MX2014005855A - Anticuerpos anti-fgfr2 y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos anti-fgfr2 y usos de los mismos.

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Lars Linden
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Ricarda Finnern
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Jan Tebbe
Sven Golfier
Sandra Bruder
Mark Trautwein
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Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos que reducen la expresión de de FGFR2 en la superficie celular después de unirse a FGFR2 en tanto células que expresan en exceso FGFR2 como células que expresan FGFR2 mutado. También se proporcionan terapias basadas en anticuerpos para enfermedades o afecciones relacionadas con FGFR2 tales como cáncer. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en el campo del diagnóstico. La invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anteriores, vectores que contienen los mismos, composiciones farmacéuticas y kits con instrucciones para su uso.

Description

ANTICUERPOS ANTI-FGFR2 Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona regiones de unión a antígeno recombinantes y anticuerpos y fragmentos funcionales que contienen tales regiones de unión a antígeno que son específicos para el receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2).
Los anticuerpos, por consiguiente, pueden usarse para tratar tumores y otros trastornos y afecciones asociados a la expresión de FGFR2. La invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anteriores anticuerpos, vectores que contienen los mismos, composiciones farmacéuticas y kits con instrucciones para su uso.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia basada en anticuerpos está demostrando ser muy eficaz en el tratamiento de diversos cánceres, que incluyen tumores sólidos. Por ejemplo, HERCEPTIN® se ha usado satisfactoriamente para tratar cáncer de mama y RITUXAN® es eficaz en tipos de cáncer relacionados con linfocitos B. Es fundamental para el desarrollo de una terapia basada en anticuerpos satisfactoria el aislamiento de anticuerpos contra proteínas de la superficie celular que se encuentra que se expresan preferencialmente sobre células tumorales.
Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos son cinasas de receptores de tirosina (RTK), de los que se conocen cuatro (FGFR1 , FGFR2, FGFR3, FGFR4) en mamíferos. Como ligandos se identifican 22 factores de crecimiento de fibroblastos humanos (FGF) (Eswarakumar y Schlessinger, Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16:139-149; Shimada y col., Proc Nati Acad Sci USA 2001 , 98:6500-6505). Los FGFR están constituidos por tres dominios similares a inmunoglobulina (Ig) extracelulares, D1-D3, en los que los dominios 2 y 3 se requieren para la unión al ligando, un único dominio transmembrana y un dominio citoplásmico que contiene el núcleo catalítico de la proteína tirosina cinasa (para una representación esquemática véase la Figura 1). La parte extracelular aloja además la caja ácida (AB) y el sitio de unión a heparina (HBS) (véase la Figura 1). Un distintivo importante de la familia de FGFR de RTK es que existe una variedad de variantes alternativamente cortadas y empalmadas. El FGFR2 de longitud completa se llama FGFR2 alfa, mientras que la isoforma que carece de D1 se llama FGFR2 beta (Figura 1). El corte y empalme alternativo en el dominio 3 produce dos variantes diferentes, concretamente FGFR2 111 lo, que aloja los exones 7 y 8, y FGFR2 lile, que contiene los exones 7 y 9 (Figura 1). El último corte y empalme afecta la unión al ligando, produciendo el patrón de especificidad. FGFR2 lile se expresa principalmente por células mesenquimatosas, FGFR2 lllb principalmente por células epiteliales. FGF7 también conocido como el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) solo se une a FGFR2 lllb que, por tanto, también se llama KGFR. Tras la unión de FGF a sus receptores se produce la posterior dimerización y fosforilación de FGFR y señalización aguas abajo mediante el complejo de la proteína de enlace FRS-GRB2 para la cascada de señalización de RAS-MAPK y la cascada de señalización de PI3K-AKT. La primera cascada de señalización participa en el crecimiento y diferenciación celular, la última en la supervivencia celular y determinación del destino (Katoh y Katoh, Int J Oncol 2006, 29:163-168).
Se requiere la señalización orquestada de los cuatro receptores (FGFR1 a FGFR4) y sus variantes de corte y empalme mediante los diferentes FGF para la apropiada organogénesis durante la embriogénesis (Ornitz y col., Genome Biol 2001 , 2:3005). En el caso de FGFR2, la falta de todas las variantes de FGFR2 produce defectos en la placenta y la formación de yemas de las extremidades y, por consiguiente, produce letalidad en E10,5. La inactivación específica de FGFR2 lllb también produce letalidad (en P0), asociada a la agenesia de pulmones, pituitaria anterior, tiroides, dientes y extremidades, mientras que la alteración de la variante de FGFR2 lile es viable mostrando osificación retardada, enanismo equilibrado y sinostosis de la base del cráneo (Eswarakumar y Schlessinger, 2005). Las mutaciones activadoras de la línea germinal de FGFR2 en seres humanos conducen a graves deformidades durante la embriogénesis, tales como sinostosis coronal y craneosinostosis en síndromes de Apert o Pfeiffer (Robin y col., en Gene Reviews, NCBI Bookshelf Washington, edts. Pagon y col., 1993). En el adulto, la señalización de FGFR2 participa en la cicatrización, reparación epitelial y citoprotección de piel y mucosa (Braun y col., Phil Trans R Soc Lond B 2004, 359:753-757) y en la regeneración de hígado lesionado (Steiling y col., Oncogene 2003, 22:4380-4388; Bóhm, disertación, Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zurich, 2009). Una función de la señalización de FGFR2 en la migración de células derivadas del epicardio (CDEP) en el corazón después de infarto está en debate, ya que durante la embriogénesis la señalización de FGF10/FGFR2 es necesaria para la migración de CDEP en el miocardio compacto, un procedimiento requerido para el desarrollo de corazón intacto (Vega-Hernández y col., Development 2011:3331-3340; Winter y De Groot, Cell Mol Life Sci 2007, 64:692-703).
La elevada señalización independiente de la línea germinal mediante FGFR2 participa en diferentes patologías, tales como acné (Katoh, J of Invest Dermatol 2009, 129:1861-1867), psoriasis (Finch y col., Am J Pathol 1997, 151 :1619-1628; Xu y col., J Invest Dermatol 2011 :131 :1521-1529), periodontitis (Li y col., J Peridontal Res 2005, 40:128-138), lentigos solares (Lin y col., Journal Dermatol Sci 2010, 59:91-97), enfermedad intestinal (Brauchle y col., J Pathol 1996, 149:521-529), endometriosis (Taniguchi y col., Fértil Steril 2008, 89:478-480), colesteatoma (Yamamoto-Fukuda y col., Eur Arch Otorhinolaryngol (2008) 265:1173-1178; d'Alessandro y col., Otol Neurotol. 2010 Sep; 31 (7): 1163-9), otitis media crónica colesteatomatosa (Yamamoto-Fukuda y col., Otol Neurotol. 2010 Jul;31(5):745-51), aterosclerosls (Che y col., Am J Physiol Heart Circ Physiol 300: H154-H161 , 2011) y cáncer (véase más adelante).
Se han publicado varios estudios que destacan una fuerte asociación de la expresión de FGFR2 y el mal desenlace de pacientes con cáncer: La expresión en exceso de FGFR2 y/o KGF está asociada con el crecimiento expansivo de cáncer gástrico y supervivencia más corta de pacientes (Matsunobu y col., Int J Cáncer 2006, 28:307-314; Toyokawa y col., Oncol Reports 2009, 21 :875-880). La expresión en exceso de FGFR2 fue así detectada en el 31-36,5 % de todas las muestras de cáncer gástrico probadas (Matsunobu y col., Int J Cáncer 2006, 28:307-314; Toyokawa y col., Oncol Reports 2009, 21 :875-880). El adenocarcinoma (70 % de todo el cáncer gástrico) se divide adicionalmente en dos tipos patológicos distintos, concretamente el cáncer gástrico de tipo intestinal y el difuso. De forma interesante, el primer tipo, menos agresivo, está asociado a una ruta oncogénica de ErbB2 activada, mientras que el último de fenotipo más agresivo aloja anomalías en la ruta de FGFR2/PI3K (Yamashita y col., Surg Today 2011 , 41 :24-38). Aproximadamente el 60 % del adenocarcinoma gástrico pertenece al tipo difuso, el 40 % restante al tipo intestinal (Werner y col., J Cáncer Res Clin Oncol 2001 , 127:207-216). La expresión en exceso de FGFR2 se encontró en el 53 % de las muestras de cáncer gástrico tipo difuso (Yamashita y col., Surg Today 2011 , 41 :24-38). Tomando todos los datos juntos, se observa que la expresión de HER2 y FGFR2 se produce en dos poblaciones de pacientes distintas. Posiblemente, la expresión de FGFR2 resulta parcialmente de la amplificación génica como puede encontrarse en aproximadamente el 7-10 % de la amplificación de cáncer gástricos primarios de FGFR2 (Kunii y col. Cáncer Res 2008, 68:23-40-2348). Además, la expresión de FGFR2 no se encontró solo en metástasis, pero fue incluso más fuerte que en tumores primarios (Yamashita y col., Surg Today 2011 , 41 :24-38).
En cáncer de mama, la expresión de FGFR2 lllb se encontró en el 57 % de las muestras tumorales, pero difícilmente en tejido sano (Tamaru y col. 2004, 84:1460-1471). KGF (FGF7) se encontró en el 45 % de las muestras, generalmente coincidió con FGFR2 lllb. La co-expresión de FGF7 y su único receptor FGFR2 lllb se asoció a un número significativamente reducido de células apoptósicas dentro del tumor primario con respecto a cánceres de mama primarios que ni expresan FGF7 ni FGFR2 lllb (Tamaru y col. 2004, 84:1460-1471). Como en el cáncer gástrico, la amplificación génica también se encontró en cáncer de mama: en el 4 % de cáncer de mama triple negativo (CMTN) (Turner y col. Oncogene 2010, 29:2013-2023). En cáncer de mama se identificaron varios polimorfismos nucleares pequeños (PNP), que están asociados a elevado riesgo de cáncer de mama (Hunter y col. Nature Genetics 2007, 6:870-874). Si los PNP están localizados dentro del intrón 2, se produce la regulación por incremento transcripcional de FGFR2 (Katoh Expert Reviews 2010, 10:1375-1379). De forma interesante, FGFR1 se regula preferencialmente por incremento en cánceres de mama positivos para RE, mientras que FGFR2 en negativos para RE (Katoh, Expert Reviews 2010, 0:1375-1379) En cáncer pancreático, la expresión en exceso de FGFR2 lllb y/o FGF7 está fuertemente correlacionada con invasión venosa (Cho y col., Am J Pathol 170:1964-1974), por lo que la co-expresión de FGFR2 y FGF7 se encontró en células tumorales, pero incluso más abundante en las células del estroma adyacentes a células tumorales (Ishiwata y col., Am J Pathol 1998, 153:213-222).
En cáncer de ovario epitelial, en el 80 % de los casos probados se encontró la regulación por incremento de FGFR2 con respecto al tejido normal y en el 70 % de FGF7 en el líquido ascítico (Steele y col., Oncogene 20:5878-5887).
Se encontró la proteína FGFR2 en todos los cánceres de cuello uterino invasivos probados con fuerte expresión en el frente invasivo de tumores (Kawase y col., Int J Oncol 2010, 36:331-340).
En adenocarcinoma de pulmón, la co-expresión de FGF7 y FGFR2 se encontró en el 51 ,6 % de los casos probados y se correlaciona con menores grados de diferenciación, mayor tasa de proliferación, metástasis de ganglios linfáticos y supervivencia de 5 años más corta (Yamayoshi y col., J Pathol 2004, 204:110-118).
En cáncer de endometrio, las mutaciones activantes más frecuentes de FGFR2 se encuentran en aproximadamente el 16 % de los cánceres de endometrio (Pollock y col., Oncogene 2007, 26:7158-7162).
En carcinoma esofágico (CE), la co-expresión de FGF7 y FGFR2 en células cancerosas se encontró en el 26 % de los pacientes asociada a una tendencia a la supervivencia más corta (Yoshino y col., Int J Oncol 2007, 31:721-728).
En carcinoma hepatocelular, la expresión de FGFR2 se reguló por incremento 4,7 veces en tumores malamente diferenciados. Esta expresión está asociada a incidencia de invasión de la vena porta y menores tiempos de supervivencia sin enfermedad (Harimoto y col., Oncology 2010, 78:361-368).
Varias publicaciones con datos in vitro e in vivo experimentales demuestran una relación causal de señalización de FGFR2 anómala y progresión tumoral: La inactivación y/o inhibición de FGFR2 en célula gástrica (Takeda y col., Clin Cáncer Res 2007; 13:3051-3057; Kunii y col., Cáncer Res 2008; 68:2340-2348), de mama (Turner y col. Oncogene 2010, 29:2013-2023), ovario (Colé y col., Cáncer Biol Ther 2010, 10:495-504) y escamosa de cabeza y cuello (Marshall y col., Clin Cáncer Res 2011 , 17:5016-5025) de células de carcinoma produjeron proliferación reducida y/o elevada apoptosis de células tumorales. También en xenoinjertos de tumor, inactivación de FGFR2, además de inhibición de FGFR2 en líneas celulares tumorales que expresan en exceso FGFR2, se mostró inhibición del crecimiento para líneas de células de cáncer gástrico (Takeda y col., Clin Cáncer Res 2007; 13:3051-3057) y de ovario (Colé y col., Cáncer Biol Ther 2010, 10:495-504). Adicionalmente, FGF7, que únicamente activa FGFR2, aumenta la proliferación de líneas de células de cáncer gástrico (Shin y col., J Cáncer Res Clin Oncol 2002, 128:596-602), de mama (Zhang y col., Anticancer Res 1998, 18:2541-2546) y de ovario (Colé y col., Cáncer Biol Ther 2010, 10:495-504) in vitro e in vivo. Además, la inactivación de FGFR2 en líneas de células de cáncer de endometrio que alojan FGFR2 con mutaciones activantes también produjo la detención del ciclo celular e inducción de muerte celular (Byron y col., Cáncer Res 2008, 68:6902-6907).
La señalización de FGFR2 promueve la migración e invasión de líneas de células de cáncer gástrico (Shin y col., J Cáncer Res Clin Oncol 2002, 128:596-602), de mama (Zhang y col., Anticancer Res 1998, 18:2541-2546) y pancreático in vitro (Nomura y col., Br J Cáncer 2008, 99:305-313; Niu y col., J Biol Chem 2007, 282:6601-6011).
En carcinoma de esófago, FGFR2 es el gen más regulado por incremento en fibroblastos asociados a tumor. Los fibroblastos asociados a tumor aislados liberaron un factor soluble que promueve la proliferación de células de cáncer de esófago (Zhang y col., hum Cáncer Biol 2009, 15:4017-4022), demostrando que FGFR2 también expresado por células del estroma puede promover la progresión tumoral.
Solo se ha informado de un número limitado de anticuerpos anti-FGFR2. Fortín y col. (J. Neurosci. 2005, 25: 7470-7479) describen un anticuerpo anti-FGFR2 de bloqueo. Wei y col. (Hybridoma 2006, 25: 115-124) mostraron anticuerpos específicos solo para FGFR2 lllb que inhiben la proliferación celular inducida por KGF. En el documento WO2007/144893 se desvelan anticuerpos inhibidores que se unen a FGFR2 y FGFR3. En el documento WO2010/054265 y Zhao y col. (Clin Cáncer Res. 2010,16:5750-5758) se desvelan anticuerpos que inhiben la unión de FGF. Bai y col. (Cáncer Res. 2010, 70:7630-7639) describen anticuerpos específicos para FGFR2 II Ib. R&D Systems comercializa anticuerpos anti-FGFR2 que neutralizan la actividad en sus ensayos.
En resumen, se conocen varias variantes de corte y empalme de FGFR2. Además, se sabe que enfermedades relacionadas con FGFR2 son debidas a la expresión anómala, por ejemplo, expresión en exceso o amplificación de FGFR2, o debido a diversas proteínas FGFR2 mutadas. Sin embargo, falta una terapia que trate una pluralidad de diferentes enfermedades relacionadas con FGFR2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la provisión de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que reducen la expresión de FGFR2 en la superficie celular después de unirse a FGFR2 en tanto células que expresan en exceso FGFR2 como células que expresan FGFR2 mutado. También se proporcionan terapias basadas en anticuerpos para enfermedades o afecciones relacionadas con FGFR2 tales como cáncer, en particular para tumores que expresan FGFR2, tales como cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, melanoma y cáncer de vejiga.
La invención también está relacionada con polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, células que expresan los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para producir los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para inhibir el crecimiento de células displásicas usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y procedimientos de tratamiento y detección de cáncer usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
La invención describe anticuerpos que se distinguen de anticuerpos para FGFR2 existentes porque reducen la expresión superficial de FGFR2 después de unirse a FGFR2 en células que expresan en exceso FGFR2, además de en células que expresan FGFR2 mutado. Una realización de la invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al epítopo del extremo N extracelular (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 (SEC ID N°: 63). Los anticuerpos o fragmento de unión a antígeno de los mismos de la invención a) activan FGFR2 a corto plazo, b) inducen la internalización de FGFR2 c) produciendo degradación eficiente, d) desensibilización de las células cancerosas o células tumorales que expresan FGFR2 y e) finalmente produciendo una actividad antitumoral de estos anticuerpos en experimentos de tumores in vivo. Estos y otros objetivos de la invención se describen más completamente en el presente documento.
Un anticuerpo de la invención podría coadministrarse con medicamentos conocidos, y en algunos casos el anticuerpo podría modificarse por sí mismo. Por ejemplo, un anticuerpo podría conjugarse con un agente citotóxico, inmunotoxina, toxóforo o radioisótopo para aumentar posiblemente adicionalmente la eficacia.
La invención proporciona además anticuerpos que constituyen una herramienta para diagnosticar afecciones malignas o displásicas en la que la expresión de FGFR2 es elevada en comparación con tejido normal o en los que FGFR2 se desprende de la superficie celular y se convierte en detectable en suero. Se proporcionan anticuerpos anti-FGFR2 conjugados con un marcador detectable. Marcadores preferidos son una radiomarca, una enzima, un cromóforo o un agente fluorescente.
La invención también está relacionada con polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, células que expresan los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para producir los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, procedimientos para inhibir el crecimiento de células displásicas usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y procedimientos para tratar y detectar cáncer usando los anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas, g cada una de las cuales puede codificar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo anteriormente mencionado que es específico para un epítopo de FGFR2. Los ácidos nucleicos de la invención son adecuados para la producción recombinante de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno. Así, la invención también se refiere a vectores y células huésped que contienen una secuencia de ácido nucleico de la invención.
Las composiciones de la invención pueden usarse para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. La invención, por tanto, incluye una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo inventivo o fragmento de unión a antígeno del mismo y, por tanto, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un procedimiento para tratar un trastorno o afección asociado a la presencia no deseada de células que expresan FGFR2. En una realización preferida, el trastorno anteriormente mencionado es cáncer. Tal procedimiento contiene las etapas de administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo inventivo como se describe o se contempla en el presente documento.
La invención también proporciona instrucciones para usar una biblioteca de anticuerpos para aislar uno o más miembros de tal biblioteca que se unen específicamente a FGFR2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Diagrama esquemático de la estructura de FGFR2. Se muestran variantes de corte y empalme alfa (SEC ID N°: 61) y beta (SEC ID N°: 62) en comparación. El diagrama muestra los tres dominios similares a Ig (D1 , D2 y D3), el dominio transmembrana (TM) y el dominio de cinasa intracelular. Se indican el sitio de unión a heparina (HBS), la caja ácida (AB) y los dominios parciales lllb/lllc alternativos. El extremo amino está marcado con una N, el extremo carboxi con una C. El epítopo de unión de los anticuerpos de la presente invención se representa rayado.
Figura 2: Inducción de niveles de FGFR2 fosforilado (FGFR2-P) después de incubación a corto plazo (15 min) con anticuerpos anti-FGFR2 a 10 pg/ml en células MFM223. Y es "% de células de control sin tratar". Como se muestra, los anticuerpos M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 aumentan la señal de ELISA de FGFR2-F por un factor superior a 4 veces en comparación con células de control sin tratar. A diferencia, ni el anticuerpo IgG de control ni los anticuerpos anti-FGFR2 comercialmente disponibles de R&D (MAB665, MAB684, MAB6843) mostraron ningún efecto significativo sobre los niveles de FGFR2-F después de la incubación a corto plazo. Estos resultados revelan un efecto agonista de los anticuerpos anti-FGFR2 descritos dentro de la presente invención sobre FGFR2 después de la incubación a corto plazo.
Figura 3: La desensibilización de células MFM223 contra FGF7 (25 ng/ml, 15 min) medió en la inducción de niveles de FGFR2-F después de la incubación a largo plazo (24 h) con anticuerpos anti-FGFR2 a 10 pg/ml. Y es "% de células de control sin tratar". Como se muestra, los anticuerpos M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 reducen el nivel de FGFR2-F que puede lograrse después de la estimulación de FGF7 muy pronunciada. En células tratadas sin tratamiento con anticuerpo, además de en células tratadas con IgG de control de isotipo, la estimulación con FGF7 conduce a un aumento de aproximadamente 4 veces de los niveles de FGFR2-F. A diferencia, en muestras pretratadas con anticuerpos anti-FGFR2 durante 24 h, FGF7 solo indujo niveles de FGFR2-F de 1 ,37-1 ,4 veces.
Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que la incubación prolongada de células con anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención conduce a desensibilización hacia la estimulación con FGF7.
Figura 4: Regulación por disminución de la expresión superficial de FGFR2 en líneas celulares con expresión en exceso de FGFR2 (MFM223, SNU16) o mutaciones de FGFR2 (AN3-CA, MFE-296) 4,5 h después de la incubación con anticuerpos anti-FGFR2 a 10 pg/ml medida por análisis de FACS. Y es "% de células de control". Como se muestra, los anticuerpos M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 son los únicos anticuerpos que reducen la expresión superficial de FGFR2 con líneas celulares que expresan en exceso FGFR2 (MFM223, SNU16) y líneas celulares que tienen mutaciones de FGFR2 (AN3-CA, MFE-296). Anticuerpos como MAB684 y MAB6843 (R&D) solo reducen la expresión superficial de FGFR2 con líneas celulares que no expresan en exceso FGFR2. Anticuerpos similares a GAL-FR21 no reducen la expresión superficial de FGFR2 con líneas celulares que tienen mutaciones de FGFR2.
Figura 5: Regulación por disminución de niveles de FGFR2 total después de la incubación a largo plazo (96 h) con anticuerpos anti-FGFR2 en células SNU16. Y es "% de células de control". X es "concentración de anticuerpo [pg/ml]". Como se muestra, los anticuerpos M048-D01-hlgG1 (blanco) y M047-D08-hlgG1 (rayado) disminuyen los niveles de FGFR2 total significativamente después de 96 h de manera dependiente de la dosis. Un anticuerpo de control de no unión (negro) no muestra ningún efecto. Estos resultados indican que los anticuerpos anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 no solo conducen a una disminución a corto plazo en los niveles de FGFR2 superficial, sino también a una reducción a largo plazo de los niveles de FGFR2 total.
Figura 6: Evaluación microscópica del transcurso de tiempo de la internalización específica de M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 tras la unión a células endógenas que expresan FGFR2. Y es "recuentos de gránulos por célula". X es "tiempo [min]". La internalización de anticuerpos se investigó en la línea celular de cáncer de mama SUM 52PE. Los recuentos de gránulos por célula se midieron de un modo cinético. Como se muestra, los anticuerpos M048-D01-hlgG1 (cuadrados negros y línea continua) y M047-D08-hlgG1 (triángulos negros y línea discontinua) muestran una rápida internalización como se indica por el recuento de gránulos creciente por célula. Un anticuerpo de control de isotipo (estrellas y línea discontinua) no muestra ninguna internalización.
Figura 7: La internalización de M048-D01-hlgG1 (A, B) y M047-D08-hlgG1 (C, D) en células SUM 52PE mostró co-tinción como se indica con Rab 7 (A, C) y no con Rab 11 (B, D). La internalización de GAL-FR21 (E, F) y GAL-FR22 (G, H) en células SUM 52PE mostró co-tinción como se indica con Rab 11 (F, H) y no con Rab 7 (E, G).
Figura 8: Crecimiento de xenoinjertos de SNU-16 subcutáneos bajo tratamiento intraperitoneal con 2 mg/kg de M017-B02-hlgG1 (triángulos blancos, línea continua) en comparación con PBS (círculos rellenos, línea continua) y tratamiento con IgG de control (triángulos rellenos, línea continua). Se representan la media + desviación estándar. X es "tiempo después de la inoculación del tumor [días]". Y es "área del tumor [mm2]". El tratamiento con M017-B02-hlgG1 produjo una inhibición tumoral muy significativa del crecimiento.
Figura 9: Crecimiento de xenoinjertos de SNU-16 subcutáneos bajo tratamiento intraperitoneal con 2 mg/kg de M021-H02-hlgG1 (triángulos blancos, línea continua) en comparación con PBS (círculos rellenos, línea continua) y tratamiento con IgG de control (triángulos rellenos, línea continua). Se representan la media + desviación estándar. X es "tiempo después de la inoculación del tumor [días]". Y es "área del tumor [mm2]". El tratamiento con M021-H02-hlgG1 produjo una inhibición tumoral muy significativa del crecimiento.
Figura 10: Crecimiento de xenoinjertos de SNU-16 subcutáneos bajo tratamiento intraperitoneal con 2 mg/kg de M048-D01-hlgG1 (triángulos blancos, línea continua) en comparación con PBS (círculos rellenos, línea continua) y tratamiento con IgG de control (triángulos rellenos, línea continua). Se representan la media + desviación estándar. X es "tiempo después de la inoculación del tumor [días]". Y es "área del tumor [mm2]". El tratamiento con M048-D01-hlgG1 produjo una inhibición tumoral muy significativa del crecimiento.
Figura 11 : Crecimiento de xenoinjertos de SNU-16 subcutáneos bajo tratamiento intraperitoneal con 2 mg/kg de M054-A05-hlgG1 (triángulos blancos, línea continua) en comparación con PBS (círculos rellenos, línea continua) y tratamiento con IgG de control (triángulos rellenos, línea continua). Se representan la media + desviación estándar. X es "tiempo después de la inoculación del tumor [días]". Y es "área del tumor [mm2]". El tratamiento con M054-A05-hlgG1 produjo una inhibición tumoral muy significativa del crecimiento.
Figura 12: Crecimiento de xenoinjertos de SNU-16 subcutáneos bajo tratamiento intraperitoneal con 2 mg/kg de M054-D03-hlgG1 (triángulos blancos, línea continua) en comparación con PBS (círculos rellenos, línea continua). Se representan la media + desviación estándar. X es "tiempo después de la inoculación del tumor [días]". Y es "área del tumor [mm2]". El tratamiento con M054-D03-hlgG1 produjo una inhibición tumoral muy significativa del crecimiento.
Figura 13: Crecimiento de xenoinjertos de SNU-16 subcutáneos bajo tratamiento intraperitoneal con 2 mg/kg de M047-D08-hlgG1 (triángulos blancos, línea continua) en comparación con PBS (círculos rellenos, línea continua). Se representan la media + desviación estándar. X es "tiempo después de la inoculación del tumor [días]". Y es "área del tumor [mm2]". El tratamiento con M047-D08-hlgG1 produjo una inhibición tumoral muy significativa del crecimiento.
Figura 14: Gráficos de puntos del área del tumor de tumores 4T1 subcutáneos en el día 13 después de la inoculación de células tumorales, el último momento antes de que los tumores se volvieran necróticos. En este momento los ratones recibieron tratamiento con PBS solo (A), 5 mg/kg de M048-D01-hlgG1 dos veces a la semana i.v. (B), 100 mg/kg de lapatinib p.o. (C) o con 5 mg/kg de M048-D01-hlgG1 dos veces a la semana i.v. y 100 mg/kg de lapatinib p.o. (D). Y es el área del tumor [mm2] en el día 13, líneas de puntos indican los valores medios, líneas continuas indican las medianas. El tratamiento con M048-D01-hlgG1 solo produjo una reducción significativa del área del tumor, mientras que lapatinib solo no afectó significativamente el área del tumor. La combinación de M048-D01-hlgG1 con lapatinib produjo una actividad antitumoral significativamente aditiva.
Figura 15: Gráficos de puntos del área del tumor de tumores 4T1 subcutáneos en el día 13 después de la inoculación de células tumorales, el último momento antes de que los tumores se volvieran necróticos. En este momento, los ratones recibieron tratamiento con PBS solo (A), 5 mg/kg de M048-D01-hlgG1 dos veces a la semana i.v. (B), 24 mg/kg de taxol una vez a la semana i.v. (C) o con 5 mg/kg de M048-D01-hlgG1 dos veces a la semana i.v. y 24 mg/kg de taxol una vez a la semana i.v. (D). Y es el área del tumor [mm2] en el día 13, líneas de puntos indican los valores medios, líneas continuas indican las medianas. El tratamiento con M048-D01-hlgG1 solo produjo una reducción significativa del área del tumor, mientras que taxol solo no afectó significativamente el área del tumor. La combinación de M048-D01-hlgG1 con taxol produjo una actividad antitumoral significativamente aditiva.
Figura 16: Crecimiento de xenoinjertos de GC10-0608 subcutáneos derivados de pacientes bajo tratamiento intraperitoneal con 5 mg/kg (triángulos rellenos, línea continua), 2 mg/kg (círculos rellenos, línea discontinua) y 1 mg/kg (cuadrados rellenos, línea de puntos) de M048-D01-hlgG1 en comparación con PBS (diamantes blancos, línea continua). Se representan la media ± error estándar de las medias. X es "tiempo bajo tratamiento [días]". Y es "volumen del tumor [mm3]". El tratamiento con las tres dosis de M048-D01-hlgG1 produjo una inhibición significativa del crecimiento tumoral.
Figura 17: Crecimiento de xenoinjertos de GC12-0811 subcutáneos procedentes de pacientes bajo tratamiento intraperitoneal con 5 mg/kg (triángulos rellenos, línea continua), 2 mg/kg (círculos rellenos, línea discontinua) y 1 mg/kg (cuadrados rellenos, línea de puntos) de M048-D01-hlgG1 en comparación con PBS (diamantes blancos, línea continua). Se representan la media ± error estándar de las medias. X es "tiempo bajo tratamiento [días]". Y es "volumen del tumor [mm3]". El tratamiento con dosis de 5 y 1 mg/kg de M048-D01-hlgG1 produjo una inhibición significativa del crecimiento tumoral.
Figura 18: Regulación por disminución de FGFR2 total [FGFR2 total] y FGFR2 fosforilado [FGFR2-F] después del tratamiento a largo plazo de xenoinjertos de SNU16 con anticuerpos anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 en comparación con un anticuerpo de control (2 mg/kg, dos veces a la semana, i.p., se tomaron muestras 24 h después de la última dosis). Como se muestra después del tratamiento con M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 , FGFR2 total [FGFR2 total] y FGFR2 fosforilado [FGFR2-F] se redujeron significativamente en comparación con el tratamiento con lgG1 de control. La actina sirvió de control de carga.
Figura 19: Secuencias de la invención DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de novedosos anticuerpos que tienen una afinidad específica por FGFR2 y pueden proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto. Los anticuerpos de la invención, que pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, pueden usarse en muchos contextos, que se describen más completamente en el presente documento.
Definiciones A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Sin embargo, las siguientes referencias pueden proveer a un experto en la materia a la que se refiere la presente invención de una definición general de muchos de los términos usados en la presente invención, y pueden citarse y usarse mientras que tales definiciones sean coherentes con el significado comúnmente entendido en la materia. Tales referencias incluyen, pero no se limitan a, Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); y Lackie y col., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3a ed. 1999); y Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman y Pober, 2a edición, W.B. Saunders Company. Puede consultarse cualquier fuente técnica adicional disponible para el experto habitual en la materia que proporcione definiciones de términos usados en el presente documento que tengan el significado comúnmente entendido en la materia. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen adicionalmente. Términos adicionales se definen en cualquier parte en la descripción. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencia plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Así, por ejemplo, referencia a "un gen" es una referencia a uno o más genes e incluye equivalentes de los mismos conocidos para aquellos expertos en la materia, etc.
Un anticuerpo "humano" o fragmento de unión a antígeno del mismo se define por este documento como uno que no es quimérico (por ejemplo, no "humanizado") y no de una especie no humana (tanto en conjunto como en parte). Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo puede derivarse de un ser humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. Un "anticuerpo humano sintético" se define en el presente documento como un anticuerpo que tiene una secuencia derivada, en conjunto o en parte, por ordenador de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias de anticuerpos humanos conocidas. El diseño por ordenador de una secuencia de anticuerpo humano o fragmento del mismo puede lograrse, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias de fragmentos de anticuerpos humanos o de anticuerpos e ideando una secuencia de polipéptidos utilizando los datos obtenidos a partir de la misma. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno del mismo es uno que está codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (por ejemplo, estando tal biblioteca basada en anticuerpos tomados de una fuente natural humana). Ejemplos de anticuerpos humanos incluyen anticuerpos como se describen en Sóderlind y col., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.
Un "anticuerpo humanizado" o fragmento de unión a antígeno humanizado del mismo se define en el presente documento como uno que (i) se deriva de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico que posee un sistema inmunitario heterólogo), anticuerpo que se basa en una secuencia de la línea germinal humana; (ii) en el que los aminoácidos de las regiones marco conservadas de un anticuerpo no humano se intercambian parcialmente por secuencias de aminoácidos humanas por ingeniería genética o (iii) se injertan en CDR, siendo las CDR del dominio variable son de un origen no humano, mientras que una o más regiones estructurales del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (si lo hay) es de origen humano.
Un "anticuerpo quimérico" o fragmento de unión a antígeno del mismo se define en el presente documento como uno en el que los dominios variables se derivan de un origen no humano y algunos o todos los dominios constantes se derivan de un origen humano.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones que se producen naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Así, el término "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque están normalmente sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El término "monoclonal" no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. El término anticuerpo monoclonal incluye específicamente anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente a", es "específico para/por" o "reconoce específicamente" un antígeno de interés, por ejemplo, una diana de antígeno de polipéptido asociada a tumor (aquí FGFR2), es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad de forma que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico en la elección como diana de una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reaccione significativamente de forma cruzada con otras proteínas o no reaccione significativamente de forma cruzada con proteínas distintas de ortólogos y variantes (por ejemplo, formas mutantes, variantes de corte y empalme, o formas proteolíticamente truncadas) de la diana de antígeno anteriormente mencionada. La expresión "reconoce específicamente" o "se une específicamente a" o es "específico para/por" un polipéptido particular o un epítopo sobre una diana de polipéptido particular como se usa en el presente documento puede presentarse, por ejemplo, por un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una KD monovalente para el antígeno de menos de aproximadamente 10"4 , alternativamente menos de aproximadamente 10"5 M, alternativamente menos de aproximadamente 10"6 M, alternativamente menos de aproximadamente 10"7 M, alternativamente menos de aproximadamente 10"8 M, alternativamente menos de aproximadamente 10~9 M, alternativamente menos de aproximadamente 10"10 M, alternativamente menos de aproximadamente 10~11 M, alternativamente menos de aproximadamente 10"12 M, o menos. Un anticuerpo "se une específicamente a", es "específico para/por" o "reconoce específicamente" un antígeno si tal anticuerpo puede discriminar entre tal antígeno y uno o más antígenos de referencia. En su forma más general, "unión específica", "se une específicamente a", es "específico para/por" o "reconoce específicamente" es con referencia a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno sin relacionar, como se ha determinado, por ejemplo, según uno de los siguientes procedimientos. Tales procedimientos comprenden, pero no se limitan a, transferencias Western, pruebas de ELISA, RIA, ECL, IRMA y barridos de péptidos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo de ELISA convencional. La puntuación puede llevarse a cabo por revelado de color convencional (por ejemplo, anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano picante y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en ciertos pocilios se puntúa por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. Ruidos de fondo típicos (=reacción negativa) pueden ser 0,1 DO; la reacción positiva típica puede ser 1 DO. Esto significa que la diferencia positiva/negativa es superior a 5 veces, 10 veces, 50 veces, y preferentemente superior a 100 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando no un único antígeno de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos sin relacionar, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares.
"Afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula y su componente de unión. A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 : 1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno). La constante de disociación "KD" se usa comúnmente para describir la afinidad entre una molécula (tal como un anticuerpo) y su componente de unión (tal como un antígeno), es decir, cómo de fuerte se une un ligando a una proteína particular. Las afinidades ligando-proteína están influidas por interacciones intermoleculares no covalentes entre las dos moléculas. La afinidad puede medirse por procedimientos comunes conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en el presente documento. En una realización, "KD" O "valor de KD" según la presente invención se mide usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales usando un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.) según el Ejemplo 7. En resumen, los anticuerpos se inmovilizaron sobre un chip sensor CM5 mediante un reactivo de captura indirecto, Fe anti-lgG humana. Los reactivos del "kit de captura de anticuerpos humanos" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) se usaron como se describe por el fabricante. Aproximadamente 5000 unidades de resonancia (UR) de anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra IgG humana (Fe) se inmovilizaron por célula. Los anticuerpos anti-FGFR2 se inyectaron para alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200 a 600 UR. Diversas concentraciones de péptidos FGFR2 humanos, murinos, de rata, perro y derivados de otras especies que contenían los aminoácidos 1-15 se inyectaron sobre anticuerpos anti-FGFR2 inmovilizados. Se generaron sensogramas después de la corrección de células de referencia en linea, seguido de la resta de la muestra tampón. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó basándose en la relación de las constantes de asociación (kas) y disociación (kd¡s), obtenida ajustando sensogramas con un modelo de unión 1:1 de primer orden usando el software Biacore Evaluation. Otros dispositivos adecuados son BIACORE(R)-2000, BIACORE (R)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), o el instrumento ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
Para determinar residuos críticos para la unión de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos puede realizarse el mapeo fino de epítopos, usando por ejemplo, barrido con alanina de péptidos. Por tanto, cada aminoácido del epítopo de unión se sustituye con un residuo de alanina y la unión de anticuerpos representativos de la invención se prueba en un ensayo basado en ELISA. Así, un residuo se considera crítico para la unión cuando el anticuerpo pierde más del 50 % de su señal de ELISA al transformar este residuo en una alanina como se describe en el Ejemplo 6.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina, que preferentemente comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), que normalmente están interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada puede comprender, por ejemplo, tres dominios CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL está normalmente compuesta de tres CDR y hasta cuatro FR dispuestas del extremo amino al extremo carboxi, por ejemplo, en el siguiente orden: FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Como se usa en el presente documento, el término "regiones determinantes de la complementariedad (CDR; por ejemplo, CDR1 , CDR2 y CDR3) se refiere a los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión al antígeno. Cada dominio variable normalmente tiene tres regiones CDR identificadas como CDR1 , CDR2 y CDR3. Cada región determinante de la complementariedad puede comprender residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" como se define por Kabat (por ejemplo, aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, aproximadamente los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26- 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (Chothia y Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). En algunos casos, una región determinante de la complementariedad puede incluir aminoácidos de tanto una región CDR definida según Kabat como un bucle hipervariable.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas puede dividirse adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se llaman [alfa], [delta], [epsilon], [gamma] y [mu], respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. Como se usa en el presente documento, los anticuerpos son anticuerpos convencionalmente conocidos y fragmentos funcionales de los mismos.
Un "fragmento funcional" o "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina por este documento se define como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión a antígeno. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo normalmente se encuentra en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, por ejemplo, las regiones CDR1 , -2 y/o -3; sin embargo, las "regiones marco conservadas" variables también pueden desempeñar una función importante en la unión a antígeno, tal como proporcionando un andamiaje para las CDR. Preferentemente, la "región de unión a antígeno" comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena ligera variable (VL) y 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferentemente residuos de aminoácidos 3 a 107 de VL y 4 a 111 de VH, y particularmente se prefieren las cadenas VL y VH completas (posiciones de aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración según el documento WO 97/08320). Una clase preferida de inmunoglobulinas para su uso en la presente invención es IgG.
"Fragmentos funcionales" o "fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno" de la invención incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos de un único dominio (DAbs), anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (scFv); y anticuerpos multiespecíficos, tales como bi- y tri-específicos, formados de fragmentos de anticuerpos (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Se entiende que un anticuerpo distinto de un anticuerpo "multi-específico" o "multi-funcional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. El F(ab')2 o Fab puede manipularse para minimizar o eliminar completamente las interacciones de disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CHi y CL.
Las variantes de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno contemplados en la invención son moléculas en las que se mantiene la actividad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno para FGFR2.
Las proteínas de unión contempladas en la invención son, por ejemplo, miméticos de anticuerpos, tales como Affibodies, adnectinas, anticalinas, DARPins, avímeros, nanocuerpos (recopilados por Gebauer M. y col., Curr. Opinión in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. y col., Curr. Opinión in Pharmacology 2008; 8:608-617).
Como se usa en el presente documento, el término 'epítopo' incluye cualquier determinante de proteína que pueda unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptores de linfocitos T. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, o combinaciones de los mismos y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, además de características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos se 'unen al mismo epítopo' si se muestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitiva, por cualquiera de los procedimientos bien conocidos para aquellos expertos en la materia.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado de un componente de la célula que lo expresó. Componentes contaminantes de la célula son materiales que interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purifica (1) a más del 95 % en peso de anticuerpo como se ha determinado, por ejemplo, por el procedimiento de Lowry, espectroscopia de UV-Vis o por SDS-electroforesis en gel capilar (por ejemplo, en un dispositivo Caliper LabChip GXII, GX 90 o Biorad Bioanalyser), y en realizaciones adicionalmente preferidas más del 99 % en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo N o secuencia de aminoácidos interna, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo que se produce naturalmente aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
"Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida sobre receptores Fe gamma (FcyR) presentes sobre ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células NK, neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que lleva antígeno y posteriormente destruya la célula diana, por ejemplo, con citotoxinas. Para evaluar la actividad de ADCC de un anticuerpo de interés puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE.UU. n° 5.500.362 ó 5.821.337 o la patente de EE.UU. n° 6.737.056 (Presta). Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen CMSP y células NK.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la ruta del complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada), que están unidos a su antígeno relacionado. Para evaluar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de la región Fe alteradas (polipéptidos con una región Fe variante) y unión de C1q elevada o disminuida se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n° 6.194.551 B1 y el documento WO 1999/51642.
El término inmunoconjugado (denominado indistintamente "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC") se refiere a un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina de proteína, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los inmunoconjugados se han usado para la administración local de agentes citotóxicos, es decir, fármacos que destruyen o inhiben el crecimiento o proliferación de células, en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, Liu y col., Proc Nati. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623)). Los inmunoconjugados permiten la administración elegida como diana de un resto de fármaco a un tumor, y acumulación intracelular en su interior, donde la administración sistémica de fármacos sin conjugar puede producir niveles de toxicidad inaceptables a células y/o tejidos normales. Las toxinas usadas en los conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas de planta tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina. Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasas.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polinucleótido o de polipéptido de referencia, respectivamente, se define como el porcentaje de residuos de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de ácido nucleico o de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia de polinucleótido o de polipéptido de referencia, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias. Las sustituciones conservativas no se consideran parte de la identidad de secuencias. Se prefieren alineamientos sin huecos. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.
El término 'anticuerpos madurados' o 'fragmentos de unión a antígeno madurados' tal como variantes de Fab maduradas incluye derivados de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que presenta unión más fuerte - es decir, unión con elevada afinidad - a un antígeno dado tal como el dominio extracelular de FGFR2. La maduración es el procedimiento de identificación de un pequeño número de mutaciones dentro de las seis CDR de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que conduce a este aumento de afinidad. El procedimiento de maduración es la combinación de procedimientos de biología molecular para la introducción de mutaciones en el anticuerpo y cribado para identificar los ligantes mejorados.
Anticuerpos de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para inhibir el crecimiento de células cancerosas positivas para FGFR2 y la progresión de enfermedad neoplásica proporcionando anticuerpos anti-FGFR2. Se proporcionan proteínas de unión, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, y variantes de los anticuerpos y fragmentos que reducen la expresión superficial de FGFR2 después de unirse a FGFR2 en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado. Es otra realización de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unen a una amplia variedad de FGFR2 diferentes que expresan líneas celulares tanto en células que expresan en exceso FGFR2, además de en células que expresan FGFR2 mutado que incluyen, pero no se limitan a, SNU16 (ATCC-CRL-5974) y MFM223 (ECACC-98050130) que expresan en exceso FGFR2 y AN3-CA (DSMZ-ACC 267) y MFE-296 (ECACC-98031101) que expresan FGFR2 mutado.
Con estos objetivos, es una realización de la invención proporcionar anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos aislados, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un epítopo de FGFR2 que está presente en diferentes formas del polipéptido de FGFR2 humano maduro (por ejemplo, véanse la SEC ID N°: 61 para FGFR2 alfa lllb y SEC ID N°: 62 para FGFR2 beta lllb), que se presenta por FGFR2 que expresa líneas de células cancerosas/células cancerosas, y/o que se une por estos anticuerpos con altas afinidades. Como se usa en el presente documento, diferentes 'formas' de FGFR2 incluyen, pero no se limitan a, diferentes isoformas, diferentes variantes de corte y empalme, diferentes glicoformas o polipéptidos de FGFR2 que experimentan diferentes modificaciones traduccionales y postrad uccionales. El polipéptido de FGFR2 se llama 'FGFR2' en el presente documento.
Es otra realización de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos que sean seguros para administración humana.
Es otra realización de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se unan a FGFR2 humano y reaccionen de forma cruzada con FGFR2 de otras especies que incluyen, pero no se limitan a FGFR2 murino, de rata, Macaca mulatta, conejo, cerdo y perro. Preferentemente, dicha otra especie es un roedor, tal como, por ejemplo, ratón o rata. Lo más preferentemente, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, se unen a FGFR2 humano y reaccionan de forma cruzada con FGFR2 murino.
Es otra realización de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que se internalizan eficazmente tras la unión a una célula que expresa FGFR2. Un anticuerpo de la invención podría co-administrarse con medicamentos conocidos, y en algunos casos el anticuerpo podría modificarse por sí mismo. Por ejemplo, un anticuerpo podría conjugarse con un agente citotóxico, inmunotoxina, toxóforo o radioisótopo para aumentar potencialmente adicionalmente la eficacia.
Es otra realización de la invención proporcionar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de los mismos, o variantes de los mismos, que activan FGFR2 a corto plazo y después de la internalización conducen a degradación de FGFR2 produciendo así una desensibilización de diferentes células cancerosas que expresan FGFR2 o células tumorales para estímulo de FGF y finalmente inhiben el crecimiento tumoral in vivo.
Es otra realización de la invención proporcionar anticuerpos que constituyen una herramienta para diagnosticar afecciones malignas o displásicas en las que la expresión de FGFR2 es elevada en comparación con tejido normal o en la que FGFR2 se desprende de la superficie celular y se convierte en detectable en suero. Se proporcionan anticuerpos anti-FGFR2 conjugados con un marcador detectable. Marcadores preferidos son una radiomarca, una enzima, un cromóforo o un agente fluorescente.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que contiene una región de unión a antígeno que se une a FGFR2 expresado en la superficie celular y reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que contiene una región de unión a antígeno que se une específicamente a FGFR2 nativo expresado en la superficie celular y reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado. En una realización, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a FGFR2 nativo expresado en la superficie celular y reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto al menos dos células diferentes que expresan en exceso FGFR2 como al menos dos células diferentes que expresan FGFR2 mutado.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a FGFR2 nativo expresado en la superficie celular y (i) reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado e (ii) induce la fosforilación de FGFR2.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a FGFR2 nativo expresado en la superficie celular y (i) reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado y (ii) induce la fosforilación de FGFR2, desensibilizando el anticuerpo una célula que expresa FGFR2 para estimulación con FGF7. En otra realización, la desensibilización es la desensibilización de una célula que expresa en exceso FGFR2.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a FGFR2 nativo expresado en la superficie celular y (i) reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado y (ii) induce internalización de FGFR2 produciendo degradación de FGFR2.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a FGFR2 nativo expresado en la superficie celular y (i) reduce después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en tanto una célula que expresa en exceso FGFR2 como una célula que expresa FGFR2 mutado y (ii) reduce el crecimiento tumoral en experimentos de tumor de xenoinjerto.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de reducir la expresión de FGFR2 en la superficie celular en diferentes líneas celulares que incluyen, pero no se limitan a, SNU16 (ATCC-CRL-5974) y MFM223 (ECACC-98050130) que expresan en exceso FGFR2 y en líneas celulares AN3-CA (DSMZ-ACC 267) y MFE-296 (ECACC-98031101) que expresan FGFR2 mutado.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de reducir después de unirse a FGFR2 la expresión de FGFR2 en la superficie celular en células SNU16 (ATCC-CRL-5974) y MFM223 (ECACC-98050130) que expresan en exceso FGFR2 y en las líneas celulares AN3-CA (DSMZ-ACC 267) y MFE-296 (ECACC-98031101 ) que expresan FGFR2 mutado.
En una realización preferida, la reducción de la superficie celular es al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o el 30 % en comparación con la expresión de FGFR2 en la superficie celular de la célula no tratada o tratada con control.
En otra realización preferida, la reducción de la superficie celular después de 96 horas es al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o el 30 % en comparación con la expresión de FGFR2 en la superficie celular de la célula no tratada o tratada con control.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al epítopo del extremo N extracelular (1RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 (SEC ID N°: 63). Residuos críticos para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo dentro del epítopo del extremo N (1RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 incluyen, pero no se limitan a, Arg 1 , Pro 2 , Phe 4, Ser 5, Leu 6 y Glu 8.
En otra realización, la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) está mediada por al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Arg 1 , Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 y Glu 8.
En otra realización, la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) se reduce por sustitución de al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Arg 1 , Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 y Glu 8 con el aminoácido alanina.
En otra realización, la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) está mediada por al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Pro 2, Leu 6 y Glu 8.
En otra realización, la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) se reduce por sustitución de al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Pro 2, Leu 6 y Glu 8 con el aminoácido alanina.
En otra realización, la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) está mediada por al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Pro 2, Leu 6 y Glu 8 y la unión al epítopo es invariante a alteraciones de la secuencia de posición 5 del epítopo.
En otra realización, la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) se reduce por sustitución de al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Pro 2, Leu 6 y Glu 8 con el aminoácido alanina y la unión al epítopo es invariante a alteraciones de la secuencia de la posición 5 del epítopo.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo pierde más del 50 % de su señal de ELISA al transformar al menos uno de los residuos de aminoácidos en el epítopo del extremo N (1RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 en una alanina, (i) estando dicho residuo seleccionado del grupo Pro 2, Leu 6 y Glu 8, o (ii) estando dicho residuo seleccionado del grupo Arg 1 , Pro 2, Phe 4 y Ser 5.
En otra realización preferida, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pierden más del 50 % de su señal de ELISA al transformar al menos uno de los residuos de aminoácidos dentro del epítopo del extremo N (1RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 en una alanina, estando dicho residuo seleccionado de los grupos que incluyen, pero no se limitan a, a) Pro 2, Leu 6 y Glu 8 o b) Arg 1 , Pro 2, Phe 4 y Ser 5, como se representa en la Tabla 7.
En otra realización, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno compiten por la unión a FGFR2 con al menos un anticuerpo seleccionado del grupo "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" y "TPP-1 15" En todo este documento se hace referencia a los siguientes anticuerpos preferidos de la invención como se representan en la Tabla 9 y la Tabla 10: "M017-B02", "M021-H02", "M047-D08", "M048-D01", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" y "TPP-1415".
M017-B02 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 3 (ADN)/SEC ID N°: 1 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 4 (ADN)/SEC ID N°: 2 (proteína).
M021-H02 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 13 (ADN)/SEC ID N°: 11 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 14 (ADN)/SEC ID N°: 12 (proteína).
M047-D08 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 23 (ADN)/SEC ID N°: 21 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 24 (ADN)/SEC ID N°: 22 (proteína).
M048-D01 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 33 (ADN)/SEC ID N°: 31 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 34 (ADN)/SEC ID N°: 32 (proteína).
M054-D03 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 43 (ADN)/SEC ID N°: 41 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 44 (ADN)/SEC ID N°: 42 (proteína).
M054-A05 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 53 (ADN)/SEC ID N°: 51 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 54 (ADN)/SEC ID N°: 52 (proteína).
TPP-1397 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 83 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 84 (proteína).
TPP-1398 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 93 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 94 (proteína).
TPP-1399 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 103 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 104 (proteína).
TPP-1400 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 113 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 114 (proteína).
TPP-1401 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 123 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 124 (proteína).
TPP-1402 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 133 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 134 (proteína).
TPP-1403 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 73 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 74 (proteína).
TPP-1406 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 153 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 154 (proteína).
TPP-1407 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 163 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 164 (proteína).
TPP-1408 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 173 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 174 (proteína).
TPP-1409 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 183 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 184 (proteína).
TPP-1410 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 193 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 194 (proteína).
TPP-1411 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 203 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 204 (proteína).
TPP-1412 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 213 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 214 (proteína).
TPP-1415 representa un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada correspondiente a SEC ID N°: 143 (proteína) y una región variable de cadena ligera correspondiente a SEC ID N°: 144 (proteína).
En otra realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno comprenden secuencias de CDR de cadena pesada o ligera que son al menos el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 o el 95 % idénticas a al menos una secuencia de CDR, preferentemente correspondiente, de los anticuerpos "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP- 397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" o "TPP-1415" o al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o el 95 % idéntica a la secuencia de VH o VL de "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" o "TPP-1415", respectivamente.
En otra realización preferida, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención comprende a menos una secuencia de CDR o a menos una secuencia variable de cadena pesada o cadena ligera como se representa en la Tabla 9 y la Tabla 10.
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 5 (H-CDR1), SEC ID N°: 6 (H-CDR2) y SEC ID N°: 7 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 8 (L-CDR1), SEC ID N°: 9 (L-CDR2) y SEC ID N°: 10 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 15 (H-CDR1), SEC ID N°: 16 (H-CDR2) y SEC ID N°: 17 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 18 (L-CDR1), SEC ID N°: 19 (L-CDR2) y SEC ID N°: 20 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 25 (H-CDR1), SEC ID N°: 26 (H-CDR2) y SEC ID N°: 27 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 28 (L-CDR1), SEC ID N°: 29 (L-CDR2) y SEC ID N°: 30 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 35 (H-CDR1), SEC ID N°: 36 (H-CDR2) y SEC ID N°: 37 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 38 (L-CDR1), SEC ID N°: 39 (L-CDR2) y SEC ID N°: 40 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 45 (H-CDR1), SEC ID N°: 46 (H-CDR2) y SEC ID N°: 47 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 48 (L-CDR1), SEC ID N°: 49 (L-CDR2) y SEC ID N°: 50 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 55 (H-CDR1), SEC ID N°: 56 (H-CDR2) y SEC ID N°: 57 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 58 (L-CDR1), SEC ID N°: 59 (L-CDR2) y SEC ID N°: 60 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 75 (H-CDR1), SEC ID N°: 76 (H-CDR2) y SEC ID N°: 77 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 78 (L-CDR1), SEC ID N°: 79 (L-CDR2) y SEC ID N°: 80 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 85 (H-CDR1), SEC ID N°: 86 (H-CDR2) y SEC ID N°: 87 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 88 (L-CDR1), SEC ID N°: 89 (L-CDR2) y SEC ID N°: 90 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 95 (H-CDR1), SEC ID N°: 96 (H-CDR2) y SEC ID N°: 97 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 98 (L-CDR1), SEC ID N°: 99 (L-CDR2) y SEC ID N°: 100 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 105 (H-CDR1), SEC ID N°: 106 (H-CDR2) y SEC ID N°: 107 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 108 (L-CDR1), SEC ID N°: 109 (L-CDR2) y SEC ID N°: 110 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 115 (H-CDR1), SEC ID N°: 116 (H-CDR2) y SEC ID N°: 117 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 118 (L-CDR1), SEC ID N°: 119 (L-CDR2) y SEC ID N°: 120 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 125 (H-CDR1), SEC ID N°: 126 (H-CDR2) y SEC ID N°: 127 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 128 (L-CDR1), SEC ID N°: 129 (L-CDR2) y SEC ID N°: 130 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 135 (H-CDR1), SEC ID N°: 136 (H-CDR2) y SEC ID N°: 137 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 138 (L-CDR1), SEC ID N°: 139 (L-CDR2) y SEC ID N°: 140 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 145 (H-CDR1), SEC ID N°: 146 (H-CDR2) y SEC ID N°: 147 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 148 (L-CDR1), SEC ID N°: 149 (L-CDR2) y SEC ID N°: 150 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 155 (H-CDR1), SEC ID N°: 156 (H-CDR2) y SEC ID N°: 157 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 158 (L-CDR1), SEC ID N°: 159 (L-CDR2) y SEC ID N°: 160 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 165 (H-CDR1), SEC ID N°: 166 (H-CDR2) y SEC ID N°: 167 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 168 (L-CDR1), SEC ID N°: 169 (L-CDR2) y SEC ID N°: 170 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 175 (H-CDR1), SEC ID N°: 176 (H-CDR2) y SEC ID N°: 177 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 178 (L-CDR1), SEC ID N°: 179 (L-CDR2) y SEC ID N°: 180 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 185 (H-CDR1), SEC ID N°: 186 (H-CDR2) y SEC ID N°: 187 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 188 (L-CDR1), SEC ID N°: 189 (L-CDR2) y SEC ID N°: 190 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 195 (H-CDR1), SEC ID N°: 196 (H-CDR2) y SEC ID N°: 197 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 198 (L-CDR1), SEC ID N°: 199 (L-CDR2) y SEC ID N°: 200 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 205 (H-CDR1), SEC ID N°: 206 (H-CDR2) y SEC ID N°: 207 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 208 (L-CDR1), SEC ID N°: 209 (L-CDR2) y SEC ID N°: 210 (L-CDR3).
En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región de unión a antígeno de cadena pesada que comprende SEC ID N°: 215 (H-CDR1), SEC ID N°: 216 (H-CDR2) y SEC ID N°: 217 (H-CDR3) y comprende una región de unión a antígeno de cadena ligera que comprende SEC ID N°: 218 (L-CDR1), SEC ID N°: 219 (L-CDR2) y SEC ID N°: 220 (L-CDR3).
Un anticuerpo de la invención puede ser una IgG (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4), mientras que un fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 o scFv. Un fragmento de anticuerpo inventivo, por consiguiente, puede ser, o puede contener, una región de unión a antígeno que se comporta de una o más formas como se describen en el presente documento.
Por ejemplo, el fragmento Fab de anticuerpo M048-D01 (SEC ID N°: 31 para la cadena VH y SEC ID N°: 32 para cadena VL) se expresó como lgG1 humana M048-D01-hlgG1 (SEC ID N°: 67 para cadena pesada y SEC ID N°: 68 para cadena ligera) y el fragmento Fab M047-D08 (SEC ID N°: 21 para cadena VH y SEC ID N°: 22 para cadena VL) se expresó como lgG1 humana M047-D08-hlgG1 (SEC ID N°: 69 para cadena pesada y SEC ID N°: 70 para cadena ligera). Para la eficaz clonación, los 3 primeros aminoácidos del extremo N de las cadenas pesadas [EVQ] (SEC ID N°: 67 y SEC ID N°: 69) también pueden expresarse alternativamente como [QVE], por ejemplo, como una variante de la cadena pesada de lgG1 humana M048-D01-hlgG1 (SEC ID N°: 222). Para la eficaz clonación, las cadenas ligeras del extremo N pueden extenderse por residuos de aminoácidos, por ejemplo, alanina.
En una realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de la invención son monoclonales. En otra realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno de la invención son humanos, humanizados o quiméricos.
En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que tienen una región de unión a antígeno que se une específicamente a y/o tiene una alta afinidad por FGFR2 independiente de isoformas alfa y beta, además de formas de corte y empalme de lllb y lile (por ejemplo, véase la SEC ID N°: 61 para FGFR2 alfa lllb y la SEC ID N°: 62 para FGFR2 beta lllb). Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se dice que tiene una "alta afinidad" por un antígeno si la medición de afinidad es inferior a 250 nM (afinidad monovalente del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno). Un anticuerpo inventivo o región de unión a antígeno puede unirse preferentemente a FGFR2 humano con una afinidad inferior a 250 nM, preferentemente inferior a 150 nM, determinada como afinidad monovalente por FGFR2 humano. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo de la invención contra FGFR2 de diferentes especies puede ser aproximadamente 100 nM (afinidad monovalente del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno) como se muestra en la Tabla 8 a modo de ejemplo para M048-D1 y M047-D08.
El formato de lgG1 se usó para la determinación de afinidad basada en células por citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). La Tabla 6 proporciona un resumen de la fuerza de unión (CE50) de anticuerpos anti-FGFR2-lgG representativos en líneas de células cancerosas de origen humano (SNU16, MFM223), murino (4T1) y de rata (RUCA).
Se dice que una lgG1 tiene una "alta afinidad" por un antígeno si la medición de afinidad medida por FACS es inferior a 100 nM (afinidad aparente de IgG). Un anticuerpo bivalente inventivo o fragmento de unión a antígeno puede unirse preferentemente a FGFR2 con una afinidad inferior a 100 nM, más preferentemente inferior a 50 nM, y todavía más preferentemente inferior a 10 nM. Adicionalmente se prefieren anticuerpos bivalentes que se unen a FGFR2 con una afinidad inferior a 5 nM, y más preferentemente inferior a 1 nM, determinada como afinidad aparente de una IgG por FGFR2. Por ejemplo, la afinidad aparente de un anticuerpo de la invención contra FGFR2 puede ser aproximadamente 89,5 nM o inferior a 0,1 nM en diferentes líneas celulares tumorales de origen humano, murino y de rata como se ha determinado por análisis de FACS como se representa en la Tabla 6.
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se internaliza "eficazmente" cuando su tiempo de internalización al 50 % (t ½) en células tumorales que expresan FGFR2 es inferior a 180 min o más preferentemente inferior a 120 min y todavía más preferentemente inferior a 90 min. Adicionalmente se prefieren anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno con tiempos de internalización al 50 % (t ½) de 60 minutos o menos como se ha determinado por el protocolo descrito en el Ejemplo 12.
La co-tinción de proteínas G pequeñas puede usarse para una evaluación más detallada de la ruta de tráfico de anticuerpos después de la internalización. Por ejemplo, Rab GTPasas que regulan muchas etapas del tráfico de la membrana, que incluyen formación de vesículas, movimiento de vesículas a lo largo de redes de actina y tubulina, y fusión de membranas, pueden usarse para distinguir entre diferentes rutas. Así, la co-tinción de anticuerpos marcados con Rab7, que se expresa en endosomas y lisosomas tardíos, indica que después de la internalización de FGFR2 el complejo entra en la ruta endosómica - lisosómica, mientras que la co-tinción con Rab11 , que se expresa en endosomas tempranos y de recirculación, indica que estos anticuerpos se internalizan después de unirse a FGFR2 y favorecen la ruta de recirculación. La entrada en la ruta endosómica - lisosómica permite que los anticuerpos induzcan la degradación de FGFR2 después de la internalización que finalmente produce la desensibilización de esta ruta. La Figura 7 muestra los patrones de co-tinción de anticuerpos representativos de la invención con Rab7 y Rabí 1 como se describe en el Ejemplo 12.
Anticuerpos internalizables o fragmentos de unión a antígeno de la invención son adecuados como resto que elige diana de un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es adecuado en un procedimiento in vitro o in vivo para administrar un compuesto, preferentemente un agente citotóxico, a una célula que expresa FGFR2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno de los mismos, o derivado de los mismos, o ácido nucleico que codifica el mismo, se aisla. Un componente biológico aislado (tal como una molécula de ácido nucleico o proteína tal como un anticuerpo) es uno que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en la que el componente se produce naturalmente, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos y extra-cromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados por procedimientos de purificación convencionales como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU.) y Robert K. Scopes y col. 1994 (Protein Purification - Principies and Practice, Springer Science and Business Media LLC). El término también engloba ácidos nucleicos y proteínas preparadas por expresión recombinante en una célula huésped, además de ácidos nucleicos químicamente sintetizados.
Un anticuerpo de la invención puede derivarse de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se basa en secuencias de aminoácidos que han sido aisladas de los anticuerpos de un gran número de voluntarios sanos. Usando la tecnología n-CoDeR®, las CDR completamente humanas se recombinan en nuevas moléculas de anticuerpo. El único procedimiento de recombinación permite que la biblioteca contenga una variedad más amplia de anticuerpos que la que podría haberse creado naturalmente por el sistema inmunitario humano.
Generación de anticuerpos Se usó una biblioteca de expresión en fago de anticuerpos N-CoDeR completamente humanos para aislar anticuerpos monoclonales humanos específicos para FGFR2 de la presente invención por una combinación de inmunopurificación de células completas y proteínas y mediante el desarrollo de procedimientos específicos. Estos procedimientos incluyen el desarrollo de procedimientos de inmunopurificación y ensayos de cribado que pueden identificar anticuerpos que se unen preferencialmente a FGFR2 expresado sobre la superficie celular y que reaccionan de forma cruzada con FGFR2 murino y FGFR2 de otras especies y tienen una actividad de unión y funcional que es independiente de la expresión en exceso de FGFR2 y mutaciones comunes de FGFR2 encontradas en enfermedades relacionadas con FGFR2 tales como cáncer.
Los anticuerpos para FGFR2 de la superficie celular se desarrollaron por una combinación de tres enfoques no convencionales en tecnología de expresión en fago (PDT). Primero, se realizaron selecciones con proteínas de fusión de Fe de FGFR2 recombinantes, solubles, humanos y murinos de varias variantes de corte y empalme (alfa, beta, 11 Ib y lile) para seleccionar una reactividad cruzada de variantes de corte y empalme muy amplia. Segundo, además, se realizaron selecciones de la superficie celular con células KATO III que expresan FGFR2 sobre su superficie celular. Tercero, se desarrollaron procedimientos de cribado que permitieron el cribado sucesivo de las salidas del fago obtenidas en la inmunopurificación en células KATOIII completas y proteínas de fusión de Fe de FGFR1 , FGFR2, FGFR3 y FGFR4 recombinantes, solubles, humanos y murinos de varias variantes de corte y empalme (alfa, beta, II Ib y lile) para seleccionar ligantes específicos para FGFR2 (sin unión a FGFR1 , FGFR3 y FGFR4) con una reactividad cruzada de la variante de corte y empalme muy amplia.
Después de la identificación de fragmentos Fab preferidos, éstos se expresaron como IgG de longitud completa. Por ejemplo, el fragmento Fab de anticuerpo M048-D01 (SEC ID N°: 31 para cadena VH y SEC ID N°: 32 para cadena VL) se expresó como la lgG1 humana M048-D01-hlgG1 (SEC ID N°: 67 para cadena pesada y SEC ID N°: 68 para cadena ligera) y el fragmento Fab M047-D08 (SEC ID N°: 21 para cadena VH y SEC ID N°: 22 para cadena VL) se expresó como lgG1 humana M047-D08-hlgG1 (SEC ID N°: 69 para cadena pesada y SEC ID N°: 70 para cadena ligera). Para la eficaz clonación, los 3 primeros aminoácidos del extremo N de las cadenas pesadas [EVQ] (SEC ID N°: 67 y SEC ID N°: 69) también pueden expresarse alternativamente como [QVE], por ejemplo, como una variante de la cadena pesada de lgG1 humana M048-D01-hlgG1 (SEC ID N°: 222). Para la eficaz clonación, el extremo N de cadenas ligeras puede extenderse por residuos de aminoácidos, por ejemplo, alanina. Estas construcciones se expresaron transitoriamente, por ejemplo, en células de mamífero como se describe en Tom y col., Capítulo 12 en Methods Express: Expression Systems editado por Michael R. Dyson y Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007. Brevemente, un plásmido de expresión basado en el promotor del CMV se transfectó en células HEK293-6E y se incubó en matraces Fernbach o Wave Bags. La expresión fue a 37 °C durante 5 a 6 días en medio F17 (Invitrogen). Se complementaron 5 g/l de triptona TN1 (Organotechnie), 1 % de SBF de IgG ultra-bajo (Invitrogen) y ácido valproico 0,5 mM (Sigma) 24 h después de la transfección.
Estos anticuerpos se caracterizaron adicionalmente por su afinidad de unión en ELISA, y por unión BIAcore a FGFR2 soluble. La unión de FACS con células de diferentes especies se realizó para seleccionar anticuerpos de unión a célula que tenían una alta afinidad en líneas de células de cáncer ratón, rata y humanas.
La combinación de estos procedimientos específicos permitió el aislamiento de los anticuerpos únicos "M017-B02", "M021-H02", "M047-D08", "M048-D01", "M054-A05" y "M054-D03".
La posterior caracterización reveló que los anticuerpos seleccionados se unen a un único epítopo en el extremo N de FGFR2 produciendo sus características especiales. Estos anticuerpos únicos se caracterizaron adicionalmente en ensayos de fosforilación in vitro, ensayos de internalización y experimentos de xenoinjerto de tumor in vivo. Los anticuerpos seleccionados muestran una fuerte y significativa actividad antitumoral en experimentos de xenoinjerto de tumor con células SNU16. Variantes de péptido Los anticuerpos o fragmentos de unión alantígeno de la invención no se limitan a las secuencias de péptidos específicas proporcionadas en el presente documento. Más bien, la invención también integra variantes de realización de estos polipéptidos. Con referencia a la presente divulgación y tecnologías y referencias convencionalmente disponibles, el trabajador experto podrá preparar, probar y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos desvelados en el presente documento, al tiempo que se aprecia que estas variantes que tienen la capacidad para unirse a FGFR2 se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Una variante puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo que tiene al menos un dominio/posición de región determinante de la complementariedad (CDR) modificada (hipervariable) y/o región marco conservada (FR) (variable) con respecto a una secuencia de péptidos desvelada en el presente documento. Para ilustrar mejor este concepto sigue una breve descripción de la estructura de anticuerpos.
Un anticuerpo está compuesto de dos cadenas de péptidos, cada una de las cuales contiene uno (cadena ligera) o tres (cadena pesada) dominios constantes y una región variable (VL, VH), estando la última constituida en cada caso por cuatro regiones FR y tres CDR espaciadas. El sitio de unión a antígeno se forma por una o más CDR, incluso las regiones FR proporcionan la región marco conservada para las CDR y, por tanto, desempeñan una función importante en la unión a antígeno. Modificando uno o más residuos de aminoácidos en una región CDR o FR, el trabajador experto puede generar rutinariamente secuencias de anticuerpos mutadas o diversificadas, que pueden cribarse contra el antígeno, por ejemplo, para propiedades nuevas o mejoradas.
Otra realización preferida de la invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el que las secuencias de VH y VL están seleccionadas como se muestra en la Tabla 9. El trabajador experto puede usar los datos en la Tabla 9 para diseñar variantes de péptidos que están dentro del alcance de la presente invención. Se prefiere construir variantes cambiando aminoácidos dentro de una o más regiones CDR; una variante podría también tener una o más regiones marco conservadas modificadas. Las modificaciones también pueden hacerse en las regiones marco conservadas. Por ejemplo, un dominio FR de péptido podría estar modificado donde haya una desviación en un residuo en comparación con una secuencia de la línea germinal.
Alternativamente, el trabajador experto podría hacer el mismo análisis comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias conocidas de la misma clase de tales anticuerpos usando, por ejemplo, el procedimiento descrito por Knappik A. y col., JMB 2000, 296:57-86.
Además, pueden obtenerse variantes usando un anticuerpo como punto de partida para la optimización diversificando uno o más residuos de aminoácidos en el anticuerpo, preferentemente residuos de aminoácidos en una o más CDR, y cribando la colección resultante de variantes de anticuerpo para variantes con propiedades mejoradas. Particularmente se prefiere la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en CDR3 de VL y/o VH. La diversificación puede hacerse sintetizando una colección de moléculas de ADN usando tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) (Virnekás B. y col., Nucí. Acids Res. 1994, 22: 5600). Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos incluyen moléculas con modificaciones/variaciones que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, modificaciones que conducen a semivida alterada (por ejemplo, modificación de la parte Fe o unión de moléculas adicionales tales como PEG), afinidad de unión modificada o actividad de ADCC o CDC modificada.
Ejemplos de variantes de anticuerpos se facilitan para M048-D01 (TPP-1397, TPP-1398, TPP-1399, TPP-1400, TPP-1401 , TPP-1402 y TPP-1403) y M047-D08 (TPP-1406, TPP-1407, TPP-1408, TPP-1409, TPP-1410, TPP-1411 , TPP-1412 y TPP-1415) como se representa en la Tabla 10. Las propiedades mejoradas de estos anticuerpos de variante se muestran en la Tabla 11.
Variantes de aminoácidos conservativas Pueden prepararse variantes de polipéptidos que conserven la estructura molecular global de una secuencia de péptidos de anticuerpo descrita en el presente documento. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales, algunas sustituciones racionales se reconocerán por el trabajador experto. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, "sustituciones conservativas", pueden hacerse, por ejemplo, basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados.
Por ejemplo, (a) aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; (b) aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; (c) aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y (d) aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones pueden hacerse normalmente dentro de los grupos (a)-(d). Además, glicina y prolina pueden sustituirse entre sí basándose en su capacidad para alterar hélices a. Similarmente, ciertos aminoácidos, tales como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutámico, glutamina, histidina y lisina, se encuentran más comúnmente en hélices a, mientras que la valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano y treonina se encuentran más comúnmente en hojas plegadas ß. La glicina, serina, ácido aspártico, asparagina y prolina se encuentran comúnmente uno tras otro. Algunas sustituciones preferidas pueden hacerse entre los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; y (¡ii) A, V, L y I. Dado el código genético conocido, y técnicas de ADN recombinante y sintético, el científico experto puede construir fácilmente ADN que codifique las variantes de aminoácidos conservativas.
Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencias" entre dos secuencias de polipéptidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. "Homología de secuencias" indica el porcentaje de aminoácidos que o bien es idéntico o bien representa sustituciones de aminoácidos conservativas.
Moléculas de ADN de la invención La presente invención también se refiere a moléculas de ADN que codifican un anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo. Estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellas moléculas de ADN expuestas en SEC ID 3, 4, 13, 14, 23, 24, 33, 34, 43, 44, 53 y 54.
Las moléculas de ADN de la invención no se limitan a las secuencias desveladas en el presente documento, sino que también incluyen variantes de las mismas. Las variantes de ADN dentro de la invención pueden describirse por referencia a sus propiedades físicas en la hibridación. El trabajador experto reconocerá que el ADN puede usarse para identificar su complemento y, ya que el ADN es bicatenario, su equivalente u homólogo, usando técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. También se reconocerá que la hibridación puede producirse con menos del 100 % de complementariedad. Sin embargo, dada la elección de condiciones apropiadas, pueden usarse técnicas de hibridación para diferenciar entre secuencias de ADN basadas en su vinculación estructural a una sonda particular. Para orientación referente a tales condiciones véase Sambrook y col., 1989, arriba, y Ausubel y col., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).
La similitud estructural entre dos secuencias de polinucleótidos puede expresarse en función de la "rigurosidad" de las condiciones bajo las que las dos secuencias se hibridarán entre sí. Como se usa en el presente documento, el término "rigurosidad" se refiere al grado al que las condiciones desfavorecen la hibridación. Condiciones rigurosas desfavorecen fuertemente la hibridación, y solo las moléculas más estructuralmente relacionadas se hibridarán entre sí bajo tales condiciones. En cambio, condiciones no rigurosas favorecen la hibridación de moléculas que expresan un menor grado de parentesco estructural. Por tanto, la rigurosidad de la hibridación se correlaciona directamente con las relaciones estructurales de dos secuencias de ácidos nucleicos. Las siguientes relaciones son útiles en correlacionar la hibridación y parentesco (si Tm es la temperatura de fusión de un dúplex de ácido nucleico): a. Tm = 69,3 + 0,41 (G+C) % b. La Tm de un ADN de dúplex disminuye 1 °C con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases incorrectamente emparejadas, c (Tm)M2 - (Tm) µ? = 18,5 log10M2/p1 en la que µ1 y µ2 son las fuerzas iónicas de dos disoluciones.
La rigurosidad de hibridación es una función de muchos factores, que incluyen concentración de ADN global, fuerza iónica, temperatura, tamaño de la sonda y la presencia de agentes que alteran el enlace de hidrógeno. Los factores que promueven la hibridación incluyen altas concentraciones de ADN, altas fuerzas iónicas, bajas temperaturas, tamaño de sonda más largo y la ausencia de agentes que alteran el enlace de hidrógeno. La hibridación normalmente se realiza en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".
Variantes funcionalmente equivalentes Todavía otra clase de variantes de ADN dentro del alcance de la invención puede describirse con referencia al producto que codifican. Estos polinucleótidos funcionalmente equivalentes se caracterizan por el hecho de que codifican las mismas secuencias de péptidos encontradas en SEC ID N°: 1 , 2, 5-12, 15-22, 25-32, 35-42, 45-52, 55-60 debido a la degeneración del código genético.
Se sabe que las variantes de moléculas de ADN proporcionadas en el presente documento pueden construirse de varias formas diferentes. Por ejemplo, pueden construirse como ADN completamente sintéticos. Los procedimientos de sintetizar eficazmente oligonucleótidos en el intervalo de 20 a aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente disponibles. Véase Ausubel y col., Sección 2.11 , suplemento 21 (1993). Pueden sintetizarse oligonucleótidos solapantes y ensamblarse en un modo informado por primera vez por Khorana y col., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); véase también Ausubel y col., arriba, Sección 8.2. Se diseñan preferentemente ADN sintéticos con sitios de restricción convenientes manipulados en los extremos 5' y 3' del gen para facilitar la clonación en un vector apropiado.
Como se indica, un procedimiento de generación de variantes es empezar con uno de los ADN desvelados en el presente documento y luego realizar mutagénesis dirigida específica de sitio. Véase Ausubel y col., arriba, capítulo 8, suplemento 37 (1997). En un procedimiento típico, un ADN diana se clona en un vehículo de bacteriófago de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se aisla y se híbrida con un oligonucleótido que contiene la(s) alteración (alteraciones) de nucleótidos. La hebra complementaria se sintetiza y el fago bicatenario se introduce en un huésped. Algo de la progenie resultante contendrá el muíante deseado, que puede confirmarse usando secuenciación de ADN. Además, están disponibles diversos procedimientos que aumentan la probabilidad de que el fago de la progenie sea el mutante deseado. Estos procedimientos son muy conocidos para aquellos en el campo y están comercialmente disponibles kits para generar tales mutantes.
Construcciones de ADN recombinante y expresión La presente invención proporciona además construcciones de ADN recombinante que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la presente invención se usan a propósito de un vector, tal como un plásmido, fagémido, fago o vector viral, en el que se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo de la invención o fragmento de unión al antígeno del mismo.
Un anticuerpo, porción de unión a antígeno o derivado del mismo proporcionado en el presente documento puede prepararse por expresión recombinante de secuencias de ácidos nucleicos que codifican cadenas ligeras y pesadas o porciones de las mismas en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo, porción de unión a antígeno o derivado del mismo recombinantemente, una célula huésped puede transfectarse con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y/o pesadas o porciones de las mismas de forma que las cadenas ligeras y pesadas se expresen en la célula huésped. Se usan metodologías de ADN recombinante convencionales para preparar y/u obtener ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y ligeras, incorporar estos ácidos nucleicos en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células huésped, tales como aquellos descritos en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. y col. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1989) y en la patente de EE.UU. n° 4.816.397 por Boss y col.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de las cadenas pesadas y/o ligeras pueden convertirse, por ejemplo, en secuencias de ácidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab, o en scFv. El fragmento de ADN que codifica VL o VH puede estar operativamente ligado (de forma que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN estén en fase) a otro fragmento de ADN que codifica, por ejemplo, una región constante del anticuerpo o un ligador flexible. Las secuencias de regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera humanas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento Estadounidense de Salud y Servicios Humanos, publicación NIH n° 91-3242) y fragmentos de ADN que engloban estas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR convencional.
En ciertos ensayos se prefiere una expresión de los anticuerpos de la presente invención como IgG murina, por ejemplo, la inmunohistoquímica con muestras humanas puede analizarse más fácilmente usando anticuerpos murinos. Por tanto, por ejemplo, el fragmento Fab de anticuerpo M048-D01 (SEC ID N°: 31 para cadena VH y SEC ID N°: 32 para cadena VL) se expresó como lgG2a murina llamada M048-D01-mlgG2a (SEC ID N°: 221 para la cadena pesada). Este anticuerpo también se usó en el Ejemplo 17 como control.
Para crear una secuencia de polinucleótidos que codifica un scFv, los ácidos nucleicos que codifican VH y VL pueden ligarse operativamente a otro fragmento que codifica un ligador flexible de forma que las secuencias de VH y VL puedan expresarse como proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el ligador flexible (véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; Huston y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y col., Nature (1990) 348:552-554).
Para expresar anticuerpos, porciones de unión a antígeno o derivados de los mismos pueden usarse procedimientos de expresión de ADN recombinante convencionales (véase, por ejemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Por ejemplo, el ADN que codifica el polipéptido deseado puede insertarse en un vector de expresión que luego se transfecta en una célula huésped adecuada. Células huésped adecuadas son células procariotas y eucariotas. Ejemplos de células huésped procariotas son, por ejemplo, bacterias, ejemplos de células huésped eucariotas son células de levadura, insecto o mamífero. En algunas realizaciones, los ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras se insertan en vectores separados. En otras realizaciones, el ADN que codifica las cadenas pesadas y ligeras se inserta en el mismo vector. Se entiende que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras, está afectado por factores tales como la elección de la célula huésped, el nivel de expresión de la proteína deseada y si la expresión es constitutiva o inducible.
Expresión bacteriana Vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de iniciación y terminación de la traducción adecuadas en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores de selección fenotípicos y un origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y, si es deseable, para proporcionar amplificación dentro del huésped. Huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
Los vectores bacterianos pueden basarse, por ejemplo, en bacteriófagos, plásmidos o fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador de selección y origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles que normalmente contienen elementos del muy conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tras la transformación de una cepa huésped adecuada y crecimiento de la cepa huésped a una densidad de células apropiada, el promotor seleccionado se desrreprime/induce por medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se recogen normalmente por centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante se retiene para más purificación.
En sistemas bacterianos, varios vectores de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso previsto para la proteína que se expresa. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de una proteína tal, para la generación de anticuerpos o para cribar bibliotecas de péptidos pueden ser deseables, por ejemplo, vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente.
Por tanto, una realización de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los novedosos anticuerpos de la presente invención. Véase el Ejemplo 2 para una descripción a modo de ejemplo.
Los anticuerpos de la presente invención o fragmento de unión a antígeno de los mismos incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes de un huésped procariota que incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, preferentemente de células de E. coli.
Expresión en mamífero y purificación Secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV) (tales como un promotor/potenciador del CMV), virus 40 simio (SV40) (tal como el promotor/potenciador del SV40), adenovirus (por ejemplo, un promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para más descripción de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, véanse, por ejemplo, el documento U.S. 5.168.062 por Stinski, el documento U.S. 4.510.245 por Bell y col. y el documento U.S. 4.968.615 por Schaffner y col. Los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores de selección (véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 4.399.216, 4.634.665 y U.S. 5.179.017, por Axel y col.). Marcadores de selección adecuados incluyen genes que confieren resistencia a fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Por ejemplo, el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia a metotrexato y el gen neo confiere resistencia a G418. Para la eficaz clonación, los 3 primeros aminoácidos del extremo N de las cadenas pesadas [EVQ] (SEC ID N°: 67 y SEC ID N°: 69) también pueden expresarse alternativamente como [QVE], por ejemplo, como una variante de la cadena pesada de lgG1 humana M048-D01-hlgG1 (SEC ID N°: 222). Para la eficaz clonación, el extremo N de las cadenas ligeras puede extenderse por residuos de aminoácidos, por ejemplo, alanina.
La transfección del vector de expresión en una célula huésped puede llevarse a cabo usando técnicas convencionales tales como electroporación, precipitación con fosfato de calcio y transfección con DEAE-dextrano.
Células huésped de mamífero adecuadas para expresar los anticuerpos, porciones de unión al antígeno, o derivados de los mismos, proporcionados en el presente documento incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) [que incluyen células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]], células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En algunas realizaciones, el vector de expresión se diseña de forma que la proteína expresada sea secretada en el medio de cultivo en el que las células huésped se cultivan. Los anticuerpos, porciones de unión al antígeno, o derivados de los mismos, pueden recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos de purificación de proteínas convencionales.
Los anticuerpos de la invención o un fragmento de unión al antígeno de los mismos pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por procedimientos muy conocidos que incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía en proteína A, cromatografía en proteína G, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfo-celulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina. La cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") también puede emplearse para la purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por ejemplo, Capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, cada uno incorporado enteramente en el presente documento por referencia.
Los anticuerpos de la presente invención o fragmento de unión a antígeno de los mismos incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota que incluye, por ejemplo, células de levadura, plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede glicosilarse o puede estar no glicosilado. Tales procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, arriba, Secciones 17.37-17.42; Ausubel, arriba, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.
Por tanto, una realización de la presente invención también son células huésped que comprenden el vector o una molécula de ácido nucleico, por lo que la célula huésped puede ser una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, una célula huésped eucariota inferior, tal como una célula de levadura, y puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento de uso de la célula huésped para producir un anticuerpo y fragmentos de unión al antígeno, que comprende cultivar la célula huésped bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo.
Por tanto, otra realización de la presente invención es la producción de los anticuerpos según la presente invención (por ejemplo, anticuerpo M048-D01-hlgG1) con las células huésped de la presente invención y purificación de estos anticuerpos a al menos el 95 % de homogeneidad en peso.
Procedimientos terapéuticos Los procedimientos terapéuticos implican administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo contemplado por la invención. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" por este documento se define como la cantidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es la cantidad suficiente para disminuir células positivas para FGFR2 en un área tratada de un sujeto - tanto como una dosis única como según una pauta de dosis múltiples, sola o en combinación con otros agentes, que conduce al alivio de una afección adversa, todavía cuya cantidad es toxicológicamente tolerable. El sujeto puede ser un animal humano o no humano (por ejemplo, conejo, rata, ratón, perro, mono u otro primate de orden inferior).
Un anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo podría co-administrarse con medicamentos conocidos, y en algunos casos el anticuerpo podría modificarse por sí mismo. Por ejemplo, un anticuerpo podría conjugarse con un agente citotóxico o radioisótopo para aumentar potencialmente adicionalmente la eficacia.
Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse como el único agente farmacéutico o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales en los que la combinación produce efectos adversos aceptables. Esta terapia de combinación incluye administración de una única formulación de dosificación farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales, además de administración de un anticuerpo de la invención y cada agente terapéutico adicional en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención y un agente terapéutico pueden administrarse al paciente juntos en Una única composición de dosificación oral tal como un comprimido o cápsula, o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación separadas.
Si se usan formulaciones de dosificación separadas, un anticuerpo de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse esencialmente al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) o en tiempos escalonados por separado (por ejemplo, secuencialmente).
En particular, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en combinación fija o separada con otros agentes antitumorales tales como agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes antitumorales derivados de plantas, agentes de terapia hormonal, inhibidores de la topoisomerasa, derivados de camptotecina, inhibidores de cinasas, fármacos dirigidos, anticuerpos, interferones y/o modificadores de la respuesta biológica, compuestos antiangiógenos, y otros fármacos antitumorales. A este respecto, lo siguiente es una lista no limitante de los ejemplos de agentes secundarios que pueden usarse en combinación con los anticuerpos de la presente invención: Agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, N-óxido de mostaza de nitrógeno, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida, altretamina, apazicuona, brostalicina, bendamustina, carmustina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, mafosfamida, bendamustina y mitolactol; compuestos alquilantes coordinados con platino incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, carboplatino, eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, oxaliplatino y satraplatino; Antimetabolitos incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, 6-mercaptopurina ribósido, mercaptopurina, 5-fluorouracilo solo o en combinación con leucovorina, tegafur, doxifluridina, carmofur, citarabina, ocfosfato de citarabina, enocitabina, gemcitabina, fludarabina, 5-azacitidina, capecitabina, cladribina, clofarabina, decitabina, eflornitina, etinilcitidina, citosina arabinósido, hidroxiurea, melfalan, nelarabina, nolatrexed, ocfosfito, premetrexed de disodio, pentostatina, pelitrexol, raltitrexed, triapina, trimetrexato, vidarabina, vincristina y vinorelbina; Agentes de terapia hormonal incluyen, pero no se limitan a, exemestano, lupron, anastrozol, doxercalciferol, fadrozol, formestano, inhibidores de la 11-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 1 , inhibidores de la 17-alfa-hidroxilasa/17,20-liasa tales como acetato de abiraterona, inhibidores de la 5-alfa-reductasa tales como finasterida y epristerida, antiestrógenos tales como citrato de tamoxifeno y fulvestrant, trelstar, toremifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, letrozol, antiandrógenos tales como bicalutamida, flutamida, mifepristona, nilutamida, casodex, y antiprogesteronas y combinaciones de los mismos; Sustancias antitumorales derivadas de plantas incluyen, por ejemplo, aquellas seleccionadas de inhibidores mitóticos, por ejemplo, epotilonas tales como sagopilona, ixabepilona y epotilona B, vinblastina, vinflunina, docetaxel y paclitaxel; Agentes inhibidores de la topoisomerasa citotóxica incluyen, pero no se limitan a, aclarubicina, doxorubicina, amonafida, belotecan, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, diflomotecan, irinotecan, topotecan, edotecarina, epimbicina, etopósido, exatecan, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrona, pirambicina, pixantrona, rubitecan, sobuzoxano, taflupósido y combinaciones de los mismos; Agentes inmunológicos incluyen interferones tales como interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-1a e interferón gamma-n1 , y otros agentes inmunopotenciadores tales como L19-IL2 y otros derivados de IL2, filgrastim, lentinan, sizofilan, TheraCys, ubenimex, aldesleucina, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazina, daclizumab, denileucina, gemtuzumab, ozogamicina, ibritumomab, imiquimod, lenograstim, lentinan, vacuna para el melanoma (Corixa), molgramostim, sargramostim, tasonermina, tecleucina, timalfasina, tositumomab, Vimizin, epratuzumab, mitumomab, oregovomab, pemtumomab y Provenge; Los modificadores de la respuesta biológica son agentes que modifican los mecanismos de defensa de organismos vivos o respuestas biológicas tales como supervivencia, crecimiento o diferenciación de células de tejido para dirigirlas a que tengan actividad antitumoral; tales agentes incluyen, por ejemplo, Krestin, lentinan, sizofiran, picibanilo, ProMune y ubenimex; Los compuestos antiangiógenos incluyen, pero no se limitan a, acitretina, aflibercept, angiostatina, aplidina, asentar, axitinib, bevacizumab, alaninato de brivanib, cilengitida, combretastatina, endostatina, fenretinida, halofuginona, pazopanib, ranibizumab, rebimastat, recentína, regorafenib, removab, revlimida, sorafenib, escualamina, sunitinib, telatinib, talidomida, ucraína, vatalanib y vitaxina; Anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, rituximab, ticilimumab, ipilimumab, lumiliximab, catumaxomab, atacicept, oregovomab y alemtuzumab; Inhibidores del VEGF tales como, por ejemplo, sorafenib, regorafenib, bevacizumab, sunitinib, recentína, axitinib, aflibercept, telatinib, alaninato de brivanib, vatalanib, pazopanib y ranibizumab; Inhibidores del EGFR (HER1) tales como, por ejemplo, cetuximab, panitumumab, vectibix, gefitinib, erlotinib y Zactima; Inhibidores del HER2 tales como, por ejemplo, lapatinib, tratuzumab y pertuzumab; Inhibidores de mTOR tales como, por ejemplo, temsirolimus, sirolimus/rapamicina y everolimus; Inhibidores de c-Met; Inhibidores de PI3K y AKT; Inhibidores de CDK tales como roscovitina y flavopiridol; Inhibidores de los puntos de control del ensamblaje del huso y agentes antimitóticos dirigidos tales como inhibidores de PLK, inhibidores de Aurora (por ejemplo, hesperadina), inhibidores de cinasas de los puntos de control e inhibidores de KSP; Inhibidores de HDAC tales como, por ejemplo, panobinostat, vorinostat, MS275, belinostat y LBH589; Inhibidores de HSP90 y HSP70; Inhibidores del proteasoma tales como bortezomib y carfilzomib; Inhibidores de serina/treonina cinasas que incluyen inhibidores de MEK e inhibidores de Raf tales como sorafenib; Inhibidores de farnesil transferasa tales como, por ejemplo, tipifarnib; Inhibidores de tirosina cinasas que incluyen, por ejemplo, dasatinib, nilotibib, regorafenib, bosutinib, sorafenib, bevacizumab, sunitinib, cediranib, axitinib, aflibercept, telatinib, imatinib mesilato, alaninato de brivanib, pazopanib, ranibizumab, vatalanib, cetuximab, panitumumab, vectlbix, gefitinib, erlotinib, lapatinib, tratuzumab, pertuzumab, e inhibidores de c-Kit; Agonistas de receptores de la vitamina D; Inhibidores de la proteína Bcl-2 tales como obatoclax, oblimersen sodio y gosipol; Agrupación de antagonistas del receptor de diferenciación 20 tales como, por ejemplo, rituximab; Inhibidores de ribonucleótido reductasa tales como, por ejemplo, gemcitabina; Agonistas de receptores del ligando 1 inductor de apoptosis por necrosis tumoral tales como, por ejemplo, mapatumumab; Antagonistas de receptores de 5-hidroxitriptamina tales como, por ejemplo, rEV598, xaliproda, clorhidrato de palonosetron, granisetron, zindol y AB-1001; Inhibidores de la integrina que incluyen inhibidores de la alfa5-beta1 integrina tales como, por ejemplo, E7820, JSM 6425, voloclximab y endostatina; Antagonistas de receptores de andrógenos que incluyen, por ejemplo, decanoato de nandrolona, fluoximesterona, Android, Prost-aid, andromustina, bicalutamida, flutamida, apo-ciproterona, apo-flutamida, acetato de clormadinona, Androcur, Tabi, acetato de ciproterona y nilutamida; Inhibidores de la aromatasa tales como, por ejemplo, anastrozol, letrozol, testolactona, exemestano, aminoglutetimida y formestano; Inhibidores de metaloproteinasas de la matriz; Otros agentes antineoplásicos que incluyen, por ejemplo, alitretinoína, ampligen, atrasentan bexaroteno, bortezomib, bosentan, calcitriol, exisulind, fotemustina, ácido ibandrónico, miltefosina, mitoxantrona, l-asparaginasa, procarbazina, dacarbazina, hidroxicarbamida, pegaspargasa, pentostatina, tazaroteno, velcade, nitrato de galio, canfosfamida, darinaparsina y tretinoína.
En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en combinación con quimioterapia (es decir, agentes citotóxicos), antihormonas y/o terapias dirigidas tales como otros inhibidores de cinasas (por ejemplo, inhibidores de EGFR), inhibidores de mTOR e inhibidores de la angiogénesis.
Los compuestos de la presente invención también pueden emplearse en el tratamiento contra el cáncer conjuntamente con radioterapia y/o intervención quirúrgica.
Un anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo podría modificarse en algunos casos por sí mismo. Por ejemplo, un anticuerpo podría conjugarse con cualquiera de, pero no se limita a, los compuestos mencionados anteriormente o cualquier radioisótopo para aumentar potencialmente adicionalmente la eficacia. Además, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse, como tales o en composiciones, en investigación y diagnósticos, o como patrones de referencia analítica, y similares, que son muy conocidos en la técnica.
Los anticuerpos inventivos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden usarse como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una variedad de situaciones con señalización de FGFR2 anómala, por ejemplo, trastornos proliferativos celulares tales como cáncer o enfermedades fibróticas. Los trastornos y afecciones particularmente adecuados para el tratamiento con un anticuerpo de la invención son tumores sólidos tales como cánceres de mama, vías respiratorias, cerebro, órganos reproductores, tubo digestivo, vías urinarias, ojo, hígado, piel, cabeza y cuello, tiroides, paratiroides, y sus metástasis distantes. Aquellos trastornos también incluyen linfomas, sarcomas y leucemias.
Los tumores del tubo digestivo incluyen, pero no se limitan a, cánceres anal, de colon, colorrectal, esofágico, de la vesícula biliar, gástrico, pancreático, rectal, del intestino delgado y de la glándula salival.
Ejemplos de cáncer de esófago incluyen, pero no se limitan a, carcinomas y adenocarcinomas de células del esófago, además de carcinomas de células escamosas, leiomiosarcoma, melanoma maligno, rabdomiosarcoma y linfoma.
Ejemplos de cáncer gástrico incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma gástrico tipo intestinal y tipo difuso.
Ejemplos de cáncer pancreático incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma ductal, carcinomas adenoescamosos y tumores endocrinos pancreáticos.
Ejemplos de cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama triple negativo, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ y carcinoma lobular in situ.
Ejemplos de cánceres de las vías respiratorias incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de pulmón de células pequeñas y de células no pequeñas, además de adenoma bronquial y blastema pleuropulmonar.
Ejemplos de cánceres cerebrales incluyen, pero no se limitan a, glioma del tronco encefálico e hipotalámico, astrocitoma cerebeloso y cerebral, glioblastoma, meduloblastoma, ependimoma, además de tumor neuroectodérmico y pineal.
Tumores de los órganos reproductores masculinos incluyen, pero no se limitan a, cáncer de próstata y testicular. Los tumores de los órganos reproductores femeninos incluyen, pero no se limitan a, cáncer de endometrio, cervical, de ovario, vaginal y vulvar, además de sarcoma del útero.
Ejemplos de cáncer de ovario incluyen, pero no se limitan a, tumor seroso, tumor endometrioide, cistadenocarcinoma mucinoso, tumor de células de la granulosa, tumor de célula de Sertoli-Leydig y arrenoblastoma.
Ejemplos de cáncer de cuello uterino incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células pequeñas, tumor neuroendocrino, carcinoma de células vidriosas y adenocarcinoma villoglandular.
Tumores de las vías urinarias incluyen, pero no se limitan a, cánceres de vejiga, pene, riñon, pelvis renal, uréter, uretra y renal hereditario y papilar esporádico.
Ejemplos de cáncer de riñon incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células renales, carcinoma de células uroteliales, tumor de células yuxtaglomerulares (reninoma), angiomiolipoma, oncocitoma renal, carcinoma de conductos de Bellini, sarcoma del riñon de célula claras, nefroma mesoblástico y tumor de Wilms.
Ejemplos de cáncer de vejiga incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células transitorias, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, sarcoma y carcinoma de células pequeñas.
Cánceres de ojo incluyen, pero no se limitan a, melanoma intraocular y retinoblastoma.
Ejemplos de cánceres de hígado incluyen, pero no se limitan a, carcinoma hepatocelular (carcinomas de células del hígado con o sin variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma de los conductos biliares intrahepáticos) y colangiocarcinoma hepatocelular mixto.
Cánceres de la piel incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer de piel de células de Merkel y cáncer de piel no melanoma.
Cánceres de cabeza y cuello incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas de la cabeza y el cuello, cáncer de laringe, hipofaringe, nasofaringe, orofaringe, labio y cavidad bucal, y cáncer de células escamosas.
Linfomas incluyen, pero no se limitan a, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkin, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin y linfoma del sistema nervioso central.
Sarcomas incluyen, pero no se limitan a, sarcoma de tejido blando, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma y rabdomiosarcoma.
Leucemias incluyen, pero no se limitan a, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia de células pilosas. En una realización preferida, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención son adecuados para un procedimiento terapéutico o de diagnóstico para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad de cáncer comprendida en un grupo constituido por cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, melanoma y cáncer de vejiga. Además, los anticuerpos inventivos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos también pueden usarse como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una variedad de otros trastornos en los que FGFR2 participa tales como, pero no se limitan a, enfermedades fibróticas tales como fibrosis intraalveolar, fibrosis pulmonar inducida por sílice, fibrosis pulmonar experimental, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis renal, además de linfangioleiomiomatosis, síndrome del ovario poliquístico, acné, psoriasis, colesteatoma, otitis media crónica colesteatomatosa, periodontitis, lentigos solares, enfermedad intestinal, aterosclerosis o endometriosis.
Los trastornos anteriormente mencionados se han caracterizado bien en seres humanos, pero también existen con una etiología similar en otros animales, que incluyen mamíferos, y pueden tratarse administrando composiciones farmacéuticas de la presente invención.
Para tratar cualquiera de los anteriores trastornos, las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención pueden formularse de un modo convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Un anticuerpo de la invención o fragmento de unión al antígeno del mismo puede administrarse por cualquier medio adecuado, que puede variar, dependiendo del tipo de trastorno que esté tratándose. Posibles vías de administración incluyen parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea), intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención podría administrarse por infusión en el pulso con, por ejemplo, dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, lo más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. La cantidad a administrar dependerá de una variedad de factores tales como los síntomas clínicos, peso del individuo, si se administran o no otros fármacos. El experto reconocerá que la vía de administración variará dependiendo del trastorno o afección que va a tratarse.
Determinar una cantidad terapéuticamente eficaz del novedoso polipéptido, según la presente invención, dependerá en gran parte de las características del paciente particular, vía de administración y la naturaleza del trastorno que está tratándose. Orientación general puede encontrarse, por ejemplo, en las publicaciones de la Conferencia Internacional sobre Armonización y en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 y 28, pág. 484-528 (18a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, determinar una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de factores tales como toxicidad y eficacia del medicamento. La toxicidad puede determinarse usando procedimientos muy conocidos en la técnica y encontrados en las anteriores referencias. La eficacia puede determinarse utilizando la misma orientación conjuntamente con los procedimientos descritos más adelante en los ejemplos.
Procedimientos de diagnóstico Los anticuerpos para FGFR2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden usarse para detectar la presencia de tumores que expresan FGFR2. La presencia de células que contienen FGFR2 o repelen FGFR2 dentro de diversas muestras biológicas, que incluyen suero, y especímenes de biopsia de tejido, puede detectarse con anticuerpos para FGFR2. Además, pueden usarse anticuerpos para FGFR2 en diversas metodologías de obtención de imágenes tales como inmunogammagrafía con un anticuerpo conjugado con 99Tc (u otro isótopo). Por ejemplo, un protocolo de obtención de imágenes similar al recientemente descrito usando un anticuerpo anti-PSMA conjugado con 111ln puede usarse para detectar carcinomas pancreáticos o de ovario (Sodee y col., Clin. Nuc. Med. 21 : 759-766, 1997). Otro procedimiento de detección que puede usarse es la tomografía por emisión de positrones conjugando los anticuerpos de la invención con un isótopo adecuado (véase Herzog y col., J. Nucí. Med. 34:2222-2226, 1993).
Composiciones farmacéuticas y administración Una realización de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos para FGFR2 o fragmento de unión a antígeno de los mismos, solos o en combinación con al menos otro agente, tal como compuesto estabilizador, que puede administrarse en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, que incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Otra realización son composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de unión a FGFR2 o fragmento de unión a antígeno del mismo y otro compuesto farmacéuticamente activo que es adecuado para tratar enfermedades relacionadas con FGFR2 tales como cáncer. Cualquiera de estas moléculas puede administrarse a un paciente sola o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas, en composiciones farmacéuticas en las que se mezcla con excipiente(s) o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es farmacéuticamente inerte.
La presente invención también se refiere a la administración de composiciones farmacéuticas. Tal administración se lleva a cabo por vía oral o parenteralmente. Los procedimientos de administración parenteral incluyen administración tópica, intraarterial (directamente al tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Más detalles sobre técnicas para la formulación y administración pueden encontrarse en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).
Las composiciones farmacéuticas para administración por vía oral pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables muy conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para administración por vía oral. Tales vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas como comprimidos, pildoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones finas, suspensiones y similares, para ingestión por el paciente.
Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse mediante combinación de compuestos activos con excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Excipientes adecuados son cargas de hidratos de carbonos o de proteína tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas que incluyen arábiga y tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.
Se proporcionan núcleos de grageas con recubrimientos adecuados tales como disoluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Tintas o pigmentos pueden añadirse a los comprimidos o recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar para la identificación de productos o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, además de cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un recubrimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con una carga o aglutinantes tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.
Formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de compuestos activos. Para inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en disoluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o solución salina fisiológicamente tamponada.
Suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.
Para administración tópica o nasal, penetrantes apropiados a la barrera particular que va a permearse se usan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Kits La invención se refiere además a envases y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos de uno o más de los componentes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención. Asociado a tal(es) recipiente(s) puede estar un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, que refleja la autorización por la agencia de la fabricación, uso o venta del producto para administración humana.
En otra realización, los kits pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Preferentemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se proporcionan en un plásmido adecuado para transfección en y expresión por una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (frecuentemente un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido también puede contener sitios de restricción apropiados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido para producir diversos anticuerpos. Los plásmidos también pueden contener numerosos otros elementos para facilitar la clonación y expresión de las proteínas codificadas. Tales elementos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, marcadores de selección, codones de iniciación, codones de terminación, y similares.
Fabricación y almacenamiento Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de un modo que se conoce en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de comprimidos recubiertos de azúcar, trituración, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal y puede formarse con ácidos, que incluyen, pero no se limitan a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros protónicos que son las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, 0,1 %-2 % de sacarosa, 2 %-7 % de manitol en un intervalo de pH de 4,5 a 5,5 que se combina con tampón antes de uso.
Después de haberse preparado las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo aceptable, pueden colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada. Para la administración de anticuerpos para FGFR2 o fragmento de unión a antígeno de los mismos, tal etiquetado incluiría cantidad, frecuencia y procedimiento de administración.
Dosis terapéuticamente eficaz Composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin previsto, es decir, tratamiento de un estado de enfermedad particular caracterizado por expresión de FGFR2. La determinación de una dosis eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de aquellos expertos en la materia.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse ¡nicialmente tanto en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, células neoplásicas, como en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros, cerdos o monos. El modelo animal también se usa para lograr un intervalo de concentración y vía de administración deseable. Tal información pueden entonces usarse para determinar dosis y vías útiles para administración en seres humanos.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que mejora los síntomas o afección. La eficacia terapéutica y toxicidad de tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y DL5o (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, DE50/DL50. Se prefieren composiciones farmacéuticas que presentan grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios animales se usan en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, sensibilidad del paciente y la vía de administración.
La dosificación exacta se elige por el médico individual en vista del paciente que va a tratarse. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar suficientes niveles del resto activo o para mantener el efecto deseado. Factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, por ejemplo, tamaño del tumor y localización; edad, peso y sexo del paciente; dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación (combinaciones) de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada podrían administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y tasa de eliminación de la formulación particular.
Cantidades de dosificación normales pueden variar de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 2 g, dependiendo de la vía de administración. Orientación en cuanto a dosificaciones particulares y procedimientos de administración se proporcionan en la bibliografía. Véanse las patentes de EE.UU. n° 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Aquellos expertos en la materia emplearán formulaciones diferentes para polinucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. Similarmente, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células, condiciones, localizaciones particulares, etc. Actividades específicas preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden oscilar de 0,1 a 10 mCi/mg de proteína (Riva y col., Clin. Cáncer Res. 5:3275-3280, 1999; Ulaner y col., 2008 Radiology 246(3):895-902).
La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención por referencia a realizaciones específicas. Estas ejemplificaciones, aunque ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no representan las limitaciones o circunscriben el alcance de la invención desvelada.
Todos los ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas convencionales, que son muy conocidas y rutinarias para aquellos expertos en la materia, excepto cuando se describan de otro modo en detalle. Técnicas de biología molecular rutinarias de los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo como se describe en manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Una realización preferida de la invención es: A. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que reduce la expresión de FGFR2 en la superficie celular después de unirse a FGFR2 en líneas celulares SNU16 (ATCC-CRL-5974) y MFM223 (ECACC-98050130) que expresan en exceso FGFR2 y en líneas celulares AN3-CA (DSMZ-ACC 267) y MFE-296 (ECACC-98031101) que expresan FGFR2 mutado.
B. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación A, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al epítopo del extremo N extracelular (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 como se presenta con (SEC ID N°: 63). C. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación B en el que la unión del anticuerpo al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) está mediada por al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Arg 1, Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 y Glu 8.
Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones B-C. anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que pierde más del 50 % de su señal de ELISA al transformar al menos uno de los residuos de aminoácidos en el epítopo del extremo N (1RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 en una alanina a) estando dicho residuo seleccionado del grupo Pro 2, Leu 6 y Glu 8, o b) estando dicho residuo seleccionado del grupo Arg 1, Pro 2, Phe 4 y Ser 5.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones A a D, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que compite en la unión a FGFR2 con al menos un anticuerpo seleccionado del grupo " 048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05" "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" y "TPP-1415".
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación E, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es al menos el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 o el 95 % idéntica a al menos una secuencia de CDR de "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412", o "TPP-1415", o al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o el 95 % idéntica a la secuencia de VH o VL de "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" o "TPP-1415".
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones E a F, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende al menos una secuencia de CDR o al menos una secuencia de cadena pesada o cadena ligera variable como se representa en la Tabla 9 y la Tabla 10.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación A a G que comprende a) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 5-7 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 8-10, o b) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 15-17 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 18-20, o c) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 25-27 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 28-30, o d) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 35-37 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 38-40, o e) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 45-47 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 48-50, o f) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 55-57 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 58-60, o g) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 75-77 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 78-80, o h) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 85-87 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 88-90, o i) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 95-97 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 98-100, o j) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 105-107 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 108-110, o k) las secuencias de CDR de la cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 115-117 y las secuencias de CDR de - cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 118-120, o I) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 125-127 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 128-130, o m) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 135-137 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 138-140, o n) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 145-147 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 148-150, o o) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 155-157 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 158-160, o p) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 165-167 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 168-170, o q) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 175-177 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 178-180, o r) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 185-187 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 188-190, o s) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 195-197 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 198-200, o t) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 205-207 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 208-210, o u) las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 215-217 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 218-220. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según las reivindicaciones A - H que comprende a) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 1 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 2, o b) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 11 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 12, o c) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 21 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 22, o d) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 31 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 32, o e) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 41 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 42, o f) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 51 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 52, o g) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 73 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 74, o h) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 83 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 84, o i) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 93 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 94, o j) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 103 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 104, o k) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 113 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 114, o I) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 123 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 124, o m) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 133 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 134, o n) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 143 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 144, o o) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 153 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 154, o p) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 163 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 164, o q) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 173 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 174, o r) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 183 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 184, o s) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 193 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 194, o t) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 203 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 204, o u) una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 213 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta por SEC ID N°: 214.
El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo IgG.
El fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un fragmento scFv, Fab, Fab' o un fragmento F(ab')2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es anticuerpo humano, humanizado o quimérico, o fragmento de unión a antígeno.
Un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según las reivindicaciones A a M. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones A a M.
Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación O.
Una célula aislada que expresa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones A - M y/o que comprende un ácido nucleico según la reivindicación O o un vector según la reivindicación P.
Una célula aislada según la reivindicación Q, siendo dicha célula una célula procariota o eucariota.
Un procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones A - M que comprende cultivar una célula según la reivindicación R y la purificación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones A - M o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación N como medicamento.
Un anticuerpo o antígeno fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones A- M como agente de diagnóstico.
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones A - M o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación N como un medicamento para el tratamiento de cáncer.
Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones A - M o un conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación N.
Una combinación de una composición farmacéutica según la reivindicación W y uno o más compuestos terapéuticamente activos.
Un procedimiento para tratar un trastorno o afección asociado a la presencia no deseada de FGFR2, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica según la reivindicación W o de una combinación según la reivindicación X.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Generación de anticuerpos a partir de bibliotecas n-CoDeR Herramientas usadas para las selecciones de fago: Las proteínas recombinantes usadas para el aislamiento de anticuerpos humanos de la presente invención se obtuvieron de R&D Systems y se enumeran en la Tabla 1. Todas las variantes usadas estuvieron presentes como proteínas de fusión de Fe en preparaciones sin portador. hTRAIL-Fc sirvió de agente de reducción para evitar el ligante de Fe. Las proteínas se biotinilaron según instrucciones del fabricante usando un exceso molar de aproximadamente 2 veces de biotina-LC-NHS (Pierce; Cat. n° 21347) y se desalaron usando columnas de desalación Zeba (Pierce; Cat. n° 89889).
Tabla 1 : Lista de proteínas recombinantes usadas en selecciones de fagos y cribado Para selecciones de fagos en células se empleó la línea celular de carcinoma gástrico humano KATO III (ATCC HTB-103), expresando FGFR2 nativo sobre su superficie celular.
Selecciones de fagos: El aislamiento de anticuerpos humanos de la presente invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se realizó por tecnología de expresión en fago empleando la biblioteca de anticuerpos Fab sin tratamiento previo n-CoDeR de Biolnvent International AB (Lund, Suecia; descrita en Sóderling y col., Nat. Biotech. 2000, 18:853-856), que es una biblioteca de Fab en la que las seis CDR están diversificadas. Como se ha resumido en la Tabla 2, se emplearon tres estrategias diferentes para la selección de anticuerpos inventivos.
Tabla 2: Resumen de estrategias de selección Tampones convencionales usados en este ejemplo son: 1 x PBS: de Sigma (D5652-50I) PBST: PBS 1x complementado con 0,05 % de Tween 20 (Sigma, P7949) Tampón de bloqueo: PBST complementado con 3 % de BSA (Sigma A4503) Tampón de precipitación: 20 % de PEG (Calbiochem, 528877) en NaCI 2,5 M Tampón de FACS: PBS complementado con 3 % de SBF (GIBCO, 10082) y 0,01 % de NaN3 (Sigma, 71289) Brevemente, una alícuota de la biblioteca de anticuerpos Fab se centrifugó a ta durante 5 min, el sedimento resultante se resuspendió en 40 mi de PBS y se precipitó mediante la adición de tampón de precipitación, seguido de una incubación sobre hielo durante 1 h y una etapa de centrifugación (1 h a 4000 rpm). La biblioteca precipitada se resuspendió posteriormente en 1 mi de tampón de bloqueo y se incubó a ta durante 30 min.
Por otra parte, se prepararon alícuotas de Dynabeads M280 recubiertas con estreptavidina (Invitrogen, 11206D) lavando 3 veces con PBS durante 30 min sobre un agitador rotacional tipo noria. Después de eso, algunas alícuotas se mezclaran con proteína TRAIL-Fc biotinilada 200 nM mientras que el resto se mezcló con la proteína diana biotinilada como se indica en la Tabla 2. Las mezclas se incubaron a ta en un agitador rotacional tipo noria durante 30 min y posteriormente se lavaron 3 veces en 1 mi de PBS. Las perlas recubiertas se bloquearon finalmente por resuspensión en 1 mi de tampón de bloqueo, seguido de recogida de las perlas y eliminación del sobrenadante.
Para el agotamiento de ligantes de Fe no deseados, la biblioteca bloqueada (descrita anteriormente) se añadió a Dynabeads bloqueadas recubiertas con TRAIL-Fc y se incubaron a ta durante 30 min mientras se giraban. Después de la recogida de las perlas en una gradilla magnética, el sobrenadante se mezcló con Dynabeads bloqueadas recubiertas con proteína diana. Después de 60 min de incubación sobre un agitador rotacional tipo noria, las muestras se lavaron 3 veces con tampón de bloqueo seguido de lavado de 5 veces con PBST. Los fagos unidos se eluyeron añadiendo 100 µ? de disolución de trietanolamina (TEA, 100 mM). Después de 10 min de incubación a ta , las muestras se neutralizaron añadiendo 400 µ? de Tris-CI 1 M, pH 7,5.
La estrategia I de selección por afinidad incluyó 2 rondas de inmunopurificación sobre células completas como fuente de proteína diana (véase la Tabla 2). Para este fin, células KATO III se resuspendieron en tampón FACS helado a una densidad de 107 células por mi. Una alícuota de fagos rescatados se añadió a 1 mi de suspensión de células y se incubó a 4 °C por agitación en agitador rotacional tipo noria. Posteriormente, las células se lavaron 10 veces con 2,5 mi de tampón FACS, seguido de una elución de fagos unidos con 300 µ? de ácido cítrico 76 nM (pH 2,5). Después de 5 min de incubación, las células se centrifugaron durante 5 min a 400 g y 4 °C y el sobrenadante se neutralizó añadiendo 300 mi de Tris-C1 1 M, pH 7,5 Los fagos eluidos se propagaron y los títulos de fagos se determinaron esencialmente como se ha descrito previamente (Cicortas Gunnarsson y col., Protein Eng Des Sel 2004; 17 (3): 213-21). Brevemente, alícuotas de la disolución de eluato se guardaron para experimentos de valoración mientras que el resto se usó para transformar exponencialmente TG1 de E. coli en crecimiento (de Stratagene) para la preparación de nuevas disoluciones madre de fagos usadas en una segunda, tercera y cuarta ronda de selección según las estrategias representadas en la Tabla 2. Para cada ronda de selección, tanto los fagos de entrada como de salida se valoraron en TG1 de E. coli exponencialmente crecientes y se recogieron clones de la ronda 2 a 4 para análisis en ELISA de fagos.
Enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA): ELISA de fagos: Fagos seleccionados de diferentes rondas de selección se analizaron para especificidad usando ELISA de fagos. Brevemente, la expresión en fagos se realizó añadiendo 10 µ? de cultivo durante la noche (en medio LB complementado con 100 pg/ml de ampicilina (Sigma, A5354), 1 % de glucosa) a 100 µ? de medio fresco (medio LB complementado con 100 pg/ml de ampicilina y 0,1 % de glucosa (Sigma, G8769) y agitando a 250 rpm y 37 °C en MTP de 96 pocilios hasta que se alcanzó una DO600 de 0,5. Posteriormente se añadieron 40 µ? de fago auxiliar M13K07 (Invitrogen, 420311) y las muestras se incubaron durante otros 15 min a 37 °C sin agitación. Después de la adición de IPTG (c.f. de 0,5 mM; volumen final 200 µ?), las células se incubaron durante la noche a 30 °C mientras que se agitaban a 200 rpm.
Placas de ELISA de 96 pocilios recubiertas previamente con estreptavidina (Pierce, 15500) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 1 pg/ml de FGFR2-2p Fe (lllb) biotinilado o TRAIL-Fc biotinilado. Al día siguiente las placas se lavaron 3 veces con PBST, se trataron con reactivo de bloqueo y se lavaron de nuevo 3 veces con PBST. Por otra parte, los cultivos en fago se centrifugaron brevemente, luego se eliminaron 125 µ? del sobrenadante y se mezclaron con 125 µ? de tampón de bloqueo. Después de eso, 100 µ? de los fagos bloqueados se transfirieron por pocilio y se incubaron durante 1 h a ta. Después de lavar 3 veces con PBST, el anticuerpo anti-M13 acoplado a HRP (GE Healthcare, 27-9421-01 ; diluido 1 :2500 en PBST) se añadió y se incubó durante 1 h a ta. La reacción de color se desarrolló mediante la adición de 50 µ? de TMB (Invitrogen, 2023) y se detuvo después de 5-15 min añadiendo 50 µ? de H2S04 (Merck, 1120801000). La reacción colorimétrica se registró a 450 nM en un lector de placas (Tecan).
Selección de sFab por ELISA: Para la generación de fragmentos Fab solubles (sFab), se aisló ADN de fagémido de las rondas de selección 3 y 4 y se digirió con enzimas de restricción Eagl (Fermentas, FD0334) y EcoRI (NEB, R0101 L) según las instrucciones del proveedor con el fin de eliminar la secuencia del gen III. El fragmento resultante se re-ligó y se transformaron construcciones en Top10 de E. coli químicamente competentes usando procedimientos convencionales. Se recogieron clones individuales, se transfirieron a placas de 96 pocilios que contenían medio LB (100 Mg/ml de ampicilina (Sigma, A5354), 1 % de glucosa) y se agitaron a 250 rpm y 37 °C. A la mañana siguiente, 10 mi de pre-cultivo se transfirieron a 150 µ? de medio LB fresco (100 pg/ml de ampicilina (Sigma, A5354), 0,1 % de glucosa) hasta que se alcanzó una DO600 de 0,5. Después de eso, la producción de sFab se indujo por la adición de IPTG (c.f. 0,5 mM) y la incubación continuó durante la noche a 30 °C mientras que se agitaba a 200 rpm. A la mañana siguiente se añadieron 50 µ? de tampón BEL (24,7 g/l de ácido bórico; 18,7 g/l de NaCI; 1 ,49 g/l de EDTA a pH 8,0; 2,5 mg/ml de lisozima (Roche)) a cada pocilio, la mezcla se incubó 1 h a ta. Posteriormente se añadió 1/3 de volumen de tampón de bloqueo con 9 % de BSA y después de una etapa de incubación de 30 min adicionales a ta, 50 µ? de cada pocilio se analizaron para la unión de sFab a la diana en un ELISA esencialmente como se ha descrito para fagos, excepto que la detección se realizó con un anti-hlgG (específico para Fab) acoplado a HRP (diluido 1 :2500; Sigma; A 0293).
EJEMPLO 2: Producción a pequeña escala de éxitos de cribado de Fab soluble Se produjeron éxitos de cribado únicos a pequeña escala para el análisis inicial de su unión a diferentes variantes de proteínas de FGFR (véase el Ejemplo 3). 20-50 mi de medio LB (complementado con 0,1 mg/ml de ampicilina y 0,1 % de glucosa) se inocularon con un pre-cultivo del clon Top 10 de E. coli respectivo, que contenía una secuencia de Fab única clonada en el vector de pBIF inicial, pero que carecía de la secuencia del gen III. La producción de sFab se indujo mediante la adición de IPTG 0,5 mM (concentración final) y la incubación continuó durante la noche a 30 °C a 250 rpm con agitación.
Posteriormente, las células se recogieron por centrifugación y se lisaron suavemente por incubación de 1 h a 4 °C en un tampón de lisis, que contenía 20 % de sacarosa (peso/volumen), TRIS 30 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, 1 mg/ml de lisozima (Sigma L-6876) y 2,5 U/ml de benzonasa (Sigma E1014), seguido de la adición de un volumen igual de PBS. Después de eso, el sobrenadante transparente se aplicó a Dynabeads para el aislamiento de la marca His (Invitrogen, 101-03D) y se incubó durante 2 h a 4 °C en un agitador rotacional tipo noria. Posteriormente, la matriz se lavó 3 veces con tampón 1 (tampón fosfato de Na 50 mM, pH 7,4, NaCI 300 mM, imidazol 5 mM, 0,01 % de Tween-20) seguido de una única etapa de lavado en tampón 2 (PBS que contiene 0,005 % de Tween-20). Finalmente, los Fab se eluyeron con tampón E (tampón fosfato de Na 10 mM, pH 7,4, NaCI 300 mM, imidazol 300 mM) y se concentraron en Vivaspin 500 (corte 10000; de GE; 28-9322-25) usando tampón PBS. Los Fab se analizaron para contenido de proteína y para pureza por SDS-PAGE.
EJEMPLO 3: Perfil de reactividad cruzada de anticuerpos Se produjeron éxitos de cribado únicos a pequeña escala como se ha descrito en el Ejemplo 2 y se probaron en un ELISA respecto a su unión a diferentes variantes de FGFR enumeradas en la Tabla 3.
Tabla 3: Lista de proteínas recombinantes usadas en ELISA para el perfilado de reactividad cruzada del ligante Todas las variantes usadas estuvieron presentes como proteínas de fusión de Fe en preparaciones sin portador. Las proteínas se biotinilaron usando un exceso molar de aproximadamente 2 veces de biotina-LC-NHS (Pierce; N° de cat. 21347) según instrucciones del fabricante y se desalaron usando columnas de desalación Zeba (Pierce; N° de cat. 89889).
Para ELISA, placas de 96 pocilios previamente recubiertas con estreptavidina (Pierce, 15500) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 1 pg/ml de proteína biotinilada. Los pocilios recubiertos con TRAIL-Fc biotinilado sirvieron de referencia. Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces con PBST, se trataron con reactivo de bloqueo y se lavaron de nuevo 3 veces con PBST. Se añadieron 100 µ? de Fab purificados (1 pg/ml) y se incubaron durante 1 h a ta. Después de lavar 3 veces con PBST se añadió un anti-hlgG (específico para Fab) acoplado a HRP (diluido 1 :2500; Sigma; A 0293) y se incubó durante 1 h a ta. La reacción de color se desarrolló mediante la adición de 50 µ? de TMB (Invitrogen, 2023) y se detuvo después de 5-15 min añadiendo 50 µ? de H2S04 (Merck, 1120801000). La reacción colorimétrica se registró a 450 nM en un lector de placas (Tecan). Los pocilios que contenían TRAIL-Fc se usaron como valores de ruido de fondo y las relaciones de señal con respecto a ruido de fondo se calcularon como se ha resumido en la Tabla 4.
Tabla 4: Resumen de datos de ELISA sobre la reactividad cruzada de anticuerpos Relaciones de señal con respecto a ruido de fondo: 0: <2; +: 2-3; ++: 3-5; +++: >5 Como se muestra en la Tabla 4, los anticuerpos de la presente invención se unen a FGFR2 humano y murino independiente de alfa y beta, además de la forma de corte y empalme lllb y lile. Los anticuerpos de la presente invención no se unen a FGFR1 , FGFR3 y FGFR4 como se muestra en la Tabla 4.
EJEMPLO 4: Unión de anticuerpos para FGFR2 a la superficie celular de líneas de células cancerosas Para determinar las características de unión de los anticuerpos anti-FGFR2 sobre líneas de células cancerosas de ratón, rata y humanas, la unión se probó por citometría de flujo para un panel de líneas celulares. Se lavaron células adherentes dos veces con PBS (sin Ca y Mg) y se desprendieron por tampón de disociación de células basado en PBS libre de enzimas (Invitrogen). Las células se suspendieron a aproximadamente 105 células/pocilio en tampón FACS (PBS sin Ca/Mg, Biochrom que contiene 3 % de SBF, Biochrom). Las células se centrifugaron (250 g, 5 min, 4 °C) y se desechó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en diluciones de los anticuerpos de interés (5 pg/ml en 80 µ? si no se indica de otro modo) en tampón FACS y se incubaron sobre hielo durante 1 h. A continuación, las células se lavaron una vez con 100 µ? de tampón FACS frío y se añadieron 80 µ? de anticuerpo secundario diluido a 1 :150 (PE-anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana, Dianova n° 109-115-098, o PE-anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón, Jackson Immuno Research n° 115-115-164). Después de la incubación durante 1 h sobre hielo, las células se lavaron de nuevo con tampón FACS frío, se resuspendieron en 100 µ? de tampón FACS y se analizaron por citometría de flujo usando un matriz de FACS (BD Biosciences). Los resultados se calculan como la media geométrica de la detección por el anticuerpo de interés restado por la fluorescencia del ruido de fondo como se mide por detección con el anticuerpo secundario solo. Los valores se puntúan según el siguiente sistema: Media geométrica - Media geométrica del anticuerpo secundario solo >10: +, >100: ++, >1000: +++, 10000: ++++, próximo al límite de categoría en ().
Lista de líneas celulares usadas para el perfilado de la reactividad cruzada de anticuerpos: Como se muestra en la Tabla 5, todos los anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención usados a una concentración de 5 pg/ml se unen a una amplia variedad de células tumorales que expresan FGFR2 de origen murino (4T1, EMT6), de rata (RUCA) y humano (todas las otras líneas celulares se incluyen en la tabla).
Tabla 5: Unión de anticuerpos anti-FGFR2 a 5 pg/ml a diferentes líneas celulares por puntuación de análisis de FACS (Media geométrica - Media geométrica de anticuerpo secundario solo >10: +, >100: ++, >1000: +++, >10000: ++++, próximo al límite de categoría en () Para determinar los valores de CE50 para la unión de anticuerpos a líneas de células cancerosas seleccionadas, las células se tiñeron con anticuerpos para FGFR2 como se ha descrito anteriormente, pero con diversas concentraciones de anticuerpos que oscilan de 0,1-100 nM. Los valores de CE50 se determinaron usando el software Graph Pad Prism y se presentan en la Tabla 6. Tres anticuerpos con la mayor afinidad (M017-B02-hlgG1 , M048-D01-hlgG1 , M047-D08-hlgG1) muestran valores de CE50 de subnanomolares a nanomolares bajos en líneas celulares humanas (SNU-16, MFM223), murinas (4T1) y de rata (Ruca). M021-H02-hlgG1, M054-A05-hlgG1 y M054-D03-hlgG1 muestran también valores de CE50 celulares nM bajos en líneas celulares murinas y humanas. Así, todos los anticuerpos probados son reactivos de forma cruzada en la unión a células humanas, murinas y de rata que expresan FGFR2.
Tabla 6: Los valores de CE5o de la unión de anticuerpos anti-FGFR2 a líneas celulares de origen humano (SNU16, MFM223), murino (4T1) y de rata (RUCA) se analizaron por FACS (n.d. representa no determinado/medido) EJEMPLO 5: Mapeo de epítopos por tecnología de péptidos químicamente ligados sobre andamiajes (CLIPS) de Pepscan Para determinar las características de unión de los anticuerpos encontrados se realizó un intenso mapeo de epítopos basado en la tecnología de péptidos químicamente ligados sobre andamiajes (CLIPS) patentada por Pepscan (Timmerman y col., J. Mol. Recognit. 2007, 20:283-99). En total, se diseñaron 8653 péptidos CLIPS diferentes de epítopos lineales, conformacionales y discontinuos que cubren 15AA y 30AA de longitud sobre el FGFR2 humano nativo. Los péptidos se sintetizaron sobre matrices de péptidos. Los anticuerpos de la presente invención se probaron sobre las matrices de péptidos en formato de lgG1 humana en un ensayo basado en ELISA. Los péptidos que dieron los mayores valores de ELISA se analizaron para identificar secuencias de aminoácidos similares compartidas.
Para la reconstrucción de epítopos discontinuos de la molécula diana se sintetizó una biblioteca de péptidos estructurados. Esto se hizo usando la tecnología de péptidos químicamente ligados sobre andamiajes (CLIPS) patentada por Pepscan (Timmerman y col., J. Mol. Recognit. 2007, 20:283-99). La tecnología de CLIPS permite estructurar péptidos en bucles individuales, bucles dobles, bucles triples, pliegues similares a hojas, pliegues similares a hélices y combinaciones de los mismos. Los moldes de CLIPS se acoplan a residuos de cisteína. Las cadenas laterales de múltiples cisteínas en los péptidos se acoplan a uno o dos moldes de CLIPS. Por ejemplo, una disolución 0,5 mM del molde de CLIPS T2 1 ,3-bis(bromometil)benceno se disolvió en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (1 :1(v/v)). Esta disolución se añadió sobre las matrices de péptidos. El molde de CLIPS se unió a cadenas laterales de dos cisteínas como se presenta en los péptidos unidos en fase sólida de las matrices de péptidos (placa de 455 pocilios con pocilios de 3 µ?). Las matrices de péptidos se agitaron suavemente en la disolución durante 30 a 60 minutos mientras que se cubrieron completamente en disolución. Finalmente, las matrices de péptidos se lavaron ampliamente con exceso de H2O y se sonicaron en tampón de interrupción que contenía 1 por ciento de SDS/0,1 por ciento de beta-mercaptoetanol en PBS (pH 7,2) a 70 °C durante 30 minutos, seguido de sonicación en H20 durante otros 45 minutos. Los CLIPS T3 que llevan péptidos se prepararon de un modo similar pero ahora con tres cisteínas.
La unión de anticuerpo a cada péptido se probó en un ELISA basado en PEPSCAN (Slootstra y col., Molecular Diversity 1996, 1 : 87-96). Las matrices de péptidos se preincubaron con 5 % al 100 % de tampón de unión (1 h, 20 °C). El tampón de unión estuvo compuesto por 1 % de Tween-80, 4 % de suero de caballo, 5 % de albúmina de huevo (peso/volumen) y se diluyó con PBS. Después de lavar las matrices de péptidos se incubaron con disolución de anticuerpo primario (1 a 5 ug/ml) en PBS que contenía 1 % de Tween-80 (durante la noche a 4 °C). Después de lavar, las matrices de péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 en 100 % de tampón de unión de un conjugado de anticuerpo-peroxidasa durante una hora a 25 °C (anti-humano). Después de lavar se añadieron el sustrato de peroxidasa sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 microlitros/mililitro de H202 al 3 por ciento. Después de una hora, el desarrollo de color se midió. El desarrollo de color se cuantificó con un dispositivo de carga acoplada (CCD) - cámara y un sistema de procesamiento de imágenes.
Procesamiento de datos Los datos sin procesar son valores ópticos obtenidos por un CCD-cámara. Los valores oscilan de 0 a 3000 mUA, similar a un lector de ELISA de placas de 96 pocilios convencional. Los valores de unión se quitaron para el análisis. Ocasionalmente, un pocilio contiene una burbuja de aire que produce un valor positivo falso, las tarjetas se inspeccionaron manualmente y cualquier valor producido por una burbuja de aire se puntuó como 0.
Todos los anticuerpos de la presente invención se unen al mismo epítopo, que comprende residuos del extremo N de FGFR2 ( RPSFSLVEDTTLEPE15). El análisis de 1257 CLIPS y péptidos lineales mostró valores de ELISA altos coherentes para péptidos del extremo N.
Los residuos del extremo N (1RPSFSLVEDTTLEPE15) están presentes en todas las variantes de corte y empalme de FGFR2 humano independiente del corte y empalme alternativo en D3 que produce isoformas lllb y lile (véase la Figura 1). El epítopo también está presente si el dominio D1 se corta y empalma del FGFR2 de longitud completa (SEC ID N°: 61 ; FGFR2 alfa) produciendo la forma beta más corta de FGFR2 (SEC ID N°: 62). En este caso, el epítopo está directamente enfrente del dominio D2 (véase la Figura 1).
Entonces es de especial interés que la secuencia del extremo N esté conservada en ser humano, ratón, rata y Macaca mulatta. Esto permite una amplia reactividad cruzada entre especies.
Este nuevo epítopo está fuera del sitio de unión al ligando muy conocido y el sitio de unión a heparina (véase la Figura 1) y produce características novedosas de los anticuerpos de la presente invención.
EJEMPLO 6: Mapeo fino de epítopos por cribado con alanina de péptidos Para definir las características de unión de los anticuerpos de la invención en más detalle se realizó un cribado con alanina. Como se describe en el Ejemplo 5, se sintetizaron péptidos de 15 AA y 30 AA de longitud y cada aminoácido de la secuencia de FGFR2 humano se sustituyó con un cierto péptido por un residuo de alanina. La unión de los anticuerpos se analizó como se ha descrito en el Ejemplo 5. Si el intercambio de un residuo de aminoácido con una alanina produce una reducción significativa de la señal de unión, este residuo se consideró crítico para la unión.
La Tabla 7 muestra para los anticuerpos de la presente invención los residuos críticos en la parte del extremo N (1RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2.
Tabla 7: Residuos críticos en la parte del extremo N (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 para la unión de anticuerpos de la presente invención (Los residuos que son críticos para la unión se marcan con una (X).
Cambiando este residuo por una alanina se pierde más del 50 % de la señal de ELISA) Los anticuerpos M048-D01 y M021-H02 son de especial interés debido a que están uniéndose independientemente de variaciones en la posición Ser-5. Esto les permite unirse, además de a FGFR2 humano, de ratón, rata y Macaca mulatta FGFR2 (SEC ID N°: 63), a FGFR2 de conejo (SEC ID N°: 64), cerdo (SEC ID N°: 65) y perro (SEC ID N°: 66) haciendo posible usar incluso más especies para desarrollo preclínico.
EJEMPLO 7: Afinidad de anticuerpos por el epítopo del extremo N analizado por Biacore Para definir las afinidades de unión para los péptidos del extremo N caracterizados como epítopos se realizaron experimentos de resonancia de plasmones superficiales Biacore.
Las afinidades de unión de los anticuerpos anti-FGFR2 se determinaron por análisis de resonancia de plasmones superficiales en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.). Los anticuerpos como lgG1 humana se inmovilizaron sobre un chip sensor CM5 mediante un reactivo de captura indirecto, anti-lgG humana (Fe). Los reactivos del "kit de captura de anticuerpo humano" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) se usaron como se describe por el fabricante. Se inmovilizaron aproximadamente 5000 UR de anticuerpo (Fe) monoclonal de ratón dirigido contra IgG humana por célula. Los anticuerpos anti-FGFR2 se inyectaron a una concentración de 5 pg/ml a 10 µ?/min durante 10 s. Se inyectaron diversas concentraciones (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,12 nM) en tampón HEPES-EP (GE Healthcare Biacore, Inc.) de péptidos derivados de los 15 primeros aminoácidos de FGFR2 de diferentes especies (FGFR2 humano, de ratón, rata, Macaca mulatta (SEC ID N°: 63), conejo (SEC ID N°: 64), cerdo (SEC ID N°: 65) y perro (SEC ID N°: 66)) con respecto a anticuerpos anti-FGFR2 inmovilizados a una velocidad de flujo de 60 µ?/min durante 3 minutos y la disociación se permitió durante 5 minutos. Los sensogramas se generaron después de la corrección de células de referencia en línea, seguido de la resta de la muestra tampón. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó basándose en la relación de las constantes de asociación (kas) y disociación (kdiS), obtenidas ajusfando sensogramas con un modelo de unión de primer orden 1 :1 usando el software Biavaluation (versión 4.0).
M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 se unen a FGFR2 humano, murino, de rata y Macaca mulatta con un valor de KD de de aproximadamente 100 nM (para detalles véase la Tabla 8). Como se ha respaldado por el barrido con alanina, M048-D01 mostró casi el mismo valor de KD para todos los péptidos derivados de varias especies (véase la Tabla 8).
Tabla 8: Valores de KD monovalentes de anticuerpos M048-D01 y M047-D08 como se mide por Biacore con péptidos de 15 aminoácidos de longitud.
EJEMPLO 8: Estimulación de niveles de FGFR2-F (FGFR2 fosforilado) después de la incubación a corto plazo con anticuerpos anti-FGFR2 en líneas celulares que expresan en exceso FGFR2 Para determinar el efecto de anticuerpos anti-FGFR2 sobre niveles celulares de FGFR2 fosforilado (FGFR2-F) después de incubación a corto plazo se realizaron ELISA de FGFR2-F. Se sembraron células MFM223 a 7000 células por pocilio en medio de crecimiento (MEM Earle (Biochrom; F0315) + 10 % de SBF + glutamina 2mM) en placas de 96 pocilios. 24 h después de la siembra las células se incubaron con anticuerpos (10 µ/ml) durante 15 min, seguido de dos etapas de lavado con PBS y lisis en 100 µ? de tampón de lisis frío constituido por Hepes 50 mM a pH 7,2, NaCI 150 mM, MgCI2 1 mM, Na4P207 10 mM, NaF 100 mM, 10 % de glicerina, 1,5 % de Tritón X-100 y mezcla completa de inhibidores de proteasas recientemente añadida (Roche n° 1873580001), Na3V044 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH por agitación durante 5 min. Se ultracongelaron muestras y se guardaron a -80 °C hasta análisis. La medición de los niveles de FGFR2-F se llevó a cabo usando un kit de ELISA de FGFR2-F de R&D Systems según las instrucciones del fabricante. La DO se midió a 450 nM (Tecan Spectra, Rainbow) con corrección del ruido de fondo. Los niveles de FGFR2-F se calcularon como el % de niveles de control sin tratar. Para controlar los efectos no específicos del formato de anticuerpo, se incubaron muestras paralelas con IgG de control de no unión a células del mismo isotipo.
Los resultados se muestran en la Figura 2 e indican una inducción pronunciada de niveles de FGFR2-F por anticuerpos anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1. A diferencia, ni el anticuerpo IgG de control ni los anticuerpos anti-FGFR2 comercialmente disponibles de R&D (MAB665, MAB684, MAB6843) muestran ningún efecto significativo sobre los niveles de FGFR2-F después de la incubación a corto plazo. Estos resultados revelan un efecto agonista de anticuerpos anti-FGFR2 descritos dentro de la presente invención sobre FGFR2 después de incubación a corto plazo.
EJEMPLO 9: Desensibilización de células que expresan en exceso FGFR2 contra la estimulación de FGFR2-F por FGF7 después de incubación a largo plazo con anticuerpos anti-FGFR2 Para determinar el efecto de anticuerpos anti-FGFR2 sobre niveles celulares de FGFR2 fosforilado (FGFR2-F) después de una incubación a largo plazo y el efecto del tratamiento con anticuerpos sobre la potencia de FGF7 para inducir la fosforilación de FGFR2, se realizaron ELISA de FGFR2-F. Se sembraron células MFM223 a 7000 células por pocilio en medio de crecimiento (MEM Earle (Biochrom; F0315) + 10 % de SBF + glutamina 2 mM) en placas de 96 pocilios. 24 h después de la siembra las células se incubaron con anticuerpos (10 µ/ml) durante 24 min, seguido de incubación en presencia o ausencia de FGF7 (R&D Systems, 25 ng/ml) durante 15 min. Las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron en tampón de lisis que consistía en (Hepes 50 mM a pH 7,2, NaCI 150 mM, MgCI2 1 mM, Na4P207 10 mM, NaF 100 mM, 10 % de glicerina, 1,5 % de Tritón X-100, mezcla completa de inhibidores de proteasas recientemente añadida (Roche n° 1873580001), Na3VÜ 4 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH) y agitación durante 5 min a temperatura ambiente. Se congelaron muestras criogénicamente y se guardaron a -80 °C hasta el análisis por ELISA de FGFR2-F de R&D según las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió a 450 nm (Tecan Spectra, Rainbow) con corrección del ruido de fondo. Los niveles de FGFR2-F se calcularon como el % de niveles de control sin tratar. Para controlar los efectos no específicos del formato de anticuerpo, muestras paralelas se incubaron con IgG de control de no unión a células del mismo isotipo.
Los resultados correspondientes se presentan en la Figura 3. En células tratadas sin tratamiento con anticuerpo, además de en células tratadas con IgG de control de isotipo, la estimulación con FGF7 conduce a un aumento de aproximadamente 4 veces de los niveles de FGFR2-F. A diferencia, en muestras pretratadas con anticuerpos anti-FGFR2 durante 24 h, FGF7 solo indujo niveles de FGFR2-F de 1 ,37-1 ,4 veces.
Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que la incubación prolongada de células con anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención conduce a desensibilización hacia la estimulación con FGF7.
EJEMPLO 10: Regulación por disminución de la expresión superficial de FGFR2 después de la incubación de líneas celulares con anticuerpos anti-FGFR2 Para analizar la expresión superficial de FGFR2 después del tratamiento con anticuerpos anti-FGFR2 se llevó a cabo análisis de FACS en diferentes líneas celulares con expresión en exceso de FGFR2 (MFM223, SNU16) o mutación de FGFR2 (AN3-CA, MFE-296). Se lavaron células adherentes dos veces con PBS (sin Ca y Mg) y se desprendieron con tampón de disociación de células basado en PBS sin enzima (Invitrogen). Las células se suspendieron a 0,5*105 células/pocilio en 80 µ? de medio de crecimiento (MFM223, MFE-296: MEM Earle (Biochrom; F0315) + 10 % de SBF + glutamina 2 mM, SNU-16: RPMI 1640 (Biochrom, FG1215) + 10 % de SBF; AN3-CA:MEM Earle (Biochrom; FG0325) + 10 % de SBF + piruvato de sodio 1 mM + 1x ANE: aminoácidos no esenciales Biochrom K0293). Se añadieron 20 µ? de dilución de anticuerpo 5 veces concentrada (concentración final de 10 pg/ml) y se incubó durante 4,5 h a 37 °C. Después de terminar el tiempo de incubación, las células se lavaron una vez con 100 µ? de tampón FACS, se tiñeron con anticuerpo de detección (a 5 pg/ml, anti-FGFR2 de ratón para hlgG, anti-FGFR2 humano para mlgG) durante 45 min a 4 °C, seguido de un lavado adicional con 100 µ? de tampón FACS. El anticuerpo secundario teñido con PE (PE-anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana, Dianova n° 109-115-098, o PE-anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón, Jackson Immuno Research n° 115-115-164, diluido 1:150) se añadió en 80 µ? de volumen, se incubó durante 45 min a 4 °C y después de un lavado adicional con tampón FACS las células se analizaron por citometría de flujo usando una matriz de FACS (BD Biosciences). En experimentos de control, la competición del anticuerpo por epítopos solapantes se excluyó por incubación paralela con el anticuerpo de interés y el anticuerpo de detección correspondiente. Las medias geométricas medidas después de la tinción con anticuerpos secundarios solo se restaron de las medias geométricas de picos detectados después de la tinción con anticuerpos anti-FGFR2. Los resultados se calculan como % de células de control que se incubaron durante 4,5 h sin la presencia de anticuerpos.
Los resultados se representan en la Figura 4. La incubación de células con IgG de control conduce a la no disminución de la expresión de la superficie de FGFR2, mientras que los anticuerpos anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 regularon por disminución los niveles superficiales de FGFR2 significativamente el 39-60 % en las 4 líneas celulares independientemente de la expresión en exceso o mutación de FGFR2. A diferencia, ningún otro anticuerpo anti-FGFR2 tanto comercialmente disponible de R&D (MAB665, MAB684, MAB6843) como descrito en cualquier parte, por ejemplo, (GAL-FR21 , GAL-FR22; WO2010/054265 y Zhao y col. (Clin Cáncer Res. 2010,16:5750-5758)) mostró regulación por disminución de la superficie de FGFR2 en las 4 líneas celulares independientemente de la expresión en exceso o mutaciones de FGFR2. GAL-FR21 reguló por disminución los niveles superficiales de FGFR2 en líneas celulares con amplificación de FGFR2 (SNU16 y MFM223), pero no tuvo impacto sobre líneas celulares con mutación de FGFR2. GAL-FR22 alcanzó el 73 y el 21 % de regulación por disminución de la expresión superficial de FGFR2 en líneas celulares mutadas de FGFR2 (AN3-CA y MFE-296, respectivamente), pero no tuvo impacto significativo sobre los niveles de FGFR2 superficial en células SNU16 y MFM223. MAB684 y MAB6843 indujeron de nuevo aproximadamente el 60 % de reducción de niveles superficiales de FGFR2 en líneas celulares mutadas de FGFR2 sin efectos importantes sobre líneas celulares que expresan en exceso FGFR2. Finalmente, MAB665 no mostró ningún impacto en absoluto sobre niveles superficiales de FGFR2.
Resumiendo, los anticuerpos anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 son los únicos anticuerpos anti-FGFR2 que inducen regulación por disminución de la superficie de FGFR2 en líneas de células cancerosas independientemente de la expresión en exceso o mutación de FGFR2.
EJEMPLO 11: Regulación por disminución de niveles de FGFR2 total después de incubación a largo plazo de células cancerosas con anticuerpos anti-FGFR2 Para analizar si la regulación por disminución de la superficie de FGFR2 inducida por anticuerpos anti-FGFR2 conduce o no a disminución a largo plazo en niveles de FGFR2 totales, los niveles de proteína total de FGFR2 se analizaron por ELISA de FGFR2. Se sembraron células SNU16 a 5000 células/pocilio en placas de 96 pocilios en medio de crecimiento (RPMI 1640 (Biochrome, FG1215) + 10 % de SBF). 2 h después las células se incubaron con anticuerpos anti-FGFR2 a diversas concentraciones como se indica o IgG de control de isotipo correspondiente. 96 h después del inicio de la incubación con los anticuerpos, las células se centrifugaron durante 5 min a 300 g a temperatura ambiente, se lavaron dos veces en PBS y se lisaron mediante la adición de 100 µ? de tampón de lisis (Hepes 50 mM a pH 7,2, NaCI 150 mM, MgCI2 1 mM, Na4P207 10 mM, NaF 100 mM, 10 % de glicerina, 1 ,5 % de Tritón X-100, mezcla completa de inhibidores de proteasas recientemente añadida (Roche n° 1873580001), Na3V04 4 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH) y agitación durante 5 min a temperatura ambiente. Se congelaron muestras criogénicamente y se aguardaron a -80 °C hasta análisis usando el kit de ELISA de FGFR2 total (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió a 450 nm (Tecan Spectra, Rainbow) junto con corrección del ruido de fondo. Para calcular niveles absolutos de FGFR2 total, la curva patrón usando proteína FGFR2 aislada se aplicó según las recomendaciones del fabricante (R&D Systems). Los resultados se representan como el % de niveles de FGFR2 medidos en células de control que se incubaron durante 96 h en ausencia de anticuerpo.
Los resultados se presentan en la Figura 5. La incubación con anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención durante 96 h conduce a una reducción del 41-55 % de los niveles de FGFR2 total. La reducción al 50 % se alcanza a la dosis de 3 g/ml de los anticuerpos anti-FGFR2. A diferencia, la incubación con anticuerpo de control de isotipo no tiene efecto sobre los niveles de FGFR2 total.
Tomados conjuntamente, estos resultados indican que los anticuerpos anti-FGFR2 M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 no solo conducen a una disminución a corto plazo en los niveles de FGFR2 superficial, sino también a una reducción a largo plazo de los niveles de FGFR2 total.
EJEMPLO 12: Internalización de anticuerpos anti-FGFR2 en células Los anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención se analizaron para ver su capacidad para internalizar después de unirse al antígeno de FGFR2.
Para visualizar este procedimiento se seleccionaron anticuerpos para FGFR2 específicos M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 y un anticuerpo de control de isotipo. Los anticuerpos se conjugaron en presencia de un doble exceso molar de monoéster de NHS CypHer 5E (lote 357392, GE Healthcare) a pH 8,3. Después de la conjugación, la mezcla de reacción se dializó (casetes de diálisis slide-A-Lyser MWCD 10kD, empresa Pierce) durante la noche a 4 °C para eliminar el colorante en exceso y ajustar el valor de pH. Después se concentró la disolución de proteína (VIVASPIN 500, empresa Sartorius stedim biotec). Además del colorante fluorescente dependiente del pH CypHer5E se usó el colorante independiente del pH Alexa 488. La carga de colorante del anticuerpo se determinó con un espectrofotómetro (empresa NanoDrop). La carga de colorante de M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 y el control de isotipo (M014) estuvieron en un intervalo similar. La afinidad de los anticuerpos marcados se probó en un ensayo de unión a célula para garantizar que el marcado no alteró la unión a FGFR2. Estos anticuerpos marcados se usaron en los siguientes ensayos de internalización. Antes del tratamiento, las células (2x104/pocillo) se sembraron en 100 µ? de medio en una 96-MTP (grande, negra, fondo transparente n° 4308776, empresa Applied Biosystems). Después de 18 h de incubación a 37 °C/5 % de CO2, el medio se cambió y se añadieron anticuerpos anti-FGFR2 marcados M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 a diversas concentraciones (10, 5, 2,5, 1, 0,3, 0,1 pg/ml). Se llevó a cabo un tratamiento idéntico con el anticuerpo de control de isotipo (control negativo). El tiempo de incubación se eligió para ser 0, 5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h y 24 h. La medición de la fluorescencia se realizó con InCellAnalyser 1000 (empresa GE Healthcare). Los recuentos de gránulos y la intensidad de fluorescencia total se midieron en un modo cinético.
Se observó una internalización altamente específica y significativa de M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 en líneas de células cancerosas que expresan FGFR2 endógeno SNU16 (cáncer gástrico) y SUM52PE (cáncer de mama).
Esta internalización fue dependiente de la diana ya que solo pudo demostrarse captación usando los anticuerpos anti-FGFR2 mientras que no se observó internalización con los controles de isotipo. Durante las 6 primeras horas, los anticuerpos anti-FGFR2 mostraron un aumento de 20-40 veces de la internalización de anticuerpos en comparación con controles de isotipo. El control de isotipo mostró una menor internalización después de una larga exposición (>24 h).
La internalización de anticuerpos anti-FGFR2 marcados con Alexa 488 tras la unión revela que más del 50 % de los anticuerpos internalizados parece seguir la ruta endocitótica.
En la Figura 6 se muestra una evaluación microscópica del transcurso temporal de la internalización específica de M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 tras la unión a células endógenas que expresan FGFR2. La internalización de anticuerpos (2,5 pg/ml) se investigó en la línea de células de cáncer de mama SUM 52PE. Los recuentos de gránulos se midieron en un modo cinético. La rápida internalización podría observarse para M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 , mientras que la hlgG1 de control de isotipo no internaliza.
Una evaluación más detallada de la ruta de tráfico se realizó con co-tinción de proteínas G pequeñas. Las Rab GTPasas regulan muchas etapas del tráfico de membranas, que incluyen formación de vesículas, movimiento de vesículas a lo largo de redes de actina y tubulina, y fusión de membranas. Para distinguir entre diferentes rutas se seleccionaron dos proteínas Rab para la tinción - Rab7, que se expresa en endosomas y lisosomas tardíos, y Rab 11 , que se expresa en endosomas tempranos y de recirculación. Después de una internalización de 6 h de anticuerpos marcados, las células se fijaron y se permeabilizaron con metanol antes de la tinción con anticuerpos para Rab 7 y Rab 11. Los resultados se muestran en la Figura 7.
M048-D01-hlgG1 y M047-D08-hlgG1 muestran una co-tinción significativa con Rab 7, mientras que la co-tinción con Rab 11 es solo menor. Estos resultados indican que después de la ¡nternalización de FGFR2, el complejo entra en la ruta endosómica - lisosómica.
El patrón de tinción para otros anticuerpos descritos como GAL-FR21 y GAL-FR22 (documento WO2010/054265 y Zhao y col. (Clin Cáncer Res. 2010,16: 5750-5758)) parece completamente diferente. Aquí, casi no podría detectarse tinción con Rab7, pero se logró una co-tinción importante con Rab11. Esto indica que estos anticuerpos se internalizan después de unirse al receptor FGFR2 y favorecen la ruta de recirculación.
EJEMPLO 13: Prueba de anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención en tumores experimentales en modelo de ratón La eficacia in vivo de los anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención se probó, por ejemplo, mediante modelos de tumor xenógeno o alógeno subcutáneo. El experto conoce procedimientos de la técnica anterior con el fin de demostrar la eficacia de los innovadores anticuerpos. Por ejemplo, por tanto, se inocularon ratones subcutáneamente con células tumorales que expresan el FGFR2 diana. Después, los ratones portadores del tumor tanto se trataron con anticuerpos que eligen FGFR2 como diana de la presente invención, control de isotipo de no unión como solución salina tamponada con fosfato (PBS). La aplicación de anticuerpos se llevó a cabo intraperitonealmente o intravenosamente dos veces a la semana. Con el fin de probar la eficacia antitumoral aditiva, los Abs para FGFR2 de la presente invención se combinaron con tratamientos de referencia comunes y se compararon con las eficacias de agentes individuales. El crecimiento tumoral se controló por medición frecuente del área del tumor mediante un compás calibrador. Después del crecimiento tumoral y el tratamiento durante algunas semanas, los tumores se recogieron y los pesos de los tumores o tamaños de los tumores (área del tumor calculada por la fórmula longitud x anchura) de animales tratados con los anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención se compararon con aquellos tratados con PBS o anticuerpos de control de isotipo. Los ratones tratados con los anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención mostraron tumores significativamente más pequeños.
Células tumorales humanas o murinas que expresan FGFR2 se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones inmunodeprimidos, por ejemplo, ratones Nude o SCID. Por ratón, 0,25-10 millones de células se desprendieron de matraces de cultivo celular, se centrifugaron y se suspendieron en 100 µ? de PBS, 50 % de medio / 50 % de Matrigel, o 100 % de Matrigel, respectivamente. Entonces, las células se inocularon subcutáneamente por debajo de la piel sobre el flanco de los ratones. En el caso de modelos de tumor derivados de paciente, los tumores recogidos de pacientes con cáncer gástrico se sometieron subcutáneamente a pases en ratones inmunodeprimidos. Para probar la eficacia de los anticuerpos anti-FGFR2, trozos de tumor de un tamaño definido (2 x 2 mm) se trasplantaron subcutáneamente en el flanco de ratones. En el transcurso de un par de días se estableció un tumor. El tratamiento empezó antes si los tumores alcanzaron un tamaño de 20 mm2 (tumores derivados de línea celular) o 100 mm3 (tumores derivados de paciente), por lo que el área del tumor (mm2) se calculó por la fórmula longitud x anchura y el volumen del tumor (mm3) por la fórmula longitud x anchura2 / 2. El tratamiento con los anticuerpos se realizó tanto intraperitonealmente como intravenosamente mediante inyección en la vena de la cola. Los anticuerpos tanto se disolvieron en PBS como en acetato de Na 50 mM, NaCI 150 mM. Los anticuerpos se aplicaron en un volumen de 10 ml/kg. El programa de tratamiento se basó en el comportamiento farmacocinético del anticuerpo. Como norma, los anticuerpos se aplicaron dos veces a la semana (alternativamente cada tres y cuatro días). Como norma, el tratamiento se realizó hasta que el grupo de control alcanza el máximo tamaño del tumor posible. Alternativamente, el tratamiento se detuvo antes. Como norma, se usaron 8 ratones por grupo de tratamiento. El número de ratones por grupo de tratamiento puede aumentarse, si se esperan mayores variaciones en el crecimiento tumoral. En paralelo con los grupos de tratamiento, un grupo de control se trató con PBS siguiendo el mismo programa de tratamiento. Durante el estudio, el área del tumor se evaluó frecuentemente midiendo la longitud y anchura de tumores usando un compás calibrador. Al final del estudio, los tumores se recogieron y se pesaron. La relación de pesos medios de los tumores de los grupos tratados con anticuerpo (T) y los pesos medios de los tumores del control (C) se establecieron como T/C. Si los grupos de tratamiento y de control terminaron en diferentes momentos de tiempo o el peso del tumor no pudo usarse como dato de medición ya que los tumores se volvieron necróticos, las relaciones T/C se calcularon basándose en el área del tumor del último momento de tiempo de medición común. 2 millones de células SNU-16 de cáncer gástrico humano en 50 % de medio / 50 % de Matrigel se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones nodSCID hembra. El tratamiento intraperitoneal con los anticuerpos anti-FGFR2 empezó cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 20-30 mm2 y continuó dos veces a la semana hasta el fin del estudio. Si tumores del grupo de control alcanzaron el máximo tamaño aceptable, el estudio terminó y los tumores se recogen y se pesan.
Todos los anticuerpos anti-FGFR2 probados de la presente invención redujeron significativamente el crecimiento tumoral con respecto al control. El tratamiento con una dosis de 2 mg/kg de M017-B02-hlgG1 , M021-H02-hlgG1 , M048-D01-hlgG1 , M054-A05-hlgG1 , M054-D03-hlgG1 y 047-D08-hlgG1 produjo T/C de 0,19, 0,22, 0,17, 0,19, 0,21 y 0,22, respectivamente (véanse las Figuras 8 a 13). 2,5 x 105 células 4T1 murinas de cáncer de mama se inocularon subcutáneamente en 100 % de PBS en el flanco de ratones NMRI nu/nu. Se eligieron ratones inmunodeprimidos en lugar de singénicos con el fin de evitar el desarrollo de anticuerpos neutralizantes contra la proteína IgG humana. El tratamiento de tumores empezó en el momento en el que los tumores habían alcanzado un tamaño medio de 24 mm2. Con el fin de probar la posible eficacia antitumoral aditiva de M048-D01-hlgG1 , los ratones tanto se trataron con M048-D01-hlgG1 , lapatinib o taxol, respectivamente, solos y en combinación con M048-D01-hlgG1 y taxol o Lapatinib. Como control, los ratones se trataron con PBS solo. El tratamiento con M048-D01-hlgG1 se llevó a cabo dos veces a la semana intravenosamente (i.v.), lapatinib una vez diariamente por vía oral (p.o.) y taxol una vez a la semana intravenosamente. Todos los tratamientos se realizaron hasta el fin del estudio. Como los tumores se volvieron necróticos al final del estudio, el área del tumor en el día 13 después de la inoculación de células tumorales se usó para determinar la eficacia antitumoral. Este estudio reveló que la combinación de M048-D01-hlgG1 con tanto lapatininb como taxol alcanzó eficacia antitumoral aditiva: la monoterapia con lapatinib y taxol, respectivamente, no cambió significativamente el crecimiento de tumores con respecto al control de vehículo, mientras que M048-D01-hlgG1 solo produjo reducción significativa con respecto a vehículo con una T/C de 0,73. La combinación con lapatinib y taxol redujo esta T/C a 0,58 y 0,52, ambos estadísticamente significativos frente a ambas monoterapias (véanse las Figuras 14 y 15).
Trozos de 2 x 2 mm de tumores gástricos derivados originalmente de pacientes, GC10-0608 y GC12-0811 (Prof. Huynh Hung, Universidad Nacional de Singapur (ÑUS)), sometidos a pases en ratones inmunodeprimidos, se trasplantaron subcutáneamente en ratones sin tratamiento previo inmunodeprimidos hembra. El tamaño del tumor se evaluó frecuentemente usando un compás calibrador que medía el tumor en dos dimensiones y el volumen del tumor se calculó por la fórmula longitud x anchura2 / 2. El tratamiento con diferentes dosis de M048-D01-hlgG1 se inició en el momento en el que los tumores alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 100 mm3. El tratamiento se realizó intravenosamente dos veces a la semana con dosis de 5, 2 y 1 mg/kg de M048-D01-hlgG1. En un modelo de tumor con alta expresión de proteínas FGFR2 (GC10-0608), las tres dosis produjeron reducción significativa del crecimiento tumoral produciendo valores de T/C basados en el peso del tumor final de 0,55, 0,60 y 0,41 (véase la Figura 16). En un modelo con expresión de proteínas FGFR2 marcadamente menor (GC12-0811), 5 y 2 mg/kg de M048-D01-hlgG1 produjeron reducción significativa del peso del tumor produciendo T/C de 0,70 y 0,67 (véase la Figura 17). Según la menor expresión de FGFR2, 1 mg/kg de M048-D01-hlgG1 no produjo reducción significativa del peso del tumor final. Para el tratamiento de otros dos modelos de tumor, el modelo de cáncer de mama MFM223 y el modelo de cáncer colorrectal NCI-H716 (ATCC-CCL-251), los presentes inventores no han encontrado un esquema de aplicación apropiado para reducir significativamente el crecimiento tumoral.
EJEMPLO 14: Regulación por disminución de FGFR-F y niveles de FGFR2 total en tumores de xenoinjerto después del tratamiento con anticuerpos anti-FGFR2 Para analizar si la regulación por disminución observada de niveles de FGFR2 total y la simultánea reducción en FGFR2-F también se observa en tumores de xenoinjerto in vivo, tumores SNU-16 después del tratamiento con anticuerpos anti-FGFR2 se analizaron por transferencia Western. Los tumores se recogieron al final de un experimento de xenoinjerto en ratones NOD/SCID, se trataron con anticuerpos anti-FGFR2 a 2 mg/kg i.p. dos veces a la semana (véase el Ejemplo 13 para detalles). Los tumores se tomaron 24 h después de la última inyección de los anticuerpos, se congelaron criogénicamente en nitrógeno líquido y se guardaron a -80 °C hasta análisis. Antes de los análisis de transferencia Western, los tumores congelados se cortaron en rebanadas de aproximadamente 5 mm de diámetro y cada rebanada se depositó en un tubo Eppendorf de 2 mi junto con una bola de acero de 5 mm previamente enfriada (Qiagen) y 500 µ? de tampón de lisis (Hepes 50 mM a pH 7,2, NaCI 150 mM, MgCI2 1 mM, Na4P207 10 mM, NaF 100 mM, 10 % de glicerina, 1 ,5 % de Tritón X-100, mezcla completa de inhibidores de proteasas recientemente añadida (Roche n° 1873580001), Na3V04 4 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH). Las muestras se lisaron durante 3 min a 300 Hz en un Tissuelyzer (Qiagen) seguido de incubación sobre hielo durante 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 13000 rpm a 4 °C en una microcentrífuga (Eppendorf) y los sobrenadantes de las rebanadas procedentes de un tumor original se reunieron juntos de nuevo. Los niveles de proteína en los lisados de tumor se determinaron usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Novagen, lisados 1 :50 diluidos en H2O). Las muestras se diluyeron a una concentración final de 5 mg/ml y 50 µ? de muestra se mezclaron con 7,7 µ? de (10*) agente reductor de muestra y 19,2 µ? (4*) de tampón de muestra NuPAGE (Invitrogen). Muestras correspondientes a 115 pg de proteína se aplicaron a geles al 4-12 % de SDS-PAGE NuPage de Invitrogen y se ejecutaron durante 2 h 45 min a 120 V. La transferencia se llevó a cabo por un sistema ¡Blot (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. Las membranas se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente en 5 % de QuickBlocker BLOT en PBST (Invitrogen), seguido de incubación con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: FGFR-F: n° AF3285, R&D Systems, 0,5 pg/m; FGFR2 total: M017-B02-hlgG1 , 4 µg ml en 3 % de QuickBlocker BLOT en PBST. Al día siguiente, las membranas se lavaron tres veces en PBST, seguido de incubación con anticuerpos secundarios (anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de conejo AffiniPure conjugado con peroxidasa (H+L) (Jackson ImmunoResearch n° 111-035-003 o anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana AffiniPure conjugado con peroxidasa + IgM (H+L) (Jackson ImmunoResearch n° 109-035-127, 1 :10000 en 3 % de BLOT QuickBlocker/PBST) durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se lavaron cuatro veces durante 10 min con PBST y las señales se detectaron por quimioluminiscencia después de la incubación con reactivo ECL. Para detectar el control de carga, las membranas se arrastraron con disolución de arrastre fuerte (1 :10 en hfeO Milipore) durante 15 min de agitación a temperatura ambiente, seguido de bloqueo y detección con anticuerpo anti-actina n° A2066 (Sigma) 1 :1000 en 3 % de QuickBlocker/PBST.
Resultados representativos de 2 animales por grupo tratados con anticuerpos anti-FGFR2 se muestran en la Figura 18 lado a lado con muestras de animales tratados con IgG de control. Niveles de FGFR2 total, además de niveles de FGFR-F, se redujeron fuertemente después del tratamiento con anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención. Así, el modo de acción de la regulación por disminución de FGFR2 total descrito en los estudios in vitro también es relevante en tumores de xenoinjerto después del tratamiento con anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención.
EJEMPLO 15: Modelo de cáncer de xenoinjerto subcutáneo con conjugados de anticuerpo-fármaco Los anticuerpos anti-FGFR2 pueden conjugarse con moléculas pequeñas citotóxicas usando protocolos que se conocen en la técnica (por ejemplo, Liu y col., Proc Nati. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623). Células A431 se mantienen como cultivos adherentes en DMEM complementado con 10 % de SBF. Ratones NOD SCID u otros inmunodeprimidos de 6-7 semanas de edad se inocularán subcutáneamente en el flanco derecho con 1-5 x 10e6 células en 0,1 mi de medio. Cuando los tamaños de los tumores alcanzan aprox. 25 mm2, los conjugados de anticuerpo-fármaco se administrarán intraperitonealmente 3x cada 4, 7 ó 10 días a una dosis de 1-10 mg/kg. Los ratones de control se tratarán con PBS o un anticuerpo monoclonal irrelevante conjugado con el mismo toxóforo. El tamaño del tumor se medirá dos veces a la semana con un compás calibrador deslizante. La eficacia antitumoral se evaluará comparando el tamaño del tumor del tratamiento con conjugado de anticuerpo anti-FGFR2-fármaco frente al tratamiento de control.
EJEMPLO 16: Generación de variantes maduradas de anticuerpos seleccionados con afinidades mejoradas Los anticuerpos anti-FGFR2 de la presente invención descubiertos por expresión en fago como se representa en la Tabla 9 se optimizaron adicionalmente por maduración por afinidad.
Tabla 9: Secuencias de anticuerpos descubiertas por expresión en fago La maduración por afinidad de anticuerpos es un procedimiento de dos etapas en el que se combinan mutagénesis de saturación y cribado de alto rendimiento basado en pocilios para identificar un pequeño número de mutaciones que producen aumentos de afinidad. En la primera ronda de maduración por afinidad, la diversificación posicional del anticuerpo natural se introdujo por mutagénesis dirigida específica de sitio sitio usando casetes de trinucleótidos NNK (en donde N representa un 25 % de mezcla de cada uno de los nucleótidos de adenina, timina, guanina y citosina y K representa un 50 % de mezcla de cada uno de los nucleótidos timina y guanina) según BMC Biotechnology 7: 65, 2007. De esta forma, los 20 aminoácidos se introducen en una posición de aminoácido individual. Esta aleatorización posicional está limitada a las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR). En la segunda ronda de maduración por afinidad se recombinaron sustituciones beneficiosas y se cribaron para mejoras adicionales. Ejemplos de tales variantes se representan en la Tabla 10.
Tabla 10: Secuencias de anticuerpos de variante derivadas de M048-D01 y M047- D08, respectivamente Se usaron dos tipos de ELISA diferentes para determinar la mejora de la unión de variantes mutadas: a) ELISA de unión a péptidos: un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos del epítopo ligada por el extremo C a una lisina biotinilada RPSFSLVEDTTLEPEG-Ttds-Lys(biotina) (secuencia de péptidos derivada de SEC ID N°: 63, sintetizada por JPT Peptide Technology GmbH, Berlín, Alemania), y b) ELISA de unión a proteína recombinante: FGFR2 humano recombinante (secuencia de ADN de FGFR2 humano (NP_000132,3 ) Met 1 - Glu 377, fusionada con una marca de polihistidina en el extremo C; n° 10824-H08H, Sino Biological Inc., Beijing, China).
Brevemente, en ambos formatos de ELISA, placas MTP (Maxisorp de 384 pocilios, Nunc) se recubrieron con 20 µ? de IgG anti-humana específica para Fe (n° 12136; Sigma) a 2,2 g/ml durante 2,5 h a 37 °C en tampón de recubrimiento (n° 121125 Candor Bioscience GmbH). Después de una etapa de lavado usando 50 µ? de PBST (solución salina tamponada con fosfato, NaCI 137 mlvl, KCI 2,7 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 2 mM, pH 7,4, 0,05 % de Tween 20), las placas se bloquearon con 50 µ? de 10 % de Smart Block (n° 113500, Candor Bioscience GmbH) durante 1 h a 20 - 22 °C y la etapa de lavado se repitió 3 veces. Las variantes anti-FGFR2 se inmovilizaron en concentraciones de 0,035 g/ml (ensayo basado en péptidos) o 0,2 pg/ml (ensayo basado en proteínas FGFR2 humanas recombinantes) en 10 % de Smart Block en PBST dependiendo del formato y variantes a analizar por incubación de 20 µ? durante una hora a 20 - 22 °C. Después de una etapa de lavado usando 50 µ? de PBST se añadieron cuádruplos de 20 µ? de series de dilución del antígeno en 10 % de SmartBIock en PBST con una concentración máxima de 100 nM y se incubaron durante 1 h a 20 - 22 °C y la etapa de lavado se repitió 3 veces. Para la detección del péptido del epítopo biotinilado, se aplicaron 20 µ? de conjugado de estreptavidina / POD (n° S5512, Sigma) en una dilución 1 :1000 en 10 % de SmartBIock en PBST durante una hora a 20 - 22 °C. Para la detección de la proteína FGFR2 recombinante, 20 µ? de conjugado de anti-His / HRP (n° 71840, Novagen) en una dilución 1 :10000 en 10 % de SmartBIock en PBST se aplicaron durante una hora a 20 - 22 °C. Después de 3 etapas de lavado se añadieron 20 µ? de sustrato Amplex Red 10 µ? (n° A12222, Invitrogen) en hidrogenofosfato de sodio 50 mM, pH 7,6, y la señal de fluorescencia se detectó usando un lector de fluorescencia común, por ejemplo, Tecan M1000. Los valores de CE50 se evaluaron ajusfando los datos (respuesta a dosis sigmoide, pendiente variable, base fijada al ruido de fondo; software GraphPad Prism).
En la Tabla 10 se proporcionan varios ejemplos de variantes con sustituciones de aminoácidos generadas en las cadenas pesadas y ligeras de M048-D01 (TPP-1403). Todas las variantes mostraron una fuerte mejora en la unión al antígeno evaluada en dos formatos de ELISA con diferentes formas de antígeno en comparación con la variante cambiada no CDR (Tabla 11).
En la Tabla 10 se proporcionan varios ejemplos de variantes con sustituciones de aminoácidos generadas en las cadenas pesadas y ligeras de M047-D08 (TPP-1415). Todas las variantes mostraron una mejora significativa en la unión al antígeno en comparación con la variante cambiada no CDR (Tabla 11).
Las diferencias entre ambos formatos con respecto a los resultados numéricos, CE50 y el factor de mejora, fueron inesperadas, pero probablemente pueden explicarse por el uso de antígeno en forma de péptido o proteína y diferencias en la formación del conjugado de enzima finalmente detectada en la parte superior del sándwich de ELISA: no se conoce la KD del conjugado anti-His-HRP y el FGFR2 marcado con His, pero es muy probable que sea órdenes de magnitud superior a la KD de biotina y estreptavidina (10-15 M) utilizada en la detección del péptido del epítopo. Por consiguiente, la sensibilidad para el péptido encontrado es significativamente superior a la sensibilidad para la proteína marcada con His, conduciendo a la posibilidad de determinar CE50 más pequeñas. Además, o alternativamente, las diferencias pueden producirse por desviaciones en la interacción del anticuerpo anti-FGFR2 con ambos antígenos a pesar de su secuencia idéntica sobre un estiramiento de 15 aminoácidos; en primer lugar, la química del extremo C que sigue a parte de las moléculas es muy diferente, en segundo lugar los 15 aminoácidos podrían adoptar una conformación 3D no idéntica a la región correspondiente en la proteína FGFR2. Ambas explicaciones podrían referirse a las diferencias entre el ELISA basado en péptidos y proteínas que muestran valores de CE50 más pequeños en el formato de ELISA de péptidos.
Los conjuntos de datos en la Tabla 11 indican claramente que M048-D01 (TPP-1403) se une a FGFR2 en su secuencia del extremo N como se representa en el péptido del epítopo, y que varias variantes con sustituciones de aminoácidos en las CDR sorprendentemente hacen lo mismo incluso con mayor afinidad. En particular, la sustitución N102I está presente en cinco de las otras seis variantes de TPP-1403 acompañadas por varias otras sustituciones en CDR-L1 , -L2, -L3, -H2 y/o -H3, pero no en TPP-1399 que muestran sorprendentemente una lisina (K) en la posición HC-102.
Los conjuntos de datos en la Tabla 1 1 indican que M047-D08 (TPP-1415) se une a FGFR2 en su secuencia del extremo N como se representa en el péptido del epítopo, y que varias variantes con sustituciones de aminoácidos en las CDR hacen sorprendentemente lo mismo incluso con mayor afinidad. Variantes de M047-D08 (TPP-1415) con múltiples sustituciones de aminoácidos mostraron unión mejorada de aproximadamente cuatro a cuarenta veces, TPP-1409 la que menos (2,1 nM) y TPP- 1406 (0,22 nM) la que más. En particular, tres de ellas tienen una sustitución G102L (TPP- 406, -1407 y -1412) y una sustitución G102V (TPP-1408) acompañada por varias otras sustituciones en CDR-L1 , -L2, -L3, -H1 y/o -H3.
Tabla 11: Resultados de ELISA de unión a péptido, resultados de ELISA de unión a proteína y datos de eficacia de internalización de anticuerpos de variante derivados de M048-D01 y M047-D08, respectivamente (continuación) Además, en la Tabla 11 se resumen las mejoras de eficacia de internalización de anticuerpos anti-FGFR2 madurados. El factor de mejora se calcula basándose en la comparación de la intensidad de gránulos totales/célula alcanzada por la internalización y degradación de anticuerpos madurados para el valor correspondiente del anticuerpo parental. Se consiguen hallazgos iguales por comparación del recuento de gránulos/célula que producen la clasificación idéntica de anticuerpos. Detalles experimentales se describen en el Ejemplo 12. En particular, todas las variantes maduradas de M048-D01 (TPP-1403) mostraron una eficacia de internalización mejorada (1 ,9 a 2,4 veces). En el caso de M047-D08 (TPP-1415), la variante TPP-1412 mostró una eficacia de internalización mejorada de 1 ,5 veces. La internalización es una característica importante de los anticuerpos de la presente invención.
Con las variantes proporcionadas para M047-D08 y M048-D01 podría demostrarse claramente que las variantes de estos anticuerpos pueden tener propiedades similares o mejoradas si el epítopo se mantiene.
EJEMPLO 17: Determinación de la competición con otros anticuerpos anti-FGFR2 Para analizar la competición entre anticuerpos anti-FGFR2 según la invención y anticuerpos anti-FGFR2 descritos en la materia, se evaluaron diferentes anticuerpos en un formato de ELISA competitivo.
Placas TP (Maxisorp de 384 pocilios, Nunc) se recubrieron con 20 µ? de 2 pg/ml de IgG anti-humana específica para Fe (n° 12136; sigma) en tampón de recubrimiento (n° 121125 Candor Bioscience GmbH) a 4 °C durante la noche. Después de una etapa de lavado usando 50 µ? de PBST (solución salina tamponada con fosfato, NaCI 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 2 mM, pH 7,4, 0,05 % de Tween 20), las placas se bloquearon con 50 µ? de 100 % de Smart Block (n° 113500, Candor Bioscience GmbH) durante 1 h a 20 - 22 °C y la etapa de lavado se repitió 3 veces. Se inmovilizó M048-D01-hlgG1 a concentraciones de 1 Mg/ml en 10 % de Smart Block en PBST por incubación de 20 µ? durante una hora a 20 - 22 °C (indicado en la Tabla 12; fila 2 con captura de M048-D01-hlgG1 sí); se incubaron pocilios de control sin M048-D01-hlgG1 con 10 % de Smart Block en PBST solo (indicado en la Tabla 12; fila 2 con captura de M048-D01-hlgG1 no). La etapa de inmovilización fue seguida de tres etapas de lavado usando 50 µ? de PBST. Se añadieron cuádruplos de 20 µ? de la mezcla de antígeno / anticuerpo pre-incubada (1 h a 20 - 22 °C) compuesta por FGFR2 humano recombinante, 10 nM (n° 10824-H08H, SinoBiologic) e IgG anti-FGFR2 en una serie de dilución de 5 veces (1000 a 0,064 nM) en 10 % de SmartBIock en PBST y se incubaron durante 1 h a 20 - 22 °C, seguido de tres etapas de lavado.
Para la detección del FGFR2 humano recombinante, 20 µ? de conjugado de anti-His / HRP (n° 71840, Novagen) en una dilución 1 :10000 en 10 % de SmartBIock en PBST se aplicaron durante una hora a 20 - 22 °C. Después de 3 etapas de lavado se añadieron 20 µ? de sustrato Amplex Red 10 µ? (n° A12222, Invitrogen) en hidrogenofosfato de sodio 50 mM, pH 7,6, y la señal de fluorescencia se detectó usando un lector de fluorescencia común, por ejemplo, Tecan M1000.
Se han descrito tres anticuerpos de unión a FGFR2 diferentes llamados GAL- FR21 , GAL-FR22 y GAL-FR23 (descritos en el documento WO2010/054265 y Zhao y col. (Clin Cáncer Res. 2010,16:5750-5758)) para unirse a diferentes epitopos de dominio. Para la evaluación de diferencia con estos anticuerpos se realizaron ensayos de competición.
Debido a los diferentes isotipos de los anticuerpos analizados, el formato de ELISA de competición tiene que garantizar una detección igualmente y directamente comparable de la situación de competición sin superposición de efectos adicionales debido al uso de diferentes anticuerpos de detección o diferentes afinidades de un único anticuerpo de detección para los diferentes isotipos de IgG. El formato de ELISA descrito anteriormente satisface este criterio por detección del antígeno de FGFR2 mediante su marca de His en lugar de la detección de lgG1 o lgG2a de ratón o humana unida. La inmovilización de M048-D01-hlgG1 es específica con respecto a su porción Fe humana, de otro modo cantidades significativas de FGFR2 se habrían detectado en pocilios de placas de ELISA recubiertos con IgG anti-humana (específica para Fe), pero no suministrados con M048-D01-hlgG1 ; no se detectó una posible unión de anti-FGFR2-lgG de ratón a IgG anti-humana (específica para Fe) y posterior unión de FGFR2 (Tabla 12, columnas 8 - 11). Adicionalmente, no se observó unión significativa no específica de FGFR2 a la IgG anti-humana inmovilizada (específica para Fe) (columna 2). La "auto-competición" de M048-D01-hlgG1 funcionó muy claramente (columna 6), y lo mismo es cierto para M048-D01-mlgG2a, (columna 7). La observación de que ni GAL-FR21 , -FR22 ni -FR23 mostraran reducción dependiente de la dosis en FGFR2 detectable (columna 3 - 5) como M048-D01-hlgG1 y M048-D01-mlgG2a hecha con una señal disminuida >50 % a 1 ,25 y 0,63 nM y mayores concentraciones de anticuerpo competente, respectivamente, demuestra las diferencias entre M048-D01 y los tres anticuerpos para GAL. A diferencia, después de la pre-incubación de FGFR2 monomérico (10 nM) con GAL-FR22 y GAL-FR23, pero no con GAL-FR21, la cantidad de FGFR2 detectable pareció ser significativamente elevada. Como los anticuerpos para GAL no están ni fusionados con una marca de His, comprobado por análisis de Western, ni capturados por la IgG anti-humana (específica para Fe), la explicación más probablemente es que FGFR2 monomérico puede dimerizarse por la pre-incubación con anticuerpos lo que conduce a un efecto de avidez en la posterior unión de FGFR2 a M048-D01-hlgG1 inmovilizado. La situación de M048-D01-hlgG1 inmovilizado unido directamente a FGFR2 y mediado por esto indirectamente a los anticuerpos dimerizantes GAL-FR22 y GAL-FR23 ilustraría adicionalmente que M048-D01-hlgG1 se une a un epítopo de FGFR2 completo diferente de los anticuerpos GAL, de otro modo no podría producirse un evento de unión simultánea. En particular, GAL-FR21 no aumentó la cantidad de FGFR2 detectable. Esta diferencia puede interpretarse plausiblemente teniendo en cuenta la descripción más particular de los anticuerpos GAL como se describe en el documento WO2010/054265: Gal-FR22 se une a un epítopo en D2-D3llla, y GAL-FR23 se une a uno total o parcialmente localizado en D1 ; ambas regiones representadas en la molécula de FGFR2-lllc humana recombinante usada. Pero para GAL-FR21 se describe que el epítopo se localiza en D3-lllb, un estiramiento de secuencia no representado en esta isoforma de FGFR2-lllc; por consiguiente, GAL-FR21 no puede unirse al antígeno y mediar en un efecto de avidez. Como se muestra, en ninguno de los ensayos se observó la competición entre M048-D01-hlgG1 y uno de los anticuerpos para GAL.
Tabla 12: ELISA de competición de anticuerpos. Las señales promedio se facilitan con respecto al valor correspondiente para FGFR2 10 nM determinado en la serie de calibración (columna 1) Los resultados de experimentos de competición, como se han descrito anteriormente, están respaldados por la observación de que los tres anticuerpos para GAL que incluyen GAL-FR23 (epítopo total o parcialmente localizado en D1) no muestran unión al péptido sintético del epítopo del extremo N extracelular de FGFR2 (SEC ID N°: 63) que comprende la secuencia de aminoácidos del epítopo del extremo C ligado a una lisina biotinilada (1RPSFSLVEDTTLEPE15G-Ttds-Lys(biotina)) incluso a la mayor concentración en la serie de valoración de IgG aplicada (600 nM), mientras que la fuerte unión de M048-D01-hlgG1 (detectada por el conjugado de IgG anti-humana (específica para Fe) / POD; n° A5175, sigma) y M048-D01-mlgG2a produjo CE50 en el intervalo =1 nM (datos detallados no mostrados). Para la detección de anticuerpos de ratón se usó conjugado de IgG antiratón (específica para Fe) / POD (n° 715-35-15, jakson), comprobado positivamente para su capacidad para detectar GAL-FR21, -FR22, -FR23 y M048-D01-mlgG2a unido a FGFR2-lllb alfa.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo caracterizado porque reduce la expresión de FGFR2 en la superficie celular después de unirse a FGFR2 en líneas celulares SNU16 (ATCC-CRL-5974) y MFM223 (ECACC-98050130) que expresan en exceso FGFR2 y en líneas celulares AN3-CA (DSMZ-ACC 267) y MFE-296 (ECACC-98031101) que expresan FGFR2 mutado.
2. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo caracterizado porque se une específicamente al epítopo del extremo N extracelular (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 como se presenta con SEC ID N°: 63.
3. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 2, caracterizado porque la unión del anticuerpo al epítopo del extremo N extracelular (SEC ID N°: 63) está mediada por al menos un residuo de epítopo seleccionado del grupo de residuos constituido por Arg 1 , Pro 2, Phe 4, Ser 5, Leu 6 y Glu 8.
4. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 2 - 3, caracterizado porque pierde más del 50 % de su señal de ELISA al transformar al menos uno de los residuos de aminoácidos en el epítopo del extremo N (1 RPSFSLVEDTTLEPE15) de FGFR2 en una alanina a. estando dicho residuo seleccionado del grupo Pro 2, Leu 6 y Glu 8, o b. estando dicho residuo seleccionado del grupo Arg 1 , Pro 2, Phe 4 y Ser 5.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque compite en la unión a FGFR2 con al menos un anticuerpo seleccionado del grupo "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP- 1400", "???-1401", "???-1402", "???-1403", "???-1406", "???-1407", "???-1408", "???-1409", "???-1410", "???-1411", "???-1412" y "???-1415".
6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 5, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es al menos el 50 %, 55 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 o el 95 % idéntica a al menos una secuencia de CDR de "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP- 412", o "TPP-1415", o al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 % o el 95 % idéntica a la secuencia de VH o VL de "M048-D01", "M047-D08", "M017-B02", "M021-H02", "M054-A05", "M054-D03", "TPP-1397", "TPP-1398", "TPP-1399", "TPP-1400", "TPP-1401", "TPP-1402", "TPP-1403", "TPP-1406", "TPP-1407", "TPP-1408", "TPP-1409", "TPP-1410", "TPP-1411", "TPP-1412" o "TPP-1415".
7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de CDR o al menos una secuencia de cadena pesada o cadena ligera variable como se representa en la Tabla 9 y la Tabla 10
8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 a 7 caracterizado porque comprende a. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 5-7 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 8-10, o b. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 15-17 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 18-20, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 25-27 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 28-30, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan por SEC ID N°: 35-37 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 38-40, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 45-47 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 48-50, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 55-57 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 58-60, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 75-77 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 78-80, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 85-87 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 88-90, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 95-97 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 98-100, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 105-107 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 108-1 0, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 115-117 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 118-120, o las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 125-127 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 128-130, o m. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 135-137 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 138-140, o n. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 145-147 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 148-150, o o. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 155-157 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 158-160, o p. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 165-167 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 168-170, o q. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 175-177 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 178-180, o r. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 185-187 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 188-190, o s. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 195-197 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 198-200, o t. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 205-207 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 208-210, o u. las secuencias de CDR de cadena pesada variable como se presentan con SEC ID N°: 215-217 y las secuencias de CDR de cadena ligera variable presentadas con SEC ID N°: 218-220.
9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según las reivindicaciones - 8 caracterizado porque comprende una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 1 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 2, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 11 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 12, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 21 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 22, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 31 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 32, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 41 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 42, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 51 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 52, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 73 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 74, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 83 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 84, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 93 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 94, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 103 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 104, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 113 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N0: 114, 0 una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 123 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 124, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 133 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 134, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 143 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 144, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 153 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 154, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 163 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 164, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 173 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 174, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 183 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 184, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 193 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 194, o una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 203 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 204, o u. una secuencia de cadena pesada variable como se presenta con SEC ID N°: 213 y una secuencia de cadena ligera variable como se presenta con SEC ID N°: 214.
10. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo IgG.
11. El fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un fragmento scFv, Fab, Fab' o un fragmento F(ab')2.
12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión alantígeno.
13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es anticuerpo humano, humanizado o quimérico o fragmento de unión a antígeno.
14. Un conjugado de anticuerpo-fármaco, caracterizado porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se define en las reivindicaciones 1 a 13.
15. Una secuencia de ácido nucleico aislada caracterizada porque codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en cualquiera las reivindicaciones 1 a 13.
16. Un vector caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico tal como se deine en la reivindicación 15.
17. Una célula aislada caracterizada porque expresa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y/o que comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 15 o un vector tal como se define en la reivindicación 16.
18. Una célula aislada según la reivindicación 17, caracterizada porque dicha célula es una célula procariota o eucariota.
19. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, el procedimiento estando caracterizado comprende cultivar una célula según la reivindicación 18 y la purificación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
20. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en las reivindicaciones 1 - 13 o un conjugado de anticuerpo-fármaco tal como se define en la reivindicación 14 para uso como un medicamento.
21. Un anticuerpo o antígeno fragmento de unión a antígeno tal como se define en las reivindicaciones 1 - 13 para uso como agente de diagnóstico.
22. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en las reivindicaciones 1 - 13 o un conjugado de anticuerpo-fármaco tal como se define en la reivindicación 14 para uso como un medicamento utiel en el tratamiento de cáncer.
23. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se define en las reivindicaciones 1 - 13 o un conjugado de anticuerpo-fármaco tal como se define en la reivindicación 14.
24. Una combinación que comprende una composición farmacéutica tal como se define en la reivindicación 23 y uno o más compuestos terapéuticamente activos.
25. Un procedimiento para tratar un trastorno o afección asociado a la presencia no deseada de FGFR2 que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica según la reivindicación 23 o de una combinación según la reivindicación 24.
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