BR112015010046B1 - Proteínas de ligação a antígeno ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma e seu método de produção, vetor, célula hospedeira de microrganismo transgênico, imunoconjugado e seu uso, composição farmacêutica e hibridoma murino - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DA MESMA E SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICRORGANISMO TRANSGÊNICO, IMUNOCONJUGADO E SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E HIBRIDOMA MURINO. A presente invenção refere-se a proteínas de ligação a antígeno, em particular anticorpos monoclonais, capazes de ligação à proteína Axl bem como às sequências de amino ácido e ácido nucleico codificando as ditas proteínas. A partir de um aspecto, a invenção refere-se a proteínas de ligação a antígeno, ou fragmentos de ligação a antígeno, capazes de se ligar à Axl e, através da indução da internalização de Axl, ser internalizadas na célula. A invenção compreende também o uso das ditas proteínas de ligação a antígeno como produtos de endereçamento em conjugação com outros compostos anticâncer, tais como toxinas, radioelementos ou fármacos, e o uso das mesmas para o tratamento de certos cânceres.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a proteínas de ligação a antígeno, em particular anticorpos monoclonais, capazes de se ligar à proteína Axl bem como as sequências de aminoácido e ácido nucleico codificando as ditas proteínas. A partir de um aspecto, a invenção refere-se a proteínas de ligação a antígeno, ou fragmentos de ligação a antígeno, capazes de ligação à Axl e, ao induzir internalização de Axl, ser internalizados na célula. A invenção também compreende o uso das ditas proteínas de ligação a antígeno como produtos de endereçamento em conjugação com outros compostos anticâncer, tais como toxinas, radioelementos ou fármacos, e ao uso dos mesmos para tratamento de certos cânceres.

[0002] "Axl" (também referida como "Ufo", "Ark" ou "Tyro7") foi clonada de pacientes com leucemia mieloide crônica como um oncogene disparando a transformação quando superexpressa por camundongo NIH3T3. Ela pertence à família de tirosina cinases receptoras (RTKs) chamadas TAM (Tyro3, Axl, Mer), que inclui Tyro3 (Rse, Sky, Dtk, Etk, Brt, Tif), Axl e Mer (Eyk, Nyk, Tyro-12) [Lemke, G. e outros, Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 327-336].

[0003] A proteína humana Axl é uma proteína de 894 aminoácidos cuja sequência é representada na listagem de sequência como SEQ ID NO: 29. Os aminoácidos 1-25 correspondendo ao peptídeo de sinal, a proteína Axl humana, sem o dito sinal de peptídeo, é representada na listagem de sequência como SEQI D NO: 30.

[0004] Gas6, originalmente isolado como gene específico de parada de crescimento, é o ligante comum para os membros da família TAM [Varnum, B. C. e outros, Nature (1995) 373, 623-626]. Gas6 exibe a maior afinidade com Axl, seguido por Tyro3 e finalmente por Mer [Nagata, K. e outros, J. Biol. Chem. (1996) 271, 30022-30027]. Gas6 consiste em um domínio rico em Y-carboxiglutamato (Gla) que faz a mediação de ligação a membranas de fosfolipídeo, quatro domínios tipo fator de crescimento epidermal, e dois domínios tipo laminina G (LG) [Manfioletti, G., Brancolini, C., Avanzi, G. & Schneider, C. Mol. Biol. (1993) 13, 4976-4985]. Como muitas outras RTKs, ligação a ligante resulta em dimerização de receptor e autofosforilação de resíduos tirosina (resíduos tirosina 779, 821 e 866 para o receptor de Axl), que servem como sítios de ancoragem para uma variedade de moléculas de sinalização intracelular [Linger, R.M., Keating, A.K., Earp, H.S. & Graham, D.K. Adv. Cancer Res. (2008) 100, 35-83]. Além disso, o receptor de Axl pode ser ativado através de um processo independente de ligante. Esta ativação pode ocorrer quando o receptor de Axl é superexpresso.

[0005] Sinalização de Gas6/Axl foi mostrada regular vários processos celulares incluindo proliferação, adesão, migração e sobrevivência celulares em uma grande variedade de células in vitro [Hafizi, S. & Dahlback, B., FEBS J. (2006) 273, 5231-5244]. Ainda, os receptores TAM estão envolvidos no controle de imunidade inata; eles inibem as respostas inflamatórias a patógenos em células dendríticas (DCs) e macrófagos. Eles também direcionam fagocitose de células apoptóticas por essas células imunes e eles são requeridos para a atividade de maturação e morte de células assassinas naturais (NK) (Natural Killer) [Lemke, G. e outros, Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 327336].

[0006] Fracamente expressa em células normais, ela é predominantemente observada em fibroblastos, células progenitoras mieloides, macrófagos, tecidos neurais, músculos cardíaco e esqueletal onde ela apoia principalmente sobrevivência celular. O sistema Gas6/Axl desempenha um papel importante em biologia vascular através da regulagem da homeostase de célula do músculo liso vascular [Korshunov, V.A., Mohan, A.M., Georger, M.A. & Berk, B.D. Circ. Res. (2006) 98, 1446-1452; Korshunov, V.A., Daul, M., Massett, M.P. & Berk, B.C. Hypertension (2007) 50, 1057-1062].

[0007] Em células de tumor, Axl desempenha um papel importante em regulagem de invasão e migração celular. Superexpressão de Axl está associada não apenas com prognóstico pobre, mas também com invasividade aumentada de vários cânceres humanos conforme relatado para carcinoma de mama, cólon, esôfago, cânceres hepatocelular, gástrico, glioma, pulmão, melanoma, osteossarcoma, ovariano, próstata, rabdomiossarcoma, renal, tireoide e uterino [Linger, R.M., Keating, A.K., Earp, H.S. & Graham, D.K. Adv. Cancer Res. (2008) 100, 35-83 e Verma, A. Mol. Cancer Ther. (2011) 10, 1763-1773, para revisões]. Em câncer de mama, Axl parece ser um forte efetor da transição epitelial-para-mesenquimal (EMT); o programa EMT contribui ativamente para migração e disseminação de células cancerosas no organismo [Thiery, J.P. Curr. Opin. Cell Biol. (2003) 15, 740-746].

[0008] Axl também foi mostrada regular angiogênese. Na verdade, a inativação de Axl em células endoteliais prejudicou a formação e migração de tubo [Holland, S.J. e outros, Cancer Res. (2005) 65, 9294-9303] bem como cursos de sinalização angiogênica específicos perturbados [Li, Y. e outros, Oncogene (2009) 28, 3442-3455].

[0009] Mais recentemente vários estudos em uma faixa de modelos celulares descreveram o envolvimento de superexpressão de Axl em fenômenos de resistência de fármaco. A Tabela 1 que segue sumariza esses estudos.Tabela 1

[0010] Referências completas citadas na tabela 1 acima são como segue: - Macleod, K. e outros, Cancer Res. (2005) 65, 6789-6800 - Mahadevan, D. e outros, Oncogene (2007) 26, 3909-3919 - Lay, J.D. e outros, Cancer Res. (2007) 67, 3878-3887 - Hong, C.C. e outros, Cancer Lett. (2008) 268, 314-324 - Liu, L e outros, Cancer Res. (2009) 69, 6871-6878 - Keating, A.K. e outros, Mol. Cancer Ther. (2010) 9, 1298-1307 - Ye, X. e outros, Oncogene (2010) 29, 5254-5264

[0011] Em tal contexto a RTK Axl é considerada um alvo interessante em oncologia. Vários grupos já desenvolveram estratégias antitumor se direcionando ao eixo Gas6/Axl, ou usando anticorpos monoclonais nus ou moléculas pequenas direcionadas [Verma, A. Mol. Cancer Ther. (2011) 10, 1763-1773].

[0012] Em uma primeira modalidade, a invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, que i) se liga à proteína Axl humana e ii) é internalizada seguindo sua ligação à dita proteína Axl humana.

[0013] De um modo mais geral, a invenção refere-se ao uso da proteína Axl para a seleção de uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, capaz de ser internalizada seguindo sua ligação à dita Axl. Mais particularmente, o dito alvo é o domínio extracelular de Axl.

[0014] Neste aspecto particular, a presente invenção refere-se então a um método in vitro para a avaliação de um composto, ou um fragmento de ligação do mesmo, capaz de administração ou internalização de uma molécula de interesse a células de mamífero, a dita molécula de interesse sendo covalentemente ligada ao dito composto, onde o dito método compreende as etapas que seguem de: a) seleção de um composto que é capaz de se ligar à proteína Axl, ou o domínio extracelular (ECD) (Extracellular Domain) da mesma, ou um epítopo da mesma; b) opcionalmente, ligação covalente da dita molécula de interesse, ou uma molécula controle, ao dito composto selecionado na etapa a) para formar um complexo; c) contato do dito composto selecionado na etapa a), ou dito complexo obtido na etapa b), com uma célula de mamífero, preferivelmente célula viável, expressando em sua superfície a proteína Axl, ou um fragmento funcional da mesma; d) determinação de se o dito composto, ou dia molécula de interesse ou dito complexo, foi intracelularmente administrado ou internalizado na dita célula de mamífero; e e) seleção do dito composto como um composto capaz de administrar ou internalizar uma molécula de interesse em uma célula de mamífero viável.

[0015] Em uma modalidade preferida, o dito composto capaz de administração ou internalização de uma molécula de interesse em uma célula de mamífero viável é uma proteína (também aqui chamada polipeptídeo ou peptídeo) ou um composto tipo proteína compreendendo uma estrutura peptídica, particularmente uma sequência de aminoácido de pelo menos 5, 10, 15 ou mais resíduos de aminoácido, os ditos resíduo(s) de aminoácido podem ser glicosilados.

[0016] Quando o dito composto capaz de administração ou internalização de uma molécula de interesse em uma célula de mamífero viável é uma proteína ou um composto tipo proteína, o dito composto é também chamado aqui uma "proteína de ligação a antígeno", a dita proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação da mesma, pode: - i) se ligar à proteína Axl, preferivelmente a proteína Axl humana, e - ii) é internalizada em uma célula de mamífero seguindo sua ligação à dita proteína Axl quando a dita proteína Axl é expressa na superfície da dita célula de mamífero.

[0017] Em uma modalidade preferida, a dita célula viável de mamífero é uma célula humana, preferivelmente uma célula expressando naturalmente o receptor de proteína Axl.

[0018] Em uma modalidade particular, as células viáveis de mamífero na etapa c) são células de mamífero que expressam proteína(s) Axl recombinantes em sua superfície.

[0019] Em uma modalidade também preferida, a dita molécula de interesse é uma molécula citotóxica (também chamada aqui agente citotóxico ou citostático).

[0020] Em uma modalidade também preferida, a dita molécula de interesse é covalentemente ligada ao dito composto capaz de ligação à proteína Axl usando um ligante, mais preferivelmente um ligante peptídico, mais preferivelmente um ligante peptídico clivável, mais preferivelmente um ligante que pode ser clivado por compostos intracelulares naturais contidos na célula de mamífero, particularmente no citosol da dita célula de mamífero.

[0021] Em uma modalidade também preferida, o dito composto capaz de ligação à proteína Axl é um anticorpo, ou fragmento de ligação do mesmo, que é direcionado contra a proteína Axl, ou contra um epítopo da mesma localizado no domínio EDC de Axl.

[0022] A etapa de seleção de e) pode ser realizada através de qualquer método conhecido pelo versado na técnica para a avaliação ou internalização da administração intracelular. Ensaio ou teste capaz de demonstrar ou avaliar a presença, ausência ou atividade do dito composto capaz de se ligar especificamente à proteína Axl, ou do dito complexo formado pelo dito composto e dita molécula de interesse, ou de dita molécula de interesse que é covalentemente ligada ao dito composto, é bem conhecido do versado na técnica (vide alguns exemplos de tal teste ou ensaio revelado abaixo, sem limitar esses testes aos exemplos de teste que seguem).

[0023] Mais particularmente, esses testes ou ensaios podem ser concretizados através de FACS, Imunofluorescência, citometria de fluxo, Western blot, avaliações de citotoxidez/citostáticas, etc.

[0024] Neste aspecto, a presente invenção refere-se também a um método in vitro para a preparação de um complexo citotóxico ou citostático capaz de administração de um composto citotóxico a uma célula de mamífero, preferivelmente uma célula viável, o dito método compreendendo a etapa de: - covalentemente ligar um agente citotóxico a um composto que é: - i) capaz de se ligar à proteína Axl, preferivelmente a proteína Axl humana, e - ii) é internalizado em uma célula de mamífero seguindo sua ligação à dita proteína Axl quando a dita proteína Axl é expressa na superfície da dita célula de mamífero.

[0025] Preferivelmente o dito composto é uma proteína tipo proteína, mais preferivelmente um anticorpo que é direcionado contra a proteína Axl, ou contra um epítopo da mesma localizado no domínio EDC de Axl, ou um fragmento de ligação funcional do dito anticorpo.

[0026] Em uma modalidade preferida, o dito agente citotóxico é covalentemente ligado ao dito anticorpo anti-Axl ou fragmento funcional do mesmo, usando um ligante, mais preferivelmente um ligante peptídico, mais preferivelmente um ligante peptídico clivável, mais preferivelmente um ligante que pode ser clivado, como um exemplo não limitativo por compostos intracelulares naturais.

[0027] Tal como os outros membros da família TAM, o domínio extracelular (ECD) de Axl tem uma organização próxima daquelas de moléculas de adesão celular. ECD de Axl é caracterizado por uma combinação de dois domínios do tipo imunoglobulina seguido por dois domínios tipo fibronectina tipo III adjacentes [O’Bryan, J.P. e outros, Mol. Cel. Biol. (1991) 11, 5016-5031]. Os dois domínios tipo imunoglobulina N-terminais são suficientes para ligação de ligante Gas6 [Sasaki, T. e outros, EMBO J. (2006) 25, 80-87].

[0028] O ECD da proteína humana Axl é um fragmento de 451 aminoácidos, correspondendo aos aminoácidos 1-451 da sequência SEQ ID NO: 29, sequência que é representada na listagem de sequência como SEQ ID NO: 31. Os aminoácidos 1-25 correspondendo ao peptídeo de sinal, o ECD da proteína humana Axl sem o peptídeo de sinal corresponde aos aminoácidos 26-451 da sequência SEQ ID NO: 29, representada pela SEQ ID NO: 32.

[0029] Até agora modos de internalização diferentes foram identificados. Eles orientam a internalização de proteínas ou complexo de proteína na célula. Após endocitose, a maioria das proteínas ou lipídeos de membrana retorna para a superfície celular (reciclagem), mas alguns componentes da membrana são administrados aos últimos endossomos ou ao Golgi [Maxfield, F.R. & McGraw, T.E. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2004) 5, 121-132].

[0030] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, a qual i) se liga à proteína Axl humana e ii) é internalizada seguindo sua ligação à dita proteína Axl humana.

[0031] Em uma modalidade mais preferida, a invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, que i) se liga à proteína Axl humana, preferivelmente tendo a sequência SEQ ID NO: 29 ou 30 ou sequência variante natural da mesma, e ii) é internalizada seguindo sua ligação à dita proteína Axl humana.

[0032] Uma "proteína de ligação" ou "proteína de ligação a antígeno" é uma cadeia peptídica tendo uma afinidade específica ou geral com outra proteína ou molécula (geralmente referida como antígeno). Proteínas são trazidas em contato e formam um complexo quando ligação é possível. A proteína de ligação a antígeno da invenção pode ser preferivelmente, sem limitação, um anticorpo, um fragmento ou derivado de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo.

[0033] Por "fragmento de ligação a antígeno" de uma proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção, é pretendido indicar qualquer peptídeo, polipeptídeo ou proteína retendo a habilidade de se ligar especificamente ao alvo (também geralmente referido como antígeno) da proteína de ligação a antígeno e compreendendo uma sequência de aminoácido de pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácido contíguos ou pelo menos 250 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido da proteína de ligação a antígeno.

[0034] Em uma modalidade preferida onde a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo, tais "fragmentos de ligação a antígeno" são selecionados do grupo consistindo em fragmentos Fv, scFv (sc para cadeia única), Fab, F(ab’)2, Fab’, scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja a meia-vida teria sido aumentada através de modificação química, tal como a adição de poli(alquileno)glicol tal como poli(etileno)glicol ("PEGuilação") (fragmentos peguilhados chamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab’)2-PEG ou Fab’-PEG) ("PEG" para Poli(Etileno) Glicol) ou através de incorporação em um lipossoma, os ditos fragmentos tendo pelo menos uma das CDRs características do anticorpo de acordo com a invenção. Preferivelmente, os ditos "fragmentos de ligação a antígeno" serão constituídos ou compreenderão uma sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo do qual eles são derivados, a dita sequência parcial sendo suficiente para reter a mesma especificidade de ligação que o anticorpo do qual ela é descendente e uma afinidade suficiente, preferivelmente pelo menos igual a 1/100, em uma maneira mais preferida para pelo menos 1/10, da afinidade do anticorpo do qual ela é descendente, com relação ao alvo. Tal fragmento funcional conterá no mínimo 5 aminoácidos, preferivelmente 10, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos consecutivos da sequência do anticorpo da qual ele é descendente.

[0035] O termo "epítopo" é uma região de um antígeno que é ligada por uma proteína de ligação a antígeno, incluindo anticorpos. Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Epítopos podem também ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não lineares. Em certas modalidades, epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativos tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila, e, em certas modalidades podem ter características estruturais tridimensionais e/ou características de carga específicas.

[0036] No presente pedido, o epítopo está localizado no domínioextracelular da proteína Axl humana.

[0037] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, se liga especificamente a um epítopo localizado no domínio extracelular de proteína Axl humana, preferivelmente tendo a sequência SEQ ID NO: 31 ou 32 ou sequência variante natural da mesma.

[0038] Por "ligação", "se liga", ou similar, quer dizer que a proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Métodos para determinação de se duas moléculas se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plasmon de superfície e similar.

[0039] Neste sentido, "EC50" se refere à concentração 50% eficaz.Mais precisamente a concentração metade máximo eficaz (EC50) corresponde à concentração de um fármaco, anticorpo ou agente tóxico que induz uma resposta no meio do caminho entre a linha de base e máxima após algum tempo de exposição especificado. Ela é comumente usada como uma medida da potência do fármaco. A EC50 de uma curva de dose resposta graduada então representa a concentração de um composto onde 50% de seu efeito máximo são observados. A EC50 de uma curva de dose resposta quantal representa a concentração de um composto onde 50% da população exibem uma resposta, após duração de exposição especificada. Medições de concentração tipicamente seguem uma curva sigmoidal, aumentando rapidamente durante uma mudança relativamente pequena em concentração. Isso pode ser determinado matematicamente através de derivação da linha best-fit.

[0040] Como uma modalidade preferida, a EC50 determinada na presente invenção caracterizou a potência de ligação de anticorpo no ECD de Axl exposto em células de tumor humanas. O parâmetro de EC50 é determinado usando análise FACS. O parâmetro de EC50 reflete a concentração do anticorpo para a qual 50% da ligação máxima na Axl humana expressa em células de tumor são obtidos. Cada valor de EC50 foi calculado como o ponto médio da curva de dose resposta usando um programa de ajuste de curva de regressão de quatro parâmetros (Software Prism). Este parâmetro foi selecionado para ser representativo de condições fisiológicas/patológicas.

[0041] Em uma modalidade da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, se liga a seu epítopo com uma EC50 de pelo menos 10-9 M, preferivelmente entre 109 e 10-12 M.

[0042] Outra modalidade da invenção é um processo ou método para a seleção de uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, capaz de se ligar intracelularmente internalizando em uma célula de mamífero, preferivelmente em uma célula humana, preferivelmente uma célula viável, compreendendo as etapas de: - i) seleção da proteína de ligação a antígeno que se liga à Axl, preferivelmente a seu domínio ECD ou a um epítopo da mesma; e - ii) seleção da dita proteína de ligação a antígeno da etapa i) anterior que é internalizada em uma célula de mamífero seguindo sua ligação a uma proteína Axl expressa na superfície da dita célula de mamífero.

[0043] Em uma modalidade particular, a dita célula de mamífero expressa naturalmente o receptor de proteína Axl em sua superfície ou são células de mamífero que expressam proteína Axl recombinante em sua superfície, preferivelmente células humanas.

[0044] Tais métodos ou processos podem compreender as etapas de i) seleção de proteína de ligação a antígeno que se liga à Axl com uma EC50 de pelo menos 10-9 M e ii) seleção de proteínas de ligação a antígeno da etapa anterior que são internalizadas seguindo sua ligação à Axl. A etapa de seleção de ii) pode ser concretizada através de qualquer método conhecido do versado na técnica para a avaliação da internalização. Mais particularmente, testes podem ser realizados através de FACS, Imunofluorescência, citometria de fluxo, Western blot, avaliações de citotoxidez, etc.

[0045] Outra característica da proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção é que ela não tem nenhuma atividade significante sobre a proliferação de células de tumor. Mais particularmente, conforme ilustrado nos exemplos que seguem, a proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção não tem nenhuma atividade in vitro significante sobre o modelo de proliferação SN12C.

[0046] Em oncologia, há múltiplos mecanismos através dos quais mAbs podem exercer eficácia terapêutica, mas frequentemente sua atividade não é suficiente para produzir um benefício duradouro. Desta maneira, várias estratégias foram empregadas para aumentar sua atividade, particularmente combinando-os com fármacos como agentes quimioterapêuticos. Como uma alternativa eficiente para protocolos de combinação, imunotoxinas se tornaram uma nova opção terapêutica para tratamento de câncer [Beck, A. e outros, Discov. Med. (2010) 10, 329-339; Alley, S.C. e outros, J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009) 330, 932938]. Conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) (Antibody-Drug Conjugates) representam uma abordagem onde habilidade em subordinar especificidade de mAbs e direcionar a administração de um agente citotóxico para o tumor podem aumentar significantemente as atividades de ambos mAbs e fármaco. Idealmente, o mAb se ligará especificamente a um antígeno com expressão substancial em células de tumor, mas expressão limitada em células normais.

[0047] A presente invenção focou em proteínas de ligação à Axl, e mais particularmente em anticorpos anti-Axl específicos, apresentando uma grande habilidade em ser internalizadas seguindo ligação à Axl. Tais proteínas de ligação a antígeno são interessantes como um dos componentes imuno-fármaco-conjugados, de maneira que elas direcionam o citotóxico ligado para as células de câncer. Uma vez internalizado, o citotóxico dispara morte de célula de câncer.

[0048] Chaves importantes para sucesso com a terapia de imunoconjugado são pensadas ser a especificidade do antígeno alvo e a internalização dos complexos de proteína de ligação a antígeno nas células de câncer. Obviamente, antígenos de não internalização são menos eficazes do que antígenos de internalização para administrar agentes citotóxicos. Processos de internalização são variáveis através dos antígenos e dependem de parâmetros múltiplos que podem ser influenciados por proteínas de ligação. RTKs de superfície celular constituem uma família de antígenos interessante para investigar quanto a tal abordagem.

[0049] Na biomolécula, o agente citotóxico causa a atividade citotóxica e a proteína de ligação a antígeno usada causa sua especificidade contra células de câncer, bem como um vetor para entrada nas células para endereçar corretamente o agente citotóxico.

[0050] Desta maneira para aperfeiçoar a molécula de imunoconjugado, a proteína de ligação a carreador deve exibir alta habilidade em internalizar nas células de câncer alvo. A eficiência com a qual as proteínas de ligação fazem a mediação de internalização difere significantemente dependendo do epítopo direcionado. Seleção de proteínas de ligação anti-Axl de internalização potentes requer vários dados experimentais estudando não apenas sub-regulagem de Axl, mas também as proteínas de ligação anti-Axl que seguem internalizadas na célula.

[0051] Em uma modalidade preferida, a internalização da proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção pode ser avaliada preferivelmente através de imunofluorescência (conforme exemplificado daqui em diante no presente pedido) ou qualquer método ou processo conhecido do versado na técnica específico para o mecanismo de internalização.

[0052] Em outra modalidade preferida, como a proteína de ligação a antígeno Axl complexa, de acordo com a invenção, é internalizada após a ligação da proteína de ligação da invenção ao ECD da dita Axl, uma redução na quantidade de Axl na superfície das células é induzida. Esta redução pode ser quantificada através de qualquer método conhecido pelo versado na técnica (Western-blot, FACS, imunofluorescência, etc).

[0053] Em uma modalidade da invenção, esta redução, então refletindo a internalização, pode ser preferivelmente medida através de FACS e expressa como a diferença ou delta entre a Intensidade de Fluorescência Média (MFI) medida em células não tratadas com a MFI medida com células tratadas com a proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção.

[0054] Como um exemplo não limitativo da presente invenção, este delta é determinado com base em MFIs obtidas com células não tratadas e células tratadas com a proteína de ligação a antígeno da invenção conforme descrito no Exemplo 9 usando i) células SN12C de tumor renal humanas após um período de incubação de 24 horas com a proteína de ligação a antígeno da invenção e ii) um anticorpo secundário marcado com Alexa488. Este parâmetro é definido como calculado com a fórmula que segue:Δ (MFI24h células não tratadas - MFI24h células tratadas com proteína de ligação a antígeno

[0055] Esta diferença entre MFIs reflete a sub-regulagem de Axl uma vez que MFIs são proporcionais de Axl expressa na superfície celular.

[0056] Em um aspecto mais preferido e vantajoso, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, da invenção consiste em um anticorpo monoclonal, preferivelmente um Mab isolado, disparando uma Δ (MFI24h células não tratadas - MFI24h células tratadas) de pelo menos 200, preferivelmente de pelo menos 300.

[0057] A proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a invenção, induz uma redução de MFI de pelo menos 200.

[0058] Em mais detalhes, o delta acima pode ser medido de acordo com o processo que seguem, que deve ser considerado como um exemplo, ilustrativo e não limitativo: a) Tratamento e incubação de células tumorais de interesse com a proteína de ligação a antígeno da invenção; b) Tratamento das células tratadas da etapa a) e, em paralelo, células não tratadas com a proteína de ligação a antígeno da invenção, c) Medição da MFI (representativa da quantidade de Axl presente na superfície) para as células tratadas e as não tratadas com um anticorpo marcado secundário capaz de ligação à proteína de ligação a antígeno, e d) Cálculo da delta como a subtração da MFI obtida com as células tratadas da MFI obtida com as células não tratadas.

[0059] Os termos "anticorpo", "anticorpos" e "imunoglobulina" são usados intercomutavelmente no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais, preferivelmente Mab isolado (por exemplo, anticorpos monoclonais de comprimento integral ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes ou anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada).

[0060] Mais particularmente, tais moléculas consistem em uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (ou domínio) abreviado aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreendendo um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura principal (FR).Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0061] Anticorpos no sentido da invenção também incluem certos fragmentos de anticorpo, dos mesmos. Os ditos fragmentos de anticorpo exibem as especificidade e afinidade de ligação desejadas, sem importar a fonte ou tipo de imunoglobulina (isto é, IgG, IgE, IgM, IgA, etc), isto é, eles são capazes de se ligar especificamente à proteína Axl com uma afinidade comparável com os anticorpos de comprimento integral da invenção.

[0062] Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem de murino, é possível se referir a técnicas que são descritas em particular no manual "Antibodies" (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprign Harbor NY, pp. 726, 1988) ou à técnica de preparação de hibridomas descrita por Kohler e Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

[0063] O termo "anticorpo monoclonal" ou "Mab" conforme aqui usado se refere a uma molécula de anticorpo que é direcionada contra um antígeno específico e que pode ser produzida por um único clone de células B ou hibridoma. Anticorpos monoclonais podem ser também recombinantes, isto é, produzidos por engenharia de proteína. Ainda, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem vários anticorpos direcionados contra vários determinantes, ou epítopos, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um epítopo único do antígeno. A invenção refere-se a anticorpos isolados ou obtidos através de purificação a partir de fontes naturais ou obtidas através de recombinação genética ou síntese química.

[0064] Uma modalidade preferida da invenção é uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo ou consistindo em um anticorpo selecionado no grupo consistindo em: a) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 4, 5 e 6 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. b) um anticorpo compreendendo as CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 39, 40 e 41; c) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 64, 65 e 66 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 67, 68 e 69 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 67, 68 e 69.

[0065] Em uma modalidade mais preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, consiste em um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: a) um anticorpo compreendendo pelo menos três CDRs de cadeia leve, conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e as três CDRs de cadeia pesada, conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 4, 5 e 6; b) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve, conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e as três CDRs de cadeia pesada, conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41; c) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve, conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; e as três CDRs de cadeia pesada, conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 67, 68 e 69.

[0066] Em um aspecto preferido, por regiões de CDR ou CDR(s) é pretendido indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve das imunoglobulinas conforme definido por IMGT. Sem nenhuma menção contraditória, as CDRs serão definidas no presente pedido de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[0067] A numeração IMGT única foi definida para comparar os domínios variáveis qualquer que seja o receptor de antígeno, o tipo de cadeia ou a espécie [Lefranc M.P., Immunology Today 18, 509(1997)/Lefranc M.P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. Na numeração única IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo, cisteína 23 (1a-CYS), triptofano 41 (CONSERVED-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2a-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J-TRP). A numeração única IMGT provê uma delimitação padronizada das regiões de estrutura principal (FR1-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões de determinação de complementaridade: CDR1-IMGT: 27 a 38; CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. As lacunas representam posições não ocupadas, os comprimentos de CDR-IMGT (mostrados entre colchetes e separados por pontos, por exemplo, [8.8.13]) se tornam informação crucial. A numeração única IMGT é usada em representações gráficas 2D, chamadas IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. e Lefranc, M.P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. e Lefranc, M.P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] e em estruturas 3D em IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. e Lefranc, M.P., "T cell receptor and MHC structural data". Nucl. Acids Res., 32, D208-210 (2004)].

[0068] Deve ser compreendido que, sem especificação contraditória no presente relatório, regiões de determinação de complementaridade ou CDRs significa as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas conforme definido de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[0069] Não obstante, CDRs podem ser também definidas de acordo com o sistema de numeração Kabat (Kabat e outros, Sequences of proteins of immunological interest, 5a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, e últimas edições). Há três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve. Aqui, os termos "CDR" e "CDRs" são usados para indicar, dependendo do caso, um ou mais, ate mesmo todas, as regiões contendo a maioria dos resíduos de aminoácido responsáveis pela afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno ou epítopo que ele reconhece.

[0070] De acordo com o sistema de numeração Kabat, a presente invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, consistindo em um anticorpo do grupo selecionado consistindo em: a) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve, conforme definido de acordo com o sistema de numeração Kabat, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 9, 10 e 11; e as três CDRs de cadeia pesada, conforme definido de acordo com o sistema de numeração Kabat, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 12, 13 e 14 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 12, 13 e 14; b) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve, conforme definido de acordo com o sistema de numeração Kabat, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 44, 45 e 46 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 45 e 46; e as três CDRs de cadeia pesada, conforme definido de acordo com o sistema de numeração Kabat, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 47, 48 e 49 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 47, 48 e 49; c) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve, conforme definido de acordo com o sistema de numeração Kabat, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 72, 73 e 74 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; e as três CDRs de cadeia pesada, conforme definido de acordo com o sistema de numeração Kabat, compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 75, 76 e 77 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 75, 76 e 77.

[0071] No sentido da presente invenção, a "identidade percentual" entre duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a porcentagem de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtida após alinhamento ótimo, esta porcentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuída aleatoriamente ao longo de seu comprimento. A comparação de duas sequências de ácido nucleico ou aminoácido é tradicionalmente realizada comparando as sequências após ter otimamente alinhada as mesmas, a dita comparação sendo capaz de ser conduzida por segmento ou usando uma "janela de alinhamento". Alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser realizado, em adição à comparação manual, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch ((1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por meio do método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ou por meio de software de computador usando esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Sciences Dr., Madison, WI, ou pelo software de comparação BLAST NR ou BLAST P).

[0072] A identidade percentual entre duas sequências de ácido nucleico ou aminoácido é determinada através de comparação das duas sequências otimamente alinhadas onde a sequência de ácido nucleico ou aminoácido a comparar pode ter adições ou deleções comparado com a sequência de referência para alinhamento ótimo entre as duas sequências. Identidade percentual é calculada através da determinação do número de posições nas quais o nucleotídeo ou resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas sequências, preferivelmente entre as duas sequências completas, dividindo o número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de alinhamento e multiplicando o resultado por 100 para obter a identidade percentual entre as duas sequências.

[0073] Por exemplo, o programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova e outros, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250) disponível no site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, pode ser usado com os parâmetros default (notadamente para os parâmetros "penalidade de lacuna aberta": 5 e "penalidade de lacuna de extensão": 2; a matriz selecionada sendo, por exemplo, a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa); a identidade percentual entre as duas sequências a comparar é calculada diretamente pelo programa.

[0074] Para as sequências de aminoácido exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com uma sequência de aminoácido de referência, exemplos preferidos incluem aqueles contendo a sequência de referência, certas modificações, notadamente uma deleção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, truncamento ou extensão. No caso de substituição de um ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, substituições são preferidas onde os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos "equivalentes". Aqui, a expressão "aminoácidos equivalentes" pretende indicar quaisquer aminoácidos prováveis ser substituídos por um dos aminoácidos estruturais sem, no entanto, modificar as atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e daqueles exemplos específicos definidos abaixo.

[0075] Aminoácidos equivalentes podem ser determinados ou em sua homologia estrutural com os aminoácidos que eles substituem ou nos resultados de testes comparativos de atividade biológica entre as várias proteínas de ligação a antígeno provavelmente geradas.

[0076] Como um exemplo não limitante, a Tabela 2 abaixo sumariza as possíveis substituições provavelmente geradas sem resultar em uma modificação significante da atividade biológica da proteína de ligação a antígeno modificada correspondente; substituições inversas são naturalmente possíveis sob as mesmas condições.Tabela 2

[0077] Uma modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 8 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 8.

[0078] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 8, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 8.

[0079] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 8 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 8.

[0080] Por "qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 8" é pretendido designar a sequência exibindo as três CDRs de cadeia pesada CDRs SEQ ID NOs: 4, 5 e 6 e, ainda, exibindo pelo menos 80% de identidade com a sequência inteira SEQ ID NO: 8 fora das sequências correspondendo às CDRs, isto é, SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.

[0081] Outra modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve da sequência SEQ ID NO: 7 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 7; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 4, 5 e 6 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.

[0082] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve da sequência SEQ ID NO: 7 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 7; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.

[0083] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 7 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 7.

[0084] Por "qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 7" é também pretendido designar a sequência exibindo as três CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e, ainda, exibindo pelo menos 80% de identidade com a sequência inteira SEQ ID NO: 7 foram das sequências correspondente correspondendo às CDRs, isto é, SEQ ID NOs: 1, 2 e 3.

[0085] Outra modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 7, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 7; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 7 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 8.

[0086] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 7, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 8 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 8.

[0087] Uma modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 43.

[0088] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 43.

[0089] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 43.

[0090] Por "qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 43" pretende designar a sequência exibindo as três CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOs: 39, 40 e 41 e, ainda, exibindo pelo menos 80% de identidade com a sequência integral SEQ ID NO: 43 fora das sequências correspondendo às CDRs, isto é, SEQ ID NOs: 39, 40 e 41.

[0091] Outra modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 42; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 39, 40 e 41.

[0092] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 42; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41.

[0093] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 42.

[0094] Por "qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 42" é também pretendido designar a sequência exibindo as três CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 36, 37 e 38 e, ainda, exibindo pelo menos 80% de identidade com a sequência integral SEQ ID NO: 42 fora das sequências correspondendo às CDRs, isto é, SEQ ID NOs: 36, 37 e 38.

[0095] Outra modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 42; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 43.

[0096] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 42 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 43.

[0097] Uma modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 64, 65 e 66 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 71.

[0098] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 71.

[0099] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 71.

[0100] Por "qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 71" é pretendido designar a sequência exibindo as três CDRs de cadeia pesada SEQ ID NOs: 67, 68 e 69 e, ainda, exibindo pelo menos 80% de identidade com a sequência inteira SEQ ID NO: 71 fora das sequências correspondendo às CDRs, isto é, SEQ ID NOs: 67, 68 e 69.

[0101] Outra modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 70; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 67, 68 e 69, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com as SEQ ID NOs: 67, 78 e 69.

[0102] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 70; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 67, 68 e 69.

[0103] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 70.

[0104] Por "qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 70" é pretendido também designar a sequência exibindo as três CDRs de cadeia leve SEQ ID NOs: 64, 65 e 66 e, ainda, exibindo pelo menos 80% de identidade com a sequência integral de SEQ ID NO: 70 for das sequências correspondendo às CDRs, isto é, SEQ ID NOs: 64, 65 e 66.

[0105] Outra modalidade da invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 70; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80%,preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com a SEQ ID NO: 71.

[0106] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70, ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 70 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71 ou qualquer sequência exibindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 71.

[0107] Para mais clareza, as Tabelas 3a-3c abaixo sumarizam as várias sequências de aminoácido correspondendo às proteínas de ligação a antígeno da invenção.Tabela 3A

Tabela 3b

Tabela 3c

[0108] Um aspecto preferido da presente invenção refere-se a um anticorpo de murino, ou seus compostos derivados ou fragmentos de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato do dito anticorpo também compreender regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao camundongo, notadamente homem.

[0109] Outro aspecto específico da presente invenção refere-se a um anticorpo quimérico, ou seus compostos derivados ou fragmentos de ligação a antígeno, caracterizados pelo fato do dito anticorpo também compreender regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao camundongo, notadamente humano.

[0110] Ainda outro aspecto preferido da invenção refere-se a um anticorpo humanizado, ou seus compostos derivados ou fragmentos de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato das regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de anticorpo humano serem, respectivamente, a região lambda ou kappa e a região gama -1, gama- 2 ou gama-4.

[0111] Outro aspecto da invenção é uma proteína de ligação a antígeno consistindo em um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo em: a) o anticorpo monoclonal 110D7 derivado do hibridoma I-3959 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 2 de abril de 2008, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo; b) o anticorpo monoclonal 1003A2 derivado do hibridoma I-4499 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; c) o anticorpo monoclonal 1024G11 derivado do hibridoma I-4501 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0112] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de murino capaz de secretar uma proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção, notadamente o hibridoma de origem de murino depositado na coleção Francesa para culturas de micro-organismo (CNCM, Pasteur Institute, Paris, França) em 2 de abril de 2008, sob o número I-3959; 28 de julho de 2011, sob o número I4499 ou 28 de julho de 2011 sob número I-4501.

[0113] Os ditos hibridomas foram obtidos pela infusão de esplenócitos/linfócitos de camundongos imunizados Balb/C e células da linhagem de célula Sp 2/O-Ag 14 de mieloma.

[0114] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de murino capaz de secretar um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 4, 5 e 6, o dito hibridoma sendo depositado no CNCM, Pasteur Institute, Paris, França, em 2 de abril de 2008, sob o número I-3959.

[0115] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de murino capaz de secretar um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41, o dito hibridoma sendo depositado no CNCM, Pasteur Institute, Paris, França, em 28 de julho de 2011, sob o número I-4499.

[0116] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibridoma de murino capaz de secretar um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 67, 68 e 69, o dito hibridoma sendo depositado no CNCM, Pasteur Institute, Paris, França, em 28 de julho de 2011, número I-4501.

[0117] Os ditos hibridomas foram obtidos através da fusão dos esplenócitos/linfócitos de camundongos imunizados Balb/C e células da linhagem de célula Sp 2/O-Ag 14 de mieloma.

[0118] Um objetivo da presente invenção é um hibridoma de murino selecionado de: a) o hibridoma de murino I-3959 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 2 de abril de 2008; b) o hibridoma de murino I-4499 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011; c) o hibridoma de murino I-4501 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011.

[0119] A proteína de ligação a antígeno da invenção também compreende anticorpos quiméricos ou humanizados.

[0120] Um anticorpo quimérico é um contendo uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) derivada de um anticorpo de uma dada espécie em combinação com regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga às ditas dadas espécies.

[0121] Os anticorpos, ou fragmentos quiméricos dos mesmos, podem ser preparados usando as técnicas de genética recombinante. Por exemplo, o anticorpo quimérico poderia ser produzido através de clonagem de DNA recombinante contendo um promotor e uma sequência codificando a região variável de um anticorpo monoclonal não humano da invenção, notadamente murino, e uma sequência codificando a região constante de anticorpo humano. Um anticorpo quimérico de acordo com a invenção codificado por um tal gene recombinante poderia ser, por exemplo, uma quimera camundongo- humano, a especificidade deste sendo determinada pela região variável derivada do DNA de murino e seu isotipo determinado pela região constante derivada de DNA humano. Recorrer a Verhoeyn e outros (BioEssays, 8:74, 1988) quanto a métodos para preparação de anticorpos quiméricos.

[0122] Em outro aspecto, a invenção descreve uma proteína de ligação que consiste em um anticorpo quimérico.

[0123] Em uma modalidade particular, o anticorpo quimérico, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, da invenção é selecionado do grupo consistindo em: a) um anticorpo compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 7 e pelo fato de compreender uma sequência de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 8; b) um anticorpo compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 42 e pelo fato de compreender uma sequência de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 43; c) um anticorpo compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 70 e pelo fato de compreender uma sequência de domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 71.

[0124] Em outro aspecto, a invenção descreve uma proteína de ligação que consiste em um anticorpo humanizado.

[0125] "Anticorpos humanizados" significa um anticorpo que contém regiões de CDR derivadas de um anticorpo de origem não humana, as outras partes da molécula de anticorpo sendo derivadas de um (ou vários) anticorpos humanos. Ainda, alguns dos resíduos de segment de esqueleto (chamados FR) podem ser modificados para preservar afinidade de ligação (Jones e outros, Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen e outros, Science, 239:1534-1536, 1988; Riechman e outros, Nature, 332:323-327, 1988).

[0126] Os anticorpos humanizados da invenção ou fragmentos dos mesmos podem ser preparados através de técnicas conhecidas de um versado na técnica (tal como, por exemplo, aquelas descritas nos documentos Singer e outros, J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain e outros, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; e Bebbington e outros, Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Tais anticorpos humanizados são preferidos para seu uso em métodos envolvendo diagnóstico in vitro ou tratamento preventivo e/ou terapêutico in vivo. Outras técnicas de humanização, também conhecidas de um versado na técnica, tais como, por exemplo, a técnica de "enxerto de CDR" descrita por PDL nas patentes EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 566 647 ou US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089 e US 5.693.761. Patentes US 5.639.641 ou 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293 podem ser também citadas.

[0127] Ainda, a invenção refere-se também a anticorpos humanizados tendo origem dos anticorpos de murino descritos acima.

[0128] De uma maneira preferida, regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de anticorpo humano são, respectivamente, a região lambda ou kappa e a gama-1, gama-2 ou gama-4.

[0129] Um novo aspecto da presente invenção refere-se a um ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre os ácidos nucleicos que seguem (incluindo qualquer código genético degenerado):um ácido nucleico codificando uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a invenção; um ácido nucleico compreendendo: - uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 15 a 28, 50 a 63 e 78 a 91, ou - uma sequência de ácido nucleico compreendendo as 6 sequências de ácido nucleico SEQ ID NOs: 15 a 20 ou 50 a 55 ou 78 a 83, ou - uma sequência de ácido nucleico compreendendo as duas sequências de ácido nucleico SEQ ID NOs: 21 e 22 ou 56 e 57 ou 84 e 85; c) um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico conforme definido em a) ou b); e d) um ácido nucleico, preferivelmente tendo pelo menos 18 nucleotídeos, capaz de hibridizar sob condições altamente adstringentes com uma sequência de ácido nucleico conforme definido na parte a) ou b) ou com uma sequência com pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade após alinhamento ótimo com uma sequência de ácido nucleico conforme definido na parte a) ou b).

[0130] As Tabelas 4a-4c abaixo sumarizam as várias sequências de nucleotídeo com relação à proteína de ligação da invenção.Tabela 4a

Tabela 4b

Tabela 4c

[0131] Os termos "ácido nucleico", "sequência nucleica", "sequência de ácido nucleico", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", "sequência de polinucleotídeo" e "sequência de nucleotídeo", usados intercomutavelmente no presente relatório, significam uma sequência precisa de nucleotídeos, modificados ou não, definindo um fragmento ou uma região de ácido nucleico, contendo nucleotídeos naturais ou não, e sendo ou um DNA de filamento duplo, um DNA de filamento único ou produtos de transcrição dos ditos DNAs.

[0132] As sequências da presente invenção foram isoladas e/ou purificadas, isto é, elas foram amostradas diretamente ou indiretamente, por exemplo, através de uma cópia, seu ambiente tendo sido pelo menos parcialmente modificado. Ácidos nucleicos isolados obtidos através de genética recombinante, por meio, por exemplo, de células hospedeiras, ou obtidos através de síntese química devem ser também mencionados aqui.

[0133] "Sequências nucleicas exibindo uma identidade percentual de pelo menos 80%, preferivelmente 85%, 90%, 95% e 98%, após alinhamento ótimo com uma sequência preferida" significa sequências de ácido nucleico exibindo, com relação à sequência de ácido nucleico de referência, certas modificações tais como, em particular, uma deleção, um truncamento, uma extensão, uma fusão e/ou substituição quimérica, notadamente pontual. Preferivelmente, essas são sequências que codificam as mesmas sequências de aminoácido que a sequência de referência, isso sendo relacionado à degeneração do código genético, ou sequências complementares que são prováveis hibridizar especificamente com sequências de referência,preferivelmente sob condições altamente adstringentes, notadamente aquelas definidas abaixo.

[0134] Hibridização sob condições altamente adstringentes significa que as condições relacionadas à temperatura e resistência iônica são selecionadas de tal maneira que elas permitem que hibridização seja mantida entre dois fragmentos de DNA complementares. Em uma base puramente ilustrativa, as condições altamente adstringentes da etapa de hibridização para o propósito de definição dos fragmentos de polinucleotídeo descritos acima são vantajosamente como segue.

[0135] Hibridização de DNA-DNA e DNA-RNA é realizada em duas etapas: (1) pré-hibridização a 42° C por três horas em tampão de fosfato (20 mM, pH 7,5) contendo 5X SSC (1X SSC corresponde a uma solução de NaCl 0,15M + citrato de sódio 0,015 M), formamida 50%, dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, Denhardt 10X, dextrano sulfato 5% e DNA de esperma de salmão 1%; (2) hibridização primária por 20 horas em uma temperatura dependendo do comprimento da sonda (isto é: 42° C para uma sonda >100 nucleotídeos de comprimento) seguido por lavagens de 2 minutos a 20° C em 2X SSC + 2% SDS, uma lavagem de 20 minutos a 20° C em 0,1X SSC + 0,1% SDS. A última lavagem é realizada em 0,1X SSC + SDS 0,1% por 30 minutos a 60° C para uma sonda >100 nucleotídeos de comprimento. As condições de hibridização altamente adstringentes descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas por um versado na técnica para oligonucleotídeos mais longos ou mais curtos, de acordo com os procedimentos descritos em Sambrook e outros (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3a edição, 2001).

[0136] A invenção refere-se também a um vetor compreendendo um ácido nucleico conforme descrito na invenção.

[0137] A invenção notadamente se refere a vetores de clonagem e/ou expressão que contêm tal sequência de nucleotideo.

[0138] Os vetores da invenção contêm preferivelmente elementos que permitem a expressão e/ou a secreção de sequências de nucleotideo em uma dada célula hospedeira. O vetor então deve conter um promotor, sinais de início e terminação de tradução, bem como regiões de regulagem de transcrição adequadas. Ele deve ser capaz de ser mantido de uma maneira estável na célula hospedeira e pode ter opcionalmente sinais específicos que especificam secreção da proteína traduzida. Esses vários elementos são selecionados e otimizados por um versado na técnica de acordo com a célula hospedeira usada. Para este propósito, as sequências de nucleotideo podem ser inseridas em vetores de autorreplicação dentro do dado hospedeiro ou ser vetores de integração do hospedeiro escolhido.

[0139] Tais vetores são preparados através de métodos tipicamente usados por um versado na técnica e os clones resultantes podem ser introduzidos em um hospedeiro adequado através de métodos padrão tais como lipofecção, eletroporação, choque térmico ou métodos químicos.

[0140] Os vetores são, por exemplo, vetores de origem de plasmídeo ou viral. Eles são usados para transformar células hospedeiras a fim de clonar ou expressar as sequências de nucleotideo da invenção.

[0141] A invenção compreende também células hospedeiras isoladas transformadas por ou compreendendo um vetor conforme descrito na presente invenção.

[0142] A célula hospedeira pode ser selecionada dentre sistemas procarióticos ou eucarióticos tais como células bacterianas, por exemplo, mas também células de levedura ou células animais, notadamente células de mamífero (com a exceção de humano). Células de inseto ou planta podem ser também usadas.

[0143] A invenção refere-se também a animais, outro que não humano, que têm uma célula transformada de acordo com a invenção.

[0144] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para a produção de uma proteína de ligação a antígeno de acordo com a invenção, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, caracterizado pelo fato do dito método compreender as etapas que seguem: a) a cultura em um meio com as condições de cultura adequadas para uma célula hospedeiro de acordo com a invenção; e b) a recuperação da proteína de ligação a antígeno, ou um de seus fragmentos de ligação a antígeno, então produzida a partir do meio de cultura ou a partir das ditas células culturadas.

[0145] As células transformadas de acordo com a invenção são de uso em métodos para a preparação de proteínas de ligação a antígeno recombinantes de acordo com a invenção. Métodos para a preparação de proteínas de ligação a antígeno de acordo com a invenção em forma recombinante, caracterizados pelo fato dos ditos métodos usarem um vetor e/ou uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção, são também compreendidos na presente invenção. Preferivelmente, uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção é culturada sob condições que permitem a expressão da dita proteína de ligação a antígeno mencionada acima e recuperação da dita proteína recombinante.

[0146] Como já mencionado, a célula hospedeira pode ser selecionada dentre sistemas procarióticos ou eucarióticos. Em particular, é possível identificar as sequências de nucleotídeo da invenção que facilitam secreção em tal sistema procariótico ou eucariótico. Um vetor de acordo com a invenção carregando tal sequência pode então ser usado vantajosamente para a produção de proteínas recombinantes a serem secretadas. Na verdade, a purificação dessas proteínas recombinantes de interesse será facilitada pelo fato que elas estão presentes no sobrenadante da cultura celular ao invés de dentro das células hospedeiras.

[0147] A proteína de ligação a antígeno da invenção pode ser também preparada através de síntese química. Tal método de preparação é também um objetivo da invenção. Um versado na técnica conhece métodos para síntese química, tais como técnicas de fase sólida (vide notadamente Steward e outros, 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111,2a ed., pp. 71-95) ou técnicas de fase sólida parcial, através da condensação de fragmentos ou através de síntese convencional em solução. Polipeptídeos obtidos através de síntese química e capazes de conter aminoácidos não naturais correspondentes são também compreendidos na invenção.

[0148] A proteína de ligação a antígeno, ou o fragmento de ligação a antígeno da mesma, provável de ser obtida através do método da invenção são também compreendidos na presente invenção.

[0149] De acordo com um aspecto particular, a invenção refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, conforme acima descrito para uso como um produto de endereçamento para administração de um agente citotóxico em um sítio alvo hospedeiro, o dito sítio alvo hospedeiro consistindo em um epítopo localizado no domínio extracelular de proteína Axl, preferivelmente o domínio extracelular de proteína Axl humana, mais preferivelmente o domínio extracelular de proteína Axl humana tendo a sequência SEQ ID NO: 31 ou 32 ou sua sequência variante natural.

[0150] Em uma modalidade preferida, o dito sítio alvo hospedeiro é um sítio alvo de uma célula de mamífero, mais preferivelmente de uma célula humana, mais preferivelmente células que naturalmente ou que por meio de recombinação genética expressam a proteína Axl.

[0151] A invenção refere-se a um imunoconjugado compreendendo a proteína de ligação a antígeno conforme descrito no presente pedido conjugada a um agente citotóxico.

[0152] Na compreensão da presente invenção, a expressão "imunoconjugado" ou "imuno-conjugado" se refere em geral a um composto compreendendo pelo menos um produto de endereçamento fisicamente ligado com um ou mais agente(s) terapêutico(s), desta maneira criando um composto altamente direcionado.

[0153] Em uma modalidade preferida, tais agentes terapêuticos consistem em agentes citotóxicos.

[0154] Por "agente citotóxico" ou "citotóxico" quer dizer um agente que, quando administrado a um indivíduo, trata ou previne o desenvolvimento de proliferação celular, preferivelmente o desenvolvimento de câncer no corpo do indivíduo, através da inibição ou prevenção de uma função celular e/ou causando morte celular.

[0155] Muitos agentes citotóxicos foram isolados ou sintetizados e tornam possível inibir a proliferação celular, ou destruir ou reduzir, se não definitivamente, pelo menos significantemente, as células de tumor. No entanto, a atividade tóxica desses agentes não é limitada a células de tumor, e as células não tumor são também afetadas e podem ser destruídas. Mais particularmente, efeitos colaterais são observados em células se renovando rapidamente, tais como células hematopoiéticas ou células do epitélio, em particular nas membranas mucosais. A título de ilustração, as células do trato gastrointestinal são muito afetadas pelo uso de tais agentes citotóxicos.

[0156] Um dos principais objetivos da presente invenção é também ser capaz de prover um agente citotóxico que torne possível limiar os efeitos colaterais em células normais enquanto ao mesmo tempo conservando uma citotoxidez alta em células de tumor.

[0157] Mais particularmente, o agente citotóxico pode preferivelmente consistir em, sem limitação, um fármaco (isto é, "conjugado de anticorpo-fármaco"), uma toxina (isto é, "imunotoxina" ou "conjugado anticorpo-toxina), um radioisótopo (isto é, "radioimunoconjugados" ou "conjugado anticorpo-radioisótopo), etc.

[0158] Em uma primeira modalidade preferida da invenção, o imunoconjugado consiste em uma proteína de ligação ligada a pelo menos um fármaco ou um medicamento. Tal imunoconjugado é referido como um conjugado anticorpo-fármaco (ou "ADC" (Antibody-Drug Conjugate)) quando a proteína de ligação é um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0159] Em uma primeira modalidade, tais fármacos podem ser descritos com relação ao seu modo de ação. Como exemplo não limitativo, podem ser mencionados agentes de alquilação tais como nitrogênio mostarda, alquil-sulfonatos, nitrosoureia, oxazoforinas, aziridina ou iminoetilenos, antimetabolitos, antibióticos antitumor, inibidores mitóticos, inibidores da função de cromatina, agentes antiangiogênese, antiestrogênios, antiandrogênios, agentes de quelação, estimulante de absorção de ferro, inibidores de ciclo- oxigenase, inibidores de fosfodiesterase, inibidores de DNA, inibidores da síntese de DNA, estimulantes de apoptose, inibidores de timidilato, inibidores de célula T, agonistas de interferon, inibidores de ribonucleosídeo trifosfato redutase, inibidores de aromatase, antagonistas de receptor de estrogênio, inibidores de tirosina cinase, inibidores de ciclo celular, taxana, inibidores de tubulina, inibidores de angiogênese, estimulantes de macrófago, antagonistas do receptor de neuroquinina, agonista do receptor de canabinoide, agonistas do receptor de dopamina, agonistas de fator de estimulação de granulócitos, agonistas de receptor de eritropoietina, agonistas de receptor de somatostatina, agonistas de LHRH, sensibilizadores de cálcio, antagonistas de receptor de VEGF, antagonistas de receptor de interleucina, inibidores de osteoclasto, estimulantes de formação de radical, antagonistas de receptor de endotelina, vinca alcaloide, anti- hormônio ou imunomoduladores ou qualquer outro fármaco novo que satisfaça os critérios de atividade de um citotóxico ou uma toxina.

[0160] Tais fármacos são, por exemplo, mencionados no VIDAL 2010, na página dedicada aos compostos ligados à coluna de cancerologia e hematologia "Citotóxicos", esses compostos citotóxicos mencionados com referência a este documento são mencionados aqui como agentes citotóxicos preferidos.

[0161] Mais particularmente, sem limitação, os fármacos que seguem são preferidos de acordo com a invenção: mecloretamina, clorambucol, melfalenon, cloridrato, pipobromeno, prednimustina, fosfato dissódico, estramustina, ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida, ifosfamida, tiotepa, trietilenamina, altetramina, carmustina, estreptozocina, fotemustina, lomustinaa, bussulfano, treosulfano, improssulfano, dacarbazina, cis-platina, oxaliplatina, lobaplatina, heptaplatina, hidrato de miriplatina, carboplatina, metotrexato, pemetrexede, 5-fluoruracila, floxuridina, 5- fluordesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, citosina arabinosídeo, 6-mercaptopurina (6-MP), nelarabina, 6-tioguanina (6- TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina, tegafur, pentostatina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina, procarbazina, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, topotecano, irinotecano, etoposídeo, valrubicina, cloridrato de amrubicin, pirarubicina, acetato de eliptínio, zorrubicina, epirrubicina, idarrubicin eteniposídeo, razoxina, marimastato, batimastato, prinomastato, tanomastato, ilomastato, CGS-27023A, halofuginona, COL-3, neovastate, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, esqualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974,interleucina-12, IM862, angiostatina, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozol, letrozol, exemestano, flutamida, nilutamida, esprironolactona, acetato de ciproterona, finasterida, cimitidina, bortezomida, Velcade, bicalutamida, ciproterona, flutamida, fulvestrano, exemestana, dasatinibe, erlotinibe, gefitinibe, imatinibe, lapatinibe, nilotinibe, sorafenibe, sunitinibe, retinoide, rexinoide, metoxsaleno, metilaminolevulinato, aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox, interleucin-2, tasonermina, lentinano, sizofilano, roquinimex, pidotimode, pegademase, timopentina, poli I:C, procodazol, Tic BCG, corinebacterium parvum, NOV-002, ucraína, levamisol, 1311-chTNT, H- 101, celmoleucina, interferon alfa2a, interferon alfa2b, interferon gamma1a, interleucina-2, mobenacina, Rexin-G, teceleucina, aclarrubicina, actinomicina, arglabin, asparaginase, carzinofilin, cromomicina, daunomicina, leucovorina, masoprocol, neocarzinostatina, peplomicina, sarcomicina, solamargina, trabectedina, estreptozocina, testosterona, cunecateqiunas, sinecatequinas, alitretinoína, cloridrato de belotecano, calusterona, dromostanolona, acetato eliptínio, etinil estradiol, etoposídeo, fluoximesterona, formestano, fosfetrol, acetato de goserelina, hexil amino levulinato, histrelina, hidroxiprogesterona, ixabepilona, leuprolida, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megesterol, metilprednisolona, metiltestosterona, miltefosina, mitobronitol, fenilpropionato de nadrolona, acetato de noretindrons, prednisolons, prednisons, temsirrolimus, testo lactona, triamconolona, triptorelina, acetato de vapreotídeo, estimalâmero de zinostatina, amsacrina, trióxido arsênico, cloridrato de bisantreno, clorambucil, clortrianiseno, cis-diaminodicloroplatina, ciclofosfamida, dietilestilbestrol, hexametilmelamina, hidroxiureia, lenalidomida, lonidamina, mecloretanamina, mitotano, nedaplatina, cloridrato de nimustina, pamidronato, pipobromano, porfímero sódico, ranimustina, razoxana, semustina, sobuzoxana, mesilato, trietilenemelamina, ácido zoledrônico, mesilato de camostato, HCl de fadrozol, nafoxidina, aminoglutetimida, carmofur, clofarabina, citosina arabinosídeo, decitabina, doxifluridina, enocitabina, fosfato de fludarabeno, fluorouracila, ftorafur, uracil mostarda, abarelix, bexaroteno, raltiterxede, tamibaroteno, temozolomida, vorinostato, megastrol, clodronate dissódico, levamisol, ferumoxitol, isomaltosida de ferro, celecoxibe, ibudilaste, bendamustina, altretamina, mitolactol, temsirolimus, pralatrexato, TS-1, decitabina, bicalutamida, flutamida, letrozol, clodronate dissódico, degarelix, citrato de toremifeno, dicloridrato de histamina, DW-166HC, nitracrina, decitabina, cloridrato de irinotecano, amsacrina, romidepsina, tretinoína, cabazitaxel, vandetanibe, lenalidomida, ácido ibandrônico, miltefosina, vitespeno, mifamurtida, nadroparina, granisetrona, ondansetrona, tropisetrona, alizaprida, ramosetrona, mesilato de dolasetrona, fosaprepitante dimeglumina, nabilona, aprepitante, dronabinol, TI- 10721, hidrogeno maleato de lisurida, epiceram, defibrotida, etexilato de dabigatrano, filgrastim, pegfilgrastim, reditux, epoetina, molgramostim, oprelvecina, sipuleucel- T, M-Vax, acetil L-carnitina, cloridrato de donepezil, ácido 5 - aminolevulínico, metil amino levulinato, acetato de cetrorelix, icodextrina, leuprorelina, metbilfenidato, octreotida, amlexanox, plerixafor, menatetrenona, anetol ditioletione, doxercalciferol, clorirato de cinacalcete, alefacepte, romiplostim, timoglobulina, timalfasina, ubenimex, imiquimode, everolimus, sirolimus, H-101, lasofoxifeno, trilostano, incadronato, gangliosídeos, pegaptanibe octasssódico, vertoporfina, ácido minodrônico, ácido zoledrônico, nitrato de gálio, alendronato sódico, etidronato dissódico, pamidronato dissódico, dutasterida, estibogluconato sódico, armodafmil, dexrazoxana, amifostina, WF-10, temoporfina, darbepoetina alfa, ancestim, sargramostim, palifermina, R-744, nepidermina, oprelvecina, diftitox denileucina, crisantaspase, buserelina, deslorelina, lanreotida, octreotida, pilocarpina, bosentana, calicheamicina, maitansinoides e ciclonicato.

[0162] Para mais detalhes, o versado na técnica deve se referir ao manual editado pela "The Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique" e intitulado "traité de chimie thérapeutique, vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspective dans le traitement des cancers, edição TEC & DOC, 2003".

[0163] Em uma segunda modalidade preferida da invenção, o imunoconjugado consiste em uma proteína de ligação ligada a pelo menos um radioisótopo. Tal imunoconjugado é referido como um conjugado anticorpo-radioisótopo (ou "ARC") quando a proteína de ligação é um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma.

[0164] Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de ARC tais como, mas sem limitação, At211, C13, N15, O17, F19, I123, I131, I125, In111, Y90, Re186, Rc188, Sm153, tc99 m, Bi212, P32, Pb212, isótopos radioativos de Lu, gadolínio, manganês ou ferro.

[0165] Quaisquer métodos ou processos conhecidos do versado na técnica podem ser usados para incorporar tal radioisótopo na ARC (vide, por exemplo, "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", Chatal, CRC Press, 1989). Como um exemplo não limitante, tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligados através de um resíduo cisteína. Y90 pode ser ligado através de um resíduo lisina. I123 pode ser ligado usando o método IODOGEN (Fraker e outros (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57).

[0166] Vários exemplos podem ser mencionados para ilustrar o conhecimento do versado na técnica no campo de ARC tal como Zevalin® que é um ARC composto de um anticorpo monoclonal anti- CD20 e um radioisótopo In111 ou Y90 ligado por um quelante ligante de tioureia (Wiseman e outros (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman e outros (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig e outros (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig e outros (2002) J. Clin. Oncol.20(15):3262-69); ou Mylotarg® que é composto de um anticorpo anti- CD33 ligado à calicheamicina (US 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). Mais recentemente, pode ser também mencionada a ADC referida como Adcetris (correspondendo à Brentuximabe vedotina) que foi recentemente aceita pelo FDA no tratamento de linfoma de Hodgkin (Nature, vol. 476, pp. 380-381, 25 de agosto de 2011).

[0167] Em uma terceira modalidade preferida da invenção, o imunoconjugado consiste em uma proteína de ligação ligada a pelo menos uma toxina. Tal imunoconjugado é referido como um conjugado anticorpo-toxina (ou "ATC") quando a proteína de ligação é um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma.

[0168] Toxinas são venenos eficazes e específicos produzidos por organismos vivos. Elas geralmente consistem em uma cadeia de aminoácido que pode variar em peso molecular entre um par de cem (peptídeos) e cem mil (proteínas). Elas podem também ser compostos orgânicos de baixo peso molecular. Toxinas são produzidas por vários organismos, por exemplo, bactérias, fungos, algas e plantas. Muitas delas são extremamente venenosas, com uma toxidez que é de várias ordens de magnitude maior do que os agentes nervosos.

[0169] Toxinas usadas em ATC podem incluir, sem limitação, todos os tipos de toxina que podem exercer seus efeitos citotóxicos por mecanismos incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição de topoisomerase.

[0170] Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usados incluem cadeia A da difteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos.

[0171] Toxinas de molécula pequena, tais como dolastatinas, auristatinas, um tricoteceno, e CC1065, e os derivados dessas toxinas que têm atividade de toxina, são também compreendidas aqui. Dolastatinas e auristatinas foram mostradas interferir com a dinâmica de microtúbulo, hidrólise de GTP e divisões nuclear e celular e têm atividades anticâncer a antifúngica.

[0172] "Ligante", "Unidade ligante" ou "ligação" significa uma porção química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente uma proteína de ligação a pelo menos um agente citotóxico.

[0173] Ligantes podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como propionato de N- succimidil-3-(2-(piridiltio) (SPDP), succinimidila-4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados funcionais de imidoésteres (tal como HCl de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido (tal como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tal como tolueno 2,6-di-isocianato) e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluor- 2,4-dinitrobenzeno). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopenta-acético marcado com carbono-14 (MX-DTPA) é um agente de quelação exemplar para conjugação de agentes citotóxicos ao sistema de endereçamento. Outros reagentes de reticulação podem ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulf-GMBS, MBS, MPBH, SBAP, SAI, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulf-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., USA).

[0174] O ligante pode ser um "não clivável" ou "clivável".

[0175] Em uma modalidade preferida, ela consiste em um "ligante clivável" facilitando liberação do agente citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto pode ser usado. O ligante é, em uma modalidade preferida, clivável sob condições intracelulares, de maneira que clivagem do ligante libera o agente citotóxico da proteína de ligação no ambiente intracelular.

[0176] Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossomo ou endossomo ou caveolea). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma enzima peptidase ou protease intracelular, incluindo, mas não limitado a, uma protease lisossomal ou endossomal. Tipicamente, o ligante de peptídeo é de pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Agentes de clivagem podem incluir catepsina B e D e plasmina, todos são conhecidos hidrolisar derivados de fármaco de dipeptídeo resultando na liberação de fármaco ativo dentro das células alvo. Por exemplo, um ligante de peptidila que é clivável por sua protease dependente de tiol catepsina B, que é altamente expresso em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligante Phe-Leu ou um Gly-Phe-Leu-Gly). Em modalidades específicas, o ligante peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit ou um ligante Phe-Lys. Uma vantagem de uso de liberação proteolítica intracelular do agente citotóxico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades no soro dos conjugados são tipicamente altas.

[0177] Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o ligante sensível a pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, um ligante ácido-lábil que é hidrolisável no lisossomo (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiossemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou similar) pode ser usado. Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como aqueles no sangue, mas são instáveis abaixo de pH 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossomo. Em certas modalidades, o ligante hidrolisável é um ligante tioéter (tal como, por exemplo, um tioéter ligado ao agente terapêutico através de uma ligação acilidrazona.

[0178] Em ainda outras modalidades, o ligante é clivável sob condições de redução (por exemplo, um ligante dissulfeto). Uma variedade de ligantes dissulfeto é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridiltio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno)-, SPDB e SMPT.

[0179] Como um exemplo não limitante de ligantes não cliváveis ou "não reduzíveis" pode ser mencionado o imunoconjugado Trastuzumabe-DM1 (TDM1) que combina trastuzumabe com um agente de quimioterapia ligado, maitansina (Cancer Research 2008; 68: (22). 15 de novembro de 2008).

[0180] Em uma modalidade preferida, o imunoconjugado da invenção pode ser preparado através de qualquer método conhecido do versado na técnica tal como, mas não limitado a, i) reação de um grupo nucleofílicos da proteína de ligação a antígeno com um reagente ligante bivalente seguido por reação com o agente citotóxico ou ii) reação de um grupo nucleofílicos de um agente citotóxico com um reagente ligante bivalente seguido por reação com o grupo nucleofílicos da proteína de ligação a antígeno.

[0181] Grupos nucleofílicos ou proteína de ligação a antigen incluem, sem limitação, grupos amina N-terminais, grupos amina de cadeia lateral, por exemplo, lisina, grupos tiol de cadeia lateral e grupos hidroxila ou amino açúcar quando a proteína de ligação a antígeno é glicosilada. Grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções ligantes e reagentes ligantes incluindo, sem limitação, ésteres ativos tais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos e haletos ácidos; haletos de alquila e benzila tais como grupos haloacetamidas; aldeídos, cetonas, carboxila e maleimida. A proteína de ligação a antígeno pode ter dissulfetos intercadeia reduzíveis, isto é, pontes cisteína. As proteínas de ligação a antígeno podem ser tornadas reativas para conjugação com os reagentes ligantes através de tratamento com um agente de redução tal domo DTT (ditiotreitol). Cada ponte cisteína então formará, teoricamente, dois nucleófilos tiol reativos. Grupos nucleófilos adicionais podem ser introduzidos na proteína de ligação a antígeno através de qualquer reação conhecida do versado na técnica. Como exemplo não limitante, grupos tióis reativos podem ser introduzidos na proteína de ligação através de introdução de um ou mais resíduos cisteína.

[0182] Imunoconjugados podem também ser produzidos através de modificações da proteína de ligação a antígeno para introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou agente citotóxico. Os açúcares de proteína de ligação a antígeno glicosilada podem ser oxidados para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amino de reagentes ligantes ou agente citotóxico. Os grupos de base Schiff imina resultantes podem formar uma ligação estável ou podem ser reduzidos para formar ligações amina estáveis. Em uma modalidade, reação da porção carboidrato de uma proteína de ligação a antígeno glicosilada ou com galactose oxidase ou meta-periodato de sódio pode fornecer grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos apropriados no fármaco. Em outra modalidade, proteínas contendo resíduos serina ou treonina N-terminais podem reagir com meta- periodato de sódio, resultando em producao de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido.

[0183] Em certas modalidades preferidas, a unidade ligante pode ter a fórmula geral que segue: --Ta--Ww--Ty— onde: - T é uma unidade de extensão; a é 0 ou 1; -W- é uma unidade de aminoácido; w é independentemente um inteiro variando de a partir de 1 a 12; -Y- é uma unidade espaçadora; y é 0, 1 ou 2.]

[0184] A unidade de extensão (-T-), quando presente, liga a proteína de ligação a antígeno a uma unidade de aminoácido (-W-). Grupos funcionais úteis que podem estar presentes na proteína de ligação a antígeno, ou naturalmente ou através de manipulação química, incluem sulfidrila, amino, hidroxila, o grupo hidroxila anomérico de um carboidrato e carboxila. Grupos funcionais adequados são sulfidrila e amino. Grupos sulfidrila podem ser gerados através de redução das ligações dissulfeto intramoleculares da proteína de ligação a antígeno, se presente. Alternativamente, grupos sulfidrila podem ser gerados através de reação de um grupo amino de uma porção lisina da proteína de ligação a antígeno com 2-iminotiolano ou outros reagentes de geração de sulfidrila. Em modalidades específicas, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo recombinante e é engenheirada para carregar uma ou mais lisinas. Mais preferivelmente, a proteína de ligação a antígeno pode ser engenheirada para carregar uma ou mais Cisteínas (cf. TioMabs).

[0185] Em certas modalidades específicas, a unidade de extensão forma uma ligação com um átomo de enxofre da proteína de ligação a antígeno. O átomo de enxofre pode ser derivado de um grupo sulfidrila (-SH) de uma proteína de ligação a antígeno reduzida.

[0186] Em certas outras modalidades específicas, a unidade de extensão é ligada à proteína de ligação a antígeno através de uma ligação dissulfeto entre um átomo de enxofre da proteína de ligação a antígeno e um átomo de enxofre da unidade de extensão.

[0187] Em outras modalidades específicas, o grupo reativo do extensor contém um sítio reativo que pode ser reativo para um grupo amino da proteína de ligação a antígeno. O grupo amino pode ser aquele de uma arginina ou uma lisina. Sítios reativos de amina adequados incluem, mas não estão limitados a, ésteres ativados tais como ésteres de succinimidas, ésteres de 4-nitrofenila, ésteres de pentafluorfenila, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos.

[0188] Em ainda outro aspecto, a função reativa do extensor contém um sítio reativo que é reativo para um grupo carboidrato modificado que pode estar presente na proteína de ligação a antígeno. Em uma modalidade específica, a proteína de ligação a antígeno é glicosilada enzimaticamente para prover uma porção carboidrato (deve ser notado que, quando a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo, o dito anticorpo é geralmente naturalmente glicosilado). O carboidrato pode ser levemente oxidado com um reagente tal como periodato de sódio e a unidade carbonila resultante do carboidrato oxidado pode ser condensada com um extensor que contém uma funcionalidade tal como uma hidrazina, uma oxima, uma amina reativa, uma hidrazina, uma tiossemicarbazida, um carboxilato de hidrazina ou uma arilidrazida.

[0189] A unidade de aminoácido (-W-) liga a unidade do extensor (T-) à unidade Espaçadora (-Y-) se a unidade espaçadora estiver presente, e liga a unidade extensora ao agente citotóxico se a unidade espaçadora estiver ausente.

[0190] Conforme acima mencionado -WW- pode ser uma unidade dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo,undecapeptídeo ou dodecapeptídeo.

[0191] Em algumas modalidades, a unidade aminoácido pode compreender resíduos de aminoácido tais como, sem limitação, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina protegida com acetila ou formila, arginina, arginina protegida com grupos tosila ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetila ou formila e citrulina. Componentes ligantes de aminoácido exemplares incluem preferivelmente um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo.

[0192] Dipeptídeos exemplares incluem: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp- Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg.

[0193] Tripeptídeos exemplares incluem: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val,Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

[0194] Tetrapeptídeos exemplar incluem: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 33), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 34).

[0195] Pentapeptídeo exemplar inclui: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 35).

[0196] Resíduos de aminoácido que compreendem um componente ligante de aminoácido incluem aqueles que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos em quantidade menor e análogos de aminoácido de ocorrência não natural, tal como citrulina. Componentes ligantes de aminoácido podem ser projetado e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsinas B, C e D ou uma protease plasmina.

[0197] A unidade de aminoácido do ligante pode ser enzimaticamente clivada por uma enzima incluindo, mas não limitada a, uma proteinase associada a tumor para liberar o agente citotóxico.

[0198] A unidade de aminoácido pode ser projetada e otimizada em sua seletividade para clivagem enzimática por uma protease associada a tumor particular. As unidades adequadas são aquelas cuja clivagem é catalisada pelas proteases, catepsinas B, C e D e plasmina.

[0199] A unidade espaçadora (-Y-), quando presente, liga uma unidade de aminoácido ao agente citotóxico. Unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: autoimolativas e não autoimolativas. Uma unidade espaçadora não autoimolativa é uma onde parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada ao agente citotóxico após clivagem enzimática de uma unidade amino do imunoconjugado. Exemplos de uma unidade espaçadora não autoimolativa incluem, mas não estão limitados a, uma unidade espaçadora (glicina-glicina) e uma unidade espaçadora glicina. Para liberar o agente citotóxico, uma reação de hidrólise independente deve acontecer dentro da célula alvo para clivar a unidade glicina-alvo ligada.

[0200] Em outra modalidade, uma unidade espaçadora não autoimolativa (-Y-) é -Gly-.

[0201] Em uma modalidade, o imunoconjugado não tem uma unidade espaçadora (y=0). Alternativamente, um imunoconjugado contendo uma unidade espaçadora autoimolativa pode liberar o agente citotóxico sem a necessidade de uma etapa de hidrólise separada. Nessas modalidades, -Y- é um álcool de p-aminobenzila (PAB) que é ligado a -Ww- através do átomo de nitrogênio do grupo PAB e conectado diretamente a -D através de um grupo carbonato, carbamato ou éter.

[0202] Outros exemplos de espaçadores autoimolativos incluem, mas não estão limitados a, compostos aromáticos que são eletronicamente equivalentes ao grupo PAB tais como derivados de 2- aminoimidazol-5-metanol e orto- e para-aminobenzilacetais. Podem ser usados espaçadores que sofrem ciclização fácil quando da hidrólise de ligação amida, tais como amidas do ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas, sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituídos e amidas do ácido 2- aminofenilpropiônico.

[0203] Em uma modalidade alternativa, a unidade espaçadora é uma unidade bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificada, que pode ser usada para incorporar agentes citotóxicos adicionais.

[0204] Finalmente, a invenção refere-se a um imunoconjugado conforme acima descrito para uso no tratamento de câncer.

[0205] Cânceres podem ser preferivelmente selecionados de canceres relacionados à Axl incluindo células tumorais expressando ou superexpressando toda ou parte da proteína Axl em sua superfície.

[0206] Mais particularmente, os ditos cânceres são câncer de mama, cólon, carcinoma esofageal, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmão, melanoma, osteossarcoma, ovariano, próstata, rabdomiossarcoma, renal, tireoide, uterino, endometrial e quaisquer fenômenos de resistência a fármaco. Outro objetivo da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo o imunoconjugado conforme descrito no relatório.

[0207] Mais particularmente, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o imunoconjugado da invenção com pelo menos um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0208] No presente relatório descritivo, a expressão "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente" pretende indicar um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica não provocando reações secundárias e que permitem, por exemplo, facilitação da administração do(s) composto(s) ativo(s), um aumento em seu tempo de vida e/ou em sua eficácia no corpo, um aumento em sua solubilidade em solução ou então uma melhora em sua conservação. Esses veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão bem adaptados pelo versado na técnica como uma função da natureza e o modo de administração do(s) composto(s) ativo(s) escolhido(s).

[0209] Preferivelmente, esses imunoconjugados serão administrados através da via sistêmica, em particular através da via intravenosa, através da via intramuscular, intradermal, intraperitoneal ou subcutânea ou através da via oral. De uma maneira mais preferida, a composição compreendendo os imunoconjugados de acordo com a invenção será administrada várias vezes, de uma maneira sequencial.

[0210] Seus modos de administração, dosagens e formas farmacêuticas ideias podem ser determinados de acordo com os critérios geralmente levados em consideração no estabelecimento de um tratamento adaptado a um paciente tal como, por exemplo, a idade ou o peso do corpo do paciente, a seriedade de sua condição geral, a tolerância ao tratamento e os efeitos secundários notados.

[0211] Outras características e vantagens da invenção aparecem na continuação do relatório descritivo com os exemplos e figuras cujas legendas são representadas abaixo.

LEGENDAS DAS FIGURAS

[0212] Figuras 1A-C: ensaio de citotoxidez in vitro usando anticorpo secundário conjugado em células SN12C para 110D7 (A), 1003A2 (B) e 1024G11 (C).

[0213] Figuras 2A-2I: Especificidade de ligação à anti-Alx de: - 110D7 na proteína rhAxl-Fc imobilizada (2A), proteínas rhDtk-Fc (2B) ou rhMer-Fc (2C) através de ELISA,- 1003A2 na proteína rhAxl-Fc imobilizada (2D), proteínas rhDtk-Fc (2E) ou rhMer-Fc (2F) através de ELISA, - 1024G11 na proteína rhAxl-Fc imobilizada (2G), proteínas rhDtk-Fc (2H) ou rhMer-Fc (2I) através de ELISA.

[0214] Figuras 3A-C: dados de resposta de dose de 110D7 (A), 1003A2 (B) e 1024G11 (C) obtidos através de citometria de fluxo na presença de várias linhagens de célula de tumor humanas (Calu-1, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB435S, NCI-H125, Panc1 e SN12C).

[0215] Figuras 4A-C: ELISA na proteína rmAxl-Fc imobilizada ("rm" para recombinante de murino) para 110D7 (A), 1003A2 (B) e 1024G11 (C).

[0216] Figuras 5A-C: Ligação de 110D7 (A), 1003A2 (B) e 1024G11 (C) a células CO7 conforme determinado através do protocolo de marcação indireta usando método de citometria de fluxo.

[0217] Figuras 6A-C: ELISA de competição de ligação de Gas6 usando anticorpos anti-Axl 110D7 (A), 1003A2 (B) e 1024G11 (C).

[0218] Figuras 7A-C: Análise de ligação de epítopo através de Western blot usando lisato de célula SN12C para 110D7 (A), 1003A2 (B) e 1024G11 (C). NH (sem calor); NR (sem redução); H (calor); R (redução). Detecção de GAPDH prova a carga de amostra correta no gel.

[0219] Figuras 8A-F: Estudo de sub-regulagem de Axl após ligação de 110D7, 1003A2 e 1024G11 em células SN12 através de Western blot com as Figuras 8A (110D7), 8C (1003A2) e 8E (1024G11) - Imagem de Western blot representativa dos 3 experimentos independentes realizados (A análise Western blot foi realizada após uma incubação de 4 h e 24 h do anticorpo anti-Axl em células SN12C); e Figuras 8B (110D7), 8D (1003A2) e 8F (1024G11) - Quantificação de densidade óptica da película apresentada usando software "QuantityOne".

[0220] Figuras 9A-I: Microscopia de imunofluorescência de células SN12C após incubação com o anticorpos anti-Axl 110D7, 1003A2 e 1024G11, Figuras 9A (110D7), 9D (1003A2) e 9G (1024G11) - Fotografias das condições controle de isotipo mIgG1 para tingimento de ambos a membrana e intracelular. Figuras 9B (110D7), 9E (1003A2) e 9H (1024G11) - Tingimento de membrana. Figuras 9C (110D7), 9F (1003A2) e 9I (1024G11) - Tingimento intracelular de ambos os receptores de Axl usando os anticorpos 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G11, e do marcador de endossoma inicial EEA1. Sobreposições de imagem são apresentadas abaixo e co-localizações visualizadas são indicadas pelas setas.

[0221] Figuras 10A-C: Efeito dos anticorpos 110D7 (A), 1003A (B) e 1024G11 (C) sobre proliferação de células SN12C in vitro comparado com o efeito de um anticorpo controle de isotipo mIgG1.

[0222] As Figuras 11A-11K apresentam porcentagem de citotoxidez em função da concentração de imunoconjugado de 110D7 obtida em ensaios de citotoxidez de célula in vitro distintos com (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA- MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 ou (K) células de tumor Panc1 tratadas com uma faixa de concentrações de imunoconjugado de 117D7-saporina.

[0223] As Figuras 12A-12K representam porcentagem de citotoxidez em função da concentração de imunoconjugado de 1003A2 obtida em ensaios de citotoxidez de célula in vitro com (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA- MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 ou (K) células de tumor Panc1 tratadas com uma faixa de concentrações de imunoconjugado de 113A2-saporina.

[0224] As Figuras 13A-13K apresentam porcentagem de citotoxidez em função da concentração de imunoconjugado de 1024G11 obtida em ensaios de citotoxidez de célula in vitro com (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 ou (K) células de tumor Panc1 tratadas com uma faixa de concentrações de imunoconjugado de 1024G11- saporina.

EXEMPLOS

[0225] Nos exemplos que seguem, anticorpo controle de isotipo usado consiste em uma IgG1 de murino referida como 9G4. Significa que, nos exemplos que seguem, as expressões mIgG1, controle e 9G4 são similares.

Exemplo 1: Internalização de receptor de Axl

[0226] Como uma abordagem de imunoconjugado é mais eficiente quando o antígeno direcionado é uma proteína de internalização, internalização de receptor de Axl usando ensaio de citotoxidez de Mab- Zap em linhagens de célula de tumor humanas foi estudada. Mais precisamente, o reagente Mab-Zap é um conjugado químico de IgG anticamundongo de cabra purificada por afinidade e a proteína de inativação de ribossomo, saporina. Se internalização do complexo imune ocorrer, a saporina se separa do agente de direcionamento e inativa os ribossomos, o que causa inibição de proteína e, por fim, morte celular. Determinação da viabilidade celular após 72 horas de incubação com anticorpos em células positivas para Axl permite conclusão da internalização de receptor de Axl.

[0227] Para este exemplo, células altamente positivas para Axl,conforme determinado usando reagente Qifikit (Dako), foram usadas.Os dados são apresentados na Tabela 5 que segue.Tabela 5

[0228] No exemplo que segue, as células SN12C foram usadas como exemplo não limitativo. Outra linhagem de célula expressando nível apropriado de receptor de Axl em sua superfície celular poderia ser usada.

[0229] Faixas de concentração dos anticorpos 110D7,respectivamente anticorpos anti-Axl 1003A2 e 1024G11 ou o anticorpo 9G4 controle de isotipo mIgG1, foram pré-incubadas com 100 ng de anticorpo secundário Mab-Zap (sistemas de direcionamento avançado) em meio de cultura celular por 30 minutos em RT. Essas misturas foram carregadas em células SN12C subconfluentes plaqueadas em microplaca de placa de 96 cavidades brancas. As placas foram incubadas por 72 h a 37° C na presença de 5% de CO2. Viabilidade celular foi determinada usando um método de proliferação de célula Cell Titer Glo de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Vários controles são realizados: condições i) sem nenhum imunoconjugado secundário e ii) sem anticorpo primário são preparadas. Em paralelo, os ensaios são realizados com um controle de isotipo mIgG1.

[0230] Os resultados obtidos são apresentados nas Figuras 1A (110D7), 1B (1003A2), 1C (1024G11).

[0231] O anticorpo 110D7 mostra um efeito citotóxico máximo sobre células SN12C de ~49%. O anticorpo 1003A2 mostra um efeito citotóxico máximo sobre células SN12C de ~37%. O anticorpo 1024G11 mostra um efeito citotóxico máximo sobre células SN12C de ~40%.

[0232] Nenhum efeito citotóxico foi observado na presença do anticorpo 9G4, considerado controle de isotipo mIgG1 no experimento.

[0233] Nenhuma citotoxidez foi observada em cavidades contend apenas anticorpos primários (dados não mostrados). Desta maneira, o receptor de Axl parece ser um antígeno conveniente para alvo para uma abordagem de imunoconjugado como o complexo imune compreendendo Axl-110D7-MabZap, Axl-1003A2-MapZap ou Axl- 1024G11-MabZap dispara uma citotoxidez eficaz das células alvo.

Exemplo 2: Geração de anticorpos contra proteína de ECD rhAxl. 2.1 Geração do anticorpo para Axl 110D7

[0234] Para gerar anticorpos monoclonais de murino (Mabs) contra domínio extracelular (ECD) humano do receptor de Axl, 5 camundongos BALB/c foram imunizados 3 vezes s.c. com 5-15 μg da proteína rh Axl- Fc (R & D Systems, No. cat. 154-AL). A primeira imunização foi realizada na presença de Adjuvante Completo de Freund (Sigma, St. Louis, MD, USA). Adjuvante Incompleto de Freund (Sigma) foi adicionado para imunizações seguintes.

[0235] Três dias antes da infusão, os camundongos imunizados foram reforçados om 15 μg da proteína rhAxl-Fc (CIPF) intraperitonealmente (i.p.) com IFA.

[0236] Esplenócitos e linfócitos foram preparados através de perfusão do baço e corte em pedaços dos nós linfáticos proximais, respectivamente, coletados de 1 dos 5 camundongos imunizados (selecionados após titulação do soro) e fundidos a células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, Rockville, MD, USA). O protocolo de fusão é descrito por Kohler e Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Células fundidas são então submetidas à seleção HAT. Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem de murino, é possível se referir a técnicas que são descritas em particular no manual "Antibodies" (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 726, 1988).

[0237] Aproximadamente 10 dias após a infusão, colônias de células híbridas foram avaliadas. Para a avaliação primária, sobrenadantes de hibridomas foram avaliados quanto à secreção de Mabs criados contra a proteína rhAxl-Fc usando um ELISA. Em paralelo, análise FACS foi realizada para selecionar Mabs capazes de se ligar à forma celular de Axl presente na superfície celular das células de tumor de próstata DU145 (ATCC).

[0238] Assim que possível hibridomas selecionados foram clonados por diluição limite e subsequentemente avaliados quanto à sua reatividade contra a proteína de ECD Axl humana. Mabs clonados foram então isotipificados usando um Isotyping kit (No. cat. 5300.05, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). Um clone obtido de cada hibridoma foi selecionado e expandido.

[0239] Os sobrenadantes de hibridoma foram ensaiados através de ELISA para determinar sua capacidade de ligação ao domínio de ECD do receptor de Axl humana ou a proteína rh Axl-Fc. Quando o teor de IgG em sobrenadantes foi determinado, titulação foi realizada começando em 5 μg/ml. Então uma diluição serial % foi realizada nas 11 fileiras que seguem. De outro modo, os sobrenadantes foram aplicados puros. Em suma, placas de ELISA de 96 cavidades (Costar 3690, Corning, NY, USA) foram revestidas 50 μl/cavidade da proteína rh Axl-Fc (R & D Systems, No. cat. 154-AL) a 2 μg/ml em PBS de um dia para o outro a 4° C. As placas foram então bloqueadas com PBS contendo gelatina 0,5% (No. 22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha) por 2 h a 37° C. Uma vez o tampão de saturação descartado batendo as placas, 50 μl de sobrenadantes de célula de hibridoma ou 50 μl de uma solução 5 μg/ml foram adicionados às placas de ELISA e incubados por 1 h a 37° C. Após três lavagens, 50 μl de IgG anticamundongo de cabra policlonal conjugado à peroxidase de rábano silvestre (No. 115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) foram adicionados em uma diluição 1/5000 em PBS contendo gelatina 0,1% e Tween 20 0,05% (p:p) por 1 h a 37° C. Então, placas de ELISA foram lavadas 3 vezes e o substrato de TMB (No. UP664782, Uptima, Interchim, França) foi adicionado. Depois de um período de incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, a reação foi parada usando ácido sulfúrico 1M e a densidade óptica a 450 nm foi medida.

[0240] Para a seleção através de citometria de fluxo, 100 000 células DU145 de câncer de próstata humano que expressam receptor de Axl em sua superfície (ATCC) foram plaqueadas em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades em PBS contendo BSA 1% e azida de sódio 0,01% (tampão FACS) a 4° C. Após uma centrifugação de 2 min a 2000 rpm, o tampão foi removido e sobrenadantes de hibridoma ou Mabs purificados (1 μg/ml) a serem testados foram adicionados. Depois de 20 minutos de incubação a 4° C, as células foram lavadas duas vezes e um anticorpo anticamundongo de cabra conjugado a Alexa 488 1/500° diluído em tampão FACS (No. A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) foi adicionado e incubado por 20 min a 4° C. Após uma lavagem final com tampão de FACS, as células foram analisadas através de FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) após adição de iodeto de propídio a cada tubo em uma concentração final de 40 μg/ml. Cavidades contendo células sozinhas e células incubadas com o anticorpo conjugado a Alexa 488 secundário foram incluídas como controles negativos. Controles de isotipo foram usados em cada experimento (Sigma, ref. M90351MG). Pelo menos 5000 células foram avaliadas para calcular o valor médio de intensidade de fluorescência (MFI).

[0241] Mais precisamente, a fusão foi realizada com 310.106 de esplenócitos coletados e 310,106 células de mieloma (razão 1:1). Duzentas células da suspensão de célula resultante foram então plaqueadas a 2,106 célula/ml em 30 placas de 96 cavidades.

[0242] Uma primeira avaliação (mais ou menos no Dia 14 após infusão) ambos através de ELISA na proteína rh Axl-Fc e através de analise FACS usando a linhagem de célula de tumor DU145 permitiu selecionar 5 hibridomas apresentando densidade ópticas (ODs) acima de 0,5 em um revestimento de rh Axl-Fc e MFI acima de 40 em linhagem de célula de tumor de próstata humana DU145.

[0243] Esses 5 hibridomas foram expandidos e clonados através de diluição limite. Uma placa de 96 cavidades foi preparada para cada código. Nove dias após o plaqueamento, sobrenadantes de placas de clonagem foram primeiro avaliados através de ELISA quanto à sua especificidade de ligação com o domínio extracelular da proteína rh Axl- Fc. Então outro ensaio ELISA foi realizado para eliminar Mabs anti-Fc usando a proteína Notch-Fc recombinante de rato imobilizada. Ainda, hibridomas foram testados quanto à reatividade em linhagem de célula de câncer de próstata humana DU145 através de citometria de fluxo. Três clones de cada código foram expandidos e isotipificados. Uma vez produzidos os anticorpos anti-Axl foram estudados adicionalmente quanto à sua habilidade em serem internalizados seguindo ligação à Axl na superfície celular.

2.2 Geração dos Anticorpos para Axl 1003A2 e 1024G11

[0244] Para gerar anticorpos monoclonais de murino (Mabs) contra domínio extracelular humano (ECD) do receptor de Axl, 5 camundongos BALB/c foram imunizados 4 vezes s.c. (subcutaneamente) com 20 μg da proteína Axl monomérica humana (produto da casa). A primeira imunização foi realizada na presença de Adjuvante de Freund Completo (Sigma, St. Louis, MD, USA). Adjuvante de Freund Incompleto (Sigma) foi adicionado para as imunizações seguintes.

[0245] Três dias antes da fusão, os camundongos imunizados foram reforçados com 20 μg da proteína Axl monomérica (produto da casa) intraperitonealmente (i.p.) com IFA.

[0246] Para gerar célula de hibridoma, esplenócitos e linfócitos foram preparados através de perfusão do baço e cortando em pedaços os nós linfáticos proximais, respectivamente, coletados de 1 dos 5 camundongos imunizados (selecionados após titulação do soro) e fundidos a células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, Rockville, MD, USA). O protocolo de fusão é descrito por Kohler e Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Células fundidas são então submetidas à seleção HAT. Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos funcionais, especialmente de origem de murino, é possível se referir a técnicas que são descritas em particular no manual "Antibodies" (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 726, 1988).

[0247] Aproximadamente 10 dias após a infusão, colônias de células híbridas foram avaliadas. Para a avaliação primária, sobrenadantes de hibridomas foram avaliados quanto à secreção de Mabs criados contra a proteína Axl monomérica humana (CIPF) usando um ELISA. Em paralelo, uma análise FACS foi realizada para selecionar Mabs capazes de se ligar à forma celular de Axl presente na superfície celular das células de tumor de próstata DU145 humanas (ATCC).

[0248] Assim que possível, hibridomas selecionados foram clonados através de diluição limite e subsequentemente avaliados quanto à sua reatividade contra o receptor de Axl monomérico. Mabs clonados foram então isotipificados usando um Isotyping kit (No. cat. 5300.05, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). Um clone obtido de cada hibridoma foi selecionado e expandido.

[0249] Os sobrenadantes de hibridoma foram ensaiados através de ELISA para determinar sua capacidade de ligação ao domínio de ECD do receptor de Axl humano. Quando o teor de IgG em sobrenadantes foi determinado, titulação foi realizado começando em 5 μg/ml. Então uma diluição serial ^ foi realizada nas 11 fileiras seguintes. De outro modo, sobrenadantes foram aplicados puros. Em suma, placas de ELISA de 96 cavidades (Costar 3690, Corning, NY, USA) foram revestidas ou com 50 μl/cavidade de uma solução de Axl de ACD (CIPF) a 2 μg/ml em PBS ou 50 μl/cavidade da proteína rh Axl-Fc (R & D Systems, No. cat. 154-AL) a 2 μg/ml em PBS de um dia para o outro a 4° C. As placas foram então bloqueadas com PBS contendo gelatina 0,5% (No. 22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha) por 2 h a 37° C. Uma vez o tampão de saturação descartado batendo as placas, 50 μl de sobrenadantes de célula de hibridoma puros ou 50 μl de uma solução 5 μg/ml foram adicionados às placas de ELISA e incubados por 1 h a 37° C. Após três lavagens, 50 μl de IgG anticamundongo de cabra policlonal conjugado à peroxidase de rábano silvestre (No. 115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) foram adicionados em uma diluição 1/5000 em PBS contendo gelatina 0,1% e Tween-20 0,05% (p:p) por 1 h a 37° C. Então, placas de ELISA foram lavadas 3 vezes e o substrato de TMB (No. UP664782, Uptima, Interchim, França) foi adicionado. Após um tempo de incubação de 10 min em temperatura ambiente, a reação foi parada usando ácido sulfúrico 1 M e a densidade óptica a 450 foi medida.

[0250] Para a seleção através de citometria de fluxo, 100 000 células DU145 de câncer de próstata humano que expressam receptor de Axl em sua superfície (ATCC) foram plaqueadas em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades em PBS contendo BSA 1% e azida de sódio 0,01% (tampão FACS) a 4° C. Após uma centrifugação de 2 min a 2000 rpm, o tampão foi removido e sobrenadantes de hibridoma ou Mabs purificados (1 μg/ml) a serem testados foram adicionados. Depois de 20 minutos de incubação a 4° C, as células foram lavadas duas vezes e um anticorpo anticamundongo de cabra conjugado a Alexa 488 1/500° diluído em tampão FACS (No. A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) foi adicionado e incubado por 20 min a 4° C. Após uma lavagem final com tampão de FACS, as células foram analisadas através de FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) após adição de iodeto de propídio a cada tubo em uma concentração final de 40 μg/ml. Cavidades contendo células sozinhas e células incubadas com o anticorpo conjugado a Alexa 488 secundário foram incluídas como controles negativos. Controles de isotipo foram usados em cada experimento (Sigma, ref. M90351MG). Pelo menos 5000 células foram avaliadas para calcular o valor médio de intensidade de fluorescência (MFI).

[0251] A fusão foi realizada com 280,106 de esplenócitos e linfócitos coletados e 280,106 células de mieloma (razão 1:1). A suspensão de célula fundida resultante (2,106 celuals/ml) foi então plaqueada em 30 placas de 96 cavidades.

[0252] Uma primeira avaliação (mais ou menos no Dia 14 após infusão) ambos através de ELISA na proteína de ECD Axl imobilizada permitiu seleção de 69 hibridomas apresentando densidades ópticas (ODs) acima de 1 no revestimento de Axl de ECD. Uma análise FACS complementar usando a linhagem de célula de tumor DU145 limite o número de hibridomas selecionados. Nesta etapa 17 hibridomas apresentando MFI acima de 100 em linhagem de célula de tumor de próstata humana DU145 foram mantidos e clonados através de diluição limite. Placas de clonagem foram avaliadas usando ELISA de Axl monomérico; hidridomas selecionados foram então expandidos e caracterizados adicionalmente quanto à sua especificidade de ligação e habilidade em ser internalizados.

Exemplo 3: Especificidade de ligação à Axl

[0253] Neste exemplo, a ligação dos anticorpos 110D7, 1003A2, 1024G11 é respectivamente estudada na proteína rh Axl-Fc. Segundo, sua ligação nos dois outros membros da família TAM, rhDtk-Fc e rhMer- Fc, é estudada.

[0254] Em suma, as proteínas Axl-Fc (R & D systems, No. Cat. 154AL/FC), rh Dtk (R & D Systems, No. Cat. 859-DK) ou rh-Mer-Fc (R & D Systems, No. Cat. 891-MR) humanas recombinantes foram revestidas de um dia para o outro a 4° C em placas de 96 cavidades Immulon II e, após uma etapa de bloqueio de 1 h com uma solução de gelatina 0,5%, anticorpos purificados 110D7, 1003A2, 1024G11 foram adicionados, respectivamente, por mais 1 h a 37° C em concentração de partida de 5 μg/ml (3,33 10-8M). Então, diluições seriais ^ foram feitas em 12 colunas. Então as placas foram lavadas e um IgG-HRP específico anticamundongo de cabra (Jackson) foi adicionado por 1 h a 37° C. Desenvolvimento de reação foi realizado usando a solução de substrato de TMB. O anticorpo anti-Axl Mab 154 comercial é também usado em paralelo (dados não mostrados). Controles de revestimento são realizados na presença de um soro policlonal IgG Fc anti-humano de cabra marcado com HRP (Jackson, ref. 109-035-098) e/ou na presença de um anticorpo anti-Histidina acoplado a HRP (R & D Systems, ref.: MAB050H). Nenhuma ligação não específica é observada na ausência de anticorpo primário (diluente). Resultados para o 110D7 são apresentados nas Figuras 2A, 2B e 2C, respectivamente. Resultados para o 1003A2 são representados nas Figuras 2D, 2E e 2F, respectivamente. Resultados para o 1024G11 são representados nas Figuras 2G, 2H e 2I, respectivamente.

[0255] Este exemplo mostra que os anticorpos 110D7, 1003A2, 1024G11 apenas se ligam à proteína rhAxl-Fc e não se ligam aos dois outros membros da família TAM, rhDtk ou rhMer. Nenhuma especificidade cruzada de ligação dos anticorpos 110D7, 1003A2,1024G11 é observada entre membros TAM.

Exemplo 4: Detecção de Axl em células de tumor humanas

[0256] Nível de expressão de Axl em superfície celular em células de tumor humanas foi primeiro estabelecido usando um anticorpo para Axl comercial (R & D Systems, ref.: MAB154) em paralelo de contas de calibragem para permitir a quantificação de nível de expressão de Axl. Segundo, ligação da Axl de superfície celular foi estudada usando 110D7, 1003A2 e 1024G11. Em ambos os casos, as condições experimentais foram como rapidamente descrito abaixo.

[0257] Para estudos de ligação à superfície celular, diluições seriais de duas vezes de uma solução de anticorpo primário 10 μg/ml (6,66 108 M) (anticorpo comercial para Axl 110D7, 1003A2, 1024G11, MAB154 ou Mab 9G4 controle de isotipo de mIgG1) são preparadas em 11 pontos e são aplicadas em 2,105 células por 20 min a 4° C. Após 3 lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com BSA 1% e NaN3 0,01%, as células foram incubadas com anticorpo secundário Alexa 488 anti-camundongo de cabra (diluição 1/500°) por 20 minutos a 4° C. Depois de 3 lavagens adicionais em PBS suplementado com BSA 1% e NaN3 0,1%, as células foram analisadas através de FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Pelo menos 5000 células foram avaliadas para calcular o valor médio de intensidade de fluorescência.

[0258] Para determinação de ABC quantitativa usando anticorpo para Axl MAB154, contas de calibragem QIFIKIT® são usadas. Então, as células foram incubadas, em paralelo com as contas QIFIKIT®, com Imunoglobulinas Anticamundongo de Cabra Policlonais/FITC, F(ab’)2 de cabra, na concentração de saturação. O número de sítios antigênicos nas células do espécime é então determinado através de interpolação da curva de calibragem (a intensidade de fluorescência das populações de conta individuais contra o numero de moléculas de Mab nas contas). 4.1. Quantificação de nível de expressão de Axl em superfície celular

[0259] Nível de expressão de Axl na superfície de células de tumor humanas foi determinado através de citometria de fluxo usando ensaio de imunofluorescência indireto (método QIFIKIT® (Dako, Dinamarca), um estojo de citometria de fluxo quantitativa para avaliação de antígenos de superfície de célula. Uma comparação da intensidade de fluorescência média (MFI) dos níveis de antígeno conhecidos das contas com um gráfico de calibragem permite determinação da capacidade de ligação de anticorpo (ABC) das linhagens de célula.

[0260] A Tabela 6 apresenta nível de expressão de Axl detectado na superfície de várias linhagens de célula de tumor humanas (SN12C, Calu-1, A172, A431, DU145, MDA-MB435S, MDA-MB231, PC3, NCI- H226, NCI-H125, MCF7, Panc) (ATCC, NCI) conforme determinado usando QIKIFIT® na presença do anticorpo comercial para Axl MAB154 (R & D Systems). Os valores são dados como Complexo de ligação a antígeno (ABC).Tabela 6

[0261] Os resultados obtidos com um anticorpo monoclonal para Axl comercial (MAB154) mostraram que receptor de Axl é expresso em vários níveis dependendo da célula de tumor humana considerada.

4.2 Detecção de Axl usando anticorpos para Axl 110D7, 1003A2 e 1024G11 em células de tumor humanas

[0262] Mais especificamente, ligação à Axl foi estudada usando anticorpo 110D7, 1003A2 ou 1024G11 para Axl. Curvas de resposta de dose de anticorpo para Axl foram aplicadas. MFIs obtidos usando as várias células de tumor humanas foram então analisados com software Prism. Os dados são apresentados nas Figuras 3A-3C.

[0263] Os dados indicam que os três anticorpos para Axl se ligam especificamente ao receptor de Axl da membrana conforme atestado pelos perfis de curva de saturação. No entanto, intensidades diferentes de marcação foram observadas, revelando níveis variáveis de receptor de Axl de superfície de célula em células de tumor humanas. Nenhuma ligação de receptor de Axl foi observada usando linhagem de célula de tumor de mama humana MCF7.

Exemplo 5: Especificidade cruzada interespécies de anticorpos 110D7, 1003A2, 1024G11

[0264] Para se endereçar à especificidade cruzada de espécie dos anticorpos anti-Axl 110D7, 1003A2 e 1024G11, 2 espécies foram consideradas: camundongo e macaco. Primeiro a ligação no receptor de Axl de camundongo recombinante (rm) é estudada através de ELISA (Figuras 4A a C). Segundo, experimentos de citometria de fluxo foram realizados usando células COS7 de macaco uma vez que essas células expressavam o receptor de Axl em sua superfície (Figuras 5A a C). A linhagem de célula COS7 foi obtida através de imortalização de uma linhagem de célula CV-1 derivada de células de rim do macaco verde africano com uma versão do genoma de SV40 que pode produzir antígeno T grande, mas tem um defeito em replicação genômica.

5.1 ELISA de rmAxl-Fc

[0265] Em suma, as proteínas Axl-Fc de camundongo recombinantes (R & D Systems, No. cat. 854-AX/CF) foram revestidas de um dia para o outro a 4° C em placas de 96 cavidades Immulon II e, após uma etapa de bloqueio de 1 h com uma solução de gelatina 5%, os anticorpos purificados, 110D7, 1003A2, 1024G11, respectivamente, foram adicionados por mais 1 h a 37° C na concentração de partida de 5 μg/ml (3,33 10-8M). Então diluições seriais ^ foram feitas em 12 colunas. Então as placas foram lavadas e HRP de IgG específica de anticamundongo de cabra (Jackson) foi adicionado por 1 h a 37° C. Desenvolvimento de reação foi realizado usando a solução de substrato TMB. O anticorpo Mab 154 anti-Axl de camundongo comercial é também usado em paralelo. Controles de revestimento são realizados na presença de um soro policlonal Fc IgG anti-humano de cabra acoplado com HRP (Jackson, ref. 109-035-098) e na presença de um anticorpo anti-Histidina acoplado a HRP (R & D Systems, ref.: MAB050H). Nenhuma ligação específica é observada na ausência de anticorpo primário (diluente).

[0266] Os resultados são apresentados nas Figuras 4A (110D7), 4B (1003A2) e 4C (1024G11).

[0267] A Figura 4A mostra que o anticorpo 110D7 da presente invenção é capaz de se ligar ao domínio ECD de Axl de murino apenas na presença de concentração de anticorpo alta (acima de 8,3 10-9 M).

[0268] A Figura 4B mostra que o anticorpo 1003A2 da presente invenção não se liga ao domínio de ECD de Axl de murino.

[0269] A Figura 4C mostra que o anticorpo 1024G11 da presente invenção nãos e liga ao domínio de ECD de Axl de murino.

5.2 FACS COS7

[0270] Para 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G11, propósito de ligação celular, 2,105 células foram incubadas com uma faixa de concentração de anticorpo preparada através de diluição serial ^ (12 pontos) de uma solução de anticorpo 10 μg/ml (6,66 10-8M) de 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G11, ou m9G4 (Mab controle isotipo mIgG1) por 20 min a 4° C. Após 3 lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com BSA 1% e NaN3 0,01%, as células foram incubadas com Alexa 488 anticamundongo de cabra secundário (diluição 1/500) por 20 minutos a 4° C. Após 3 lavagens adicionais em PBS suplementado com BSA 1% e NaN3 0,1%, as células foram analisadas através de FACS (Facscalibur, Becton- Dickinson). Pelo menos 500 células foram avaliadas para calcular o valor médio de intensidade de fluorescência. Os dados são analisados usando software Prism.

[0271] Os resultados são apresentados nas Figura 5A (110D7), 5B (1003A2) e 5C (1024G11).

[0272] A curva de titulação estabelecida em células COS7 usando anticorpo 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G11, e controle de isotipo mIgG1 confirma que 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G11, são capazes de reconhecer forma celular de macaco do receptor de Axl expresso na superfície das células COS7.

[0273] Platô é atingido para concentrações de anticorpo 110D7 acima de 156 μg/ml (10-9M). Platô é atingido para concentrações de anticorpo 1003A2 acima de 0,07 μg/ml (5,2 10-10M). Platô é atingido para concentrações de anticorpo 1024G11 acima de 0,07 μg/ml (5,2 x 1010M).

[0274] Nenhuma ligação é observada na presença do controle de isotipo mIgG1.

Exemplo 6: Experimentos de competição por Gas6 realizados na presença dos anticorpos 110D7, 1003A2 e 1024G11

[0275] Para caracterizar adicionalmente os Mabs anti-Axl, ensaios de competição por Gas6 foram realizados. Neste ensaio, a proteína rhAxl-Fc e o anticorpo anti-Axl são incubados para formar complexo de antígeno-anticorpo e então os complexos são carregados na superfície revestida com Gas na placa de ensaio. Os complexos de anticorpo- antígeno não ligados são retirados antes da adição de anticorpo secundário ligado à enzima contra a porção Fc humana da proteína rhAxl-Fc. O substrato é então adicionado e a concentração de antígeno pode então ser determinada através da resistência de sinal elicitada pela reação de enzima-substrato.

[0276] Em suma, mistura de reação compreendendo a proteína rhAxl-Fc na presença ou não de Mabs a serem testados é preparada em uma placa saturada separada (gelatina 0,5% em PBX 1X). Diluições seriais 1:2 (partindo de 80 μg/ml em 12 colunas) de anticorpos para Axl de murino (110D7, 1003A2 e 1024G11) são realizadas. Então 0,5 μg/ml da proteína rhAxl-Fc é adicionado (R & D Systems, ref. 15AL/FC), exceto pelo controle negativa que contém apenas diluente de ELISA (gelatina 0,1%, Tween 20 0,05% em PBX 1X). Após homogeneização, as amostras de competição são carregadas em placas revestidas com Gas6 com uma solução de rhGas 6 μg/ml em PBS (R & D Systems, No. Cat. 885-GS-CS/CF). Após incubação e várias lavagens, proteínas rhAxl-Fc ligadas são detectadas usando um IgG-HRP anti-Humano de cabra (Jackson, ref. 109-035-098). Uma vez ligado, o substrato de TMB é adicionado às placas. A reação é parada através da adição de solução ácida de H2SO4 e as densidades ópticas obtidas lidas a 450 min usando um instrumento leitor de microplaca.

[0277] Este experimento (Figuras 6A, 6B e 6C, respectivamente) mostra que 110D7, 1003A2 e 1024G11 são capazes de competir com a ligação de rhAxl-Fc em seu ligante imobilizado. Competição com ligação de Gas6 ocorre na presença de concentrações de anticorpo 110D7 acima de 2,5 μg/ml (1,67 10-8 M). Competição com ligação de Gas6 ocorre na presença de concentrações de anticorpo 1003A2 acima de 2,5 μg/ml (1,67 10-8 M). Nenhuma ligação mais da rhAxl-Fc na Gas6 imobilizado é observado na presença de concentração de anticorpo 1003A2 acima de 10 μg/ml (6,67 10-8 M). Competição com ligação de Gas6 ocorre na presença de concentrações de anticorpo 1024G11 acima de 2,5 μg/ml (1,67 10-8 M). Nenhuma ligação mais da rhAxl-Fc no Gas6 imobilizado é observada na presença de concentração de anticorpo 1024G11 acima de 10 μg/ml (6,67 10-8 M).

[0278] Os anticorpos 110D7, 1003A2 e 1024G11 boqueiam ligação de Gas6 em rhAxl-Fc.

Exemplo 7: Reconhecimento de epítopo por Western blot

[0279] Para determinar se os anticorpos anti-Axl 110D7, 1003A2 e 1024G11 reconhecem um epítopo linear ou conformacional, análise Western blot foi feita usando lisatos de célula SN12C. As amostras foram diferentemente tratadas para estarem em condições de redução ou não redução. Se uma faixa for visualizada com amostra reduzida, o anticorpo testado se direciona a um epítopo linear do domínio ECD; se não, ele é originado contra um epítopo conformacional do ECD de Axl.

[0280] Células SN12C foram semeadas em RPMI + FBS inativado com calor 10% + L-glutamina 2 mM a 5,104 células/cm2 em frascos T162 cm2 por 72 h a 37° C em uma atmosfera de CO2 5%. Então as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lisadas com 1,5 ml de tampão de lise gelado [Tris-HCl 50 mM (pH 7,5); NaCl 150 mM; Nonidet 40 1%; desoxicolato 0,5%; e 1 comprimido de coquetel inibidor de protease completo mais antifosfatases 1%]. Lisatos de célula foram agitados por 90 minutos a 4° C e apurados a 1500 rpm por 10 min. A concentração de proteína foi quantificada usando BCA. Várias amostras foram carregadas. Primeiro 10 μg de lisato de célula integral (10 μg em 20 μl) foram preparados em condições de redução (tampão de amostra 1x (BIORAD) + agente de redução 1x (BIORAD)) e carregados em um SDS-PAGE após incubação de 2 min a 96° C. Segundo, duas outras amostras de 10 μg de lisato de célula integral foram preparadas em condições de não redução (em tampão de amostra 1x (BIORAD) apenas). Antes de ser carregada no gel de SDS-PAGE, uma dessas duas últimas amostras é aquecida 2 min de incubação a 96° C; a outra é mantida em gelo. Após migração, as proteínas são transferidas para membrana de nitrocelulose. As membranas foram saturadas por 1 h em RT com TBS-Tween 20 0,1% (TBST); leite desnatado 5% e examinado com o anticorpo 110D7, respectivamente, 1003A2 e 1024G11, a 10 μg/ml de um dia para o outro a 4° C em TBST-leite em pó desnatado 5%. Os anticorpos foram diluídos em solução salina tamponada com Tris-Tween 20 0,1% (v/v) (TBST) com leite em pó desnatado 1%. As membranas foram lavadas com TBST e incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase (diluição 1/1000) por 1 h em RT. Proteínas imunorreativas foram visualizadas com ECL (Pierce No. 32209). Após visualização de Axl, as membranas foram lavadas novamente com TBST e incubadas por 1 h em RT com anticorpo anti-GAPDH de camundongo (diluição 1/200 000) em TBST-leite em pó desnatado 5%. Então as membranas foram lavadas em TBST e incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase, por 1 h em RT. As membranas foram lavadas e GAPDH foi revelado usando ECL.

[0281] Os resultados são apresentados nas Figuras 7A (110D7), 7B (1003A2) e 7C (1024G11).

[0282] Os anticorpos anti-Axl 110D7, 1003A2 e 1024G11 reconhecem um epítopo conformacional como uma faixa específica é apenas observada em condições de não redução. Nenhuma faixa é observada em condição de migração desnaturante do lisato de célula SN12C.

Exemplo 8: Medição de sub-regulagem de Axl disparada pelos anticorpos 110D7, 1003A2, 1024G11 através de Western blot

[0283] No exemplo que segue, a linhagem de célula de carcinoma de célula renal humana SN12C (ATCC) foi selecionada para se endereçar à atividade de anticorpos sobre expressão de receptor de Axl. A linhagem de célula SN12C superexpressa o receptor de Axl. A sub- regulagem de Axl foi estudada por Western blot em extratos de célula integral nas Figuras 8A-8B, 8C-8D (1003A2), 8E-8F (1024G11).

[0284] Células SNC12 foram semeadas em RPMI + FBS inativado com calor 10% + L-glutamina 2 mM a 6,104 células/cm2 em placas de seis cavidades por 48 h em uma atmosfera de 5% de CO2. Após duas lavagens com solução salina de tampão de fosfato (PBS), as células foram deixadas sem soro em um meio contendo ou 800 ng/ml de ligante Gas6 de camundongo recombinante (R & D Systems, ref.: 986-GS/CF) ou 10 μg/ml de um anticorpo controle de isotipo mIgGI (9G4) ou 10 μg/ml do anticorpo anti-Axl da presente invenção e incubadas por 4 h ou 24 horas adicionais. Então o meio foi suavemente removido e as células lavadas duas vezes com PBS frio. As células foram lisadas com 200 μl de tampão de lise gelado [Tris-HCl 50 mM (pH 7,5); NaCl 150 mM; Nonidet 40 1%; desoxicolato 0,5%; e 1 comprimido de coquetel inibidor de protease completo mais antifosfatases 1%]. Lisatos de célula foram agitados por 90 minutos a 4° C e apurados a 1500 rpm por 10 min. A concentração de proteína foi quantificada usando BCA. Lisatos de célula integral (10 μg em 20 μl) foram separados através de SDS- PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose. As membranas foram saturadas por 1 h em RT com TBS-Tween 20 0,1% (TBST); leite desnatado 5% e examinado com o anticorpo anti-Axl comercial a 0,5 μg/ml (AbNova H00000558-M02) de um dia para o outro a 4° C em TBST-leite em pó desnatado 5%. Os anticorpos foram diluídos em solução salina tamponada com Tris-Tween 20 0,1% (v/v) (TBST) com leite em pó desnatado 1%. As membranas foram lavadas com TBST e incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase (diluição 1/1000) por 1 h em RT. Proteínas imunorreativas foram visualizadas com ECL (Pierce No. 32209). Após visualização de Axl, as membranas foram lavadas novamente com TBST e incubadas por 1 h em RT com anticorpo anti-GAPDH de camundongo (diluição 1/200 000) em TBST- leite em pó desnatado 5%. Então as membranas foram lavadas em TBST e incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase, por 1 h em RT. As membranas foram lavadas e GAPDH foi revelado usando ECL. A intensidade da faixa foi quantificada através de densitometria.

[0285] Os resultados apresentados nas Figuras 8A e 8B são representativos de 3 experimentos independentes e demonstram que 110D7 é capaz de subregular Axl em uma linhagem de célula de tumor humana superexpressando Axl. Em 4 h, o anticorpo 110D7 dispara uma sub-regulagem de Axl 50% e até 84% após uma incubação de 24 h com o anticorpo 110D7.

[0286] Os resultados apresentados nas Figuras 8C e 8D são representativos de 3 experimentos diferentes e demonstram que 1003A2 é capaz de subregular Axl em uma linhagem de célula de tumor humana superexpressando Axl. Em 4 h, o anticorpo 1003A2 dispara uma sub-regulagem de Axl 66% e até 89% após uma incubação de 24 h com o anticorpo 1003A2.

[0287] Os resultados apresentados nas Figuras 8E e 8F são representativos de 3 experimentos independentes e demonstram que 1024G11 é capaz de subregular Axl em uma linhagem de célula de tumor humana superexpressando Axl. Em 4 h, o anticorpo 1024G11 dispara uma sub-regulagem de Axl 68% e até 85% após uma incubação de 24 h com o anticorpo 1024G11.

Exemplo 9: Estudo de citometria de fluxo de efeito de anticorpo anti-Axl sobre expressão de Axl de superfície celular

[0288] Técnica de citometria de fluxo permite marcação de receptor de Axl de superfície celular. O uso desta técnica pode destacar o efeito de anticorpo sobre a expressão de Axl de membrana. Células SN12C de tumor renal humanas que expressam níveis altos de Axl foram usadas neste exemplo.

[0289] Linhagem de célula de tumor SN12C foi culturada em RPMI1640 com L-glutamina 1% e 10% de FCS por 3 dias antes do experimento. As células foram então separadas usando tripsina e plaqueadas em placas de 6 multicavidades em RMPI1640 com L- glutamina 1% e FCS 5%. No dia seguinte, anticorpos de interesse foram adicionados a 10 μg/ml. Cavidades não tratadas foram também incluídas. As células são incubadas a 37° C, CO2 5%. Vinte e quatro horas depois, as células foram lavadas com PBS, separadas e incubadas com os mesmos anticorpos de interesse em tampão FACS (PBS, BSA 1%, azida de sódio 0,01%). Cavidades não tratadas foram também tingidas com o mesmo anticorpo a fim de comparar a intensidade de sinal obtida com o mesmo Mab nas células tratadas e não tratadas. As células foram incubadas por 20 minutos a 4° C e lavadas três vezes com tampão de FACS. Um anticorpo IgG anticamundongo de cabra marcado com Alexa 488 foi incubado por 20 minutos e as células foram lavadas três vezes antes de análise FACS em população de célula negativa para iodeto de propídio. A diferença entre o tingimento de um Mab na célula não tratada e na condicao tratada com o mesmo anticorpo indicou uma sub-regulagem da proteína Axl na superfície celular das células.

[0290] Dois parâmetros são determinados: (i) a porcentagem de Axl restante na superfície da célula e ii) a diferença do sinal fluorescente detectado na superfície de células tradas com 110D7, respectivamente 1003A2, 1024G11, comparado com as células tratadas com mIgG1 em 24 h. % de Axl restante é calculada como segue:% Axl restante = (MFI Mab da invenção 24 h / MFI mIgG1 24 h) x 100

[0291] Dados de um experimento representativo são apresentados na Tabela 7. Os resultados foram reproduzidos em três experimentos independentes.

[0292] A diferença de MFI entre o tingimento de um Mab na célula não tratada e a condicao tratada com o mesmo anticorpo reflete uma sub-regulagem da proteína Axl na superfície celular das células devido à ligação do Mab considerado. Condições sem anticorpo proveram resultados similares a condições na presença de anticorpo controle de isotipo (m9G4).Tabela 7

[0293] Os dados demonstram que a intensidade de fluorescência média detectada na superfície das células tratadas com 110D7 por 24 horas é reduzida (-588) comparado com os MFIs obtidos com células não tratadas marcadas com o anticorpo 110D7. Após uma incubação de 24 h com o anticorpo 110D7, 29,8% do receptor de Axl de superfície celular permanecem na superfície da célula SN12C.

[0294] Os dados demonstram que a intensidade de fluorescência média detectada na superfície das células tratadas com 1003A2 por 24 h é reduzida (-505) comparado com as MFIs obtidas com células não tratadas marcadas com o anticorpo 1003A2. Após um período de incubação de 24 h com o anticorpo 1003A2, 35% do receptor de Axl de superfície celular permanecem na superfície da célula SN12C.

[0295] Os dados demonstram que a intensidade de fluorescência média detectada na superfície das células tratadas com 1024G11 por 24 horas é reduzida (-478) comparado com as MFIs obtidas com células não tratadas marcadas com o anticorpo 1024G11. Após uma incubação de 24 h com o anticorpo 1024G11, 45,5% do receptor de Axl de superfície celular permanecem na superfície da célula SN12.

Exemplo 10: Estudo de internalização de anticorpo anti-Axl usando marcação de imunocitoquímica fluorescente

[0296] Resultados de internalização complementares são obtidos através de microscopia confocal usando método de marcação fluorescente indireto.

[0297] Em suma, linhagem de célula de tumor SN12 foi culturada em RPMI1640 com L-glutamina 1% e 10% de FCS por 3 dias antes do experimento. As células foram então separadas usando tripsina e plaqueadas em placa de 6 multicavidades contendo tampa em RPMI1640 com L-glutamina 1% e FCS 5%. No dia seguinte, o anticorpo 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G11, foi adicionado a 10 μg/ml. Células tratadas com um anticorpo irrelevante foram também incluídas. Essas células foram então incubadas por 1 h e 2 h a 37° C, CO2 5%. Para T 0 h, as células foram incubadas por 30 minutos a 4° C para determinar ligação de anticorpo à superfície celular. As células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído por 15 minutos. As células foram enxaguadas e incubadas com um anticorpo Alexa 488 IgG anticamundongo de cabra por 60 minutos a 4° C para identificar anticorpo restante na superfície celular. Para seguir penetração de anticorpo nas células, as células foram fixadas em paraformaldeído e permealizadas com saponina. Um Alexa 488 IgG anticamundongo de cabra (Invitrogen) foi usado para tingir anticorpo de ambos membrana e intracelular. Endossomas iniciais foram identificados usando um anticorpo policlonal de coelho contra EEA1 revelado com um anticorpo Alexa 555 IgG anticoelho de cabra (Invitrogen). As células foram lavadas três vezes e os núcleos foram tingidos usando Draq5. Após tingimento, as células foram montadas em meio de montagem Prolong Gold (Invitrogen) e analisadas usando um microscópio confocal Zeiss LSM 510.

[0298] As fotografias são apresentadas nas Figuras 9A-9C (110D7), 9D-9F (1003A2) e 9G-9I (1024G11).

[0299] As imagens foram obtidas através de microscopia confocal. Na presença do controle de isotipo mIgG1, nem tingimento de membrana nem marcação intracelular é observado (Figuras 9A, 9D, 9G). Uma perda progressiva da marcação anti-Axl de membrana é observada logo após 1 h de incubação das células SN12C com 110D7 (Figura 9B), respectivamente 1003A2 (Figura 9E) e 1024G11 (Figura 9H). Acúmulo intracelular do anticorpo ant-Axl 110D7 (Figura 9C), respectivamente 1003A2 (Figura 9F) e 1024G11 (Figura 9I) é mais pronunciado em 2 h. Anticorpo intracelular se co-localiza com EEA1, um marcador de endossoma inicial. Essas fotografias confirmam a internalização dos mAbs anti-Axl 110D7, 1003A2 e 1024G11 em células SN12C.

Exemplo 11: Atividade antitumoral mediada por anti-Axl in vitro Ensaio de proliferação de SN12C

[0300] Dez mil células SN12C por cavidade foram semeadas em meio livre de FCS em placas de 96 cavidades de um dia para o outro a 37° C em uma atmosfera de CO2 5%. No dia seguinte, as células foram pré-incubadas com 10 μg/ml de cada anticorpo por 1 h a 37° C. As células foram tratadas com ou sem rmGas6 (R & D Systems, No. cat. 986-GS/CF), através da adição do ligante diretamente à cavidade, e então deixadas crescer por 72 h. Proliferação foi medida seguindo incorporação de timidina 3H.

[0301] Os dados são apresentados nas Figuras 10A (110D7), 10B (1003A2) e 10C (1024G11). Nenhum efeito foi observado com o 110D7, respectivamente 1003A2 e 1024G1, que é silencioso quando adicionado a células SN12C.

Exemplo 12: Potência de citotoxidez de imunoconjugados de m110D7- saporina, 1003A2-saporina e 1024G11-saporina em várias linhagens de célula de tumor humana

[0302] No presente exemplo, é documentada a potência de citotoxidez de anticorpos 110D7, 1003A2 ou 1024G11 acoplados à saporina. Para este propósito, ensaios de citotoxidez in vitro usando um painel grande de linhagens de célula de tumor foram realizados (Figuras 11A-11K). Este painel de célula de tumor compreende várias expressões de Axl.

[0303] Em suma, 5000 células foram semeadas em placas de cultura de 96 cavidades em 100 μl de meio de cultura adequado FBS 5%. Após incubação de 24 horas em atmosfera de CO2 5% a 37° C, uma faixa de concentração do imunoconjugado (mAxl Ab-saporina ou m9G4-saporina) é aplicada às células. Placas de cultura são então incubadas a 37° C em uma incubadora de 5% de CO2 umidificada por 72 horas.

[0304] Em D4, a viabilidade celular é avaliada usando o CellTiter- Glo® Luminescent Cell Viability kit (Promega Corp., Madison, Wis.) que permite determinação do número de células viáveis em cultura baseada em quantificação da ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas. Emissões luminescentes são registradas por um dispositivo luminômetro.

[0305] Do resultado de luminescência é calculada a porcentagem de citotoxidez usando a fórmula que segue:% citotoxidez = 100- [(RLUAb-sapx 100)/RLU Sem Ab]

[0306] As Figuras 11A-11K mostram que os imunoconjugados de 110D7-saporina, 1003A2-saporina e 1024G11-saporina disparam citotoxidez nessas linhagens de tumor de célula humana diferentes. A potência do efeito de citotoxidez resultante depende da linhagem de célula de tumor humana.

Claims (31)

1. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, caracterizada pelo fato de que consiste em um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: a) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 4, 5 e 6; b) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41; c) um anticorpo compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs. 64, 65 e 66; e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 67, 68 e 69.

2. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido fragmento de ligação a antígeno é selecionado do grupo consistindo em fragmentos Fv, scFv (sc para cadeia única), Fab, F(ab’)2, Fab’, scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja a meia-vida teria sido aumentada através de modificação química, tal como a adição de poli(alquileno)glicol tal como poli(etileno)glicol ("PEGuilação") (fragmentos peguilados chamados Fv- PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab’)2-PEG ou Fab’-PEG) ("PEG" para Poli(Etileno) Glicol) ou através de incorporação em um lipossoma, os ditos fragmentos tendo pelo menos uma das CDRs do anticorpo como definido na reivindicação 1.

3. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno se liga especificamente a proteína Axl humana, preferivelmente tendo a sequência SEQ ID NO: 29 ou 30 ou uma sequência variante natural da mesma.

4. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno se liga especificamente a um epítopo localizado no domínio extracelular de proteína Axl humana, preferivelmente tendo a sequência SEQ ID NO: 31 ou 32 ou uma sequência variante natural da mesma.

5. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno se liga a seu epítopo com uma EC50 de pelo menos 10-9 M, preferivelmente entre 10-9 e 10-12 M.

6. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é capaz de ser internalizada seguindo a ligação da referida proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, a Axl.

7. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida internalização é detectada por FACS, Imunofluorescência, citometria de fluxo, Western blot, ou avaliações de citotoxidade.

8. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno induz uma Δ (MFl24h células não tratadas - MFl24h células tratadas) de pelo menos 200, preferivelmente de pelo menos 300.

9. Proteína de ligação a antígeno, ou qualquer fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é selecionada no grupo consistindo de: a) uma proteína de ligação a antígeno, ou qualquer fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 8; b) uma proteína de ligação a antígeno, ou qualquer fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 7, e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 4, 5 e 6; c) uma proteína de ligação a antígeno, ou qualquer fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 36, 37 e 38; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43; d) uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42, e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 39, 40 e 41; e) uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo as três CDRs de cadeia leve compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71; f) uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70, e as três CDRs de cadeia pesada compreendendo as sequências SEQ ID NOs: 67, 68 e 69; g) uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 8; h) uma proteína de ligação a antígeno, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 42, e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 43; e i) uma proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreendendo um domínio variável de cadeia leve de sequência SEQ ID NO: 70 e um domínio variável de cadeia pesada de sequência SEQ ID NO: 71.

10. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo multivalente, ou um anticorpo multi específico.

11. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

12. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as referidas regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas do referido anticorpo são, respectivamente, a região lambda ou kappa e a região gama-1, gama-2 ou gama-4.

13. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, , caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo em: a) o anticorpo monoclonal 110D7 derivado do hibridoma I3959 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 2 de abril de 2008, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo; b) o anticorpo monoclonal 1003A2 derivado do hibridoma I-4499 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo; c) o anticorpo monoclonal 1024G11 derivado do hibridoma I-4501 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

14. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleico sendo selecionado dentre os seguintes ácidos nucleicos: a) um ácido nucleico, selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 15 a 28, 50 a 63 e 78 a 91; b) uma sequência de ácido nucleico compreendendo as 6 sequências de ácido nucleico SEQ ID NOs: 15 a 20 ou 50 a 55 ou 78 a 83; c) uma sequência de ácido nucleico compreendendo as duas sequências de ácido nucleico SEQ ID NOs: 21 e 22 ou 56 e 57 ou 84 e 85; d) um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico como definido em a), b) ou c); e e) um ácido nucleico tendo pelo menos 18 nucleotídeos, capaz de hibridizar sob condições altamente adstringentes com uma sequência de ácido nucleico como definida em a) ou b) ou c).

15. Vetor, caracterizado pelo fato de que é composto de um ácido nucleico como definido na reivindicação 14.

16. Célula hospedeira de microrganismo transgênico, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor como definido na reivindicação 15.

17. Método de produção de uma proteína de ligação a antigeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, caracterizada pelo fato de que o referido método compreende as seguintes etapas: - o cultivo em um meio com condições indicadas de cultivo para uma célula hospedeira como definida na reivindicação 16; e - a recuperação da referida proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, então produzida a partir do meio de cultura ou a a partir da referida cultura de células.

18. Proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é para uso como um produto de endereçamento para administração de um agente citotóxico em um sítio hospedeiro alvo, o referido sítio hospedeiro alvo consistindo em um epítopo localizado no domínio extracelular de proteína Axl, preferivelmente o domínio extracelular de proteína Axl humana, mais preferivelmente o domínio extracelular de proteína Axl humana tendo a sequência SEQ ID NO: 31 ou 32 ou sequência variante natural da mesma.

19. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende a proteína de ligação a antígeno, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 conjugada a um agente citotóxico.

20. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é um fármaco, um radioisótopo, ou uma toxina.

21. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido fármaco é selecionado no grupo de nitrogênio mostarda, alquil-sulfonatos, nitrosoureia, oxazoforinas, aziridina ou iminoetilenos, antimetabolitos, antibióticos antitumor, inibidores mitóticos, inibidores da função de cromatina, agentes antiangiogênese, antiestrogênios, antiandrogênios, agentes de quelação, estimulante de absorção de ferro, inibidores de ciclo- oxigenase, inibidores de fosfodiesterase, inibidores de DNA, inibidores da síntese de DNA, estimulantes de apoptose, inibidores de timidilato, inibidores de célula T, agonistas de interferon, inibidores de ribonucleosídeo trifosfato redutase, inibidores de aromatase, antagonistas de receptor de estrogênio, inibidores de tirosina cinase, inibidores de ciclo celular, taxana, inibidores de tubulina, inibidores de angiogênese, estimulantes de macrófago, antagonistas do receptor de neuroquinina, agonista do receptor de canabinoide, agonistas do receptor de dopamina, agonistas de fator de estimulação de granulócitos, agonistas de receptor de eritropoietina, agonistas de receptor de somatostatina, agonistas de LHRH, sensibilizadores de cálcio, antagonistas de receptor de VEGF, antagonistas de receptor de interleucina, inibidores de osteoclasto, estimulantes de formação de radical, antagonistas de receptor de endotelina, vinca alcaloide, anti- hormônio e imunomoduladores.

22. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido radioisótopo é selecionado no grupo de At211, C13, N15, O17, F19, I123, I131, I125, In111, Y90, Re186, Rc188, Sm153, tc99m, Bi212, P32, Pb212, e o isótopo radioativo de Lu, gadolínio, manganês ou ferro.

23. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a referida toxina é selecionada no grupo de cadeia A da difteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, dolastatinas, auristatinas, CC1065, e os derivados dessas toxinas.

24. Imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o referido imunoconjugado ainda compreende um ligante.

25. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é um ligante clivável ou não clivável.

26. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido ligante clivável é um ligante ácido-lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou um ligante contendo dissulfeto.

27. Uso do imunoconjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 26, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratamento de câncer.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é um câncer relacionado com Axl, células tumorais expressando ou superexpressando toda ou parte da proteína Axl em sua superfície notadamente.

29. Uso de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado de câncer de mama, cólon, carcinoma esofageal, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmão, melanoma, osteossarcoma, ovariano, próstata, rabdomiossarcoma, renal, tireoide, e endometrial uterino.

30. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 25 e pelo menos um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

31. Hibridoma murino, caracterizado pelo fato de que é selecionado de: a) o hibridoma de murino I-3959 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 2 de abril de 2008; b) o hibridoma de murino I-4499 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011; c) o hibridoma de murino I-4501 depositado no CNCM, Institut Pasteur, França, em 28 de julho de 2011.

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