CN104066750B - 抗fgfr2的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，其在结合至过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2之后，降低FGFR2的细胞表面表达。本发明还提供了基于抗体的用于FGFR2相关的疾病或病症例如癌症的疗法。本发明的抗体还可用于诊断领域。本发明还提供了编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和具有使用说明书的试剂盒。

Description

抗FGFR2的抗体及其用途
技术领域
本发明提供特异性针对成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的重组抗原结合区域和抗体以及含有这类抗原结合区域的功能片段。
因此，所述抗体可用于治疗与FGFR2的表达相关的肿瘤和其他障碍和病症。本发明还提供了编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和具有使用说明书的试剂盒。
背景技术
基于抗体的疗法被证明可非常有效的治疗多种癌症，包括实体瘤。例如，已经被成功用于治疗乳腺癌，在B细胞相关的癌症类型中有效。开发成功的基于抗体的疗法的关键是分离抗优先在肿瘤细胞上表达的细胞表面蛋白的抗体。
成纤维细胞生长因子受体是酪氨酸受体激酶(RTK)，在哺乳动物中已知其中的四种(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)。鉴定了22种作为配体的人成纤维细胞生长因子(FGF)(Eswarakumar and Schlessinger,Cytokine&Growth Factor Reviews2005,16:139-149；Shimada et al.,Proc Natl Acad Sci USA2001,98:6500-6505)。FGFR由3个细胞外的免疫球蛋白(Ig)样结构域(D1-D3，其中结构域2和3为配体结合所必需)，单个跨膜结构域和含有催化蛋白酪氨酸激酶核心的细胞质结构域组成(参见图1的图示)。细胞外部分另外包含酸性盒(AB)和肝素结合位点(HBS)(参见图1)。RTK的FGFR家族的重要标志是存在多种可变剪接的变体。全长FGFR2称作FGFR2α，而缺少D1的同种型(isotype)称作FGFR2β(图1)。结构域3中的可变剪接导致2种不同的变体，即含有外显子7和8的FGFE2IIIb，和含有外显子7和9的FGFR2IIIc(图1)。后者的剪接影响配体结合，导致特异性模式。FGFR2IIIc主要由间充质细胞表达，FGFR2IIIb主要由上皮细胞表达。FGF7也被称作角化细胞生长因子(KGF)，仅结合FGFR2IIIb，因此FGFR2IIIb也被称作KGFR。FGF与其受体结合后，随后发生FGFR的二聚化作用和磷酸化作用以及经由FRS-GRB2停靠蛋白复合体的下游信号传导至RAS-MAPK信号传导级联和PI3K-AKT信号传导级联。所述第一个信号传导级联参与细胞生长和分化，后者参与细胞存活和命运决定(Katoh and Katoh,Int J Oncol2006,29:163-168)。
所有四种受体(FGFR1-FGFR4)及其剪接变体通过不同的FGF进行的协调信号传导是胚胎发育过程中适当的器官发生所必需的(Ornitz et al.,Genome Biol2001,2:3005)。在FGFR2的情形中，缺少所有FGFR2变体可导致胎盘和肢芽形成方面的缺陷，因而在E10.5导致死亡。特异性敲除FGFR2IIIb还导致死亡(在P0)，这与肺、垂体前叶、甲状腺、牙齿和四肢的发育不全相关，而破坏FGFR2IIIc变体是能存活的，同时显示出骨化延迟、成比例的矮小和颅底的骨连结(Eswarakumar and Schlessinger,2005)。人的FGFR2的种系活化突变在胚胎发生过程中导致严重的畸形，例如阿佩尔综合征或斐弗综合征中的冠状颅缝早闭和颅缝早闭(Robin et al.,in Gene Reviews,NCBI Bookshelf Washington,edts.Pagon etal.,1993)。在成年人中，FGFR2信号传导参与伤口愈合、上皮修复以及皮肤和粘膜的细胞保护作用(Braun et al.,Phil Trans R Soc Lond B2004,359:753-757)，以及损伤肝脏的再生(Steiling et al.,Oncogene2003,22:4380-4388；dissertation,SwissFederal Institute of Technology Zurich,2009)。FGFR2信号传导在梗死形成后心外膜衍生细胞(EPDC)向心脏中迁移的过程中的作用尚在讨论中，这是因为在胚胎发生过程中，FGF10/FGFR2信号传导是EPDC在致密心肌膜中迁移所必需的，该过程是完整的心脏发育所必需的(Vega-Hernández et al.,Development2011:3331-3340；Winter and De Groot,Cell Mol Life Sci2007,64:692-703)。
相反，通过FGFR2进行的种系非依赖性信号传导参与不同病症，例如痤疮(Katoh,Jof Invest Dermatol2009,129:1861-1867)、银屑病(Finch et al.,Am J Pathol1997,151:1619-1628；Xu et al.,J Invest Dermatol2011:131:1521-1529)、牙周炎(Li etal.,J Peridontal Res2005,40:128-138)、晒斑(solar lentigine)(Lin et al.,JournalDermatol Sci2010,59:91-97)、肠病(Brauchle et al.,J Pathol1996,149:521-529)、子宫内膜异位(Taniguchi et al.,Fertil Steril2008,89:478-480)、胆脂瘤(Yamamoto-Fukuda et al.,Eur Arch Otorhinolaryngol(2008)265:1173–1178；d'Alessandro etal.,Otol Neurotol.2010Sep；31(7):1163-9)、胆脂瘤型慢性中耳炎(Yamamoto-Fukuda etal.,Otol Neurotol.2010Jul；31(5):745-51)、动脉粥样硬化(Che et al.,Am J PhysiolHeart Circ Physiol300:H154–H161,2011)和癌症(参见下文)。
已公开了数篇研究，强调了FGFR2表达与癌症患者的不良结果之间的较强关联：
FGFR2和/或KGF的过表达与胃癌的扩张性生长和患者的更短存活时间相关(Matsunobu et al.,Int J Cancer2006,28:307-314；Toyokawa et al.,OncolReports2009,21:875-880)。因此在31-36.5％的所有测试的胃癌样品中检测到FGFR2的过表达(Matsunobu et al.,Int J Cancer2006,28:307-314；Toyokawa et al.,OncolReports2009,21:875-880)。腺癌(所有胃癌的70％)进一步分为两种不同的病理学类型，即肠型胃癌和弥散型胃癌。有趣的是，前一种攻击性较小的类型与活化的ErbB2致癌通路相关，而后一种攻击性更强的表型在FGFR2/PI3K通路中包含畸变(Yamashita et al.,SurgToday2011,41:24-38)。大约60％的胃腺癌属于弥散型，其余40％属于肠型(Werner etal.,J Cancer Res Clin Oncol2001,127:207-216)。FGFR2过表达存在于53％的弥散型胃癌样品中(Yamashita et al.,Surg Today2011,41:24-38)。综合所有数据，HER2和FGFR2过表达似乎发生在2种不同的患者群体中。可能地，FGFR2的表达部分地是由于基因扩增引起的，这是因为FGFR2的扩增可存在于大约7-10％的原发性胃癌中(Kunii et al.CancerRes2008,68:23-40-2348)。此外，FGFR2不仅只是在转移癌中存在，而且甚至在转移癌中比在原发性肿瘤中更强(Yamashita et al.,Surg Today2011,41:24-38)。
在乳腺癌中，FGFR2IIIb表达存在于57％的肿瘤样品中，但几乎不存在于健康组织中(Tamaru et al.2004,84:1460-1471)。KGF(FGF7)存在于45％的样品中，通常与FGFR2IIIb同时存在。当与既不表达FGF7也不表达FGFR2IIIb的原发性乳腺癌相比时，FGF7和其唯一的受体FGFR2IIIb的共表达与原发性肿瘤中的凋亡细胞数目显著减少相关(Tamaru et al.2004,84:1460-1471)。与在胃癌中相同，在乳腺癌中基因扩增也存在于：4％的三阴性乳腺癌(TNBC)中(Turner et al.Oncogene2010,29:2013-2023)。在乳腺癌中鉴定出一些小核多态性(SNP)，SNP与增加的乳腺癌风险相关(Hunter et al.NatureGenetics2007,6:870-874)。如果SNP位于内含子2中，则导致FGFR2的转录上调(KatohExpert Reviews2010,10:1375-1379)。有趣的是，FGFR1优先在ER阳性的乳腺癌中上调，而FGFR2优先在ER阴性的乳腺癌中上调(Katoh,Expert Reviews2010,10:1375-1379)。
在胰腺癌中，FGFR2IIIb和/或FGF7的过表达与静脉浸润强相关(Cho et al.,Am JPathol170:1964-1974)，借此FGFR2和FGF7的共表达存在于肿瘤细胞中，但是甚至更加大量的存在于与肿瘤细胞相邻的间充质细胞中(Ishiwata et al.,Am J Pathol1998,153:213-222)。
在上皮卵巢癌中，与正常组织相比，80％的测试情形中存在FGFR2的上调，70％的测试情形中FGF7存在于腹水中(Steele et al.,Oncogene20:5878-5887)。
FGFR2蛋白存在于所有测试的浸润性宫颈癌中，在肿瘤的浸润性前端强烈表达(Kawase et al.,Int J Oncol2010,36:331-340)。
在肺腺癌中，FGF7和FGFR2的共表达存在于51.6％的测试的情形中，与较低的分化等级、更高的增殖率、淋巴结转移和更短的5年存活率相关(Yamayoshi et al.,JPathol2004,204:110-118)。
在子宫内膜癌中，FGFR2的最频繁的活化突变存在于大约16％的子宫内膜癌中(Pollock et al.,Oncogene2007,26:7158-7162)。
在食管癌(EC)中，癌细胞中的FGF7和FGFR2的共表达存在于26％的患者中，这与更短的存活趋势相关(Yoshino et al.,Int J Oncol2007,31:721-728)。
在肝细胞癌中，FGFR2表达在低分化的肿瘤中被上调了4.7倍。该表达与门静脉浸润的发生和更短的无疾病生存时间相关(Harimoto et al.,Oncology2010,78:361-368)。
一些具有体外和体内的实验数据的出版物证实异常的FGFR2信号传导和肿瘤进展之间的因果关系：
敲低和/或抑制胃(Takeda et al.,Clin Cancer Res2007；13:3051-3057；Kuniiet al.,Cancer Res2008；68:2340-2348)、乳腺(Turner et al.Oncogene2010,29:2013-2023)、卵巢(Cole et al.,Cancer Biol Ther2010,10:495-504)和头颈鳞状上皮细胞(Marshall et al.,Clin Cancer Res2011,17:5016-5025)的癌细胞中的FGFR2，导致肿瘤细胞的增殖降低和/或凋亡增加。同样，在肿瘤异种移植物中，在过表达FGFR2的肿瘤细胞系中敲低FGFR2和抑制FGFR2，显示对胃(Takeda et al.,Clin Cancer Res2007；13:3051-3057)和卵巢(Cole et al.,Cancer Biol Ther2010,10:495-504)癌细胞系的生长抑制。此外，仅激活FGFR2的FGF7可在体外和在体内增加胃(Shin et al.,J Cancer Res ClinOncol2002,128:596–602)、乳腺(Zhang et al.,Anticancer Res1998,18:2541-2546)和卵巢(Cole et al.,Cancer Biol Ther2010,10:495-504)癌细胞系的增殖。此外，在含有具有激活突变的FGFR2的子宫内膜癌细胞系中敲低FGFR2还导致细胞周期停止并诱导细胞死亡(Byron et al.,Cancer Res2008,68:6902-6907)。
FGFR2信号传导在体外促进胃(Shin et al.,J Cancer Res Clin Oncol2002,128:596–602)、乳腺(Zhang et al.,Anticancer Res1998,18:2541-2546)和胰腺癌细胞系(Nomura et al.,Br J Cancer2008,99:305-313；Niu et al.,J Biol Chem2007,282:6601-6011)的迁移和侵入。
在食管癌中，FGFR2是肿瘤相关的成纤维细胞中上调最高的基因。分离的肿瘤相关的成纤维细胞释放出促进食管癌细胞增殖的可溶性因子(Zhang et al.,hum CancerBiol2009,15:4017-4022)，表明由间充质细胞表达的FGFR2也可促进肿瘤进展。
仅报道了有限量的抗FGFR2的抗体。Fortin et al.(J.Neurosci.2005,25:7470-7479)描述了封闭性的抗FGFR2的抗体。Wei et al.(Hybridoma2006,25:115-124)展示了仅特异性针对FGFR2IIIb的可抑制FGF诱导的细胞增殖的抗体。在WO2007/144893中，公开了结合FGFR2和FGFR3的抑制性抗体。在WO2010/054265和Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16:5750-5758)中，公开了抑制FGF结合的抗体。Bai et al.(Cancer Res.2010,70:7630-7639)描述了特异性针对FGFR2IIIb的抗体。R&D Systems出售在FGFR2测定法中中和活性的抗FGFR2的抗体。
总之，已知一些FGFR2剪接变体。此外，已知FGFR2相关的疾病是由于FGFR2的异常表达例如过表达或扩增引起的，或是由于多种突变的FGFR2蛋白引起的。但是，仍然缺乏可以解决多种不同的FGFR2相关疾病的疗法。
发明内容
本发明涉及提供抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，其在结合至过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2之后，降低FGFR2的细胞表面表达。本发明还提供了基于抗体的疗法，所述疗法用于FGFR2相关的疾病或病症，例如癌症，特别是用于表达FGFR2的肿瘤，例如胃癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤和膀胱癌。
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞，用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段抑制发育异常的细胞的生长的方法，用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗和检测癌症的方法。
本发明描述了抗体，其与现存的FGFR2抗体的区别在于它们在与过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2结合之后，降低FGFR2的细胞表面表达。本发明的实施方案是结合FGFR2的细胞外N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)(SEQ ID NO:63)的抗体或其抗原结合片段。本发明的抗体或其抗原结合片段a)在短时间内激活FGFR2，b)诱导FGFR2的内化，c)导致有效的降解，d)使表达FGFR2的癌细胞或肿瘤细胞脱敏以及e)最终导致这些抗体在体内肿瘤实验中的抗肿瘤活性。本发明的这些和其他目的在本文中更加详细地描述。
本发明的抗体可以与已知药物共同给药，在一些实例中所述抗体自身可以被修饰。例如，抗体可缀合至细胞毒性试剂、免疫毒素、毒性基团或放射性同位素，以有可能进一步增加效能。
本发明还提供了构成用于诊断恶性或发育不良病症的工具的抗体，在所述病症中，FGFR2表达与正常组织相比有所提高，或者FGFR2从所述细胞表面脱落并且变得可以在血清中检测到。提供了缀合至可检测的标记物的抗FGFR2的抗体。优选的标记物为放射性标记、酶、生色团或荧光剂。
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞，用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段抑制发育不良的细胞的生长的方法，和使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于治疗和检测癌症的方法。
本发明还涉及分离的核酸序列，每个所述分离的核酸序列可编码上述的特异性针对FGFR2的表位的抗体或其抗原结合片段。本发明的核酸适用于重组生产抗体或抗原结合抗体片段。因此，本发明还涉及含有本发明的核酸序列的载体和宿主细胞。
本发明的组合物可用于治疗性或预防性的应用。因此，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段和可药用的载体或赋形剂。在相关方面中，本发明提供了用于治疗与不希望存在的表达FGFR2的细胞相关的疾病或病症的方法。在优选的实施方案中，前述的疾病为癌症。这类方法包括给予有需求的受试者有效量的所述药物组合物的步骤，所述药物组合物包含本文记载的或考虑到的本发明的抗体。
本发明还提供了用于使用抗体文库以分离特异性结合FGFR2的一个或多个这类文库的成员的说明。
附图说明
图1：FGFR2结构的示意图。比较性地示出了α(SEQ ID NO:61)和β(SEQ ID NO:62)剪接变体。所述图示出了3个Ig样结构域(D1、D2和D3)、跨膜结构域(TM)和细胞内激酶结构域。标明了肝素结合位点(HBS)、酸性盒(AB)和可变的IIIb/IIIc部分结构域。氨基末端由N标记，羰基末端由C标记。本发明的抗体的结合表位用条纹表示。
图2：与10μg/ml的抗FGFR2的抗体短时间(15min)孵育后，MFM223中磷酸化FGFR2(P-FGFR2)水平的诱导。Y为“未处理的对照细胞的％”。如图所示，与未处理的对照细胞相比，抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1使P-FGFR2的ELISA信号增加了4倍。与之相反，在短时间孵育后所述对照IgG抗体和可商购自R&D的抗FGFR2的抗体(MAB665、MAB684、MAB6843)都未表现出任何对P-FGFR2水平的显著效应。这些结果揭示了在短时间孵育后本发明中描述的抗FGFR2的抗体对FGFR2的对抗效应。
图3：与10μg/ml的抗FGFR2的抗体长时间(24小时)孵育后，MFM223细胞对FGF7(25ng/ml，15min)介导的对P-FGFR2水平的诱导脱敏。Y为“未处理的对照细胞的％”。如图所示，抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1非常显著地降低了FGF7刺激后可达到的P-FGFR2的水平。在不用抗体处理方法处理的细胞中以及在用同种型对照IgG处理的细胞中，使用FGF7的刺激导致P-FGFR2水平增加约4倍。与之相反，在用抗FGFR2的抗体预处理24小时的样品中，FGF7仅将P-FGFR2水平诱导了1.37-1.4倍。
总之，这些结果表明延长细胞与本发明的抗FGFR2的抗体的孵育时间导致对使用FGF7的刺激的脱敏作用。
图4：与10μg/ml的抗FGFR2的抗体孵育4.5小时后，具有FGFR2过表达(MFM223、SNU16)或FGFR2突变(AN3-CA、MFE-296)的细胞系中FGFR2表面表达的下调(通过FACS分析测量)。Y为“对照细胞的％”。如图所示，抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1是仅有的在过表达FGFR2的细胞系(MFM223、SNU16)和具有FGFR2突变的细胞系(AN3-CA、MFE-296)中降低FGFR2表面表达的抗体。抗体例如MAB684和MAB6843(R&D)仅在不过表达FGFR2的细胞系中降低FGFR2表面表达。抗体例如GAL-FR21在具有FGFR2突变的细胞系中不降低FGFR2表面表达。
图5：在SNU16细胞中用抗FGFR2的抗体进行长时间(96小时)孵育后总FGFR2水平的下调。Y为“对照细胞的％”。X为“抗体浓度[μg/ml]”。如图所示，抗体M048-D01-hIgG1(白色)和M047-D08-hIgG1(条纹)在96小时后以剂量依赖的方式显著降低了总FGFR2水平。未结合的对照抗体(黑色)未表现出任何效应。这些结果表明抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1不仅导致表面FGFR2水平的短期降低，还导致总FGFR2水平的长期降低。
图6：M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1在结合至表达内源性FGFR2的细胞后特异性内化作用的时间进程的显微评价。Y为“颗粒计数/细胞”。X为“时间[min]”。在乳腺癌细胞系SUM52PE上研究了抗体(2.5μg/ml)的内化作用。在乳腺癌细胞系SUM52PE上研究抗体的内化作用。颗粒计数/细胞是以动态方式中测量。如图所示，增加的颗粒计数/细胞表明，抗体M048-D01-hIgG1(黑色正方形和实线)和M047-D08-hIgG1(黑色三角形和虚线)表现出快速的内化。同种型对照抗体(星型和虚线)未表现出任何内化。
图7：M048-D01-hIgG1(A,B)和M047-D08-hIgG1(C,D)在SUM52PE细胞中的内化作用表现出与Rab7(A,C)的共染色，而未与Rab11(B,D)共染色。GAL-FR21(E,F)和GAL-FR22(G,H)在SUM52PE细胞中的内化作用表现出与Rab11(F,H)的共染色，而未与Rab7(E,G)共染色。
图8：与PBS(实心圆，实线)和对照IgG的处理(实心三角，实线)相比，在用2mg/kgM017-B02-hIgG1(空心三角，实线)进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU-16异种移植物的生长。标绘了平均值+标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间[天]”。Y为“肿瘤面积[mm2]”。用M017-B02-hIgG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。
图9：与PBS(实心圆，实线)和对照IgG的处理(实心三角，实线)相比，在用2mg/kgM021-H02-hIgG1(空心三角，实线)进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU-16异种移植物的生长。标绘了平均值+标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间[天]”。Y为“肿瘤面积[mm2]”。用M021-H02-hIgG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。
图10：与PBS(实心圆，实线)和对照IgG的处理(实心三角，实线)相比，在用2mg/kgM048-D01-hIgG1(空心三角，实线)进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU-16异种移植物的生长。标绘了平均值+标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间[天]”。Y为“肿瘤面积[mm2]”。用M048-D01-hIgG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。
图11：与PBS(实心圆，实线)和对照IgG的处理(实心三角，实线)相比，在用2mg/kgM054-A05-hIgG1(空心三角，实线)进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU-16异种移植物的生长。标绘了平均值+标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间[天]”。Y为“肿瘤面积[mm2]”。用M054-A05-hIgG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。
图12：与PBS(实心圆，实线)相比，在用2mg/kg M054-D03-hIgG1(空心三角，实线)进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU-16异种移植物的生长。标绘了平均值+标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间[天]”。Y为“肿瘤面积[mm2]”。用M054-D03-hIgG1进行的处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。
图13：与PBS(实心圆，实线)相比，在用2mg/kg M047-D08-hIgG1(空心三角，实线)进行的腹膜内处理的情况下皮下SNU-16异种移植物的生长。标绘了平均值+标准偏差。X为“肿瘤接种后的时间[天]”。Y为“肿瘤面积[mm2]”。用M047-D08-hIgG1处理导致非常显著的肿瘤生长抑制。
图14：在肿瘤细胞接种后的第13天——肿瘤变得坏死前的最后时间点，皮下4T1肿瘤的肿瘤面积的点图。在该时间点，小鼠接受单独使用PBS的治疗(A)，每周2次静脉注射的5mg/kg的M048-D01-hIgG1的治疗(B)，口服的100mg/kg拉帕替尼(lapatinib)的治疗(C)，或每周2次静脉注射的5mg/kg的M048-D01-hIgG1和口服的100mg/kg拉帕替尼的治疗(D)。Y为第13天的肿瘤面积[mm2]，虚线表示平均值，实线表示中值。单独使用M048-D01-hIgG1的治疗导致肿瘤面积显著减小，而单独使用拉帕替尼未显著影响肿瘤面积。M048-D01-hIgG1与拉帕替尼的组合导致显著增加的抗肿瘤活性。
图15：在肿瘤细胞接种后的第13天——肿瘤变得坏死前的最后时间点，皮下4T1肿瘤的肿瘤面积的点图。在该时间点，小鼠接受单独使用PBS的治疗(A)，每周2次静脉注射的5mg/kg的M048-D01-hIgG1的治疗(B)，每周1次静脉注射的24mg/kg紫杉酚的治疗(C)，或每周2次静脉注射的5mg/kg的M048-D01-hIgG1并且每周1次静脉注射的24mg/kg紫杉酚的治疗(D)。Y为第13天的肿瘤面积[mm2]，虚线表示平均值，实线表示中值。单独使用M048-D01-hIgG1的治疗导致肿瘤面积显著减小，而单独使用紫杉酚未显著影响肿瘤面积。M048-D01-hIgG1与紫杉酚的组合导致显著增加的抗肿瘤活性。
图16：与PBS(空心菱形，实线)相比，在使用5mg/kg(实心三角，实线)、2mg/kg(实心圆，短划线)和1mg/kg(实心正方形，虚线)的M048-D01-hIgG1的腹膜内治疗的情况下，皮下的来源自患者的GC10-0608异种移植物的生长。标绘了平均值±平均值的标准误差。X为“在治疗情况下的时间[天]”。Y为“肿瘤体积[mm3]”。使用所有三种剂量的M048-D01-hIgG1进行的治疗均导致显著的肿瘤生长抑制。
图17：与PBS(空心菱形，实线)相比，在使用5mg/kg(实心三角，实线)、2mg/kg(实心圆，短划线)和1mg/kg(实心正方形，虚线)的M048-D01-hIgG1的腹膜内治疗的情况下，皮下的来源自患者的GC12-0811异种移植物的生长。标绘了平均值±平均值的标准误差。X为“在治疗情况下的时间[天]”。Y为“肿瘤体积[mm3]”。使用剂量为5和1mg/kg的M048-D01-hIgG1进行的治疗导致显著的肿瘤生长抑制。
图18：与对照抗体相比，使用抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1长期处理SNU16异种移植物后(2mg/kg，每周2次，腹膜内，最后给药后24h取得样品)，总FGFRE2[总FGFRE2]和磷酸化FGFR2[P-FGFR2]的下调。如图所示，与使用对照IgG1进行的处理相比，使用M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1进行的处理后总FGFR2[总FGFRE2]和磷酸化FGFR2[P-FGFR2]显著降低。激动蛋白充当上样对照。
图19：本发明的序列。
具体实施方式
本发明是基于新抗体的发现：所述抗体对FGFR2具有特异性的亲和力的并且可给予受试者治疗益处。本发明抗体可为人的、人源化的或嵌合的，可用于许多本文更加充分描述的情况中。
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。然而，以下参考文献可为本发明所属的技术领域的技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般性定义，并且只要这类定义合乎本领域中通常理解的含义，以下参考文献就可被引用和使用。这类参考文献包括但不限于Singleton et ah,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2d ed.1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；Hale&Marham,The HarperCollins Dictionary of Biology(1991)；和Lackie et al.,The Dictionary of Cell&Molecular Biology(3d ed.1999)；和Cellular and Molecular Immunology,Eds.Abbas,Lichtman and Pober,2nd Edition,W.B.Saunders Company。可查阅任何其他的本领域普通技术人员可获得的提供本文使用的具有本领域中通常理解的含义的术语定义的技术来源。为了本发明的目的，进一步定义以下术语。其他术语在说明书中的其他地方定义。当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一，”、“一个”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。因此，例如，提及“一个基因”是提及一个或多个基因并包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。
“人”抗体或其抗原结合片段在本文中被定义为是非嵌合的(例如，非“人源化的”)并且不来自(无论是整体还是部分)非人物种。人抗体或其抗原结合片段可源自人，或者可以为合成的人抗体。本文中“合成的人抗体”被定义为具有(全部或部分地)以计算机方法衍生自合成序列的序列的抗体，所述合成序列是基于对已知人抗体序列的分析。人抗体序列或其片段的计算机设计可通过以下方式实现：分析人抗体或抗体片段序列的数据库和利用由此获得的数据设计多肽序列。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是从人来源的抗体序列的文库(例如，基于采自人天然来源的抗体的这种文库)中分离的核酸所编码的人抗体或抗原结合片段。人抗体的实例包括记载于et al.,Nat.Biotechnol.2000,18(8):853-856中的抗体。
“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段：(i)来源于非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；(ii)其中非人抗体框架区的氨基酸被通过基因工程部分地调换为人氨基酸序列；或者(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人来源，而可变区的一个或多个框架为人来源的，并且恒定区(如果有的话)是人来源的。
“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中被定义为其中可变区来源于非人来源并且一些或全部恒定区来源于人来源的抗体或其抗原结合片段。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关(discrete)抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他免疫球蛋白污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
用于本文时，抗体“特异性结合至…”、是“特异性针对”或“特异性识别”目的抗原例如肿瘤相关的多肽抗原靶(本文中，FGFR2)，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗性试剂靶向表达所述抗原的细胞或组织，并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体(ortholog)和变体(例如突变形式、剪接变体，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。本文使用的术语“特异性识别”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽靶标上的表位，可以通过例如对抗原的单价KD低于约10-4M，或者低于约10-5M，或者低于约10-6M，或者低于约10-7M，或者低于约10-8M，或者低于约10-9M，或者低于约10-10M，或者低于约10-11M，或者低于约10-12M，或更低的抗体或其抗原结合片段来展现。如果抗体能够将抗原和一种或多种参考抗原区分开，那么这样的抗体“特异性结合至”、“特异性针对”或“特异性识别”所述抗原。在其最一般的形式中，“特异性结合”、“特异性结合至”、“特异性针对”或“特异性识别”是指按照例如以下方法之一测定的抗体区分目的抗原和不相关抗原的能力。这类方法包括，但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试以及肽扫描。例如，可进行标准ELISA测定。可以通过标准显色进行评分(例如，具有辣根过氧化物酶的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)。通过例如在450nm下的光密度来将某些孔中的反应评分。典型背景(＝阴性反应)可以为0.1OD；典型阳性反应可以为1OD。这意味着阳性/阴性的差异可以大于5倍、10倍、50倍，优选大于100倍。通常，通过使用不止单独一个参考抗原而是一组约3-5个不相关的抗原(例如奶粉、BSA、转铁蛋白等)来确定结合特异性。
“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣(binding partner)之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1：1的相互作用。离解常数“KD”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。配体-蛋白亲和力受到所述两个分子之间非共价分子间相互作用的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法测量，包括本文描述的那些。在一个实施方案中，本发明的“KD”或“KD值”是通过依照实施例7使用表面等离子共振测定法来测量，所述表面等离子共振测定法使用Biacore T100仪器(GE Healthcare Biacore,Inc.)。简言之，将抗体通过间接捕获试剂——抗人IgG Fc固定到CM5传感器芯片上。如制造商所描述，使用来自“人抗体捕获试剂盒”(BR-1008-39,GE Healthcare Biacore,Inc.)的试剂。每个小室固定大约5000共振单位(RU)单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体。注射抗FGFR2的抗体以达到大约200-600RU的捕获水平。将多种浓度的人、鼠、大鼠、狗和其他物种衍生的含有氨基酸1-15的FGFR2肽注射到固定的抗FGFR2的抗体上。进行线性参比室校正(in-line reference cell correction)及减去缓冲液样品后，产生传感图。离解平衡常数(KD)是基于以下计算：通过使用BiacoreEvaluation Software以一级1：1结合模型拟合传感图获得的缔合速率常数(kon)和离解速率常数的比例。其他合适的设备为BIACORE(R)-2000、BIACORE(R)-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)或ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。
为了确定对于抗体或抗体片段的结合的关键性残基，可使用例如肽的丙氨酸-扫描进行表位精细定位。因此，结合表位的每个氨基酸被丙氨酸残基置换，并且在基于ELISA的测定法中测试本发明的典型抗体的结合。因此，如实施例6所描述，当通过将一个残基变为丙氨酸，所述抗体就会失去其ELISA信号的多于50％时，该残基就被视为对于结合是关键性的。
用于本文时术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。所述重链恒定区可包括例如3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含1个结构域(CL)。所述VH和VL区可进一步细分为穿插在更保守的区域(称为框架区(FR))的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
用于本文时术语“互补决定区(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的氨基酸残基，互补决定区的存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(例如，轻链可变区中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat et al.,Sequences of Proteinsof Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.1991))和/或来自”高变环”的那些残基(例如，轻链可变区中的约残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia and Lesk；J Mol Biol196:901-917(1987))。在一些实例中，互补决定区可包括来自根据Kabat定义的CDR区和来自高变环的氨基酸。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可被分配到不同的“类”。存在五大类完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类中的若干还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区分别被称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。本文使用的抗体为通常已知的抗体和其功能片段。
抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合片段”在本文中被定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR1、-2和/或–3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，例如通过提供CDR的支架。优选地，所述“抗原结合区”至少包括可变轻链(VL)的氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，并且特别优选完整的VL和VH链(VL的氨基酸第1-109位和VH的氨基酸第1-113位；编号根据WO97/08320进行)。本发明中使用的优选的免疫球蛋白类为IgG。
本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双体；单域抗体(Dab)、线性抗体；单链抗体分子(scFv)；和由抗体片段形成的多特异性的(例如双或三-特异性的)抗体(C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann&S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。除了“多特异性的”或“多功能的”抗体以外的抗体被理解为使其每个结合位点相同。可以将F(ab’)2或Fab改造以最小化或完全除去发生在CH1和CL结构域之间的分子间二硫键相互作用。
本发明中考虑到的抗体或抗原结合抗体片段的变体为其中保持了所述抗体或抗原结合抗体片段对FGFR2的结合活性的分子。
本发明中考虑到的结合蛋白为例如抗体模拟物，例如Affibodies、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、Nanobodies(综述：Gebauer M.et al.,Curr.Opinion inChem.Biol.2009；13:245-255；Nuttall S.D.et al.,Curr.Opinion inPharmacology2008；8:608-617)。
用于本文时术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。如果通过本领域技术人员公知的任何方法证明在竞争性结合测定法中一种抗体与第二种抗体竞争，则称两种抗体“结合相同表位”。
“分离的”抗体是已经被鉴别并且从表达它的细胞的组分中分离的抗体。所述细胞的污染组分是会干扰所述抗体的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，所述抗体(1)被纯化至通过罗氏蛋白定量法(Lowry method)、UV-Vis光谱法或通过SDS-毛细管凝胶电泳(例如，在CaliperLabChip GXII、GX90或Biorad Bioanalyzer设备上)测定的，高于95重量％的抗体，并且在更优选的实施方案中,高于99重量％；(2)被纯化至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度；或者(3)被通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染的SDS纯化至同质。分离的天然抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。然而，通常情况下，分离的抗体是通过至少一个纯化步骤进行制备。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体(FcγRs)上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞，随后例如使用细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。典型的补体途径的活化是通过将补体系统的第一组分(C1q)与结合至其相应抗原的(适当亚类的)抗体结合来起始。为了评估补体活化，可进行CDC测定法，例如记载于Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol Methods202:163(1996)中的CDC测定法。例如在美国专利No.6,194,551Bl和WO1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。
术语免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)是指与一种或多种细胞毒性试剂缀合的抗体，所述细胞毒性试剂例如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶促活性毒素或其片段)，或者放射性同位素(即放射性缀合物)。免疫缀合物已经被用于在癌症的治疗过程中局部递送细胞毒性试剂，所述细胞毒性试剂即杀伤或抑制细胞的生长或增殖的药物(例如Liu et al.,ProcNatl.Acad.Sci.(1996),93,8618-8623)。免疫缀合物使得能够将药物部分靶向递送至肿瘤和其中的细胞内累积物，而全身性给予未缀合的药物可导致对正常细胞和/或组织产生不可接受的毒性水平。抗体-毒素缀合物中使用的毒素包括细菌毒素例如白喉毒素、植物毒素例如蓖麻毒蛋白、小分子毒素例如格尔德霉素。所述毒素可通过一些机制——包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制——发挥它们的细胞毒性效应。
分别相对于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分数(％)”，被分别定义为(根据需要)比对序列以及引入缺口以实现最大序列同一性百分数之后，候选序列中分别与参考多核苷酸或多肽序列中核酸或氨基酸残基相同的核酸或氨基酸残基的百分数。保守置换不被认为是序列同一性的一部分。优选不带缺口(un-gapped)的比对。目的是确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以以在本领域技术人员能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在要比较的序列全长上实现最大(maximal)对齐所需要的任何算法。
术语‘成熟的抗体’或‘成熟的抗原结合片段’例如成熟的Fab变体包括展示出更强的结合至——即亲和力增加的结合至——给定抗原(例如FGFR2的细胞外结构域)的抗体或抗体片段的衍生物。成熟是鉴定抗体或抗体片段的6个CDR中的少数导致该亲和力增加的突变的过程。成熟过程是用于将突变引入抗体的分子生物学方法和用于鉴定改善的结合物的筛选方法的结合。
本发明的抗体
本发明涉及通过提供抗FGFR2的抗体来抑制FGFR2阳性的癌细胞生长和肿瘤性疾病进展的方法。本发明提供了能够在结合至过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的FGFR2之后，减少FGFR2的表面表达的结合蛋白、抗体、其抗原结合抗体片段和所述抗体和片段的变体，本发明的另一个实施方案提供了抗体、其抗原结合抗体片段或其变体，其在过表达FGFR2的细胞以及表达突变的FGFR2的细胞中结合多种不同的表达FGFR2的细胞系，所述细胞包括但不限于过表达FGFR2的SNU16(ATCC-CRL-5974)和MFM223(ECACC-98050130)以及表达突变的FGFR2的AN3-CA(DSMZ-ACC267)和(MFE-296(ECACC-98031101)。
为此目的，本发明的一个实施方案提供了分离的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，或其抗原结合抗体片段，其特异性结合至存在于成熟的人FGFR2多肽的不同形式中的FGFR2表位(例如，参见对于FGFR2αIIIb为SEQ ID NO:61，对于FGFR2βIIIb为SEQ ID NO:62)，所述成熟的人FGFR2多肽由表达FGFR2的癌细胞系/癌细胞呈递，和/或被这些抗体以高亲和力结合。用于本文时，FGFR2的不同‘形式’包括但不限于不同同种型、不同剪接变体、不同糖型或经过不同的翻译和翻译后修饰的FGFR2多肽。FGFR2多肽在本文中被称为‘FGFR2’。
本发明的另一个实施方案提供了对于人给药具有安全性的抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体。
本发明的另一个实施方案提供了结合人FGFR2并且与另一物种的FGFR2交叉反应的抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体，所述另一物种的FGFR2包括但不限于鼠、大鼠、猕猴(macaca mulatta)、兔、猪和狗FGFR2。优选地，所述其他物种为啮齿动物，例如小鼠或大鼠。最优选地，所述抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体结合人FGFR2，并且与鼠FGFR2交叉反应。
本发明的另一个实施方案提供了结合至表达FGFR2的细胞之后被有效内化的抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体。本发明的抗体可与已知药物共给予，在一些实例中所述抗体自身可被修饰。例如，抗体可缀合至细胞毒性试剂、免疫毒素、毒性基团或放射性同位素以可能进一步增加效能。
本发明的另一个实施方案提供了这样的抗体、或其抗原结合抗体片段、或其变体，其在短期内活化FGFR2并在内化后导致FGFR2降解，因此导致不同的表达FGFR2的癌细胞或肿瘤细胞对FGF刺激的脱敏作用，最终抑制体内肿瘤生长。
本发明的另一个实施方案提供了构成用于诊断恶性的或发育不良性的病症的工具的抗体，在所述病症中与正常组织相比FGFR2表达提高，或者FGFR2从细胞表面脱落并在血清中可检测到。本发明提供了缀合至可检测的标记物的抗FGFR2的抗体。优选的标记物为放射性标记、酶、生色团或荧光剂。
在一个方面，本发明提供了这样的分离的抗体或其抗原结合片段，其含有结合细胞表面表达的FGFR2的结合抗原区域，并在结合至FGFR2之后降低FGFR2在过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达。在一个实施方案中，本发明提供了这样的分离的抗体或其抗原结合片段，其含有特异性结合天然的细胞表面表达的FGFR2的抗原结合区，并且在结合至FGFR2之后降低FGFR2在过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达。在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合天然的细胞表面表达的FGFR2，并且在结合FGFR2之后降低FGFR2在至少两种不同的过表达FGFR2的细胞和至少两种不同的表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合天然的细胞表面表达的FGFR2，并且(i)在结合FGFR2之后降低FGFR2在过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达和(ii)诱导FGFR2磷酸化。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合天然的细胞表面表达的FGFR2，并且(i)在结合FGFR2之后降低FGFR2在过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达和(ii)诱导FGFR2磷酸化，其中所述抗体使表达FGFR2的细胞对使用FGF7的刺激作用脱敏。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合天然的细胞表面表达的FGFR2，并且(i)在结合FGFR2之后降低FGFR2在过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达和(ii)诱导FGFR2的内化作用，从而导致FGFR2降解。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合天然的细胞表面表达的FGFR2，并且(i)在结合FGFR2之后降低FGFR2在过表达FGFR2的细胞和表达突变的FGFR2的细胞中的细胞表面表达和(ii)在异种移植肿瘤实验中降低肿瘤生长。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够降低在不同细胞系中的FGFR2细胞表面表达，所述细胞系包括但不限于过表达FGFR2的SNU16(ATCC-CRL-5974)和MFM223(ECACC-98050130)以及表达突变的FGFR2的AN3-CA(DSMZ-ACC267)和MFE-296(ECACC-98031101)。
在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够在结合FGFR2之后降低在过表达FGFR2的SNU16(ATCC-CRL-5974)和MFM223(ECACC-98050130)细胞以及表达突变的FGFR2的细胞系AN3-CA(DSMZ-ACC267)和MFE-296(ECACC-98031101)中的FGFR2细胞表面表达。
在优选的实施方案中，与未处理的或对照处理的细胞的FGFR2细胞表面表达相比，所述细胞表面降低为至少10％、15％、20％、25％或30％。
在另一个优选的实施方案中，与未处理的或对照处理的细胞的FGFR2细胞表面表达相比，96小时后的所述细胞表面降低为至少10％、15％、20％、25％或30％。
在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合FGFR2的细胞外的N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)(SEQ ID NO:63)。在FGFR2的N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中对于所述抗体或其抗原结合片段的结合来说关键性残基包括但不限于Arg1、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和Glu8。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞外的N末端表位(SEQID NO:63)的结合是由至少一个选自残基Arg1、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和Glu8的表位残基介导的。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞外的N末端表位(SEQID NO:63)的结合是通过由氨基酸丙氨酸置换至少一个选自残基Arg1、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和Glu8的表位残基而降低。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞外的N末端表位(SEQID NO:63)的结合是由至少一个选自残基Pro2、Leu6和Glu8的表位残基介导的。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞外的N末端表位(SEQID NO:63)的结合是通过由氨基酸丙氨酸置换至少一个选自残基Pro2、Leu6和Glu8的表位残基而降低。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞外的N末端表位(SEQ ID NO:63)的结合是由至少一个选自残基Pro2、Leu6和Glu8的表位残基介导的，并且与所述表位的结合不随所述表位的位置5的序列变化而改变。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与细胞外的N末端表位(SEQID NO:63)的结合是通过由氨基酸丙氨酸置换至少一个选自残基Pro2、Leu6和Glu8的表位残基而降低，并且与所述表位的结合不随所述表位的位置5的序列变化而改变。
在另一实施方案中，通过将FGFR2的N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中的至少一个氨基酸残基变为丙氨酸而使所述抗体或其抗原结合片段失去多于50％的其ELISA信号，(i)所述残基选自Pro2、Leu6和Glu8，或(ii)所述残基选自Arg1、Pro2、Phe4和Ser5。
在另一优选实施方案中，通过将FGFR2的N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中的至少一个氨基酸残基变为丙氨酸而使所述分离的抗体或其抗原结合片段失去多于50％的其ELISA信号，其中所述残基选自(包括但不限于)a)Pro2、Leu6和Glu8，或b)Arg1、Pro2、Phe4和Ser5，如表7中所描述。
在另一实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与至少一个选自如下的抗体竞争性结合FGFR2：“M048-D01”、“M047-D08”、“M017-B02”、“M021-H02”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“ＴPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”和“TPP-1415”。
整个说明书中，提及了表9和表10中所描述的以下本发明的优选抗体：“M017-B02”、“M021-H02”、“M047-D08”、“M048-D01”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“TPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”和“TPP-1415”。
M017-B02代表包含对应于SEQ ID NO:3(DNA)/SEQ ID NO:1(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:4(DNA)/SEQ ID NO:2(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
M021-H02代表包含对应于SEQ ID NO:13(DNA)/SEQ ID NO:11(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:14(DNA)/SEQ ID NO:12(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
M047-D08代表包含对应于SEQ ID NO:23(DNA)/SEQ ID NO:21(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:24(DNA)/SEQ ID NO:22(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
M048-D01代表包含对应于SEQ ID NO:33(DNA)/SEQ ID NO:31(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:34(DNA)/SEQ ID NO:32(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
M054-D03代表包含对应于SEQ ID NO:43(DNA)/SEQ ID NO:41(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:44(DNA)/SEQ ID NO:42(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
M054-A05代表包含对应于SEQ ID NO:53(DNA)/SEQ ID NO:51(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:54(DNA)/SEQ ID NO:52(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1397代表包含对应于SEQ ID NO:83(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:84(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1398代表包含对应于SEQ ID NO:93(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:94(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1399代表包含对应于SEQ ID NO:103(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:104(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1400代表包含对应于SEQ ID NO:113(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:114(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1401代表包含对应于SEQ ID NO:123(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:124(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1402代表包含对应于SEQ ID NO:133(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:134(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1403代表包含对应于SEQ ID NO:73(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:74(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1406代表包含对应于SEQ ID NO:153(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:154(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1407代表包含对应于SEQ ID NO:163(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:164(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1408代表包含对应于SEQ ID NO:173(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:174(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1409代表包含对应于SEQ ID NO:183(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:184(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1410代表包含对应于SEQ ID NO:193(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:194(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1411代表包含对应于SEQ ID NO:203(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:204(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1412代表包含对应于SEQ ID NO:213(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:214(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
TPP-1415代表包含对应于SEQ ID NO:143(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ IDNO:144(蛋白质)的轻链可变区的抗体。在另一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含这样的重链CDR序列或轻链CDR序列：其分别与以下抗体的至少一个(优选对应的)CDR序列至少50％、55％、60％、70％、80％、90或95％相同：“M048-D01”、“M047-D08”、“M017-B02”、“M021-H02”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“TPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”或“TPP-1415”；或者其分别与“M048-D01”、“M047-D08”、“M017-B02”、“M021-H02”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“TPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”或“TPP-1415”的VH或VL序列50％、60％、70％、80％、90％、92％或95％相同。
在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含表9和表10中所描述的至少一个CDR序列或至少一个重链可变序列或轻链可变序列。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:5(H-CDR1)、SEQ ID NO:6(H-CDR2)和SEQ ID NO:7(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:8(L-CDR1)、SEQ IDNO:9(L-CDR2)和SEQ ID NO:10(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:15(H-CDR1)、SEQ ID NO:16(H-CDR2)和SEQ ID NO:17(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:18(L-CDR1)、SEQ IDNO:19(L-CDR2)和SEQ ID NO:20(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:25(H-CDR1)、SEQ ID NO:26(H-CDR2)和SEQ ID NO:27(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:28(L-CDR1)、SEQ IDNO:29(L-CDR2)和SEQ ID NO:30(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:35(H-CDR1)、SEQ ID NO:36(H-CDR2)和SEQ ID NO:37(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:38(L-CDR1)、SEQ IDNO:39(L-CDR2)和SEQ ID NO:40(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:45(H-CDR1)、SEQ ID NO:46(H-CDR2)和SEQ ID NO:47(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:48(L-CDR1)、SEQ IDNO:49(L-CDR2)和SEQ ID NO:50(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:55(H-CDR1)、SEQ ID NO:56(H-CDR2)和SEQ ID NO:57(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:58(L-CDR1)、SEQ IDNO:59(L-CDR2)和SEQ ID NO:60(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:75(H-CDR1)、SEQ ID NO:76(H-CDR2)和SEQ ID NO:77(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:78(L-CDR1)、SEQ IDNO:79(L-CDR2)和SEQ ID NO:80(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ IDNO:85(H-CDR1)、SEQ ID NO:86(H-CDR2)和SEQ ID NO:87(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:88(L-CDR1)、SEQ IDNO:89(L-CDR2)和SEQ ID NO:90(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:95(H-CDR1)、SEQ ID NO:96(H-CDR2)和SEQ ID NO:97(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:98(L-CDR1)、SEQ IDNO:99(L-CDR2)和SEQ ID NO:100(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:105(H-CDR1)、SEQ ID NO:106(H-CDR2)和SEQ ID NO:107(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:108(L-CDR1)、SEQ ID NO:109(L-CDR2)和SEQ ID NO:110(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:115(H-CDR1)、SEQ ID NO:116(H-CDR2)和SEQ ID NO:117(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:118(L-CDR1)、SEQ ID NO:119(L-CDR2)和SEQ ID NO:120(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ IDNO:125(H-CDR1)、SEQ ID NO:126(H-CDR2)和SEQ ID NO:127(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:128(L-CDR1)、SEQ ID NO:129(L-CDR2)和SEQ ID NO:130(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:135(H-CDR1)、SEQ ID NO:136(H-CDR2)和SEQ ID NO:137(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:138(L-CDR1)、SEQ ID NO:139(L-CDR2)和SEQ ID NO:140(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:145(H-CDR1)、SEQ ID NO:146(H-CDR2)和SEQ ID NO:147(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:148(L-CDR1)、SEQ ID NO:149(L-CDR2)和SEQ ID NO:150(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:155(H-CDR1)、SEQ ID NO:156(H-CDR2)和SEQ ID NO:157(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:158(L-CDR1)、SEQ ID NO:159(L-CDR2)和SEQ ID NO:160(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:165(H-CDR1)、SEQ ID NO:166(H-CDR2)和SEQ ID NO:167(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:168(L-CDR1)、SEQ ID NO:169(L-CDR2)和SEQ ID NO:170(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:175(H-CDR1)、SEQ ID NO:176(H-CDR2)和SEQ ID NO:177(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:178(L-CDR1)、SEQ ID NO:179(L-CDR2)和SEQ ID NO:180(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:185(H-CDR1)、SEQ ID NO:186(H-CDR2)和SEQ ID NO:187(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:188(L-CDR1)、SEQ ID NO:189(L-CDR2)和SEQ ID NO:190(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:195(H-CDR1)、SEQ ID NO:196(H-CDR2)和SEQ ID NO:197(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:198(L-CDR1)、SEQ ID NO:199(L-CDR2)和SEQ ID NO:200(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:205(H-CDR1)、SEQ ID NO:206(H-CDR2)和SEQ ID NO:207(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:208(L-CDR1)、SEQ ID NO:209(L-CDR2)和SEQ ID NO:210(L-CDR3)。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区和轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:215(H-CDR1)、SEQ ID NO:216(H-CDR2)和SEQ ID NO:217(H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含SEQ ID NO:218(L-CDR1)、SEQ ID NO:219(L-CDR2)和SEQ ID NO:220(L-CDR3)。
本发明的抗体可为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，而抗体片段可为例如Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv。因此，本发明的抗体片段可为或可含有，以本文所描述的一种或多种方式起作用的抗原结合区。
例如，抗体Fab片段M048-D01(对于VH链为SEQ ID NO:31，对于VL链为SEQ ID NO:32)被表达为人IgG1M048-D01-hIgG1(对于重链为SEQ ID NO:67，对于轻链为SEQ ID NO:68)，并且Fab片段M047-D08(对于VH链为SEQ ID NO:21，对于VL链为SEQ ID NO:22)被表达为人IgG1M047-D08-hIgG1(对于重链为SEQ ID NO:69，对于轻链为SEQ ID NO:70)。为了有效的克隆，重链(SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69)N末端的前3个氨基酸[EVQ]或者还可被表达为[QVE]，例如被表达为人IgG1M048-D01-hIgG1(SEQ ID NO:222)的重链的变体。为了有效的克隆，轻链的N末端可由氨基酸残基例如丙氨酸延长。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段为单克隆的。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段为人的、人源化的或嵌合的。
在另一方面中，本发明提供了具有抗原结合区的抗体或抗原结合片段，其不依赖于α和β同种型以及IIIb和IIIc剪接形式而特异性结合FGFR2和/或具有高的针对FGFR2的亲和力(例如，参见，对于FGFR2αIIIb为SEQ ID NO:61，对于FGFR2βIIIb为SEQ ID NO:62)。如果亲和力测量为小于250nM(所述抗体或抗原结合片段的单价亲和力)，那么就说抗体或抗原结合片段具有对抗原的“高亲和力”。本发明的抗体或抗原结合区优选地可以小于250nM，优选小于150nM的亲和力结合至人FGFR2，所述亲和力作为对人FGFR2的单价亲和力来确定。例如，抗来自不同物种的FGFR2的本发明抗体的亲和力可为大约100nM(所述抗体或抗原结合片段的单价亲和力)，如表8对于M048-D1和M047-D08所示例性地示出的。
IgG1型用于通过荧光激活细胞分类术(FACS)进行的基于细胞的亲和力的确定。表6提供了代表性的抗FGFR2-IgG的抗体在人(SNU16、MFM223)、鼠(4T1)和大鼠(RUCA)来源的癌细胞系上的结合强度(EC50)的总结。
如果通过FACS测量的亲和力测量结果为小于100nM(IgG的表观亲和力)，那么就说IgG1具有对抗原的“高亲和力”。本发明的二价抗体或抗原结合片段优选地可以以小于100nM，更优选小于50nM，仍更优选小于10nM的亲和力结合FGFR2。还优选的是，以小于5nM，和更优选小于1nM的亲和力结合FGFR2的二价抗体，所述亲和力被确定为IgG对FGFR2的表观亲和力。例如，在人、小鼠和大鼠来源的不同肿瘤细胞系上本发明抗体对FGFR2的表观亲和力可为约89.5nM或小于0.1nM，所述亲和力是通过FACS分析确定，如表6中所描述。
当本发明的抗体或抗原结合片段的内化进表达FGFR2的肿瘤细胞中半最大内化时间(t1/2)为短于180min或更优选短于120min并且仍更优选短于90min时，本发明的抗体或抗原结合片段“有效”内化。还优选的是，半最大内化时间(t1/2)为60分钟或更短的抗体或抗原结合片段，所述t1/2是通过实施例12中所述的方案确定。
小G蛋白的共染色可用于更加详细的评价内化后抗体的运输途径。例如Rab GTP酶可用于区分不同的途径，所述Rab GTP酶调节膜运输的许多步骤，包括囊泡形成、囊泡沿着肌动蛋白和微管蛋白网络移动和膜融合。因此，在晚期内体和溶酶体中表达的Rab7与经标记的抗体的共染色指示FGFR2内化之后所述复合体进入内体-溶酶体途径，而用在早期内体和再循环内体中表达的Rab11进行的共染色则指示这些抗体结合FGFR2之后发生内化并侧重于再循环途径。进入胞内体-溶酶体途径使得所述抗体能够在内化后诱导FGFR2的降解，这最终导致该途径的脱敏。图7示出了实施例12中所述的本发明的典型抗体与Rab7和Rab11的共染色模式。
本发明的可内化抗体或抗原结合片段适于作为抗体-药物缀合物(ADC)的靶向部分。抗体或抗原结合片段适于在体外或体内方法中将化合物优选细胞毒性剂递送至表达FGFR2的细胞中。
在一些实施方案中，分离了抗体、其抗原结合片段，或其衍生物或编码它们的核酸。分离的生物学组分(例如核酸分子或蛋白质，例如抗体)是已从所述组分天然存在的生物体的细胞中其他生物学组分(例如，其他的染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)中基本上分离或纯化出来的生物学组分。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质，所述纯化方法例如Sambrook et al.,1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)和Robert K.Scopes eatal1994(Protein Purification,-Principles and Practice,Springer Science andBusiness Media LLC)中所述。该术语也包括通过宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸。
本发明的抗体可来源于重组抗体文库，所述重组抗体文库基于已经从大量健康志愿者的抗体中分离的氨基酸序列。使用技术可将完全的人CDR重组至新的抗体分子中。独特的重组方法使得所述文库能够含有比由人免疫系统天然产生的抗体种类更多的抗体。
抗体产生
通过全细胞和蛋白质淘选(panning)的组合并且通过开发特异性方法，将完全人N-CoDeR抗体噬菌体展示文库用于分离本发明的FGFR2特异性的人单克隆抗体和其抗原结合片段。这些方法包括能够鉴定抗体的淘选方法和筛选测定法的开发，所述抗体优先结合细胞表面上展示的FGFR2并且可与鼠FGFR2和来自其他物种的FGFR2交叉反应，并且具有不依赖于FGFR2过表达和在FGFR2相关疾病例如癌症中存在的普通FGFR2突变的结合和功能活性。
通过噬菌体展示技术(PDT)中三种非常规方法的结合来开发针对细胞表面FGFR2的抗体。首先，使用某些剪接变体(α、β、IIIb和IIIc)的重组、可溶、人和鼠FGFR2Fc融合蛋白进行选择，以选择非常宽的剪接变体交叉反应性。第二，使用其细胞表面表达FGFR2的KATOIII细胞来进行额外的细胞表面选择。第三，开发筛选方法，其允许连续筛选在全KATOIII细胞的淘选中获得的噬菌体输出，以及某些剪接变体(α、β、IIIb和IIIc)的重组、可溶、人和鼠FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4Fc融合蛋白，以选择具有非常宽的剪接变体交叉反应性的FGFR2特异性结合体(不结合FGFR1、FGFR3和FGFR4)。
鉴定优选的Fab片段之后，将这些Fab片段表达为全长IgG。例如抗体Fab片段M048-D01(对于VH链为SEQ ID NO:31，对于VL链为SEQ ID NO:32)被表达为人IgG1M048-D01-hIgG1(对于重链为SEQ ID NO:67，对于轻链为SEQ ID NO:68)，以及Fab片段M047-D08(对于VH链为SEQ ID NO:21，对于VL链为SEQ ID NO:22)被表达为人IgG1M047-D08-hIgG1(对于重链为SEQ ID NO:69，对于轻链为SEQ ID NO:70)。为了有效的克隆，重链(SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69)N末端的前3个氨基酸[EVQ]或者还可被表达为[QVE]，例如被表达为人IgG1M048-D01-hIgG1(SEQ ID NO:222)的重链的变体。为了有效的克隆，轻链的N末端可由氨基酸残基例如丙氨酸延长。例如这些构建体在哺乳动物细胞中短暂表达，如Tom et al.,Chapter12in Methods Express:Expression Systems edited by Micheal R.Dyson andYves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007中所记载。简言之，将基于CMV-启动子的表达质粒转染至HEK293-6E细胞中，在Fernbach烧瓶或摇袋(Wave-Bag)中孵育。在F17培养基(Invitrogen)中于37℃下表达5-6天。转染后24小时补充5g/l胰蛋白胨TN1(Organotechnie)、1％Ultra-Low IgG FCS(Invitrogen)和0.5mM丙戊酸(Sigma)。
通过这些抗体在ELISA中的结合亲和力和通过与可溶性FGFR2的BIAcore结合来进一步表征这些抗体。实施使用来自不同物种的细胞进行的FACS结合，以选择在小鼠、大鼠和人癌细胞系上具有高亲和力的细胞结合抗体。
这些特定方法的组合使得能够分离独特的抗体“M017-B02”、“M021-H02”、“M047-D08”、“M048-D01”、“M054-A05”和“M054-D03”。
进一步的表征揭示了所选择的抗体结合至FGFR2的N末端上的独特表位，导致其特有的特征。在体外磷酸化测定法、内化测定法和体内肿瘤异种移植物实验中进一步表征这些独特的抗体。在使用SNU16细胞的肿瘤异种移植物实验中，所选择的抗体表现出强烈且显著的抗肿瘤活性。
肽变体
本发明的抗体或抗原结合片段不限于本文提供的具体肽序列。相反，本发明还包括这些多肽的变体。参考本公开内容和常规可用技术和参考文献，技术人员能够制备、测试和利用本文公开的抗体的功能性变体，同时应理解具有结合FGFR2能力的这些变体落在本发明的范围内。
变体可包括例如，与本文公开的肽序列相比，具有至少一个改变的互补决定区(CDR)(高变的)和/或框架(FR)(可变的)域/位置的抗体。为了更好地说明这个概念，下文简要描述抗体结构。
抗体由两条肽链组成，每条链含有1个(轻链)或3个(重链)恒定结构域和1个可变区(VL、VH)，后者在每种情况下均由4个FR区和3个间隔的CDR组成。所述抗原结合位点由一个或多个CDR形成，而FR区为所述CDR提供结构框架，并且因此在抗原结合中起重要作用。通过改变CDR或FR区中的一个或多个氨基酸残基，技术人员可常规地产生突变的或多样化的抗体序列，所述抗体序列可用所述抗原进行筛选，用于例如筛选新的或改善的特性。
本发明的另一个优选实施方案为其中如表9所示选择了VH和VL序列的抗体或抗原结合片段。技术人员可使用表9中的数据设计本发明范围内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体；变体还可以具有一个或多个改变的框架区。还可在框架区进行改变。例如，可改变其中与种系序列相比残基有偏差的肽FR结构域。
或者，技术人员可通过使用例如nappik A.,et al.,JMB2000,296:57-86所记载的方法，将本文公开的氨基酸序列与这类抗体的相同类别的已知序列进行比较，来进行相同的分析。
此外，可如下获得变体：通过使用一种抗体作为优化的起点，通过使所述抗体中的一个或多个氨基酸残基，优选一个或多个CDR中的氨基酸残基多样化，并且通过筛选所得的抗体变体集合以获得具有改善特性的变体。特别优选的是VL和/VH的CDR3中的一个或多个氨基酸残基的多样化(diversification)。多样化可通过采用三核苷酸诱变(TRIM)技术(B.et al.,Nucl.Acids Res.1994,22:5600.)来合成一批DNA分子来进行。抗体或其抗原结合片段包括具有修饰/变化的分子，所述修饰/变化包括但不限于例如导致半衰期改变(例如，修饰Fc部分或连接其他分子例如PEG)、结合亲和力改变或者ADCC或CDC活性改变的修饰。
如表10中所述，给出了M048-D01(TPP-1397、TPP-1398、TPP-1399、TPP-1400、TPP-1401、TPP-1402和TPP-1403)和M047-D08(TPP-1406、TPP-1407、TPP-1408、TPP-1409、TPP-1410、TPP-1411、TPP-1412和TPP-1415)的抗体变体的实例。这些变体抗体的改善特性示于表11。
保守性氨基酸变体
可以使得多肽变体保留本文所述的抗体肽序列的整体分子结构。考虑到各氨基酸的特性，技术人员会认识到一些合理的置换。氨基酸置换，即“保守性置换”，可以例如在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性的基础上进行。
例如，(a)非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；(c)荷正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；(d)荷负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。置换通常可以在(a)-(d)组内进行。此外，基于它们破坏α-螺旋的能力，甘氨酸和脯氨酸可以相互置换。相似地，某些氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更常见地存在于α-螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更常见地存在于β-折叠片中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常见地存在于转角(turn)中。一些优选的置换可以在下组中进行：(i)S和T；(ii)P和G；(iii)A、V、L和I。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，技术人员可以容易地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。
用于本文时，两条多肽序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。“序列同源性”表示相同的或代表保守性氨基酸置换的氨基酸的百分比。
本发明的DNA分子
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA分子。这些序列包括但不限于SEQ IDs3、4、13、14、23、24、33、34、43、44、53和54所示的那些DNA分子。
本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中的DNA变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。技术人员会认识到利用核酸杂交技术，DNA可用于鉴别其互补物以及(因为DNA是双链的)其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100％互补性发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交技术可用于基于DNA序列与与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见，Sambrook et al.,1989supra and Ausubel et al.,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols inMolecular Biology.New York:John Wiley and Sons)。
两条多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为这两个序列会彼此杂交的条件的“严格性”的函数。用于本文时，术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格条件非常不利于杂交，并且仅结构上最相关的分子会在这类条件下彼此杂交。相反地，非-严格条件有利于表现出较低程度的结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两条核酸序列的结构关系直接相关。以下关系可用于关联杂交与相关性(其中Tm为核酸双链体的解链温度)：
a.Tm＝69.3+0.41(G+C)％
b.错配碱基对数目每增加1％，双链体DNA的Tm降低1℃。
c.(Tm)μ2-(Tm)μ1＝18.5log10μ2/μ1
其中，μ1和μ2为两种溶液的离子强度。
杂交严格性是许多因素的函数,包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小以及破坏氢键的试剂的存在情况。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小以及不存在破坏氢键的试剂。杂交通常在两个阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
功能等同的变体
本发明的范围内的另一类DNA变体可参考它们编码的产物来描述。这些功能等同的多核苷酸通过以下事实表征：由于遗传密码的简并性，它们编码SEQ ID NO:1、2、5-12、15-22、25-32、35-42、45-52、55-60中存在的相同肽序列。
据认为，本文提供的DNA分子的变体可以以若干种不同的方式构建。例如，它们可以构建为完全合成的DNA。有效合成在20至约150个核苷酸的范围内的寡核苷酸的方法可广泛获得。参见Ausubel et al.,section2.11,Supplement21(1993)。重叠寡核苷酸可以通过Khorana et al.,J.Mol.Biol.72:209-217(1971)首先报道的方式合成和装配；也参见Ausubel et al.,supra，Section8.2。优选地设计合成的DNA以在所述基因的5'和3'末端改造出方便的限制性位点，以便于克隆至适当载体中。
如本文所示，产生变体的方法是从本文公开的DNA之一开始，然后进行定点突变。参见Ausubel et al.,supra,chapter8,Supplement37(1997)。在典型方法中，将靶DNA克隆至单-链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA，并将其与含有所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，并且将双链噬菌体引入宿主中。一些所得的子代会含有所需的突变，这可以利用DNA测序来证实。此外，可以使用多种方法来增加子代噬菌体为所述突变体的可能性。这些方法对于本领域的技术人员是已知的，并且用于产生这类突变体的试剂盒是可商购的。
重组DNA构建体和表达
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体可与载体一起使用，所述载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA分子插入所述载体中。
本文提供的抗体、抗原结合部分或其衍生物可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体、抗原结合部分或其衍生物，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning；ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)、Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates,(1989)和Boss et al.的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
此外，可将编码所述重链和/或轻链的可变区的核酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或ScFv的核酸序列。可以将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接(以使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框架中)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的(参见，例如Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)，包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。
在某些测定法中，优选本发明的抗体表达为鼠IgG，例如通过使用鼠抗体可以更容易地分析采用人样品的免疫组织化学。因此，例如抗体Fab片段M048-D01(对于VH链为SEQID NO:31，对于VL链为SEQ ID NO:32)被表达为鼠IgG2a，被称为M048-D01-mIgG2a(对于重链为SEQ ID NO:221)。该抗体还用于实施例17中作为对照。
为了产生编码scFv的多核苷酸序列，可将编码VH和VL的核酸可操作连接至编码柔性接头的另一片段，以使得所述VH和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，且所述VL和VH区通过所述柔性接头连接在一起(参见，例如Bird et al.(1988)Science242:423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554)。
为了表达所述抗体、抗原结合部分或其衍生物，可使用标准重组DNA表达方法(参见，例如，Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990))。例如，可将编码所需多肽的DNA插入至表达载体中，随后将所述表达载体转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为例如细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码所述重链和轻链的DNA插入至不同载体中。在其他实施方案中，将编码所述重链和轻链的DNA插入至同一载体中。应理解，包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
细菌表达
通过将编码所需蛋白的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号以及有功能的启动子插入可操作阅读相(phase)中，来构建可用于细菌的可用表达载体。所述载体会包含一个或多个表型选择标记以及复制起点以确保维持所述载体，以及根据需要在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个种。
细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可含有选择标记和细菌复制起点，其来源于通常含有公知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的元件的可商购的质粒。转化合适的宿主菌株并使所述宿主菌株生长至适当细胞密度之后，通过适当的方法(例如，温度变化或化学诱导)将所选择的启动子去阻遏/诱导，并且将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法使细胞破裂，并且保留所得的粗提取物用于进一步纯化。
在细菌系统中，根据所表达的蛋白的目的用途，可有利地选择多种表达载体。例如，当要生产大量这样的蛋白用于生产抗体或用于筛选肽文库时，例如，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。
因此，本发明的实施方案为包含编码本发明的新抗体的核酸序列的表达载体。参见实施例2的示例性描述。
本发明的抗体或其抗原结合片段包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核宿主产生的产物，所述原核宿主包括，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的多个种，优选大肠杆菌细胞。
哺乳动物表达和纯化
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件、例如源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)的启动子和/或增强子(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒的启动子和/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述参见例如，Stinski的U.S.5,168,062、Bell etal.的U.S.4,510,245和Schaffner et al的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如，Axel et al的U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括赋予已经引入所述载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，而neo基因赋予对G418的抗性。对于有效的克隆，重链(SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69)N末端的前3个氨基酸[EVQ]或者还可被表达为[QVE]，例如被表达为人IgG1M048-D01-hIgG1(SEQ ID NO:222)的重链的变体。对于有效的克隆，轻链的N末端可由氨基酸残基例如丙氨酸延长。
将所述表达载体至宿主细胞中的转染可以利用标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染来进行。
用于表达本文提供的抗体、抗原结合部分或其衍生物的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-CHO细胞，记载于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中，使用DHFR选择标记，例如记载于R.J.Kaufmanand P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中]，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计表达载体，使得所表达的蛋白分泌至所述宿主细胞生长的培养基中。所述抗体、抗原结合部分或其衍生物可使用标准蛋白质纯化方法从所述培养基中回收。
本发明的抗体或其抗原结合片段可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述公知方法包括，但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、Protein A色谱法、Protein G色谱法、阴离子或阳林子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan,Current Protocols in Immunology,或Current Protocols in ProteinScience,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文纳入本文。
本发明的抗体或其抗原结合片段包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括，例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产方法中所使用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的。这类方法记载于许多标准实验室手册中，例如上文的Sambrook，第17.37-17.42节；上文的Ausubel，第10、12、13、16、18和20章。
因此，本发明的实施方案还为包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可为高等真核宿主细胞例如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞例如酵母细胞，并可为原核细胞例如细菌细胞。
本发明的另一个实施方案是使用所述宿主细胞产生抗体和抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养所述宿主细胞并回收所述抗体。
因此，本发明的另一个实施方案是使用本发明的宿主细胞产生本发明抗体(例如抗体M048-D01-hIgG1)，以及将这些抗体纯化至至少95重量％的同质性。
治疗方法
治疗方法包括向有治疗需要的受试者给予治疗有效量的本发明考虑到的抗体或其抗原结合片段。“治疗有效”量在本文定义为抗体或抗原结合片段的量，其是足以作为单一剂量或根据多剂量方案，单独或联合其他试剂，耗尽受试者治疗区中的FGFR2阳性细胞的量，这导致不利病症的减轻，而且所述量是毒理学上可耐受的。所述受试者可为人或非人动物(例如兔、大鼠、小鼠、狗、猴子或其他更低目的灵长类)。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以与已知药物共同给药，并且在一些实例中，所述抗体本身可被修饰。例如，抗体可缀合至细胞毒性试剂或放射性同位素，以可能进一步增加效能。
本发明的抗体可以作为单独的药物试剂给予或与一种或多种额外的治疗性试剂组合给予，其中所述组合不会引起不可接受的不利影响。该组合疗法包括给予含有本发明的抗体和一种或多种额外的治疗性试剂的单一药物剂型，以及给予其自己单独的药物剂型形式的本发明抗体和每种额外的治疗性试剂。例如，本发明的抗体和治疗性试剂可以以单一口服剂量组合物的形式例如片剂或胶囊剂共同给予所述患者，或者每种试剂可以以单独的剂型形式给予。
当使用单独的剂型时，本发明的抗体和一种或多种额外的治疗性试剂可以在基本上相同的时间(例如同时地)或者在各自错开的时间(例如惯序地)给予。
具体地，本发明的抗体可以与其他抗肿瘤试剂固定组合或单独组合使用，所述其他抗肿瘤试剂例如烷化剂、抗代谢药、植物来源的抗肿瘤试剂、激素治疗试剂、拓扑异构酶抑制剂、喜树碱衍生物、激酶抑制剂、靶向药物、抗体、干扰素和/或生物应答调节剂、抗血管生成的化合物，以及其他抗肿瘤药物。在这方面，以下是可以与本发明的抗体组合使用的第二试剂的实例的非限制性列表：
烷化剂包括，但不限于，氮芥N氧化物、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、六甲蜜胺、阿帕齐醌、溴他利星、苯达莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福莫司汀、葡膦酰胺、马磷酰胺、苯达莫司汀和二溴卫矛醇；铂配位的烷化化合物包括，但不限于，顺铂、卡铂、艾铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂和沙铂；
抗代谢药包括，但不限于，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤核苷、巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶(单独或与亚叶酸组合)、替加氟、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、依诺他滨、吉西他滨、氟达拉宾、5-阿扎胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、地西他滨、依氟鸟氨酸、乙炔基胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、羟基脲、美法仑、奈拉滨、诺拉曲塞、十八烷基磷酸盐(ocfosfite)、培美曲塞二钠、喷司他丁、吡利曲索、雷替曲塞、triapine、三甲曲沙、阿糖腺苷、长春新碱和长春瑞滨；
激素治疗剂包括，但不限于，依西美坦、亮丙瑞林、阿那曲唑、度骨化醇、法罗唑、福美坦、11-β羟基类固醇脱氢酶1抑制剂、17-α羟化酶/17，20裂解酶抑制剂例如醋酸阿比特龙、5-α还原酶抑制剂例如非那雄胺和爱普列特、抗雌激素类例如枸橼酸他莫昔芬和氟维司群、曲普瑞林、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、来曲唑、抗雄激素类例如比卡鲁胺、氟他胺、米非司酮、尼鲁米特、康士得和抗黄体酮及其组合；
植物来源的抗肿瘤物质包括例如选自有丝分裂抑制剂的物质，例如埃博霉素例如沙戈匹隆、伊沙匹隆和爱波喜龙B、长春碱、长春氟宁、多西他赛和紫杉醇；
细胞毒性拓扑异构酶抑制剂包括但不限于阿柔比星、多柔比星、氨萘非特、贝洛替康、喜树碱、10-羟喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟替康、伊立替康、托泊替康、艾特咔林、epimbicin、依托泊苷、依沙替康、吉马替康、勒托替康、米托蒽醌、pirambicin、匹克生琼、芦比替康、索布佐生、他氟泊苷及其组合；
免疫药包括干扰素(例如干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a和干扰素γ-n1)和其他免疫增强剂例如L19-IL2和其他IL2衍生物、非格司亭、香菇多糖、西左非兰、TheraCys、乌苯美司、阿地白介素、阿仑珠单抗、BAM-002、达卡巴嗪、达克珠单抗、地尼白介素、吉妥珠单抗、奥加米星、替伊莫单抗、咪喹莫德、来格司亭、香菇多糖、黑素瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭、沙格司亭、他索纳明、替西白介素、胸腺法新、托西莫单抗、Vimlizin、依帕珠单抗、米妥莫单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗和Provenge；
生物反应调节剂是改进活生物的防御机制或生物反应(例如组织细胞的存活、生长或分化)以引导它们具有抗肿瘤活性的药剂；这类药剂包括例如云芝多糖、香菇多糖、西佐喃、溶血性链球菌制剂(picibanil)、ProMune和乌苯美司；
抗血管生成化合物包括但不限于阿维A、阿柏西普、血管生长抑素、阿普立定(aplidine)、asentar、阿昔替尼、贝伐单抗、丙氨酸布立尼布(brivanib alaninat)、西仑吉肽(cilengtide)、考布他汀、内皮生长抑素、芬维A胺、齿夫酮、帕唑帕尼、雷珠单抗、瑞马司他、瑞司汀(recentin)、瑞戈非尼,、卡妥索单抗(removab)、来那度胺(revlimid)、索拉非尼、角鲨胺、舒尼替尼、替拉替尼、沙利度胺、ukrain、伐他拉尼和维他辛(vitaxin)；
抗体包括但不限于曲妥单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、替西木单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、卡妥索单抗(catumaxomab)、阿塞西普、奥戈伏单抗和阿仑珠单抗；
VEGF抑制剂例如索拉非尼、瑞戈非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、瑞司汀、阿昔替尼、阿柏西普、替拉替尼、丙氨酸布立尼布、伐他拉尼、帕唑帕尼和雷珠单抗；
EGFR(HERl)抑制剂例如西妥昔单抗、帕尼单抗、维克替比(vectibix)、吉非替尼、埃罗替尼和凡德他尼(Zactima)；
HER2抑制剂例如拉帕替尼、曲妥单抗(tratuzumab)和培妥珠单抗；
mTOR抑制剂例如坦罗莫司、西罗莫司/雷帕霉素和依维莫司；
c-Met抑制剂；
PI3K和AKT抑制剂；
Q3K抑制剂例如细胞周期蛋白依赖激酶(roscovitine)和黄酮比多(flavopiridol)；
纺锤体装配检查点抑制剂和靶向的抗有丝分裂剂例如PLK抑制剂、Aurora抑制剂(例如Hesperadin)、检查点激酶抑制剂和KSP抑制剂；
HDAC抑制剂例如帕比司他、伏林司他、MS275、贝林司他和LBH589；
HSP90和HSP70抑制剂；
蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米和卡非佐米；
丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包括MEK抑制剂和Raf抑制剂例如索拉非尼；
法尼基转移酶抑制剂例如替匹法尼；
酪氨酸激酶抑制剂包括例如达沙替尼、尼洛替尼(nilotibib)、瑞戈非尼、波舒替尼、索拉非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、西地尼布、阿昔替尼、阿柏西普、替拉替尼、甲磺酸伊马替尼、丙氨酸布立尼布、帕唑帕尼、雷珠单抗、伐拉尼布、西妥昔单抗、帕木单抗、维克替比、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、曲妥单抗、培妥珠单抗和C-Kit抑制剂；
维生素D受体激动剂；
Bcl-2蛋白抑制剂例如奥巴克拉、奥利美生钠和棉酚；
分化20受体族拮抗剂(Cluster of differentiation20receptor antagonist)的簇，例如利妥昔单抗；
核糖核苷酸还原酶抑制剂例如吉西他滨；
肿瘤坏死细胞凋亡诱导配体受体I激动剂例如马帕木单抗；
5-羟色胺受体拮抗剂例如rEV598、扎利罗登(xaliprode)、盐酸帕洛诺司琼、格拉司琼、Zindol和AB-1001；
整联蛋白抑制剂包括α5-β1整联蛋白抑制剂，例如E7820、JSM6425、伏洛昔单抗和内皮生长抑素；
雄激素受体拮抗剂包括例如癸酸诺龙、氟甲睾酮、甲睾酮、Prost-aid、安卓姆斯汀(andromustine)、比卡鲁胺、氟他胺、载脂蛋白环丙孕酮(apo-cyproterone)、载脂蛋白氟他胺(apo-flutamide)、醋酸氯地孕酮、色普龙、Tabi、醋酸环丙孕酮和尼鲁米特；
芳香酶抑制剂例如阿那曲唑、来曲唑、睾内酯、依西美坦、氨鲁米特和福美坦；
基质金属蛋白酶抑制剂；
其它抗癌药剂包括例如阿利维A酸、聚肌胞、阿曲生坦、贝沙罗汀、硼替佐米、波生坦、骨化三醇、依昔舒林、福莫司汀、伊班膦酸、米替福新、米托蒽醌、I-天冬酰胺酶、丙卡巴肼、达卡巴嗪、羟基脲、培门冬酶、喷司他丁、他扎罗汀(tazaroten)、万珂(velcade)、硝酸镓、坎磷酰胺、达雷那新和维A酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体可以与化学疗法(即细胞毒性试剂)、抗激素和/或靶向疗法例如其他激酶抑制剂(例如EFGR抑制剂)、mTOR抑制剂和血管生成抑制剂组合使用。
本发明的化合物还可与放射疗法和/或外科手术联合用于癌症治疗。
本发明的抗体或其抗原结合片段在一些实例中可以自身被修饰。例如，抗体可以缀合至任何但不限于上文提及的化合物或任何放射性同位素，以可能进一步增加效能。此外，本发明的抗体可以本身或在组合物中使用，用于研究和诊断中，或者用作分析参考标准，等等，这些在本领域中是公知的。
本发明的抗体或其抗原结合片段可在多种具有异常FGFR2信号传导的情形中——例如细胞增殖疾病例如癌症或纤维化疾病——用作治疗或诊断工具。特别适合用本发明的抗体治疗的疾病和病症为实体瘤，例如乳腺、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、泌尿道、眼、肝、皮肤、头颈、甲状腺、副甲状腺的癌症，及其远端转移。那些疾病还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
消化道的肿瘤包括，但不限于肛门癌、结肠癌、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。
食管癌的实例包括，但不限于食管细胞癌和腺癌，以及鳞状细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性黑色素瘤、横纹肌肉瘤和淋巴瘤。
胃癌的实例包括，但不限于肠型胃腺癌和弥散性胃腺癌。
胰腺癌的实例包括，但不限于导管腺癌、腺鳞癌和胰腺内分泌肿瘤。
乳腺癌的实例包括，但不限于三阴性乳腺癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
呼吸道癌症的实例包括，但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。
脑癌的实例包括，但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肿瘤。
男性生殖器官肿瘤包括，但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括，但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫肉瘤。
卵巢癌的实例包括，但不限于浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、粘液囊腺癌、粒层细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤和含睾丸母细胞瘤。
宫颈癌的实例包括，但不限于鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞状癌、小细胞癌、神经内分泌癌、玻璃状细胞癌和绒毛腺性腺癌。
泌尿道肿瘤包括，但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌，以及遗传性和自发性乳突状肾癌(papillary renal cancer)。
肾癌的实例包括，但不限于肾细胞癌、膀胱上皮细胞癌、肾小球旁细胞瘤(肾素瘤)、血管肌脂瘤、肾嗜酸细胞瘤、比里尼导管癌、肾透明细胞肉瘤、中胚叶肾瘤和肾母细胞瘤。
膀胱癌的实例包括，但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤和小细胞癌。
眼癌包括，但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。
肝癌的实例包括，但不限于肝细胞癌(伴或不伴纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)以及混合型肝细胞癌和胆管癌。
皮肤癌包括，但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌和非黑色素瘤皮肤癌。
头颈癌包括，但不限于头颈部鳞状细胞癌、喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌，以及鳞状细胞癌。
淋巴瘤包括，但不限于AIDS相关的淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。
肉瘤包括，但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
白血病包括，但不限于急性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病和多毛细胞白血病。在优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段适合用于治疗或诊断癌症疾病的治疗或诊断方法，所述癌症疾病包括在以下癌症组中：胃癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、肝细胞癌、黑色素瘤和膀胱癌。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可用作治疗或诊断多种涉及FGFR2的其他疾病的工具，所述其他疾病例如，但不限于纤维化疾病例如肺泡内纤维化、二氧化硅诱导的肺纤维化、实验性肺纤维化、特发性肺纤维化、肾纤维化、以及淋巴管平滑肌增多症、多囊卵巢综合征、痤疮、银屑病、胆脂瘤、胆脂瘤型慢性中耳炎、牙周炎、晒斑、肠病、动脉粥样硬化或子宫内膜异位症。
上文提到的疾病在人中已被充分地表征，但是也以相似的病因学存在于其他动物(包括哺乳动物)中，并且可通过给予本发明的药物组合物进行治疗。
为了治疗任一种上述疾病，按照本发明使用的药物组合物可以通过使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过任何合适的方法给予，所述给药方法可以根据待治疗的疾病的类型而有所不同。可能的给药途径包括肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下)、肺内和鼻内给药，并且根据需要，对于局部免疫抑制治疗采用病灶内给药。此外，本发明的抗体可通过使用例如递减剂量的所述抗体的脉冲输注给予。优选地，所述给药是通过注射进行，最优选静脉内或皮下注射，这部分地取决于所述给药是短暂还是长期的。待给予的量取决于多种因素例如临床症状、个体的重量、是否给予其他药物。技术人员会认识到给药途径根据待治疗的疾病或病症而有所不同。
确定本发明的新多肽的治疗有效量，主要取决于具体患者特征、给药途径以及待治疗的疾病的性质。一般性指导记载于例如国际协调会议的出版物中以及REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,第27和28章，484-528页(18th ed.,Alfonso R.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990)中。更具体地，确定治疗有效量，取决于诸如药物的毒性和效能(efficacy)的因素。毒性可使用本领域中公知的和上述参考文献中记载的方法测定。效能可利用相同的指导结合下文实施例中所述的方法测定。
诊断方法
FGFR2的抗体或其抗原结合片段可用于检测表达FGFR2的肿瘤的存在。在多种生物样品(包括血清和组织活检标本)中含有FGFR2的细胞或脱落的FGFR2的存在，可使用FGFR2的抗体检测。此外，FGFR2的抗体可用于多种成像方法学，例如使用缀合有99Tc(或其他同位素)的抗体进行的免疫闪烁成像。例如，与最近记载的使用缀合有111In的抗PSMA的抗体的成像方法类似的成像方法，可用于检测胰腺癌或卵巢癌(Sodee et al.,Clin.Nuc.Med.21:759-766,1997)。另一个可用的检测方法是通过将本发明的抗体与合适的同位素缀合进行的正电子发射断层扫描，(参见Herzog et al.,J.Nucl.Med.34:2222-2226,1993)。
药物组合物和给药
本发明的实施方案为包含抗FGFR2的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述抗体或抗原结合片段是单独的或与至少一种其他试剂(例如稳定化合物)组合，所述药物组合物可以在任何无菌的生物相容性药物载体中给药，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。另一个实施方案为包含结合FGFR2的抗体或其抗原结合片段和其他药物活性化合物的药物组合物，所述其他药物活性化合物适于治疗与FGFR2相关的疾病例如癌症。可将任何这些分子在药物组合物中单独或与其他试剂、药物或激素组合给予患者，在所述药物组合物中所述分子与赋形剂或可药用载体混合。在本发明的一个实施方案中，所述可药用载体在药学上是惰性的。
本发明还涉及药物组合物的给药。这种给药可经口或经肠胃外完成。肠胃外递送的方法包括体表、动脉内(直接至肿瘤)、肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给药。除了活性成分以外，这些药物组合物可以含有合适的可药用载体，包括赋形剂和助剂，其有利于将所述活性化合物加工为在药学上可使用的制剂。制剂和给药技术的进一步细节可以在最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.MaackPublishing Co,Easton,Pa.)中找到。
用于口服给药的药物组合物可使用本领域中公知的可药用载体以适于口服给药的剂量配制。这类载体使得所述药物组合物可被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬液等，用于患者摄取。
用于口服使用的药物制剂可通过以下方式获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得的混合物，根据需要加入合适的助剂之后，加工所述粒料混合物以获得片剂或锭剂的片芯。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、稻、土豆或其他植物的淀粉；纤维素例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；胶，包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；以及蛋白质例如明胶和胶原。根据需要，可加入崩解剂或增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或它们的盐，例如藻酸钠。
锭剂片芯与合适的包衣(例如浓缩糖溶液)一起提供，其还可能含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向所述片剂或锭剂包衣中加入染料或色素，用于产品辨识或表征活性化合物的量，即剂量。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的压入式(push-fit)胶囊，以及由明胶和包衣(例如甘油和山梨醇)制成的软的密封胶囊。压入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可在有或没有稳定剂的情况下将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。
用于肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。为了注射，可以将本发明的药物组合物配制于水溶液中，优选生理学上相容的缓冲液例如汉克斯(Hank)溶液、林格氏(Ringer)溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬液可含有增加该悬液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，所述活性化合物的悬液可以制备为适当的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂(vehicles)包括脂肪油例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。任选地，所述悬液还可含有合适的稳定剂或增加所述化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
为了局部或经鼻给药，适合待渗透的特定屏障的渗透剂可以被用于该制剂。这类渗透剂是本领域中通常已知的。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器装有上文提到的本发明组合物的一种或多种成分。与这类容器相关的可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的提示，其反映被所述产品的生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可含有编码本发明抗体的DNA序列。优选地，所述编码这些抗体的DNA序列在适用于转染至宿主细胞内并由宿主细胞表达的质粒中提供。所述质粒可含有启动子(通常为诱导型启动子)以调节所述DNA在宿主细胞中的表达。所述质粒还可含有适当的限制性位点以便于将其他DNA序列插入至所述质粒中以产生各种抗体。所述质粒还可含有多种其他元件以有利于所编码蛋白的克隆和表达。这类元件是本领域技术人员公知的，并且包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、锭剂制备、研磨(levigating)、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
所述药物组合物可以盐的形式提供，可以用酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐更易溶于相应的游离碱形式的水性或其他质子性溶剂。在其他情况中，优选的制剂可以为在pH4.5-5.5下的1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇中的冻干粉，其在使用之前与缓冲液组合。
在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。对于抗FGFR2的抗体或其抗原结合片段的给药，这类标签会包括给药的量、频率和方法。
治疗有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以实现预期目的(即治疗以FGFR2表达表征的具体疾病状态)的组合物。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力之内。
对于任何化合物，治疗有效剂量最初可在细胞培养测定法例如赘生性细胞，或在动物模型(通常为小鼠、兔、狗、猪或猴)中估计。动物模型也可用于获得所需的给药的浓度范围和途径。然后这类信息可用于确定在人中给药的可用剂量和途径。
治疗有效剂量是指改善症状或病症的抗体或其抗原结合片段的量。这类化合物的治疗效果和毒性可通过在细胞培养或实验动物中进行的标准药学方法来确定，例如ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，其可表示为比值ED50/LD50。表现出大的治疗指数的药物组合物是优选的。获自细胞培养测定法和动物研究的数据被用于配制人使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选地在循环浓度的范围内，所述范围包括具有很少毒性或无毒性的ED50。根据所用的剂型、患者的敏感性和给药途径，剂量在该范围内有所变化。
确切剂量由个体医师根据待治疗的患者来选择。调整剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持所需的作用。可以考虑的其他因素包括疾病状态的严重性；例如肿瘤大小和位置；患者的年龄、体重和性别；饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性和应答。根据具体制剂的半衰期和清除率，长效药物组合物可每3-4天、每周或每两周一次给药。
根据给药途径，正常剂量可以在0.1至100,000微克，最高达约2g的总剂量内变化。具体递送剂量和方法的指导提供在文献中。参见U.S专利No.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。对于多核苷酸，本领域的技术人员会使用与蛋白质或它们的抑制剂的制剂不同的制剂。相似地，多核苷酸或多肽的递送会是特定细胞、病症、部位等特异性的。放射性标记的抗体的优选特异性活性可以为0.1至10mCi/mg的蛋白(Riva et al.,Clin.Cancer Res.5:3275-3280,1999；Ulaner et al.,2008Radiology246(3):895-902)。
本发明通过以下实施例进一步描述。提供实施例仅为了参考具体实施方案说明本发明。这些例证虽然说明本发明的某些特定方面，但是不意图限制或者限定所公开的本发明的范围。
所有实施例均利用标准技术进行，所述标准技术对于本领域技术人员来说是公知和常规的，除了当另有详细描述时。以下实施例的常规分子生物学技术可以依标准实验室手册进行，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
本发明的优选实施方案为：
A.分离的抗体或其抗原结合片段，其在结合过表达FGFR2的细胞系SNU16(ATCC-CRL-5974)和MFM223(ECACC-98050130)和表达突变的FGFR2的细胞系AN3-CA(DSMZ-ACC267)和MFE-296(ECACC-98031101)中的FGFR2之后，降低FGFR2的细胞表面表达。
B.权利要求A的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合由(SEQ ID NO:63)表示的FGFR2的细胞外N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)。
C.权利要求B的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与所述细胞外N末端表位(SEQ ID NO:63)的结合是通过至少一个选自残基Arg1、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6和Glu8的表位残基介导的。
D.权利要求B-C任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中通过将FGFR2的N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中的至少一个氨基酸残基改变为丙氨酸，所述抗体或其抗原结合片段失去了多于50％的其ELISA信号
a)所述残基选自Pro2、Leu6和Glu8，或
b)所述残基选自Arg1、Pro2、Phe4和Ser5。
E.权利要求A-D任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一个选自如下的抗体竞争性结合FGFR2：“M048-D01”、“M047-D08”、“M017-B02”、“M021-H02”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“TPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”和“TPP-1415”。
F.权利要求E的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与“Ｍ048-D01”、“M047-D08”、“M017-B02”、“M021-H02”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“TPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”或“TPP-1415”的至少一个CDR序列至少50％、55％、60％、70％、80％、90或95％相同；或者与“M048-D01”、“M047-D08”、“M017-B02”、“M021-H02”、“M054-A05”、“M054-D03”、“TPP-1397”、“TPP-1398”、“TPP-1399”、“TPP-1400”、“TPP-1401”、“TPP-1402”、“TPP-1403”、“TPP-1406”、“TPP-1407”、“TPP-1408”、“TPP-1409”、“TPP-1410”、“TPP-1411”、“TPP-1412”或“TPP-1415”的VH或VL序列至少50％、60％、70％、80％、90％、92％或95％相同。
G.权利要求E-F任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含表9和表10所示的至少一个CDR序列或至少一个重链可变区或轻链可变区序列。
H.权利要求A-G的抗体或抗原结合片段包含
a)由SEQ ID NO:5-7表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:8-10表示的可变轻链CDR序列，或
b)由SEQ ID NO:15-17表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:18-20表示的可变轻链CDR序列，或
c)由SEQ ID NO:25-27表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:28-30表示的可变轻链CDR序列，或
d)由SEQ ID NO:35-37表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:38-40表示的可变轻链CDR序列，或
e)由SEQ ID NO:45-47表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:48-50表示的可变轻链CDR序列，或
f)由SEQ ID NO:55-57表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:58-60表示的可变轻链CDR序列，或
g)由SEQ ID NO:75-77表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:78-80表示的可变轻链CDR序列，或
h)由SEQ ID NO:85-87表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:88-90表示的可变轻链CDR序列，或
i)由SEQ ID NO:95-97表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:98-100表示的可变轻链CDR序列，或
j)由SEQ ID NO:105-107表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:108-110表示的可变轻链CDR序列，或
k)由SEQ ID NO:115-117表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:118-120表示的可变轻链CDR序列，或
l)由SEQ ID NO:125-127表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:128-130表示的可变轻链CDR序列，或
m)由SEQ ID NO:135-137表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:138-140表示的可变轻链CDR序列，或
n)由SEQ ID NO:145-147表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:148-150表示的可变轻链CDR序列，或
o)由SEQ ID NO:155-157表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:158-160表示的可变轻链CDR序列，或
p)由SEQ ID NO:165-167表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:168-170表示的可变轻链CDR序列，或
q)由SEQ ID NO:175-177表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:178-180表示的可变轻链CDR序列，或
r)由SEQ ID NO:185-187表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:188-190表示的可变轻链CDR序列，或
s)由SEQ ID NO:195-197表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:198-200表示的可变轻链CDR序列，或
t)由SEQ ID NO:205-207表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:208-210表示的可变轻链CDR序列，或
u)由SEQ ID NO:215-217表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:218-220表示的可变轻链CDR序列。
I.权利要求A-H的抗体或抗原结合片段包含
a)由SEQ ID NO:1表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:2表示的可变轻链序列，或
b)由SEQ ID NO:11表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:12表示的可变轻链序列，或
c)由SEQ ID NO:21表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:22表示的可变轻链序列，或
d)由SEQ ID NO:31表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:32表示的可变轻链序列，或
e)由SEQ ID NO:41表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:42表示的可变轻链序列，或
f)由SEQ ID NO:51表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:52表示的可变轻链序列，或
g)由SEQ ID NO:73表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:74表示的可变轻链序列，或
h)由SEQ ID NO:83表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:84表示的可变轻链序列，或
i)由SEQ ID NO:93表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:94表示的可变轻链序列，或
j)由SEQ ID NO:103表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:104表示的可变轻链序列，或
k)由SEQ ID NO:113表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:114表示的可变轻链序列，或
l)由SEQ ID NO:123表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:124表示的可变轻链序列，或
m)由SEQ ID NO:133表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:134表示的可变轻链序列，或
n)由SEQ ID NO:143表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:144表示的可变轻链序列，或
o)由SEQ ID NO:153表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:154表示的可变轻链序列，或
p)由SEQ ID NO:163表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:164表示的可变轻链序列，或
q)由SEQ ID NO:173表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:174表示的可变轻链序列，或
r)由SEQ ID NO:183表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:184表示的可变轻链序列，或
s)由SEQ ID NO:193表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:194表示的可变轻链序列，或
t)由SEQ ID NO:203表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:204表示的可变轻链序列，或
u)由SEQ ID NO:213表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:214表示的可变轻链序列。
J.前述权利要求任一项的抗体，其为IgG抗体。
K.前述权利要求任一项的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)2片段。
L.前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或抗原结合片段。
M.前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。
N.一种抗体-药物缀合物，其包含权利要求A-M的抗体或其抗原结合片段。
O.一种分离的核酸序列，其编码权利要求A-M的抗体或抗原结合片段。
P.一种载体，其包含权利要求O的核酸序列。
Q.一种分离的细胞，其表达权利要求A-M任一项的抗体或抗原结合片段和/或包含权利要求O的核酸或权利要求P的载体。
R.权利要求Q的分离的细胞，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。
S.一种产生权利要求A-M任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求R的细胞和纯化所述抗体或抗原结合片段。
T.权利要求A-M的抗体或抗原结合片段或权利要求N的抗体-药物缀合物作为药物。
U.权利要求A-M的抗体或抗原结合片段作为诊断试剂。
V.权利要求A-M的抗体或抗原结合片段或权利要求N的抗体-药物缀合物作为用于治疗癌症的药物。
W.一种药物组合物，其包含权利要求A-M的抗体或抗原结合片段或权利要求N的抗体-药物缀合物。
X.权利要求W的药物组合物与一种或多种治疗活性化合物的结合物。
Y.一种用于治疗与不需要的FGFR2的存在相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给予有所需要的受试者有效量的权利要求W的药物组合物或权利要求X的结合物。
实施例
实施例1：从n-CoDeR文库产生抗体
用于噬菌体选择的工具：
用于分离本发明的人抗体的重组蛋白从R&D Systems获得，列于表1中。使用的所有变体在无载体制剂中作为Fc融合蛋白存在。hTRAIL-Fc充当消耗(depletion)试剂以消除Fc结合剂(binder)。依照制造商说明书使用大约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS(Pierce；Cat.No.21347)对蛋白质进行生物素化，并使用Zeba脱盐柱(Pierce；Cat.No.89889)脱盐。
表1：用于噬菌体选择和筛选的重组蛋白的列表
蛋白质 来源 Cat.No.(R&D系统)
hFGFR2β-Fc(IIIb) 人 665-FR
mFGFR2β-Fc(IIIb) 鼠 708-MF
hFGFR2α-Fc(IIIb) 人 66３-FR
hFGFR2β-Fc(IIIc) 人 684-FR
hTRAIL-Fc 人 630-TR
对于细胞上的噬菌体筛选，使用其细胞表面展示天然的FGFR2的人胃癌细胞系KATO III(ATCC HTB-103)，
噬菌体筛选:
本发明的人抗体或其抗原结合片段的分离是通过噬菌体展示技术利用BioInventInternational AB的天然Fab抗体文库n-CoDeR来进行(Lund,Sweden；described inet al.,Nat.Biotech.2000,18:853-856)，所述文库为其中六个CDR全部被多样化的Fab文库。如表2所概述，采用了三种不同的策略用于筛选本发明抗体。
表2：筛选策略的总结
本实施例中使用的标准缓冲液为：
1×PBS:来自Sigma(D5652-50l)
PBST:补充有0.05％吐温20(Sigma,P7949)的1×PBS
封闭缓冲液：补充有3％BSA(Sigma A4503)的PBST
沉淀缓冲液：2.5M NaCl中的20％PEG(Calbiochem,528877)
FACS-缓冲液：补充有3％FBS(GIBCO,10082)和0.01％NaN3(Sigma,71289)的PBS
简言之，将所述Fab抗体文库的等分试样在室温下离心5min，将所得的片状沉淀物重悬于40ml的PBS中，通过添加沉淀缓冲液进行沉淀，然后在冰上孵育1小时，进行离心步骤(1小时，4000rpm)。随后将所述沉淀的文库重悬于1ml的封闭缓冲液中，在室温下孵育30min。
同时，通过在端至端旋转器上用PBS洗涤3次(持续30分钟)来制备链霉亲和素包被的Dynabeads M280(Invitrogen,11206D)的等分试样。然后将一些等分试样与200nM的生物素化的TRAIL-Fc蛋白混合，同时将剩余的等分试样与生物素化的靶蛋白混合，如表2所示。将混合物在端至端旋转器上室温下孵育30min，随后在1ml的PBS中洗涤3次。最后通过将包被的微珠重悬于1ml封闭缓冲液来封闭，然后收集微珠并去除上清液。
为了耗尽不需要的Fc结合物，将封闭的文库(上文所述)加至包被有TRAIL-Fc的封闭的Dynabeads，在旋转的同时在室温下孵育30min。在磁道(magnetic rack)上收集微珠后，将上清液与包被有靶蛋白的封闭的Dynabeads混合。将所述样品在端至端旋转器上孵育60min后，将其用封闭缓冲液洗涤3次，接着用PBST洗涤5次。通过添加100μl三乙醇胺溶液(TEA，100mM)来洗脱结合的噬菌体。室温下孵育10min后，通过添加400μl1M pH7.5的Tris-Cl以中和样品。
淘选策略I包括在全细胞上进行2轮淘选，所述全细胞作为靶蛋白的来源(参见表2)。为了该目的，将KATO III细胞重悬于冰冷的FACS缓冲液中，密度为107个细胞/ml。向1ml细胞悬液中加入拯救(rescue)噬菌体的等分试样，通过端至端旋转在4℃下孵育。随后，将细胞用2.5ml FACS缓冲液洗涤10次，接着用300μl76nM柠檬酸(pH2.5)洗脱结合的噬菌体。孵育5min后，将细胞在4℃下以400g离心5min。通过添加300ml1M pH7.5的Tris-Cl以中和上清液。
使洗脱的噬菌体增殖，并基本上按照前人所述(Cicortas Gunnarsson et al.,Protein Eng Des Sel2004；17(3):213-21)测定噬菌体滴度。简言之，保存所述洗脱溶液的等分试样用于滴定实验，同时根据表2中描述的策略将剩余的部分用于转化呈指数生长的大肠杆菌(E.coli)TG1(来自Stratagene)用于制备在第二轮、第三轮和第四轮筛选中使用的新噬菌体原料。对于每轮筛选，将输入和输出噬菌体在呈指数生长的大肠杆菌HB TG1上进行滴定，并从第2轮至第4轮挑选克隆用于噬菌体ELISA中的分析。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：
噬菌体ELISA:
使用噬菌体ELISA分析从不同轮筛选中选择的噬菌体的特异性。简言之，噬菌体表达是通过向100μl新鲜培养基(补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖(Sigma,G8769)的LB培养基)加入10μl过夜培养物(在补充有100μg/ml氨苄青霉素(Sigma，A5354)、1％葡萄糖的LB培养基中)，并且在37℃下在96孔MTP中以250rpm振荡直到OD600达到0.5。随后，加入40μl辅助噬菌体M13KO7(Invitrogen，420311)，并将样品在37℃下再孵育15分钟，不进行振荡。添加IPTG(终浓度为0.5mM；终体积为200μl)后，将细胞在30℃下过夜孵育，同时以200rpm振荡。
将用链霉亲和素预包被的96-孔ELISA-板(Pierce，15500)在4℃下用1μg/ml生物素化的FGFR2-2βFc(IIIb)或生物素化的TRAIL-Fc包被过夜。第二天，将板用PBST洗涤3次，用封闭试剂处理并用PBST再洗涤3次。同时，将噬菌培养物简单离心，然后除去125μl的上清液，再与125μl的封闭缓冲液混合。这样做之后，每孔转入100μl的封闭的噬菌体，并在室温下孵育1小时。用PBST洗涤3次之后，加入偶联HRP的M13抗体(GE Healthcare,27-9421-01；在PBST中1:2500稀释)并在室温下孵育1小时。显色反应是通过加入50μl TMB(Invitrogen，2023)发生，并在5-15分钟之后通过加入50μl H2SO4(Merck,1120801000)中止。在酶标仪(Tecan)中，在450nM下记录比色反应。
通过ELISA筛选sFab：
为了生成可溶性的Fab片段(sFab)，从第3轮和第4轮筛选中分离噬粒DNA，并依照供应商说明书用限制性内切酶EagI(Fermentas，FD0334)和EcoRI(NEB，R0101L)消化以除去基因III序列。将所得的片段重新连接，并使用标准方法将构建体转化至化学感受态大肠杆菌Top10中。挑选单个克隆，将其转移至含LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素(Sigma,A5354)、1％葡萄糖)的96孔板中并在37℃下以250rpm振荡过夜(ON)。第二天早上将10ml的预培养物转移至150μl新鲜LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素(Sigma,A5354)、0.1％葡萄糖)，直到OD600达到0.5。这样做之后，通过加入IPTG(终浓度0.5mM)诱导sFab产生，在30℃下继续孵育过夜同时以200rpm振荡。第二天早上，向每孔加入50μl BEL-缓冲液(24.7g/l硼酸；18.7g/l NaCl；1.49g/l EDTA pH8.0；2.5mg/ml溶菌酶(Roche))，混合物在室温下孵育1小时。随后，添加1/3体积的含有9％BSA的封闭缓冲液，然后进行另一个在室温下30min孵育的步骤后，除了使用偶联HRP的抗-hIgG(Fab-特异性)(1:2500稀释；Sigma；A0293)进行检测以外，基本上按照对噬菌体的描述在ELISA中分析50μl的每孔中sFab与靶的结合。
实施例2：可溶性Fab筛选活性化合物(hit)的小规模生产
小规模地生产了独特的筛选活性化合物(hit)用于初步分析所述活性化合物与FGFR-蛋白的不同变体的结合(参见实施例3)。用各个大肠杆菌Top10克隆的预培养物接种至20-50ml的LB培养基(补充有0.1mg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖)，所述克隆含有克隆至初始pBIF载体中的独特Fab序列却没有基因III序列。通过加入0.5mM IPTG(终浓度)诱导sFab的产生，并在30℃和250rpm振荡下，继续孵育过夜。
随后，通过离心收获细胞，并通过在4℃下在裂解缓冲液中孵育1小时进行温和裂解，所述裂解缓冲液含有20％蔗糖(w/v)、30mM TRIS、1mM EDTA、pH8.0、1mg/ml溶菌酶(Sigma L-6876)和2.5U/ml全能核酸酶(benzonase，Sigma E1014)，接着加入等体积的PBS。这样做之后，将澄清的上清液应用于Dynabead用于His-tag分离(Invitrogen,101-03D)，在端至端旋转器上在4℃下孵育2小时。随后，将所述基质用缓冲液1(50mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，300mM NaCl，5mM咪唑，0.01％吐温-20)洗涤3次，接着进行在缓冲液2(含有0.005％吐温-20的PBS)中的单次洗涤步骤。最后，将Fab用缓冲液E(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，300mM NaCl，300mM咪唑)洗脱，并且在Vivaspin500(cut-off10000；来自GE；28-9322-25)中使用PBS缓冲液浓缩。通过SDS-PAGE分析Fab的蛋白浓度和纯度
实施例3：抗体的交叉反应性情况
如实施例2所述小规模生产了独特的筛选活性化合物，在ELISA中测试所述活性化合物与表3所列的不同FGFR-变体的结合。
表3：ELISA中使用的用于结合物的交叉反应性情况的重组蛋白的列表
蛋白质 来源 Cat.No.(RnD系统)
hFGFR2β-Fe(IIIb) 人 665-FR
mFGFR2β-Fc(IIIb) 鼠 708-MF
hFGFR2α-Fc(IIIb) 人 663-FR
hFGFR2β-Fc(IIIc) 人 684-FR
hFGFR1β-Fc(IIIc) 人 661-FR
hFGFR1β-Fc(IIIb) 人 765-FR
hFGFR3-Fc(IIIc) 人 766-FR
hFGFR3-Fc(IIIb) 人 1264-FR
hFGFR4-Fc 人 685-MF
mFGFR2β-Fc(IIIc) 鼠 716-MF
mFGFR3-Fc(IIIc) 鼠 710-MF
hTRAIL-Fc 人 630-TR
使用的所有变体在不含载体的制剂中作为Fc-融合蛋白存在。依照制造商的说明书使用大约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS(Pierce；Cat.No.21347)对蛋白质进行生物素化，并使用Zeba脱盐柱(Pierce；Cat.No.89889)脱盐。
对于ELISA，将用链霉亲和素预包被的96孔板(Pierce,15500)用1μg/ml的生物素化的蛋白质在4℃下包被过夜。用生物素化的TRAIL-Fc包被的孔充当参照。第二天将板用PBST洗涤3次，用封闭试剂处理，并用PBST再洗涤3次。加入100μl的纯化的Fab(1μg/ml)，室温下孵育1小时。用PBST洗涤3次之后，加入偶联HRP的抗hIgG(Fab-特异性的)(1:2500稀释；Sigma；A0293)，在室温下孵育1小时。显色反应是通过加入50μl TMB(Invitrogen，2023)发生，并在5-15分钟之后通过加入50μl H2SO4(Merck,1120801000)中止。在酶标仪(Tecan)中，在450nM下记录比色反应。含有TRAIL-Fc的孔用作背景值，计算信号与背景的比率，如表4中所总结。
表4：抗体的交叉反应性的ELISA数据的总结
信号与背景的比率：0:<2；+:2-3；++:3-5；+++:>5
如表4所示，本发明的抗体结合人和鼠FGFR2，而不依赖于α和β以及IIIb和IIIc的剪接形式。如表4所示，本发明的抗体不结合FGFR1、FGFR3和FGFR4
实施例4：FGFR2的抗体与癌细胞系的细胞表面的结合
为了确定抗FGFR2的抗体在小鼠、大鼠和人癌细胞系上的结合特征，通过对一组细胞系进行流式细胞术来测试结合情况。将贴壁细胞用PBS(不含Ca和Mg)洗涤2次，通过基于不含酶的PBS的细胞解离缓冲液(Invitrogen)进行脱附。将细胞以大约105个细胞/孔悬浮在FACS缓冲液(不含Ca/Mg的PBS，含有3％FCS的Biochrom，Biochrom)中。对细胞进行离心(250g,5min,4℃)，去除上清。将细胞重悬于目的抗体在FACS缓冲液中的稀释物中(如果未另有说明，为5μg/ml，80μl)，并在冰上孵育1小时。接着将细胞用100μl冷的FACS缓冲液洗涤一次，然后加入80μl以1:150稀释的二抗(PE山羊抗人IgG，Dianova#109-115-098，或PE山羊抗小鼠IgG，Jackson Immuno Research#115-115-164)。在冰上孵育1小时后，将细胞再用冷的FACS缓冲液洗涤，重悬于100μl FACS缓冲液中，通过流式细胞术使用FACS-Array(BDBiosciences)进行分析。结果计算为：以目的抗体进行的检测的Geo Mean减去背景荧光(通过仅使用所述二抗的检测所测量的)。数值依据以下系统计分：
Geo Mean-仅二抗的Geo Mean>10：+，>100:++，>1000:+++，10000:++++，接近()中类别的边界。
用于抗体的交叉反应性情况的细胞系的列表：
如表5所示，以5μg/ml的浓度使用的本发明的所有抗FGFR2的抗体结合范围广泛的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞表达鼠(4T1，EMT6)、大鼠(RUCA)和人(所述表中包括的所有其他细胞系)来源的FGFR2。
表5：通过FACS分析计分5μg/ml的抗FGFR2的抗体与不同细胞系的结合情况
(Geo Mean-仅二抗的Geo Mean>10：+，>100:++，>1000:+++，>10000:++++，接近()中类别的边界)
为了确定抗体结合筛选的癌细胞系的EC50值，如上文所述将细胞使用抗FGFR2的抗体染色，但使用0.1-100nM范围内的多种浓度的抗体。EC50值使用Graph Pad PrismSoftware确定，并列于表6中。具有最高亲和力的三种抗体(M017-B02-hIgG1、M048-D01-hIgG1、M047-D08-hIgG1)在人(SNU-16,MFM223)、鼠(4T1)和大鼠(Ruca)细胞系中表现出次纳摩尔(subnanomolar)至低纳摩尔(low nanomolar)的EC50值。M021-H02-hIgG1、M054-A05-hIgG1和M054-D03-hIgG1在鼠和人细胞系中也表现出低nM的细胞EC50值。因此，所有测试的抗体在与表达FGFR2的人、鼠和大鼠细胞的结合中具有交叉反应性。
表6：通过FACS分析与人(SNU16,MFM223)、鼠(4T1)和大鼠(RUCA)来源的细胞系的抗FGFR2的抗体的EC50值
(n.d.代表未确定/测量)
实施例5：通过Pepscan’s Chemically Linked Peptides on Scaffolds(CLIPS)技术进行的表位定位
为了确定目的抗体的结合特征，进行基于Pepscan’s proprietary ChemicallyLinked Peptides on Scaffolds(CLIPS)技术(Timmerman et al.,J.Mol.Recognit.2007,20:283-99)的加强的表位定位。设计了总共8653个不同的长度为15AA和30AA的CLIPS肽，所述肽覆盖了天然的人FGFR2上的线性、构象和不连续的表位。所述肽在肽阵列上合成。本发明的抗体在基于ELISA的测定法中在肽阵列上以人IgG1形式测试。对得到最高ELISA值的肽进行分析，以鉴定共有的相似氨基酸序列。
为了重新构建靶分子的不连续的表位，合成结构化的肽的文库。这使用Pepscan’sproprietary Chemically Linked Peptides on Scaffolds(CLIPS)技术(Timmerman etal.,J.Mol.Recognit.2007,20:283-99)来完成。CLIPS技术允许将肽结构化为单环、双环、三环、片层状折叠、螺旋状折叠及其组合。将CLIPS模板偶联至半胱氨酸残基。将所述肽中多个半胱氨酸的侧链偶联至1个或2个CLIPS模板。例如，将0.5mM的T2CLIPS模板1,3-bis(溴甲基)苯溶解于碳酸氢铵(20mM，pH7.9)/乙腈(1:1(v/v))。将该溶液加至所述肽阵列上。CLIPS模板结合2个半胱氨酸的侧链，所述半胱氨酸存在于肽阵列(具有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中。将所述肽阵列在完全覆盖在溶液中时，在所述溶液中温和震荡30-60分钟。最后，将所述肽阵列广泛地使用过量的H2O进行洗涤，70℃下在含有溶于PBS中的1％SDS/0.1％β巯基乙醇的裂解液中进行超声30分钟，接着在H2O中再进行超声45分钟。以类似的方式制成携带肽的T3CLIPS，但这次具有3个半胱氨酸。
抗体与每种肽的结合在基于PEPSCAN的ELISA(Slootstra et al.,MolecularDiversity1996,1:87-96)中进行测试。将所述肽阵列用5％-100％结合缓冲液进行预孵育(1小时，20℃)。所述结合缓冲液含有1％吐温-80、4％马血清、5％卵清蛋白(w/v)，并用PBS稀释。洗涤之后，将所述肽阵列与一抗溶液(1-5μg/ml，在含有1％吐温-80的PBS中)孵育(过夜，4℃下)。洗涤之后，将所述肽阵列用抗体过氧化物酶缀合物在100％结合缓冲液中的1/1000稀释液在25℃下孵育1小时(抗-人)。洗涤之后，加入过氧化物酶底物2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μL/mL的3％H2O2。1小时后，测量显色。显色使用电荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统定量。
数据处理
原始数据是通过CCD-照相机获得的光学值。所述值为0-3000mAU，这与标准96-孔板酶标仪(ELISA-reader)类似。提取结合值用于分析。偶尔含有气泡的孔会产生假阳性值，手动检查卡片并将任何由气泡引起的值记为0。
本发明的所有抗体结合由FGFR2的N末端残基(1RPSFSLVEDTTLEPE15)组成的相同表位。对1257CLIPS和线性肽的分析表明N末端肽具有一致的高ELISA值。
所述N末端残基(1RPSFSLVEDTTLEPE15)存在于人FGFR2的所有剪接变体中，这不依赖于在D3中产生IIIb和IIIc同种型的可变剪接(参见图1)。如果结构域D1被从全长FGFR2(SEQ ID NO:61；FGFR2α)中剪切掉，产生较短的β形式的FGFR2(SEQ ID NO:62)，那么所述表位也存在。在这种情况下，所述表位直接位于结构域D2的前面(参见图1)。
特别有趣的是，所述N末端序列在人、小鼠、大鼠和猕猴中是保守的。这使得产生广泛的种间交叉反应性。
这个新的表位在公知的配体结合位点和肝素结合位点的范围外(参见图1)，并且导致本发明抗体的新的特征。
实施例6：通过肽的丙氨酸扫描进行表位精细定位
为了更加详细地定义本发明的抗体的结合特征，进行丙氨酸扫描。如实施例5所述，合成长度为15AA和30AA的肽，对于特定的肽，将所述人FGFR2序列的每个氨基酸用丙氨酸残基替换。如实施例5所述对所述抗体的结合进行分析。如果将氨基酸残基换成丙氨酸导致结合信号的显著降低，那么就称该残基对结合具有关键作用。
表7示出了对于本发明的抗体来说，FGFR2的N末端部分(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中的关键残基。
表7：对于本发明的抗体的结合来说，FGFR2的N末端部分(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中的关键残基
(对于结合来说关键性的残基由(X)标记。通过将该残基变成丙氨酸，失去了多于50％的ELISA信号)
抗体M048-D01和M021-H02特别值得注意，这是因为它们的结合不依赖于位置Ser-5上的改变。这使得除了人、小鼠、大鼠和猕猴FGFR2(SEQ ID NO:63)之外，它们能够结合兔(SEQ ID NO:64)、猪(SEQ ID NO:65)和狗(SEQ ID NO:66)FGFR2，这使得可能使用甚至更多的物种用于临床开发。
实施例7：通过Biacore分析的抗体对所述N末端表位的亲和力
为了定义对表征为表位的N末端肽的结合亲和力，进行Biacore表面等离子体共振实验。
抗FGFR2的抗体的结合亲和力是通过在Biacore T100仪器(GE HealthcareBiacore,Inc.)上进行表面等离子体共振分析来确定。通过间接捕获试剂(抗人IgG(Fc))将作为人IgG1的抗体固定在CM5传感器芯片上。如制造商的描述使用来自“人抗体捕获试剂盒”(BR-1008-39,GE Healthcare Biacore,Inc.)的试剂。每孔固定约5000RU的单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体。将浓度为5μg/ml的抗FGFR2的抗体以10μl/min的速度注射10秒。将在HEPES-EP缓冲液(GEHealthcare Biacore,Inc.)中的各种浓度(400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.12nM)的肽以60μl/min的流速向固定的抗FGFR2的抗体上注射3分钟，并解离5分钟，所述肽来自不同物种(人、小鼠、大鼠、猕猴FGFR2(SEQ ID NO:63)、兔(SEQID NO:64)、猪(SEQ ID NO:65)和狗(SEQ ID NO:66))的FGFR2的前15个氨基酸。进行线性参比室校正及减去缓冲液样品之后，生成传感图。离解平衡常数(KD)通过以下计算：基于通过使用Biavaluation Software(version4.0)以一级1：1结合模型拟合传感图获得的缔合速率常数(kon)和离解速率常数的比例。
M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1以约为100nM的KD值结合人、鼠、大鼠和猕猴FGFR2结合(详情参见表8)。如丙氨酸扫描所支持，M048-D01对于来自几个物种的所有肽表现出几乎相同的KD值(参见表8)。
表8：通过使用15个氨基酸长度的肽进行的Biacore测量的抗体M048-D01和M047-D08的单价KD值
实施例8：与抗FGFR2的抗体在过表达FGFR2的细胞系上短时间孵育之后，P-FGFR2(磷酸化FGFR2)水平的刺激
为了确定短时间孵育之后抗FGFR2的抗体对磷酸化FGFR2(P-FGFR2)的细胞水平的效应，进行P-FGFR2ELISA。将MFM223细胞以7000个细胞/孔铺板到96孔板中的生长培养基(MEM Earle(Biochrom；F0315)+10％FCS+2mM Glutamin)中。铺板24小时后，将细胞与抗体(10μ/ml)孵育15分钟，接着进行2次用PBS的洗涤步骤，在冷的裂解缓冲液中裂解，所述裂解缓冲液由50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10％丙三醇、1.5％Triton X-100和新加入的完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete ProteaseInhibitor cocktail)(Roche No.1873580001)、4mM Na3VO4组成，通过振荡5分钟用NaOH将pH调至7.4。对样品进行冷击，并保存在-80℃下直至分析。依照制造商的说明书使用来自R&D Systems的P-FGFR2ELISA试剂盒，对P-FGFR2水平进行测量。在450nM下(Tecan Spectra,Rainbow)测量OD，进行背景校正。将P-FGFR2的水平计算为未处理的对照水平的％。为了对所述抗体形式的非特异性效应进行对照，将平行样品用相同同种型的无细胞结合对照IgG进行孵育。
结果示于图2中，表明抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1显著诱导了P-FGFR2的水平。与之相反，对照IgG抗体和可商购自R&D的抗FGFR2的抗体(MAB665、MAB684、MAB6843)在短时间孵育之后都未表现出任何对P-FGFR2水平的显著效应。这些结果揭示出在短时间孵育之后本发明中描述的抗FGFR2的抗体对FGFR2的对抗效应。
实施例9：与抗FGFR2的抗体长时间孵育后，过表达FGFR2的细胞对于FGF7对P-FGFR2的刺激的脱敏
为了确定长时间孵育之后抗FGFR2的抗体对磷酸化FGFR2(P-FGFR2)的细胞水平的效应以及抗体处理对FGF7诱导FGFR2磷酸化的能力的效应，进行P-FGFR2ELISA。将MFM223细胞以7000个细胞/孔铺板到96孔板中的生长培养基(MEM Earle(Biochrom；F0315)+10％FCS+2mM Glutamin)中。铺板24小时后，将细胞与抗体(10μ/ml)孵育24分钟，接着在存在或不存在FGF7(R&D Systems,25ng/ml)的情况下孵育15分钟。将细胞用PBS洗涤2次，在裂解缓冲液中裂解，所述裂解缓冲液由(50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10％丙三醇、1.5％Triton X-100和新加入的完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheNo.1873580001)、4mM Na3VO4组成，用NaOH将pH调至7.4)，在室温下振荡5分钟。对样品进行冷击(snap frozen)，并保存在-80℃下直至依照制造商的说明书通过来自R&D的P-FGFR2ELISA进行分析。在450nM下测量光密度(Tecan Spectra,Rainbow)，进行背景校正。将P-FGFR2的水平计算为未处理的对照水平的％。为了对所述抗体形式的非特异性效应进行对照，将平行样品与具有相同同种型的无细胞结合对照IgG进行孵育。
相应的结果示于图3中。在不用抗体处理方法处理的细胞中以及在使用同种型对照IgG处理的细胞中，使用FGF7的刺激导致P-FGFR2水平增加至约4倍。与之相反，在使用抗FGFR2的抗体预处理24小时的样品中，FGF7仅将P-FGFR2水平诱导了1.37-1.4倍。
总之，这些结果表明延长细胞与本发明的抗FGFR2的抗体的孵育时间，导致对使用FGF7的刺激的脱敏作用。
实施例10：将细胞系与抗FGFR2的抗体孵育之后FGFR2表面表达的下调
为了分析用抗FGFR2的抗体处理之后FGFR2的表面表达，在具有FGFR2过表达(MFM223、SNU16)或FGFR2突变(AN3-CA、MFE-296)的不同细胞系中进行FACS分析。将贴壁细胞用PBS(不含Ca和Mg)洗涤2次，并用基于不含酶的PBS的细胞解离缓冲液(Invitrogen)进行脱附。将细胞以0.5*105个细胞/孔悬浮于80μl生长培养基(MFM223、MFE-296：MEM Earle(Biochrom；F0315)+10％FCS+2mM Glutamin，SNU-16：RPMI1640(Biochrom,FG1215)+10％FBS；AN3-CA：MEM Earle(Biochrom；FG0325)+10％FCS+1mM丙酮酸钠+1x NEA：非必需氨基酸Biochrom K0293)中。加入20μl的5倍浓缩的抗体稀释液(终浓度为10μg/ml)，37℃下孵育4.5小时。孵育时间结束后，将细胞用100μl FACS缓冲液洗涤1次，用检测抗体(以5μg/ml，对于hIgG为小鼠抗FGFR2，对于mIgG为人抗-FGFR2)在4℃下染色45min，接着使用100μl FACS缓冲液再次洗涤。加入80μl体积的PE染色的第二抗体(PE山羊抗人IgG，Dianova#109-115-098，或PE山羊抗小鼠IgG，Jackson Immuno Research#115-115-164，1:150稀释)，在4℃下孵育45min，再次用FACS缓冲液洗涤之后，通过流式细胞术使用FACS阵列(BD Biosciences)对细胞进行分析。在对照实验中，通过所述目的抗体与相应的检测抗体的平行孵育，排除抗体对重叠表位的竞争。从来自用抗FGFR2的抗体染色之后检测的峰值的Geo-Mean减去仅用第二抗体着色后测量的Geo-Mean。将结果计算为在不存在抗体的情况下孵育4.5小时的对照细胞的％。
结果示于图4中。将细胞与对照IgG进行孵育导致FGFR2表面表达未降低，而抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1在所有4种细胞系中(不依赖于FGFR2过表达或突变)都将FGFR2表面水平显著下调了39-60％。与之相反，没有其他抗FGFR2的抗体(可商购自R&D的抗FGFR2的抗体(MAB665、MAB684、MAB6843)或在别处描述的抗FGFR2的抗体，例如(GAL-FR2、GAL-FR22；WO2010/054265and Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16:5750-5758))在所有4种细胞系中(不依赖于FGFR2过表达或突变)都表现出FGFR2表面表达的下调。GAL-FR21在具有FGFR2扩增的细胞系(SNU16和MFM223)中下调了FGFR2表面水平，但对具有FGFR2突变的细胞系没有影响。GAL-FR22在FGFR2突变的细胞系(分别为AN3-CA和MFE-296)中使FGFR2表面表达下调了73和21％，但在SNU16和MFM223细胞中对表面FGFR2水平没有显著影响。MAB684和MAB6843在FGFR2突变的细胞系中也诱导FGFR2表面水平降低了约60％，而对过表达FGFR2的细胞系没有主要效应。最后，MAB665根本未表现出任何对FGFR2表面水平的影响。
总之，抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1是仅有的能够在癌细胞系中(不依赖于FGFR2过表达或突变)诱导FGFR2表面下调的抗FGFR2的抗体。
实施例11：癌细胞与抗FGFR2的抗体长时间孵育后总FGFR2水平的下调
为了分析抗FGFR2的抗体诱导的FGFR2表面下调是否导致总FGFR2水平的长期降低，通过FGFR2ELISA对FGFR2的总蛋白水平进行分析。将SNU16细胞以5000个细胞/孔铺板到96孔板的生长培养基(RPMI1640(Biochrome,FG1215)+10％FBS)中。2小时后，将细胞与各种所示浓度的抗FGFR2的抗体或相应的同种型对照IgG进行孵育。与所述抗体孵育开始后96小时，将细胞在室温下以300g离心5min，在PBS中洗涤2次，通过加入100μl裂解缓冲液(50mMHepes pH7,2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10％丙三醇、1.5％TritonX-100、新加入的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche No.1873580001)、4mM Na3VO4，用NaOH将pH调至7.4)进行裂解，并在室温下振荡5min。对样品进行冷击，并保存在-80℃下直至依照制造商的说明书使用Total-FGFR2-ELISA Ki(R&D Systems)进行分析。在450nM下(TecanSpectra,Rainbow)测量光密度，并进行背景校正。为了计算总FGFR2的绝对水平，依照制造商的推荐(R&D Systems)应用使用分离的FGFR2蛋白的标准曲线。结果表示为在不存在抗体的情况下孵育96小时的对照细胞中检测的FGFR2水平的％。
结果示于图5中。与本发明的抗FGFR2的抗体进行孵育96小时导致总FGFR2水平降低了41-55％。在所述抗FGFR2的抗体的3μg/ml的剂量下达到半数最大降低。与之相反，与同种型对照抗体进行孵育对总FGFR2水平没有影响。
总之，这些结果表明抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1不仅导致表面FGFR2水平的短期降低，还导致总FGFR2水平的长期降低。
实施例12：抗FGFR2的抗体内化至细胞中
对本发明的抗FGFR2的抗体分析了其在结合所述FGFR2抗原之后的内化能力。
为了可视化该过程，选择了所述FGFR2特异性抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1以及同种型对照抗体。在2摩尔过量的CypHer5E单NHS酯(batch357392,GEHealthcare)的存在下在pH8.3下对所述抗体进行缀合。缀合后将所述反应混合物在4℃下进行透析(slide-A-Lyser Dialysis Cassettes MWCD10kD，Fa.Pierce)过夜，以消除过量染料和调整pH值。然后对所述蛋白质溶液进行浓缩(VIVASPIN500，Fa Sartorius stedimbiotec)。除了pH依赖性的荧光染料CypHer5E之外，还使用ph-非依赖性的染料Alexa488。所述抗体的染料负荷是使用分光光度计(Fa.NanoDrop)确定。M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1以及所述同种型对照(M014)的染料负荷在相似的范围内。所述标记的抗体的亲和力在细胞结合测定法中测试，以确保标记未改变与FGFR2的结合。这些标记的抗体用于以下内化测定法中。在处理之前，将细胞(2x104/孔)接种于96-MTP(厚，黑色，透明底部No4308776,Fa.Applied Biosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5％CO2下孵育18小时后，更换培养基并加入多种浓度(10、5、2.5、1、0.3、0.1μg/ml)的标记的抗FGFR2的抗体M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1。使用所述同种型对照抗体(负对照)进行相同处理。孵育时间选择为0、5h、1h、2h、3h、6h和24h。使用InCellAnalyzer1000(Fa.GE Healthcare)进行荧光测量。颗粒计数和总荧光强度以动态方式测量。
在表达内源性FGFR2的癌细胞系SNU16(胃癌)和SUM52PE(乳腺癌)中观察到M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1的高度特异性和明显的内化作用。
该内化作用是靶依赖性的，这是因为摄取仅可以在使用所述抗FGFR2的抗体时被证实，而使用所述同种型对照未观察到内化作用。在前6个小时期间，所述抗FGFR2的抗体与同种型对照相比表现出抗体内化作用的20-40倍增加。同种型对照在长时间暴露(>24h)后表现出较少的内化作用。
标记有Alexa488的抗FGFR2的抗体在结合后的内化作用揭示出多于50％的内化抗体似乎遵循内吞途径。
图6示出了M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1在结合表达内源性FGFR2的细胞后特异性内化作用的时间进程的显微评价。在乳腺癌细胞系SUM52PE上研究了抗体(2.5μg/ml)的内化作用。颗粒计数以动态方式测量。对于M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1可观察到快速内化作用，而所述同种型对照hIgG1未内化。
使用小G蛋白的共染色对运输途径进行更加详细的评价。Rab GTP酶调控膜运输的许多步骤，所述步骤包括囊泡形成、囊泡沿着肌动蛋白和微管蛋白网络移动，以及膜融合。为了辨别不同的途径，选择2个Rab蛋白用于染色——在晚期内体和溶酶体中表达的Rab7和在早期内体和再循环内体中表达的Rab11。在标记的抗体的6h内化作用后，使用甲醇固定所述细胞并进行渗透化处理，然后用Rab7-和Rab11-抗体进行染色。结果示于图7中。
M048-D01-hIgG1和M047-D08-hIgG1表现出明显的与Rab7的共染色，而与Rab11的共染色仅较弱。这些结果表明FGFR2内化后所述混合物进入内体-溶酶体途径。
用于其他描述的抗体例如GAL-FR21和GAL-FR22(WO2010/054265和Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16:5750-5758))的染色方式似乎完全不同。在此情况下使用Rab7时几乎不可检测到染色，但是使用Rab11达到较多的共染色。这表明，这些抗体在结合FGFR2受体后内化，并侧重于再循环途径。
实施例13：本发明的抗FGFR2的抗体在小鼠模型的实验肿瘤中的测试
例如通过皮下异种移植或同种移植瘤模型测试本发明的抗FGFR2的抗体的体内效能。专家了解证明所述创新的抗体的效能的现有技术方法。例如，因此用表达所述靶FGFR2的肿瘤细胞皮下接种小鼠。然后，用本发明的靶向FGFR的抗体、非结合的同种型对照或磷酸盐缓冲液(PBS)处理荷瘤小鼠。每周2次腹膜内或静脉内进行抗体的应用。为了对另外的抗肿瘤效能进行测试，将本发明的FGFR2Ab与普通护理标准结合，并与单独试剂的效能进行比较。通过经由卡尺的频繁地测量肿瘤面积，来监测肿瘤生长。肿瘤生长和处理数周后，收集肿瘤并将用本发明的抗FGFR2的抗体处理的动物的肿瘤重量或肿瘤大小(肿瘤面积通过公式长度×宽度来计算)与用PBS或同种型对照抗体处理的那些进行比较。用本发明的抗FGFR2的抗体处理的小鼠表现出显著更小的肿瘤。
将表达FGFR2的人或鼠肿瘤细胞皮下接种到免疫妥协小鼠(例如裸鼠或SCID-小鼠)的侧腹。从细胞培养瓶中脱附250,000-10,000,000个细胞(每只小鼠)，将其进行离心并分别悬浮于100μl的PBS、50％培养基/50％基质胶、或100％基质胶中。然后将细胞皮下接种到小鼠侧腹的皮下。在来自患者的肿瘤模型的情况下，将从胃癌患者收集的肿瘤皮下传代(passage)到免疫妥协小鼠。为了测试所述抗FGFR2的抗体的效能，将具有确定大小(2x2mm)的肿瘤片皮下移植到小鼠的侧腹。在几天内确立肿瘤。如果肿瘤达到20mm2(衍生自细胞系的肿瘤)或100mm3(衍生自患者的肿瘤)，就尽早开始处理，而通过公式长度×宽度计算肿瘤面积(mm2)，通过公式长度×宽度2/2计算肿瘤体积(mm3)。通过腹膜内注射或经由尾静脉的静脉内注射进行使用所述抗体的处理。将抗体溶于PBS或50mM Na-acetat、150mM NaCl中。以10ml/kg的体积应用抗体。治疗计划基于所述抗体的代谢动力学行为。作为标准，每周2次(或者每3天或4天)应用抗体。作为标准，进行处理直至对照组达到最大可能肿瘤大小。或者，更早停止处理。作为标准，每个治疗组使用8只小鼠。如果预期肿瘤生长具有较高的变化，那么可以增加每个处理组的小鼠的数量。与所述处理组平行，遵循相同的处理计划使用PBS处理对照组。在研究期间，通过使用卡尺测量肿瘤的长度和宽度，来经常评估肿瘤面积。在研究末期，收集肿瘤并称重。将所述抗体处理的组(T)的平均肿瘤重量与所述对照(C)的平均肿瘤重量的比值称为T/C。如果处理和对照组在不同的时间点结束，或者由于肿瘤变得坏死而使肿瘤重量不可用做读出，那么就基于最后的普通测量时间点的肿瘤面积来计算T/C比值。
将50％培养基/50％基质胶中的2Mio人胃癌SNU-16细胞皮下接种至雌性nodSCID小鼠的侧腹。当肿瘤达到20-30mm2的平均大小时，开始用所述抗FGFR2的抗体进行腹膜内治疗，每周2次持续进行治疗直至研究结束。如果对照组的肿瘤达到最大可接受的大小，那么就终止研究，收集肿瘤并称重。
与对照相比，所有测试的本发明抗FGFR2的抗体显著降低了肿瘤生长。使用2mg/kg剂量的M017-B02-hIgG1、M021-H02-hIgG1、M048-D01-hIgG1、M054-A05-hIgG1、M054-D03-hIgG1和M047-D08-hIgG1的处理分别导致T/C为0.19、0.22、0.17、0.19、0.21和0.22(参见图8-13)。
将100％PBS中的2.5x105个小鼠4T1乳腺癌细胞皮下接种到NMRI nu/nu小鼠的侧腹。选择免疫妥协而非同基因的小鼠，以避免开饭针对人IgG蛋白的中和抗体。在肿瘤已经达到24mm2的平均大小时的时间点开始进行肿瘤的治疗。为了测试M048-D01-hIgG1的可能的另外的抗肿瘤效能，分别用M048-D01-hIgG1、拉帕替尼或紫杉酚——单独以及M048-D01-hIgG1与紫杉酚或拉帕替尼组合——处理小鼠。作为对照，单独用PBS处理小鼠。每周2次静脉内进行使用M048-D01-hIgG1的处理，每日1次口服(p.o.)进行使用拉帕替尼的处理，以及每周1次静脉内进行使用紫杉酚的处理。所有处理一直进行到所述研究结束。由于在所述研究结束时肿瘤变得坏死，所以使用在肿瘤细胞接种后第13天的肿瘤面积来确定抗肿瘤的效能。该研究揭示了M048-D01-hIgG1与拉帕替尼或紫杉酚的组合达到了增加的抗肿瘤效能：与所述赋形剂对照相比，分别使用拉帕替尼和紫杉酚的单一疗法未显著改变肿瘤的生长，而与赋形剂相比，单独使用M048-D01-hIgG1导致显著的降低，T/C为0.73。与拉帕替尼和紫杉酚的组合将该T/C降低至0.58和0.52，与两个单一疗法相比二者在统计学上显著(参见图14和15)。
将2x2mm的最初衍生自患者并在免疫妥协小鼠传代的胃癌肿瘤GC10-0608和GC12-0811(Prof.Huynh Hung,National University of Singapore(NUS))的小片(piece)皮下移植至雌性免疫妥协的初次接受试验的小鼠(mice)。使用卡尺以二维测量所述肿瘤来频繁评估肿瘤大小，并且通过公式长度x宽度2/2计算肿瘤体积。在肿瘤达到大约100mm3的平均大小时的时间点，开始使用不同剂量的M048-D01-hIgG1进行处理。每周2次使用剂量为5、2和1mg/kg的M048-D01-hIgG1进行静脉内处理。在具有高FGFR2蛋白表达的肿瘤模型(GC10-0608)中，所有三种剂量都导致肿瘤生长显著降低，导致基于最终肿瘤重量的T/C值为0.55、0.60和0.41(参见图16)。在具有显著更低的FGFR2蛋白表达的模型(GC12-0811)中，5和2mg/kg的M048-D01-hIgG1导致肿瘤重量显著降低，导致T/C为0.70和0.67(参见图17)。根据所述更低的FGFR2表达，1mg/kg的M048-D01-hIgG1未导致最终肿瘤重量的显著降低。对于两个其他肿瘤模型——乳腺癌模型MFM223和结直肠癌模型NCI-H716(ATCC-CCL-251)的处理，本发明人未发现适当的应用方案以显著降低肿瘤生长。
实施例14：用抗FGFR2的抗体治疗后异种移植物肿瘤中的P-FGFR和总FGFR2水平的下调
为了分析所观察到的总FGFR2水平的下调和同时发生的P-FGFR2的减少是否也在体内的异种移植物肿瘤中存在，用抗FGFR2的抗体治疗后通过蛋白质印迹对SNU-16肿瘤进行分析。在每周2次腹膜内注射2mg/kg抗FGFR2的抗体的小鼠中进行的异种移植实验结束时收集肿瘤(详情参见实施例13)。最后一次注射所述抗体后24h取出肿瘤，将肿瘤在液氮中迅速冷冻并在-80℃中保存直至分析。在蛋白质印迹分析之前，将冷冻肿瘤切成约5mm直径的切片，将每个切片与预冷的5mm steel bull(Qiagen)和500μl裂解缓冲液(50mM HepespH7.2，150mM NaCl，1mM MgCl2，10mM Na4P2O7，100mM NaF，10％Glycerin，1.5％Triton X-100，新加入的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche No.1873580001)，4mM Na3VO4，用NaOH将pH调整至7.4)一起放置在2ml Eppendorf管中。将样品在Tissuelyzer(Qiagen)中以300Hz裂解3min，接着在冰上孵育30min。然后，将样品在微型离心机(Eppendorf)中以13000rpm在4℃下离心10min，将来自一个最初肿瘤的切片所得的上清液混合在一起。通过使用BCA蛋白测定试剂盒(Novagen，将裂解物以1:50在H20中稀释)来确定所述肿瘤裂解物中的蛋白水平。将样品稀释至终浓度为5mg/ml，将50μl的样品与7.7μl的(10*)样品还原剂和19.2μl(4*)NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen)混合。将对应于115μg的蛋白的样品上样于来自Invitrogen的NuPage4-12％SDS page凝胶，在120V下运行2h45min。通过iBlot系统(Invitrogen)依照制造商的推荐进行印迹。将膜在PBST中的5％BLOT QuickBlocker(Invitrogen)中在室温下进行封闭2h，接着与第一抗体在4℃下孵育过夜。第一抗体如下：P-FGFR：#AF3285，R&D Systems，0.5μg/m；总FGFR2：M017-B02-hIgG1，4μg/ml(在PBST中的3％BLOT QuickBlocker中)。第二天将膜在PBST中洗涤3次，接着与第二抗体过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch#111-035-003或过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗人IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch#109-035-127，在3％BLOT QuickBlocker/PBST中1:10000稀释)在室温下进行孵育2h。随后，将膜用PBST洗涤10min，进行4次，然后在与ECL试剂孵育后通过化学发光来检测信号。为了检测负载对照，用强剥离溶液(stripping solution strong)(1:10Milipore-H2O中)在室温下振荡15min而将膜剥离，接着用肌动蛋白抗体#A2066(Sigma)(1:1000在3％QuickBlocker/PBST中)进行封闭并检测。
来自用抗FGFR2的抗体治疗的每个组的2只动物和来自用对照IgG治疗的动物的样品的结果示于图18中。用本发明的抗FGFR2的抗体治疗后总FGFR2和P-FGFR水平显著下降。因此，体外研究中描述的总FGFR2的下调的作用模式也在用本发明的抗FGFR2的抗体治疗后的异种移植物肿瘤中相关。
实施例15：使用抗体药物缀合物的皮下异种移植癌症模型
可使用本领域已知的方案(例如Liu et al.,Proc Natl.Acad.Sci.(1996),93,8618-8623)将抗FGFR2的抗体缀合至细胞毒性的小分子。将A431保持为在补充有10％FBS的DMEM中的贴壁培养物。向6-7周龄的NOD SCID或其他免疫妥协小鼠右翼皮下注射在0.1ml的培养基中的1-5x10e6个细胞。当肿瘤大小达到ca.25mm2时，抗体药物缀合物将以1-10mg/kg的剂量腹膜内给药，每4、7或10天给药3次。对照小鼠将使用PBS或缀合有所述相同的毒性基团的无关的单克隆抗体进行处理。每周2次用游标卡尺测量肿瘤大小。通过比较抗FGFR2的抗体药物缀合物治疗的肿瘤大小与对照治疗的肿瘤大小，来评价抗肿瘤效能。
实施例16：具有改善亲和力的筛选的抗体的成熟变体的产生
通过亲和力成熟进一步优化表9所示的通过噬菌体展示所发现的本发明的抗FGFR2的抗体。
表9：通过噬菌体展示所发现的抗体的序列
抗体亲和力成熟是这样的2步过程：将饱和诱变与基于孔的高通量筛选相结合，以鉴定少量导致亲和力增加的突变。在亲和力成熟的第一轮中，依照BMC Biotechnology7:65,2007使用NNK-单核苷酸盒(其中N代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸每种都有25％的混合，K代表胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸每种都有50％的混合)通过定点诱变引入野生型抗体的位置多样化。以这种方法，在单个氨基酸位置引入所有20种氨基酸。该位置随机化限制在6个互补决定区(CDR)。在亲和力成熟的第二轮中，对有益置换进行重组和筛选，用于进一步的改进。这类变体的实例示于表10中。
表10：分别衍生自M048-D01和M047-D08的变体抗体的序列
使用两种不同类型的ELISA来证实突变的变体的结合改善。
a)肽结合ELISA：包含C末端连接至生物素化的赖氨酸的所述表位的氨基酸序列RPSFSLVEDTTLEPEG-Ttds-Lys(生物素)的合成肽(肽序列衍生自SEQ ID NO:63，通过JPT肽技术GmbH,Berlin,Germany合成)，和
b)重组蛋白结合ELISA：重组人FGFR2(人FGFR2的DNA序列(NP_000132.3)Met1-Glu377，C末端与多组氨酸标签融合；#10824-H08H，Sino Biological Inc.，北京，中国)
简言之，在两种ELISA形式中，在37℃下用包被缓冲液(#121125CandorBioscience GmbH)中的20μl2.2μg/ml的特异性的抗-人IgG Fc(#I2136；sigma)对MTP板(384孔Maxisorp，Nunc)进行包被。进行一次使用50μl PBST(磷酸盐缓冲液，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4，0.05％吐温20)的洗涤步骤之后，将板用50μl的10％Smart Block(#113500,Candor Bioscience GmbH)在20-22℃下封闭1h，并重复3次洗涤步骤。通过在20-22℃下孵育1小时，将20μl浓度为0.035μg/ml(基于肽的测定)或0.2μg/ml(基于重组人FGFR2蛋白的测定)的抗-FGFR2变体固定在PBST中的10％Smart Block中，抗-FGFR2变体的浓度取决于所述方式和待分析的变体。进行一次使用50μl PBST的洗涤步骤后，添加4份20μl的用PBST中10％SmartBlock稀释的所述抗原的级联稀释物(最大浓度为100nM)，在20-22℃下孵育1h，并重复3次洗涤步骤。对于所述生物素化的表位肽的检测，将20μl的用PBST中10％SmartBlock1:1000稀释的链霉亲和素/POD缀合物(#S5512,Sigma)在20-22℃下应用1小时。对于所述重组FGFR2蛋白的检测，将20μl的用PBST中10％SmartBlock1:10000稀释的抗-组氨酸/HRP缀合物(#71840,novagen)在20-22℃下应用1小时。进行3次洗涤步骤后，加入20μl在50mM磷酸氢二钠中的10μM amplex red底物(#A12222,Invitrogen)(pH7.6)，使用普通荧光阅读器例如Tecan M1000检测荧光信号。通过拟合数据(s形剂量反应、可变斜率、设为背景的基线；GraphPad Prism software)来评价EC50值。
表10提供了具有在M048-D01(TPP-1403)的重链和轻链中产生的氨基酸置换的变体的一些实例。与所述非CDR改变的变体(表11)相比，所有变体在抗原结合方面表现出较强改善，这是在具有不同形式抗原的两种ELISA方式中评价的。
表10提供了具有在M047-D08(TPP-1415)的重链和轻链中产生的氨基酸置换的变体的一些实例。与所述非CDR改变的变体(表11)相比，所有变体在抗原结合方面表现出显著改善。
虽然两种数值结果形式——EC50和改善系数之间的差异是意想不到的，但是其可能通过肽或蛋白质形式的抗原的使用以及最终检测的在所述ELISA三明治最上层的酶缀合物的形成方面的差异来解释：虽然不知道所述抗-组氨酸-HRP缀合物和所述组氨酸标签的FGFR2的KD，但是非常可能的是，其数量级高于在所述表位肽的检测中使用的生物素和链霉亲和素(10-15M)的KD。因此，对所述结合的肽的敏感性显著高于对所述组氨酸标签的蛋白质的敏感性，这导致确定更小的EC50的可能性。此外或替代地，所述差异可能是由所述抗FGFR2的抗体与两种抗原之间的相互作用的差异引起的，尽管它们的一段15个氨基酸的序列是相同的；第一，所述分子的C末端的后面部分的化学性质非常不同，第二，所述15个氨基酸的3D构象可能与所述FGFR2蛋白中的相应区域不相同。两种解释都可认为与基于肽和蛋白质的ELISA之间的差异有关，暗示了在所述肽ELISA方式中可以确定更小的EC50值。
表11中的数据集清楚地表明，当在所述表位肽中表示时M048-D01(TPP-1403)在其N末端序列上结合FGFR2，并且令人惊奇的是，在CDR中具有氨基酸置换的一些变体也具有相同的情况，甚至具有更高的亲和力。值得注意的是，置换N102I存在于TPP-1403的六种其他变体中的五种中，所述5种变体同时在CDR-L1、-L2、-L3、-H2和/或-H3中伴随一些其他置换，但是所述置换N102I不存在于TPP-1399中，令人惊奇的是，所述TPP-1399在位置HC-102上展示为赖氨酸(K)。
表11中的数据集表明，当在所述表位肽中表示时M047-D08(TPP-1415)在其N末端序列上结合FGFR2，并且令人惊奇的是，在CDR中具有氨基酸置换的一些变体也具有相同的情况，甚至具有更高的亲和力。具有多个氨基酸置换的M047-D08(TPP-1415)的变体表现出大约4-40倍改善的结合，TPP-1409最少(2.1nM)，TPP-1406(0.22nM)最多。值得注意的是，它们其中的三种具有G102L(TPP-1406、-1407和-1412)置换和一种具有G102V(TPP-1408)置换，同时在CDR-L1、-L2、-L3、-H1和/或-H3中伴随一些其他置换。
表11：分别衍生自M048-D01和M047-D08的变体抗体的肽结合ELISA结果、蛋白质结合ELISA结果和内化效能数据
此外，表11中总结了成熟的抗FGFR2的抗体的内化效能的改善。基于成熟抗体的通过内化作用和降解作用达到的总颗粒强度/细胞与所述亲本抗体的相应值的比较来计算改善系数。通过能够表征相同等级的抗体的比较颗粒计数/细胞的方法而完成相同发现。实验细节在实施例12中描述。值得注意的是，M048-D01(TPP-1403)的所有成熟变体都表现出改善的内化效能(1.9-2.4倍)在M047-D08(TPP-1415)的情形中，变体TPP-1412表现出1.5倍改善的内化效能。内化作用是本发明的抗体的重要特征。
对于为M047-D08和M048-D01提供的所述变体，可以清楚地证实，如果保留了所述表位，那么这些抗体的变体就可以具有类似或改善的性质。
实施例17：与其他抗FGFR2的抗体的竞争的测定
为了分析本发明抗FGFR2的抗体与本领域中所描述的抗FGFR2的抗体之间的竞争，在竞争性ELISA方式中对不同抗体进行评价：
用20μl的在包被缓冲液(#121125Candor Bioscience GmbH)中的2μg/ml抗人IgG(Fc特异的(#I2136；sigma))在4℃下包被MTP板(384孔Maxisorp，Nunc)过夜。进行一次使用50μl PBST(磷酸盐缓冲液，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4，0.05％吐温20)的洗涤步骤后，将板用50μl的100％Smart Block(#113500,CandorBioscience GmbH)在20-22℃下封闭1h，重复3次所述洗涤步骤。通过在20-22℃下孵育1小时，将20μl的浓度为1μg/ml的M048-D01-hIgG1(在PBST中的10％Smart Block中)固定(示于表12；第二行M048-D01-hIgG1捕获为“是”)；将不使用M048-D01-hIgG1的对照孔仅用PBST中的10％Smart Block进行孵育(示于表12；第二行M048-D01-hIgG1捕获为“否”)。固定步骤之后进行三次使用50μlPBST的洗涤步骤。添加4份20μl的预孵育(20-22℃下1h)的抗原/抗体混合物，所述抗原/抗体混合物由10nM的重组人FGFR2(#10824-H08H,SinoBiological)和抗-FGFR2IgG组成，所述混合物用10％SmartBlock(PBST中)以5倍级联稀释而成(1000至0.064nM)，在20-22℃下孵育1h，接着进行3次洗涤步骤。
对于所述重组人FGFR2的检测，将20μl的用10％SmartBlock(在PBST中)以1:10000稀释的抗-组氨酸/HRP缀合物(#71840,novagen)在20-22℃下应用1h。进行3次洗涤步骤后，添加20μl的10μM amplex red底物(#A12222,Invitrogen)(在50mM磷酸氢二钠中，pH7.6)，使用普通荧光阅读器例如Tecan M1000检测荧光信号。
已经描述了三种不同的FGFR2结合抗体——称为GAL-FR21、GAL-FR22和GAL-FR23能够结合不同结构域表位(描述于WO2010/054265和Zhao et al.(Clin Cancer Res.2010,16:5750-5758))。为了评价这些抗体之间的差异，进行竞争测定。
由于不同的同种型的所述分析的抗体，竞争ELISA方式必须确保竞争情形的平等且直接地检测，所述竞争情形不会发生以下情况：由于使用不同的检测抗体或使用单一检测抗体对不同IgG同种型的不同亲和力，而产生附加效应的叠加。
上文所述的ELISA方式通过经由其组氨酸-标签检测所述FGFR2抗原，而非通过检测结合的小鼠或人IgG1或IgG2a，实现了这一标准。
M048-D01-hIgG1的固定是特异的，这与其人Fc部分相关，否则将会在用抗人IgG(Fc特异的)包被的ELISA板的孔中检测到大量的FGFR2，而检测不到M048-D01-hIgG1；未检测到可能发生的鼠抗-FGFR2-IgG与抗-人IgG(Fc特异的)的结合以及后续的FGFR2的结合(表12，第8-11列)。此外，未观察到显著的FGFR2与所述固定的抗-人IgG(Fc特异的)的非特异性结合(第2列)。非常清楚地发生了M048-D01-hIgG1的“自我竞争”(第6列)，并且这与M048-D01-mIgG2a的情况相同(第7列)。GAL-FR21、-FR22和-FR23的都未表现出剂量依赖性的可检测的FGFR2的降低(第3-5列)，而M048-D01-hIgG1和M048-D01-mIgG2a在竞争抗体为1.25和0.63nM以及更高浓度的情况下信号分别降低了>50％，这个观察结果证实了M048-D01与所述三种GAL抗体之间存在差异。与之相反，将所述单分子FGFR2(10nM)与GAL-FR22和GAL-FR23(而不与GAL-FR21)进行预孵育之后，可检测的FGFR2的量似乎显著增加。由于所述GAL抗体既不与组氨酸标签融合(通过蛋白质印记分析检查)，也不被所述抗-人IgG(Fc特异的)捕获，因此最有可能的解释是，单分子FGFR2可以通过与抗体进行预孵育而被二聚化，从而导致在后续的FGFR2与所述固定的M048-D01-hIgG1的结合方面产生亲和力效应。固定的M048-D01-hIgG1直接结合FGFR2，以及通过这种直接结合介导而间接与能够使单分子FGFR2发生二聚化的所述抗体GAL-FR22和GAL-FR23结合，这种情况将进一步说明M048-D01-hIgG1与所述GAL抗体结合完全不同的FGFR2表位，否则不可能发生同时结合的情况。值得注意的是，GAL-FR21未使可检测的FGFR2的量增加。这种差异似乎可以通过考虑WO2010/054265中所述的对GAL抗体的更具体的描述来解释：Gal-FR22结合D2-D3IIIa中的表位，而GAL-FR23结合全部或部分位于D1中的表位；这两个区域都存在于所述使用的重组人FGFR2-IIIc分子中。但是对于GAL-FR21，描述了所述表位位于D3-IIIb中，这个序列片段不存在于该FGFR2-IIIc同种型中；因此，GAL-FR21不能结合所述抗原并介导亲和力效应。如本文所示，在所有测定中，均未观察到M048-D01-hIgG1与所述GAL抗体之一之间发生竞争。
表12：抗体竞争ELISA。给出了相对于在校准系列中测定的10nMFGFR2的相应值(第1列)的平均信号。
上文所述竞争实验的结果得到以下观察结果的支持：所有三种GAL抗体包括GAL-FR23(表位全部或部分位于D1中)表现出不结合所述FGFR2细胞外N末端表位的合成肽(SEQID NO:63)，所述肽包含C末端连接至生物素化的赖氨酸的所述表位的氨基酸序列(1RPSFSLVEDTTLEPE15G-Ttds-Lys(生物素))，甚至在应用最高浓度的所述IgG滴定系列的情况下(600nM)，也未发生所述结合，而M048-D01-hIgG1(通过抗人IgG(Fc特异的)POD缀合物检测；#A5175，sigma)和M048-D01-mIgG2a的强烈结合导致EC50在≤1nM的范围内(详细数据未显示)。对于小鼠抗体的检测，使用抗-小鼠IgG(Fc特异的)POD缀合物(#715-35-15,jakson)，阳性检测表示其能够检测GAL-FR21、-FR22、-FR23和与FGFR2-IIIbα结合的M048-D01-mIgG2a。

Claims (20)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合由SEQ ID NO:63表示的FGFR2的细胞外N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与所述细胞外N末端表位(SEQ ID NO:63)的结合是通过至少一个选自Arg 1、Pro 2、Phe 4、Ser 5、Leu 6和Glu 8残基的表位残基介导的。
3.权利要求1-2任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中通过将FGFR2的N末端表位(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中的至少一个氨基酸残基改变为丙氨酸，所述抗体或其抗原结合片段失去了多于50％的其ELISA信号
a)所述残基选自Pro 2、Leu 6和Glu 8，或
b)所述残基选自Arg 1、Pro 2、Phe 4和Ser 5。
4.权利要求1-2任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一个选自如下的抗体竞争结合至FGFR2：“M048-D01”，其包含对应于SEQ ID NO:31的重链可变区和对应于SEQ ID NO:32的轻链可变区；“M047-D08”，其包含对应于SEQ ID NO:21的重链可变区和对应于SEQ ID NO:22的轻链可变区；“M017-B02”，其包含对应于SEQ ID NO:1的重链可变区和对应于SEQ ID NO:2的轻链可变区；“M021-H02”，其包含对应于SEQ ID NO:11的重链可变区和对应于SEQ ID NO:12的轻链可变区；“M054-A05”，其包含对应于SEQ IDNO:51的重链可变区和对应于SEQ ID NO:52的轻链可变区；“M054-D03”，其包含对应于SEQID NO:41的重链可变区和对应于SEQ ID NO:42的轻链可变区；“TPP-1397”，其包含对应于SEQ ID NO:83的重链可变区和对应于SEQ ID NO:84的轻链可变区；“TPP-1398”，其包含对应于SEQ ID NO:93的重链可变区和对应于SEQ ID NO:94的轻链可变区；“TPP-1399”，其包含对应于SEQ ID NO:103的重链可变区和对应于SEQ ID NO:104的轻链可变区；“TPP-1400”，其包含对应于SEQ ID NO:113的重链可变区和对应于SEQ ID NO:114的轻链可变区；“TPP-1401”，其包含对应于SEQ ID NO:123的重链可变区和对应于SEQ ID NO:124的轻链可变区；“TPP-1402”，其包含对应于SEQ ID NO:133的重链可变区和对应于SEQ ID NO:134的轻链可变区；“TPP-1403”，其包含对应于SEQ ID NO:73的重链可变区和对应于SEQ ID NO:74的轻链可变区；“TPP-1406”，其包含对应于SEQ ID NO:153的重链可变区和对应于SEQ IDNO:154的轻链可变区；“TPP-1407”，其包含对应于SEQ ID NO:163的重链可变区和对应于SEQ ID NO:164的轻链可变区；“TPP-1408”，其包含对应于SEQ ID NO:173的重链可变区和对应于SEQ ID NO:174的轻链可变区；“TPP-1409”，其包含对应于SEQ ID NO:183的重链可变区和对应于SEQ ID NO:184的轻链可变区；“TPP-1410”，其包含对应于SEQ ID NO:193的重链可变区和对应于SEQ ID NO:194的轻链可变区；“TPP-1411”，其包含对应于SEQ ID NO:203的重链可变区和对应于SEQ ID NO:204的轻链可变区；“TPP-1412”，其包含对应于SEQID NO:213的重链可变区和对应于SEQ ID NO:214的轻链可变区；和“TPP-1415”，其包含对应于SEQ ID NO:143的重链可变区和对应于SEQ ID NO:144的轻链可变区。
5.权利要求1-2任一项的抗体或抗原结合片段，其包含
a.由SEQ ID NO:5-7表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:8-10表示的可变轻链CDR序列，或
b.由SEQ ID NO:15-17表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:18-20表示的可变轻链CDR序列，或
c.由SEQ ID NO:25-27表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:28-30表示的可变轻链CDR序列，或
d.由SEQ ID NO:35-37表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:38-40表示的可变轻链CDR序列，或
e.由SEQ ID NO:45-47表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:48-50表示的可变轻链CDR序列，或
f.由SEQ ID NO:55-57表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:58-60表示的可变轻链CDR序列，或
g.由SEQ ID NO:75-77表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:78-80表示的可变轻链CDR序列，或
h.由SEQ ID NO:85-87表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:88-90表示的可变轻链CDR序列，或
i.由SEQ ID NO:95-97表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:98-100表示的可变轻链CDR序列，或
j.由SEQ ID NO:105-107表示的可变重链CDR序列和由SEQ ID NO:108-110表示的可变轻链CDR序列，或
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6.权利要求1-2任一项的抗体或抗原结合片段，其包含
a.由SEQ ID NO:1表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:2表示的可变轻链序列，或
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7.权利要求1-2任一项的抗体，其为IgG抗体。
8.权利要求1-2任一项的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)2片段。
9.权利要求1-2任一项的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或抗原结合片段。
10.权利要求1-2任一项的抗体或抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。
11.一种抗体-药物缀合物，其包含权利要求1-10任一项的抗体或其抗原结合片段。
12.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1-10任一项的抗体或抗原结合片段。
13.一种载体，其包含权利要求12的核酸序列。
14.一种分离的细胞，其表达权利要求1-10任一项的抗体或抗原结合片段和/或包含权利要求12的核酸或权利要求13的载体。
15.权利要求14的分离的细胞，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。
16.一种产生权利要求1-10任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求15的细胞和纯化所述抗体或抗原结合片段。
17.权利要求1-10任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求11的抗体-药物缀合物制备用于治疗癌症的药物的用途。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-10任一项的抗体或抗原结合片段或权利要求11的抗体-药物缀合物。
19.权利要求18的药物组合物与一种或多种治疗活性化合物的结合物。
20.权利要求18的药物组合物或权利要求19的结合物制备用于治疗与不希望存在的FGFR2相关的疾病或病症的药物的用途。
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