CN102812047B

CN102812047B - 抗C4.4a抗体及其用途

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Publication number: CN102812047B
Application number: CN201080063444.XA
Authority: CN
Inventors: L.林登; 曹永江; G.莱德; B.施泰尔特-路德维希; A.哈伦加; R.芬纳恩; F.迪特默; A.迈耶-巴特施密德; J.弗兰茨; S.格雷文; J.维卢达; J.特比
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2009-12-09
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: TWI488642B; PT2510012T; ZA201203498B; JP2016104820A; CN102812047A; KR101931820B1; AU2010329904A1; JP2013513369A; PL2510012T3; HRP20170973T1; IL219801A0; EP2510012B1; ES2632748T3; HUE034847T2; EP2510012A1; AU2010329904B2; IN2012DN05175A; CA2783338A1; EP3144323A3; LT2510012T

Abstract

本发明提供重组抗原结合区以及含有所述抗原结合区的抗体和功能片段，其对膜锚定的29kDa的C4.4a多肽具有特异性，所述多肽在若干肿瘤例如肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和乳腺癌中过量表达。因此，这些抗体可用于治疗这些和其它病症和病况。本发明的抗体还可用于诊断领域，以及用于进一步研究C4.4a在癌症相关病症进程中的作用。本发明还提供编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和附有使用说明书的药盒。

Description

抗C4.4a抗体及其用途

本发明提供重组抗原结合区以及含有所述抗原结合区的抗体和功能片段，其对命名为C4.4a的29 kDa膜锚定多肽具有特异性，所述C4.4a在肿瘤中过量表达。

此外，它在这些癌症类型的转移中具有高丰度。因此，该抗体可用于治疗这些和其它病症和病况。本发明的抗体还可用于诊断领域，以及用于进一步研究C4.4a在癌症相关病症进程中的作用。本发明还提供编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和附有使用说明书的药盒。

发明背景

基于抗体的疗法证明在治疗包括实体瘤在内的各种癌症中非常有效。例如，HERCEPTIN®已被成功用于治疗乳腺癌，RITUXAN®在B细胞相关癌症类型中是有效的。开发成功的基于抗体的疗法的重点是针对所发现的在肿瘤细胞上优先表达的细胞表面蛋白的抗体分离。C4.4a (基因名：LYPD3)多肽是一种糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定的高度糖基化的细胞表面蛋白。大鼠C4.4a最早被描述为在大鼠胰腺肿瘤细胞转移过程中的转移相关的细胞表面蛋白(Rösel M.等，Oncogene 1998, 17(15):1989-2002)。从胎盘cDNA文库中克隆人C4.4a (Würfel, J.等，Gene 2001,262:35-41)。C4.4a显示与uPAR受体有结构同源性，并且含有2个LY6结构域，显示出典型的3指蛋白质折叠(three finger protein fold) (Jacobsen B.和Ploug M.，Current Medicinal Chemistry 2008，15:2559-2573)。该蛋白质是高度糖基化的，含有6个预测的N-糖基化位点和若干O-糖基化位点。此外，C4.4a共含有9个位于2个Ly6结构域上的二硫键(Hansen L.等, Biochem J. 2004，380:845-857)。在以下肿瘤细胞中C4.4a显示强表达，如肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌和黑素瘤。RNA印迹分析表明，C4.4a在约50%的原发性肺肿瘤和约75%的肺肿瘤转移中表达，然而在未患病肺组织中未检出表达(Würfel J.等, Gene 2001, 262:35-41)。在非小细胞肺癌中，C4.4a可用作预后标志物。该文的临床数据清楚表明C4.4a高表达与预后差有关(Hansen L.等, Lung Cancer 2007，58:260-266)。在黑素瘤中，详细的表达分析揭示了C4.4a不在黑素细胞和痣中表达，但在约60%的原发性恶性黑素瘤和100%的淋巴结和皮肤转移中表达(Seiter S.等，J Invest Dermatol. 2001，116(2):344-347)。此外，发现在与相当的邻近正常乳腺组织相比的乳腺癌组织中(Fletcher G.C., Br. J. Cancer 2003，88(4):579-585)、在各种乳腺癌细胞系中以及在与正常尿路上皮相比的尿路上皮癌中(Smith B. A.等，Cancer Res 2001，61(4):1678-1685)，C4.4a基因表达上调。在结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌的各种肿瘤细胞系中，通过用多克隆抗体的FACS证实了C4.4a表达。在结肠直肠癌、胰腺癌和乳腺癌样品的IHC研究中，人肿瘤细胞系中C4.4a的可变糖基化干扰这些抗体的结合。因此，C4.4a必须至少部分去糖基化以允许结合这些多克隆抗体。在结肠直肠癌患者中，C4.4a表达是十分普遍的，且C4.4a从细胞表面脱落，使之成为预后血清肿瘤标志物。侵袭前沿C4.4a的表达是结肠直肠癌疾病复发的新的预后标志物(K. Konishi等，Cancer Science 2010)。未阐述针对可溶血清C4.4a的诊断抗体(Paret C.等，British Journal of Cancer 2007，97:1146-1156)。在正常组织中，C4.4a表达限于皮肤角质形成细胞、食管内皮细胞和胎盘细胞(Würfel J.等，Gene 2001，262:35-41)，使之成为肿瘤疗法的理想靶标。WO01/23553提出将降低或抑制C4.4a表达或活性的C4.4a抑制剂(例如抗C4.4a抗体)用于治疗癌症。

C4.a的确切功能未知；然而，它在伤口愈合的迁移性角质形成细胞中被上调(Hansen L.等, Biochem J. 2004, 380:845-857)。根据与uPAR的转移关联性和结构同源性，提出了该分子可能通过与胞外基质的相互作用而参与肿瘤细胞侵袭(Rösel M.等, Oncogene 1998，17(15):1989-2002；Paret C.等，British Journal of Cancer 2007，97:1146-1156)。潜在配体是层粘连蛋白1和5、半乳凝素3 (Paret C., Int. J. Cancer 2005, 115:724-733)以及agr2和agr3 (Fletcher GC., Brit. J. Cancer 2003, 88:579-585)。

用于免疫毒素癌症疗法临床结果的异种移植物鼠癌症模型的预测值常受缺乏治疗性抗体与其鼠直向同源物的交叉反应性的限制，这导致与正常组织的非特异性结合降低。另一方面，在用鼠抗体或嵌合抗体治疗的患者中形成的中和抗小鼠Fv抗体可引起剂量限制性毒性或治疗效力降低。因此，为了充分开发癌症治疗中特异性C4.4a表达的潜力，需要这样的靶向抗体，其兼具以下优势：与完全人或人源化抗体形式的高亲和力C4.4a结合且具有鼠交叉反应性。

新抗体的其它必要特征是与表达C4.4a的不同癌细胞系的表面结合的高亲和力。在肿瘤细胞中，C4.4a是差异糖基化的(Paret C.等，British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156)。因此，有效的抗C4.4a抗体必须独立于个体差异(包括但不限于糖基化模式的差异)而与不同患者的肿瘤细胞呈递的表位结合，这导致不同形式的C4.4a的表达。

本文提供这样的抗体、其抗原结合抗体片段或其变体，其以高亲和力与C4.4a结合、有效内化且优选与另一物种的C4.4a交叉反应。还提供用于癌症、特别是用于表达C4.4a的肿瘤的基于抗体的疗法，所述肿瘤例如乳腺癌、消化道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远处转移，还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。这些疗法使用有利于将治疗活性剂递送给癌细胞的抗体、其抗原结合抗体片段或其变体。

发明概述

本发明的目的是提供这样的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，其对患者血清中细胞表面上GPI锚定的C4.4a多肽或对通过除去GPI部分而可溶的C4.4a多肽有高度选择性，且其可用于检测与以下疾病状态有关的C4.4a表达的方法和用于治疗这类疾病状态：例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌或黑素瘤。为此，本发明的目的是提供与C4.4a表位特异性结合的分离的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合抗体片段，所述C4.4a表位存在于不同形式的278个氨基酸的成熟人C4.4a多肽(SEQ ID 1)中，其通过表达C4.4a的癌细胞系呈递，和/或其被这些抗体以高亲和力结合。本文所用的C4.4a的不同‘形式’包括但不限于不同的糖形、不同的同工型或进行不同的翻译和翻译后修饰的C4.4a多肽。本发明的另一个目的是提供对于人给药是安全的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。

本发明的另一个目的是提供与人C4.4a结合且对另一物种的C4.4a有交叉反应性的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。优选所述其它物种是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。最优选抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与人C4.4a结合并与鼠C4.4a交叉反应。

本发明的另一个目的是提供与大范围的不同的表达C4.4a的细胞系结合的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。本发明的另一个目的是提供抗体或其变体，其与不同的表达C4.4a的癌细胞或肿瘤细胞结合，并且通过使用一种或多种本发明的抗体或其变体引发针对表达C4.4a的癌细胞的免疫效应子活性(例如ADCC或CDC)。

本发明的另一个目的是提供在与表达C4.4a的细胞结合后被有效内化的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。本发明的抗体可与已知的药物共同给予，在一些情况下，抗体自身可被修饰。例如，抗体可与细胞毒性剂、免疫毒素、毒簇或放射性同位素缀合以潜在地进一步提高功效。

本发明的另一个目的是提供这样的抗体，其为用于诊断恶性病况或发育异常病况的工具，与正常组织相比在所述病况中C4.4a表达提高或在所述病况中C4.4a从细胞表面上脱落且在血清中可检出。提供了与可检测标记缀合的抗C4.4a抗体。优选的标记为放射性标记、酶、生色团或荧光剂。

本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞、用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法、使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于抑制发育异常细胞的生长的方法以及使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于治疗和检测癌症的方法。

本发明提供区别于现有C4.4a抗体的抗体(Paret C.等，British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156)，因为它们a)与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4.4a结合，优选与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4.4a的结构域S1结合，b)与鼠C4.4a交叉反应，和c)有效内化到表达C4.4a的细胞中。本文更完整地描述了本发明的这些目标和其它目标。

一方面，本发明提供这样的分离抗体或其含有抗原结合区的抗原结合片段，其与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4.4a特异性结合，优选与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4.4a多肽的结构域S1 (C4.4a的氨基酸1-85；SEQ ID NO: 1)特异性结合。在另一个实施方案中，在抗体或抗原结合片段与前述细胞结合时，所述抗体或抗原结合片段被内化到表达C4.4a的细胞中。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4.4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人C4.4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人和啮齿动物C4.4a，又一个优选的实施方案是其中啮齿动物C4.4a为小鼠C4.4a。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:5 (H-CDR1)、SEQ ID NO:9 (H-CDR2)和SEQ ID NO:13 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:17 (L-CDR1)、SEQ ID NO:21 (L-CDR2)和SEQ ID NO:25 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:6 (H-CDR1)、SEQ ID NO:10 (H-CDR2)和SEQ ID NO:14 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:18 (L-CDR1)、SEQ ID NO:22 (L-CDR2)和SEQ ID NO:26 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:7 (H-CDR1)、SEQ ID NO:11 (H-CDR2)和SEQ ID NO:15 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:19 (L-CDR1)、SEQ ID NO:23 (L-CDR2)和SEQ ID NO:27 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:8 (H-CDR1)、SEQ ID NO:12 (H-CDR2)和SEQ ID NO:16 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:20 (L-CDR1)、SEQ ID NO:24 (L-CDR2)和SEQ ID NO:28 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:45 (H-CDR1)、SEQ ID NO:46 (H-CDR2)和SEQ ID NO:47 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:48 (L-CDR1)、SEQ ID NO:49 (L-CDR2)和SEQ ID NO:50 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:55 (H-CDR1)、SEQ ID NO:56 (H-CDR2)和SEQ ID NO:57 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:58 (L-CDR1)、SEQ ID NO:59 (L-CDR2)和SEQ ID NO:60 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:65 (H-CDR1)、SEQ ID NO:66 (H-CDR2)和SEQ ID NO:67 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:68 (L-CDR1)、SEQ ID NO:69 (L-CDR2)和SEQ ID NO:70 (L-CDR3)。

在另外更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:75 (H-CDR1)、SEQ ID NO:76 (H-CDR2)和SEQ ID NO:77 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:78 (L-CDR1)、SEQ ID NO:79 (L-CDR2)和SEQ ID NO:80 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:85 (H-CDR1)、SEQ ID NO:86 (H-CDR2)和SEQ ID NO:87 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:88 (L-CDR1)、SEQ ID NO:89 (L-CDR2)和SEQ ID NO:90 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:95 (H-CDR1)、SEQ ID NO:96 (H-CDR2)和SEQ ID NO:97 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:98 (L-CDR1)、SEQ ID NO:99 (L-CDR2)和SEQ ID NO:100 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:105 (H-CDR1)、SEQ ID NO:106 (H-CDR2)和SEQ ID NO:107 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:108 (L-CDR1)、SEQ ID NO:109 (L-CDR2)和SEQ ID NO:110 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:115 (H-CDR1)、SEQ ID NO:116 (H-CDR2)和SEQ ID NO:117 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:118 (L-CDR1)、SEQ ID NO:119 (L-CDR2)和SEQ ID NO:120 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:125 (H-CDR1)、SEQ ID NO:126 (H-CDR2)和SEQ ID NO:127 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:128 (L-CDR1)、SEQ ID NO:129 (L-CDR2)和SEQ ID NO:130 (L-CDR3)。

在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:135 (H-CDR1)、SEQ ID NO:136 (H-CDR2)和SEQ ID NO:137 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:138 (L-CDR1)、SEQ ID NO:139 (L-CDR2)和SEQ ID NO:140 (L-CDR3)。

本发明的抗体可以是IgG (例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄)，而抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’)₂或scFv。因此，本发明的抗体片段可以是或可含有以本文所述的一种或多种方式起作用的抗原结合区。

本发明还涉及分离的核酸序列，其每一种可编码对C4.4a的表位有特异性的前述抗体或其抗原结合片段。本发明的核酸适于抗体或抗原结合抗体片段的重组产生。因此，本发明还涉及含有本发明的核酸序列的载体和宿主细胞。

本发明的组合物可用于治疗性或预防性应用。因此，本发明包括包含本发明抗体(或其抗原结合片段)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在相关方面，本发明提供用于治疗与不希望存在的表达C4.4a的细胞有关的病症或病况的方法。在优选的实施方案中，所述病症是癌症。该方法包括将有效量的含有本文所描述或预期的本发明抗体的药物组合物给予有此需要的受试者的步骤。

本发明还提供使用抗体文库以分离与C4.4a特异性结合的这种文库的一个或多个成员的说明书。

附图简述

图1表示采用夹心表面等离振子共振分析(sandwich surface plasmon resonance analysis)进行的表位分型实验的结果。Y是共振单位，X是时间(秒)。将本发明的抗体之一包覆在芯片上。A表示加入C4.4a的时间。B表示加入本发明的其它抗体的时间。两种抗体不能与C4.4a同时结合，这就表示至少有重叠表位。

图2提供有关本发明的抗C4.4a抗体与重组人(a)和呈人IgG1形式的小鼠(b) C4.4a结合的数据。EC₅₀值通过实施例4中描述的ELISA测定。M31-B01 (A)与人和鼠C4.4a结合的EC₅₀分别为0.24和0.29 nM。M20 B02 S-A (B)与人和鼠C4.4a结合的EC₅₀分别为0.3和0.38 nM。X为log nM；Y为360 nm下的消光值(Extinction)。

图3提供有关本发明的抗体与用以下hC4.4a转染的不同肿瘤细胞系特异性结合的数据：如A549:hC4.4a (a)或天然表达C4.4a的肿瘤细胞系如NCI H322 (b)、NCI H292 (c)；H1975/BCRP (d)或BxPC3 (e)。将M31-B01 (空心圆)和M20-D02 S-A (实心圆)结合的EC₅₀值概括于(f)中。IgG1同种型对照(实心三角形)与细胞没有任何结合。所有数据通过FACS滴定法产生。X为浓度(log nM)，Y为几何平均荧光(x10³)。

图4(a)提供有关荧光团标记的抗C4.4a抗体特异性内化至A549:hC4.4a细胞内的数据。图4 (b)提供有关非转染的A549细胞作为阴性对照的数据。A为M31-B01 (实心矩形)；B为M20-D02 S-A (空心矩形)；C为hIgG1的同种型对照(星号)；X为时间(分钟)，Y为颗粒计数/细胞[*10³]。两种C4.4a抗体被特异性、有效并快速内化至携带C4.4a的肿瘤细胞中。

图4(c)和(d)提供有关M31-B01内化至A549:hC4.4a细胞内的数据。5分钟后(c)，仅可观察到细胞表面的弱染色。90分钟后(d)，强烈着色的含有内化M31-B01抗体(其携带pH依赖性荧光染料)的内体清晰可见，表明有效内化。

图5提供有关通过蛋白质印迹法测定的表位M31-B01和M20-D02 S-A所结合的数据。A)表示不同C4.4a种类经考马斯250染色的SDS-PAGE (泳道2+7 hC4.4a，泳道3+8 mC4.4a，泳道4+9 hC4.4a结构域S1-Fc-his6，泳道5+10 hC4.4a结构域S2-Fc-his6；泳道1、6和11含有分子量标记；泳道2-5含有未还原的样品；泳道6-10含有还原样品)。B)和C)表示具有与A)相同的样品加载的各个蛋白质印迹。B)与M31-B01一起孵育而C)与M20-D02 S-A一起孵育作为检测抗体。两种抗体显示特异性还原依赖性染色，这表明构象表位。然而，两种抗体与人和小鼠全长C4.4a及与人C4.4a结构域S1结合，但不与人C4.4a结构域S2结合。

图6提供有关通过用xCELLigence分析仪测量确定的本发明抗体(B01-3)体外抑制肿瘤细胞增殖的数据。在实施例15描述的条件下，将A549:hC4.4a细胞与100 nM未结合的hIgG1同种型对照抗体(A)或100 nM B01-3 (B)在E板(E-plate)单个孔中共孵育所规定的时间。X为时间(小时)，Y为细胞增殖的相对速率。与对照IgG1相比，与B01-3孵育的A549:hC4.4a细胞的细胞增殖降低。

图7表示本发明的序列。

发明详述

本发明基于对C4.4a具有特异性或对C4.4a具有高亲和力并可向受试者递送治疗益处的新抗体的发现。本发明抗体(其可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)可用于本文将更全面描述的许多情况中。

定义

“人”抗体或其抗原结合片段在本文定义为不是嵌合的(例如非“人源化的”)且并非来自(完全或部分)非人物种的抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段可来源于人或可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在本文定义为具有完全或部分来源于经由计算机模拟的(in silico)合成序列的序列的抗体，所述合成抗体基于对已知人抗体序列的分析。可通过例如分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用从中获得的数据设计多肽序列，来实现人抗体序列或其片段的经由计算机模拟的设计。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是由自人源的抗体序列文库分离的核酸编码的人抗体或其抗原结合片段(例如该文库基于取自人天然来源的抗体)。人抗体的实例包括如Söderlind等, Nature Biotech. 2000, 18:853-856中描述的抗体。

“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文定义为如下的人源化抗体或其人源化抗原结合片段：(i)来源于非人来源(例如携带异种免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；(ii)其中非人抗体的构架区的氨基酸通过遗传工程改造部分转换为人氨基酸序列，或(iii) CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人源，而可变结构域的一个或多个构架是人源的，且恒定结构域(如有的话)是人源的。

“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中定义为这样的嵌合抗体或其抗原结合片段，其中可变结构域来源于非人源，且一些或所有恒定结构域来源于人源。

本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即除可存在的少量可能突变(例如天然存在的突变)以外，包含该群的各个抗体是相同的。因此，术语“单克隆”表示不是无关抗体的混合物的抗体特征。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的各个单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。除其特异性以外，单克隆抗体制备物是有利的，因为它们通常未被其它免疫球蛋白污染。术语“单克隆”不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。术语单克隆抗体特别地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

本文所用抗体与目标抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶标(在这里为C4.4a)) “特异性结合”、对目标抗原“具有特异性”或“特异性识别”目标抗原，是以足够的亲和力与抗原结合的抗体，使得抗体可在靶向表达抗原的细胞或组织中用作治疗剂且不与其它蛋白质进行显著的交叉反应或不与前述抗原靶标的直向同源物(ortholog)和变体(例如突变体、剪接变体或蛋白水解截短形式)以外的蛋白质进行显著的交叉反应。可通过例如对抗原的一价K_D为以下的抗体或其抗原结合片段来表示本文所用术语“特异性识别”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上表位或者对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“具有特异性”：小于约10^-4 M、或者小于约10^-5 M、或者小于约10^-6 M、或者小于约10^-7 M、或者小于约10^-8 M、或者小于约10^-9 M、或者小于约10^-10 M、或者小于约10^-11 M、或者小于约10^-12 M或更小。如果抗体能够将抗原与一种或多种参比抗原区别开来，则该抗体与该抗原“特异性结合”、对抗原“具有特异性”或“特异性识别”抗原。在其最普遍的形式中，“特异性结合”、“与……特异性结合”、“对……具有特异性”或“特异性识别”是指按照例如下列方法之一测定的抗体区别目标抗原与无关抗原的能力。所述方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA试验、RIA试验、ECL试验、IRMA试验和肽扫描。例如，可进行标准ELISA测定。可通过标准显色反应(例如第二抗体与辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺与过氧化氢)进行评分。在某些孔中的反应通过例如450 nm下的光密度来评分。典型背景(=阴性反应)可为0.1 OD；典型阳性反应可为1 OD。这意味着阳性/阴性的差异超过5倍、10倍、50倍并优选超过100倍。通常不使用单一参比抗原，而是约3-5个无关抗原的组，例如奶粉、BSA、运铁蛋白等，来进行结合特异性的测定。

“结合亲和力”是指分子的单个结合部位与其结合配偶体之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则本文所用“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。解离常数“K_D”通常用来描述分子(例如抗体)与其结合配偶体(例如抗原)之间的亲和力，即配体如何紧密地与特定蛋白质结合。配体-蛋白质亲和力受两个分子之间非共价分子间相互作用的影响。亲和力可通过本领域已知的常用方法、包括本文描述的方法测量。在一个实施方案中，采用实施例3的Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore，Inc.)，通过表面等离振子共振测定法测量本发明的“K_D”或“K_D值”。简单地说，通过间接俘获试剂抗人IgG Fc，将抗体固定在CM5传感器芯片上。按照生产商所述，使用“人抗体俘获试剂盒(Human Antibody Capture Kit)” (BR-1008-39，GE Healthcare Biacore，Inc.)的试剂。每细胞固定约5000共振单位(RU)单克隆小鼠抗人IgG (Fc)抗体。注入抗C4.4抗体以达到约200-600 RU的俘获水平。在整个固定的抗C4.4a抗体上注入各种浓度的人或鼠C4.4a。线内参比细胞校正接着减去缓冲液样品后，生成传感图(Sensogram)。根据应用Biacore评价软件将传感图与一级1:1结合模型拟合得到的缔合(k_on)与解离速率(k_off)常数的比率，计算解离平衡常数(K_D)。其它合适的装置为BIACORE(R)-2000、BIACORE (R)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)或ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories, Inc.)。

本文所用术语“抗体”意欲指免疫球蛋白分子，其优选由4条多肽链，即2条重(H)链和2条轻(L)链(其通常通过二硫键相互连接)组成。每条重链由重链可变区(本文简写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区可包含例如3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文简写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域(CL)组成。可将VH和VL区进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布有更保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL通常由3个CDR和至多4个FR组成。按例如下列顺序自氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

本文所用术语“互补决定区(CDR；例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个可变结构域通常具有3个CDR区，被称为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可包含来自由Kabat限定的“互补决定区”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的大致残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)和重链可变结构域中的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3) (Kabat等, Sequences of Proteins of Immulological Interest, 第5版, Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变结构域中的大致残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域中的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3) (Chothia和Lesk；J Mol Biol 196：901-917 (1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自由Kabat限定的CDR区和高变环两者的氨基酸。

可根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，将完整抗体分为不同的“类别”。有5个主要的完整抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可进一步分成“亚类” (同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同免疫球蛋白类型的亚基结构和三维构型是众所周知的。本文所用抗体按惯例称为抗体及其功能片段。

本文抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区；然而，可变“构架”区也可通过例如提供用于CDR的支架，而在抗原结合中起重要作用。优选“抗原结合区”包含可变轻(VL)链的至少氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的4-111，特别优选的是完整的VL和VH链(VL的氨基酸1-109位和VH的1-113；按照WO 97/08320编号)。用于本发明的优选的免疫球蛋白类别是IgG。

本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab') ₂ 和Fv片段；双抗体；单结构域抗体(DAb)、线性抗体；单链抗体分子(scFv)和由抗体片段形成的多特异性(例如二特异性和三特异性)抗体(C. A. K Borrebaeck主编(1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology)，Oxford University Press；R. Kontermann和S. Duebel主编(2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual)，Springer Verlag)。非“多特异性”或“多功能性”抗体的抗体要理解为其各个结合部位相同。可对F(ab’)₂或Fab进行工程改造以使在C_H1和C_L结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用降到最低或完全除去。

本发明的抗体可来源于重组抗体文库，其基于自大量健康志愿者的抗体中分离的氨基酸序列。采用n-CoDeR^®技术，将完全人CDR重组至新的抗体分子中。独特的重组方法允许文库含有比可通过人免疫系统天然产生的抗体更多种多样的抗体。

本文所用的抗原(例如C4.4a)的不同“形式”，在本文定义为来自不同的翻译和翻译后修饰的不同蛋白质分子，例如但不限于C4.4a初级转录物的剪接差异、糖基化差异和翻译后蛋白酶剪切的差异。

本文所用术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定子。表位决定子通常由化学活性表面分型的分子(例如氨基酸或糖侧链或其组合)组成，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特性。如果通过本领域技术人员熟知的任何方法，一种抗体在竞争结合测定中显示与第二抗体竞争，则认为两种抗体“结合相同表位”。

“分离的”抗体是已经鉴定并且从表达该抗体的细胞组分中分离出来的抗体。细胞的污染物组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中：抗体被纯化(1)至大于抗体重量的95%，在又一个优选的实施方案中，大于99%重量，这例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII、GX 90或Biorad Bioanalyzer装置上)测定，被纯化(2)至足以得到N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色，通过SDS-PAGE被纯化至同质性。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通常可通过至少一个纯化步骤制备。

“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中存在于某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)中的与Fc γ受体(FcγR)结合的分泌Ig使这些细胞毒性效应子细胞能够与携带抗原的靶细胞特异性结合，随后用例如细胞毒素杀死靶细胞。为了评价目标抗体的ADCC活性，可进行例如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056 (Presta)描述的体外ADCC测定法。对于这类测定法有用的效应子细胞包括PBMC和NK细胞。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。通过补体系统的第一组分(C1q)与抗体(合适亚类的抗体)结合启动经典补体途径的活化，所述抗体与其同族抗原(cognate antigen)结合。为了评价补体活化，可按例如Gazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202：163 (1996)中所述，进行CDC测定。在例如美国专利号6,194,551 Bl和WO 1999/51642中，描述了Fc区氨基酸序列改变(具有变体Fc区的多肽)且C1q结合增加或降低的多肽变体。

术语免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)是指与一种或多种细胞毒性剂缀合的抗体，例如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。免疫缀合物在癌症治疗中用于局部递送细胞毒性剂，即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物(例如Liu等, Proc Natl. Acad. Sci. (1996)，93，8618-8623))。免疫缀合物允许将药物部分定向递送至肿瘤并在其中进行胞内蓄积，其中全身给予未缀合的药物可导致对正常细胞和/或组织的不可接受的毒性水平。用于抗体-毒素缀合物的毒素包括细菌毒素例如白喉毒素、植物毒素例如蓖麻毒蛋白、小分子分子毒素例如格尔德霉素。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性作用。

有关参比多核苷酸或多肽序列的“百分比(%)序列同一性”分别定义为在比对序列和引入缺口(必要时)以达到最大百分比序列同一性后，分别与参比多核苷酸或多肽序列的核酸或氨基酸残基分别相同的候选序列的核酸或氨基酸残基分别的百分比。保守取代不视为序列同一性的部分。优选为无缺口的比对。为了确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可用本领域技术范围内的各种方式实现，例如，应用可公开获取的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在待比较序列全长内达到最大比对所需要的任何算法。

本发明的抗体

本发明涉及通过提供抗C4.4a抗体来抑制C4.4a阳性癌细胞生长和肿瘤性疾病进程的方法。提供了与29 kDa人C4.4a多肽(SEQ ID NO: 1或其片段)特异性结合的抗体、其抗原结合抗体片段及该抗体和片段的变体。在优选实施方案中，所述抗体、其抗原结合片段或变体与C4.4a多肽的胞外域S1特异性结合。C4.4a多肽在本文中称为‘C4.4a’。

在另一个实施方案中，在抗体或其抗原结合片段与表达C4.4a的细胞结合时，所述抗体或其抗原结合片段被内化到前述细胞中。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4.4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人C4.4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人和啮齿动物C4.4a，又一个优选的实施方案是其中啮齿动物C4.4a为小鼠C4.4a。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表7所述的至少一个(优选相应的)CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链或轻链CDR序列，或者其包含分别与表7所述VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性的可变重链或轻链序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别与抗体M31-B01或M20-D02 S-A的至少一个(优选相应的)CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链和/或轻链CDR序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别与抗体M31-B01或M20-D02 S-A的(优选相应的)重链和/或轻链CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链和/或轻链CDR序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与重链CDR2和CDR3序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链CDR2和CDR3序列及与抗体M31-B01的轻链CDR1和CDR3序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的轻链CDR1和CDR3序列。在更优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与重链CDR2和CDR3序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链CDR2和CDR3序列及与抗体M20-D02 S-A的轻链CDR1和CDR3序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的轻链CDR1和CDR3序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表7或表4中公开的优选抗体M31-B01或M20-D02 S-A的VH序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性的可变重链序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表7或表3中公开的优选抗体M31-B01或M20-D02 S-A的VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性的可变轻链序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别与抗体M31-B01或M20-D02 S-A的VH和VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性的可变重链和轻链序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表15所述的M31-B01或M20-D02 S-A来源的(优选相应的)CDR共有序列一致的重链和轻链CDR序列。又一个优选的实施方案是这样抗体或其抗原结合片段，其包含与由共有序列SEQ ID NO: 297 (CDR H1)、SEQ ID NO: 298 (CDR H2)和SEQ ID NO: 299 (CDR H3)表示的相应重链CDR序列一致的重链CDR序列和与由共有序列SEQ ID NO: 300 (CDR L1)、SEQ ID NO: 22 (CDR L2)和SEQ ID NO: 301 (CDR L3)表示的相应轻链CDR序列一致的轻链CDR序列，或者包含与由共有序列SEQ ID NO: 302 (CDR H1)、SEQ ID NO: 303 (CDR H2)和SEQ ID NO: 304 (CDR H3)表示的相应重链CDR序列一致的重链CDR序列和与由共有序列SEQ ID NO: 305 (CDR L1)、SEQ ID NO: 306 (CDR L2)和SEQ ID NO: 307 (CDR L3)表示的相应轻链CDR序列一致的轻链CDR序列。

在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4中公开的或者优选表7或表3和表4所述抗体的至少一个(优选相应的)重链和/或轻链CDR序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4中公开的或者优选表7或表3和表4所述抗体的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个(优选相应的)重链和轻链CDR序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链或轻链CDR1、CDR2或CDR3序列、表7或表3和表4所述抗体的重链或轻链CDR1和CDR2序列、表7或表3和表4所述抗体的重链或轻链CDR1和CDR3序列、表或表3和表4所述抗体的重链或轻链CDR2和CDR3序列、表或表3和表4所述抗体的重链或轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链CDR序列CDR1和CDR2及轻链CDR序列CDR1、CDR2、CDR3。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDR1、CDR2或CDR3序列；表或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDR1和CDR2序列；表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDR1和CDR3；表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDR2和CDR3序列；表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDR序列。

在又一个实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4公开的VH和/或VL序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的VH和VL序列。

在优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是单克隆的。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是人的、人源化的或嵌合的。

本发明中预期的抗体或抗原结合抗体片段的变体是其中保持抗体或抗原结合抗体片段对C4.4a的结合活性的分子。在优选的实施方案中，所述变体与表7所述抗体、优选与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4.4a。

在本文件全文中，提及下列优选的本发明抗体：“M31-B01”、“M20-D02 S-A”、“M60-G03”和 “M36-H02”、“B01-3”、“B01-5”、“B01-7”、“B01-10”、“B01-12”、“D02-4”、“D02-6”、“D02-7”、“D02-11”和“D02-13”。

M31-B01表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 41 (DNA)/SEQ ID NO: 33 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 37 (DNA)/SEQ ID NO: 29 (蛋白质)的可变轻链区。

M20-D02 S-A表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 42 (DNA)/SEQ ID NO: 34 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 38 (DNA)/SEQ ID NO: 30 (蛋白质)的可变轻链区。

M60-DG03表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 43 (DNA)/SEQ ID NO: 35 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 39 (DNA)/SEQ ID NO: 31 (蛋白质)的可变轻链区。

M36-H02表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 44 (DNA)/SEQ ID NO: 36 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 40 (DNA)/SEQ ID NO: 32 (蛋白质)的可变轻链区。

B01-3表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 53 (DNA)/SEQ ID NO: 51 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 54 (DNA)/SEQ ID NO: 52 (蛋白质)的可变轻链区。

B01-5表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 63 (DNA)/SEQ ID NO: 61 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 64 (DNA)/SEQ ID NO: 62 (蛋白质)的可变轻链区。

B01-7表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 73 (DNA)/SEQ ID NO: 71 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 74 (DNA)/SEQ ID NO: 72 (蛋白质)的可变轻链区。

B01-10表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 83 (DNA)/SEQ ID NO: 81 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 84 (DNA)/SEQ ID NO: 82 (蛋白质)的可变轻链区。

B01-12表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 93 (DNA)/SEQ ID NO: 91 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 94 (DNA)/SEQ ID NO: 92 (蛋白质)的可变轻链区。

D02-4表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 103 (DNA)/SEQ ID NO: 101 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 104 (DNA)/SEQ ID NO: 102 (蛋白质)的可变轻链区。

D02-6表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 113 (DNA)/SEQ ID NO: 111 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 114 (DNA)/SEQ ID NO: 112 (蛋白质)的可变轻链区。

D02-7表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 123 (DNA)/SEQ ID NO: 121 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 124 (DNA)/SEQ ID NO: 122 (蛋白质)的可变轻链区。

D02-11表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 133 (DNA)/SEQ ID NO: 131 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 134 (DNA)/SEQ ID NO: 132 (蛋白质)的可变轻链区。

D02-13表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 143 (DNA)/SEQ ID NO: 141 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 144 (DNA)/SEQ ID NO: 142 (蛋白质)的可变轻链区。

另一方面，本发明提供具有与C4.4a的一个或多个区特异性结合和/或对C4.4a的一个或多个区有高亲和力的抗原结合区的抗体或抗原结合片段，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 1描述。如果亲和力测量结果小于250 nM (抗体或抗原结合片段的一价亲和力)，则认为抗体或抗原结合片段对抗原有“高亲和力”。本发明的抗体或抗原结合区优选可与人C4.4a结合，其作为对人C4.4a的一价亲和力而测定的亲和力小于250 nM、优选小于100 nM、更优选小于25 nM、甚至更优选小于11 nM。例如，本发明抗体对于C4.4a的亲和力可为约220.0 nM或1 nM (抗体或抗原结合片段的一价亲和力)。

表1提供通过表面等离振子共振(Biacore)在直接固定的人或鼠C4.4a上测定的本发明代表性抗体的解离常数一览表。

表1：通过表面等离振子共振测定的抗C4.4a IgG1的一价解离常数

IgG1形式用于通过与Scatchard分析结合的荧光激活细胞分选术(FACS)的基于细胞的亲和力测定。图3f)表示转染的表达C4.4a的A549肿瘤细胞和内源性表达C4.4a的肿瘤细胞中代表性IgG抗体的结合强度。表8提供转染的鼠CHO-S:mC4.4a细胞和内源性表达C4.4a的NCI H292肿瘤细胞中代表性IgG抗体的结合强度(EC₅₀)一览表。

表8：通过FACS测定的抗C4.4a IgG1的EC₅₀值

如果通过FACS测量的亲和力测量结果小于100 nM (IgG的表观亲和力)，则认为IgG1对抗原具有“高亲和力”。本发明的二价抗体或抗原结合片段优选可与人C4.4a结合，其亲和力小于100 nM、更优选小于50 nM、还更优选小于10 nM。其它优选的是以亲和力小于5 nM、更优选小于1 nM与C4.4a结合的二价抗体，所述亲和力测定为IgG对人C4.4a的表观亲和力。例如，本发明抗体针对不同肿瘤细胞系中的C4.4a的表观亲和力可为约4.3 nM或0.03 nM，这通过如图3f所示的FACS分析测定。

当其进入表达C4.4a的肿瘤细胞的半最大内化(half maximal internalization)时间(t½)短于180分钟或更优选短于120分钟、还更优选短于90分钟时，本发明的抗体或抗原结合片段“有效”内化。更优选的为通过实施例6描述的方案测定的半最大内化时间(t½)为60分钟或更短的抗体或抗原结合片段，更优选的为小于50分钟，或小于35分钟。表9提供通过实施例6描述的方案测定的本发明代表性抗体的内化时间一览表。本发明的可内化抗体或抗原结合片段适于作为抗体-药物缀合物(ADC)的靶向部分。抗体或抗原结合片段适于以体外或体内方法将化合物、优选细胞毒性剂递送至表达C4.4a的细胞。

表9：

在一些实施方案中，将所述抗体、其抗原结合片段或其衍生物或者编码所述抗体、其抗原结合片段或其衍生物的核酸分离。分离的生物学组分(例如核酸分子或蛋白质例如抗体)是这样的生物学组分，其已从其中天然存在所述组分的生物体细胞中的其它生物学组分(例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)中基本分离或纯化。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过Sambrook等人(1989)的标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质(Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)和Robert K. Scopes等1994 Protein Purification, - Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC。该术语还包括在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。

抗体产生

通过全细胞和蛋白质淘选的组合以及通过特定工具的开发，使用完全人N-CoDeR抗体噬菌体展示文库分离高亲和力、C4.4a特异性的人单克隆抗体。这些工具和方法包括表达人C4.4a的重组细胞系、表达鼠C4.4a的细胞系、重组人和鼠C4.4a及能够鉴定在细胞表面展示的与C4.4a优先结合且与鼠C4.4a交叉反应的抗体的淘选程序和筛选试验的开发。

通过噬菌体展示技术(PDT)中3种非常规方法的组合，来开发针对癌细胞表面标志物C4.4a的抗体。首先，分别用编码人或小鼠蛋白质(SEQ ID NO:3)和(SEQ ID NO:4)的全长GPI锚定形式的质粒稳定转染CHO-S细胞和A549肿瘤细胞，来构建表达人和小鼠C4.4a的膜结合形式的重组细胞系，分别得到人CHO-S:hC4.4a、鼠CHO-S:mC4.4a和人A549:hC4.4a细胞系。其次，用后一种重组细胞系和乳腺癌细胞系MCF-7进行细胞表面选择。包括用CHO-S细胞或非转染的A549细胞预吸附(Pre-adsorption)以避免选出与亲代细胞的表位结合的Fab片段。用重组、可溶性、纯化的人C4.4a；用重组、可溶性、纯化的鼠C4.4a进行额外的选择。第三，开发筛选方法，其允许连续筛选在全A549:hC4.4a细胞以及CHO-S:hC4.4a细胞的淘选中获得的噬菌体输出。这些特定方法的组合允许分离独特的抗体“M31-B01”、“M20-D02 S-A”、“M60-G03”和“M36-H02”。

这些独特抗体的特征还在于：其在ELISA中的结合亲和力、与可溶性C4.4a的BIAcore结合、其识别可溶性C4.4a上的不同表位的能力、由BIAcore和FACS评价的其与鼠C4.4a交叉反应的能力及其在基于细胞的试验中被内化的能力。内化试验以时间分辨的方式定量测量荧光标记的抗C4.4a抗体的内化。

肽变体

本发明的抗体或抗原结合片段不限于本文提供的特定肽序列。更确切地说，本发明还包括这些多肽的变体。关于本公开内容和常规可获得的技术和参考文献，技术人员能够制备、测试和利用本文公开的抗体的功能性变体，同时了解具有与C4.4a结合的能力的变体均落入本发明的范围。

变体可包括例如具有相对于本文公开的肽序列的至少一个经改变的互补决定区(CDR) (高变)和/或构架(FR) (可变)结构域/位置的抗体。为了更好地说明这个构思，下面给出抗体结构的简述。

抗体由两条肽链组成，各含有一个(轻链)或三个(重链)恒定结构域和一个可变区(VL、VH)，每种情况下的后者由4个FR区和3个间插的CDR组成。抗原结合部位由一个或多个CDR组成，而FR区提供CDR的结构构架，因此，在抗原结合中起重要作用。通过改变CDR或FR区的一个或多个氨基酸残基，技术人员按常规可产生突变的或多种的抗体序列，例如可针对抗原筛选出其新的或改进的性质。

表3 (VL)和表4 (VH)描述了本发明某些抗体的CDR和FR区，并将给定位置的氨基酸彼此比较并与相应的共有序列进行比较。

表 3 ： VL 序列

表 4 ： VH 序列

本发明的又一个优选的实施方案是这样的抗体或其抗原结合片段，其中按表7所示选择CDR序列。

本发明的又一个优选的实施方案是这样的抗体或抗原结合片段，其中按表7所示选择VH和VL序列。技术人员可利用表3、4和7中的数据设计本发明范围内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体；变体还可具有一个或多个经改变的构架区。还可在构架区内进行改变。例如，可以改变肽FR结构域，其中与种系序列相比残基中有偏差。

关于新的抗体与相应的共有序列(列于表3和表4中)的比较，与基因DP47的VHIII相比，可以改变的候选残基包括例如M20-D02 S-A可变重链的残基42。或者，技术人员可采用例如Knappik A.等，JMB 2000，296:57-86描述的方法，通过将本文公开的氨基酸序列与所述抗体的相同类别的已知序列进行比较，来进行相同的分析。

此外，可如下获得变体：使用一种抗体作为优化的起点，通过使抗体中的一个或多个氨基酸残基、优选使一个或多个CDR中的氨基酸残基多样化，并通过针对具有改进性质的变体筛选所得的抗体变体集合。特别优选的是VL和/或VH的CDR3中的一个或多个氨基酸残基的多样化。多样化可通过采用三核苷酸诱变(TRIM)技术，合成一批DNA分子来进行(Virnekäs B.等, Nucl. Acids Res. 1994，22：5600)。抗体或其抗原结合片段包括具有修饰/变异的分子，包括但不限于例如导致半衰期改变(例如Fc部分的修饰或其它分子例如PEG的连接)或者ADCC或CDC活性改变的修饰。

保守氨基酸变体

可制备多肽变体，其保留本文所述抗体肽序列的总体分子结构。鉴于各个氨基酸的性质，技术人员将认识到一些合理的取代。例如可根据有关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性，进行氨基酸取代，即“保守取代”。

例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。取代通常在(a)-(d)组内产生。另外，甘氨酸和脯氨酸根据其破坏α-螺旋的能力可彼此取代。类似地，某些氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更普遍存在于α-螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更普遍存在于β折叠片中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸普遍存在于转角中。一些优选的取代可在下列组中进行：(i) S和T；(ii) P和G；和(iii) A、V、L和I。考虑到已知的遗传密码及重组和合成DNA技术，具有技术的科研人员可容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。在一个具体实例中，SEQ ID NO: 33-36中的氨基酸3位可由Q变为E。

本文所用的两个多肽序列之间的“序列同一性”表示该序列之间相同氨基酸的百分比。“序列同源性”表示相同氨基酸或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。

本发明的 DNA 分子

本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA分子。这些序列包括但不限于SEQ ID 37-44、53、54、63、64、73、74、83、84、93、94、103、104、113、114、123、124、133、134、143、144和308-345中所示的那些DNA分子。

本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，而是还包括其变体。可参照其在杂交中的物理性质来描述本发明的DNA变体。技术人员应认识到，可采用核酸杂交技术，使用DNA鉴定其互补序列及其等同物或同源物(因为DNA是双链的)。还应认识到，可以以小于100%的互补性进行杂交。然而，鉴于适当的条件选择，可根据DNA序列与特定探针的结构相关性，采用杂交技术区分DNA序列。有关所述条件的指导参见Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A.和Struhl, K.主编(1995)。Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley和Sons)。

两个多核苷酸序列的结构相似性可表示为条件“严格性”的函数，两个序列在所述条件下将彼此杂交。本文所用术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格条件强烈不利于杂交，并且在这种条件下只有结构上最相关的分子可彼此杂交。相反地，非严格条件有利于显示较低程度结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两个核酸序列的结构关系直接相关。下列关系可用于将杂交和相关性相关联(其中T_m是核酸双链体的解链温度)：

a.

b.双链体DNA的T_m随错配碱基对数目每增加1%而下降1℃

c.

其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。

杂交严格性随许多因素而变化，包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的试剂的存在情况。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小和不存在破坏氢键的试剂。杂交通常在以下两阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。

首先，结合阶段，探针在有利于杂交的条件下与靶标结合。在这个阶段，通常通过改变温度来控制严格性。对于高严格性，温度通常介于65℃和70℃之间，除非使用短的(< 20 nt)寡核苷酸探针。代表性杂交溶液包含6X SSC、0.5% SDS、5X Denhardt溶液和100 μg非特异性载体DNA。参见Ausubel等，第2.9节，补充材料27 (1994)。当然，已知许多不同的但在功能上等同的缓冲液条件。如果相关性程度较低，则可选择较低的温度。低严格性结合温度介于约25℃和40℃之间。中等严格性介于至少约40℃至小于约65℃之间。高严格性至少约为65℃。

其次，通过洗涤除去过量探针。正是在该阶段，通常采用更严格的条件。因此，正是这个“洗涤”阶段，在通过杂交确定相关性方面是最重要的。洗涤溶液通常含有较低的盐浓度。一种示例性中等严格性溶液含有2X SSC和0.1% SDS。高严格性洗涤溶液含有小于约0.2X SSC的等同物(在离子强度方面)，且优选的严格性溶液含有约0.1X SSC。与各种严格性有关的温度与上文对于“结合”所论述的相同。洗涤期间，通常还更换洗涤溶液多次。例如，典型的高严格性洗涤条件包括在55℃下洗涤2次持续30分钟，且在60℃下洗涤3次持续15分钟。

本发明的一个实施方案是编码以下的分离核酸序列：(i)本发明的抗体或抗原结合片段、表7中所述的CDR序列，或(ii)表7中所述的可变轻链和重链序列，或(iii)其包含编码本发明的抗体或抗原结合片段、表7中所述的CDR序列或表7中所述的可变轻链和重链序列的核酸序列。

在本发明变体的一个具体的实施例中，SEQ ID NO: 37-40中的核酸7位，或SEQ ID NO: 41-44中的16位可由C取代成G，从而将密码子由CAC变为GAG。

功能等同性变体

可参照其编码的产物来描述本发明范围内的又一类DNA变体。这些功能等同的多核苷酸的特征在于以下事实，由于遗传密码的简并性，它们编码与存在于SEQ ID NO: 5-36、45-50、55-60、65-70、75-80、85-90、95-100、105-110、115-120、125-130、135-140中肽序列相同的肽序列。

要认识到，可以以若干不同方式构建本文所提供DNA分子的变体。例如，它们可作为完全合成的DNA来构建。可普遍获得有效合成范围为20个至约150个核苷酸的寡核苷酸的方法。参见Ausubel等，第2.11节，补充材料21 (1993)。可按照Khorana等, J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)首次报道的方式，合成并装配重叠的寡核苷酸；另参见Ausubel等，同上，第8.2节。优选用基因5'和3'端处经工程改造的合宜限制位点设计合成DNA以利于克隆至合适的载体中。

如所指出的，产生变体的方法始于本文公开的DNA之一，然后进行位点定向诱变。参见Ausubel等，同上，第8章，补充材料37 (1997)。在典型方法中，将靶DNA克隆至单链DNA噬菌体载体。分离出单链DNA，并与含有所需的一个或多个核苷酸变化的寡核苷酸杂交。合成互补链，将双链噬菌体导入宿主中。所得子代中的一些将含有所需要的突变体，其可采用DNA测序来证实。另外，提高子代噬菌体成为所需突变体的概率的各种方法是可获得的。这些方法为本领域技术人员所熟知，且用于产生这类突变体的试剂盒是市售可获得的。

重组 DNA 构建体和表达

本发明还提供包含一个或多个本发明的核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体与载体(例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)联用，向所述载体中插入编码本发明抗体或其抗原结合片段的DNA分子。

可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列，来制备本文所提供的抗体、其抗原结合部分或衍生物。为了重组表达抗体、其抗原结合部分或衍生物，宿主细胞可用一个或多个重组表达载体(其携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段)转染，使得轻链和重链在宿主细胞中表达。采用标准重组DNA方法制备和/或获得编码重链和轻链的核酸，将这些核酸掺入重组表达载体中，并将载体导入宿主细胞中，例如以下文献描述的方法：Sambrook、Fritsch和Maniatis (主编), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F。M.等(主编) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等的美国专利号4,816,397。

另外，可将编码重链和/或轻链可变区的核酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或scFv的核酸序列。可将编码VL或VH的DNA片段与编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一个DNA片段有效连接(使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列是符合读框的)。人重链和轻链恒定区的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services), NIH公布号91-3242)，并且包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。

为了产生编码scFv的多核苷酸序列，可将编码VH和VL的核酸与编码柔性接头的另一个片段有效连接，使得VH和VL序列可作为连续的单链蛋白质表达，且VL和VH区被柔性接头连接(参见例如Bird等(1988) Science 242:423-426；Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等，Nature (1990) 348:552-554)。

为了表达抗体、其抗原结合部分或衍生物，可采用标准重组DNA表达方法(参见例如Goeddel；Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。例如，可将编码所需多肽的DNA插入表达载体，然后将其转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为例如细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入不同载体中。在其它实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入相同的载体。要理解的是，表达载体的设计，包括调节序列的选择受以下因素的影响：例如宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平及表达是组成型还是诱导型。

细菌表达

通过以与功能性启动子的可操作阅读相(operable reading phase)，插入编码所需蛋白质的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号，来构建用于细菌应用的有用的表达载体。载体可包含一个或多个表型选择标记和复制起点，以确保载体的维持，且需要时提供宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各个菌种。

细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒的。这些载体可含有选择标记和来源于市售可获得质粒的细菌复制起点，所述质粒通常含有众所周知的克隆载体pBR322 (ATCC 37017)的元件。在合适的宿主菌株转化并且宿主菌株生长至适当细胞密度后，通过适当方法(例如温度变化或化学诱导)去阻抑/诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。细胞通常通过离心收获、通过物理或化学方法破坏，并且保留所得粗提物用于进一步纯化。

在细菌系统中，可根据待表达的蛋白质的预期用途，有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这类蛋白质以用于例如产生抗体或筛选肽文库时，指导易于纯化的高水平融合蛋白产物表达的载体可能是合乎需要的。本发明的抗体或其抗原结合片段包括天然纯化产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从以下原核宿主中产生的产物：包括例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各个菌种，优选从大肠杆菌细胞产生的产物。

哺乳动物表达和纯化

用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于以下的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV) (例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40 (SV40) (例如SV40启动子/增强子)、腺病毒、(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的U.S. 5,168,062、Bell等人的U.S. 4,510,245和Schaffner等人的U.S. 4,968,615。重组表达载体还可包括复制起点和选择标记(参见例如Axel等人的U.S. 4,399,216、4,634,665和U.S. 5,179,017)。合适的选择标记包括在导入载体的宿主细胞中赋予药物(例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予甲氨蝶呤抗性，neo基因赋予G418抗性。

表达载体至宿主细胞的转染可采用标准技术进行，例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖、脂转染或聚阳离子介导的转染。

用于表达本文所提供的抗体、其抗原结合部分或衍生物的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞) (包括Urlaub和Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与例如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中描述的DHFR选择标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计这样的表达载体，使得表达的蛋白质分泌到培养宿主细胞的培养基中。可按照例如以下方案实现抗体的瞬时转染/表达：Durocher等(2002) Nucl.Acids Res. 第30 e9卷。可按照例如UCOE系统中的方案(T. Benton等(2002) Cytotechnology 38：43-46)实现抗体的稳定转染/表达。

抗体、其抗原结合部分或衍生物可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。

本发明的抗体或其抗原结合片段可通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，所述方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A色谱法、蛋白G色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如Colligan Colligan, Current Protocols in Immunology, 或Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各通过引用全部结合到本文中。

本发明的抗体或其抗原结合片段包括天然纯化产物、化学合成方法的产物和通过重组技术由真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞、优选由哺乳动物细胞产生的产物。根据用于重组生产方法的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的，优选为糖基化的。在许多标准实验室手册中描述了这类方法，例如Sambrook，同上，第17.37-17.42节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章。

治疗方法

治疗方法包括给予需要治疗的受试者治疗有效量的本发明预期的抗体或其抗原结合片段。“治疗有效的”量在本文定义为作为单剂量或按多剂量方案，单独或与其它药剂组合，在受试者受治疗部位的量足于耗尽C4.4a阳性细胞的抗体或抗原结合片段的量，其导致不利情况减轻，但该量又是毒理学上可容许的。受试者可以是人或非人动物(例如兔、大鼠、小鼠、狗、猴或其它低级灵长类)。

本发明的抗体或其抗原结合片段可与已知的药物共同给予，在一些情况下，该抗体自身可被修饰。例如，抗体可与细胞毒性剂或放射性同位素缀合以潜在地进一步提高功效。

本发明的抗体可以以单独的药剂给予或者与一种或多种另外的治疗剂组合给予，其中所述组合不引起不可接受的不良反应。这种组合治疗包括给予含有本发明的抗体和一种或多种另外的治疗剂的单一药物剂型，以及给予本发明的抗体和呈其自身单独药物剂型的另外的各治疗剂。例如，可将本发明的抗体和治疗剂以单个口服剂量组合物(例如片剂或胶囊剂)一起给予患者，或各药剂可以以单独的剂型给予。

如果使用单独的剂型，则本发明的抗体和一种或多种另外的治疗剂基本上可在同一时间(例如同时)或在单独错开的时间(例如序贯)给予。

特别地，本发明抗体可与其它抗肿瘤药剂按固定组合或不同组合使用，所述其它抗肿瘤药剂例如烷化剂、抗代谢药、植物来源的抗肿瘤药剂、激素治疗药剂、拓扑异构酶抑制剂、喜树碱衍生物、激酶抑制剂、靶向药物、抗体、干扰素和/或生物反应调节剂、抗血管生成化合物和其它抗肿瘤药物。在这一方面，下面是可与本发明的抗体组合使用的第二药剂实例的非限制性清单：

烷化剂包括但不限于氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派(thiotepa)、雷莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)、阿帕齐醌(apaziquone)、brostallicin、苯达莫司汀(bendamustine)、卡莫司汀(carmustine)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine),、葡磷酰胺(glufosfamide)、马磷酰胺(mafosfamide)、苯达莫司汀(bendamustin)和二溴卫矛醇(mitolactol)；铂配位的烷化化合物包括但不限于顺铂、卡铂、依他铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂和沙铂；

抗代谢药包括但不限于甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤核苷、巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶(单独或与亚叶酸组合)、替加氟(tegafur)、去氧氟尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、依诺他滨(enocitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-阿扎胞苷(5-azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、地西他滨(decitabine)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、乙炔基胞苷(ethynylcytidine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside),、羟基脲、美法仑(melphalan)、奈拉滨(nelarabine)、诺拉曲塞(nolatrexed)、ocfosfite、培美曲塞二钠、喷司他丁(pentostatin)、吡利曲索(pelitrexol)、雷替曲塞(raltitrexed)、triapine、三甲曲沙(trimetrexate)、阿糖腺苷(vidarabine)、长春新碱和长春瑞滨(vinorelbine)；

激素治疗药剂包括但不限于依西美坦(exemestane)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)、阿那曲唑(anastrozole)、度骨化醇(doxercalciferol)、法倔唑(fadrozole)、福美坦(formestane)、11-β羟基类固醇脱氢酶1抑制剂、17-α羟化酶/17,20裂解酶抑制剂例如醋酸阿比特龙(abiraterone acetate)、5-α还原酶抑制剂例如非那雄胺(finasteride)和依立雄胺(epristeride)、抗雌激素类例如枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)和氟维司群(fulvestrant)、Trelstar、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、来曲唑(letrozole)、抗雄激素类例如比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、米非司酮(mifepristone)、尼鲁米特(nilutamide)、康士德(Casodex)和抗黄体酮和其组合；

植物来源的抗肿瘤物质包括例如选自有丝分裂抑制剂的物质，例如埃坡霉素(epothilone)例如沙戈匹隆(sagopilone)、伊沙匹隆(ixabepilone)和埃坡霉素B(epothilone B)、长春碱、长春氟宁(vinflunine)、多西他赛(docetaxel)和紫杉醇；

细胞毒性拓扑异构酶抑制剂包括但不限于阿柔比星(aclarubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氨萘非特(amonafide)、贝洛替康(belotecan)、喜树碱、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟替康(diflomotecan)、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、艾特咔林(edotecarin)、epimbicin、依托泊苷(etoposide)、依沙替康(exatecan)、吉马替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、pirambicin、匹蒽醌(pixantrone)、卢比替康(rubitecan)、索布佐生(sobuzoxane)、他氟泊苷(tafluposide)和其组合；

免疫药(Immunologicals)包括干扰素(例如干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a和干扰素γ-n1)和其它免疫增强剂例如L19-IL2和其它IL2衍生物、非格司亭(filgrastim)、香菇多糖、西佐喃(sizofilan)、TheraCys、乌苯美司(ubenimex)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、BAM-002、达卡巴嗪(dacarbazine)、达克珠单抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥佐米星(ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、来格司亭(lenograstim)、香菇多糖、黑素瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、沙格司亭(sargramostim)、他索纳明(tasonermin)、替西白介素(tecleukin)、胸腺法新(thymalasin)、托西莫单抗(tositumomab)、Vimlizin、依帕珠单抗(epratuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(pemtumomab)和Provenge；

生物反应调节剂是改进活生物的防御机制或生物反应(例如组织细胞的存活、生长或分化)以引导它们具有抗肿瘤活性的药剂；这类药剂包括例如云芝多糖(krestin)、香菇多糖、西佐喃、溶血性链球菌制剂(picibanil)、ProMune和乌苯美司(ubenimex)；

抗血管生成化合物包括但不限于阿维A(acitretin)、阿普西柏(aflibercept)、血管生长抑素、aplidine、asentar、阿昔替尼(axitinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、brivanib alaninat、西仑吉肽(cilengtide)、考布他汀(combretastatin)、内皮生长抑素、芬维A胺(fenretinide)、卤夫酮(halofuginone)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠单抗(ranibizumab)、瑞马司他(rebimastat)、recentin、regorafenib、removab、revlimid、索拉非尼(sorafenib)、角鲨胺(squalamine)、舒尼替尼(sunitinib)、telatinib、沙利度胺(thalidomide)、ukrain、伐他拉尼(vatalanib)和αVβ3人源化抗单抗(vitaxin)；

抗体包括但不限于曲妥单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗、利妥昔单抗(rituximab)、替西木单抗(ticilimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、atacicept、奥戈伏单抗和阿仑单抗；

VEGF抑制剂例如索拉非尼、regorafenib、贝伐单抗、舒尼替尼、recentin、阿昔替尼、阿普西柏、telatinib、丙氨酸布立尼布(brivanib alaninate)、伐他拉尼、帕唑帕尼和雷珠单抗；

EGFR (HER1)抑制剂例如西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、vectibix、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和Zactima；

HER2抑制剂例如拉帕替尼(lapatinib)、曲妥单抗(tratuzumab)和培妥珠单抗(pertuzumab)；

mTOR抑制剂例如坦罗莫司(temsirolimus)、西罗莫司/雷帕霉素(sirolimus/Rapamycin)和依维莫司(everolimus)；

c-Met抑制剂；

PI3K和AKT抑制剂；

CDK抑制剂例如roscovitine和黄酮吡多(flavopiridol)；

纺锤体装配检查点抑制剂和靶向的抗有丝分裂剂例如PLK抑制剂、Aurora抑制剂(例如Hesperadin)、检查点激酶抑制剂和KSP抑制剂；

HDAC抑制剂例如帕比司他(panobinostat)、伏林司他(vorinostat)、MS275、belinostat和LBH589；

HSP90和HSP70抑制剂；

蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米(bortezomib)和carfilzomib；

丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包括MEK抑制剂和Raf抑制剂例如索拉非尼；

法呢酰基转移酶抑制剂例如替匹法尼(tipifarnib)；

酪氨酸激酶抑制剂包括例如达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotibib)、regorafenib、波舒替尼(bosutinib)、索拉非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、cediranib、阿昔替尼、阿普西柏、telatinib、甲磺酸伊马替尼、丙氨酸布立尼布、帕唑帕尼、雷珠单抗、伐他拉尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、vectibix、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、曲妥单抗、培妥珠单抗和c-Kit抑制剂；

维生素D受体激动剂；

Bcl-2蛋白抑制剂例如奥巴克拉(obatoclax)、奥利美生钠(oblimersen sodium)和棉酚(gossypol)；

分化20受体簇拮抗剂(Cluster of differentiation 20 receptor antagonist)例如利妥昔单抗；

核糖核苷酸还原酶抑制剂例如吉西他滨；

肿瘤坏死细胞凋亡诱导配体受体1激动剂例如马帕木单抗(mapatumumab)；

5-羟色胺受体拮抗剂例如rEV598、扎利罗登(xaliprode)、盐酸帕洛诺司琼(palonosetron hydrochloride)、格拉司琼(granisetron)、Zindol和AB-1001；

整联蛋白抑制剂包括α5-β1整联蛋白抑制剂，例如E7820、JSM 6425、伏洛昔单抗(volociximab)和内皮生长抑素；

雄激素受体拮抗剂包括例如癸酸诺龙、氟甲睾酮、甲睾酮(Android)、Prost-aid、andromustine、比卡鲁胺、氟他胺、apo-cyproterone(apo-环丙孕酮)、apo-flutamide(apo-氟他胺)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、色普龙(Androcur)、Tabi、醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)和尼鲁米特；

芳香酶抑制剂例如阿那曲唑、来曲唑、睾内酯、依西美坦、氨鲁米特(aminoglutethimide)和福美坦；

基质金属蛋白酶抑制剂；

其它抗癌药剂包括例如阿利维A酸(alitretinoin)、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)、贝沙罗汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、波生坦(bosentan)、骨化三醇、依昔舒林(exisulind)、福莫司汀、伊班膦酸(ibandronic acid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌、I-天冬酰胺酶、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、羟基脲、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、他扎罗汀(tazaroten)、万珂(velcade)、硝酸镓、坎磷酰胺(canfosfamide)、darinaparsin和维A酸(tretinoin)。

在优选的实施方案中，本发明的抗体可与化学疗法(即细胞毒性剂)、抗激素和/或靶向疗法例如其它激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂)、mTOR抑制剂和血管生成抑制剂联用。

本发明的化合物也可与放射疗法和/或手术介入联合用于癌症治疗。

在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段自身可被修饰。例如，可将抗体与任何(但不限于)上述化合物或任何放射性同位素缀合以潜在地进一步增加功效。此外，本发明的抗体可照原样使用或可用于组合物、研究和诊断，或可作为分析比照标准等，这是本领域众所周知的。

本发明的抗体或其抗原结合片段可在其中C4.4a不合乎需要地表达或存在的各种情况(例如细胞增殖性病症例如癌症)下用作治疗或诊断工具。特别适于用本发明的抗体治疗的病症和病况为实体瘤，例如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远处转移。这些病症还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。

乳腺癌的实例包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。

呼吸道癌的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺胚细胞瘤。

脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层瘤和松果体瘤。

男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。

消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。

泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌及遗传性和偶发性乳头状肾癌。

眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。

肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(伴有或没有纤维板层变异的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合型肝细胞胆管癌。

皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、恶性黑素瘤、梅克尔细胞(Merkel cell)皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。

头颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌及鳞状细胞癌。

淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。

肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。

白血病包括但不限于急性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病。

上述病症在人中已得到良好表征，但亦以类似病原学存在于其它动物(包括哺乳动物)中，并且可通过给予本发明的药物组合物来治疗。

为了治疗前述病症的任一种，可使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂，以常规方式配制按照本发明使用的药物组合物。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过任何合适的方法给予，所述方法可根据待治疗的病症类型而变化。可能的给药途径包括胃肠外(例如肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下)、肺内和鼻内，且需要时用于局部免疫抑制治疗、病灶内给药(intralesional administration)。另外，本发明的抗体可用例如减量的抗体通过脉冲输注给予。优选通过注射给予剂量，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于是短暂给予还是长期给予。待给予的量将取决于多种因素，例如临床症状、个体体重、是否给予其它药物。技术人员应认识到，给药途径可根据待治疗的病症或病况而改变。

确定本发明的新多肽的治疗有效量，很大程度上将取决于具体的患者特性、给药途径和待治疗病症的性质。一般指导可参见例如国际协调会议(International Conference on Harmonization)出版物和Remington's Pharmaceutical Sciences，第27和28章，第484-528页(第18版, Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)。更具体地讲，治疗有效量的确定取决于例如药物的毒性和功效等因素。毒性可通过本领域众所周知的方法测定，并可见于前述参考文献。可利用相同指导结合下文实施例所述方法测定功效。

诊断方法

C4.4a抗体或其抗原结合片段可用于检测表达C4.4a的肿瘤的存在情况。各种生物样品(包括血清和组织活检试样)内的含有C4.4a的细胞或C4.4a脱落的存在情况可用C4.4a抗体检测。另外，C4.4a抗体可用于各种成像方法，例如具有⁹⁹Tc (或其它同位素)缀合的抗体的免疫闪烁法。例如可用成像方案(其类似于最近描述的使用¹¹¹In缀合的抗PSMA抗体的成像方案)来检测胰腺癌或卵巢癌(Sodee等, Clin. Nuc. Med. 21：759-766，1997)。可以采用的另一种检测方法是通过将本发明的抗体与合适的同位素缀合的正电子发射断层扫描术(参见Herzog等, J. Nucl. Med. 34:2222-2226，1993)。

药物组合物和给药

本发明的一个实施方案是药物组合物，其包含单独或与至少一种其它药剂(例如稳定化合物)组合的C4.4a抗体或其抗原结合片段，所述药物组合物可以用任何无菌的生物相容性药物载体给予，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。其它实施方案是这样的药物组合物，其包含C4.4a结合抗体或其抗原结合片段和适于治疗C4.4a相关疾病(例如癌症)的其它药物活性化合物。这些分子的任一种可单独给予患者，或与其它药剂、药物或激素组合给予患者、用与一种或多种赋形剂或药学上可接受的载体混合的药物组合物给予患者。在本发明的一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。

本发明还涉及药物组合物的给予。所述给予经口或胃肠外实现。胃肠外递送的方法包括局部、动脉内(直接至肿瘤)、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给予。除活性成分以外，这些药物组合物还可含有合适的药学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)，其有利于将活性化合物加工成可药用的制剂。有关制剂和给药技术的更多详情可参见Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本(主编Maack Publishing Co，Easton，Pa.)。

用于口服给予的药物组合物可使用本领域众所周知的药学上可接受的载体以适于口服给予的剂量配制。这类载体使药物组合物能够制成被患者摄入的片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液(slurry)、混悬剂等。

口服用药物制剂可通过将活性化合物与固体赋形剂混合获得，任选研磨所得混合物，加工成颗粒混合物，在加入合适的助剂(如有需要)后，得到片剂或锭剂心。合适的赋形剂为碳水化合物或蛋白质填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；得自玉米、小麦、稻米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶包括阿拉伯树胶和西黄蓍胶；蛋白质例如明胶和胶原。如有需要，可加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐，例如藻酸钠。

锭剂心用合适的包衣(例如浓缩糖溶液)提供，其还可含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或锭剂包衣中用于产品鉴别或表征活性化合物的量，即剂量。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入适配胶囊剂(push-fit capsule)，以及由明胶和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊剂。推入适配胶囊剂可含有与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，可将活性化合物溶于或悬浮于含有或不含稳定剂的合适的液体剂中，所述液体剂例如脂肪油、液状石蜡或液态聚乙二醇。

用于胃肠外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射剂，本发明的药物组合物可在水溶液中、优选在生理相容的缓冲液例如Hank’s溶液、林格氏液或生理缓冲盐水中配制。水性注射混悬剂可含有增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外，可将活性化合物的混悬液制备成合适的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。任选混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的物质。

对于局部或经鼻给药，在制剂中使用适于待渗透的特定屏障的渗透剂。这类渗透剂一般是本领域已知的。

药盒

本发明还涉及药包(pharmaceutical pack)和药盒，其包括装有前述本发明组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。所述一个或多个容器可附有监管药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定格式的通知，表明用于人给药的产品已获生产、使用或销售监管机构批准。

在另一个实施方案中，药盒可装有编码本发明抗体的DNA序列。优选编码这些抗体的DNA序列以适于转染至宿主细胞并被宿主细胞表达的质粒提供。质粒可含有启动子(通常为诱导型启动子)以调节DNA在宿主细胞中的表达。质粒还可含有合适的限制位点以利于其它DNA序列插入质粒以产生各种抗体。质粒还可含有多种其它元件以利于克隆和所编码蛋白质的表达。这类元件为本领域技术人员所熟知，并包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等。

制备与贮存

本发明的药物组合物可以以本领域已知方式制备，例如借助常规混合、溶解、制粒、制锭(dragee-making)、研碎、乳化、胶囊化、包封(entrapping)或冻干过程的方法制备。

药物组合物可作为盐提供，并可与酸一起形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐趋于更溶于水性溶剂或其它质子溶剂(其为相应的游离碱形式)中。在其它情况下，优选的制剂可以是在pH范围为4.5-5.5下的1 mM-50 mM组氨酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇中的冻干粉，使用前与缓冲液混合。

在制备药物组合物(其包含在可接受的载体中配制的本发明化合物)后，可将其装入合适的容器中，贴上用于治疗的适应症的标签。对于C4.4a抗体或其抗原结合片段的给药，这种贴标签可包括给药的量、频率和方法。

治疗有效剂量

适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效量的活性成分以实现预期目的，即治疗特征为C4.4a表达的特定疾病状态。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

对于任何化合物，最初可在细胞培养试验(例如赘生性细胞)中，或在动物模型(通常为小鼠、兔、狗、猪或猴)中，估算治疗有效剂量。动物模型还用于得到所需的浓度范围和给药途径。然后，可用这类信息确定在人中的有益剂量和给药途径。

治疗有效剂量是指改善症状或病况的抗体或其抗原结合片段的量。可在细胞培养物或实验动物中，通过标准药学方法，例如ED₅₀ (50%群体中治疗有效的剂量)和LD₅₀ (50%群体的致死剂量)，来确定这类化合物的治疗功效和毒性。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，它可表示为ED₅₀/LD₅₀比率。表现出大的治疗指数的药物组合物是优选的。将从细胞培养试验和动物研究中获得的数据用于确定人用剂量范围。这类化合物的剂量优选位于包括ED₅₀在内的几乎无毒或无毒的循环浓度范围内。剂量在该范围变化，这取决于所采用的剂型、患者的敏感性和给药途径。

确切的剂量由每个医生考虑到待治疗的患者来选择。调整剂量和给药以提供足够水平的活性部分或保持所需效果。可考虑的其它因素包括疾病状态的严重程度，例如肿瘤大小和部位；患者的年龄、体重和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。可根据特定制剂的半衰期和清除率，每3-4天、每周或每两周一次给予长效药物组合物。

根据给药途径，正常剂量可从0.1微克到100,000微克不等，总剂量至多约为1 g。文献中提供了有关特定剂量和递送方法的指引。参见美国专利号4,657,760、5,206,344或5,225,212。本领域技术人员可采用不同于蛋白质或其抑制剂的制剂的多核苷酸制剂。类似地，多核苷酸或多肽的递送对于特定细胞、病况、部位等将是特异性的。放射性标记的抗体的优选比活范围可为0.1-10 mCi/mg蛋白质(Riva等, Clin. Cancer Res. 5:3275-3280，1999；Ulaner等，2008 Radiology 246(3):895-902)。

通过下面的实施例对本发明作进一步描述。通过参照具体的实施方案，所提供的实施例仅用于说明本发明。这些实施例虽然说明本发明的某些具体方面，但并非描述所公开发明的限制方面或限定所公开发明的范围。

所有实施例采用本领域技术人员熟知的常规标准技术进行，除非另有详细描述。按照以下标准实验室手册所述，实施下列实施例的常规分子生物学技术：例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989。

本发明优选的实施方案是：

A. 与C4.4a、优选与C4.4a的结构域S1特异性结合的分离抗体或其抗原结合片段。

B. 实施方案A的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与啮齿动物C4.4a、优选与鼠C4.4a交叉反应。

C. 实施方案A或B的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在与表达C4.4a的细胞结合后被内化。

D. 实施方案A-C中任一个的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4.4a。

E. 实施方案D的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与表7中所述至少一个CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性，或者与表7所述至少一个VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性。

F. 实施方案D-E中任一个的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与M31-B01或M20-D02 S-A的至少一个CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性，或者与M31-B01或M20-D02 S-A的VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性。

G. 实施方案D-F中任一个的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与共有序列SEQ ID NO: 297或SEQ ID NO: 302 (CDR H1)、SEQ ID NO: 298或SEQ ID NO: 303 (CDR H2)或者SEQ ID NO: 299或SEQ ID NO: 304 (CDR H3)一致的至少一个重链CDR序列，和/或与SEQ ID NO: 300或SEQ ID NO: 305 (CDR L1)、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 306 (CDR L2)或者SEQ ID NO: 301或SEQ ID NO: 307 (CDR L3)的共有序列一致的至少一个轻链CDR序列。

H. 实施方案D-G中任一个的抗体或抗原结合片段，

a) 其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO: 297 (CDR H1)、SEQ ID NO: 298 (CDR H2)和SEQ ID NO: 299 (CDR H3)一致的重链CDR序列及与SEQ ID NO: 300 (CDR L1)、SEQ ID NO: 22 (CDR L2)和SEQ ID NO: 301 (CDR L3)一致的轻链CDR序列，或者

b) 其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO: 302 (CDR H1)、SEQ ID NO: 303 (CDR H2)和SEQ ID NO: 304 (CDR H3)一致的重链CDR序列及与SEQ ID NO: 305 (CDR L1)、SEQ ID NO: 306 (CDR L2)和SEQ ID NO: 307 (CDR L3)一致的轻链CDR序列。

I. 实施方案D-H中任一个的抗体或抗原结合片段，其包含抗体M31-B01或由其修饰的可变重链和可变轻链CDR序列，其中

i. 在修饰的CDR-H1中，3位的氨基酸选自N和S，而4位的选自A和Y；

ii. 在修饰的CDR-H2中，10位的氨基酸选自T和S，而11位的选自I和T；

iii. 在修饰的CDR-H3中，10位的氨基酸选自Y、K、G、W和N；

iv. 在修饰的CDR-L1中，1位的氨基酸选自T和S；

v. 在修饰的CDR-L2中，4位的氨基酸选自Q和K；

vi. 在修饰的CDR-L3中，4位的氨基酸选自W、E、F和Y，7位的氨基酸选自R、S和M，9位的氨基酸选自N、K和S，10位的氨基酸选自G和R，而11位的氨基酸选自P和A。

J. 实施方案G-H的抗体或抗原结合片段，其包含抗体M31-B01或由其修饰的可变重链和可变轻链CDR序列的构架序列，其中在修饰的可变轻链中，10位的氨基酸选自A和V，而13位的氨基酸选自A和T。

K. 实施方案D-H中任一个的抗体或抗原结合片段，其包含抗体M20-D02 S-A或由其修饰的可变重链和可变轻链CDR序列，其中

i. 在修饰的CDR-H1中，3位的氨基酸选自D和S；

ii. 在修饰的CDR-H2中，4位的氨基酸选自V和I，9位的氨基酸选自A和G，而10位的氨基酸选自R和S；

iii. 在修饰的CDR-H3中，9位的氨基酸选自S、K和R，10位的氨基酸选自A、S和R，14位的氨基酸选自D、K、E和R，而15位的氨基酸选自S和Y；

iv. 在修饰的CDR-L1中，7位的氨基酸选自V和I；

v. 在修饰的CDR-L3中，3位的氨基酸选自A、Q和R，5位的氨基酸选自D和G，7位的氨基酸选自R和S，9位的氨基酸选自N、W和S，而12位的氨基酸选自V、A和G。

L. 实施方案D-K的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含表7中所述的至少一个CDR序列或至少一个可变重链或轻链序列。

M. 前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含表7抗体的重链和轻链CDR序列或可变重链和轻链序列。

N. 前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其包含

SEQ ID NO: 75-77所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 78-80所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 5、9和13所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 17、21和25所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 6、10和14所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 18、22和26所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 7、11和15所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 19、23和27所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 8、12和16所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 20、24和28所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 45-47所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 48-50所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 55-57所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 58-60所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 65-67所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 68-70所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 85-87所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 88-90所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 95-97所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 98-100所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 105-107所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 108-110所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 115-117所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 118-120所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 125-127所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 128-130所示可变轻链CDR序列，或者

SEQ ID NO: 135-137所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 138-140所示可变轻链CDR序列。

O. 前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO: 81所示可变重链序列和SEQ ID NO: 82所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 33所示可变重链序列和SEQ ID NO: 29所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 34所示可变重链序列和SEQ ID NO: 30所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 35所示可变重链序列和SEQ ID NO: 31所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 36所示可变重链序列和SEQ ID NO: 32所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 51所示可变重链序列和SEQ ID NO: 52所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 61所示可变重链序列和SEQ ID NO: 62所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 71所示可变重链序列和SEQ ID NO: 72所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 91所示可变重链序列和SEQ ID NO: 92所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 101所示可变重链序列和SEQ ID NO: 102所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 111所示可变重链序列和SEQ ID NO: 112所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 121所示可变重链序列和SEQ ID NO: 122所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 131所示可变重链序列和SEQ ID NO: 132所示可变轻链序列，

或者SEQ ID NO: 141所示可变重链序列和SEQ ID NO: 142所示可变轻链序列。

P. 前述实施方案中任一个的抗体，其是IgG抗体。

Q. 前述实施方案中任一个的抗原结合片段，其是scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)₂片段。

R. 前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其是单克隆抗体或抗原结合片段。

S. 前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其是人、人源化或嵌合的抗体或抗原结合片段。

T. 一种抗体-药物缀合物，其包含实施方案A-S的抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，ADC包含细胞毒性剂或放射性同位素，在又一个优选的实施方案中，细胞毒性剂或放射性同位素与抗体或抗原结合片段共价连接。

U. 一种分离核酸序列，其编码实施方案A-S的抗体或抗原结合片段。又一个实施方案为表7所述核酸。

V. 一种载体，其包含实施方案U的核酸序列。

W. 一种细胞，其表达实施方案A-S中任一个的抗体或抗原结合片段和/或包含实施方案U的核酸或实施方案V的载体。

X. 实施方案W的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。

Y. 一种产生实施方案A-S中任一个的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养实施方案X的细胞，并且纯化抗体或抗原结合片段。

Z. 实施方案A-S的抗体或抗原结合片段或者实施方案T的抗体-药物缀合物，其作为药物。

AA. 实施方案A-S的抗体或抗原抗原结合片段，其作为诊断剂。

BB. 实施方案A-S的抗体或抗原结合片段或者实施方案T的抗体-药物缀合物，其作为用于治疗癌症的药物。

CC. 一种药物组合物，其包含实施方案A-S的抗体或抗原结合片段或者实施方案T的抗体-药物缀合物。

DD. 实施方案A-S的抗体或抗原结合片段或者实施方案CC的药物组合物和一种或多种治疗活性化合物的组合。

EE. 一种用于治疗与C4.4a的不希望的存在有关的病症或病况的方法，所述方法包括给予有此需要的受试者有效量的实施方案CC的药物组合物或实施方案DD的组合。在又一个优选的实施方案中，所述疾病是癌症。

实施例

实施例 1 ：产生自 n-CoDeR 文库的抗体

在细胞选择方法中，采用未试验过的BioInvent International AB的抗体文库n-CoDeR (Lund，Sweden；参见Söderling等，Nature Biotech. 2000，18:853-856)，通过噬菌体展示技术，进行抗C4.4a的人抗体的分离。n-CoDeR是Fab文库，其中所有6种CDR是多样化的。CDR序列最初得自健康人供体。

简单地说，通过将等分试样的Fab抗体文库与10⁷个不表达C4.4a的亲代CHO-S细胞在PBS/3% FCS/0.01% NaN3 (缓冲液A)中于4℃下预孵育，经立式圆筒旋转15分钟，将所述文库所不需要的表面结合剂耗尽。通过离心除去细胞后，使用上清液在CHO-S细胞中再进行2轮预孵育。通过将噬菌体制备物在缓冲液A中于4℃孵育45分钟，接着用缓冲液A (4℃)洗涤10次，对靶细胞(10⁷个CHO-S:hC4.4a细胞)进行序贯淘选。通过在5分钟内用76 mM柠檬酸(4℃)立式圆筒旋转处理细胞，洗脱结合的噬菌体。含有洗脱的噬菌体的制备物通过加入1M Tris/HCl (pH 7.5)中和，并再进行2轮细胞淘选。在每轮中，使洗脱的噬菌体增殖，如前所述测定噬菌体效价(Cicortas Gunnarsson等，PEDS 2004，17(3) 213-221)。简单地讲，保留等分试样的洗出液溶液用于滴定实验，而其余部分用来转化指数生长的大肠杆菌HB101´以制备新的噬菌体原液。对于每轮选择，在指数生长的大肠杆菌HB101´中对输入和输出噬菌体两者进行滴定，从第2和3轮挑选克隆用于噬菌体ELISA分析。

酶联免疫吸附测定 (ELISA) ：

噬菌体 ELISA ：

采用噬菌体ELISA分析选自不同选择轮次的噬菌体的特异性。简单地讲，通过将10 µl的过夜培养物(在补充了100 µg/ml氨苄西林和15 µg/ml四环素的LB培养基中)加入100 µl新鲜培养基(补充了100 µg/ml氨苄西林、15 µg/ml四环素和0.1%葡萄糖的LB培养基)中来进行噬菌体表达，在96孔MTP中在250 rpm和37℃下振摇直到OD600达到0.5。随后加入辅助噬菌体M13KO7 (Invitrogen)，在不振摇的情况下将样品在37℃下再孵育15分钟。加入IPTG后(f. c. 0.25 mM)，在200 rpm下振摇的同时，将细胞在30℃下孵育16小时。

在4℃下用重组的50 µl C4.4a (5 µg/ml人或小鼠蛋白质)包被96孔MTP (Nunc-maxisorb)16小时。次日，将板用PBS/0.05%吐温20 (缓冲液B)洗涤3次，用封闭试剂(3%奶粉/缓冲液B)处理，再用缓冲液B洗涤3次。将得自噬菌体表达的50 µl等分试样转移到每孔后，在20℃下孵育1小时。用缓冲液B洗涤3次后，加入与HRP偶联的抗M13抗体(GE Healthcare，27-9421-01；1:2500稀释于缓冲液B中)，在20℃下孵育1小时。通过加入50 µl TMB (Invitrogen)进行显色反应，在5-15分钟后在20℃下通过加入50 µl终止溶液(Invitrogen)终止反应。在Tecan读数仪中在450 nM下记录比色反应。

通过 ELISA 筛选 sFab ：

为了产生可溶性Fab (sFab)，按照供应商说明书，将得自第2和3轮选择的噬菌粒DNA分离，并用限制性内切酶EagI和EcoRI消化，以便除去基因III产物。采用标准方法，将所得片段重新连接，将构建体转化至化学上的感受态大肠杆菌Top10中。挑选出共约1500个克隆，转移至含有LB培养基(100 µg/ml、0.1%葡萄糖)的96孔板中，在250 rpm和37℃下振摇，直到OD600达到0.5。之后，通过加入IPTG (终浓度0.5 mM)诱导sFab产生，在200 rpm下振摇的同时，在30℃下继续孵育16小时。次日早晨，将BEL缓冲液加入各孔(24.7 g/l硼酸；18.7 g/l NaCl；1.49 g/l EDTA pH 8.0；2.5 mg/ml溶菌酶(Roche))，在基本与噬菌体所述一样的ELISA中，分析50 µl经处理的培养物中与靶标结合的sFab，不同之处在于检测用与HRP (Sigma；产品编号A 0293)偶联的抗hIgG (Fab特异性)进行。

在得自BD的FACSarray上，对sFab与靶细胞的细胞结合进行分析。简单地讲，将50 µl细胞悬液(2x10⁶个细胞/ml)与50 µl大肠杆菌上清液在4℃和300 rpm下混合1小时。随后加入100 µl缓冲液A，将细胞离心，再用缓冲液A洗涤2次。为了检测结合的Fab，将1:100稀释于缓冲液A的R-藻红蛋白缀合物AffiniPure F(ab')₂片段山羊抗人F(ab’)₂片段特异性的；Jackson Immuno Research；产品编号109-116-097加入细胞中，在4℃下孵育1小时。用缓冲液A洗涤3次后，将最终的沉淀重新悬浮于150 µl缓冲液A中，记录每个样品的5000 FACS事件。应用BD FACSArray系统软件，进行数据分析。

实施例 2 ：表位分型 (Epitope Grouping)

在Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore，Inc.)上采用表面等离振子共振分析，通过监测抗C4.4a抗体对与C4.4a的同时结合，进行表位分型实验。所有下列下列步骤均在20℃下进行。将约2000 RU (1 RU (共振单位)表示1 pg蛋白质/mm²的结合)的第一抗体通过伯胺偶联共价固定在CM5传感器芯片上。将芯片用1:1比例(ration)的0.4 M N-乙基-N-(3-二乙基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.1 M n-羟基琥珀酰胺(NHC)以10µl/分钟的流速活化5-15分钟。然后，将表面上未占据的结合部位用过量的1 M乙醇胺(pH 8.5)封闭。通过固定化抗体将可溶性C4.4a (HEPES-EP缓冲液(GE Healthcare Biacore，Inc.)中的浓度400 nM，流速10 µl/分钟持续3分钟)俘获在表面上。因此，对于所有结合的C4.4a分子，俘获抗体的表位均被封闭。随后，将第二抗体(以HEPES-EP缓冲液中200 nM的浓度，以10 µl/分钟的流速持续3分钟)立即通过表面与俘获的C4.4a结合。识别相同表位或重叠表位的2种抗体无法与C4.4a结合，而具有独特表位的抗体能够结合。用3M MgCl2 (以10 µl/分钟的流速持续30秒钟)再生抗体表面，以除去所有结合的蛋白质，然后用其它抗体重复该过程。

对呈IgG1形式的抗体M31-B01和M20-D02 S-A进行了测试。两种抗体不能够与C4.4a同时结合，因此竞争结合(参见图1)。

实施例 3 ：与鼠 C4.4a 的交叉反应性

表1所示为Biacore的结果和显示本发明的抗鼠C4.4a抗体的交叉反应性和解离常数(K_D)的研究。

在Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore，Inc.)上通过表面等离振子共振分析，测定抗C4.4抗体的结合亲和力。通过间接俘获试剂抗人IgG Fc将抗体固定在CM5传感器芯片上。按照生产商所述，使用“人抗体俘获试剂盒” (BR-1008-39，GE Healthcare Biacore，Inc.)的试剂。每个细胞固定约5000 RU单克隆小鼠抗人IgG (Fc)抗体。将抗C4.4抗体以5µg/ml的浓度按10µl/分钟注入10秒钟以达到约200-600 RU的俘获水平。将人或鼠C4.4a的HEPES-EP缓冲液(GE Healthcare Biacore，Inc.)中的各种浓度(400 nM、200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM和3.12 nM)以60 µl/分钟的流速注入到固定的抗C4.4a抗体上持续3分钟，允许解离10分钟。在线内参比细胞校正，接着减去缓冲液样品后，生成传感图。应用Biavaluation软件(4.0版)，基于缔合(k_on)和解离速率(k_off)常数(其通过将传感图与一级1:1结合模型拟合而得到)的比率，计算解离平衡常数(KD)。

实施例 4 ：与重组人和鼠 C4.4a 的结合

图2描绘了抗C4.4抗体M31-B01和M20 D02 S-A分别在重组人C4.4a (A)和鼠C4.4a (B)中的结合曲线。简单地讲，在4℃下用重组人或小鼠C4.4a包被96孔MTP达16小时，100 ng/孔板用PBS/0.05%吐温20 (=缓冲液B)洗涤3次，用封闭试剂(PBS + 2% BSA)处理，再用缓冲液B洗涤3次。此后，以0.39 ng-400 ng/每孔的浓度加入本发明的抗C4.4a抗体，在20℃下孵育1小时。用缓冲液B洗涤3次后，将100 µl缓冲液B中的20 ng蛋白A加入各孔中。通过加入50 µl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) (Sigma)进行显色反应。18分钟后，在Tecan无限读板仪中通过测量360 nm下的消光值，记录EC₅₀测定的数据。人和鼠C4.4a中M31-B01的EC₅₀值分别分别为0.24 nM和0.29 nM。而人和鼠C4.4a中M20-D02 S-A的EC₅₀值分别为0.3 nM和0.38 nM。这就表明本发明的抗C4.4a抗体与人和鼠可溶性重组C4.4a两者高亲和力结合。

实施例 5 ：与不同肿瘤细胞的结合

图3描绘了抗体M31-B01和M20-D02 S-A与不同肿瘤细胞的结合曲线和EC₅₀值。使用转染细胞系A549:hC4.4a和天然表达C4.4a的肿瘤细胞系NCI H292、NCI H332、H1975/BCRP和BxPC3，通过FACS进行了分析。图3f)表示两种本发明的抗体与该大范围的肿瘤细胞特异性结合并具有高亲和力。本发明的其它抗体对mC4.4a:CHO细胞和NCI H292细胞的EC₅₀值示于表8。

FACS滴定法在96孔微量滴定板中进行，其中将在50 µl体积的FACS缓冲液(3% FCS/PBS)中系列稀释的第一抗体与50 µl含2x105个细胞/ml的细胞悬液混合，所述细胞已用细胞解离溶液(1x) Non-enzymatic (Sigma)脱离，并重新悬浮于FACS缓冲液中。在搅拌下，在4℃下孵育1小时。使细胞沉淀，用FACS缓冲液洗涤，并重新悬浮于100 µl/孔藻红蛋白标记的山羊抗人IgG (Dianova)溶液/FACS缓冲液中。如前进行孵育和洗涤。采用FACS Array装置，在各个检测波长下，对细胞结合的抗体进行分析。应用Swift 8.0软件，根据一式两份的荧光中位值，求出EC₅₀值。

实施例 6 ：内化

转染的C4.4a:A549细胞中抗C4.4a抗体的相对内化见图4和表9。用荧光标记的C4.4a抗体进行内化试验。

选择pH敏感的荧光染料CypHer 5E (GE Healthcare，PA15401)作为荧光标记，因为只有在酸性pH下存在于内体中，才可检测到荧光信号，而在中性或碱性pH值时，则测不到荧光。对于偶联，将抗C4.4a抗体与PBS/碳酸钠(pH 8.3) (9:1)中的2摩尔过量染料一起在20℃下孵育1小时。平均达到1.6的Lys偶联的染料负荷。在FACS测定法中，测试了偶联对亲和力的作用，EC₅₀值的变化可忽略不计。使用1x10⁴个A549:hC4.4a细胞，以研究在抗体结合时的特异性C4.4a内化。在37℃/5% CO₂下，将细胞用各种浓度(34nM-6.6nM)的经标记的抗体处理。IN细胞分析仪1000 (IN Cell Analyzer 1000)动态测量内化长达24小时。用显微镜以40 x放大倍数并通过测定颗粒度(颗粒计数/细胞；对于CypHer5E，620 nm激发，700 nm发射)，进行内化分析。使用细胞可渗透染剂Hoechst 33342 (0.5µg/ml，30分钟孵育，在353-365 nm下发射，在480 nm下检测)，用DNA染色显现核。

相应的不表达C4.4a的载体细胞用作对照以及A549野生型(A549 wt)细胞。选出人IgG1作为同种型对照，并进行平行标记。进行了3次独立实验；数据点代表一式三份的测定结果。M31-B01和M20-D02 S-A被有效内化。M31-B01和M20-D02 S-A的半最大内化时间分别为31分钟和49分钟。

实施例 7 ：自 Fab 至 IgG 形式的转化

为了将VH和VL区自Fab转移至IgG形式和/或将表达系统自大肠杆菌变成哺乳动物细胞系统，使用PCR引物扩增VH和VL。在VH和VL的5’端和3’端分别引入旁侧的限制性内切酶切割位点。这些限制位点用于将VH和VL克隆至含有例如IgG骨架的表达载体中。

将大肠杆菌细胞加入装有100 μl水的试管中，在95℃下孵育10分钟，然后在冰上保持5分钟。涡旋后，通过离心使细菌碎片沉淀。上清液用于DNA扩增。分别使用具有用于VL的BamHI和HpaI限制位点及用于VH的Blp1和Mfe1位点的特异性引物对，分别制备用于VH和VL的PCR反应物。按照生产商说明书，用AccuPrime Pfx聚合酶(Invitrogen # 12344-024)进行PCR反应。在1%琼脂糖凝胶上对PCR产物进行质量检查。按照供应商说明书，将表达载体和PCR产物用各自的限制性内切核酸酶在37℃下消化2小时以产生匹配末端。通过在70℃下孵育15分钟终止消化反应。采用标准方法，将所得片段与表达载体连接，并将构建体转化至大肠杆菌或哺乳动物细胞。

实施例 8 ：皮下异种移植物癌症模型

可使用免疫缺陷小鼠中的皮下异种移植物模型，评价抗C4.4a抗体的抗肿瘤作用。将A431细胞作为贴壁培养物保持在补充了10% FBS的DMEM中。用1 x 10e7个细胞/0.1 ml培养基，皮下接种到6-7周龄的SCID小鼠右胁。每3天以5-60 mg/kg的剂量腹膜内给予单克隆抗体3x。对照小鼠用PBS或无关单克隆抗体治疗。每2天用游标卡尺测量肿瘤大小。可通过比较抗C4.4a抗体治疗与对照治疗的肿瘤大小，来评价抗肿瘤功效。

实施例 9 ：用抗体药物缀合物的皮下异种移植物癌症模型

可采用本领域已知方案，将抗C4.4a抗体与细胞毒性小分子缀合(例如Liu等, Proc Natl. Acad. Sci. (1996)，93，8618-8623)。将A431细胞作为贴壁培养物保持在补充了10% FBS的DMEM中。用1 x 10e7个细胞/0.1 ml培养基，皮下接种6-7周龄SCID小鼠的右胁。当肿瘤大小达到50 mm³时，可每3天以1-60 mg/kg的剂量腹膜内给予抗体药物缀合物3x。对照小鼠用PBS、无关单克隆抗体或游离的未缀合药物治疗。可用游标卡尺每两天测量肿瘤大小。可通过比较抗C4.4a抗体药物缀合物治疗与对照治疗的肿瘤大小，来评价抗肿瘤功效。

实施例 10 ：克隆、表达和定量亲和力成熟的 Fab 抗体片段表达水平的亲和力成熟

将在重链C端携带3xHA标签和六个组氨酸标签的野生型Fab M31-B01和M20-D02 S-A的重链和轻链亚克隆至pET28a细菌表达载体(Novagen/Merck Chemicals Ltd.，Nottingham，UK)中，并转化至Top10F’细胞(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)中。或者，可以使用其它细菌表达载体(例如pQE载体系统，Qiagen GmbH，Hilden，Germany)和菌株(例如DH5α，Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)。通过标准的基于寡核苷酸的位点定向诱变产生变体，并通过DNA测序证实。特别地，对重链和/或轻链内的互补决定区内或附近的氨基酸残基进行修饰。

对于表达，将变体转化至BL21starDE3大肠杆菌菌株(Invitrogen，C6010-03)中，接种至包括卡那霉素(30 µg/ml)的LB培养基中的过夜培养物中，并在37℃下孵育18小时。通过将培养物1:20接种到具有卡那霉素(30 µg/ml)的新鲜LB培养基中，产生表达培养物。在37℃下6小时后，加入1 mM IPTG以诱导抗体表达，再将培养物在30℃下孵育18小时。

对于表达水平的定量，采用ELISA方法。简单地讲，将MTP板(Nunc maxisorp black，460518)与稀释于包被缓冲液(Candor Bioscience GmbH，121125)中的HA表位标签特异性mAb (Covance，MMS-101P)一起在4℃下孵育16小时，用PBST (含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4 (pH 7.4)、0.05%吐温20的磷酸缓冲盐水)洗涤，在20℃下用100% Smart Block (Candor Bioscience GmbH，113500)封闭1小时，并再次洗涤。将培养物稀释于10% Smart Block/PBST中，在20℃下与MTP板结合1小时。用PBST洗涤后，将俘获的抗体与HRP偶联的抗λ抗体(Sigma，A5175)一起孵育，通过将板与10µM amplex red底物(Invitrogen，A12222)一起在20℃下在暗处孵育30分钟，接着通过荧光测量来检测。检查所测定的量化信号在校准系列的动态范围内，该校准系列用允许对每个单独的Fab表达样品进行相对定量的浓缩亲代Fab (M31-B01或M20-D02-S-A)表达培养物上清液构建。

实施例 11 ：测定产生的 Fab 抗体片段变体的活性和种间交叉反应性

为了测定重组可溶性人或小鼠C4.4a中突变的Fab变体的活性，采用直接ELISA测定形式。简单地讲，将MTP板(Nunc maxisorp black，460518)用稀释于包被缓冲液(Candor Bioscience GmbH，121125)的2 µg/ml人或小鼠C4.4a包被，并在4℃下孵育15小时。用PBST洗涤3次后，在20℃下用100% Smart Block (Candor Bioscience GmbH，113500)将板封闭1小时，重复洗涤步骤。对于Fab抗体片段的结合，在20℃下将20 µl的培养上清液加到板中1小时，接着洗涤。在一些情况下，通过用10% Smart Block/PBST的额外孵育步骤持续90分钟，接着用PBST洗涤3次(表10b中的“方法B”)，来提高洗涤严格性。然后通过HA表位标签特异性抗体_HRP缀合物(Bethyl，A190-108P)检测结合的亲代Fab和变体。将10µM amplex red底物(Invitrogen，A12222)加到板中，使用普通荧光读数仪(例如Tecan Ultra)检测荧光信号。将量归一化的亲和力信号计算为在相应ELISA中背景校正的亲和力与定量信号的比率：(信号亲和力-背景亲和力)/(信号量-背景量)。所得值主要与亲和力正相关，而未归一化值另外与样品中结合Fab的浓度相关。因此，量归一化的亲和力信号用作测定亲和力改进的变体的极佳指导。

实施例 12 ：单个和多个氨基酸取代

表10a和表10b所提供的是M20-D02 S-A的重链和轻链中产生的单个氨基酸取代的若干实例。HC D101K、LC A90Q、LC V97A和LC V97G显示对于人C4.4a中归一化亲和力信号的最强改进，且小鼠C4.4a中的相应信号是相对于与人C4.4a中信号的至少1/8 (表10a)。至于人C4.4a中归一化亲和力信号，在CDR3以外，2个取代HC D31S和HC V51I显示最强改进，在HC V51I的情况下，且小鼠C4.4a中相应信号为30% (表10b)。

表10a. M20-D02 S-A重链和轻链CDR3内单个氨基酸取代的分析。对于人和小鼠C4.4a中归一化的亲和力信号，列出了至少一式四份的两次测量的平均值和各自的标准差

表10a：

。

表10b. M20 D02-S-A重链和轻链的CDR3以外的单个氨基酸取代的分析。分别列举了人和鼠C4.4a中归一化的亲和力信号；给出的数值是一式四份测量的中位值。方法B和A之间的差异是方法B中在缓冲液中持续90分钟的额外孵育步骤

表10b：

。

表11a和表11b中提供的是在B01的重链和轻链中产生的单个氨基酸取代的若干实例。至于人C4.4a中归一化的亲和力信号，LC W91E、LC W91F、LC W91Y和LC G95bR显示最强改进，且小鼠C4.4a中相应信号是相对于人C4.4a中信号的至少1/8，后3种的为40%或更高(表11a)。在CDR3以外，对于人C4.4a中归一化的亲和力信号，取代HC A32Y显示最强改进(表11b)。

表11a. M31-B01重链和轻链的CDR3内单个氨基酸取代的分析。列举了人和小鼠C4.4a中归一化的亲和力信号；两次测量的平均值和各自的标准差产生于至少一式四份

表11a:

。

表11b. B01重链和轻链的CDR3以外的单个氨基酸取代的分析。列举了人和小鼠C4.4a中归一化的亲和力信号；给出的数值是至少一式三份测量的中位值

表11b：

。

表12a和表12b中提供的是M20-D02 S-A 抗C4.4a抗体内组合氨基酸取代的一些实例。一些取代作为单个氨基酸取代进行分析(表10a和表10b)，其它仅作为该组合取代的部分进行分析。虽然表12a和表12b中未提供每个组合，但预期抗C4.4a抗体可包含表10a和表10b中提供的修饰的任何组合。

表12a和表12b. M20-D02 S-A内多个氨基酸取代的实例

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表13a和表13b中所提供的是M31-B01 抗C4.4a抗体内组合氨基酸取代的一些实例。一些取代作为单个氨基酸取代进行分析(表11a和表11b)，其它仅作为该组合取代的部分进行分析。虽然表13a和表13b中未提供每个组合，但是预期抗C4.4a抗体可包含表11a和表11b中提供的修饰的任何组合。

表13a和表13b. M31-B01内多个氨基酸取代的实例

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表14a和表14b中所提供的是具有潜在脱酰氨基化位点，具体地讲为M20-D02 S-A和M31-B01的Asn-Gly (“NG”)和Asn-Ala (“NA”)的CDR序列段(sequence stretch)，以及具有多个氨基酸取代的一些相应变体的相应序列。

在M20 D02-S-A中，CDR中有2个潜在的脱酰氨基化位点，一个在CDR-L3中，一个在CDR-H2中。在D02-11、D02-10、D02-06、D02-07和D02-13中，CDR-L3中的该位点通过N＞S取代除去。

表14a：

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在M31-B01中，CDR中有2个潜在的脱酰氨基化位点，一个在CDR-L3中，一个在CDR-H1中。在B01-nn3、-05、-10、-nn4和-12中通过N＞S取代、B01-nn1中通过N＞K取代、而B01-06中通过G＞R取代除去CDR-L3中的该位点。在B01-02、-09、-10、-06、-nn4、-12、-nn5和-11中，通过N＞S取代除去CDR-H1的该位点。B01-10、-06、-nn4和-12不具有这两个潜在的脱酰氨基化位点的任一个。

表14b：

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采用实施例10-12中所述方法，通过单个突变及其单个突变的组合产生亲和力成熟的抗体。这些方法极适于产生来源于亲代抗体的竞争性抗体。表7中描述了上述实施例的抗体。这些实施例提供：另外的C4.4a结合抗体或抗原片段-结合片段，其包含与M31 B01的CDR H1有至少77%同一性的CDR H1序列、与M31 B01的CDR H2有至少90%同一性的CDR H2序列、与M31 B01的CDR H3有至少90%同一性的CDR H3序列、与M31 B01的CDR L1有至少92%同一性的CDR L1序列、与M31 B01的CDR L2有至少85%同一性的CDR L2序列和与M31 B01的CDR L3有至少58%同一性的CDR L3序列(这些抗体变体与M31 B01竞争结合)；和抗体或抗原-片段-结合蛋白，其包含与M20 D02 S-A的CDR H1有至少88%同一性的CDR H1序列、与M20 D02 S-A的CDR H2有至少85%同一性的CDR H2序列、与M20 D02 S-A的CDR H3有至少73%同一性的CDR H3序列、与M20 D02 S-A的CDR L1有至少92%同一性的CDR L1序列、与M20 D02 S-A的CDR L2有至少100%同一性的CDR L2序列和M20 D02 S-A的CDR L3有至少58%同一性的CDR L3序列(这些抗体变体与M20 D02 S-A竞争结合)。

表15a：该表概括了方法12所述的M20 D02 S-A重链和轻链的CDR 1-3的氨基酸变异。

下面表示来源于M20 D02 S-A的各个CDR序列的共有序列形式的上述结果。表15a (i)中分别描述了CDR H1的共有序列(SEQ ID NO: 297)，表15a (ii)中描述了CDR H2的共有序列(SEQ ID NO: 298)，表15a (iii)中描述了CDR H3的共有序列(SEQ ID NO: 299)，表15a (iv)中描述了CDR L1的共有序列(SEQ ID NO: 300)，描述了与SEQ ID NO: 22相同的CDR L2的共有序列(表15a (v))，表15a (v)描述了CDR L3的共有序列(SEQ ID NO: 301)。

表15a：该表概括了实施例12所述的M20 D02 S-A重链和轻链的CDR 1-3的氨基酸变异

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下面表示来源于M31 B01的各个CDR序列的共有序列形式的上述结果。表15b (i)中描述了CDR H1的共有序列(SEQ ID NO: 302)，表15b (ii)中描述了CDR H2的共有序列(SEQ ID NO: 303)，表15b (iii)中描述了CDR H3的共有序列(SEQ ID NO: 304)，表15b (iv)中描述了CDR L1的共有序列(SEQ ID NO: 305)，表15b (v)中描述了CDR L2的共有序列(SEQ ID NO: 306)，表15b (v)中描述了CDR L3的共有序列(SEQ ID NO: 307)。

表15b：该表概括了实施例12中所述M31 B01重链和轻链的CDR 1-3的氨基酸变异

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实施例 13 ：通过蛋白质印迹测定抗体与 C4.4a 单个结构域的结合

为了表征M31-B01和M20-D02 S-A的抗体结合结构域，通过标准方法，分别产生由人C4.4a SEQ ID NO: 1的C4.4a结构域S1氨基酸1-85和C4.4结构域S2 108-193组成的构建体作为C端人IgG1 Fc-6xHis标签融合物，将其克隆至含有CMV5启动子的哺乳动物表达载体中，在HEK293 6E细胞中瞬时表达。然后，使用20℃下的5 ml NiNTA超流动柱(superflow column) (Qiagen)，通过金属螯合色谱法从细胞上清液中纯化所表达的S1和S2蛋白。用1M NaOH调节样品的pH至pH 8.0，然后以1ml/分钟加到之前用50mM NaH2PO4 + 300mM NaCl (pH 8.0)平衡的柱中。柱用15 CV平衡缓冲液洗涤，结合的带His标签的蛋白质用50mM NaH2PO4 + 300mM NaCl + 250mM咪唑(Imidazol) (pH 8.0)洗脱。洗脱的蛋白质通过尺寸排阻色谱法，在Tricorn Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare)上进一步纯化。

对于进一步分析全长(C4.4a SEQ ID NO: 1)，按照生产厂说明书，将纯化的S1-Fc-6xHis标签融合物和S2 Fc-6xHis标签加入预制的NuPage Bis-Tris 4-12%梯度凝胶(Invitrogen，编号NP0322Box)的不同泳道，使用NuPage MES SDS Running Puffer (Invitrogen NP0002)通过电泳分离。

然后使用iBlot装置(Invitrogen)，将SDS凝胶转印到iblot凝胶转移膜(Invitrogen IB3010-02)上。将膜在DPBS pH 7.4 + 4% 奶粉 + 0.1%吐温20中于4℃封闭16小时，接着在DPBS (pH 7.4) + 0.1%吐温20中于20℃通过3次洗涤步骤(5分钟)。分别以1/5000和1/2000的稀释度加入M31-B01 (5.76 mg/ml)或M20-D02 S-A (3.49mg/ml)，并在20℃下孵育1.5小时，接着在DPBS pH 7.4 + 0.1%吐温20中2x洗涤。以1/1000的稀释度将第二抗体(碱性磷酸酶缀合物山羊抗人IgG，Fab特异性；109-055-097 Jackson ImmunoResearch)在20℃下孵育1.5小时。接着在DPBS pH 7.4 + 0.1%吐温20中在20℃下3次洗涤步骤(5分钟)。用10 ml水中的Sigma Fast BCIP/NBT/1片于20℃进行染色，直到条带显现。通过用水洗涤终止染色反应。

抗体M31-B01和M20-D02 S-A两者与全长人和小鼠C4.4a结合。另外，它们还与图6所示的C4.4a的结构域S1结合，但不与C4.4a的结构域S2结合。只可在非DTT还原样品中检测到结合，这就强烈表明被一个或多个二硫键稳定的构象依赖性表位的存在。

实施例 14 ：依赖抗体的细胞毒性试验 (ADCC 试验 )

抗C4.4a IgG的抗肿瘤活性可由ADCC介导。将表达C4.4a的A549:hC4.4a细胞和不表达C4.4a的亲代细胞与250 ng/ml、1000 ng/ml或2000 ng/ml人抗C4.4a或对照IgG1抗体(例如抗地高辛抗体)一起孵育。以50:1、25:1和5:1比率的效应子-靶标比率将人PBMC加到这些细胞中。进行铬-51释放试验，以测定靶标裂解的水平。如果在抗C4.4a抗体和PBMC存在下裂解速率高于在模拟抗体或无抗体和PBMC存在下的(自发性)裂解速率，这说明ADCC是有效的。

实施例 15 ：增殖的抗体依赖性抑制—通过 xCELLigence 系统测量细胞增殖

xCELLigence系统(RTCA分析仪目录号05228972001，Roche)在不掺入标记的情况下实时监测细胞事件。该系统测量跨越在组织培养物E板底部集成的交错微电极的电阻抗。阻抗测量结果提供有关细胞生物学状态的定量信息，包括细胞数、存活力和形态。为了测定A549:hC4.4a的细胞增殖率，将细胞与未结合的hIgG1同种型对照抗体或100 nM B01-3 (作为hIgG1)一起孵育。首先将50µl细胞培养基(RPMI (Biochrom FG1640) + 10% FCS (Biochrom #S0145) + 1 µg/ml嘌呤霉素(Sigma 8833))加到E板96的各孔中。将E板96插入RTCA MP台(目录号05331625001，Roche)中，测定各孔的本底阻抗。从E板96中再次移出溶液，将50µl细胞悬液(细胞培养基中5000个细胞/孔A549:hC4.4a)加到各孔中。将板再插入，在37℃ + 5% CO₂下测量4小时。重新取出E板96，加入100µl细胞培养基中的抗体(100nM B01-3或无结合对照hIgG1)。所有样品以一式三份运行。在重新插入E板后，在37℃ + 5% CO₂下进行测量92小时。用内置软件包对结果进行分析。结果见图6。与未结合的对照抗体相比，抗体B01-3使细胞增殖明显降低。这就表明本发明的抗体有效抑制表达C4.4a的细胞的细胞增殖。

表7：抗体序列

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Claims

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其与人C4.4a特异性结合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含下列CDR序列：

SEQ ID NO: 45所示的CDR H1，

SEQ ID NO: 46所示的CDR H2，

SEQ ID NO: 47所示的CDR H3，

SEQ ID NO: 48所示的CDR L1，

SEQ ID NO: 49所示的CDR L2，和

SEQ ID NO: 50所示的CDR L3。

2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO: 51所示可变重链序列和SEQ ID NO: 52所示可变轻链序列。

3.权利要求1或2的抗体，其为IgG抗体。

4.权利要求1或2的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)₂片段。

5.权利要求1或2的抗体，其为单克隆抗体。

6.权利要求1或2的抗原结合片段，其为单克隆抗体的抗原结合片段。

7.权利要求1或2的抗体，其为人、人源化或嵌合的抗体。

8.权利要求1或2的抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合的抗体的抗原结合片段。

9.抗体药物缀合物，其包含权利要求1-8的抗体或其抗原结合片段。

10.分离的核酸序列，其编码权利要求1-8的抗体或抗原结合片段。

11.载体，其包含权利要求10的核酸序列。

12.分离的细胞，其表达权利要求1-8中任一项的抗体或抗原结合片段，和/或包含权利要求10的核酸或权利要求11的载体。

13.权利要求12的分离的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。

14.用于产生权利要求1-8中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求13的细胞并纯化所述抗体或抗原结合片段。

15.权利要求1-8的抗体或抗原结合片段或者权利要求9的抗体-药物缀合物，其作为药物。

16.权利要求1-8的抗体或抗原结合片段，其作为诊断剂。

17.权利要求1-8的抗体或抗原结合片段或者权利要求9的抗体-药物缀合物，其作为用于治疗癌症的药物。

18.药物组合物，其包含权利要求1-8的抗体或抗原结合片段或者权利要求9的抗体-药物缀合物。

19.权利要求18的药物组合物和一种或多种治疗活性化合物的组合产品。

20.权利要求18的药物组合物或权利要求19的组合产品在制备用于治疗癌症的药物中的用途。