ES2632748T3

ES2632748T3 - Anticuerpos anti-C4.4a y usos de los mismos

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Publication number: ES2632748T3
Application number: ES10798996.4T
Authority: ES
Inventors: Lars Linden; Yong-Jiang Cao; Gabriele Leder; Beatrix Stelte-Ludwig; Axel Harrenga; Ricarda Finnern; Frank Dittmer; Anke Mayer-Bartschmid; Juergen Franz; Simone Greven; Jörg WILLUDA; Jan Tebbe
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: JP5989544B2; TW201134485A; EP3144323A3; NZ600470A; JP6240696B2; IN2012DN05175A; RS56161B1; TWI488642B; PT2510012T; US20170158775A1; EP2510012A1; CN102812047B; RU2577977C2; HUE034847T2; US20120321619A1; LT2510012T; JP2016104820A; KR20120116958A; HRP20170973T1; EP3144323A2

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de forma específica a los aminoácidos 1 - 85 de la SEQ ID NO:1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se internaliza después de la unión a células que expresan C4.4a, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias variables de CDR de la cadena pesada: H-CDR1 que comprende la SEQ ID NO:45, H-CDR2 que comprende la SEQ ID NO:46 y H-CDR3 que comprende la SEQ ID NO:47, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias variables de CDR de la cadena ligera: L-CDR1 que comprende la SEQ ID NO:48, L-CDR2 que comprende la SEQ ID NO:49, y L-CDR3 que comprende la SEQ ID NO:50.

Description

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como un anticuerpo que tiene una secuencia obtenida, por completo o en parte, in silico de secuencias sintéticas que son a base de los análisis de secuencias de anticuerpos humanos conocidas. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo humano, o un fragmento del mismo, se puede conseguir mediante, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias de anticuerpo humano o de fragmento de anticuerpo, e ideando una secuencia polipeptídica utilizando los datos obtenidos de ellas. Otro ejemplo de un anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es uno que codifica un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpo de origen humano (por ejemplo, estando tal biblioteca basada en anticuerpos tomados de una fuente natural humana). Los ejemplos de anticuerpos humanos incluyen anticuerpos como se describe en Söderlind y col., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.

Un “anticuerpo humanizado”, o fragmento de unión a antígeno humanizado del mismo, se define en el presente documento como uno que se (i) obtiene de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico que porta un sistema inmunitario heterólogo), en el que el anticuerpo está basado en una secuencia de línea germinal humana;

(ii) en donde los aminoácidos de las regiones marco conservadas de un anticuerpo humano están parcialmente intercambiadas con las secuencias de aminoácidos humanas mediante ingeniería genética es o (iii) está injertado con CDR, en el que las CDR del dominio variable son de origen no humano, mientras que un o más armazones del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (en su caso) es de origen humano.

En el presente documento, un “anticuerpo quimérico”, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se define como uno en el que los dominios variables se obtienen de un origen no humano y algunos o todos los dominios constantes se obtienen de un origen humano.

La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por lo tanto, el término “monoclonal” indica que la naturaleza del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos distintos. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido frente un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en cuando a que normalmente no están contaminadas con otras inmunoglobulinas. El término “monoclonal” no debe interpretarse como que se requiere la producción del anticuerpo mediante algún procedimiento particular. La expresión anticuerpo monoclonal incluye de forma específica anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.

Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo que “se une de forma específica a”, es “específico de/para”

o “reconoce de forma específica” un antígeno de interés, por ejemplo una diana antigénica polipeptídica asociada con tumor (en el presente documento, C4.4a), es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad, de forma tal que el anticuerpo es útil como agente terapéutico en cuanto a que está dirigido a un tejido o célula que expresa el antígeno, y reacciona de forma cruzada de forma significativa con otras proteínas o no reacciona de forma cruzada con proteínas que no son ortólogas y variantes (por ejemplo, formas mutantes, variantes de corte y empalme o formas truncadas de forma proteolítica) de la diana antigénica mencionada anteriormente. La expresión “reconoce de forma específica” o “se une de forma específica a” o es “específico de/para” un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular, como se utiliza en el presente documento, puede estar presentada por, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una KD monovalente por el antígeno inferior a aproximadamente 10-4 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-5 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-6 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-7 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-8 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-9 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-10 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-11 M, como alternativa inferior a aproximadamente 10-12 M, o menos. Un anticuerpo “se une de forma específica a”, es “específico de/para” o “reconoce de forma específica” un antígeno si tal anticuerpo tiene la capacidad de discriminar entre tal antígeno y uno o más antígeno(s) de referencia. En su forma más general, “unión específica”, “se une de forma específica a”, es “específico de/para” o “reconoce de forma específica” se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, como se determina, por ejemplo, en conformidad con uno de los procedimientos siguientes. Dichos procedimientos comprenden, pero sin limitación, transferencias tipo Western, pruebas de ELISA, RIA, ECL, IRMA y barridos peptídicos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo ELISA convencional. La valoración se puede llevar a cabo mediante desarrollo de color convencional (por ejemplo, anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano picante y bencidina de tetrametilo con peróxido de hidrógeno). La reacción en determinados pocillos se puntúa mediante la densidad óptica, por ejemplo a 450 nM. El fondo típico (= reacción negativa) puede ser una DO de 0,1; la reacción positiva típica puede ser una DO de 1. Esto significa que la diferencia positivo/negativo es de más de 5 veces, 10 veces, 50 veces y, preferentemente, de más de 100 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza utilizando no un único antígeno de referencia sino un grupo de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tal como leche en polvo, BSA, transferrina o similares.

“Afinidad de unión” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula y su compañero de unión. A menos que se indique otra cosa, como se utiliza en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1: 1 entre los

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fragmentos de anticuerpos (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Se entiende que un anticuerpo que no es un anticuerpo “multiespecífico” o “multifuncional” tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. El F(ab’)2 o Fab puede diseñarse por ingeniería para minimizar o eliminar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL.

Un anticuerpo de la invención puede obtenerse de una biblioteca de anticuerpos recombinante que sea a base de secuencias de aminoácidos que se han aislado de los anticuerpos de un gran número de voluntarios sanos. Utilizando la tecnología n-CoDeR®, las CRD completamente humanas se recombinan en nuevas moléculas de anticuerpo. El procedimiento de recombinación exclusivo permite que la biblioteca contenga una variedad más amplia de anticuerpos de lo que podría haber creado de forma natural el sistema inmunitario humano.

Como se utiliza en el presente documento, se definen ‘formas’ distintas de antígeno, por ejemplo C4.4a, en el presente documento como distintas moléculas de proteínas resultantes de distintas modificaciones traduccionales y postraduccionales, tales como, pero sin limitación, diferencias en el corte y empalme del tránscrito primario de C4.4a, diferencias en la glucosilación y diferencias en la escisión proteolítica postraduccional. Como se utiliza en el presente documento, el término ‘epítopo’ incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de forma específica a una inmunoglobulina o receptores de células T. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie activas de forma química, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, o combinaciones de las mismas, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos ‘se unen al mismo epítopo’ si se muestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitivo, mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia.

Un “anticuerpo aislado” es uno que se ha identificado y separado de un componente de la célula que lo ha expresado. Los componentes contaminantes de la célula son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferentes, el anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95 % en peso del anticuerpo, como se determina mediante, por ejemplo, el método de Lowry, espectroscopia UV-Vis o mediante electroforesis en gel SDScapilar (por ejemplo en un Caliper LabChip GXII, GX 90 o dispositivo Biorad Bioanalyzer) y en realizaciones preferentes adicionales más del 99 % en peso, (2) hasta un punto suficiente como para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, de plata. Anticuerpo de origen natural aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, habitualmente el anticuerpo aislado se preparará al menos mediante una etapa de purificación.

La “citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos” o “CCDA” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida a receptores Fc gamma (FcγR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células NK, neutrófilos y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan de forma específica a una célula diana portadora de antígeno y, posteriormente, destruyan la célula diana, por ejemplo con citotoxinas. Para evaluar la actividad CCDA de un anticuerpo de interés se puede realizar un ensayo de CCDA in vitro, tal como el descrito en la patente de Estados Unidos nº 5.500.362 o 5.821.337 o la patente de Estados Unidos nº 6.737.056 (Presta). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen CMSP y linfocitos NK.

“Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemente se puede realizar un ensayo CDC, como el descrito en, por ejemplo Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Las variantes polipeptídicas con las secuencias de aminoácidos de la región Fc modificadas (polipéptidos con una región Fc variante) y unión a C1q aumentada o disminuida se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 6.194.551 B1 y el documento WO 1999/51642.

El término inmunoconjugado (denominado de forma indistinta como “conjugado anticuerpo-fármaco” o “CAF”) se refiere a un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina proteica, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, fragmentos de los mismos) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Los inmunoconjugados se han utilizado para la entrega local de agentes citotóxicos, es decir, fármacos que destruyen o que inhiben el crecimiento o la proliferación de células, en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, Liu y col., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623)). Los inmunoconjugados permiten la entrega dirigida de una fracción de fármaco en un tumor, y la acumulación intracelular allí, en donde la administración sistémica de fármacos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad en células y/o tejidos normales. Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina. Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos que incluyen la unión a

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tubulina, la unión a ADN o la inhibición de topoisomerasa.

“Porcentaje (%) de identidad de secuencia” con respecto a una secuencia polinucleotídica o polipeptídica de referencia, respectivamente, se define como el porcentaje de restos de ácido nucleico o de aminoácido, respectivamente, en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia polinucleotídica o polipeptídica de referencia, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Las sustituciones conservadoras no se consideran parte de la identidad de secuencia. Son preferentes los alineamientos sin huecos. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diversos modos dentro de la experiencia en la técnica utilizando, por ejemplo, un programa informático disponible públicamente tal como los programas informáticos BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se están comparando.

Anticuerpos de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para inhibir el crecimiento de células cancerosas positivas para C4.4a y la evolución de la enfermedad neoplásica proporcionando anticuerpos anti-C4.4a. Se proporcionan anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos y variantes de los anticuerpos y fragmentos, que se unen de forma específica al polipéptido C4.4a humano de 29 kDa (SEQ ID NO: 1, o fragmentos de la misma). Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o variantes de los mismos se unen de forma específica al dominio extracelular S1 del polipéptido C4.4a. En el presente documento, el polipéptido C4.4a se denomina ‘C4.4ª’.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se internalizan en una célula que expresa C4.4a tras la unión del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a la célula mencionada anteriormente. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, compiten en la unión a C4.4a con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, compiten en la unión a C4.4a humana con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, compiten en la unión a C4.4a humana y de roedor con los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, una realización adicional preferente es una en la que C4.4a de roedor es C4.4a de ratón.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada o ligera que son al menos el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a al menos una, preferentemente que corresponden con, secuencia de CDR como se representa en la tabla 7, o que comprenden secuencias variables de cadena pesada o ligera que son al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a una secuencia de VH o VL representada en la tabla 7, respectivamente.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera que son, al menos, el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a al menos una, preferentemente que corresponde con, secuencia de CDR de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, respectivamente.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera que son, al menos, el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las, preferentemente que corresponde con, secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, respectivamente.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de la CDR2 y 3 de la cadena pesada que son, al menos, el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias de la CDR2 y 3 de la cadena pesada, y secuencias de la CDR1 y 3 de la cadena ligera que son al menos el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias de la CDR1 y 3 de la cadena ligera de los anticuerpos M31-B01. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de la CDR2 y 3 de la cadena pesada que son, al menos, el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias de la CDR2 y 3 de la cadena pesada y secuencias de la CDR1 y 3 de la cadena ligera que son al menos el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a las secuencias de la CDR1 y 3 de la cadena ligera de los anticuerpos M20-D02 S-A.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una secuencia variable de cadena pesada que es al menos del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a una secuencia de VH desvelada en la tabla 7 o la tabla 4, preferentemente de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los

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anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una secuencia variable de cadena ligera que es al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a una secuencia de VL desvelada en la tabla 7 o la tabla 3, preferentemente de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias variables de cadena pesada y de cadena ligera que son al menos el 50 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o 95 % idénticas a la secuencia VH y VL de los anticuerpos M31-B01 o M20-D02 S-A, respectivamente.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden secuencias de CDR de cadena pesada y ligera que se adaptan a las secuencias consenso de CDR obtenidas, preferentemente correspondientes, de M31-B01 o M20-D02 S-A, como se representa en la tabla 15. Una realización adicional preferente de la presente divulgación son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de CDR de cadena pesada que se adaptan a las correspondientes secuencias de CDR de cadena pesada como se representan en las secuencias consenso SEQ ID NO: 297 (CDR H1), SEQ ID NO: 298 (CDR H2) y SEQ ID NO: 299 (CDR H3), y las secuencias de CDR de cadena ligera de acuerdo con las correspondientes secuencias de CDR de cadena ligera como se representa por las secuencias consenso SEQ ID NO: 300 (CDR L1), SEQ ID NO: 22 (CDR L2) y SEQ ID NO: 301 (CDR L3), o que comprenden las secuencias de la CDR de cadena pesada de acuerdo con las correspondientes secuencias de la CDR de cadena pesada como se representa por las secuencias consenso SEQ ID NO: 302 (CDR H1), SEQ ID NO: 303 (CDR H2) y SEQ ID NO: 304 (CDR H3), y las secuencias de CDR de cadena ligera de acuerdo con las correspondientes secuencias de CDR de cadena ligera como se representa por las secuencias consenso SEQ ID NO: 305 (CDR L1), SEQ ID NO: 306 (CDR L2) y la SEQ ID NO: 307 (CDR L3).

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden al menos una, preferentemente correspondientes, secuencia de CDR de cadena pesada y/o ligera como se desvela en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, o, preferentemente, de un anticuerpo tal como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis, preferentemente correspondientes, secuencias de CDR de cadena pesada y ligera como se desvela en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, o, preferentemente, de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4. En una realización adicional preferente , los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias de la CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR1 y CDR2 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR1 y CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR2 y CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla o las tablas 3 y 4. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 y CDR2 y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1, CDR2, CDR3 de un anticuerpo, como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias de la CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR1 y CDR2 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR1 y CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4, las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y

4. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de un anticuerpo como se representa en la tabla 7 o las tablas 3 y 4.

En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden una secuencia de VH y/o VL desvelada en la tabla 7 o las tablas 3 y 4. En una realización adicional preferente de la presente divulgación, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno comprenden la secuencia de VH y VL de un anticuerpo representada en la tabla 7 o las tablas 3 y 4.

En una realización preferente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención son monoclonales. En una realización adicional preferente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de la invención son humanos, humanizados o quiméricos.

Las variantes de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno contemplados en la divulgación son moléculas en las cuales se mantiene la actividad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión al antígeno para C4.4a. En una realización preferente de la presente divulgación, las variantes compiten en la unión a C4.4a con un anticuerpo representado en la tabla 7, preferentemente con el anticuerpo M31-B01 o M20-D02 S-A.

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antígeno).

La tabla 1 proporciona un resumen de las constantes de disociación de anticuerpos representativos de la divulgación, determinadas mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) sobre C4.4a humana o murina inmovilizada de forma directa.

Tabla 1: Constantes de disociación monovalentes determinadas para IgG1 anti-C4.4a mediante resonancia de plasmón superficial

C4.4a humana: C4.4a de ratón

Anticuerpo (IgG1): KD [M] KD [M]

M31-B01: 7,0 x 10-8 1,3 x 10-7

M20-D02 S-A: 2,2 x 10-7 1,8 x 10-7

B01-3: 6,0 x 10-8 1,2 x 10-7

B01-5: 4 x 10-9 1 x 10-8

B01-7: 7 x 10-9 9 x 10-9

B01-10: 4 x 10-9 1 x 10-9

B01-12: 1 x 10-9 2 x 10-9

D02-4: 2,9 x 10-8 5,6 x 10-8

D02-6: 6 x 10-9 2,1 x 10-8

D02-7: 9 x 10-9 2,2 x 10-8

D02-11: 1 x 10-8 2,4 x 10-8

D02-13: 2 x 10-9 4,2 x 10-8

El formato de IgG1 se usó para la determinación de la afinidad basada en células mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS) combinada con análisis Scatchard. La Figura 3 f) indica la fuerza de unión de

10 anticuerpos IgG representativos en células tumorales A549 transfectadas que expresan C4.4a y células tumorales que expresan C4.4a de forma endógena. La Tabla 8 proporciona un resumen de fuerza de la unión (CE50) de anticuerpos IgG representativos en células CHO-S:mC4.4a murinas transfectadas y células tumorales NCI H292 que expresan C4.4a de forma endógena.

Tabla 8: Valores CE50 determinados para IgG1 anti-C4.4a mediante FACS

C4.4a:CHO de ratón: NCI H292

Anticuerpo (IgG1): CE50 [M] CE50 [M]

M31-B01: 1,9 x 10-9 3 x 10-10

M20-D02 S-A: 1,6 x 10-9 1,3 x 10-9

B01-3: 3,6 x 10-10 6 x 10-11

B01-5: 1,2 x 10-9 5 x 10-11

B01-7: 5,7 x 10-10 6 x 10-11

B01-10: 4,3 x 10-10 1 x 10-10

B01-12: 1,4 x 10-9 Nd

D02-6: 1 x 10-9 2 x 10-11

D02-7: 7,8 x 10-10 3 x 10-11

D02-11: 1,7 x 10-9 1 x 10-11

D02-13: 2 x 10-9 1,2 x 10-10

nd=no determinado

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Se dice que una IgG1 tiene una “afinidad elevada” por un antígeno si la medición de la afinidad mediante FACS es inferior a 100 nM (afinidad aparente de IgG). Preferentemente, un anticuerpo bivalente desvelado, o fragmento de unión a antígeno, puede unirse a C4.4a humana con una afinidad inferior a 100 nM, más preferentemente inferior a 50 nM, y todavía más preferentemente inferior a 10 nM. Otros preferentes son anticuerpos bivalentes que se unen a 20 C4.4a con una afinidad inferior a 5 nM, y más preferentemente inferior a 1 nM, determinada como la afinidad aparente de una IgG respecto a C4.4a humana. Por ejemplo, la afinidad aparente de un anticuerpo de la divulgación

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Tabla: 4: Secuencias VH

Secuencias VH

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Una realización adicional preferente de la divulgación es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que las secuencias de CDR se seleccionan como se muestra en la tabla 7.

Una realización adicional preferente de la divulgación es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el que las secuencias VH y VL se seleccionan como se muestra en la tabla 7. El experto en la materia puede utilizar los datos en las Tablas 3, 4 y 7 para diseñar variantes peptídicas. Es preferente que las variantes se construyan cambiando los aminoácidos dentro de una o más regiones de CDR; además, una variante podría tener una o más regiones marco conservadas modificadas. También se pueden hacer modificaciones en las regiones marco conservadas. Por ejemplo, podría modificarse un dominio de FR peptídico cuando exista una desviación en un resto en comparación con una secuencia de línea germinal.

Con referencia a una comparación de los anticuerpos nuevos con respecto a las correspondientes secuencias consenso, las cuales se enumeran en las Tablas 3 y 4, los restos candidatos que se pueden cambiar incluyen, por ejemplo, el resto 42 de la cadena pesada variable de M20-D02 S-A en comparación con VHIII del gen DP47. Como alternativa, el experto podría hacer el mismo análisis mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias conocidas de la misma clase de tales antibióticos, utilizando, por ejemplo, el procedimiento descrito por Knappik, A., y col. JMB 2000, 296:57-86.

Además, se pueden obtener variantes utilizando un anticuerpo como punto de partida para la optimización, diversificando de uno o más restos de aminoácido en el anticuerpo, preferentemente restos de aminoácido en una o más CDR, y explorando la colección resultante de variantes de anticuerpos para variantes con propiedades mejoradas. Es particularmente preferente la diversificación de uno o más restos de aminoácido en la CDR3 de VL y/o VH. La diversificación se puede realizar sintetizando de una colección de moléculas de ADN utilizando tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (MTRI) (Virnekäs, B, y col., Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600.). Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen moléculas con modificaciones/variaciones que incluyen, pero sin limitación, modificaciones que conducen a una semivida modificada (por ejemplo, modificación de la porción Fc o unión de moléculas adicionales tales como PEG) o a una actividad CCDA o CDC modificada.

Variantes conservativas de aminoácidos

Se pueden fabricar variantes polipeptídicas que conserven la estructura molecular global de una secuencia peptídica del anticuerpo descrita en el presente documento. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales, el experto reconocerá algunas sustituciones racionales. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos, es decir “sustituciones conservativas”, por ejemplo a base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los restos implicados.

Por ejemplo, (a) los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína,

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En segundo lugar, la sonda en exceso se elimina mediante lavado. Es en esta fase en la habitualmente se aplican las condiciones más rigurosas. Por lo tanto, es esta etapa de “lavado” la que más importante para determinar la relación a través de hibridación. Normalmente, las soluciones de lavado contienen concentraciones menores de sales. Una solución de rigurosidad media ejemplar contiene SSC 2X y SDS al 0,1 %. Una solución de lavado de alta rigurosidad contiene el equivalente (en fuerza iónica) de menos de aproximadamente SSC 0,2X, con una solución rigurosa preferente que contiene aproximadamente SSC 0,1X. Las temperaturas asociadas con diversas rigurosidades son las mismas que las discutidas anteriormente para la “unión”. Además, normalmente la solución de lavado se cambia varias veces durante el lavado. Por ejemplo, las condiciones típicas de lavado de alta rigurosidad comprenden lavar dos veces durante 30 minutos a 55 ºC y tres veces durante 15 minutos a 60 ºC.

Una realización de la divulgación es una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica (i) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación, las secuencias de CDR como se representan en la tabla 7 o (ii) las secuencias variables de la cadena ligera y pesada como se representan en la tabla 7, o (iii) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación, las secuencias de CDR que se representan en la tabla 7 o las secuencias variables de la cadena ligera y pesada que se representan en la tabla 7.

Variantes equivalentes de forma funcional

Puede describirse otra clase más de variantes de ADN dentro del ámbito de la divulgación con referencia al producto que codifican. Estos polinucleótidos equivalentes de forma funcional se caracterizan por el hecho de que codifican las mismas secuencias peptídicas que se encuentran en las SEQ ID NO: 5-36, 45-50, 55-60, 65-70, 75-80, 85-90, 95-100, 105-110, 115-120, 125-130, 135-140, debido a la degeneración del código genético.

Se ha reconocido que las variantes de las moléculas de ADN proporcionadas en el presente documento se pueden construir de varios modos distintos. Por ejemplo, se pueden construir como ADN completamente sintéticos. Los procedimientos para sintetizar de forma eficaz oligonucleótidos en el intervalo de 20 a aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente disponibles. Véase Ausubel y col., sección 2.11, suplemento 21 (1993). Los oligonucleótidos solapantes se pueden sintetizar y ensamblar de un modo comunicado por primera vez por Khorana y col., J. Mol. BioI. 72:209-217 (1971); véase también Ausubel y col., citado anteriormente, Sección 8.2. Preferentemente, los ADN sintéticos se diseñan con sitios de restricción convenientes modificados por ingeniería en los extremos 5’ y 3’ del gen, para facilitar la clonación en un vector apropiado.

Como se ha indicado, un procedimiento para generar variantes es comenzar con uno de los ADN desvelados en el presente documento y, después, realizar mutagénesis dirigida. Véase Ausubel y col., citado anteriormente, sección 8, suplemento 37 (1997). En un procedimiento típico, se clona un ADN diana en un vehículo de bacteriófago de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se aísla e hibrida con un oligonucleótido que contiene la alteración (o alteraciones) nucleotídica(s) deseada(s). Se sintetiza la hebra complementaria y el fago bicatenario se introduce en un hospedador. Alguna de la progenie resultante contendrá el mutante deseado, lo que se puede confirmar utilizando secuenciación de ADN. Además, están disponibles diversos procedimientos que aumentan la probabilidad de que el fago progenie sea el mutante deseado. Estos procedimientos son bien conocidos para los expertos en la materia y hay disponibles de forma comercial kits para generar tales mutantes.

Construcciones y expresión de ADN recombinante

La divulgación proporciona construcciones de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias nucleotídicas de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la divulgación se utilizan en relación a un vector, tal como un plásmido, fagémido, fago o vector vírico, en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención.

Un anticuerpo, porción de unión a antígeno o derivado del mismo, proporcionado en el presente documento, se puede preparar mediante expresión recombinante de secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas ligera y pesada, o porciones de las mismas, en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo, porción de unión a antígeno o derivado del mismo de forma recombinante, se puede transfectar una célula hospedadora con uno o más vectores de expresión recombinante que porten fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y/o pesada, o porciones de las mismas, de forma tal que las cadenas ligera y pesada se expresen en la célula hospedadora. Para preparar y/u obtener ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera, para incorporar estos ácidos nucleicos en vectores de expresión recombinantes y para introducir los vectores en células hospedadoras, se utilizan metodologías convencionales de ADN recombinante tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. y col. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la patente de Estados Unidos nº 4.816.397 de Boss y col.

Además, las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y/o ligera se pueden convertir en, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican cadenas de anticuerpo de longitud completa, fragmentos Fab o en scFv. El fragmento de ADN que codifica VL o VH se puede unir de forma operativa (de modo tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN estén en marco) a otro

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placas sustrato rojo amplex 10 µM (Invitrogen, A12222) y la señal de fluorescencia se detectó utilizando un lector de fluorescencia normal, por ejemplo Tecan Ultra. La cantidad de señales de afinidad normalizadas se calculó como las proporciones de las señales de afinidad y de cuantificación corregidas con el fondo en los respectivos ELISA: (señal de afinidad – afinidad de fondo) / (cantidad de señal-cantidad de fondo). Los valores resultantes correlacionan

5 principalmente con la afinidad de una manera positiva, mientras que los valores no normalizados correlacionan de forma adicional con la concentración del Fab de unión en la muestra. Por lo tanto, la cantidad de las señales de afinidad normalizadas sirve como una orientación muy buena para la determinación de las variantes con afinidad mejorada.

Ejemplo 12: Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples

10 En las Tablas 10a y 10b se proporcionan varios ejemplos de sustituciones de aminoácido únicas generadas en las cadenas pesada y ligera de M20-D02 S-A. HC D101K, LC A90Q, LC V97A y LC V97G mostraron la mejora más fuerte con respecto a las señales de afinidad normalizadas en C4.4a humana, con una señal correspondiente en C4.4a de ratón de al menos 1/8 en comparación con la señal en C4.4a humana (Tabla 10a). Más allá de las dos sustituciones de CDR3, HC D31S y HC V51I mostraron la mejora más fuerte con respecto a las señales de afinidad

15 normalizadas en C4.4a humana, con una señal correspondiente en C4.4a de ratón del 30 % en el caso de HC V51I (Tabla 10b).

Tabla 10a. Análisis de sustituciones de aminoácido únicas dentro de la CDR3 de las cadenas pesada y ligera de M20-D02 S-A. Se enumeran las señales de afinidad normalizadas en C4.4a humana y de ratón, el promedio y las respectivas desviaciones típicas de dos mediciones al menos por cuadruplicado.

20 Tabla 10a:

humana: de ratón

pos: en la SEQ ID NO: pos en la SEQ ID NO: Nombre promedio desv. típ. promedio desv. típ.

9: 14 105 34 HC S100aR 0,43 0,13 0,02 0,01

9: 14 105 34 HC S100aK 0,45 0,21 0,06 0,01

10: 14 106 34 HC A100bR 0,87 0,21 0,01 0,01

10: 14 106 34 HC A100bS 0,34 0,17 0,02 0,00

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14: 110 34 HC D101E 0,31 0,24 0,05 0,00

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14: 110 34 HC D101K 1,65 0,48 0,21 0,09

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14: 110 34 HC D101R 0,61 0,18 0,03 0,01

3: 26 91 30 LC A90Q 1,41 0,67 0,29 0,15

3: 26 91 30 LC A90R 0,94 0,47 0,17 0,04

5: 26 93 30 LC D92G 0,64 0,25 0,10 0,04

9: 26 97 30 LC N95aW 0,11 0,06 0,00 0,01

12: 26 100 30 LC V97A 1,32 0,21 0,52 0,11

12: 26 100 30 LC V97G 1,21 0,31 0,30 0,13

34 – VH 30 -VL: M20-D02 S-A 0,04 0,03 0,01 0,01

Tabla 10b. Análisis de sustituciones aminoácidos únicas más allá de la CDR3 de las cadenas pesada y ligera de M20-D02 S-A. Se enumeran las señales de afinidad normalizadas en C4.4a humana y murina, respectivamente; los números proporcionados son las medianas de una medición por cuadruplicado. La diferencia entre el procedimiento B y el A es una etapa de incubación adicional en tampón durante 90 min en el procedimiento B.

Tabla 10b:

proceso A: proceso B

pos: en la SEQ ID NO: pos en la SEQ ID NO: nombre humana ratón humana ratón

3: 6 31 34 HC D31S 0,84 0,04

4: 10 51 34 HC V51I 0,52 0,16

9: 10 56 34 HC A55G 0,15 0,04

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10: 57 34 HC R56S 0,21 0,06

34 -VH 30 -VL: M20-D02 S-A 0,15 0,04 0,06 0,00

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Ejemplo 15: Inhibición de la proliferación dependiente de anticuerpos -Proliferación celular medida mediante el sistema xCELLigence

El sistema xCELLigence (analizador RTCA nº de cat. 05228972001, Roche) controla los acontecimientos celulares en tiempo real sin incorporar marcadores. El sistema mide la impedancia eléctrica a través de microelectrodos 5 interdigitados integrados en el fondo de placas E de cultivo tisular. La medición de la impedancia proporciona información cuantitativa sobre el estado biológico de las células, incluyendo el número, la viabilidad y la morfología de las células. Para determinar la velocidad de la proliferación celular de las células A549:hC4.4a, estas se incubaron con un anticuerpo control de isotipo IgG1h de no unión o B01-3 100 nM (como IgG1h). En primer lugar, a cada pocillo de una placa E 96 se añadieron 50 µl de medio de cultivo celular (RPMI (Biochrom FG1640) + SFB al 10 10 % (Biochrom n.º S0145) + Puromicina 1 µg/ml (Sigma 8833)). La placa E 96 se introdujo en la estación RTCA MP (nº de cat. 05331625001, Roche) y se determinó la impedancia del fondo de cada pocillo. Las soluciones se retiraron de nuevo de la placa E 96 y se añadieron 50 µl de la suspensión celular a los pocillos (5000 células/pocillo de A549:hC4.4a en un medio de cultivo celular). Se volvieron a introducir las placas y se midieron durante 4 horas a 37 ºC + CO2 al 5 %. La placa E 96 se retiró de nuevo y se añadieron 100 µl de anticuerpos (B01-3 100 nM o IgG1h 15 de control de no unión) en medio de cultivo celular. Todas las muestras se procesaron por triplicado. Después de la reintroducción de la placa E, la medición se realizó durante 92 horas a 37 ºC + CO2 al 5 %. Los resultados se analizaron con el paquete de programa informático integrado. Los resultados se representan en la Figura 6. El anticuerpo B01-3 claramente disminuye la proliferación celular en comparación con un anticuerpo de control de no unión. Esto muestra que los anticuerpos de la invención inhiben de forma eficaz la proliferación celular de las células 20 que expresan C4.4a.

Tabla 7: Secuencias de anticuerpos

Anticuerpo: SEQ ID NO: HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO:HCDR3 SEQ ID NO :LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO: VHProteína SEQ ID NO: VLProteína SEQ ID NO: VH Nucleótido SEQ ID NO: VLNucleótido

M31-B01: 5 9 13 17 21 25 33 29 41 37

M20-D02 S-A: 6 10 14 18 22 26 34 30 42 38

M60-G03: 7 11 15 19 23 27 35 31 43 39

M36-H02: 8 12 16 20 24 28 36 32 44 40

B01-3: 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

B01-5: 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64

B01-7: 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74

B01-10: 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

B01-12: 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94

D02-4: 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104

D02-6: 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114

D02-7: 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124

D02-11: 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134

D02-13: 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144

B01-nn1: 145 146 147 148 149 150 151 152 308 309

B01-nn2: 153 154 155 156 157 158 159 160 310 311

B01-nn3: 161 162 163 164 165 166 167 168 312 313

B01-nn4: 169 170 171 172 173 174 175 176 314 315

B01-nn5: 177 178 179 180 181 182 183 184 316 317

B01-2: 185 186 187 188 189 190 191 192 318 319

B01-4: 193 194 195 196 197 198 199 200 320 321

B01-6: 201 202 203 204 205 206 207 208 322 323

B01-8: 209 210 211 212 213 214 215 216 324 325

B01-9: 217 218 219 220 221 222 223 224 326 327

B01-11: 225 226 227 228 229 230 231 232 328 329

B01-12: 233 234 235 236 237 238 239 240 330 331

D02-ogl: 241 242 243 244 245 246 247 248 332 333

D02-5: 249 250 251 252 253 254 255 256 334 335

D02-8: 257 258 259 260 261 262 263 264 336 337

D02-9: 265 266 267 268 269 270 271 272 338 339

D02-10: 273 274 275 276 277 278 279 280 340 341

D02-11: 281 282 283 284 285 286 287 288 342 343

D02-12: 289 290 291 292 293 294 295 296 344 345

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Claims

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