一種胜肽(peptidic)連接子，更佳為一種可切割的胜肽(peptidic)連接子，更佳為一種能由，如非限制性實例天然的細胞內化合物予以切割的連接子。

如同TAM家族其他的成員一樣，Axl細胞外領域(ECD)具有接近細胞黏著分子的該等組織之組織。Axl ECD特徵在於二個類免疫球蛋白領域接著二個鄰接的類纖維網蛋白第III型領域的組合[O'Bryan J.P.等人，Mol.Cell Biol.(1991).11,5016-5031]。二個N端類免疫球蛋白領域足夠的用於Gas6配體結合[Sasaki T.等人，EMBO J.(2006).25,80-87]。

人類蛋白Axl之ECD為一種451個胺基酸片段，對 應於序列係表示於序列序列辨識編號29之胺基酸1-451，其序列係表示於序列辨識編號31所列出的序列之內。胺基酸1-25對應於訊息胜肽，無訊息胜肽之人類蛋白Axl之ECD係對應於表示於序列序列辨識編號29之胺基酸26-451，由序列序列辨識編號32來表示。

迄今已經鑑別出不同模式的內化。其等定位已變成內化的蛋白或蛋白質的(proteic)複合物於細胞內。在胞吞作用(endocytosis)之後，多數的膜蛋白或脂質返回細胞表面(recycling)，但是一些膜組分遞送至晚期內體或高基氏體(Golgi)[Maxfield F.R.& McGraw,T.E.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.(2004).5,121-132]。

於一較佳具體例中，本發明係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其i)結合人類蛋白Axl，以及ii)在其結合該人類蛋白Axl以後被內化。

於一最佳的具體例中，本發明係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其i)結合人類蛋白Axl，較佳為具有序列序列辨識編號29或30或是其天然變異體序列，以及ii)在其結合該人類蛋白Axl以後被內化。

“結合蛋白”或“抗原結合蛋白”為一種胜肽鏈(peptidic chain)，其與另一個蛋白或是分子(通常稱為抗原)有專一或一般的親和性。使蛋白接觸以及當可能結合時，會形成複合物。本發明之抗原結合蛋白較佳可以為，但不限制為，一種抗體、抗體的片段或是衍生物、蛋白質或是 胜肽。

按依據本發明之抗原結合蛋白的“抗原結合片段”，想要表示任何胜肽、多肽或蛋白，其保留專一地結合至抗原結合蛋白之標的(通常也稱為抗原)的能力，以及包含抗原結合蛋白的胺基酸序列之至少5個鄰接的胺基酸殘基、至少10個鄰接的胺基酸殘基、至少15個鄰接的胺基酸殘基、至少20個鄰接的胺基酸殘基、至少25個鄰接的胺基酸殘基、至少40個鄰接的胺基酸殘基、至少50個鄰接的胺基酸殘基、至少60個鄰接的胺基酸殘基、至少70個鄰接的胺基酸殘基、至少80個鄰接的胺基酸殘基、至少90個鄰接的胺基酸殘基、至少100個鄰接的胺基酸殘基、至少125個鄰接的胺基酸殘基、至少150個鄰接的胺基酸殘基、至少175個鄰接的胺基酸殘基、至少200個鄰接的胺基酸殘基，或是至少250個鄰接的胺基酸殘基之胺基酸序列。

於一較佳具體例中，其中該抗原結合蛋白為一抗體，此等“抗原結合片段”係選自於以下所構成的群組：Fv、scFv(sc代表單鏈)、Fab、F(ab’)₂、Fab’、scFv-Fc片段或雙價抗體(diabodies)，或是已經藉由化學修飾來增加半生期之任何片段，例如添加聚(亞烷基)二醇，例如聚(乙二醇)(“聚乙二醇化”)(聚乙二醇化片段稱為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)₂-PEG或Fab’-PEG)(“PEG”代表聚(乙二醇))，或是藉由併入脂質體來增加半生期之任何片段，該等片段擁有如本發明的抗體之至少一個特徵CDRs。較佳地，該等“抗原結合片段”會由衍生出該等抗原結合片段之抗體 可變異重鏈或輕鏈之部份序列構成，或是包含衍生出該等“抗原結合片段之抗體可變異重鏈或輕鏈之部份序列，該部份序列足以保留如同該部份序列起源的抗體相同的結合專一性以及足夠的標的親和性，較佳為該部份序列起源的抗體的抗體的標的親和性之至少等於1/100，更佳為至少1/10。此一功能性片段會含括其起源的抗體序列之最少5個胺基酸，較佳為10個、15個、25個、50個或100個連續的胺基酸。

術語"抗原決定位(epitope)"係提及結合抗原結合蛋白的一抗原區域，包括抗體。抗原決定位可以定義為結構性的或功能性的。功能性的抗原決定位通常為結構性的抗原決定位的子集，以及具有直接促成交互作用親和性之該等殘基。抗原決定位亦可以為構形的，那就是，由非線型的胺基酸構成。於某些具體例中，抗原決定位可以包含決定子(determinants)，決定子為分子的化學活性表面聚集，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基基團，或是磺醯基基團，以及於某些具體例中，可以具有三維結構的特徵，及/或特定的電荷特徵。

於本申請案中，抗原決定位係位於人類蛋白Axl之細胞外領域之內。

依據本發明之較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，專一地結合位於人類蛋白Axl細胞外領域內之一個抗原決定位，其較佳具有序列序列辨識編號31或32或是其天然變異體序列。

按“結合(binding)”、“結合(binds)”，或類似物，意思是該抗原結合蛋白或其抗原結合片段與一個抗原，形成一個於生理條件下相對穩定的複合物。判定是否二個分子結合的方法為本技藝熟知的以及包括，舉例而言，平衡透析、表面電漿子共振，及類似物。

從這個角度講，“EC₅₀”提及50%的有效濃度。更準確地，術語半最大的有效濃度(EC₅₀)對應於藥物、抗體或是毒的濃度，其在某些規定的曝露時間之後，於基線及最大量之間的中間處誘導其反應。其通常使用來作為藥物的效價(potency)之測量法。分級的劑量反應曲線之EC₅₀因而表示，觀察到一種化合物之最大的效應之50%的化合物濃度。定量劑量反應曲線之EC₅₀表示在規定的曝露持續期間之後，總體的50%展現出反應之化合物的濃度。濃度測量典型地遵循S形的曲線，對於相對小的濃度變化，濃度迅速地增加。此可以於數學上，藉由最佳配適線之推導予以判定。

作為一較佳的具體例，本發明判定的EC₅₀描繪出與曝露於人類的腫瘤細胞上之Axl ECD結合之抗體的效價特徵。EC₅₀參數係使用FACS分析來判定。EC₅₀參數反映，最大的結合表現於人類的腫瘤細胞上的人類Axl之50%，所獲得的抗體濃度。各EC50值係使用四參數迴歸曲線擬合程式(Prism軟體)之的計算為劑量反應曲線的中點。已經選擇此參數作為生理/病理條件的代表。

於本發明之一具體例中，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，以至少10^-9M，優先地於10^-9M及10^-12M之 間，的EC50來結合其之抗原決定位。

本發明之另一個具體例為一種用於選擇抗原結合蛋白或其抗原結合片段之製程或是方法，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段能被細胞內內化至哺乳動物細胞，較佳至人類細胞，較佳為活細胞，該製程或是方法包含下列步驟：-i)選擇結合Axl之抗原結合蛋白，較佳為結合其ECD領域或其抗原決定位；以及-ii)選擇來自先前的步驟i)之該抗原結合蛋白，其在其等結合表現於哺乳動物細胞的表面處之Axl蛋白以後，被內化至該哺乳動物細胞內。

於一特定的具體例中，該哺乳動物細胞天然表現Axl蛋白受體於其等的表面處，或是為其等之表面處表現重組型Axl蛋白的哺乳動物細胞，較佳為人類細胞。

此等方法或製程可以包含下列步驟：i)選擇抗原結合蛋白，其以至少10^-9M的EC₅₀結合Axl，以及選擇來自ii)先前的步驟之抗原結合蛋白，在其等結合Axl以後被內化。ii)之選擇步驟可以藉由熟悉此藝者已知的任何內化評估方法來實行。更特別地，測試可以以FACS、免疫螢光法、流動式細胞測量術、西方墨點法、細胞毒性評估，等等來實行。

依據本發明之抗原結合蛋白之另一個特徵是其對於腫瘤細胞增殖不具有任何顯著的活性。更特別地，如同下列的實例內闡釋的，依據本發明之抗原結合蛋白對於 增殖SN12C模型不具有任何顯著的活體外活性。

於腫瘤學方面，mAbs可以透過多重的機制來發揮治療的功效，但是通常其等之活性不足以產生持續的好處。因此已經使用數個策略來提升其等之活性，特別是透過組合其等與藥物來作為化學治療劑。因組合性協定為有效的替代方案，免疫毒素變成一種治療癌症之新穎的治療選擇[Beck A.等人，Discov.Med.(2010).10,329-339；Alley S.C.等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.(2009).330,932-938]。抗體藥物共軛物(Antibody-drug conjugates)(ADCs)表示一種方法，該方法利用mAbs專一性以及標定遞送一種細胞毒性劑至腫瘤的能力，可以顯著地提升mAbs以及藥物兩者之活性。理想上mAb會專一地結合實質表現於腫瘤細胞上但是有限的表現於正常的細胞上的一種抗原。

本發明聚焦在抗-Axl結合蛋白，以及更特別地聚焦在專一的抗-Axl抗體，其呈現高度的Axl結合後被內化的能力。此抗原結合蛋白引起作為免疫藥物共軛物(conjugate)組分的一者的興趣，是它們將該等經連接的細胞毒性劑(cytotoxic)定址(addresse)至標定的癌細胞之內。一旦經內化，細胞毒性劑(cytotoxic)便觸發癌細胞死亡。

免疫共軛物(immunoconjugate)療法成功之重要的關鍵認為是標的抗原專一性，以及抗原結合蛋白複合物的內化至癌細胞之內。明顯地，非內化的抗原於遞送細胞毒性劑上比起內化的抗原為較不有效的。內化的過程於抗原間為多變化的，以及取決於可能被結合蛋白影響的多重 參數。細胞表面RTKs構成了引起興趣調查此一方法的抗原家族。

於生物分子方面，細胞毒性劑(cytotoxic)帶來細胞毒性活性且所使用的抗原結合蛋白帶來其對抗癌細胞之專一性，以及帶來一種供用於進入於該細胞內以正確地定址細胞毒性劑(cytotoxic)的載體。

因而為了改進免疫共軛物的分子，載體-結合蛋白必須展現出高度的能力以內化至標定的癌細胞之內。結合蛋白媒介的內化效率取決於標定的抗原決定位而有顯著不同。有效能的內化抗-Axl結合蛋白之選擇，不僅需要研究Axl向下調節而且還需要研究抗-Axl結合蛋白變成在細胞內以後的各種各樣的實驗資料。

於一較佳具體例中，依據本發明之抗原結合蛋白的內化較佳可以透過免疫螢光法(如同本申請案下文內所舉例說明的)或是內化機制特定的熟悉此藝者已知的任何方法或製程來評估。

於另一較佳具體例中，因依據本發明之複合物Axl-抗原結合蛋白，在本發明的結合蛋白結合該Axl的ECD之後被內化，誘導了該細胞表面上的Axl數量的減少。此減少可以藉由熟悉此藝者已知的任何方法來實行(西方墨點、FACS、免疫螢光法等等)。

於本發明的一具體例中，此減少，以此方式反映出內化作用，較佳可以藉由FACS分析法來測量，以及用未處理的細胞測量的平均螢光強度(MFI)及用依據本發明之 抗原結合蛋白處理的細胞測量的MFI，之間的差異或△(delta)來表達。

作為本發明之非限制性實例，此讦係根據未處理的細胞及本發明之抗原結合蛋白處理的細胞所獲得的MFIs來判定，如同實施例9中描繪的，其使用i)用本發明之抗原結合蛋白、24小時孵育期間後的人類的腎臟腫瘤SN12C細胞以及ii)一種用Alexa488標定的二級抗體。此參數係依照下列公式計算的來定義：

此在MFIs之間的差異反映Axl向下調節，因為MFIs和該細胞表面上表現的Axl成比例。

於更佳且有利的態樣中，本發明之抗原結合蛋白或其抗原結合片段由一種單株抗體所組成，較佳為經單離之Mab，其觸發至少200的△(MFI_24h未處理的細胞-MFI_24h處理的細胞)，較佳為至少300。

本發明之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，誘導MFI至少200的減少。

更詳細地，以上提到的讦可以依據下列的方法來測量，必須把下列方法視為闡釋性及非限制性實例：a)用本發明之抗原結合蛋白處理及孵育有興趣的腫瘤細胞；b)用本發明之抗原結合蛋白處理步驟a)之經處理的細胞以及，同時處理，未處理的細胞， c)用能結合該抗原結合蛋白之二級標定的抗體來測量該經處理的細胞及無處理的細胞之MFI(代表表面處存在的Axl之數量)，以及d)依照以該經處理的細胞獲得的MFI減去無處理的細胞獲得的MFI來計算讦。

術語“抗體(antibody)”、“抗體(antibodies)”或者“免疫球蛋白(immunoglobulin)”就最廣義而言可以交替使用，並且包括單株抗體，較佳為經單離的Mab，(例如，全長或者完整的單株抗體)、多株抗體、多價抗體(multivalent antibodies)或者多專一性抗體(multispecific antibodies)[例如，雙專一性抗體(bispecific antibodies)，只要它們展現出所欲的生物活性]。

更特別地，此分子係由一醣蛋白所組成，該醣蛋白包含由雙硫鍵而互相連接之至少2個重(H)鏈與2個輕(L)鏈。各重鏈含有一重鏈可變異區域(或領域)(本文中縮寫為HCVR或VH)與一重鏈恆定區域。重鏈恆定區域包含三個領域，CH1、CH2與CH3。各輕鏈含有一輕鏈可變異區域(本文中縮寫為LCVR或VL)與一輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域包含一個領域，CL。VH和VL區域可進一步區分為高度變異區域，稱之為互補性決定區域(CDR)，穿插一些較恆定的區域，稱之為框架區域(FR)。各VH和VL係由三個CDR與四個FR組成，由胺基端至羧基端之順序安排為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈與輕鏈之可變異區域含有可與一抗原相互作用之結合領域。抗體之恆定區域 可以媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統的各種細胞(如效應細胞)與典型補體系統的第一補體(Clq)。

就本發明來說，抗體亦包括其等之某些抗體片段。該等抗體片段展現出所欲的結合專一性及親和性，不管來源或是免疫球蛋白種類(亦即，IgG、IgE、IgM、IgA，等等)，其等能與Axl蛋白專一地結合，且具有比得上本發明的全長抗體之親和性。

一般而言，關於單株抗體或是其等之功能性片段，尤其鼠科起源的單株抗體或是其等之功能性片段，之製備可以參照手冊“Antibodies”(Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)中特別說明的技術或是由Kohler和Milstein所說明的從融合瘤來製備的技術(Nature,256：495-497,1975)。

當使用於本文中，術語"單株抗體"或"Mab"意指一種抗體分子，其針對特定的抗原且其可以由從一單一純株(single clone)的B細胞或融合瘤來產生。單株抗體可以為重組型，亦即透過蛋白質工程(protein engineering)來產生。此外，與多株抗體之製備相比，多株抗體典型地包括針對各種各樣的決定位或抗原決定位之各種抗體，各個單株抗體係針對該抗原之單一的抗原決定位。本發明係有關於從天然來源純化而單離或獲得的，或是藉由基因重組或化學合成所單離或獲得的抗體。

本發明之較佳具體例為一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含選自於以下所構成的群組之抗體或是由選自於以下所構成的群組之抗體組成：

a)一抗體，其包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號1、2和3，或是與序列辨識編號1、2和3呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何的序列；以及三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號4、5和6，或是與序列辨識編號4、5和6呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何的序列。

b)一抗體，其包含下列：含有序列序列辨識編號36、37和38之三個輕鏈CDRs，或是與序列辨識編號36、37和38呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何的序列；以及含有序列序列辨識編號39、40和41之三個重鏈CDRs，或是與序列辨識編號39、40和41呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何的序列；

c)一抗體，其包含下列：含有序列序列辨識編號64、65和66之三個輕鏈CDRs，或是與序列辨識編號64、65和66呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何的序列；以及含有序列序列辨識編號67、68和69之三個重鏈CDRs，或是與序列辨識編號67、68和69呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何的序列。

於本發明之更佳具體例中，該抗原結合蛋白或是其抗原結合片段，係由選自於以下所構成的群組之抗體所 組成：a)一抗體，其包含如同根據IMGT編號系統所定義之三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號1、2和3；以及如同根據IMGT編號系統所定義之三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號4、5和6；b)一抗體，其包含如同根據IMGT編號系統所定義之三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號36、37和38；以及如同根據IMGT編號系統所定義之三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號39、40和41；c)一抗體，其包含如同根據IMGT編號系統所定義之三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號64、65和66；以及如同根據IMGT編號系統所定義之三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號67、68和69。

於較佳態樣中，關於CDR區域或CDR(s)，想要表示如同由IMGT編號系統所定義之免疫球蛋白重鏈和輕鏈之高度可變異區域。在沒有對立說法的情況下，本說明書內CDRs將根據IMGT編號系統來定義。

已經定義出IMGT獨特的編號來比較可變異領域，不管為什麼樣的抗原受體、鏈類型，或是物種[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.以及Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。於IMGT獨特的編號方面，恆 定性胺基酸總是具有相同的位置，譬如，半胱胺酸23(1st-CYS)、色胺酸41(CONSERVED-TRP)、疏水性胺基酸89、半胱胺酸104(2nd-CYS)、苯丙胺酸或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特的編號提供了框架區域(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)以及互補決定區：CDR1-IMGT：27至38、CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117，的標準化劃界。因間隙表示未被佔用的位置，所以CDR-IMGT的長度(顯示於括號之間且由點分開，例如[8.8.13])變成決定性的資訊。IMGT獨特的編號係使用於2D圖形表示法中，稱為IMGT Colliers de Perles[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.以及Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]，以及使用於IMGT/3D結構-DB之3D結構中[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。

必須了解到，在本說明書內沒有對立說明的情況下，互補決定區或是CDR，意指如同根據IMGT編號系統所定義之免疫球蛋白的重鏈和輕鏈之高度可變異區。

然而，亦可以根據Kabat編號系統來定義CDRs(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，5^th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991，以及較晚的版本)。有3個重鏈CDRs 以及3個輕鏈CDRs。此處，取決於狀況，術語“CDR”和“CDRs”用來指示，含括負責該抗體辨識的抗原或抗原決定位的抗體之結合親和性的多數胺基酸殘基，之該等區域的一個或更多個，或者甚至是該等區域的全部。

根據Kabat編號系統，本發明係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其係由選自於以下所構成的群組之抗體組成：a)一抗體，其包含如同根據Kabat編號系統所定義之三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號9、10和11，或是與序列辨識編號9、10和11呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及如同根據Kabat編號系統所定義之三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號12、13和14，或是與序列辨識編號12、13和14呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；b)一抗體，其包含如同根據Kabat編號系統所定義之三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號44、45和46，或是與序列辨識編號44、45和46呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及如同根據Kabat編號系統所定義之三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號47、48和49，或是與序列辨識編號47、48和49呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；c)一抗體，其包含如同根據Kabat編號系統所定義之三 個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號72、73和74，或是與序列辨識編號72、73和74呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及如同根據Kabat編號系統所定義之三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號75、76和77，或是與序列辨識編號75、76和77呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

就本發明來說，介於核酸或胺基酸的2個序列之間的“百分比同一性”意指介於待比較的2個序列之間，在最佳的排列後所獲得的同一核苷酸或胺基酸殘基之百分比，此百分比僅僅為統計上的百分比以及介於2個序列之間的差異係沿著其等的長度隨機分佈。2個核酸或胺基酸序列的比較，傳統上係藉由在最佳排列該等序列之後比較其等來進行，該比較能按節段或係藉由使用“排列視窗”予以實施。用於比較的序列之最佳排列除了可以手工比較來進行之外，還可以透過Smith和Waterman之局部同源性演算法(1981)[Ad.App.Math.2：482]，透過Neddleman和Wunsch之局部同源性演算法(1970)[J.Mol.Biol.48：443]，透過Pearson和Lipman之相似性搜索的方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]或是透過使用此等演算法的電腦軟體(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI之GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA，或是藉著比較軟體BLAST NR或BLAST P)來進行。

介於2個核酸或胺基酸序列之間的百分比同一性係藉由比較2個最佳排列的序列來決定，其中要比較的核酸或胺基酸序列與2個序列間的最佳排列之參考序列比較之下，可能有加入或刪失。百分比同一性係藉由以下方式來計算：決定在2個序列之間，較佳在2個完整的序列之間，胺基酸核苷酸或殘基為同一的位置之數量，將同一的位置之數量除以排列視窗內總位置之數量，以及將結果乘上100來獲得2個序列之間的百分比同一性。

舉例而言，可以使用於網址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可得到的BLAST程式，“BLAST 2序列”(Tatusova等人，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174：247-250)，加上預設參數(尤其關於參數“開放空格罰分”：5，以及“擴展空格罰分”：2；經選擇的矩陣為，舉例而言由該程式提議的“BLOSUM 62”矩陣)；介於要比較之2個序列之間的百分比同一性係直接地由該程式來計算。

關於與參考胺基酸序列展現出至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%同一性之胺基酸序列，較佳的實例包括含括參考序列，某些修飾，尤其至少一個胺基酸的刪失、加入或取代，截斷或延伸，的該等胺基酸序列。於一個或更多個連續胺基酸或非連續胺基酸取代的事例中，較佳的取代為經取代的胺基酸係以“均等的”胺基酸來代替。此處，措辭“均等的胺基酸”係意欲表示，很可能代替結構 性胺基酸的一者，然而，卻不會修改對應的抗體之生物活性以及在以下所界定之該等特定實例之生物活性，之任何胺基酸。

均等的胺基酸可以憑著其等與其等要取代之胺基酸之結構同源性來決定，或是憑著很可能要產生的各種各樣的抗原結合蛋白之間的生物活性之比較測試的結果來判定。

作為一非限制性實例，以下的表2係總結很可能進行，但不導致對應的經修飾的抗原結合蛋白之生物活性有顯著修飾之可能的取代；反向取代於相同的條件下當然為可能的。

本發明的一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號1、2和3，或是與序列辨識編號1、2和3呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號8，或是與序列辨識編號8呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明之較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號1、2和3；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號8，或是與序列辨識編號8呈現至少80%的同一性之任何序列。

依據本發明之另一較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號8，或是與序列辨識編號8呈現至少80%的同一性之任何序列。

按“與序列辨識編號8呈現至少80%的同一性之任何序列”，打算表明呈現三個重鏈CDRs序列辨識編號4、 5和6之序列以及還有，在對應於該等CDRs，即序列辨識編號4、5和6的範圍之外，與完全的序列序列辨識編號8呈現至少80%的同一性之序列。

本發明的另一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號7，或是與序列辨識編號7呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號4、5和6，或是與序列辨識編號4、5和6呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號7，或是與序列辨識編號7呈現至少80%的同一性之任何序列；以及含有序列序列辨識編號4、5和6之該三個重鏈CDRs。

依據本發明的另一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號7，或是與序列辨識編號7呈現至少80%的同一性之任何序列。

按“與序列辨識編號7呈現至少80%的同一性之任何序列”，打算表明呈現三個輕鏈CDRs序列辨識編號1、2和3之序列以及還有，在對應於該等CDRs，即序列辨識編號1、2和3的範圍之外，與完全的序列序列辨識編號7呈現 至少80%的同一性之序列。

本發明的另一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號7，或是與序列辨識編號7呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號8，或是與序列辨識編號8呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號7，或是與序列辨識編號7呈現至少80%的同一性之任何序列，以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號8，或是與序列辨識編號8呈現至少80%的同一性之任何序列。

本發明的一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號36、37和38，或是與序列辨識編號36、37和38呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號43，或是與序列辨識編號43呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明之較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列 序列辨識編號36、37和38；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號43，或是與序列辨識編號43呈現至少80%的同一性之任何序列。

依據本發明之另一較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號43，或是與序列辨識編號43呈現至少80%的同一性之任何序列。

按“與序列辨識編號43呈現至少80%的同一性之任何序列”，打算表明呈現三個重鏈CDRs序列辨識編號39、40和41之序列以及還有，在對應於該等CDRs，即序列辨識編號39、40和41的範圍之外，與完全的序列序列辨識編號43呈現至少80%的同一性之序列。

本發明的另一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號42，或是與序列辨識編號42呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號39、40和41，或是與序列辨識編號39、40和41呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號42，或是與序列辨識編號42呈現至少80%的同一性之任何序列；以及含有序列序列 辨識編號39、40和41之該三個重鏈CDRs。

依據本發明的另一個較佳具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號42，或是與序列辨識編號42呈現至少80%的同一性之任何序列。

按“與序列辨識編號42呈現至少80%的同一性之任何序列”，打算表明呈現三個輕鏈CDRs序列辨識編號36、37和38之序列以及還有，在對應於該等CDRs，即序列辨識編號36、37和38的範圍之外，與完全的序列序列辨識編號42呈現至少80%的同一性之序列。

本發明的另一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號42，或是與序列辨識編號42呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號43，或是與序列辨識編號43呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號42，或是與序列辨識編號42呈現至少80%的同一性之任何序列，以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號43，或是與序列辨識編號43呈現至少80%的同一性之任何序列。

本發明的一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白 或其抗原結合片段，其包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號64、65和66，或是與序列辨識編號64、65和66呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號71，或是與序列辨識編號71呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含三個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號64、65和66；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號71，或是與序列辨識編號71呈現至少80%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段包含一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號71，或是與序列辨識編號71呈現至少80%的同一性之任何序列。

按“與序列辨識編號71呈現至少80%的同一性之任何序列”，打算表明呈現三個重鏈CDRs序列辨識編號67、68和69之序列以及還有，在對應於該等CDRs，即序列辨識編號67、68和69的範圍之外，與完全的序列序列辨識編號71呈現至少80%的同一性之序列。

本發明的另一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號70，或是與序列辨識編號70呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的 同一性之任何序列；以及三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含有序列序列辨識編號67、68和69，或是與序列辨識編號67、68和69呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號70，或是與序列辨識編號70呈現至少80%的同一性之任何序列；以及含有序列序列辨識編號67、68和69之該三個重鏈CDRs。

依據本發明的另一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號70，或是與序列辨識編號70呈現至少80%的同一性之任何序列。

按“與序列辨識編號70呈現至少80%的同一性之任何序列”，打算表明呈現三個輕鏈CDRs序列辨識編號64、65和66之序列以及還有，在對應於該等CDRs，即序列辨識編號64、65和6的範圍之外，與完全的序列序列辨識編號70呈現至少80%的同一性之序列。

本發明的另一個具體例係有關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號70，或是與序列辨識編號70呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號71，或是與序列辨識編號 71呈現至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的同一性之任何序列。

依據本發明的一個較佳的具體例，該抗原結合蛋白或其抗原結合片段，包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號70，或是與序列辨識編號70呈現至少80%的同一性之任何序列，以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列序列辨識編號71，或是與序列辨識編號71呈現至少80%的同一性之任何序列。

為了更清楚之故，以下的表3a-3c總結對應於本發明的抗原結合蛋白之各種各樣的胺基酸序列。

本發明的一特定的態樣係有關於一種小鼠的抗體，或其衍生的化合物或抗原結合片段，其特徵在於該抗體亦包含有衍生自與小鼠異源(heterologous)的物種，特別是人，的一抗體之輕鏈以及重鏈恆定區域(constant regions)。

本發明的另一個特定態樣係有關於一種嵌合抗體，或其衍生的化合物或抗原結合片段，其特徵在於：該抗體亦包含有衍生自與小鼠異源的物種，特別是人，的一抗體之輕鏈以及重鏈恆定區域。

本發明又另一個特定態樣係有關於一種擬人化抗體，或其衍生的化合物或抗原結合片段，其特徵在於：該衍生自人類抗體的輕鏈以及重鏈的恆定區域，分別是λ(lambda)或κ區域(kappa region)以及γ-1(gamma-1)、γ-2(gamma-2)或γ-4區域(gamma-4 region)。

本發明的另一個特定態樣係一種抗原結合蛋白，其係由選自於以下所構成的群組之單株抗體組成：a)衍生自2008年4月2日寄存於法國巴黎巴斯德研究院(Institut Pasteur)CNCM的融合瘤I-3859，之單株抗體110D7或其抗原結合片段；b)衍生自2011年7月28日寄存於法國巴黎巴斯德研究院CNCM的融合瘤I-4499，之單株抗體1003A2或其抗原結合片段；c)衍生自2011年7月28日寄存於法國巴黎巴斯德研究院CNCM的融合瘤I-4501，之單株抗體1024G11或其抗原結合片段。

依據另一態樣，本發明係有關於一種能夠分泌如本發明的抗原結合蛋白之小鼠融合瘤，尤其為編號I-3959、2008年4月2日；編號I-4499、2011年7月28日，或是編號I-4501、2011年7月28日提申於法國微生物菌種中心(French collection for microorganism cultures)(法國巴黎巴斯德研究院CNCM)之小鼠來源的融合瘤。

該融合瘤係藉由融合Balb/C免疫的小鼠脾細胞/淋巴細胞和骨髓瘤Sp 2/O-Ag 14細胞株的細胞所獲得的。

依據另一態樣，本發明係有關於一種能夠分泌一抗體的小鼠融合瘤，該抗體包含下列：含有序列序列辨識編號1、2和3之三個輕鏈CDRs；以及含有序列序列辨識編號4、5和6之三個重鏈CDRs，該融合瘤係以編號I-3959，於2008年4月2日提申於法國巴黎巴斯德研究院CNCM。

依據另一態樣，本發明係有關於一種能夠分泌一抗體的小鼠融合瘤，該抗體包含下列：含有序列序列辨識編號36、37和38之三個輕鏈CDRs；以及含有序列序列辨識編號39、40和41之三個重鏈CDRs，該融合瘤係以編號I-4499，於2011年7月28日提申於法國巴黎巴斯德研究院CNCM。

依據另一態樣，本發明係有關於一種能夠分泌一抗體的小鼠融合瘤，該抗體包含下列：含有序列序列辨識編號64、65和66之三個輕鏈CDRs；以及含有序列序列辨識編號67、68和69之三個重鏈CDRs，該融合瘤係以編號I-4501，於2011年7月28日提申於法國巴黎巴斯德研究院CNCM。

該融合瘤係藉由融合Balb/C免疫的小鼠脾細胞/ 淋巴細胞和骨髓瘤Sp 2/O-Ag 14細胞株的細胞所獲得的。

本發明的目的為一種小鼠融合瘤，其係選自於：a)於2008年4月2日寄存於法國巴黎巴斯德研究院CNCM的小鼠融合瘤I-3859；b)於2011年7月28日寄存於法國巴黎巴斯德研究院CNCM的融合瘤I-4499；c)於2011年7月28日寄存於法國巴黎巴斯德研究院CNCM的融合瘤I-4501。

本發明的抗原結合蛋白亦包含嵌合或擬人化抗體。

嵌合抗體為含有衍生自一既定物種的抗體之天然可變異區域(輕鏈與重鏈)，組合以對該既定物種而言為異源的(heterologous)物種之抗體的輕鏈與重鏈的恆定區域者。

該等抗體或其嵌合片段可以藉由使用重組遺傳學技術來製備。舉例而言，可以藉由選殖含有一啟動子及編碼本發明的非人類單株抗體，特別是鼠，之可變異區域的序列，以及編碼人類抗體恆定區域的序列，之重組型DNA來產生嵌合抗體。由一種此重組型基因所編碼之依據本發明的嵌合抗體可以是，舉例而言，一種小鼠-人類嵌合體(chimera)，這個抗體的專一性是由衍生自小鼠DNA的可變異區域來決定，以及它的同型(isotype)是由衍生自人類DNA的恆定區域而決定。參照Verhoeyn等人(BioEssays,8：74,1988)關於製備嵌合抗體的方法。

在另一個態樣中，本發明描述一種結合蛋白， 其由一嵌合抗體組成。

於特定較佳具體例中，本發明之嵌合抗體，或其抗原結合片段係選自於以下所構成的群組：a)一抗體，其包含含有胺基酸序列序列辨識編號7之輕鏈可變異領域序列，以及在於其包含含有胺基酸序列序列辨識編號8之重鏈可變異領域序列；b)一抗體，其包含含有胺基酸序列序列辨識編號42之輕鏈可變異領域序列，以及在於其包含含有胺基酸序列序列辨識編號43之重鏈可變異領域序列；c)一抗體，其包含含有胺基酸序列序列辨識編號70之輕鏈可變異領域序列，以及在於其包含含有胺基酸序列序列辨識編號71之重鏈可變異領域序列。

在另一個態樣中，本發明描述一種結合蛋白，其由一擬人化抗體組成。

“擬人化抗體”意指一抗體，該抗體含有衍生自非人類來源之抗體的CDR區域，該抗體分子的其它部份衍生自一個(或數個)人類抗體。此外，部份的骨架節段殘基(skeleton segment residue)(稱為FR)可以被修飾而得以保留結合親和性(Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Riechmann等人，Nature,332：323-327,1988)。

本發明的擬人化抗體或它們的片段可以藉由熟悉此技藝的人士所熟知的技術(諸如，例如，那些在文件中所描述的：Singer等人，J.Immun.,150：2844-2857, 1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10：1-142,1992；以及Bebbington等人，Bio/Technology,10：169-175,1992)而製備。此等擬人化抗體對於它們用於涉及在活體外的診斷或預防(preventive)及/或在活體內的治療處理(therapeutic treatment)的方法而言是較佳的。其它的擬人化技術亦為熟悉此技藝的人士所熟知的，諸如，例如，PDL在專利案中所描述的“CDR移植(CDR grafting)”技術：EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0 566 647或US 5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089以及US 5,693,761。亦可引用US專利5,639,641或6,054,297、5,886,152以及5,877,293。

此外，本發明亦有關於由上面所描述的小鼠抗體所產生的擬人化抗體。

在一個較佳方式中，衍生自人類抗體的輕鏈與重鏈的恆定區域分別是λ或κ與γ-1、γ-2或γ-4區域。

本發明的一個新穎的態樣是有關於一種經單離的核酸，其特徵在於：它是選自於下列核酸[包含任何簡併遺傳密碼子(degenerate genetic code)]：a)一核酸，其編碼依據本發明的抗原結合蛋白、或其抗原結合片段；b)一核酸，其包含：-一核酸序列，其選自於序列辨識編號15至28、50至63及78至91所構成的群組，或是-一核酸序列，其包含6個核酸序列序列辨識編 號：15至20或50至55或78至83，或是-一核酸序列，其包含2個核酸序列序列辨識編號：21和22或是56和57或是84和85；c)一核酸，其互補於如a)或b)之中所定義的核酸；以及d)一核酸，其較佳具有至少18個核苷酸，其能夠於高度嚴苛條件下，與如a)或b)部分中所定義的核酸序列雜交，或是在與如a)或b)部分中所定義的核酸序列最佳的排列後，有至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%同一性之序列雜交。

以下的表4a-4c總結關於本發明的結合蛋白之各種各樣的核苷酸序列。

於本說明中交換地使用的術語“核酸”、“核序列(nucleic sequence)”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”以及“核苷酸序列”，意指核苷酸之精確的經修飾或未修飾的序列，其定義含括非天然的核苷酸或不含括非天然的核苷酸的核酸之片段或區域，以及不是一雙股DNA、一單股DNA就是該等DNAs之轉錄產物。

本發明的序列已經經單離及/或純化，亦即，舉例而言其等藉由複製而直接地或間接地採樣，其等之環境至少已經部分被修飾。此處也應該提及的是經由，舉例而言，藉著宿主細胞之重組遺傳學所獲得之經單離的核酸，或是藉由化學合成所獲得之經單離的核酸。

“在最佳的排列後，與一較佳的序列展現出至少80%，較佳為85%、90%、95%和98%的百分比同一性之核序列”意指，相關於參考核序列，呈現某些修飾例如，特別為刪失、截斷、延伸、嵌合融合，及/或取代，尤其點狀的，修飾之核序列。較佳地，此等序列為編碼有如參考序列相同的胺基酸序列，此係有關於遺傳密碼的簡併，或是較佳為於高度嚴苛條件下，尤其在以下定義的該等，很可能與參考序列專一地雜交之互補性序列。

於高度嚴苛條件下之雜交意指有關於溫度和離子強度的選擇方式係使得其等允許維持2個互補性DNA片段之間的雜交。基於僅僅作例證的基礎，為了界定以上所說明的多核苷酸片段之目的，雜交步驟的高度嚴苛條件有利地說明如下。

DNA-DNA或DNA-RNA雜交係以2個步驟來進行：(1)於含有5X SSC(1X SSC對應於具有0.15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉的一溶液)、50%甲醯胺、7%的十二基硫酸鈉(SDS)、10X丹哈特(Denhardt’s)、5%硫酸葡聚糖以及1%鮭魚精子DNA之磷酸鹽緩衝液內(20mM，pH 7.5)在42℃下預雜交歷時3小時；(2)於視探針長度而定的溫度下(亦即：對於長度>100個核苷酸的一探針為42℃)進行主要的雜交(primary hybridization)歷時20小時，接著於2X SSC+2% SDS內、在20℃ 20分鐘清洗2次，於0.1X SSC+0.1% SDS內、在20℃ 20分鐘清洗1次。最後的清洗對於長度上>100個核苷酸的探針而言，係在60℃於0.1X SSC+0.1% SDS內進行歷時30分鐘。以上所說明的關於一個經界定大小的多核苷酸之高度嚴苛條件，可以由熟悉此藝者依據Sambrook，等人之內所說明的程序(Molecular cloning：a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory；3rd版本，2001)而改變成供用於更長或更短的寡核苷酸。

本發明亦有關於一載體，其包含如同本發明中所說明的一核酸。

本發明尤其對準選殖及/或表現含括此一核苷酸序列之載體。

本發明的載體較佳含括了允許核苷酸序列於一假定的宿主細胞中表現及/或分泌之元素。載體因此必須含括一啟動子、轉譯起始和終止信號，以及合適的轉錄調節區域。其必須以穩定的方式維持於宿主細胞中以及可以 選擇性地具有特定的信號，該等信號具體指定經轉譯的蛋白之分泌。此等各種各樣的元素係由熟悉此藝者依據所使用的宿主細胞予以選擇以及最佳化。為此目的，核苷酸序列可以插入至所選擇的宿主內之自我複製的載體中，或是為所選擇的宿主之整合性的載體。

此等載體係藉由熟悉此藝者典型使用的方法來製備，以及所產生的純株可以藉由標準的方法，例如脂轉染(lipofection)、電穿孔、熱休克或化學的方法，予以導入至一合適的宿主內。

載體係，舉例而言質體或是病毒來源的載體。其等係使用來轉形宿主細胞俾以選殖或表現本發明的核苷酸序列。

本發明亦包含經單離的宿主細胞，其等係藉由如同本發明中所說明的一載體予以轉形或是包含如同本發明中所說明的一載體。

宿主細胞可以選自於原核或真核系統之中，例如細菌的細胞，舉例而言，而且還有酵母細胞或動物細胞，尤其哺乳動物的細胞(人類例外)。亦可以使用昆蟲或植物細胞。

本發明亦關於具有依據本發明之轉形細胞的動物，除了人類之外。

本發明的另一個態樣係有關於一種生產如本發明之抗原結合蛋白，或其之抗原結合片段的方法，其特徵在於該方法包含下列步驟： a)於培養基內及合適用於如本發明之宿主細胞的培養條件下培養；以及b)從該培養基或從該等培養的細胞回收以此方式生產的該抗原結合蛋白，或其之抗原結合片段的一者。

依據本發明之經轉形的細胞是在製備依據本發明之重組型多肽的方法中使用。本發明亦包含製備依據本發明之重組型形式之多肽的方法，該等方法係特徵在於該等方法使用本發明之一載體及/或由依據本發明之一載體予以轉形的一細胞。較佳地，由依據本發明之一載體予以轉形的一細胞係於允許前述的抗原結合蛋白之表現以及該重組型蛋白的回收之條件下培養。

如同已提及的，宿主細胞可以選自於原核或真核系統之中。特別地，要鑑別會於此一原核或真核系統中促進分泌的本發明的核苷酸序列為可能的。因此，依據本發明之帶有此一序列的載體可以有利地使用來產生待分泌的重組型蛋白。更確切地，此等有興趣的重組型蛋白存在於細胞培養物的上清液之內而不是宿主細胞之內的事實，會促進此等有興趣的重組型蛋白之純化。

本發明的抗原結合蛋白亦可以藉由化學合成予以製備。此一製備方法亦為本發明的目的。熟悉此藝者瞭解化學合成的方法，例如固相技術(見尤其Steward等人，1984,Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem.Company,Rockford,111,2nd ed.,pp 71-95)或顆粒固相技術，藉由片段之縮合或是藉由慣例的溶液內合成法。本發明亦包含藉 由化學合成所獲得的多肽及能夠含括對應的非天然胺基酸之多肽。

本發明亦包含可藉由本發明的方法獲得之抗原結合蛋白，或是其等之抗原結合片段。

依據一個特定的態樣，本發明關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，如同以上所說明的供用於作為遞送細胞毒性劑於宿主標的位址之定址產物(addressing product)，該宿主標的位址係由一個位於蛋白Axl細胞外領域之抗原決定位所組成，該蛋白Axl細胞外領域較佳為人類蛋白Axl細胞外領域，更佳為具有序列辨識編號31或32之序列或是其天然變異體序列之人類蛋白Axl細胞外領域。

於一較佳具體例中，該宿主標的位址為哺乳動物細胞之標的位址，更佳為人類細胞之標的位址，更佳為天然或是藉由基因重組而表現該Axl蛋白的細胞之標的位址。

本發明關於一種免疫共軛物，其包含如同本發明說明書中所說明的抗原結合蛋白，其共軛至一種細胞毒性劑。

於本發明的意義來說，用語“免疫共軛物(immunoconjugate)”或“免疫共軛物(immuno-conjugate)”一般係意指一種化合物，其包含實際連接一種或更多種治療劑的至少一種定址產物，因而創造出高度定標的(targeted)化合物。

於一較佳具體例中，此等治療劑係由細胞毒性劑所組成。

“細胞毒性劑(cytotoxic agent)”或“細胞毒性劑(cytotoxic)”，係意指一製劑，當投至個體後，可藉由抑制或預防細胞功能及/或造成細胞死亡，來治療或預防細胞增殖，較佳為治療或預防該個體體內癌症之發展。

已經單離或合成出許多細胞毒性劑，且有可能抑制細胞增殖，或是即使不是決定性地，至少也是顯著地破壞或減少腫瘤細胞。然而，此等製劑之毒性作用不限定於腫瘤細胞，而且非腫瘤細胞也會進行毒性作用且可能被破壞。更特別地，於快速更新的細胞觀察到副作用，例如造血的(haematopoietic)細胞或上皮細胞，尤其黏膜的細胞。作為實例說明，此等細胞毒性劑之使用大大地影響腸胃道的細胞。

本發明的一目標亦是要提供一種細胞毒性劑，其有可能限制對於正常細胞的副作用，而同時保留對腫瘤細胞的高細胞毒性。

更特別地，細胞毒性劑較佳可由以下組成，但不是限制，一種藥物(亦即“抗體藥物共軛物”)、一種毒素(亦即“免疫毒素”或“抗體毒素共軛物”)、一種放射性同位素(亦即“放射性同位素共軛物”或“抗體放射性同位素共軛物”)等等。

於本發明之第一較佳具體例中，該免疫共軛物係由一種連結至至少一藥物(drug)或藥品(medicament)的結合蛋白所組成。當該結合蛋白為一種抗體、或其等之抗原結合片段時，此一免疫共軛物稱之為抗體藥物共軛物(或是 “ADC”)。

於第一具體例中，此等藥物可以就其等之作用模式予以說明。可以提及烷化劑作為非限制性實例，諸如氮芥子(nitrogen mustard)、烷基磺酸鹽類(alkyle-sulfonates)、亞硝基脲(nitrosourea)、噁唑弗磷類(oxazophorines)、氮雜環丙烷類(aziridines)或乙撐亞胺類(imine-ethylene)、抗代謝劑、抗腫瘤抗生素、有絲分裂抑制劑、染色質功能抑制劑、抗血管新生劑、抗雌激素、抗雄性激素、螯合劑、或免疫調節劑、鐵吸收刺激劑、環加氧酶抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、DNA抑制劑、DNA合成抑制劑、細胞凋亡刺激劑、胸苷酸(Thymidylate)抑制劑、T細胞抑制劑、干擾素促效劑、核糖核苷三磷酸還原酶抑制劑、芳香酶抑制劑、雌激素受體拮抗劑、酪胺酸激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、紫杉烷、微管蛋白抑制劑、血管增生抑制劑、巨噬細胞刺激劑、神經激肽(Neurokinin)受體拮抗劑、大麻受體促效劑、多巴胺受體促效劑、顆粒球刺激因子促效劑、紅血球生成素受體促效劑、體抑素(somatostatin)受體促效劑、LHRH促效劑、鈣增感劑、VEGF受體拮抗劑、介白素受體拮抗劑、蝕骨細胞抑制劑、自由基形成刺激劑(radical formation stimulant)、內皮素受體拮抗劑、長春花生物鹼(vinca alkaloid)、抗激素或免疫調節劑(immunomodulators)或是任何其他滿足細胞毒性劑或毒素的活性準則之新穎的藥物。

此等藥物，舉例而言，引述於VIDAL 2010，於 根據標題“細胞毒性劑”內與腫瘤學和血液學有關的化合物之專用的頁次；參考此文件所引述的細胞毒性化合物係引述於本文中作為較佳的細胞毒性劑。

更特別的，但不是限制，下列試劑為本發明之較佳試劑：甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、(chlorambucol)、美法崙(melphalen)、氯瑞覺(chlorydrate)、皮普波曼(pipobromen)、潑尼莫司汀(prednimustin)、二鈉-磷酸鹽(disodic-phosphate)、雌莫司汀(estramustine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、六甲嘧胺(altretamine)、曲磷胺(trofosfamide)、硫磷醯胺(sulfofosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、噻替派(thiotepa)、三乙醇胺(triethylenamine)、阿草特胺(altetramine)、卡氮芥(carmustine)、鏈佐黴素(streptozocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、白消安(busulfan)、曲奧舒凡(treosulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、氮烯唑胺(dacarbazine)、順鉑(cis-platinum)、奧沙利鉑(oxaliplatine)、洛鉑(lobaplatin)、庚鉑(heptaplatin)、米鉑水合物(miriplatin hydrate)、卡鉑(carboplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、5-氟脲嘧啶(5-fluoruracil)、氟脲苷(floxuridine)、5-氟脫氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、奈拉濱(nelarabine)、 6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine，6-TG)、氯脫氧腺苷(chlorodesoxyadenosine)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、吉西他濱(gemcitabine)、克拉屈濱(cladribine)、脫氧肋間型黴素(deoxycoformycin)、替加氟(tegafur)、噴司他丁(pentostatin)、多索魯濱(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、放線菌黴素D(dactinomycin)、光輝黴素(mithramycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素(mitomycin)C、平陽黴素(bleomycin)、甲基芐肼(procarbazine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、脫水長春花鹼(vinorelbine)、拓撲替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、依托泊甙(etoposide)、戊柔比星(valrubicin)、氨柔比星鹽酸鹽(amrubicin hydrochloride)、吡柔比星(pirarubicin)、依利醋銨(elliptinium acetate)、佐柔比星(zorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)以及替尼泊苷(teniposide)、雷佐生(razoxin)、馬立馬司他(marimastat)、巴馬司他(batimastat)、普利司他(prinomastat)、坦諾司他(tanomastat)、伊洛馬司他(ilomastat)、CGS-27023A、溴氯哌喹酮(halofuginone)、COL-3、新伐司他(neovastat)、沙利竇邁(thalidomide)、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鯊胺(squalamine)、內皮抑制素(endostatin)、SU5416、 SU6668、干擾素-α(interferon-alpha)、EMD121974、介白素-12(interleukin-12)、IM862、血管阻斷素(angiostatin)、他莫昔芬(tamoxifene)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、艾多西芬(iodoxyfene)、阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、安体舒通(sprironolactone)、醋酸環妊酮(cyproterone acetate)、非那甾胺(finasteride)、西咪替丁(cimitidine)、硼替佐米(bortezomid)、Velcade、比卡魯胺(bicalutamide)、環丙氯地孕酮(cyproterone)、氟他胺(flutamide)、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、達沙替尼(dasatinib)、爾羅替尼(erlotinib)、吉菲替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、類視色素(retinoid)、類視黄醇(rexinoid)、甲氧沙林(methoxsalene)、甲酯氨基酮戊酸(methylaminolevulinate)、阿地介白素(aldesleukine)、OCT-43、地尼介白素(denileukin diflitox)、介白素-2、他索那明(tasonermine)、香菇多醣(lentinan)、西左醣(sizofiran)、羅喹美克(roquinimex)、匹多莫得(pidotimod)、培家酶(pegademase)、賽莫噴汀(thymopentine)、poly I：C、丙考達唑(procodazol)、Tic BCG、短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)、NOV-002、烏克蘭(ukrain)、左美索(levamisole)、 1311-chTNT、H-101、西莫介白素(celmoleukin)、干擾素-α2a、干擾素-α2b、干擾素-γ 1a、介白素-2、莫貝介白素(mobenakin)、Rexin-G、替西介白素(teceleukin)、阿柔比星(aclarubicin)、放線菌黴素(actinomycin)、阿格拉濱(arglabin)、天門冬醯胺酸酶(asparaginase)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、道諾黴素(daunomycin)、亞葉酸(leucovorin)、馬縮普克(masoprocol)、新制癌菌素(neocarzinostatine)、培洛(peplomycin)、沙克黴素(sarkomycin)、澳洲茄邊鹼(solamargine)、特必丁(trabectedin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、睪固酮、kunecatechi、賽兒茶素(sinecatechins)、阿力特丁(alitretinoin)、巴洛地肯鹽酸鹽(belotecan hydrocholoride)、卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolone)、依利醋銨(elliptinium acetate)、乙烯雌二醇(ethinyl estradiol)、依託泊苷(etoposide)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、福美坦(formestane)、磷喹酮(fosfetrol)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、己基胺基乙醯丙酸(hexyl aminolevulinate)、組氨瑞林(histrelin)、羥助孕酮(hydroxyprogesterone)、伊沙匹隆(ixabepilone)、亮丙瑞林(leuprolide)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megesterol acetate)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、甲基睪固酮(methyltestosterone)、米替福新(miltefosine)、米多普(mitobronitol)、苯丙酸南諾龍(nadrolone phenylpropionate)、醋酸炔諾酮(norethindrone acetate)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、替西羅莫司(temsirrolimus)、睾內酯(testolactone)、曲安奈德(triamconolone)、曲普瑞林(triptorelin)、醋酸伐普肽(vapreotide acetate)、淨司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、安吖啶(amsacrine)、三氧二砷(Arsenic trioxide)、蒽雙咪腙鹽酸鹽(bisantrene hydrochloride)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯烯雌醚(chlortrianisene)、順二氨二氯鉑(cis-diamminedichloroplatinium)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、羥基脲(hydroxyurea)、雷利米得(lenalidomide)、洛尼胺(lonidamine)、氮芥(mechlorethanamine)、米托坦(mitotane)、奈達鉑(nedaplatin)、尼莫司汀鹽酸鹽(nimustine hydrochloride)、帕米德諾內(pamidronate)、哌泊溴烷(pipobroman)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、蘭尼丁(ranimustine)、瑞洛山(razoxane)、司莫司汀(semustine)、索布佐生(sobuzoxane)、甲磺酸酯基(mesylate)、三伸乙三聚氰胺(triethylenemelamine)、唑來膦酸(zoledronic acid)、甲磺酸卡莫司他(camostat mesylate)、發特洛HCl(fadrozole HCl)、萘福昔定(nafoxidine)、魯米特(aminoglutethimide)、卡莫(carmofur)、氯法拉濱(clofarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、地西他濱(decitabine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟阿腺苷磷酸鹽(fludarabne phosphate)、 氟脲嘧啶(fluorouracil)、呋氟脲嘧啶(ftorafur)、脲嘧啶氮芥(uracil mustard)、阿巴瑞克(abarelix)、蓓薩羅丁(bexarotene)、雷替曲塞(raltiterxed)、他米巴羅汀(tamibarotene)、替莫唑胺(temozolomide)、伏立諾他(vorinostat)、甲地孕酮(megastrol)、氯屈膦酸二鈉(clodronate disodium)、左美索(levamisole)、納米氧化鐵(ferumoxytol)、異麥芽糖苷鐵(iron isomaltoside)、西樂葆(celecoxib)、異丁司特(ibudilast)、苯達莫司汀(bendamustine)、六甲嘧胺(altretamine)、米多醇(mitolactol)、地西洛(temsirolimus)、普拉特(pralatrexate)、TS-1、地西他濱(decitabine)、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、來曲唑(letrozole)、氯屈膦酸二鈉、地家瑞(degarelix)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、組胺二鹽酸鹽(histamine dihydrochloride)、DW-166HC、尼特新(nitracrine)、地西他濱(decitabine)、鹽酸伊立替康三水合物(irinoteacn hydrochloride)、安吖啶(amsacrine)、羅米地辛(romidepsin)、維甲酸(tretinoin)、卡巴他賽(cabazitaxel)、凡德他尼(vandetanib)、雷利米得(lenalidomide)、伊班膦酸(ibandronic acid)、米替福新(miltefosine)、維特斯朋(vitespen)、密發莫(mifamurtide)、那曲肝素(nadroparin)、格拉司瓊(granisetron)、恩丹西酮(ondansetron)、曲匹西酮(tropisetron)、阿立必利(alizapride)、雷莫司瓊(ramosetron)、去纖苷(defibrotide)、達比加群酯(dabigatran etexilate)、非格司亭(filgrastim)、乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、利妥昔單抗(reditux)、促紅細胞生成素(epoetin)、莫拉丁(molgramostim)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、西普力(sipuleucel-T)、乙醯左旋肉鹼(acetyl L-carnitine)、多奈哌齊鹽酸鹽(donepezil hydrochloride)、5-胺基乙醯丙酸(5-aminolevulinic acid)、胺基乙醯丙酸甲酯(methyl aminolevulinate)、西曲瑞克醋酸西曲瑞克(cetrorelix acetate)、艾考糊精(icodextrin)、亮丙瑞林(leuprorelin)、哌甲酯(metbylphenidate)、奧曲肽(octreotide)、胺來占諾(amlexanox)、普樂沙福(plerixafor)、四烯甲萘醌(menatetrenone)、茴香腦二硫雜環戊烯硫酮(anethole dithiolethione)、度骨化醇(doxercalciferol)、西那卡塞鹽酸鹽(cinacalcet hydrochloride)、來伐西普(alefacept)、羅米司亭(romiplostim)、胸腺免疫球蛋白(thymoglobulin)、賽馬新(thymalfasin)、烏苯美司(ubenimex)、咪喹莫特(imiquimod)、依維莫司(everolimus)、西羅莫司(sirolimus)、H-101、拉索昔芬(lasofoxifene)、曲洛司坦(trilostane)、因卡膦酸(incadronate)、神經節苷脂(ganglioside)、哌加他尼八鈉(pegaptanib octasodium)、維替泊芬(vertoporfin)、米諾膦酸(minodronic acid)、唑來膦酸(zoledronic acid)、硝酸鎵(gallium nitrate)、阿侖膦酸鈉(alendronate sodium)、依替膦酸二鈉(etidronate disodium)、帕米膦酸二鈉(disodium pamidronate)、度他雄胺(dutasteride)、葡萄糖酸銻鈉 (sodium stibogluconate)、阿莫達非尼(armodafinil)、右雷佐生(dexrazoxane)、胺磷汀(amifostine)、WF-10、替莫泊芬(temoporfin)、達依泊汀-α(darbepoetin-alfa)、安西司亭(ancestim)、沙格司亭(sargramostim)、帕立非明(palifermin)、R-744、奈匹德明(nepidermin)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、地尼介白素(denileukin diflitox)、克三他酶(crisantaspase)、布舍瑞林(buserelin)、地洛瑞林(deslorelin)、蘭瑞肽(lanreotide)、奧曲肽(octreotide)、毛果芸香鹼(pilocarpine)、波生坦(bosentan)、卡奇黴素(calicheamicin)、美登醇(maytansinoid)以及環菸酯(ciclonicate)。

關於進一步的細節，熟悉此技藝的人士可以參照由“Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique”所發行的手冊，標題為“traité de chimie thérapeutique,vol.6,Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers,edition TEC & DOC,2003”。

於本發明之第二較佳具體例中，該免疫共軛物係由一種連結至至少一放射性同位素(radioisotope)的結合蛋白所組成。當該結合蛋白為一種抗體、或其等之抗原結合片段時，此一免疫共軛物稱之為抗體放射性同位素共軛物(或是“ARC”)。

為了選擇性破壞腫瘤，該抗體可以含括高度放射性的原子。可利用各種各樣的放射性同位素用於生產 ARC，例如但不限於：At²¹¹、C¹³、N¹⁵、O¹⁷、F¹¹⁹、I¹²³、I¹³¹、I¹²⁵、In¹¹¹、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、tc⁹⁹m、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²，Lu、釓、錳或是鐵的放射性同位素。

可以使用熟悉此藝者已知的任何方法或製程來將此等放射性同位素併入至ARC(參見，舉例而言“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”,Chatal,CRC Press 1989)。例如非限制性實例，可以經由半胱胺酸殘基來附接tc⁹⁹m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸以及In¹¹¹。可以經由離胺酸殘基來附接Y⁹⁰。可以使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)來附接I¹²³。

可以提到數個實例來闡明熟悉此藝者對ARC領域的了解，例如塞瓦啉^®(Zevalin^®)，其為一種ARC，由抗CD20單株抗體及由硫脲連接子-螯合劑結合之In¹¹¹或Y⁹⁰放射性同位素構成(Wiseman等人(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等人(2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig等人(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等人(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)；或是Mylotarg^®，其為一種由連接至卡奇黴素(calicheamicin)的抗CD33抗體構成，(US 4,970,198；5,079,233；5,585,089；5,606,040；5,693,762；5,739,116；5,767,285；5,773,001)。更近期，亦提及稱為Adcetris之ADC(對應於貝倫妥單抗-維多汀(Brentuximab vedotin))，其近來已經被FDA接受於治療霍奇金氏淋巴肉瘤(Hodgkin’s lymphoma)(Nature,vol.476, pp380-381，2011年8月25日)。

於本發明之第三較佳具體例中，該免疫共軛物係由一種連結至至少一毒素的結合蛋白所組成。當該結合蛋白為一種抗體、或其等之抗原結合片段時，此一免疫共軛物稱之為抗體毒素共軛物(或是“ATC”)。

毒素為由活的生物產生之有效且特定的毒物。其等通常由分子量在幾百(胜肽)及一千(蛋白)之間變化的胺基酸鏈所組成。其等亦為低分子有機化合物(low-molecular organic compound)。毒素係由許多的生物產生，例如細菌、真菌、海藻和植物。其等多數為極其毒的，具有比神經毒劑(nerve agent)大過數個數量級的毒性。

ATC使用的毒素可包括，但不限於，可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制，而發揮其等之細胞毒性效應之所有種類的毒素。

可使用的酵素活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(獲自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、香石竹毒(dianthin)蛋白質、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白質(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素 (phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(tricothecenes)。

本文亦涵蓋小分子毒素，諸如多拉司他汀(dolastatins)、奧瑞他汀(auristatins)、新月毒素(trichothecene)，及CC1065，以及此等毒素具有毒素活性之衍生物。多拉司他汀及奧瑞他汀已顯示出會干擾微管動力學、GTP水解，以及核分裂與細胞分裂，且具有抗癌活性及抗真菌活性。

"連接子"、"連接單元"，或是"連接"意指一種化學部分(moiety)，其包含一個共價附接結合蛋白至至少一細胞毒性劑的共價鍵或原子鏈。

連接子可以利用各式之二官能蛋白偶合劑所作成，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫氫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯類的二官能衍生物(例如二甲基己二醯亞胺酯(dimethyl adipimidate)HCl)、活性酯類(例如二丁二醯亞胺基辛二酸酯(disuccinimidyl suberate))、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯類(例如2,6-二異氰酸甲苯)，以及雙-活性氟化物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。經碳14標記之1-異硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid)(MX-DTPA)為一種用於使細胞毒 性劑(cyctotoxic agent)結合於定址系統之例示性螯合劑。其他的交聯劑可為BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC，及磺酸基-SMPB，以及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)，其為商業上可得的(例如，從Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,Ill.，U.S.A)。

連接子可以為“不可切割的”或“可切割的(cleavable)”。

於一較佳具體例中，存在一種“可切割的連接子”，其促進細胞毒性劑釋放於細胞中。舉例而言，可以使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫化物連接子。於一較佳具體例中，該連接子於細胞內條件下為可切割的，以使得於細胞內環境下切割連接子會從結合蛋白釋放細胞毒性劑。

舉例而言，於一些具體例中，連接子係由細胞內環境(諸如，於溶體或內體或膜窖(caveolea)內)存在的切割劑(cleaving agent)予以切割。舉例而言，連接子可為肽基連接子，其可由細胞內之肽酶或蛋白酶酵素切割，包括但不限於，溶體或內體蛋白酶。典型地，肽基連接子為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。切割劑可包括組織蛋白酶(cathepsin)B及D以及纖維蛋白溶酶(plasmin)，已知其全部均可水解二肽藥物衍生物，使得活性藥物在標的細胞 內釋放。舉例而言，可使用由在癌性組織中高度表現之硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B，切割的肽基連接子(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接子)。於特定具體例中，可由細胞內蛋白酶切割之肽基連接子為Val-Cit連接子或是Phe-Lys連接子。使用細胞內蛋白水解釋放細胞毒性劑之優勢為該藥劑通常在結合時會減毒且共軛物之血清穩定性通常較高。

於其他的具體例中，該可切割的連接子為pH敏感性，亦即，於某些pH值之下對水解敏感的。典型地，pH敏感的連接子於酸性條件下可水解。舉例而言，可以使用可於溶體內水解的酸不穩定性連接子(例如，腙、半卡巴腙(semicarbazone)、硫半卡巴腙(thiosemicarbazone)、順烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或其類似物)。此等連接子在中性pH條件下相對穩定，諸如血液中之pH值條件，但在低於pH 5.5或5.0，近似溶體之pH值不穩定。於某些具體例中，可水解性連接子為硫醚連接子(諸如例如，經由醯基腙鍵連接於治療劑之硫醚。

於還有其他的具體例中，該連接子於還原條件下為可切割的(例如二硫化物連接子)。本技藝已知各種各樣的二硫化物連接子，包括舉例而言，可以利用SATA(N-丁二醯亞胺基S-乙醯基硫-乙酸酯(N-succinimidyl S-acetylthioacetate))、SPDP(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫氫基)丙酸酯)、SPDB(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫氫基)丁酸酯)和SMPT(N-丁二醯亞胺基-氧基羰基-脉-甲 基-脉-(2-吡啶基-二硫氫基)甲苯)-、SPDB與SMPT來形成的該等。

作為不可切割的或“不可縮減的(non reductible)”連接子之非限制性實例，可提及免疫共軛物曲妥珠單抗(Trastuzumab)-DM1(TDM1)，其組合曲妥珠單抗與連接的化療劑，美登素(maytansine)(Cancer Research 2008；68：(22).，2008年11月15日)。

於一較佳具體例中，本發明之免疫共軛物可以藉由熟悉此藝者已知的任何方法來製備，例如但不限於：i)抗原結合蛋白之親核性基團與二價連接子試劑反應，繼而與細胞毒性劑反應，或是ii)細胞毒性劑之親核性基團與二價連接子試劑反應，繼而與抗原結合蛋白之親核性基團反應。

抗原結合蛋白之親核性基團包括但不限於：N端胺基；側鏈胺基，例如離胺酸；側鏈硫醇基，以及抗原結合蛋白經醣化時之糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基為親核性的，且能夠反應以與以下之連接子部分及連接子試劑上之親電子基團形成共價鍵，其等包括但不限於：活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；醛類、酮類、羧基及馬來醯亞胺基。抗原結合蛋白可具有可還原的鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋。抗原結合蛋白可藉由經諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑處理，而使抗原結合蛋白具有與連接子試劑結合(conjugation)之反應性。各半胱胺酸橋在理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。可以藉由熟悉此藝者已知的任何 反應來將額外的親核性基團引入抗原結合蛋白中。例如非限制性實例，可藉由引入一個或更多個半胱胺酸殘基而將反應性硫醇基引入抗原結合蛋白中。

亦可以藉由抗原結合蛋白之修飾，以引入能夠與連接子試劑或細胞毒性劑上之親核性取代基反應之親電子部分來產生免疫共軛物。可以氧化經醣化的抗原結合蛋白之糖以形成可與連接子試劑或細胞毒性劑之胺基反應的醛或酮基。所得的亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定的鍵結，或是可以還原而形成穩定的胺鍵結。在一個具體例中，經醣化的抗原結合蛋白之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉的反應，可於蛋白中產生能與藥物上之適當基團反應的羰基(醛及酮)基團。在另一個具體例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白可與偏過碘酸鈉反應，產生醛而非第一胺基酸。

在某些較佳具體例中，連接子單元可具有下列通式：--Ta--Ww--Yy--

其中：-T-為延伸子單元；a為0或1；-W-為胺基酸單元；W獨立地為範圍由1至12之整數；-Y-為間隔子單元；y為0、1或2。

當延伸子單元(-T-)存在時，連接抗原結合蛋白與胺基酸單元(-W-)。抗原結合蛋白上存在之有用的官能基，不論是天然或是化學操縱的，包括巰基、胺基、羥基、碳水化合物之變旋異構羥基及羧基。合適的官能基為巰基及胺基。可藉由還原抗原結合蛋白之分子間雙硫鍵，設若存在，來產生巰基。任擇地，可藉由抗原結合蛋白之離胺酸部分的胺基與2-亞胺基硫烷(2-iminothiolane)或其他巰基產生試劑反應來產生巰基。於特定具體例中，抗原結合蛋白為重組型抗體以及經工程設計而攜帶一個或多個離胺酸。更佳地，抗原結合蛋白可以經工程設計而攜帶一個或多個半胱胺酸(參見ThioMabs)。

於某些特定具體例中，延伸子單元與抗原結合蛋白的硫原子形成一鍵。該硫原子可衍生自還原的抗原結合蛋白之巰基(--SH)。

於某些其他特定具體例中，延伸子單元係經由抗原結合蛋白的硫原子與延伸子單元之硫原子之間的二硫鍵，而連接至該抗原結合蛋白。

於其他特定具體例中，延伸子的反應性基團含有能與抗原結合蛋白的胺基反應的一個反應位址。胺基可以為精胺酸或離胺酸。合適的胺基反應位址包括但不限於，活化的酯類，諸如琥珀醯亞胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯基酯、酐、酸氯化物、磺醯氯、異氰酸酯以及異硫氰酸酯。

於再另一個態樣中，延伸子的反應功能包含能與抗原結合蛋白上會出現的經修飾之碳水化合物基團，進 行反應的一個反應位址。於特定具體例中，抗原結合蛋白係經酵素醣化以提供碳水化合物部分(要注意，當抗原結合蛋白為抗體時，該抗體通常為天然醣化的)。碳水化合物可以例如用過碘酸鈉的試劑略微氧化，以及所得經氧化的碳水化合物之羰基單元可以與含有官能性的延伸子，諸如醯肼、肟、反應性胺基、肼、硫半卡肼(thiosemicarbazide)、羧酸肼或是芳醯肼，進行縮合。

設若存在間隔子單元(-Y-)時，胺基酸單元(-W-)連接延伸子單元(-T-)與間隔子單元(-Y-)，並且設若不存在間隔子單元，則連接延伸子單元與細胞毒性劑。

如上所述，-Ww-可以為二胜肽、三胜肽、四胜肽、五胜肽、六胜肽、七胜肽、八胜肽、九胜肽、十胜肽、十一胜肽或十二胜肽單元。

於一些具體例中，胺基酸單元可包含胺基酸殘基，例如但不限於：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、乙醯基或甲醯基保護的離胺酸、精胺酸、甲苯磺醯基或硝基保護的精胺酸、組胺酸、鳥胺酸、乙醯基或甲醯基保護的鳥胺酸以及瓜胺酸。例示性胺基酸連接子組分較佳包括二胜肽、三胜肽、四胜肽或五胜肽。

例示性二胜肽包括：Val-Cit、Ala-Val、Lys-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Phe、Phe-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N⁹-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N⁹-硝基-Arg。

例示性三胜肽包括：Val-Ala-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Phe-Phe-Lys、Gly-Gly-Gly、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys。

例示性四胜肽包括：Gly-Phe-Leu-Gly(序列辨識編號33)、Ala-Leu-Ala-Leu(序列辨識編號34)。

例示性四胜肽包括：Pro-Val-Gly-Val-Val(序列辨識編號35)。

包含胺基酸連接子組分之胺基酸殘基含括天然存在的胺基酸殘基，以及微量胺基酸及非天然存在的胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸連接子組分可以在其等對於藉由特定酶，例如腫瘤相關蛋白酶，組織蛋白酶(cathepsin)B、C及D，或纖維蛋白溶酶(plasmin)蛋白酶，來達成的酵素切割之選擇性方面，予以設計及最佳化。

連接子之胺基酸單元可以藉由一種酵素，包括但不限於，腫瘤相關蛋白酶來釋放細胞毒性劑。

胺基酸單元可以在其對於特定的腫瘤相關蛋白酶達成的酵素切割之選擇性方面，予以設計及最佳化。合適的單元為其等之切割係由蛋白酶，組織蛋白酶B、C及D，以及纖維蛋白溶酶所催化的。

當存在間隔子單元(-Y-)時，會將胺基酸單元連接至細胞毒性劑。間隔子單元可為二種通用的類型：「自我分解型(self-immolative)」或「非自我分解型」。非自我分解型間隔子單元為間隔子單元之一部分或全部，在從免疫共軛物進行酵素切割胺基酸單元之後，仍結合至細胞毒性 劑的間隔子單元。非自我分解型間隔子單元之實例包括但不限於(甘胺酸-甘胺酸)間隔子單元及甘胺酸間隔子單元。為了釋放細胞毒性劑，獨立的水解應該發生於標的細胞內以切割甘胺酸-藥物單元的鍵。

在另一個具體例中，一種非自我分解型間隔子單元(-Y-)為-Gly-。

在一個具體例中，免疫共軛物缺少間隔子單元(y=0)。

任擇地，含有自我分解型間隔子單元之免疫共軛物可不需要各別的水解步驟來釋放細胞毒性劑。於此等具體例中，-Y-為對胺基苯甲醇(PAB)，其經由PAB基團的氮原子而連接至-Ww-，且經由碳酸酯、胺基甲酸酯或醚基團直接連接至-D。

其他的自我分解型間隔子單元之實例包括但不限於，電氣上等效於PAB基團的芳香族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物及鄰或對胺基苯甲基縮醛。可使用醯胺鍵水解之後進行流暢的環化的間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺、經適當取代之雙環[2.2.1]和雙環[2.2.2]環系統以及2-胺基苯基丙酸醯胺。

在一個任擇的具體例中，間隔子單元為分支鏈雙(羥甲基)苯乙烯(BHMS)單元，其可用於併入額外的細胞毒性劑。

最後，本發明係有關於一種如上所述的免疫共軛物，供用於治療癌症。

癌症較佳可以在Axl有關的癌症之中選擇，其包括表現或過度表現Axl蛋白的全體或部分於其等表面處之腫瘤細胞。

更特別地，該癌症為乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神經膠質瘤、肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、橫紋肌肉瘤、腎臟癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌以及任何抗藥性現象。本發明的另一個目的為一種藥學組成物，其包含如同本說明書中所說明的免疫共軛物。

更特別地，本發明有關於一種藥學組成物，其包含本發明之免疫共軛物以及至少一賦形劑及/或一藥學上可接受的載劑。

於本說明中，用詞“藥學上可接受的載劑”或是“賦形劑”想要表示加入一藥學組成物之一化合物或是化合物的組合不會造成次級反應以及，舉例而言，其促進活性化合物的投藥，增加身體內其之生命全期及/或有效性，增加其於溶液中之溶解度或是改善其之保存。此等藥學上可接受的載劑及賦形劑為熟知的，以及會由熟悉此藝者根據所選擇的活性化合物之本質和投藥途徑來改造。

較佳地，此等免疫共軛物會藉由系統性的途徑予以投藥，尤其是藉由靜脈內的途徑、肌肉內的、皮內的、腹膜內的、皮下的或是口的途徑。以更佳的方式，包含依據本發明之免疫共軛物的組成物會以連續地方式投藥數次。

其等之投藥模式、劑量和最佳的藥物形式可以根 據建立適合病人的治療通常考慮的準則來決定，例如，舉例而言，病人的年齡或體重、他/她的一般狀態嚴重性、治療耐受性以及提到的副作用。

本發明之其他的特徵和優點顯露於本說明續編部分及實施例和圖示中，以下表示其之說明。

圖1A-C：使用Mab-zap共軛的二級抗體於SN12C細胞關於110D7(A)、1003A(B)以及1024G11(C)之活體外細胞毒性分析。

圖2A-2I： -110D7對ELISA之固定化的rhAxl-Fc蛋白(2A)、rhDtk-Fc(2B)或是rhMer-Fc(2C)蛋白之抗-Axl結合的專一性， -1003A2對ELISA之固定化的rhAxl-Fc蛋白(2D)、rhDtk-Fc(2E)或是rhMer-Fc(2F)蛋白之抗-Axl結合的專一性， -1024G11對ELISA之固定化的rhAxl-Fc蛋白(2G)、rhDtk-Fc(2H)或是rhMer-Fc(2I)蛋白之抗-Axl結合的專一性。

圖3A-C：藉由流動式細胞測量術、於各種各樣的人類的腫瘤細胞株(Calu-1、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB435S、NCI-H125、Panc1以及SN12C)存在下所得到的110D7(A)、1003A2(B)以及1024G11(C)劑量反應資料。

圖4A-C：110D7(A)、1003A2(B)以及1024G11(C)關於固定化的rmAxl-Fc蛋白(“rm”代表小鼠重組型)之ELISA。

圖5A-C：依照使用流動式細胞測量方法之間接的標定 協定而判定的110D7(A)、1003A2(B)以及1024G11(C)結合於COS7細胞。

圖6A-C：使用抗-Axl抗體110D7(A)、1003A2(B)以及1024G11(C)之Gas6結合之競爭ELISA。

圖7A-C：110D7(A)、1003A2(B)以及1024G11(C)使用SN12C細胞溶解產物、經由西方墨點法之抗原決定位結合分析。NH(沒有熱度)；NR(沒有減少)；H(熱度)；R(減少)。GAPDH偵測法證實正確的樣品裝入膠體上。

圖8A-F：在110D7、1003A2以及1024G11結合於SN12C細胞上之後，用西方墨點法研究Axl向下調節，且圖8A(110D7)8C(1003A2)以及8E(1024G11)-執行的3個獨立實驗之西方墨點法影像的代表(在抗-Axl抗體於SN12C細胞上孵育4h以及24h之後執行西方墨點分析)；以及圖8B(110D7)、8D(1003A2)以及8F(1024G11)-呈現的薄膜使用“QuantityOne”軟體之光密度定量。

圖9A-I：SN12C細胞在用110D7、1003A2以及1024G11抗-Axl抗體孵育後的免疫螢光顯微鏡，圖9A(110D7)、9D(1003A2)以及9G(1024G11)-膜及細胞內染色兩者之mIgG1同型(isotype)對照條件的照片。圖9B(110D7)、9E(1003A2)以及9H(1024G11)-膜染色。圖9C(110D7)、9F(1003A2)以及9I(1024G11)-分別使用110D7、1003A2及1024G11抗體之Axl受體以及早期內體標記EEA1兩者之細胞內染色。影像重疊呈現在下方(bellow)以及顯現的共定位(co-localizations)係以箭頭指示。

圖10A-C：與mIgG1同型對照抗體之效應相比之下，110D7(A)、1003A2(B)以及1024G11(C)抗體對於活體外SN12C細胞增殖之效應。

圖11A-11K呈現以110D7免疫共軛物濃度的函數之細胞毒性百分比，其係於用一系列的117D7-沙泊寧(saporin)免疫共軛物濃度處理的(A)SN12C、(B)Calu-1、(C)A172、(D)A431、(E)DU145、(F)MDA-MB-435S、(G)MDA-MB-231、(H)PC3、(I)NCI-H226、(J)NCI-H125或(K)Panc1腫瘤細胞之不同的活體外細胞之細胞毒性分析中獲得的。

圖12A-12K呈現以1003A2免疫共軛物濃度的函數之細胞毒性百分比，其係於用一系列的1003A2-沙泊寧免疫共軛物濃度處理的(A)SN12C、(B)Calu-1、(C)A172、(D)A431、(E)DU145、(F)MDA-MB-435S、(G)MDA-MB-231、(H)PC3、(I)NCI-H226、(J)NCI-H125或(K)Panc1腫瘤細胞之不同的活體外細胞之細胞毒性分析中獲得的。

圖13A-13K呈現以1024G11免疫共軛物濃度的函數之細胞毒性百分比，其係於用一系列的1024G11-沙泊寧免疫共軛物濃度處理的(A)SN12C、(B)Calu-1、(C)A172、(D)A431、(E)DU145、(F)MDA-MB-435S、(G)MDA-MB-231、(H)PC3、(I)NCI-H226、(J)NCI-H125或(K)Panc1腫瘤細胞之不同的活體外細胞之細胞毒性分析中獲得的。

較佳實施例之詳細說明 實施例

於下列的實施例中，使用的同型對照抗體由稱為9G4之小鼠IgG1所組成。意思是，於下列的實施例中，用詞mIgG1、對照以及9G4是類似的。

實施例1：Axl受體內化

因當標定的抗原為一種內化的蛋白時，免疫共軛物方法為更有效的，所以對人類的腫瘤細胞株、使用Mab-Zap細胞毒性分析來研究Axl受體的內化。更準確地，Mab-Zap試劑為一種親和性純化的山羊抗小鼠IgG以及核糖體不活化蛋白，沙泊寧之化學共軛物。設若免疫複合物發生內化，沙泊寧會斷裂離開標定劑(targeting agent)以及不活化核糖體，此引起蛋白抑制以及最後，引起細胞死亡。在用抗體孵育Axl-陽性細胞72小時之後判定細胞活力得以推斷出Axl受體內化。

關於此實施例，使用依照利用Qifikit試劑(Dako)來決定的高度Axl-陽性細胞。資料呈現下列的表5。

於下列的實施例中，使用SN12C細胞來作為非限制性實例。可以使用表現合適位準的Axl受體於其之細胞表面上的任何其他的細胞株。

濃度範圍的110D7，分別為1003A2及1024G11抗 -Axl抗體或是mIgG1同型對照9G4抗體與100ng的Mab-Zap(先進的標定系統(Advanced targeting systems))的二級抗體於細胞培養基內、於RT下預孵育歷時30min。將此等混合物裝入平盤培養(plated)於白色96-井平盤微量平盤內之半匯集狀態的(sub-confluent)SN12C細胞上。於5% CO2存在下、在37℃平盤孵育歷時72小時。使用Cell Titer Glo細胞增殖的方法、依據製造業者的操作指南(Promega)來判定細胞活力。執行數個對照：準備i)沒有任何二級免疫共軛物以及ii)沒有初級抗體的條件。同時，用mIgG1同型對照來執行分析。

得到的結果表示於圖1A(110D7)、1B(1003A2)、1C(1024G11)內。

110D7抗體對~49%的SN12C細胞顯示最大的細胞毒性效應。1003A2抗體對~37%的SN12C細胞顯示最大的細胞毒性效應。1024G11抗體對~40%的SN12C細胞顯示最大的細胞毒性效應。

視為實驗中的mIgG1同型對照，9G4抗體存在時沒有觀察到細胞毒性效應。

僅含有初級抗體的井沒有觀察到細胞毒性效應(資料未顯示)。因而Axl受體看來為一種免疫共軛物方法之合宜的定標的抗原，因該包含Axl-110D7-MabZap、Axl-1003A2-MabZap或是Axl-1024G11-MabZap之免疫複合物觸發標定細胞有效的細胞毒性。

實施例2：對抗rhAxl ECD蛋白的抗體的產生. 2.1 110D7 Axl抗體的產生

為了產生對抗人類Axl受體之細胞外領域(ECD)的單株抗體，5隻BALB/c小鼠係用5-15μg的rh Axl-Fc蛋白(R and D Systems,Cat N°154-AL)予以免疫3次。第一次免疫係於完全佛恩得佐劑(Freund adjuvant)(Sigma,St Louis,MD,USA)存在下執行。之後的免疫添加不完全佛恩得佐劑(Sigma)。

於融合之前3天，經免疫的小鼠係用15μg的rhAxl-Fc蛋白(CIPF)、伴隨IFA予以腹膜內的(i.p.)提升(boost)免疫反應。

脾細胞及淋巴細胞係分別藉由灌注脾臟及藉由切碎近端淋巴結的方法來製備，從5隻經免疫的小鼠中的1隻收穫(在血清滴定法之後選擇)以及融合至SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC,Rockville,MD,USA)。融合協定係依照描Kohler和Milstein所述(Nature,256：495-497,1975)。融合的細胞繼而接受HAT選擇法。一般而言，關於單株抗體或其等之功能性片段的製備，尤其是小鼠起源的該等，有可能會特別提及於手冊“Antibodies”(Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)中所說明的技術。

融合大概10天之後，篩選雜交細胞之群落(colonies)。在初級篩選方面，用ELISA來評估融合瘤上清液對抗rhAxl-Fc蛋白而提升的Mabs之分泌情形。同時，執 行FACS分析來選擇能與存在於人類的DU145攝護腺腫瘤細胞(ATCC)之細胞表面上，細胞形式的Axl結合之Mabs。

選擇的融合瘤盡快地藉由限制稀釋(limit dilution)予以選殖，以及隨後篩選其等對抗人類Axl ECD蛋白之反應性。經選殖的Mabs接著使用分型(Isotyping)套組(cat #5300.05,Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)予以分型(isotype)。從各融合瘤獲得的純株選擇一個純株以及予以擴大。

融合瘤上清液係藉由ELISA來分析以判定其等對人類Axl受體之ECD領域或是對rh Axl-Fc蛋白之結合能力。當判定了上清液內的IgG含量時，滴定法係以5μg/ml開始實行。接而，之後的11列執行½連續稀釋。否則，便以純的上清液來施用。簡言之，以配於PBS之2μg/ml、50μl/井的rh Axl-Fc蛋白(R and D Systems,cat N° 154-AL)來塗覆96井ELISA平盤(Costar 3690,Corning,NY,USA)於4℃過夜。接而用含有0.5%明膠之PBS(#22151,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,Germany)於37℃封阻歷時2小時。一旦以輕彈(flicking)平盤方式丟棄飽和緩衝劑，就添加50μl純的融合瘤細胞上清液或是50μl的5μg/ml溶液至ELISA平盤，以及於37℃孵育歷時1小時。在清洗三次之後，添加配於含有0.1%明膠和0.05%妥文(Tween)20(w：w)的PBS內、1/5000稀釋之50μl辣根過氧化酶共軛的多株山羊抗小鼠IgG(#115-035-164,Jackson Immuno-Research Laboratories,Inc.,West Grove,PA,USA)至平盤、於37℃孵 育歷時1小時。接而，清洗ELISA平盤三次，以及添加TMB(#UP664782,Uptima,Interchim,France)受質。在室溫下10min孵育時間之後，使用1M硫酸來停止反應以及測量450nm之光密度。

於流動式細胞測量術的選擇法方面，100 000個表現Axl受體於其等表面上之人類的攝護腺癌症DU145細胞(ATCC)於4℃、予以平盤培養於含有1% BSA和0.01%疊氮化鈉的PBS(FACS緩衝劑)之96井平盤的每個井中。在以2000rpm離心2min之後，移去緩衝液以及添加待測試的融合瘤上清液或純化的Mabs(1μg/ml)。在4℃孵育20min之後，清洗細胞二次，以及添加一種以FACS緩衝劑1/500°稀釋的Alexa 488-共軛的山羊抗小鼠抗體(#A11017,Molecular Probes Inc.,Eugene,USA)且於4℃下孵育歷時20分鐘。在用FACS緩衝劑最後一次清洗之後，於添加終濃度40μg/ml之碘化丙啶(propidium iodide)至各管後，透過FACS(Facscalibur,Becton-Dickinson)來分析細胞。只含細胞的井及用二級Alexa 488-共軛的抗體孵育的細胞被含括作為陰性對照。各實驗中使用同型對照(Sigma,ref M90351MG)。評估至少5000個細胞來計算螢光強度平均值(MFI)。

更確切地，用310.10⁶收穫的脾細胞以及310.10⁶骨髓瘤細胞(1：1比率)來執行融合。所得的細胞懸浮液之二百個細胞係以2.10⁶細胞/ml的量予以平盤培養於30個96井平盤內。

透過rh Axl-Fc蛋白之ELISA以及使用DU145腫瘤細胞株之FACS分析二者進行之第一次篩選(大約融合之後第14天)，得以選擇出5個融合瘤，其等於rh Axl-Fc塗層呈現超過0.5之光密度(ODs)，以及於DU145人類的攝護腺腫瘤細胞株呈現超過40之MFI。

擴大此等5個融合瘤以及藉由限制稀釋來選殖。為每個編碼準備一個96井平盤。平盤培養的九天之後，來自選殖平盤的上清液首先藉由ELISA來篩選其等對於rh Axl-Fc蛋白之細胞外領域的結合專一性。接而進行使用固定化的大鼠重組型Notch-Fc蛋白之另一個ELISA分析，來排除抗-Fc Mabs。此外，藉由流動式細胞測量術來測試融合瘤關於DU145人類的攝護腺癌症(can)細胞株的反應性。擴大每個編碼的三個純株以及予以分型。一旦產生，進一步研究抗-Axl抗體關於其等在Axl結合於細胞表面上以後被內化的能力。

2.2 1003A2及1024G11 Axl抗體的產生

為了產生對抗人類Axl受體之細胞外領域(ECD)的單株抗體，5隻BALB/c小鼠係用20μg的人類單體Axl蛋白(內部產品)予以s.c.(皮下)免疫4次。第一次免疫係於完全佛恩得佐劑(Sigma,St Louis,MD,USA)存在下執行。之後的免疫添加不完全佛恩得佐劑(Sigma)。

於融合之前3天，經免疫的小鼠係用20μg的單體Axl蛋白(內部產品)、伴隨IFA予以腹膜內的(i.p.)提升(boost)免疫反應。

為了產生融合瘤細胞，脾細胞及淋巴細胞係分別藉由灌注脾臟及藉由切碎近端的淋巴結的方法來製備，從5隻經免疫的小鼠中的1隻收穫(在血清滴定法之後選擇)以及融合至SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC,Rockville,MD,USA)。融合協定係依照描Kohler和Milstein所述(Nature,256：495-497,1975)。融合的細胞繼而接受HAT選擇法。一般而言，關於單株抗體或其等之功能性片段的製備，尤其是小鼠起源的該等，有可能會特別提及於手冊“Antibodies”(Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)中所說明的技術。

融合大概10天之後，篩選雜交細胞之群落。在初級篩選方面，用ELISA來評估融合瘤上清液對抗單體Axl蛋白(CIPF)而提升的Mabs之分泌情況。同時，執行FACS分析來選擇能與存在於人類的DU145攝護腺腫瘤細胞(ATCC)之細胞表面上，細胞形式的Axl結合之Mabs。

選擇的融合瘤盡快地藉由限制稀釋予以選殖，以及隨後篩選其等對抗單體Axl受體之反應性。經選殖的Mabs接著使用分型套組(cat #5300.05,Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)予以分型。從各融合瘤獲得的純株選擇一個純株以及予以擴大。

融合瘤上清液係藉由ELISA來分析以判定其等對人類Axl受體之ECD領域之結合能力。當判定了上清液內的IgG含量時，滴定法係以5μg/ml開始實行。接而，之後的 11列執行½連續稀釋。否則，就以純的上清液來施用。簡言之，以配於PBS之2μg/ml、50μl/井的ECD Axl溶液(CIPF)，或是配於PBS之2μg/ml、50μl/井的rh Axl-Fc蛋白(R and D Systems,cat N° 154-AL)來塗覆96-井ELISA平盤(Costar 3690,Corning,NY,USA)於4℃過夜。接而用含有0.5%明膠之PBS(#22151,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,Germany)於37℃封阻歷時2小時。一旦以輕彈平盤方式丟棄飽和緩衝劑，便添加50μl純的融合瘤細胞上清液或是50μl的5μg/ml溶液至ELISA平盤，以及於37℃孵育歷時1小時。在清洗三次之後，添加配於含有0.1%明膠和0.05%妥文20(w：w)的PBS、1/5000稀釋之50μl辣根過氧化酶共軛的多株山羊抗小鼠IgG(#115-035-164,Jackson Immuno-Research Laboratories,Inc.,West Grove,PA,USA)至平盤、於37℃孵育歷時1小時。接而，清洗ELISA平盤三次，以及添加TMB(#UP664782,Uptima,Interchim,France)受質。在室溫下10min孵育時間之後，使用1M硫酸來停止反應以及測量450nm之光密度。

於流動式細胞測量術的選擇法方面，100 000個表現Axl受體於其等表面上之人類的攝護腺癌症DU145細胞(ATCC)於4℃、予以平盤培養於含有1% BSA和0.01%疊氮化鈉的PBS(FACS緩衝劑)之96井平盤的每個井中。在以2000rpm離心2min之後，移去緩衝液以及添加待測試的融合瘤上清液或純化的Mabs(1μg/ml)。在4℃孵育20min之後，清洗細胞二次，以及添加一種以FACS緩衝劑1/500°稀 釋的Alexa 488-共軛的山羊抗小鼠抗體(#A11017,Molecular Probes Inc.,Eugene,USA)且於4℃下孵育歷時20分鐘。在用FACS緩衝劑最後一次清洗之後，於添加終濃度40μg/ml之碘化丙啶至各管後，透過FACS(Facscalibur,Becton-Dickinson)來分析細胞。只含細胞的井及用二級Alexa 488-共軛的抗體孵育的細胞被含括作為陰性對照。各實驗中使用同型對照(Sigma,ref M90351MG)。評估至少5000個細胞來計算螢光強度平均值(MFI)。

用280.10⁶收穫的脾細胞及淋巴細胞以及280.10⁶骨髓瘤細胞(1：1比率)來執行融合。繼而所得的融合細胞懸浮液(2.10⁶細胞/ml)予以平盤培養於30個96井平盤內。

固定化Axl ECD蛋白之ELISA二者之第一次篩選(大約融合之後第14天)，得以選擇出69個融合瘤，其等於ECD Axl塗層呈現超過1之光密度(ODs)。使用DU145腫瘤細胞株之互補性(complementary)FACS分析限制了選擇的融合瘤的數量。此步驟中，保留於DU145人類的攝護腺腫瘤細胞株呈現超過100的MFI之17個融合瘤，以及藉由限制稀釋來選殖。使用單體Axl ELISA來篩選選殖平盤；然後擴大選擇的融合瘤，以及進一步對於其等之結合專一性和其等被內化的能力予以定特徵。

實施例3：Axl結合專一性

於此實施例中，分別研究110D7、1003A2、1024G11抗體對於rhAxl-Fc蛋白之結合作用。其次，研究其對於TAM家族之二個其他的成員，rhDtk-Fc和rhMer-Fc之結 合作用。

簡言之，將重組型人類Axl-Fc(R and D systems,cat N° 154AL/CF)、rhDtk(R and D Systems,cat N° 859-DK)或rh-Mer-Fc(R and D Systems,cat N° 891-MR)蛋白塗覆至Immulon II 96-井平盤於4℃過夜以及，在用0.5%明膠溶液之1h封阻的步驟之後，分別添加起始濃度5μg/ml(3.3310^-8M)之110D7、1003A2、1024G11純化的抗體，於37℃歷時額外的1h。然後進行12行(column)的½連續稀釋。繼而清洗平盤以及添加一種山羊抗小鼠(Jackson)專一的IgG HRP於37℃歷時1h。反應的顯影係使用TMB受質溶液予以執行。亦同時使用商業的抗-Axl Mab 154抗體(資料未顯示)。於HRP標定的山羊抗-人類IgG Fc多株血清(Jackson,ref 109-035-098)存在下及/或於HRP-偶合的抗-組胺酸抗體(R and D Systems,ref：MAB050H)存在下，執行塗覆的對照。缺少初級抗體的情況(稀釋液(diluant))沒有觀察到非專一性的結合。110D7的結果分別表示於圖2A、2B和2C內。1003A2的結果分別表示於圖2D、2E和2F內。1024G11的結果分別表示於圖2G、2H和2I內。

此實施例顯示出110D7、1003A2、1024G11抗體僅結合rhAxl-Fc蛋白以及不會結合TAM家族之二個其他的成員，rhDtk或rhMer。在TAM成員之間沒有觀察到110D7、1003A2、1024G11抗體交叉-專一性(cross-specificity)的結合。

實施例4：人類的腫瘤細胞上之Axl偵測

人類的腫瘤細胞上之細胞表面Axl表現位準首先 使用一種商業Axl抗體(R and D Systems,ref：MAB154)來建立，同時進行校正珠(calibration beads)，得以容許定量Axl表現位準。其次，使用110D7、1003A2以及1024G11來研究細胞表面的Axl之結合作用。於兩種情況中，在下方(bellow)簡短地描述實驗條件。

在細胞表面結合研究方面，於11處(points)製備二倍連續稀釋的10μg/ml(6.66 10^-8M)的初級抗體溶液(110D7、1003A2、1024G11、MAB154 Axl商業抗體或mIgG1同型對照9G4 Mab)，以及施用於2.10⁵細胞上於4℃歷時20min。在用補充有1% BSA和0.01% NaN₃的磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)清洗3次之後，用二級抗體山羊抗小鼠Alexa 488(1/500°稀釋)於4℃孵育細胞歷時20分鐘。在用補充有1% BSA和0.1% NaN₃的PBS清洗另外3次之後，透過FACS(Facscalibur,Becton-Dickinson)來分析細胞。評估至少5000個細胞來計算螢光強度平均值。

在使用MAB154Axl抗體之定量ABC判定方面，使用QIFIKIT®校正珠。然後，與QIFIKIT®小珠同時進行，用飽和終濃度的多株山羊抗小鼠免疫球蛋白/FITC、山羊F(ab')₂，來孵育細胞。接而樣本細胞上抗原位址的數量係藉由校正曲線之內插法來判定(個別的小珠總體之螢光強度對抗小珠上Mab分子的數量。

4.1.細胞表面Axl表現位準的定量

人類的腫瘤細胞表面上之Axl的表現位準係藉由使用間接免疫螢光分析的流動式細胞測量術(QIFIKIT®方 法(Dako,Denmark)來判定，其為一種用於評估細胞表面抗原之定量的流動式細胞測量套組。經由校正圖來比較小珠已知的抗原位準之平均螢光強度(MFI)得以判定細胞株之抗體結合能力(ABC)。

表6呈現於各種各樣的人類腫瘤細胞株(SN12C、Calu-1、A172、A431、DU145、MDA-MB435S、MDA-MB231、PC3、NCI-H226、NCI-H125、MCF7、Panc1)(ATCC,NCI)的表面上偵測到的Axl表現位準，如同於Axl商業抗體MAB154(R and D Systems)存在下、使用QIFIKIT®來判定的。給與抗原結合複合物(ABC)的數值。

商業Axl單株抗體(MAB154)獲得的結果顯示出Axl受體係以不同位準表現，取決於所考慮的人類的腫瘤細胞。

4.2.使用110D7、1003A2以及1024G11Axl抗體偵測人類的腫瘤細胞上的Axl

更特別地，使用Axl 110D7、1003A2或是 1024G11抗體來研究Axl的結合。應用Axl抗體劑量反應曲線。然後用Prism軟體分析使用各種各樣的人類的腫瘤細胞獲得的MFIs。資料呈現於圖3A-3C內。

如飽和曲線剖面圖證明的，資料顯示出三種Axl抗體專一地結合膜Axl受體。然而，觀察到不同的標定強度，顯露出人類的腫瘤細胞上多變位準的細胞表面Axl受體。使用MCF7人類的乳房腫瘤細胞株沒有觀察到Axl受體的結合。

實施例5：110D7、1003A2、1024G11抗體物種間的交叉專一性(inter-species crosspecificity)

為了處理抗-Axl抗體，110D7、1003A2以及1024G11之物種的交叉專一性，考慮2種物種：小鼠和猴子。首先藉由ELISA(圖4A至C)來研究重組型小鼠(rm)Axl受體的結合作用。其次，使用猴子COS7細胞作為此等表現Axl受體於其等之表面上的細胞來執行流動式細胞測量術實驗(圖5A至C)。藉由使衍生自非洲綠猴腎臟細胞之永生化CV-1細胞株，與能產生大T抗原但是基因體複製有缺陷的SV40基因體版本，來獲得COS7細胞株。

5.1 rmAxl-Fc ELISA

簡言之，將重組型小鼠Axl-Fc(R and D Systems,cat N° 854-AX/CF)蛋白塗覆至Immulon II 96-井平盤於4℃過夜以及，在用0.5%明膠溶液之1h封阻的步驟之後，分別添加起始濃度5μg/ml(3.33 10^-8M)之110D7、1003A2、1024G11純化的抗體，於37℃歷時額外的1h。然後進行12 行(column)的½連續稀釋。繼而清洗平盤以及添加一種山羊抗小鼠(Jackson)專一的IgG HRP於37℃歷時1h。反應的顯影係使用TMB受質溶液予以執行。亦同時使用商業的小鼠抗-Axl Mab 154抗體。於用HRP(Jackson,ref 109-035-098)偶合的山羊抗-人類IgG Fc多株血清存在下及於HRP-偶合的抗-組胺酸抗體(R and D Systems,ref：MAB050H)存在下，執行塗覆對照。缺少初級抗體的情況(稀釋液(diluant))沒有觀察到非專一性的結合。

結果表示於圖4A(110D7)、4B(1003A2)和4C(1024G11)內。

圖4A顯示本發明的110D7抗體僅僅在高抗體濃度(超過8.3 10^-9M)存在下能結合小鼠Axl ECD領域。

圖4B顯示本發明的1003A2抗體不會結合小鼠Axl ECD領域。

圖4C顯示本發明的1024G11抗體不會結合小鼠Axl ECD領域。

5.2 FACS COS7

分別為了110D7、1003A2和1024G11，細胞結合的目的，用分別藉由½連續稀釋(12處)之110D7、1003A2和1024G11之10μg/ml(6,66 10^-8M)抗體溶液，或是m9G4(mIgG1同型對照Mab)製備之抗體濃度範圍於4℃下孵育2.10⁵細胞歷時20分鐘。在用補充有1% BSA和0.01% NaN₃的磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)清洗3次之後用二級抗體山羊抗小鼠Alexa 488(稀釋1/500)於4℃下孵育細胞歷時20分 鐘。在用補充有1% BSA和0.1% NaN₃的PBS清洗另外3次之後，透過FACS(Facscalibur,Becton-Dickinson)來分析細胞。評估至少5000個細胞來計算螢光強度平均值。資料使用Prism軟體來分析。

結果表示於圖5A(110D7)、5B(1003A2)和5C(1024G11)內。

分別使用110D7、1003A2和1024G11抗體以及mIgG1同型對照、建立於COS7細胞之滴定曲線證實110D7、1003A2和1024G11分別能辨識表現於COS7細胞表面上之猴子細胞形式的Axl受體。

110D7抗體濃度高於156μg/ml(10^-9M)到達高原。1003A2抗體濃度高於0.07μg/ml(5.2 10^-10M)到達高原。1024G11抗體濃度高於0.07μg/ml(5.2 10^-10M)到達高原。

於mIgG1同型對照存在下沒有觀察到結合。

實施例6：於110D7、1003A2以及1024G11抗體存在下執行Gas6競爭實驗

為了進一步定出抗-Axl Mabs的特徵，執行Gas6競爭分析。於此分析中，孵育游離的rhAxl-Fc蛋白及抗-Axl抗體以形成抗原抗體複合物，然後將複合物裝入分析平盤Gas6-塗覆的表面上。清洗去掉未結合的抗原抗體複合物，而後添加對抗人類rhAxl-Fc蛋白Fc部分之酵素-連接的二級抗體。然後添加受質以及接而可以由酵素-受質反應引出的信號強度來判定抗原濃度。

簡言之，於獨立的飽和(0.5%明膠，配於PBS 1X) 的平盤上製備包含rhAxl-Fc蛋白之反應混合物，於待測試的Mabs存在或是不存在下。執行小鼠Axl抗體(110D7、1003A2和1024G11)之1：2連續稀釋(從80μg/ml開始進行12行)。然後添加0.5μg/ml的rhAxl-Fc蛋白(R and D Systems,ref.154AL/CF)，除了只含有ELISA稀釋液(diluant)(0.1%明膠，0.05%妥文20，配於PBS 1X)的陰性對照行之外。在均質化之後，將競爭樣品裝入配於PBS之6μg/ml rhGas6溶液(R and D Systems cat N° 885-GS-CS/CF)之Gas6-塗覆的平盤上。在孵育和數次清洗之後，使用山羊抗-人類IgG-HRP(Jackson,ref.109-035-098)來偵測結合的rhAxl-Fc蛋白。一旦結合，便添加TMB受質至平盤。透過添加H₂SO₄酸溶液來停止反應以及使用微量平盤讀數裝置於450nm讀取獲得的光密度。

此實驗(分別為圖6A、6B和6C)顯示出110D7、1003A2以及1024G11能與rhAxl-Fc競爭結合於其等之固定化的配體。與Gas6之結合競爭作用於出現110D7抗體濃度高於2.5μg/ml(1.67 10^-8M)的情況下發生。與Gas6之結合競爭作用於出現1003A2抗體濃度高於2.5μg/ml(1.67 10^-8M)的情況下發生。1003A2抗體濃度高於10μg/ml(6.67 10^-8M)出現的情況下，觀察到rhAxl-Fc不再結合固定化的Gas6。與Gas6之結合競爭作用出現於1024G11抗體濃度高於2.5μg/ml(1.67 10^-8M)的情況下發生。於1024G11抗體濃度高於10μg/ml(6.67 10^-8M)出現的情況下，觀察到rhAxl-Fc不再結合固定化的Gas6。

110D7、1003A2以及1024G11抗體封阻Gas6結合於rhAxl-Fc上。

實施例7：西方墨點法之抗原決定位辨識

為了判定是否110D7、1003A2以及1024G11抗-Axl抗體會辨識線型的或是構形的抗原決定位，使用SN12C細胞溶解產物來進行西方墨點分析。以不同方式處理樣品使處於還原的或非還原的條件。設若還原的樣品顯現電泳帶，則測試的抗體即標定ECD領域之線型的抗原決定位；設若沒有，則引起的測試的抗體即對抗Axl ECD之構形的抗原決定位。

以5.10⁴細胞/cm²的量播種SN12C細胞於T162cm²燒瓶內之RPMI+10%熱不活化的FBS+2mM L-麩醯胺酸中、在37℃於5% CO₂氛圍中歷時72h。然後用磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)清洗細胞二次以及用1.5ml冰冷的溶解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH7.5)；150mM NaCl；1% Nonidet P40；0.5%脫氧膽酸鹽；和1種完全蛋白酶抑制劑雞尾酒錠劑(complete protease inhibitor cocktail tablet)加上1%抗磷酸酶]來溶解。細胞溶解產物於4℃搖動歷時90min且以15 000rpm歷時10min使澄清。使用BCA來定量蛋白濃度。裝入各種的樣品。首先製備還原條件(1x樣品緩衝液(BIORAD)+1x還原劑(BIORAD))之10μg完整的細胞溶解產物(10μg配於20μl)以及在96℃孵育2min之後裝入SDS-PAGE。其次，製備非還原條件(僅僅配於1x樣品緩衝液(BIORAD))之二個其他的10μg完整的細胞溶解產物之樣品。在裝入 SDS-PAGE膠體之前，此等二個最後的樣品其中之一者於96℃加熱孵育2min；另一者保存於冰上。在移動之後，蛋白移轉至硝化纖維素膜。用TBS-妥文20 0.1%(TBST)於RT歷時1h來飽和膜；5%脫脂乳以及分別以10μg/ml 110D7、1003A2和1024G11抗體、在4℃於TBST-5%脫脂乳粉內探測過夜。於帶有1%脫脂乳粉之Tris-緩衝鹽水-0.1%妥文20(v/v)(TBST)內稀釋抗體。接而用TBST清洗膜，以及用過氧化酶共軛的二級抗體(稀釋1/1000)於RT孵育歷時1小時。用ECL(Pierce #32209)以使免疫反應性的(Immunoreactive)蛋白顯現。於Axl顯現之後，用TBST再清洗膜一次以及用配於TBST-5%脫脂乳粉內之小鼠抗-GAPDH抗體(稀釋1/200 000)於RT孵育歷時1h。接而以TBST清洗膜以及用過氧化酶共軛的二級抗體於RT孵育細胞歷時1h。清洗膜以及使用ECL來顯示GAPDH。

結果表示於圖7A(110D7)、7B(1003A2)和7C(1024G11)內。

110D7、1003A2以及1024G11抗-Axl抗體辨識構形的抗原決定位，因為僅於非還原的條件下觀察到專一性的電泳帶。於SN12C細胞溶解產物變性的移動條件沒有觀察到電泳帶。

實施例8：透過西方墨點法測量由110D7、1003A2、1024G11抗體所觸發之Axl向下調節.

於下列的實施例中，選擇人類的腎臟細胞癌細胞株SN12C(ATCC)來處理抗體對Axl受體表現的活性。SN12C 細胞株過度表現Axl受體。於圖8A-8B(110D7)、8C-8D(1003A2)和8E-8F(1024G11)內、透過西方墨點法對完整的細胞萃取物來研究Axl向下調節的作用。

SN12C細胞係以6.10⁴細胞/cm²的量播種於六井平盤內之RPMI+10%熱不活化的FBS+2mM L-麩醯胺酸中、在37℃於5% CO₂氛圍中歷時48h。在用磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)清洗二次之後，於含有800ng/ml重組型小鼠gas6配體(R and D Systems,ref：986-GS/CF)或是10μg/ml的mIgG1同型對照抗體(9G4)或是10μg/ml之本發明的抗-Axl抗體之培養基內以血清不足(serum-starved)的方式培養細胞，以及孵育歷時4h或額外的24小時。然後溫和地移去培養基以及用冷的PBS清洗細胞二次。用200μl冰冷的溶解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH7.5)；150mM NaCl；1% Nonidet P40；0.5%脫氧膽酸鹽；和1種完全蛋白酶抑制劑雞尾酒錠劑加上1%抗磷酸酶]溶解細胞。細胞溶解產物於4℃搖動歷時90min且以15 000rpm歷時10min使澄清。使用BCA來定量蛋白濃度。裝入各種的樣品。藉由SDS-PAGE來分離完整的細胞溶解產物(10μg配於20μl)以及移轉至硝化纖維素膜。用TBS-妥文20 0.1%(TBST)於RT歷時1h來飽和膜；5%脫脂乳以及用0,5μg/ml(AbNova H00000558-M02)商業抗-Axl抗體、在4℃於TBST-5%脫脂乳粉內探測過夜。於帶有1%脫脂乳粉之Tris-緩衝鹽水-0.1%妥文20(v/v)(TBST)內稀釋抗體。接而用TBST清洗膜，以及用過氧化酶共軛的二級抗體(稀釋1/1000)於RT孵育歷時1小時。用ECL(Pierce #32209)以使免疫反應性的蛋白顯現。於Axl顯現之後，用TBST再清洗膜一次，以及用配於TBST-5%脫脂乳粉內之小鼠抗-GAPDH抗體(稀釋1/200000)於RT孵育歷時1h。接而以TBST清洗膜以及用過氧化酶共軛的二級抗體於RT孵育細胞歷時1h。清洗膜以及使用ECL來顯示GAPDH。用密度測定法來定量電泳帶強度。

呈現於圖8A和8B內的結果為3個獨立實驗的代表，以及顯示出110D7能向下調節Axl過度表現的人類的腫瘤細胞株內之Axl。在4h時，110D7抗體觸發50%的Axl向下調節，以及在用110D7抗體孵育24小時之後高達84%的Axl向下調節。

呈現於圖8C和8D內的結果為3個獨立實驗的代表。以及顯示出1003A2能向下調節Axl過度表現的人類的腫瘤細胞株內之Axl。在4h時，1003A2抗體觸發66%的Axl向下調節，以及在用抗體1003A2孵育24小時之後高達89%的Axl向下調節。

呈現於圖8E和8F內的結果為3個獨立實驗的代表。以及顯示出1024G11能向下調節Axl過度表現的人類的腫瘤細胞株內之Axl。在4h時，1024G11抗體觸發68%的Axl向下調節，以及在用1024G11抗體孵育24小時之後高達85%的Axl向下調節。

實施例9：抗-Axl抗體對於細胞表面上的Axl表現之效應的流動式細胞測量術研究

流動式細胞測量術容許標定細胞表面的Axl受 體。使用此技術能突出抗體對於膜Axl表現的效應。此實施例中使用表現高位準的Axl人類的腎臟腫瘤SN12C細胞。

在實驗前於具有1% L-麩醯胺酸和10%的FCS之RMPI1640內培養SN12C腫瘤細胞株歷時3天。然後使用胰蛋白酶使細胞分離以及平盤培養於具有1% L-麩醯胺酸和5%的FCS之RMPI1640的6-多井平盤內。隔天，添加10μg/ml引起興趣的抗體。亦含括未處理的井。細胞孵育於37℃下，5% CO₂。二十四小時後，用PBS清洗細胞、使細胞分離以及用相同的引起興趣的抗體孵育於FACS緩衝液(PBS，1% BSA，0.01%疊氮化鈉)內。未處理的井亦用相同的抗體染色俾以比較相同的Mab對於處理的細胞和無處理的細胞獲得的信號強度。細胞於4℃下孵育歷時20分鐘以及用FACS緩衝液清洗三次。一種Alexa 488標定的山羊抗小鼠IgG抗體孵育歷時20分鐘以及清洗細胞三次，然後FACS分析碘化丙啶陰性細胞族群。未處理的細胞和用相同的抗體處理條件之間的Mab染色差異指示出細胞之細胞表面上的Axl蛋白之向下調節。

判定二個參數：(i)於細胞表面上剩餘的Axl之百分比以及ii)在T24h時，分別於110D7、1003A2、1024G11處理的細胞表面上偵測到的螢光訊號，與mIgG1處理的細胞相比，的差異。剩餘的Axl%經計算如下：剩餘的Axl%=(MFI本發明的Mab 24h/MFI mIgG1 24h)x 100

來自一個獨立實驗的資料呈現於表7內。結果再現於3個獨立實驗內。

未處理的細胞和用相同的抗體處理條件之間的Mab染色之MFI差反映出細胞之細胞表面上Axl蛋白的向下調節，因為結合考慮到的Mab。沒有抗體的條件帶來與存在同型對照抗體(m9G4)條件下類似的結果。

資料顯示出與用110D7抗體標定之未處理的細胞獲得的MFIs相比之下，用110D7處理歷時24小時的細胞表面上偵測之平均螢光強度是降低的(-588)。在用110D7抗體孵育24小時之後，29.8%的細胞表面的Axl受體尚留在SN12C細胞表面。

資料顯示出與用1003A2抗體標定之未處理的細胞獲得的MFIs相比之下，用1003A2處理歷時24小時的細胞表面上偵測之平均螢光強度是降低的(-505)。在用1003A2抗體孵育24小時之後，35%的細胞表面的Axl受體尚留在 SN12C細胞表面。

資料顯示出與用1024G11抗體標定之未處理的細胞獲得的MFIs相比之下，用1024G11處理歷時24小時的細胞表面上偵測之平均螢光強度是降低的(-478)。在用1024G11抗體孵育24小時之後，45.5%的細胞表面的Axl受體尚留在SN12C細胞表面。

實施例10：使用螢光免疫細胞化學標定之抗-Axl抗體內化的研究.

互補性內化(Complementary internalization)結果係藉由使用間接的螢光標定方法之共焦顯微鏡學來獲得。

簡言之，在實驗前於具有1% L-麩醯胺酸和10%的FCS之RMPI1640內培養SN12C腫瘤細胞歷時3天。然後使用胰蛋白酶使細胞分離以及平盤培養於具有1% L-麩醯胺酸和5%的FCS之RMPI1640的6-多井平盤內。隔天，分別添加10μg/ml之抗體110D7、1003A2和1024G11。亦包括用不相關的抗體處理的細胞。然後於37℃，5% CO₂孵育細胞1h和2h。在T 0h，於4℃孵育細胞歷時30分鐘以判定細胞表面上的抗體結合。用PBS清洗細胞以及用聚甲醛(paraformaldehyde)固定歷時15分鐘。沖洗細胞以及於4℃用山羊抗小鼠IgG Alexa 488抗體孵育歷時60分鐘以鑑別細胞表面上剩餘的抗體。為了跟隨(follow)穿透至細胞之內的抗體，固定細胞且以皂素予以可滲透處理(permeabilized)。使用一種山羊抗小鼠IgG Alexa 488(Invitrogen)來染色膜和細胞內抗體兩者。使用一種對抗EEA1之兔多株抗體、以一種 山抗兔IgG-Alexa 555抗體(Invitrogen)來顯現以鑑別早期內體。清洗細胞三次以及使用Draq5染色細胞核。染色之後，細胞封固於Prolong Gold封固劑(Invitrogen)內以及透過使用Zeiss LSM 510共焦顯微鏡來分析。

照片呈現於圖9A-9C(110D7)、9D-9F(1003A2)和9G-9I(1024G11)內。

藉由共焦顯微鏡學獲得影像。於mIgG1同型對照存在下，既未觀察到膜染色也未觀察到細胞內的標定(圖9A、9D、9G)。分別用110D7(圖9B)、1003A2(圖9E)和1024G11(圖9H)孵育SN12C細胞1小時之後，立即觀察到漸進的膜抗-Axl標定喪失。110D7(圖9C)、1003A2(圖9F)和1024G11(圖9I)抗-Axl抗體之分別細胞內的累積在2h時更明顯。細胞內抗體與一種早期內體標記，EEA1共定位。此等照片證實抗-Axl mAbs 110D7、1003A2以及1024G11內化至SN12C細胞之內。

實施例11：活體外抗Axl媒介的抗腫瘤活性. SN12C增殖分析

每井一萬個SN12C細胞播種於96井平盤內之無FCS的培養基中、在37℃於5% CO₂氛圍中過夜。隔天，於37℃下、用每種抗體10μg/ml來預孵育細胞歷時1h。用或未用rmGas6(R and D Systems,cat N°986-GS/CF)來處理細胞，透過直接添加配體至井內，然後讓其生長歷時72h。在³H胸苷摻入法(thymidine incorporation)以後測量增殖作用。

資料呈現於圖10A(110D7)、10B(1003A2)和 10C(1024G11)內。分別於110D7、1003A2和1024G11沒有觀察到效應，當該等抗體添加至SN12C細胞時為不活動的。

實施例12：m110D7-沙泊寧、1003A2-沙泊寧以及1024G11-沙泊寧免疫共軛物於各種各樣的人類的腫瘤細胞株內之細胞毒性效價(Cytotoxicity potency)

於本實施例中，為沙泊寧偶合的-110D7、-1003A2或是-1024G11抗體之細胞毒性效價提供證據(documented)。為此目的，使用一大組的人類腫瘤細胞株來執行活體外細胞毒性分析(圖11A-11K)。此人類的腫瘤細胞株組涵蓋各種的Axl表現。

簡言之，5000個細胞播種於96井的培養平盤內之100μl的5% FBS適當的培養基中。在37℃於5% CO₂氛圍中孵育24小時之後，施加一系列濃度的免疫共軛物(mAxl Ab-沙泊寧或m9G4-沙泊寧)至細胞。接而於37℃下、於潮濕的5% CO2孵化器內孵育培養平盤歷時72小時。

在D4，使用CellTiter-Glo®發光細胞活力套組(Promega Corp.,Madison,Wis.)來評估細胞的活力，該套組根據定量存在的ATP而得以判定培養物內活細胞的數量，ATP為具有代謝活性的細胞之指示劑。透過一種光亮度計裝置來記錄發光發射(Luminescent emissions)。

使用下列的公式從發光輸出量來計算細胞毒性百分比：細胞毒性%=100-[(RLU_Ab-sap x 100)/RLU_無Ab]

圖11A-11K顯示出110D7-沙泊寧、1003A2-沙泊 寧和1024G11-沙泊寧免疫共軛物於此等不同的人類的腫瘤細胞株內觸發細胞毒性。產生的細胞毒性效應之效價取決於人類的腫瘤細胞株。

<110> 皮爾法伯製藥公司

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<223> 來自110D7抗體之輕鏈CDR-L1(IMGT編號)

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<213> 人工的

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<212> DNA

<213> 人工的

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<212> DNA

<213> 人工的

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<212> DNA

<213> 人工的

<220>

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<212> DNA

<213> 人工的

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<223> 來自110D7抗體之重鏈CDR-H3(Kabat編號)

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<212> PRT

<213> 智人

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<221> 其他特徵

<223> 蛋白Axl(有訊息胜肽(peptide signal))

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<213> 智人

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<221> 其他特徵

<223> 蛋白Axl(無訊息胜肽(peptide signal))

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<212> PRT

<213> 智人

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<221> 其他特徵

<223> 蛋白Axl的細胞外領域(有訊息胜肽(peptide signal))

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<212> PRT

<213> 智人

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<221> 其他特徵

<223> 蛋白Axl的細胞外領域(無訊息胜肽(peptide signal))

<400> 32

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<212> PRT

<213> 人工的

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<223> 四胜肽

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

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<223> 四胜肽

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<212> PRT

<213> 人工的

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<223> 五胜肽

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<213> 人工的

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<212> PRT

<213> 人工的

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<213> 人工的

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<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L2(Kabat編號)

<400> 45

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L3(Kabat編號)

<400> 46

<210> 47

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H1(Kabat編號)

<400> 47

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H2(Kabat編號)

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H3(Kabat編號)

<400> 49

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L1(IMGT編號)

<400> 50

<210> 51

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L2(IMGT編號)

<400> 51

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L3(IMGT編號)

<400> 52

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H1(IMGT編號)

<400> 53

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H2(IMGT編號)

<400> 54

<210> 55

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H3(IMGT編號)

<400> 55

<210> 56

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 輕鏈可變異領域

<400> 56

<210> 57

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 重鏈可變異領域

<400> 57

<210> 58

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L1(Kabat編號)

<400> 58

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L2(Kabat編號)

<400> 59

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-L3(Kabat編號)

<400> 60

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之輕鏈CDR-H1(Kabat編號)

<400> 61

<210> 62

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H2(Kabat編號)

<400> 62

<210> 63

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1003A2抗體之重鏈CDR-H3(Kabat編號)

<400> 63

<210> 64

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L1(IMGT編號)

<400> 64

<210> 65

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L2(IMGT編號)

<400> 65

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L3(IMGT編號)

<400> 66

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H1(IMGT編號)

<400> 67

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H2(IMGT編號)

<400> 68

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H3(IMGT編號)

<400> 69

<210> 70

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 輕鏈可變異領域

<400> 70

<210> 71

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重鏈可變異領域

<400> 71

<210> 72

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L1(Kabat編號)

<400> 72

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L2(Kabat編號)

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L3(Kabat編號)

<400> 74

<210> 75

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H1(Kabat編號)

<400> 75

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H2(Kabat編號)

<400> 76

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H3(Kabat編號)

<400> 77

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L1(IMGT編號)

<400> 78

<210> 79

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L2(IMGT編號)

<400> 79

<210> 80

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L3(IMGT編號)

<400> 80

<210> 81

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H1(IMGT編號)

<400> 81

<210> 82

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H2(IMGT編號)

<400> 82

<210> 83

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H3(IMGT編號)

<400> 83

<210> 84

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 輕鏈可變異領域

<400> 84

<210> 85

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 重鏈可變異領域

<400> 85

<210> 86

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L1(Kabat編號)

<400> 86

<210> 87

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L2(Kabat編號)

<400> 87

<210> 88

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之輕鏈CDR-L3(Kabat編號)

<400> 88

<210> 89

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H1(Kabat編號)

<400> 89

<210> 90

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H2(Kabat編號)

<400> 90

<210> 91

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 來自1024G11之重鏈CDR-H3(Kabat編號)

<400> 91

Claims (14)

1. 一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其係由選自於以下所構成的群組之抗體組成：a)一抗體，其包含三個輕鏈互補性決定區域(CDRs)含有序列辨識編號：1、2和3之序列；以及三個重鏈CDRs含有序列辨識編號：4、5和6之序列；b)一抗體，其包含三個輕鏈CDRs含有序列辨識編號：36、37和38之序列；以及三個重鏈CDRs含有序列辨識編號：39、40和41之序列；c)一抗體，其包含三個輕鏈CDRs含有序列辨識編號64、65和66之序列；以及三個重鏈CDRs含有序列辨識編號：67、68和69之序列。
2. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含該三個輕鏈CDRs含有序列辨識編號：1、2和3之序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列辨識編號：8之序列，或是任何與序列辨識編號：8呈現至少80%的同一性之序列。
3. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列辨識編號：7之序列，或是任何與序列辨識編號：7呈現至少80%的同一性之序列；以及該三個重鏈CDRs含有序列辨識編號：4、5和6之序列。
4. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含該三個輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號 36、37和38之序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列辨識編號：43之序列，或是任何與序列辨識編號：43呈現至少80%的同一性之序列。
5. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列辨識編號：42之序列，或是任何與序列辨識編號：42呈現至少80%的同一性之序列；以及該三個重鏈CDRs含有序列辨識編號39、40和41之序列。
6. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含該三個輕鏈CDRs含有序列序列辨識編號64、65和66之序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列辨識編號：71之序列，或是任何與序列辨識編號：71呈現至少80%的同一性之序列。
7. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列辨識編號：70之序列，或是任何與序列辨識編號：70呈現至少80%的同一性之序列；以及該三個重鏈CDRs含有序列辨識編號：67、68和69之序列。
8. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列辨識編號：7之序列，或是任何與序列辨識編號：7呈現至少80%的同一性之序列；以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列辨識編號：8之序列，或是任何與序列辨識編號：8呈現至少80%的同一性之序列。
9. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列辨識編號：42之序列，或是任何與序列辨識編號：42呈現至少80%的同一性之序列，以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列辨識編號：43之序列，或是任何與序列辨識編號：43呈現至少80%的同一性之序列。
10. 如請求項1之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，其特徵在於：其包含一個輕鏈可變異領域，該輕鏈可變異領域具有序列序列辨識編號70之序列，或是任何與序列辨識編號：70呈現至少80%的同一性之序列，以及一個重鏈可變異領域，該重鏈可變異領域具有序列辨識編號：71之序列，或是任何與序列辨識編號：71呈現至少80%的同一性之序列。
11. 如請求項1至10中任一項之抗原結合蛋白或其抗原結合片段，供用於作為在一宿主標的位址上遞送細胞毒性劑之定址產物(addressing product)，該宿主標的位址係由一個位於蛋白Axl細胞外領域之抗原決定位所組成，該蛋白Axl細胞外領域較佳為人類蛋白Axl細胞外領域，更佳為具有序列辨識編號：31或32之序列或是其天然變異體序列之人類蛋白Axl細胞外領域。
12. 一種免疫共軛物(immunoconjugate)，其包含如請求項1至10中任一項之抗原結合蛋白或其抗原結合片段被共軛一至細胞毒性劑。
13. 如請求項12之免疫共軛物供用於治療癌症。
14. 一種藥學組成物，其包含如請求項12之免疫共軛物以及至少一賦形劑及/或一藥學上可接受的載劑。