KR20180123047A - 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포독성 활성제, 예컨대 키네신 스핀들 단백질 억제제가, 예를 들어, 레구마인에 의해 절단가능한 기에 의해 차폐되어, 활성제를 방출하는 화학식 (Ia)의 신규 전구약물 또는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 질환을 치료하고/거나 예방하기 위한 상기 전구약물 또는 접합체의 용도, 및 질환, 특히 예를 들어 과다증식성 및/또는 혈관신생 장애, 예컨대 암을 치료하고/거나 예방하기 위한 약물을 제조하기 위한 상기 전구약물 또는 접합체의 용도에 관한 것이다.

Description

효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
본 발명은 세포독성 약물, 예를 들어 키네신 스핀들 단백질 억제제가 종양-연관 프로테아제에 의해 선택적으로 절단되어, 약물을 방출하는 기에 접합된 신규 전구약물, 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 이들 전구약물 또는 접합체의 용도, 및 질환, 특히 과다증식성 및/또는 혈관신생 장애, 예를 들어 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 이들 전구약물의 용도에 관한 것이다. 이러한 치료는 단독요법으로서 또는 다른 의약 또는 추가의 치료적 조치와 조합되어 실시될 수 있다.
암 세포는 정상 세포보다 더 높은 정도로 특정한 프로테아제를 빈번하게 발현한다. 이는 암 세포에 대한 세포독성 약물의 선택성을 증가시키기 위한 접근법으로 이어졌으며, 여기서 약물은 이러한 프로테아제에 의해 제거되고, 그 결과로서 활성 성분이 방출되는 기에 결합된다.
이러한 종양-연관 프로테아제는 레구마인이다. 레구마인은 아스파라기닐 엔도펩티다제이고 (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J. M. Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) 소형의 세포독성 분자, 예를 들어 독소루비신 및 특히 에토포시드 유도체의 전구약물을 프로세싱하는 데 이용되었다 (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L.Stern et al.; Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al. ChemMedChem 2011, 6, 54).
US 2015/0343083 A1은 화학식 R-Y-Z-Asn-링커-D의 레구마인-절단가능한 펩티드-활성 성분 접합체를 기재하며, 여기서 링커는 p-아미노벤질카르바모일 또는 p-아미노벤질카르보네이트를 나타내고, R은 상이한 화학적 기로부터 선택된 잔기이고, D는 세포독성 약물이고, Asn은 아미노산 아스파라긴을 나타내고, Y는 Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr 및 Phe로부터 선택된 아미노산을 나타내고, Z는 Ala, Thr, Asn 및 Pro로부터 선택된 아미노산을 나타내고, 여기서 이들 아미노산은 항상 천연 L 배위로 존재한다.
본 발명은 세포독성 약물의 종양 선택성의 개선의 문제에 관한 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 세포독성 약물 분자의 전구약물을 제공한다. 이와 관련하여, 활성 성분 분자는 효소 레구마인에 의해 절단가능한 기에 접합되고, 활성 성분 및 레구마인-절단가능한 기는 공유 결합을 통해 직접 또는 자기 희생적 링커를 통해 연결된다. 이들 전구약물은 바람직하게는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서 (바람직하게는 리소솜에서) 프로세싱되는 결합제를 함유한다. 이러한 결합제는 임의로 링커를 통해 활성 성분 분자에 결합될 수 있고, 이에 따라 둘 다의 기 (레구마인-절단가능한 기 및 결합제)는 활성 대사물의 형성을 위해 독립적으로 프로세싱되어야 하거나, 또는 결합제는 임의로 링커를 통해 효소 레구마인에 의해 절단가능한 기에 결합될 수 있다 (이에 따라, 레구마인-절단가능한 기의 절단 후, 활성 성분은 결합제 또는 그의 유도체와 별개로 존재함). 바람직한 활성 성분 분자는 키네신 스핀들 단백질 억제제 (KSP 억제제)이다. 종양 세포 상의 표적 분자에 결합한 후 내재화되고 세포내에서 (바람직하게는 리소솜에서) 프로세싱되는 바람직한 결합제는 항체이다. 항체-활성 성분 접합체 (ADC)가 특히 바람직하며, 여기서 항체 및 활성 성분은 레구마인-절단가능한 기를 갖는 링커를 통해 서로 연결된다. 또한, 전구약물과 항체의 접합체 (APDC)가 바람직하며, 여기서 항체는 링커를 통해 항체의 전구약물에 결합되고, 활성 성분의 작용은 레구마인-절단가능한 기에 의해 차폐된다. 본 발명에 따라 사용된 레구마인-절단가능한 기는 구조 X-L-Asn 또는 X-L-Asp를 가지며, 여기서 X는 D-Ala, D-Pro, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Thr, D-Cys, D-Asn, D-Gln, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Arg, D-시트룰린 또는 D-His 또는 상응하는 N-알킬화 아미노산 (C1-3 알킬화, 바람직하게는 메틸화)을 나타내고, 2개 이하의 추가의 아미노산이 X에 대한 N-결합된 형태로 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 레구마인-절단가능한 링커 내의 D-아미노산의 도입은 건강한 기관의 리소솜에서의 안정성의 증가를 야기한다 (챕터 C-1c에 제시됨). 적합한 참조 실시예와의 대표적인 비교에 의해 제시된 바와 같이 (챕터 C-1a), 링커에서 D-아미노산을 갖는 본 발명의 ADC 및 APDC는 모든 경우에, 링커에서 모두-L 배위를 갖는 에피머 (참조 실시예 시리즈 R3, 4, 5 및 9)보다 놀랍게도 거의 열등하지 않은 높은 항-종양 작용을 갖는다 (챕터 C-1a 참조).
약물 D의 본 발명의 전구약물은 하기 화학식 Ia를 갖는다.
Figure pct00001
여기서
m은 0 내지 2이고;
n은 0 또는 1이고;
X는 -C(=O)-NH2 또는 -COOH이고,
La는 자기 희생적 링커이고,
A1은 아미노산 Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, 시트룰린 및 His 중 하나, 또는 각각의 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼이고,
A2는 아미노산 D-Ala, D-Pro, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Thr, D-Cys, D-Asn, D-Gln, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Arg, D-시트룰린 또는 D-His 중 하나, 또는 각각의 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼이고,
R2는 -H- 또는 C1-C3-알킬이거나,
또는
R2는 A2가 D-Pro로부터 유래된 라디칼인 경우에 프롤린 고리의 메틸렌 기에 대한 결합이고,
D는 -D1-(Lb)o-(LIG)p이고,
D1은 세포독성 약물이고,
LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
Lb는 링커이고,
o 및 p는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
R은 Z1-(C=O)q-이고,
q는 0 또는 1이고,
Z1은 C1-10-알킬, C5-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴, C5-10-헤테로시클로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, C5-10-헤테로아릴알콕시, C1-10-알콕시, C6-10-아릴옥시, C6-10-아릴-C1-10-알킬옥시 또는 C6-10-아르알콕시, C5-10-헤테로알콕시, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴옥시- 또는 C5-10-헤테로시클로알콕시 기이고 이는 -NH2, -C(=O)-, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NH-C(=O)-알킬, -N(알킬)-C(=O)-알킬, -S(=O)3-H, -S(=O)2-NH2, -S(=O)2-N(알킬)2, -COOH, -C(=O)NH2, -C(=O)-N(알킬)2 또는 -OH에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있거나,
또는 -H 또는 -(CH2)0-1-Ox-(CH2CH2O)v-R1 기이고,
x는 0 또는 1이고,
v는 1 내지 20의 수이고,
R1은 -H, -알킬, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, 또는 -CH2-CH2-NH2이거나,
또는
R은 LIG-(Lc)r-이고,
LIG는 종양 세포 상의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
Lc는 링커이고
r은 0 또는 1이다.
이와 관련하여, 알킬로서 정의된 경우에 R1은 바람직하게는 C1-12-알킬이다.
바람직하게는, 특정한 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된, A1 및 A2에서 언급된 라디칼은 C1-C3-알킬화 아미노산, 보다 바람직하게는 메틸화 아미노산이다.
바람직하게는, 결합제 (LIG)는 항체 또는 항원-결합 항체이다. 항체는 바람직하게는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 특히 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
도 1은 비-글리코실화 항체의 트랜스글루타미나제-촉매 접합 부위-특이적 관능화의 전략을 제시한다.
도 2는, 예를 들어 문헌 [Nat. Commun., 2013, 4, 2735]에 따른 히스톤 데아세틸라제 및 카텝신 L에 의한 약물 방출에 대한 연속 효소적 단계의 예를 제시한다.
도 3은 결합제-약물 접합체를 위한 바람직한 항체의 주석달린 서열을 제시한다. 제시된 것은 IgG의 중쇄 및 경쇄, 및 이들 항체의 VH 및 VL 영역의 단백질 서열이다. 서열 아래에, 중요한 영역은 주석달려 있다 (IgG 내의 VH 및 VL 영역, 및 CDR 영역 (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3)).
도 4는 결합제-약물 접합체를 위한 바람직한 항체의 서열 및 표적 단백질의 서열의 서열 목록을 제시한다.
먼저, 본 발명에 따라 유용한 레구마인-절단가능한 기 및 임의로 자기 희생적 링커를 통해 서로 연결된 세포독성 약물 D의 설명이 이어진다. 이어서 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서 (바람직하게는 리소솜에서) 프로세싱되는 본 발명에 따라 바람직한 결합제 LIG를 기재한다. 본 발명에 따른 화합물의 다양한 요소가 비제한적으로 임의의 바람직한 조합으로 사용될 수 있다. 특히, 각각의 경우에 바람직한 또는 특히 바람직한 것으로서 기재된 약물 D는 각각의 경우에 바람직한 또는 특히 바람직한 것으로서 기재된 결합제 LIG와 조합되어, 임의로 각각의 경우에 바람직한 또는 특히 바람직한 것으로서 기재된 링커와 조합되어 사용될 수 있다.
레구마인-절단가능한 기
본 발명의 화학식 (Ia)의 화합물은 화학식 (Ia')의 레구마인-절단가능한 기를 갖는다.
Figure pct00002
여기서
m은 0 내지 2의 수이고,
n은 0 또는 1이고,
X는 -C(=O)-NH2 또는 -COOH이고,
La는 자기 희생적 링커이고,
A1은 아미노산 Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, 시트룰린 및 His 중 하나, 또는 각각의 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼이고;
A2는 아미노산 D-Ala, D-Pro, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Thr, D-Cys, D-Asn, D-Gln, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Arg, D-시트룰린 또는 D-His 중 하나, 또는 각각의 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼이고;
R2는 -H- 또는 C1-C3-알킬이거나,
또는
R2는 A2가 D-Pro로부터 유래된 라디칼인 경우에 프롤린 고리의 메틸렌 기에 대한 결합이고,
R은 Z1-(C=O)q-이고,
q는 0 또는 1이고,
Z1은 C1-10-알킬, C5-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴, C5-10-헤테로시클로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, C5-10-헤테로아릴알콕시, C1-10-알콕시, C6-10-아릴옥시, C6-10-아릴-C1-10-알킬옥시 또는 C6-10-아르알콕시, C5-10-헤테로알콕시, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴옥시- 또는 C5-10-헤테로시클로알콕시 기이고 이는 -NH2, -C(=O)-, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NH-C(=O)-알킬, -N(알킬)-C(=O)-알킬, -S(=O)3-H, -S(=O)2-NH2, -S(=O)2-N(알킬)2, -COOH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-N(알킬)2 또는 -OH에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있거나,
또는 -H 또는 -(CH2)0-1-Ox-(CH2CH2O)v-R1 기이고,
x는 0 또는 1이고,
v는 1 내지 20의 수이고,
R1은 -H, -알킬, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, 또는 -CH2-CH2-NH2이거나,
또는
R은 LIG-(Lc)r-이고,
LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
Lc는 링커이고,
r은 0 또는 1이고
#1은 세포독성 약물에 대한 결합을 나타낸다.
이와 관련하여, 알킬로서 정의된 경우에 R1은 바람직하게는 C1-12-알킬이고 m은 바람직하게는 1이다.
R이 Z1-(C(=O))q-인 경우에, 화학식 Ia'의 레구마인-절단가능한 기는 또한 레구마인-절단가능한 머리기로 지칭된다.
R이 LIG-(Lc)r-인 경우에, 화학식 Ia'의 레구마인-절단가능한 기는 또한 레구마인-절단가능한 링커로 지칭된다.
화학식 Ia'의 레구마인-절단가능한 기가 레구마인-절단가능한 머리기를 지칭하는 경우에, q는 바람직하게는 1이다.
레구마인-절단가능한 머리기는 작용에 중요한 약물 (바람직하게는 KSP 억제제)의 아미노 기를 생체가역적으로 차단하는 기를 의미하는 것으로 이해된다.
X는 바람직하게는 -C(=O)-NH2이다.
A2는 바람직하게는 아미노산 D-Ala 및 D-Pro 중 하나로부터 유래된 라디칼이다.
D-Asp, D-Asn, D-His 및 D-Ser로부터 유래된 라디칼이 추가로 바람직하다.
A2가 아미노산 D-Ala 및 D-Pro 중 하나로부터 유래된 라디칼인 경우에, 화학식 (Ia')의 레구마인-절단가능한 기는 하기 화학식 (Ia") 및 (Ia"')를 갖는다.
Figure pct00003
및
Figure pct00004
화학식 (Ia')에서 A2가 D-프롤린이 아닌 경우에, R2는 바람직하게는 -H 또는 메틸 기, 보다 바람직하게는 -H이다.
화학식 Ia'의 레구마인-절단가능한 기에서, 아미노산 잔기 A1은 L 배위 또는 D 배위로 존재할 수 있다. A1은 바람직하게는 Ala 또는 Val로부터 유래된다.
L-Ala, D-Ala 또는 L-Val이 바람직하다.
L-Ala가 특히 바람직하다.
레구마인-절단가능한 보호기에서, q는 바람직하게는 1이다.
Z1은 바람직하게는 C1-10-알킬, C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로아릴알킬, C6-10-아르알콕시, C6-10-아릴-C1-10-알킬옥시 또는 C5-10-헤테로아릴알콕시 기 또는 -(CH2)0-1-Ox-(CH2CH2O)v-R1 기이며, 여기서 x, v 및 R1은 상기 주어진 정의를 갖는다.
"아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼"은 화학에서 통상적으로 아미노산의 측기를 지칭한다. 다시 말해서, 알라닌의 경우에 -CH3 등이다.
자기 희생적 링커 La
유리 약물의 충분한 방출을 보증하기 위해, 임의로 효소적 절단 부위와 약물 사이에 자기 희생적 링커 요소 (La)로 칭해지는 것을 포함하는 것이 또한 가능하다 (Anticancer Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). 약물은 다양한 메카니즘, 예를 들어 친핵성 기의 초기 효소적 방출 후 전자 캐스케이드를 통한 후속 제거 (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71) 또는 상응하는 링커 요소의 고리화 (Bioorg. Med. Chem., 2003, 11, 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17, 2241) 또는 이 둘의 조합 (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378)에 의해 방출될 수 있다. 이러한 링커 요소의 예는 도면에 제시된다:
Figure pct00005
La로서 하기 기 중 하나가 본 발명에 따라 바람직하다.
Figure pct00006
여기서 #1은 카르보닐 기에 대한 결합을 나타내고 #2는 D1의 히드록실 또는 아미노 기에 대한 결합을 나타낸다.
세포독성 약물
본 발명의 화학식 Ia의 화합물에서, D는 -D1-(Lb)o-(LIG)p 기이며, 여기서
D1은 세포독성 약물이고,
LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서 및 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제를 나타내고,
Lb는 링커를 나타내고
o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다.
사용된 세포독성 약물은 바람직하게는 미토마이신, 독소루비신, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 9-아미노캄프토테신, n8-아세틸스페르미딘, 1-(2-클로로에틸)-1,2-디메탄술포닐 히드라지드, 탈리소마이신, 시타라빈, 에토포시드, 캄프토테신, 탁솔, 에스페라미신, 포도필로톡신, 안구이딘, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 모르폴린-독소루비신, n-(5,5-디아세톡시펜틸)독소루비신, 두오카르마이신, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀 유도체, 인돌리노벤조디아제핀 (IGN) 유도체 및 모노-이민-IGN 유도체, 칼리케아미신, 다우노루비신, 캄프토테신 DX8951 (엑사테칸) 또는 키네신 스핀들 단백질 억제제 (KSP 억제제)이고, 약물은 그의 히드록실 또는 아미노 기를 통해 화학식 (Ia)에 따른 La (n = 1인 경우) 또는 카르보닐 기 (n = 0인 경우)에 결합된다. 이들 약물의 상응하는 유도체화는 공지된 방법에 기초할 수 있다 (예를 들어, 두오카르마이신과 관련하여 문헌 [Synthesis, 1999, 1505], 캄프토테신과 관련하여 문헌 [Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 337, Journal of Med. Chem., 2010, 53(3), 1043], 아우리스타틴과 관련하여 문헌 [ChemMedChem,. 2011, 6(1), 54], 독소루비신과 관련하여 문헌 [Mol. Cancer. Ther., 2005, 4, 751], 및 피롤로벤조디아제핀 유도체 (PBD 유도체)와 관련하여 문헌 [J. Biol. Chem, 2008, 283, 9318]을 참조하고; 또한 문헌 [J. Med. Chem 2013, 56, 7564] 및 도입부에서의 추가의 참고문헌, 문헌 [J. Med. Chem. 2001, 44, 1341, Oncology Reports 2011, 26, 629]을 참조한다).
그의 효능에 필수적인 유리 히드록실 또는 아미노 기를 갖는 세포독성 약물, 특히 그의 효능에 필수적인 유리 아미노 기를 갖는 것이 특히 바람직하다. 이러한 기에 대한 레구마인-절단가능한 기의 커플링은 세포독성 약물의 효능을 차폐할 수 있다. 약물의 이러한 군은, 예를 들어, 하기 화학식을 갖는 독소루비신을 포함한다.
Figure pct00007
독소루비신의 유리 아미노 기에 대한 레구마인-절단가능한 기의 접합에 의해, 그의 효능은 차폐될 수 있다.
본 발명에 따라 바람직한 추가의 세포독성 약물은 WO2015/096982에 개시된 바와 같은 키네신 스핀들 단백질 억제제이다. 하기 화학식 II 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염의 키네신 스핀들 단백질 억제제가 특히 바람직하다.
Figure pct00008
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나;
또는
X1은 N이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나;
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나;
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나;
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고
R1은 -H, -L-#1, -MOD 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -NHY3, -OY3, -SY3, 할로겐, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z' 또는 -CH(CH2W)Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -NH2, -S(=O)3H, -COOH, -NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH 또는 -(C(=O)-NH-CHY4)1-3-COOH이고;
W는 -H 또는 -OH이고,
Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬-이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환될 수 있는 아릴 또는 벤질이고,
R2는 -L-#1, -H, -MOD, -C(=O)-CHY4-NHY5 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고;
Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬-이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
Y5는 -H 또는 -C(=O)-CHY6-NH2이고,
Y6은 선형 또는 분지형 C1-6-알킬이고;
A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, 또는 -S(=O)2-NH-이고,
R3은 -L-#1, -MOD, 또는 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
n은 0, 1 또는 2이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH-(NHC(=OCH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R5는 -H, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, -CN, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실, -NO2, -NH2, -COOH 또는 할로겐이고,
R8은 C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, C4-10-시클로알킬, 플루오로-C4-10-시클로알킬 또는 -(CH2)0-2-(HZ2)이고,
HZ2는 N, O 및 S로부터 선택된 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 4- 내지 7-원 헤테로사이클이고, 이는 -OH, -COOH, -NH2 또는 -L-#1에 의해 치환될 수 있고,
R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
-L-#1은 -(Lb)o-(LIG)p이고,
LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서 및 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
Lb는 링커이고,
o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고,
-MOD는 -(NR10)n-(G1)o-G2-G3이고,
R10은 -H 또는 C1-C3-알킬이고,
G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
Figure pct00009
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 기 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)-NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-C(=O)-, -CRx=N-O 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
G3은 -H 또는 -COOH이고,
Ry는 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐, 또는 C2-C10-알키닐이고, 이들 각각은 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이다.
여기서
R3은 -L-#1, 또는 C1-10-알킬, C6-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴 또는 C5-10-헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
-MOD는 적어도 1개의 -COOH 기를 갖는
화합물이 바람직하다.
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N인
화합물이 바람직하다.
화학식 II의 화합물의 유리 아미노 기에 대한 레구마인-절단가능한 기의 접합에 의해, 그의 효능은 차폐될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 이들 키네신 스핀들 단백질 억제제는 효과에 필수적인 아미노 기를 갖는다. 펩티드 유도체로의 이 아미노 기의 변형에 의해, 키네신 스핀들 단백질과 관련된 효과는 차단되고 따라서 세포독성 효과의 발생이 또한 억제된다. 그러나, 이 펩티드 잔기가 종양-연관 효소 예컨대 레구마인에 의해 방출될 수 있는 경우에, 효과는 종양 조직에서 제어된 방식으로 재확립될 수 있다.
정의
용어 "치환된"은 지정된 원자 또는 지정된 기 상의 1개 이상의 수소가 명시된 기로부터의 선택에 의해 대체되며, 단 해당 상황 하에 지정된 원자의 정상 원자가는 초과되지 않는다는 것을 의미한다. 치환기 및/또는 가변기의 조합은 허용된다.
용어 "임의로 치환된"은 치환기의 수가 0과 동일하거나 또는 이와 상이할 수 있다는 것을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 임의로 치환된 기는 임의의 이용가능한 탄소 또는 질소 또는 황 원자 상에서의 비-수소 치환기에 의한 수소 원자의 대체에 의해 수용될 수 있는 한 가능한 많은 임의적인 치환기에 의해 치환될 수 있다. 보통, 임의적인 치환기의 수는 (존재하는 경우에) 1, 2, 3, 4 또는 5개, 특히 1, 2 또는 3개일 수 있다.
여기서, 예를 들어 본 발명의 화학식의 화합물의 치환기의 정의에 사용된 표현 "모노- 또는 폴리-"는 "1, 2, 3, 4 또는 5, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3, 가장 바람직하게는 1 또는 2"를 의미한다.
본 발명에 따른 화합물에서 라디칼이 치환되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, 라디칼은 일치환 또는 다치환될 수 있다. 본 발명의 보호 범주 내에서, 1회 초과 발생하는 모든 라디칼의 정의는 서로 독립적이다. 1, 2 또는 3개의 동일하거나 또는 상이한 치환기에 의한 치환이 바람직하다. 1개의 치환기에 의한 치환이 특히 바람직하다.
알킬
알킬은 1 내지 10개의 탄소 원자 (C1-C10-알킬), 일반적으로 1 내지 6개 (C1-C6-알킬), 바람직하게는 1 내지 4개 (C1-C4-알킬) 및 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 탄소 원자 (C1-C3-알킬)를 갖는 선형 또는 분지형 포화 1가 탄화수소 라디칼이다.
바람직한 예는 하기를 포함한다:
메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 네오펜틸, 1,1-디메틸프로필, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 2-에틸부틸, 1-에틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸.
메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 tert-부틸 라디칼이 특히 바람직하다.
헤테로알킬
헤테로알킬은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖고 기 -O-, -S-, -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)-NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-, -CRx=N-O- 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 및/또는 분지형 탄화수소 쇄이며, 여기서 측쇄를 포함하는 탄화수소 쇄는, 존재하는 경우에, -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
이와 관련하여, Ry는 각각의 경우에 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이는 각각의 경우에 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
이와 관련하여, Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이다.
알케닐
알케닐은 1 또는 2개의 이중 결합 및 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자 (C2-C10-알케닐), 특히 2 또는 3개의 탄소 원자 (C2-C3-알케닐)를 갖는 직쇄 또는 분지형 1가 탄화수소 쇄이며, 여기서, 명백할 바와 같이, 알케닐 기가 1개 초과의 이중 결합을 함유하는 경우에, 이중 결합은 서로 단리되거나 또는 서로 공액화될 수 있다. 알케닐 기는, 예를 들어, 에테닐 (또는 비닐), 프로프-2-엔-1-일 (또는 "알릴"), 프로프-1-엔-1-일, 부트-3-에닐, 부트-2-에닐, 부트-1-에닐, 펜트-4-에닐, 펜트-3-에닐, 펜트-2-에닐, 펜트-1-에닐, 헥스-5-에닐, 헥스-4-에닐, 헥스-3-에닐, 헥스-2-에닐, 헥스-1-에닐, 프로프-1-엔-2-일 (또는 "이소프로페닐"), 2-메틸프로프-2-에닐, 1-메틸프로프-2-에닐, 2-메틸프로프-1-에닐, 1-메틸프로프-1-에닐, 3-메틸부트-3-에닐, 2-메틸부트-3-에닐, 1-메틸부트-3-에닐, 3-메틸부트-2-에닐, 2-메틸부트-2-에닐, 1-메틸부트-2-에닐, 3-메틸부트-1-에닐, 2-메틸부트-1-에닐, 1-메틸부트-1-에닐, 1,1-디메틸프로프-2-에닐, 1-에틸프로프-1-에닐, 1-프로필비닐, 1-이소프로필비닐, 4-메틸펜트-4-에닐, 3-메틸펜트-4-에닐, 2-메틸펜트-4-에닐, 1-메틸펜트-4-에닐, 4-메틸펜트-3-에닐, 3-메틸펜트-3-에닐, 2-메틸펜트-3-에닐, 1-메틸펜트-3-에닐, 4-메틸펜트-2-에닐, 3-메틸펜트-2-에닐, 2-메틸펜트-2-에닐, 1-메틸펜트-2-에닐, 4-메틸펜트-1-에닐, 3-메틸펜트-1-에닐, 2-메틸펜트-1-에닐, 1-메틸펜트-1-에닐, 3-에틸부트-3-에닐, 2-에틸부트-3-에닐, 1-에틸부트-3-에닐, 3-에틸부트-2-에닐, 2-에틸부트-2-에닐, 1-에틸부트-2-에닐, 3-에틸부트-1-에닐, 2-에틸부트-1-에닐, 1-에틸부트-1-에닐, 2-프로필프로프-2-에닐, 1-프로필프로프-2-에닐, 2-이소프로필프로프-2-에닐, 1-이소프로필프로프-2-에닐, 2-프로필프로프-1-에닐, 1-프로필프로프-1-에닐, 2-이소프로필프로프-1-에닐, 1-이소프로필프로프-1-에닐, 3,3-디메틸프로프-1-에닐, 1-(1,1-디메틸에틸)에테닐, 부타-1,3-디에닐, 펜타-1,4-디에닐 또는 헥사-1,5-디에닐 기이다. 보다 특히, 기는 비닐 또는 알릴이다.
알키닐
알키닐은 1개의 삼중 결합을 갖고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 탄소 원자 (C2-C10-알키닐), 특히 2 또는 3개의 탄소 원자 (C2-C3-알키닐)를 갖는 직쇄 또는 분지형 1가 탄화수소 쇄이다. C2-C6-알키닐 기는, 예를 들어, 에티닐, 프로프-1-이닐, 프로프-2-이닐 (또는 프로파르길), 부트-1-이닐, 부트-2-이닐, 부트-3-이닐, 펜트-1-이닐, 펜트-2-이닐, 펜트-3-이닐, 펜트-4-이닐, 헥스-1-이닐, 헥스-2-이닐, 헥스-3-이닐, 헥스-4-이닐, 헥스-5-이닐, 1-메틸프로프-2-이닐, 2-메틸부트-3-이닐, 1-메틸부트-3-이닐, 1-메틸부트-2-이닐, 3-메틸부트-1-이닐, 1-에틸프로프-2-이닐, 3-메틸펜트-4-이닐, 2-메틸펜트-4-이닐, 1-메틸펜트-4-이닐, 2-메틸펜트-3-이닐, 1-메틸펜트-3-이닐, 4-메틸펜트-2-이닐, 1-메틸펜트-2-이닐, 4-메틸펜트-1-이닐, 3-메틸펜트-1-이닐, 2-에틸부트-3-이닐, 1-에틸부트-3-이닐, 1-에틸부트-2-이닐, 1-프로필프로프-2-이닐, 1-이소프로필프로프-2-이닐, 2,2-디메틸부트-3-이닐, 1,1-디메틸부트-3-이닐, 1,1-디메틸부트-2-이닐 또는 3,3-디메틸부트-1-이닐 기이다. 보다 특히, 알킬 기는 에티닐, 프로프-1-이닐 또는 프로프-2-이닐이다.
시클로알킬
시클로알킬은 3-12개의 탄소 원자 (C3-C12-시클로알킬)를 갖는 포화 1가 모노- 또는 비시클릭 히드로카르빌 라디칼이다.
이와 관련하여, 모노시클릭 히드로카르빌 라디칼은 일반적으로 3 내지 10개 (C3-C10-시클로알킬), 바람직하게는 3 내지 8개 (C3-C8-시클로알킬) 및 보다 바람직하게는 3 내지 7개 (C3-C7-시클로알킬)의 탄소 원자를 갖는 1가 히드로카르빌 라디칼이다.
모노시클릭 히드로카르빌 라디칼의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸.
시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸이 특히 바람직하다.
이와 관련하여, 비시클릭 히드로카르빌 라디칼은 일반적으로 3 내지 12개의 탄소 원자 (C3-C12-시클로알킬)를 갖는 히드로카르빌 라디칼이고, 이는 여기서 2개의 직접적으로 인접한 원자를 함께 공유하는 2개의 포화 고리계의 융합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 비시클릭 히드로카르빌 라디칼의 바람직한 예는 하기를 포함한다: 비시클로[2.2.0]헥실, 비시클로[3.3.0]옥틸, 비시클로[4.4.0]데실, 비시클로[5.4.0]운데실, 비시클로[3.2.0]헵틸, 비시클로[4.2.0]옥틸, 비시클로[5.2.0]노닐, 비시클로[6.2.0]데실, 비시클로[4.3.0]노닐, 비시클로[5.3.0]데실, 비시클로[6.3.0]운데실 및 비시클로[5.4.0]운데실.
헤테로시클로알킬
헤테로시클로알킬은 동일하거나 또는 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 갖는 비방향족 모노- 또는 비시클릭 고리계이다. 헤테로원자는 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자일 수 있다.
본 발명에 따른 모노시클릭 고리계는 3 내지 8개, 바람직하게는 4 내지 7개 및 보다 바람직하게는 5 또는 6개의 고리 원자를 가질 수 있다.
3개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
아지리디닐.
4개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
아제티디닐, 옥세타닐.
5개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 피롤리닐, 디옥솔라닐 및 테트라히드로푸라닐.
6개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 디옥사닐, 테트라히드로피라닐 및 티오모르폴리닐.
7개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
아제파닐, 옥세파닐, 1,3-디아제파닐, 1,4-디아제파닐.
8개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
옥소카닐, 아조카닐.
모노시클릭 헤테로시클로알킬 중에서, O, N 및 S의 군으로부터의 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 4- 내지 7-원 포화 헤테로시클릴 라디칼이 바람직하다.
모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리디닐 및 테트라히드로푸라닐이 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 갖는 비시클릭 고리계는 6 내지 12개 및 바람직하게는 6 내지 10개의 고리 원자를 가질 수 있으며, 여기서 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자는 O, N 및 S의 군으로부터의 동일하거나 또는 상이한 헤테로원자로 교환될 수 있다.
바람직한 예는 하기를 포함한다: 아자비시클로[3.3.0]옥틸, 아자비시클로[4.3.0]노닐, 디아자비시클로[4.3.0]노닐, 옥사자비시클로[4.3.0]노닐, 티아자비시클로[4.3.0]노닐 또는 아자비시클로[4.4.0]데실, 및 정의에 따라 추가의 가능한 조합으로부터 유래된 라디칼.
퍼히드로시클로펜타[c]피롤릴, 퍼히드로푸로[3,2-c]피리디닐, 퍼히드로피롤로[1,2-a]피라지닐, 퍼히드로피롤로[3,4-c]피롤릴 및 3,4-메틸렌디옥시페닐이 특히 바람직하다.
헤테로시클로알콕시
헤테로시클로알콕시는 -O- 기를 통해 분자의 나머지에 결합된 헤테로시클로알킬이다.
알콕시
알콕시는 일반적으로 1 내지 6개 (C1-C6-알콕시), 바람직하게는 1 내지 4개 (C1-C4-알콕시) 및 보다 바람직하게는 1 내지 3개 (C1-C3-알콕시)의 탄소 원자를 갖는 화학식 -O-알킬의 선형 또는 분지형 포화 알킬 에테르 라디칼이다.
바람직한 예는 하기를 포함한다:
메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, tert-부톡시, n-펜틸옥시 및 n-헥실옥시.
아릴
아릴은 탄소 원자로 이루어진 1가 모노- 또는 비시클릭 방향족 고리계이다. 예는 나프틸 및 페닐이고; 페닐 또는 페닐 라디칼이 바람직하다.
C6-C10-아르알킬
본 발명과 관련하여 C6-10-아르알킬은 C1-C4-알킬 기가 결합된 모노시클릭 방향족 아릴, 예로서 페닐이다.
예시적인 C6-10-아르알킬 기는 벤질이다.
헤테로아릴
헤테로아릴은 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 고리 원자 ("5- 내지 14-원 헤테로아릴" 기), 특히 5, 6, 9 또는 10개의 고리 원자를 갖고, N, O 및 S의 군으로부터의 적어도 1개의 고리 헤테로원자 및 임의로 1, 2 또는 3개의 추가의 고리 헤테로원자를 함유하고, 고리 탄소 원자 또는 임의로 (원자가에 의해 허용되는 경우) 고리 질소 원자를 통해 결합된 1가 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 방향족 고리계이다.
헤테로아릴 기는 5-원 헤테로아릴 기, 예를 들어 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴 또는 테트라졸릴; 또는 6-원 헤테로아릴 기, 예를 들어 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 또는 트리아지닐; 또는 트리시클릭 헤테로아릴 기, 예를 들어 카르바졸릴, 아크리디닐 또는 페나지닐; 또는 9-원 헤테로아릴 기, 예를 들어 벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조트리아졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리지닐 또는 퓨리닐; 또는 10-원 헤테로아릴 기, 예를 들어 퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐 또는 프테리디닐일 수 있다.
일반적으로, 및 달리 언급되지 않는 한, 헤테로아릴 라디칼은 분자의 나머지에 대한 부착 지점과 관련하여 모든 가능한 이성질체 형태, 예를 들어 호변이성질체 및 위치 이성질체를 포함한다. 따라서, 예시적이고, 비-배타적인 예로서, 용어 피리디닐은 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 및 피리딘-4-일을 포함하거나; 또는 용어 티에닐은 티엔-2-일 및 티엔-3-일을 포함한다.
C5-C10-헤테로아릴
본 발명과 관련하여 C5-10-헤테로아릴은 동일하거나 또는 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 갖는 모노- 또는 비시클릭 방향족 고리계이다. 발생할 수 있는 헤테로원자는 N, O, S, S(=O) 및/또는 S(=O)2이다. 결합 원자가는 임의의 방향족 탄소 원자 또는 질소 원자에 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 모노시클릭 헤테로아릴 라디칼은 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는다.
1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 헤테로아릴 라디칼이 바람직하다. 여기서 1 또는 2개의 질소 원자가 특히 바람직하다.
5개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴 라디칼은, 예를 들어, 하기 고리를 포함한다:
티에닐, 티아졸릴, 푸릴, 피롤릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴 및 티아디아졸릴.
6개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴 라디칼은, 예를 들어, 하기 고리를 포함한다:
피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 및 트리아지닐.
본 발명에 따른 비시클릭 헤테로아릴 라디칼은 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는다.
9개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴 라디칼은, 예를 들어, 하기 고리를 포함한다:
프탈리딜, 티오프탈리딜, 인돌릴, 이소인돌릴, 인다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 아조시닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 인돌리닐.
10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴 라디칼은, 예를 들어, 하기 고리를 포함한다:
이소퀴놀리닐, 퀴놀리닐, 퀴놀리지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 1,7- 및 1,8-나프티리디닐, 프테리디닐, 크로마닐.
아릴옥시
아릴옥시는 화학식 아릴-O-의 아릴 라디칼이다.
바람직한 예는 하기를 포함한다: 페녹시 및 나프틸옥시.
헤테로알콕시
헤테로알콕시는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖고 -O-를 통해 분자의 나머지에 결합되고 추가적으로 기 -O-, -S-, -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)-NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-, -CRx=N-O- 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 및/또는 분지형 히드로카르빌 쇄이며, 여기서 측쇄를 포함하는 탄화수소 쇄는, 존재하는 경우에, -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
이와 관련하여, Ry는 각각의 경우에 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이는 각각의 경우에 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-C(=NNH2)-, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
이와 관련하여, Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이다.
본 발명과 관련하여 할로겐 또는 할로겐 원자는 플루오린 (-F), 염소 (-Cl), 브로민 (-Br), 또는 아이오딘 (-I)이다.
플루오린 (-F), 염소 (-Cl) 및 브로민 (-Br)이 바람직하다.
본 발명에 따른 키네신 스핀들 단백질 억제제 전구약물은 바람직하게는 하기 화학식 (IIa) 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염을 갖는다.
Figure pct00010
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 N이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고
A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, 또는 -S(=O)2-NH-이고,
R1은 -H, -L-#1, -MOD 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -NHY3, -OY3, -SY3, 할로겐, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z' 또는 -CH(CH2W)Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -NH2, -S(=O)3H, -COOH, -NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)C(=O)- 또는 -(C(=O)-NH-CHY4)1-3-COOH이고,
W는 -H 또는 -OH이고,
Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
R2는 -H, -L-#1, -MOD, -C(=O)-CHY4-NHY5 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
Y5는 -H 또는 -C(=O)-CHY6-NH2이고,
Y6은 선형 또는 분지형 C1-6-알킬이고,
R3은 -MOD, -L-#1, 또는 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
n은 0, 1 또는 2이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH(NHC(=O)CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R4는 화학식 Ia', Ia" 및 Ia"'의 레구마인-절단가능한 기이고,
R5는 -H, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, -CN, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실, -NO2, -NH2, -COOH 또는 할로겐이고,
R8은 C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, C4-10-시클로알킬, 플루오로-C4-10-시클로알킬 또는 -(CH2)0-2-(HZ2)이고,
HZ2는 N, O 및 S로부터 선택된 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 4- 내지 7-원 헤테로사이클이고, 이는 -OH, -COOH, -NH2 또는 -L-#1에 의해 치환될 수 있고,
R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
-L-#1은 -(Lb)o-(LIG)p이고,
LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서 및 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
Lb는 링커이고,
o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고,
-MOD는 -(NR10)n-(G1)o-G2-G3이고,
R10은 -H 또는 C1-C3-알킬이고,
G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
Figure pct00011
이고,
n은 0 또는 1이고;
o는 0 또는 1이고
G2는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-, -C(=O)-, -CRx=N-O에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Ry는 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이들 각각은 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이고,
G3은 -H 또는 -COOH이고,
-MOD는 적어도 1개의 -COOH 기를 갖는다.
여기서
R3은 C1-10-알킬, C6-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴 또는 C5-10-헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 n 및 Z는 상기 주어진 정의를 갖는
화합물이 바람직하다.
-(C(=O)-NH-CHY4)1-3-COOH 라디칼은 1개의 -C(=O)-NH-CHY4-COOH 라디칼이 존재하거나, 또는 2개의 -(C(=O)-NH-CHY4) 라디칼이 -C(=O)-NH-CHY4-C(=O)-NH-CHY4-COOH에 따라 서로 연결될 수 있거나, 또는 3개의 라디칼이 -C(=O)-NH-CHY4-C(=O)-NH-CHY4-C(=O)-NH-CHY4-COOH에 따라 서로 연결될 수 있다는 것을 의미한다.
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 H이고,
X2는 N이고
X3은 C인
화학식 (IIa)의 화합물이 특히 바람직하다.
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N인
화학식 (IIa)의 화합물이 특히 바람직하다.
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N인
화학식 (IIa)의 화합물이 매우 특히 바람직하다.
A는 -C(=O)-인 화학식 (IIa)의 화합물이 바람직하다.
R1은 -L-#1, -MOD, -H, -COOH, -C(=O)-NH-NH2, -(CH2)1- 3NH2, -C(=O)-NZ"(CH2)1 -3 NH2 및 -C(=O)-NZ"CH2COOH이고
Z"는 -H 또는 -NH2인
화학식 (IIa)의 화합물이 추가적으로 바람직하다.
화학식 (IIa)에서, R4가 -L-#1인 경우에, R1은 바람직하게는 -MOD이다.
보다 특히, 화학식 (IIa)에서, R3이 -MOD가 아닌 경우에 R4는 -L-#1이고 R1은 -MOD이다.
화학식 (IIa)에서, R2는 바람직하게는 -H이다.
화학식 (IIa)에서, R3은 바람직하게는 -L-#1 또는 -MOD이거나, 또는 -OH, -O-알킬, -SH, -S-알킬, -O-C(=O)-알킬, -O-C(=O)-NH-알킬, -NH-C(=O)-알킬, -NH-C(=O)-NH-알킬, -S(=O)n-알킬, -S(=O)2-NH-알킬, -NH-알킬, -N(알킬)2, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환될 수 있는 C1-10-알킬이다.
여기서 알킬은 바람직하게는 C1-3알킬-이다.
화학식 (IIa)에서, R5는 바람직하게는 -H 또는 -F이다.
화학식 (IIa)에서, R6 및 R7은 바람직하게는 독립적으로 -H, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실 또는 할로겐이다.
화학식 (IIa)에서, R8은 바람직하게는 분지형 C1-5-알킬 기, 특히 -C(CH3)2-(CH2)0-2-Ry 기이며, 여기서 Ry는 -H, -OH, -C(=O)2H, 또는 -NH2이다.
보다 바람직하게는, R8은 -C(CH3)2-(CH2) -Ry 기이며, 여기서 Ry는 -H이다.
화학식 (IIa)에서, R9는 바람직하게는 -H 또는 -F이다.
화학식 (IIa)에서, -MOD는 바람직하게는 기
HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-C(=O)-
이며,
여기서
x는 2 내지 6의 수이고,
X는 -H, -NH2 또는 -COOH이고,
AM은 -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)-이다.
화학식 (IIa)에서, -MOD는 보다 바람직하게는 기
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-,
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-NH-C(=O)-
및
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-
이다.
치환기 R1 및 R3 중 어느 것도 -L-#1이 아니거나 또는 그 중 하나가 -L-#1이고,
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고
A는 -C(=O)-이고,
R1은 -H, -COOH, -C(=O)-NH-NH2, -(CH2)1- 3NH2, -C(=O)-NZ"(CH2)1 - 3NH2 및 -C(=O)-NZ"CH2-COOH이고,
Z"는 -H 또는 -NH2이고,
R2는 -H이고,
R3은 할로겐, C1-3-알킬 또는 플루오로-C1-3-알킬에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있는 페닐 기이거나, 또는 플루오린, -OY4, -SY4, -O-C(=O)-Y4, -O-C(=O)-NH-Y4, -NH-C(=O)-Y4, -NH-C(=O)-NH-Y4, -S(=O)n-Y4, -S(=O)2-NH-Y4, -NH-Y4 또는 -N(Y4)2에 의해 임의로 치환될 수 있는 C1-10-알킬 기이고,
n은 1 또는 2이고
Y4는 -H 또는 할로겐, C1-3-알킬 또는 플루오로-C1-3-알킬에 의해 임의로 일치환 또는 다치환될 수 있는 페닐 기이거나, 또는 -OH, -COOH, 및/또는 -NH-C(=O)-C1-3-알킬에 의해 치환될 수 있는 알킬-인
화학식 (IIa)의 화합물이 특히 바람직하다.
이 경우에, R3 및 Y4는 바람직하게는 플루오린에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있는 페닐 기이다.
이 경우에, Y4는 바람직하게는 C1-3-알킬이다.
R3은 -OH, -O-알킬, -SH, -S-알킬, -O-C(=O)-알킬, -O-C(=O)-NH-알킬, -NH-C(=O)-알킬, -NH-C(=O)-NH-알킬, -S(=O)n-알킬, -S(=O)2-NH-알킬, -NH-알킬, -N(알킬)2, 또는 -NH2에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있는 페닐 기이고,
n은 1 또는 2이고,
R5는 -H 또는 -F이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실 또는 할로겐이고,
R8은 분지형 C1-5-알킬 기이고
R9는 -H 또는 -F인
화학식 (IIa)의 화합물이 또한 특히 바람직하다.
이 경우에, C1-3-알킬이 특히 바람직하다.
R1은 -H, -L-#1, -COOH,
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-;
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-NH-C(=O)- 또는
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-
이고,
R2는 -H이고,
A는 -C(=O)-이고,
R3은 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2-S-CH2CH-(COOH)-NH-C(=O)-CH3, -CH(CH3)OCH3,
1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 아미노 기, 1 내지 3개의 알킬 기 또는 1 내지 3개의 할로알킬 기에 의해 치환될 수 있는 페닐 기,
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-;
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-NH-C(=O)-;
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)- 또는
-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH
이고,
x는 0 또는 1이고,
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H, -C(=O)-CH3 또는 -L-#1이고,
R5는 -H이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬 또는 할로겐이고,
R8은 C1-4-알킬이고
R9는 -H인
화학식 (IIa)의 화합물이 추가적으로 바람직하다.
여기서
R6 및 R7은 독립적으로 수소 또는 플루오린이고
R8은 tert-부틸인
화합물이 특히 바람직하다.
R1은 -H, -COOH,
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-,
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-NH-C(=O)- 또는
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-
이고,
R2는 -H이고,
A는 -C(=O)-이고,
R3은 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -CH2-S-CH2CH(COOH)NH-C(=O)-CH3, -CH(CH3)OCH3,
HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-,
HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-NH-C(=O)-,
HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-C(=O)-,
-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH 또는
1-3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 아미노 기, 1 내지 3개의 알킬 기 또는 1 내지 3개의 할로알킬 기에 의해 치환될 수 있는 페닐 기이고,
x는 0 또는 1이고,
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H, -C(=O)-CH3 또는 -L-#1이고,
R5는 -H이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬 또는 할로겐이고,
R8은 C1-4-알킬이고
R9는 -H이며,
여기서 치환기 R1 및 R3 중 하나는 -L-#1인
화합물이 추가적으로 바람직하다.
여기서
R6 및 R7은 -F이고
R8은 tert-부틸인
화합물이 특히 바람직하다.
추가적으로 화학식 (IIb)의 화합물이 바람직하다.
Figure pct00012
여기서
X1, X2,X3, R1, R2, R4, R5, R6, R7, R8 및 R9는 화학식 (IIa)에서 주어진 정의를 갖고
A는 -C(=O)-이고,
B는 단일 결합, -O-CH2- 또는 -CH2-O-이고,
R20은 -NH2, -F, -CF3, 또는 -CH3이고
n은 0, 1 또는 2이다.
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N인
화학식 (IIb)의 화합물이 바람직하다.
화학식 (IIc)의 화합물이 또한 바람직하다.
Figure pct00013
여기서
X1, X2, X3 A, R1, R3, R4, R6, R7, R8 및 R9는 화학식 (IIa)에서 주어진 정의를 갖는다.
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고,
X3은 N이고,
A는 -C(=O)-이고
R3은 -CH2OH, -CH2OCH3, -CH(CH3)OH 또는 -CH(CH3)OCH3인
화학식 (IIc)의 화합물이 바람직하다.
화학식 (IId)의 화합물이 추가로 또한 바람직하다
Figure pct00014
여기서
X1, X2, X3, A, R3, R4, R6, R7, R8 및 R9는 화학식 (IIa)에서 주어진 정의를 갖는다.
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고,
X3은 N이고,
A는 -C(=O)-이고,
R3은 -CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH이고,
x는 0 또는 1이고,
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H 또는 -C(=O)CH3인
화학식 (IId)의 화합물이 바람직하다.
ㆍ Z는 -Cl 또는 -Br이고;
ㆍ R1은 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -C(=O)-NY1Y2이고,
Y1은 -H, -NH2, 또는 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'이고;
Y2는 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'이고
Z'는 -COOH이고;
ㆍ Y1은 -H이고,
Y2는 -(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'이고
Z'는 -COOH이고;
ㆍ Y1은 -H이고,
Y2는 -CH2CH2Z'이고,
Z'는 -(C(=O)NHCHY4)2-COOH이고
Y4는 화학식 (IIa)에서 주어진 정의를 갖고;
ㆍ Y1은 -H이고,
Y2는 -CH2CH2Z'이고,
Z'는 -(C(=O)-NHCHY4)2-COOH이고
Y4는 i-프로필 또는 -(CH2)3-NH-C(=O)-NH2이고;
ㆍ Y1은 -H이고,
Y2는 -CH2CH2Z'이고,
Z'는 -(C(=O)-NHCHY4)2-COOH이고
Y4는 -CH3 또는 -(CH2)3-NH-C(=O)-NH2이고;
ㆍ Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이고;
ㆍ Y4는 i-프로필 또는 -CH3이고;
ㆍ Y1은 -H이고,
Y2는 -CH2CH2Z'이고,
Z'는 -C(=O)-NHCHY4-COOH이고
Y4는 임의로 -NH2-치환된 아릴 또는 벤질이고;
ㆍ Y4는 아미노벤질이고;
ㆍ R2는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -SY3이고
Y3은 상기 주어진 정의를 갖고;
ㆍ R4는 -C(=O)-CHY4-NHY5이고,
Y4는 상기 주어진 정의를 갖고
Y5는 -H이고;
ㆍ R4는 -C(=O)-CHY4-NHY5이고,
Y5는 -C(=O)-CHY6-NH2이고
Y4 및 Y6은 상기 주어진 정의를 갖고;
ㆍ Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환될 수 있는 선형 또는 분지형 C1-6 알킬인
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물이 추가적으로 바람직하다.
추가적으로 R1, R2 또는 R3은 -MOD인 화학식 (IIa)의 화합물이 바람직하다.
R3은 -MOD이고 R1은 -L-#1이고,
여기서
-MOD는 -(NR10)n-(G1)o-G2-G3이고,
R10은 -H 또는 C1-C3-알킬이고;
G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
Figure pct00015
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)-NRy, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-, -C(=O)-, -CRx=N-O-에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이며,
여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Ry는 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이들 각각은 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이고,
G3은 -H 또는 -COOH이며,
여기서 -MOD 기는 바람직하게는 적어도 1개의 -COOH 기를 갖는
화합물이 특히 바람직하다.
보다 바람직하게는, 기 -MOD는, 예를 들어 베타인 기에서 COOH 기를 갖는다.
바람직하게는, 이 COOH 기는 말단 위치에 존재한다.
추가적으로 보다 바람직하게는, -MOD 기는 기
-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH
이며
여기서
x는 0 또는 1이고,
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H 또는 -C(=O)CH3이다.
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 N이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 N이고
X3은 C이고,
R1은 -H, -L-#1, -MOD 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -NHY3, -OY3, -SY3, 할로겐, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z', 또는 -CH(CH2W)Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -NH2, -S(=O)3H, -COOH, -NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH 또는 -(C(=O)-NH-CHY4)1-3COOH이고,
W는 -H 또는 -OH이고,
Y4는 -NHC(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
R2는 -H, -C(=O)-CHY4-NHY5 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고;
Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
Y5는 -H 또는 -C(=O)-CHY6-NH2이고,
Y6은 선형 또는 분지형 C1-6-알킬이고,
A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2- 또는 -S(=O)2-NH-이고,
R3은 -L-#1, -MOD, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 -NH((CH2CH2O)1-20H)- 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z- 기에 의해 임의로 치환될 수 있고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH(NH-C(=O)CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R5는 -H, -MOD, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -C(=O)-OH이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, -CN, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실, -NO2, -NH2, -COOH 또는 할로겐이고,
R8은 C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, C4-10-시클로알킬 또는 플루오로-C4-10-시클로알킬이고,
R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
-MOD는 -(NR10)n-(G1)o-G2-G3 기이고,
R10은 -H 또는 C1-C3-알킬이고,
G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
Figure pct00016
이고
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)-NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Ry는 -H, -C(=O)-, -CRx=N-O-이거나 또는 임의로 NH-C(=O)-NH2-, -COOH-, -OH-, -NH2-, 술폰아미드-, 술폰-, 술폭시드- 또는 술폰산-치환된 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고,
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이고,
G3은 -H 또는 -COOH이며,
여기서 -MOD 기는 바람직하게는 적어도 1개의 -COOH 기를 갖고
여기서 R1 및 R3은 둘 다 -L-#1이 아닌
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이 추가적으로 바람직하다.
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N인
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물이 특히 바람직하다.
R3은 C1-10-알킬, C6-10-아릴, C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴 또는 C5-10-헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 -NH((CH2CH2O)1-20H) 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 임의로 치환될 수 있고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH(NH-C(=O)CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH인
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물이 추가적으로 특히 바람직하다.
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 N이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 N이고
X3은 C이고,
R1은 -H, -L-#1, -MOD 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -NHY3, -OY3, -SY3, 할로겐, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z' 또는 -CH(CH2W)Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -NH2, -S(=O)3H, -COOH, -NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH 또는 -(C(=O)-NH-CHY4)1-3COOH이고,
W는 -H 또는 -OH이고,
Y4는 선형 또는 분지형, 임의로 -NH-C(=O)-NH2-치환된 C1-6 알킬 또는 임의로 -NH2-치환된 아릴 또는 벤질이고,
R2는 -H, -C(=O)-CHY4-NHY5 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
Y4는 선형 또는 분지형, 임의로 -NH-C(=O)-NH2-치환된 C1-6 알킬 또는 임의로 -NH2-치환된 아릴 또는 벤질이고,
Y5는 -H 또는 -C(=O)-CHY6-NH2이고,
Y6은 선형 또는 분지형 C1-6-알킬이고,
A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2- 또는 -S(=O)2-NH-이고,
R3은 -L-#1, -MOD, 또는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 -NH((CH2CH2O)1-20H)- 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z- 기에 의해 임의로 치환될 수 있고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH(NH-C(=O)CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R5는 -H, -MOD, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H 또는 할로겐이고,
R8은 C1-10-알킬 또는 플루오로-C1-10-알킬이고,
R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
-L-#1은 -(Lb)o-(LIG)p 기이고,
LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
Lb는 링커이고,
o 및 p는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
-MOD는 -CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH이고,
x는 0 또는 1이고,
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H 또는 -C(=O)CH3이며
여기서 R1 및 R3은 둘 다 -L-#1이 아닌
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이 추가적으로 바람직하다.
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N인
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물이 바람직하다.
여기서
R3은 C1-10-알킬, C6-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴 또는 C5-10-헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH(NH-C(=O)CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH인
화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId)의 화합물이 추가적으로 바람직하다.
용어 "알킬"이 달리 정의되지 않은 경우에, 알킬은 바람직하게는 C1-C10-알킬이다.
용어 "할로겐"이 달리 정의되지 않은 경우에, 할로겐은 플루오린 (-F), 염소 (-Cl) 및 브로민 (-Br)이다.
하기 화학식 (V), (VI) 및 (VII)의 화합물이 특히 바람직하며, 여기서 R1, R2, R3, R4 및 R5는 화학식 (IIa)에서 주어진 정의를 갖는다.
Figure pct00017
R1, R2 및 R5는 -H이고 R4는 화학식 (IIa)에서 주어진 정의를 갖는 화학식 (V), (VI) 및 (VII)의 화합물이 특히 바람직하다.
여기서 화학식 (VI)의 화합물이 특히 바람직하다.
종양 세포의 표적 분자에 결합하는 결합제
용어 "결합제"는 결합제-약물 접합체에 의해 다루어지는 특정 표적 세포 집단에 존재하는 표적 분자에 결합하는 분자를 의미하는 것으로 가장 넓은 의미로 이해된다. 용어 결합제는 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 하고 또한, 예를 들어, 렉틴, 특정 당 쇄에 결합할 수 있는 단백질, 및 인지질-결합 단백질을 포함한다. 이러한 결합제는, 예를 들어, 고분자량 단백질 (결합 단백질), 폴리펩티드 또는 펩티드 (결합 펩티드), 비-펩티드 (예를 들어 문헌 [Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550]에 의해 검토된 압타머 (US5,270,163), 또는 비타민) 및 다른 모든 세포-결합 분자 또는 물질을 포함한다. 결합 단백질은, 예를 들어, 항체 및 항체 단편 또는 항체 모방체, 예를 들어 아피바디, 애드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머, 나노바디이다 (문헌 [Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617]에 의해 검토됨). 결합 펩티드는, 예를 들어, 리간드/수용체 쌍의 리간드 예컨대, 예를 들어, 리간드/수용체 쌍 VEGF/KDR의 VEGF, 예컨대 리간드/수용체 쌍 트랜스페린/트랜스페린 수용체 또는 시토카인/시토카인 수용체의 트랜스페린, 예컨대 리간드/수용체 쌍 TNF알파/TNF알파 수용체의 TNF알파이다.
본 발명에 따른 전구약물은 바람직하게는 종양 세포의 표적 분자에 결합할 수 있고 일반적으로, 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제를 함유한다. 이러한 결합제가 연결될 수 있는 하나의 방식은, 임의로 링커를 통해, 효소 레구마인에 의해 절단가능한 기에 의한 것이고, 이에 따라 레구마인-절단가능한 기의 절단 후, 활성 성분은 결합제 또는 그의 유도체와 별개로 존재한다. 이 경우에, 화학식 (Ia)의 -D는 -D1을 나타내고 화학식 (Ia)의 -R은 (Lc)r-LIG를 나타낸다 (실시양태 A). 또한, 결합제는, 임의로 링커를 통해 약물 분자에 연결될 수 있고, 이에 따라 레구마인-절단가능한 기의 절단 후, 활성 성분은 결합제 또는 그의 유도체와 함께 존재한다. 이 경우에, 화학식 (Ia)의 -D는 -D1-(Lb)o-LIG를 나타내고 화학식 (Ia)의 R-은 Z1-(C(=O))q-를 나타낸다 (실시양태 B).
실시양태 A의 화합물은 바람직하게는 하기 화학식 III', 보다 바람직하게는 하기 화학식 III" 및 III"'를 갖는다.
Figure pct00018
여기서 m, n, r, LIG, La, Lc, D1, X, A1, A2 및 R2는 화학식 (Ia)에서 주어진 정의를 갖는다.
실시양태 B의 화합물은 바람직하게는 하기 화학식 (IV'), 보다 바람직하게는 하기 화학식 (IV") 및 (IV"')를 갖는다.
Figure pct00019
여기서 m, n, o, R, LIG, La, Lb, D1, X, A1, A2 및 R2는 화학식 (Ia)에서 주어진 정의를 갖는다.
결합제 LIG는 일반적으로 펩티드, 단백질 (예를 들어 항체) 또는 그의 유도체이다. 상응하는 펩티드가 문헌으로부터 공지되어 있다 (문헌 [D. Bohme and A. Beck-Sickinger, J.Pept.Sci. 2015-21.186]에 의해 검토되고; 또한 문헌 [B B. Forner et al., Specialty Chemicals Magazine, May 2012; V. Ahrens et al., Future Med. Chem. 2012, 4, 1567; W. Tai et al., Mol. Pharmaceutics 2011, 8, 901; R. Soudy et al., J. Med. Chem. 2013, 56, 7564 및 [R. Soudy et al.]의 도입부에서의 추가의 참고문헌, M. Langer et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 1341; C. Gruendker et al., Oncology Reports 2011, 26, 629]을 참조한다). 펩티드 또는 그의 유도체는 바람직하게는 옥트레오티드, GnRH-III, [D-Tyr6, β-Ala11, Phe13, Nle14]BN(6-14), NT(8-13), c(RGDfK), HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2 (서열식별번호(SEQ ID NO): 161), NAP아미드, [Phe7, Pro34]NPY, HER2-표적화 펩티드, ATEPRKQYATPRVFWTDAPG (서열식별번호: 162) 또는 LQWRRDDNVHNFGVWARYRL (서열식별번호: 163)로부터 선택된다 [펩티드 서열은 여기서 아미노산에 대한 표준 1-문자 코드로 언급됨]. 문헌 [Umlauf et al., Bioconj.Chem. 2014, Oct. 15; 25(10): 1829-37]에 기재된 바와 같은 스크리닝 방법의 도움으로 추가의 펩티드 서열을 확인하는 것이 가능하다.
실시양태 A의 경우에, 펩티드는 펩티드 결합에 의해 레구마인-절단가능한 기의 N 말단에 (예를 들어 그의 C 말단에 의해) 직접 결합될 수 있다. 펩티드가 링커 Lc를 통해 레구마인-절단가능한 기의 N 말단에 결합되는 것이 또한 가능하고, 이 경우에 링커는 바람직하게는 펩티드의 C 또는 N 말단 또는 펩티드의 리신 또는 시스테인 측쇄에 결합된다.
실시양태 B의 경우에, 펩티드는 약물 분자에 직접 결합될 수 있다. 그러나, 펩티드가 링커 Lb를 통해 약물 분자에 결합되는 것이 바람직하고, 이 경우에 링커는 바람직하게는 펩티드의 C 또는 N 말단 또는 펩티드의 리신 또는 시스테인 측쇄에 결합된다. Lb 또는 펩티드의 결합은 일반적으로 약물 분자 내의 수소 원자의 치환에 의해 실시된다.
예를 들어, 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) 또는 (VII)의 화합물의 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방식으로 R1, R2, R3, R5 또는 R8 내의 수소 원자의 치환에 의해 접합체를 수득하는 것이 가능하며, 여기서 치환기 R1, R2, R3, R5 또는 R8 중 하나는 -(Lb)o-LIG를 나타낸다.
특히 바람직한 결합제 LIG는 종양 세포의 세포외 표적 분자에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체이다. 보다 바람직하게는, LIG는 1개 이상의 세포독성 약물 분자가 결합되는 항체 또는 그의 단편이다. 실시양태 A의 경우에, 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 (IIIa') 또는 (IIIa") 또는 (IIIa"')의 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
Figure pct00020
여기서 m, n, r, La, Lc, D1, X, A1, A2 및 R2는 화학식 (Ia)에서 주어진 정의를 갖고, AB는 항체를 나타내고, s는 1 내지 20, 바람직하게는 2 내지 8, 보다 바람직하게는 3 내지 5의 수, 예를 들어 4를 나타낸다. 이와 관련하여, D1은 바람직하게는 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) 또는 (VII)의 화합물이며, 여기서 R1, R2, R3, R4, R8로부터 선택된 1개의 치환기는 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) 및 (VII) 하의 상기 주어진 정의를 갖지 않지만, La 또는 카르보닐 기에 대한 결합을 나타낸다.
실시양태 B의 경우에, 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 (IVa') 또는 (IVa") 또는 (IVa"')의 항체-전구약물 접합체 (APDC)이다.
Figure pct00021
여기서 m, n, o, R, La, Lb, D1, X, A1, A2 및 R2는 화학식 (Ia)에서 주어진 정의를 갖고 AB는 항체를 나타내고, s는 1 내지 20, 바람직하게는 2 내지 8, 보다 바람직하게는 3 내지 5의 수, 예를 들어 4를 나타낸다. 이와 관련하여, D1은 바람직하게는 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) 또는 (VII)의 화합물이며, 여기서 1개의 치환기 R4는 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) 또는 (VII) 하의 상기 주어진 정의를 갖지 않지만, La 또는 카르보닐 기에 대한 결합을 나타낸다.
항체 (예를 들어 상기 화학식 (IIIa) 및 (IVa)의 AB)는 바람직하게는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 특히 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다. 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
문헌은 또한 항체에 대한 유기 분자의 공유 커플링 (접합)의 다양한 옵션을 개시한다. 항체의 시스테인 잔기의 1개 이상의 황 원자 및/또는 항체의 리신 잔기의 1개 이상의 NH 기를 통한 항체에 대한 접합이 본 발명에 따라 바람직하다. 그러나, 항체의 유리 카르복실 기 또는 당 잔기를 통해 항체에 유기 분자를 결합시키는 것이 또한 가능하다.
항체는 종양 세포의 세포외 표적 분자에 결합한다. "표적 분자"는 표적 세포 집단에 존재하고 단백질 (예를 들어 성장 인자의 수용체) 또는 비-펩티드성 분자 (예를 들어 당 또는 인지질)일 수 있는 분자를 의미하는 것으로 가장 넓은 의미로 이해된다. 바람직하게는 수용체 또는 항원이다.
용어 "세포외" 표적 분자는 세포의 외부 상에 존재하는, 세포에 결합된 표적 분자, 또는 세포의 외부 상에 존재하는 표적 분자의 일부를 기재하며, 즉 항체는 무손상 세포에서 그의 세포외 표적 분자에 결합할 수 있다. 세포외 표적 분자는 세포 막에 고정되거나 또는 세포 막의 성분일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포외 표적 분자를 확인하는 방법을 인식한다. 단백질의 경우에, 이는 막횡단 도메인(들) 및 막에서의 단백질의 배향을 결정하는 것에 의할 수 있다. 이들 데이터는 통상적으로 단백질 데이터베이스 (예를 들어 스위스프로트(SwissProt))에 기탁되어 있다.
용어 "암 표적 분자"는 동일한 조직 유형의 비-암 세포 상에서보다 1종 이상의 암 세포 종 상에서 더 풍부하게 존재하는 표적 분자를 기재한다. 바람직하게는, 암 표적 분자는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 1종 이상의 암 세포 종 상에서 선택적으로 존재하며, 여기서 선택적으로는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 암 세포 상에서의 적어도 2-배의 풍부함을 기재한다 ("선택적 암 표적 분자"). 암 표적 분자의 사용은 본 발명에 따른 접합체를 사용하여 암 세포의 선택적 요법을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 용어 "결합제"는 결합제 펩티드, 결합제 펩티드의 유도체, 결합제 단백질 또는 결합제 단백질의 유도체를 의미하는 것으로 이해된다. 결합제는 결합을 통해 링커에 연결된다. 결합제는 결합제의 헤테로원자에 의해 연결될 수 있다. 연결에 사용될 수 있는 본 발명의 결합제의 헤테로원자는
결합제의 술프히드릴 기를 통한 황,
결합제의 카르복실 기 또는 히드록실 기를 통한 산소, 및
1급 또는 2급 아민 기를 통한 질소
이다.
보다 특히, 본 발명에 따른 용어 "결합제"는 항체를 의미하는 것으로 이해된다.
상기 열거된 헤테로원자는 천연 항체에 존재할 수 있거나 또는 화학적 방법 또는 분자 생물학의 방법에 의해 도입된다. 본 발명에 따르면, 화학식 (I)의 유기 라디칼에 대한 항체의 부착은 표적 분자에 대한 항체의 결합 활성에 대해 단지 최소 효과를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 연결은 표적 분자에 대한 결합제의 결합 활성에 대해 효과를 갖지 않는다.
본 발명에 따른 용어 "항체"는 그의 가장 넓은 의미로 이해되고 이뮤노글로불린 분자, 예를 들어 무손상 또는 변형된 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체)를 포함한다. 이뮤노글로불린 분자는 바람직하게는 전형적으로 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 중쇄 (H 쇄) 및 2개의 경쇄 (L 쇄)인 4개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄의 가변 도메인 (VH로 약칭됨) 및 중쇄의 불변 도메인을 포함한다. 중쇄의 불변 도메인은, 예를 들어, 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 (VL로 약칭됨) 및 불변 도메인을 포함한다. 경쇄의 불변 도메인은 하나의 도메인 (CL로 약칭됨)을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 상보성 결정 영역 (CDR로 약칭됨)으로 지칭되는, 초가변성을 갖는 영역 및 낮은 서열 가변성을 갖는 영역 (프레임워크 영역, FR로 약칭됨)으로 추가로 세분될 수 있다. 전형적으로, 각각의 VH 및 VL 영역은 3개의 CDR 및 4개 이하의 FR로 구성된다. 예를 들어 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 항체는 임의의 적합한 종, 예를 들어 토끼, 라마, 낙타, 마우스 또는 래트로부터 수득될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 기원의 것이다. 항체는, 예를 들어, 인간, 인간화 또는 키메라일 수 있다.
용어 "모노클로날" 항체는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단의 개별 항체는 그 중 소수일 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 높은 특이성을 갖는 단일 항원 결합 부위를 인식한다. 용어 모노클로날 항체는 특정 제조 방법을 지칭하지 않는다.
용어 "무손상" 항체는 경쇄 및 중쇄의 항원-결합 도메인 및 불변 도메인 둘 다를 포함하는 항체를 지칭한다. 불변 도메인은 자연 발생 도메인 또는 다수의 변형된 아미노산 위치를 갖는 그의 변이체일 수 있다.
용어 "변형된 무손상" 항체는 그의 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 통해 공유 결합 (예를 들어 펩티드 결합)에 의해 항체 기원이 아닌 추가의 폴리펩티드 또는 단백질과 융합된 무손상 항체를 지칭한다. 또한, 항체는 지정된 위치에서, 반응성 시스테인이 도입되어 독성단에 대한 커플링을 용이하게 하도록 변형될 수 있다 (문헌 [Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008, 26(8)925-32] 참조).
용어 "인간" 항체는 인간으로부터 수득될 수 있거나 또는 합성 인간 항체인 항체를 지칭한다. "합성" 인간 항체는 인간 항체 서열의 분석에 기초하여 합성 서열로부터 부분적으로 또는 전체적으로 인 실리코 수득가능한 항체이다. 인간 항체는, 예를 들어, 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리로부터 단리된 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 항체의 예는 문헌 [Soderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856]에서 찾아볼 수 있다.
용어 "인간화" 또는 "키메라" 항체는 비-인간 및 인간 부분의 서열로 이루어진 항체를 기재한다. 이들 항체에서, 인간 이뮤노글로불린 (수용자)의 서열의 일부는 비-인간 이뮤노글로불린 (공여자)의 서열 부분에 의해 대체된다. 많은 경우에, 공여자는 뮤린 이뮤노글로불린이다. 인간화 항체의 경우에, 수용자의 CDR의 아미노산은 공여자의 아미노산에 의해 대체된다. 때때로, 프레임워크의 아미노산은, 또한, 공여자의 상응하는 아미노산에 의해 대체된다. 일부 경우에 인간화 항체는 항체의 최적화 동안 도입된, 수용자에도 공여자에도 존재하지 않는 아미노산을 함유한다. 키메라 항체의 경우에, 공여자 이뮤노글로불린의 가변 도메인은 인간 항체의 불변 영역과 융합된다.
본원에 사용된 용어 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원에 대한 결합에 요구되는 가변 항체 도메인의 아미노산을 지칭한다. 전형적으로, 각각의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 CDR 영역은 카바트의 정의에 따른 아미노산 및/또는 코티아에 따라 정의된 초가변 루프의 아미노산을 포함할 수 있다. 카바트에 따른 정의는, 예를 들어, 가변 경쇄의 약 아미노산 위치 24 - 34 (CDR1), 50 - 56 (CDR2) 및 89 - 97 (CDR3) 및 가변 중쇄의 31 - 35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) 및 95 - 102 (CDR3)로부터의 영역을 포함한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 코티아에 따른 정의는, 예를 들어, 가변 경쇄의 약 아미노산 위치 26 - 32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) 및 91 -96 (CDR3) 및 가변 중쇄의 26 - 32 (CDR1), 53 - 55 (CDR2) 및 96 - 101 (CDR3)로부터의 영역을 포함한다 (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196 901-917 (1987)). 일부 경우에, CDR은 카바트 및 코티아에 따라 정의된 CDR 영역으로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 카테고리화될 수 있다. 무손상 항체의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 추가의 하위부류로 분류될 수 있다. (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2. 중쇄의 불변 도메인은, 상이한 부류에 상응하여, [알파/α], [델타/δ], [엡실론/ε], [감마/γ] 및 [뮤/μ]로 지칭된다. 항체의 3차원 구조 및 서브유닛 구조 둘 다가 공지되어 있다.
용어 항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항체/이뮤노글로불린의 항원 결합 도메인을 여전히 포함하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어 IgG의 가변 도메인)으로 정의된다. 항체의 "항원 결합 도메인"은 전형적으로 항체의 1개 이상의 초가변 영역, 예를 들어 CDR, CDR2 및/또는 CDR3 영역을 포함한다. 그러나, 항체의 "프레임워크" 또는 "골격" 영역은 또한 항원에 대한 항체의 결합 동안에 역할을 할 수 있다. 프레임워크 영역은 CDR의 골격을 형성한다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 적어도 가변 경쇄의 아미노산 4 내지 103 및 가변 중쇄의 아미노산 5 내지 109, 보다 바람직하게는 가변 경쇄의 아미노산 3 내지 107 및 가변 중쇄의 4 내지 111, 특히 바람직하게는 완전 가변 경쇄 및 중쇄, 즉 VL의 아미노산 1 - 109 및 VH의 1 내지 113 (WO97/08320에 따른 넘버링)을 포함한다.
본 발명의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은, 비-결정적으로, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 단일 도메인 항체 (DAb), 선형 항체, 항체의 개별 쇄 (단일-쇄 Fv, scFv로 약칭됨); 및 예를 들어, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 예컨대 이중 및 삼중-특이적 항체를 포괄한다 (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체 이외의 항체는 동일한 결합 부위를 갖는 것이다. 다중특이적 항체는 항원의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나 또는 1종 초과의 항원의 에피토프에 특이적일 수 있다 (예를 들어, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; 문헌 [Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 14760 69]; 미국 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; 또는 문헌 [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148 1547 1553] 참조). F(ab')2 또는 Fab 분자는 Ch1과 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용의 수가 감소되거나 또는 달리 완전히 방지될 수 있도록 구축될 수 있다.
"에피토프"는 이뮤노글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄 또는 그의 조합으로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특성 및 또한 특이적 전하 특성을 갖는다.
"기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 그의 아미노 말단 또는 카르복실 말단을 통해 공유 결합 (예를 들어 펩티드 연결)에 의해 항체 기원이 아닌 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질과 융합될 수 있다. 또한, 항체 및 항원-결합 단편은 독성단에 대한 커플링을 용이하게 하기 위해, 지정된 위치에서 반응성 시스테인을 도입함으로써 변형될 수 있다 (문헌 [Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8)925-32] 참조).
폴리클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). 인간 및 인간화 모노클로날 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 또는 Cabilly et al. US 4,816,567 또는 Boss et al. US 4,816,397).
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예컨대, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스 (N Lonberg and D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1)65-93) 또는 파지 디스플레이 기술 (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336)624-8)에 의해 인간 항체 및 그의 단편을 제조하는 다양한 방법을 인식한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 다수의 건강한 지원자로부터 컴파일링된 다수의 항체의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 항체 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 항체는 또한 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 항체의 핵산 서열은 상용 서열분석에 의해 수득될 수 있거나 또는 공중 접근가능한 데이터베이스로부터 이용가능하다.
"단리된" 항체 또는 결합제는 세포의 다른 구성성분을 제거하기 위해 정제되었다. 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 세포의 오염 구성성분은, 예를 들어, 효소, 호르몬, 또는 세포의 다른 펩티드성 또는 비-펩티드성 구성성분이다. 바람직한 항체 또는 결합제는 항체 또는 결합제에 대해 95 중량% 초과의 정도로 정제된 것이다 (예를 들어 로우리 방법, UV-Vis 분광분석법 또는 SDS 모세관 겔 전기영동에 의해 결정됨). 또한 아미노 말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 아미노산을 결정하는 것이 가능한 이러한 정도로 정제되거나, 또는 환원 또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 결정된, 동종인 것으로 정제된 항체 (검출은 쿠마시 블루 염색에 의해 또는 바람직하게는 은 착색에 의해 결정될 수 있음). 그러나, 항체는 통상적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 미리결정된 항원/표적 분자에 결합하는 항체 또는 결합제를 지칭한다. 항체 또는 결합제의 특이적 결합은 전형적으로 적어도 10-7 M (Kd 값으로서; 즉 바람직하게는 10-7 M 미만의 Kd 값을 갖는 것)의 친화도를 갖는 항체 또는 결합제, 미리 결정된 항원/표적 분자 또는 밀접하게 관련된 항원/표적 분자가 아닌 비-특이적 항원/표적 분자 (예를 들어 소 혈청 알부민, 또는 카세인)에 대해서보다 미리 결정된 항원/표적 분자에 대해 적어도 2배 더 높은 친화도를 갖는 항체 또는 결합제를 기재한다. 항체는 바람직하게는 적어도 10-7 M (Kd 값으로서; 다시 말해서 바람직하게는 10-7 M보다 더 작은 Kd 값을 갖는 것), 바람직하게는 적어도 10-8 M, 보다 바람직하게는 10-9 M 내지 10-11 M 범위의 친화도를 갖는다. Kd 값은, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 분광분석법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 마찬가지로 이들 범위의 친화도를 나타낸다. 친화도는 바람직하게는 약물의 접합에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다 (일반적으로, 친화도는 한 자릿수 미만, 다시 말해서, 예를 들어, 최대 10-8 M 내지 10-7 M로 감소함).
본 발명에 따라 사용된 항체는 또한 바람직하게는 높은 선택성에 대해 주목할 만하다. 높은 선택성은 본 발명의 항체가 독립적인 다른 항원, 예를 들어 인간 혈청 알부민에 대해서보다 표적 단백질에 대해 적어도 2배, 바람직하게는 5배 또는 보다 바람직하게는 10배 더 우수한 친화도를 나타내는 경우에 존재한다 (친화도는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 분광분석법에 의해 결정될 수 있음).
또한, 사용된 본 발명의 항체는 바람직하게는 교차-반응성이다. (예를 들어 이종이식편 마우스에서의) 전임상 연구, 예를 들어 독성학적 또는 활성 연구를 용이하게 하고 더 잘 해석할 수 있기 위해, 본 발명에 따라 사용된 항체가 인간 표적 단백질에 결합할 뿐만 아니라 연구에 사용된 종에서 종 표적 단백질에 결합하는 경우가 유리하다. 한 실시양태에서 본 발명에 따라 사용된 항체는, 인간 표적 단백질에 더하여, 적어도 1종의 추가의 종의 표적 단백질에 대해 교차-반응성이다. 독성학적 및 활성 연구를 위해 설치류, 개 및 비-인간 영장류의 패밀리의 종을 사용하는 것이 바람직하다. 바림직한 설치류 종은 마우스 및 래트이다. 바람직한 비-인간 영장류는 레서스 원숭이, 침팬지 및 긴-꼬리 마카크이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 항체는, 인간 표적 단백질에 더하여, 마우스, 래트 및 긴-꼬리 마카크 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))로 이루어진 종의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가의 종의 표적 단백질에 대해 교차-반응성이다. 인간 표적 단백질에 더하여 적어도 마우스 표적 단백질에 대해 교차-반응성인 본 발명에 따라 사용된 항체가 특히 바람직하다. 추가의 비-인간 종의 표적 단백질에 대한 그의 친화도가 인간 표적 단백질에 대한 친화도보다 50배 이하, 보다 특히 10배 이하로 상이한 교차-반응성 항체가 바람직하다.
암 표적 분자에 대해 지시된 항체
그에 대해 결합제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 지시된 표적 분자는 바람직하게는 암 표적 분자이다. 용어 "암 표적 분자"는 동일한 조직 유형의 비-암 세포 상에서보다 1종 이상의 암 세포 종 상에서 더 풍부하게 존재하는 표적 분자를 기재한다. 바람직하게는, 암 표적 분자는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 1종 이상의 암 세포 종 상에서 선택적으로 존재하며, 여기서 선택적으로는 동일한 조직 유형의 비-암 세포와 비교하여 암 세포 상에서의 적어도 2-배의 풍부함을 기재한다 ("선택적 암 표적 분자"). 암 표적 분자의 사용은 본 발명에 따른 접합체를 사용하여 암 세포의 선택적 요법을 가능하게 한다.
항원, 예를 들어 암 세포 항원에 대해 특이적인 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 그 또는 그녀에게 친숙한 방법 (예컨대 예를 들어 재조합 발현)에 의해 제조될 수 있거나 또는 (예를 들어 머크 카게아아(Merck KGaA) (독일)로부터) 상업적으로 획득될 수 있다. 암 요법에서의 공지된 상업적으로 입수가능한 항체의 예는 에르비툭스(Erbitux)® (세툭시맙, 머크 카게아아), 아바스틴(Avastin)® 베바시주맙, 로슈(Roche)) 및 헤르셉틴(Herceptin)® (트라스투주맙, 제넨테크(Genentech))이다. 트라스투주맙은 세포-기반 검정에서 (Kd = 5 nM) 인간 표피 성장 수용체의 세포외 도메인에 고친화도로 결합하는 IgG1카파 유형의 재조합 인간화 모노클로날 항체이다. 항체는 CHO 세포에서 재조합적으로 생산된다.
바람직한 실시양태에서, 표적 분자는 선택적 암 표적 분자이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 표적 분자는 단백질이다.
한 실시양태에서, 표적 분자는 세포외 표적 분자이다. 바람직한 실시양태에서, 세포외 표적 분자는 단백질이다.
암 표적 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들의 예가 하기 열거된다.
암 표적 분자의 예는 하기와 같다:
(1) EGFR (EGF 수용체, NCBI 참조 서열 NP_005219.2, NCBI 유전자 ID: 1956)
(2) 메소텔린 (스위스프로트 참조 Q13421-3), 아미노산 296-598에 의해 코딩되는 메소텔린. 아미노산 37-286은 거핵구 강화 인자를 코딩한다. 메소텔린은 GPI 앵커에 의해 세포 막에 고정되고 세포외에 국재화된다.
(3) 카르보안히드라제 IX (CA9, 스위스프로트 참조 Q16790, NCBI 유전자 ID: 768)
(4) C4.4a (NCBI 참조 서열 NP_055215.2; 동의어 LYPD3, NCBI 유전자 ID: 27076)
(5) CD52 (NCBI 참조 서열 NP_001794.2)
(6) HER2 (ERBB2; NCBI 참조 서열 NP_004439.2; NCBI 유전자 ID: 2064)
(7) CD20 (NCBI 참조 서열 NP_068769.2)
(8) 림프구 활성화 항원 CD30 (스위스프로트 ID P28908)
(9) 림프구 부착 분자 CD22 (스위스프로트 ID P20273; NCBI 유전자 ID: 933)
(10) 골수 세포 표면 항원 CD33 (스위스프로트 ID P20138; NCBI 유전자 ID: 945)
(11) 막횡단 당단백질 NMB (GPNMB, 스위스프로트 ID Q14956, NCBI 유전자 ID: 10457)
(12) 부착 분자 CD56 (스위스프로트 ID P13591)
(13) 표면 분자 CD70 (스위스프로트 ID P32970, NCBI 유전자 ID: 970)
(14) 표면 분자 CD74 (스위스프로트 ID P04233, NCBI 유전자 ID: 972)
(15) B-림프구 항원 CD19 (스위스프로트 ID P15391, NCBI 유전자 ID: 930)
(16) 표면 단백질 뮤신-1 (MUC1, 스위스프로트 ID P15941, NCBI 유전자 ID: 4582)
(17) 표면 단백질 CD138 (스위스프로트 ID P18827)
(18) 인테그린 알파V (NCBI 참조 서열: NP_002201.1, NCBI 유전자 ID: 3685)
(19) 기형암종-유래 성장 인자 1 단백질 TDGF1 (NCBI 참조 서열: NP_003203.1, NCBI 유전자 ID: 6997)
(20) 전립선-특이적 막 항원 PSMA (스위스프로트 ID: Q04609; NCBI 유전자 ID: 2346)
(21) 티로신 단백질 키나제 EPHA2 (스위스프로트 ID: P29317, NCBI 유전자 ID: 1969)
(22) 표면 단백질 SLC44A4 (NCBI 참조 서열: NP_001171515.1, NCBI 유전자 ID: 80736)
(23) 표면 단백질 BMPR1B (스위스프로트: O00238)
(24) 수송 단백질 SLC7A5 (스위스프로트: Q01650)
(25) 상피 전립선 항원 STEAP1 (스위스프로트: Q9UHE8, 유전자 ID: 26872)
(26) 난소 암종 항원 MUC16 (스위스프로트: Q8WXI7, 유전자 ID: 94025)
(27) 수송 단백질 SLC34A2 (스위스프로트: O95436, 유전자 ID: 10568)
(28) 표면 단백질 SEMA5b (스위스프로트: Q9P283)
(29) 표면 단백질 LYPD1 (스위스프로트: Q8N2G4)
(30) 엔도텔린 수용체 유형 B EDNRB (스위스프로트: P24530, NCBI 유전자 ID: 1910)
(31) ring 핑거 단백질 RNF43 (스위스프로트: Q68DV7)
(32) 전립선 암종-연관 단백질 STEAP2 (스위스프로트: Q8NFT2)
(33) 양이온 채널 TRPM4 (스위스프로트: Q8TD43)
(34) 보체 수용체 CD21 (스위스프로트: P20023)
(35) B-세포 항원 수용체 복합체-연관 단백질 CD79b (스위스프로트: P40259, NCBI 유전자 ID: 974)
(36) 세포 부착 항원 CEACAM6 (스위스프로트: P40199)
(37) 디펩티다제 DPEP1 (스위스프로트: P16444)
(38) 인터류킨 수용체 IL20R알파 (스위스프로트: Q9UHF4, NCBI 유전자 ID: 3559)
(39) 프로테오글리칸 BCAN (스위스프로트: Q96GW7)
(40) 에프린 수용체 EPHB2 (스위스프로트: P29323)
(41) 전립선 줄기 세포-연관 단백질 PSCA (NCBI 참조 서열: NP_005663.2)
(42) 표면 단백질 LHFPL3 (스위스프로트: Q86UP9)
(43) 수용체 단백질 TNFRSF13C (스위스프로트: Q96RJ3)
(44) B-세포 항원 수용체 복합체-연관 단백질 CD79a (스위스프로트: P11912)
(45) 수용체 단백질 CXCR5 (CD185; 스위스프로트: P32302; NCBI 유전자 ID 643, NCBI 참조 서열: NP_001707.1)
(46) 이온 채널 P2X5 (스위스프로트: Q93086)
(47) 림프구 항원 CD180 (스위스프로트: Q99467)
(48) 수용체 단백질 FCRL1 (스위스프로트: Q96LA6)
(49) 수용체 단백질 FCRL5 (스위스프로트: Q96RD9)
(50) MHC 부류 II 분자 Ia 항원 HLA-DOB (NCBI 참조 서열: NP_002111.1)
(51) T-세포 단백질 VTCN1 (스위스프로트: Q7Z7D3)
(52) TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI 참조 서열: NP_057723.1, NCBI 유전자 ID: 51330)
(53) 림프구 항원 CD37 (스위스프로트: P11049, NCBI 유전자 ID: 951)
(54) FGF 수용체 2; FGFR2 (NCBI 유전자 ID: 2263; 공식 기호: FGFR2). FGFR2 수용체는 상이한 스플라이스 변이체 (알파, 베타, IIIb, IIIc)로 발생한다. 모든 스플라이스 변이체는 표적 분자로서 작용할 수 있다.
(55) 막횡단 당단백질 B7H3 (CD276; NCBI 유전자 ID: 80381 NCBI 참조 서열: NP_001019907.1, 스위스프로트: Q5ZPR3-1)
(56) B 세포 수용체 BAFFR (CD268; NCBI 유전자 ID:115650)
(57) 수용체 단백질 ROR 1 (NCBI 유전자 ID: 4919)
(58) 표면 수용체 CD123 (IL3RA; NCBI 유전자 ID: 3563; NCBI 참조 서열: NP_002174.1; 스위스프로트: P26951)
(59) 수용체 단백질 신시틴 (NCBI 유전자 ID 30816)
(60) 아스파르테이트 베타-히드록실라제 (ASPH; NCBI 유전자 ID 444)
(61) 세포 표면 당단백질 CD44 (NCBI 유전자 ID: 960)
(62) CDH15 (카드헤린 15, NCBI 유전자 ID: 1013)
(63) 세포 표면 당단백질 CEACAM5 (NCBI 유전자 ID: 1048)
(64) 세포 부착 분자 L1-유사 (CHL1, NCBI 유전자 ID: 10752)
(65) 수용체 티로신 키나제 c-Met (NCBI 유전자 ID: 4233)
(66) notch 리간드 DLL3 (NCBI 유전자 ID: 10683)
(67) 에프린 A4 (EFNA4, NCBI 유전자 ID: 1945)
(68) 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 3 (ENPP3, NCBI 유전자 ID: 5169)
(69) 응고 인자 III (F3, NCBI 유전자 ID: 2152)
(70) FGF 수용체 3 (FGFR3, NCBI 유전자 ID: 2261)
(71) 폴레이트 히드롤라제 FOLH1 (NCBI 유전자 ID: 2346)
(72) 폴레이트 수용체 1 (FOLR1; NCBI 유전자 ID: 2348)
(73) 구아닐레이트 시클라제 2C (GUCY2C, NCBI 유전자 ID: 2984)
(74) KIT 원종양유전자 수용체 티로신 키나제 (NCBI 유전자 ID: 3815)
(75) 리소솜-연관 막 단백질 1 (LAMP1, NCBI 유전자 ID: 3916)
(76) 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E (LY6E, NCBI 유전자 ID: 4061)
(77) 단백질 NOTCH3 (NCBI 유전자 ID: 4854)
(78) 단백질 티로신 키나제 7 (PTK7, NCBI 유전자 ID: 5754)
(79) 넥틴 세포 부착 분자 4 (PVRL4, 넥틴4, NCBI 유전자 ID: 81607)
(80) 막횡단 단백질 신데칸 1 (SDC1, NCBI 유전자 ID: 6382)
(81) SLAM 패밀리 구성원 7 (SLAMF7, NCBI 유전자 ID: 57823)
(82) 수송 단백질 SLC39A6 (NCBI 유전자 ID: 25800)
(83) SLIT- 및 NTRK-유사 패밀리 구성원 6 (SLITRK6, NCBI 유전자 ID: 84189)
(84) 세포 표면 수용체 TACSTD2 (NCBI 유전자 ID: 4070)
(85) 수용체 단백질 TNFRSF8 (NCBI 유전자 ID: 943)
(86) 수용체 단백질 TNFSF13B (NCBI 유전자 ID: 10673)
(87) 당단백질 TPBG (NCBI 유전자 ID: 7162)
(88) 세포 표면 수용체 TROP2 (TACSTD2, NCBI 유전자 ID: 4070)
(89) 갈라닌-유사 G 단백질-커플링된 수용체 KISS1R (GPR54, NCBI 유전자 ID: 84634)
(90) 수송 단백질 SLAMF6 (NCBI 유전자 ID: 114836)
본 발명의 바람직한 대상에서, 암 표적 분자는 암 표적 분자 (1) - (90), 특히 TWEAKR, B7H3, EGFR 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 대상에서, 결합제는 암 표적 분자 (1) - (90), 특히 TWEAKR, B7H3, EGFR 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된 세포외 암 표적 분자에 결합한다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 대상에서, 결합제는 암 표적 분자 (1) - (90), 특히 TWEAKR, B7H3, EGFR 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택된 세포외 암 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 결합제는, 표적 세포 상의 그의 세포외 표적 분자에 결합한 후, 결합을 통해 표적 세포에 의해 내재화된다. 이는 면역접합체 또는 ADC일 수 있는 결합제-약물 접합체가 표적 세포에 의해 흡수되도록 한다. 이어서, 결합제는, 바람직하게는 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱된다.
한 실시양태에서 결합제는 결합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서 결합제는 항체, 항원-결합 항체 단편, 다중특이적 항체 또는 항체 모방체이다.
바람직한 항체 모방체는 아피바디, 애드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머, 또는 나노바디이다. 바람직한 다중특이적 항체는 이중특이적 및 삼중특이적 항체이다.
바람직한 실시양태에서 결합제는 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 보다 바람직하게는 단리된 항체 또는 단리된 항원-결합 항체 단편이다.
바람직한 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, DAb, 선형 항체 및 scFv이다. Fab, 디아바디 및 scFv가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 실시양태에서 결합제는 항체이다. 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편이 특히 바람직하다. 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편이 추가로 특히 바람직하다.
암 표적 분자에 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 공지된 방법, 예컨대, 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 발현을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 암 표적 분자에 대한 결합제는 상업적으로 획득될 수 있거나 또는 공지된 방법, 예컨대, 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 발현을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 제조하는 추가의 방법은 WO 2007/070538 (페이지 22 "항체" 참조)에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어떻게 방법 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리 (예를 들어 모르포시스 HuCAL 골드(Morphosys HuCAL Gold))가 컴파일링되고 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 발견하는 데 사용될 수 있는지를 알고 있다 (WO 2007/070538, 페이지 24 ff 및 페이지 70의 AK 실시예 1, 페이지 72의 AK 실시예 2 참조). B 세포로부터의 DNA 라이브러리를 사용하는, 항체를 제조하는 추가의 방법은 예를 들어 페이지 26 (WO 2007/070538)에 기재되어 있다. 항체를 인간화하는 방법은 WO2007070538의 페이지 30-32 및 문헌 [Queen, et al., Pros. Natl. Acad. Sci. USA 8610029-10033,1989] 또는 WO 90/0786에 상세하게 기재되어 있다. 또한, 일반적으로 단백질 및 특히 항체의 재조합 발현의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vo1. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); 및 Harlow, et al., (Using Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질/항체의 발현에 필요한 상응하는 벡터, 프로모터 및 신호 펩티드를 알고 있다. 통상적인 방법이 또한 WO 2007/070538 페이지 41-45에 기재되어 있다. IgG1 항체를 제조하는 방법은 예를 들어 WO 2007/070538 페이지 74 ff의 실시예 6에 기재되어 있다. 항체의 그의 항원에 대한 결합 후 내재화의 결정을 가능하게 하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고 예를 들어 WO 2007/070538 페이지 80에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 표적 분자 특이성을 갖는 항체의 제조와 유사하게 카르보안히드라제 IX (Mn) 항체를 제조하는 데 사용된 WO 2007/070538에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
박테리아 발현
관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체가 박테리아 발현의 도움으로 생산될 수 있는 방식을 인식한다.
목적하는 단백질의 박테리아 발현에 적합한 발현 벡터는 기능적 리딩 프레임 내에서 적합한 번역 개시 및 번역 종결 신호 및 기능적 프로모터와 함께 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 삽입에 의해 구축된다. 벡터는 숙주 내에서의 벡터의 보유 및, 원하는 경우에, 그의 증폭을 가능하게 하기 위해 1종 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함한다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 속 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)로부터의 다양한 종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 박테리아 벡터는, 예를 들어, 박테리오파지, 플라스미드, 또는 파지미드에 기초할 수 있다. 이들 벡터는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 많은 상업적으로 입수가능한 플라스미드는 전형적으로 널리 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 함유한다. 박테리아 시스템에서, 다수의 유리한 발현 벡터가 발현될 단백질의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다.
적합한 숙주 균주의 형질전환 및 적절한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 후, 선택된 프로모터는 적합한 수단 (예를 들어 온도의 변화 또는 화학적 유도)에 의해 탈-재프라이밍/유도되고, 세포는 추가의 기간 동안 배양된다. 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수거되고 필요한 경우 물리적 방식으로 또는 화학적 수단에 의해 소화되고, 생성된 미가공 추출물은 추가 정제를 위해 유지된다.
따라서, 본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 신규 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성으로부터 유래된 생성물, 및 원핵 숙주, 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 및 속 슈도모나스, 스트렙토미세스, 및 스타필로코쿠스로부터의 다양한 종, 바람직하게는 이. 콜라이에서 재조합 기술에 의해 생산된 생산물을 포함한다.
포유동물 세포 발현
관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체, 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체가 포유동물 세포 발현의 도움으로 생산될 수 있는 방식을 인식한다.
포유동물 세포 숙주에서의 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 발현으로 이어지는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예를 들어 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 발현 증폭인자를 포함한다. 항체의 발현은 구성적이거나 또는 조절될 수 있다 (예를 들어 Tet 시스템과 조합되어 소분자 유도제 예컨대 테트라시클린의 첨가 또는 제거에 의해 유도될 수 있음).
바이러스 조절 요소 및 그의 서열의 추가의 설명에 대해, 예를 들어, U.S. 5,168,062 (Stinski), U.S. 4,510,245 (Bell et al.) 및 U.S. 4,968,615 (Schaffner et al.)을 참조한다. 재조합 발현 벡터는 마찬가지로 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, U.S. 4,399,216, 4,634,665 및 U.S. 5,179,017 참조). 적합한 선택 마커는 벡터가 세포 내로 도입된 경우에 물질 예컨대 G418, 퓨로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘, 제오신/블레오마이신, 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 또는 숙주 세포의 영양요구성을 유도하는 선택 마커, 예컨대 글루타민 신테타제 (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):169-75)를 포함한다.
예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여하고, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 bsd 유전자는 블라스티시딘에 대한 저항성을 부여하고, 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제는 퓨로마이신에 대한 저항성을 부여하고, Sh ble 유전자 산물은 제오신에 대한 저항성을 부여하고, 히그로마이신에 대한 저항성은 이. 콜라이 히그로마이신 저항성 유전자 (hyg 또는 hph)에 의해 부여된다. 선택 마커 예컨대 DHFR 또는 글루타민 신테타제는 또한 MTX 및 MSX와 함께 증폭 기술에 유용하다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 리포펙션, 다가양이온-기반 형질감염 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI)-기반 형질감염 및 DEAE-덱스트란 형질감염에 의한 것을 포함하는 표준 기술의 도움으로 실행될 수 있다.
항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체의 발현에 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 예컨대 CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR-선택 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 및 Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12]에 기재된 DHFR-CHO 세포, 및 문헌 [Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15]에 상술된 바와 같은 다른 녹아웃 세포를 포함함], NS0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포, HKB11 세포, BHK21 세포, CAP 세포, EB66 세포, 및 SP2 세포를 포함한다.
항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체의 발현은 또한 일시적 또는 반-안정한 방식으로 발현 시스템 예컨대 HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293 프리스타일, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO 프리스타일, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 또는 CAP-T 세포 (예를 들어 문헌 [Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9]과 같음)에서 실시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현될 단백질이 숙주 세포가 성장 중인 세포 배양 배지로 분비되도록 구축된다. 항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 단백질 정제 방법의 도움으로 세포 배양 배지로부터 수득될 수 있다.
정제
항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체는 널리 공지된 방법의 도움으로 재조합 세포 배양물로부터 수득되고 정제될 수 있고, 그 예는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 친화성 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 마찬가지로 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 방법으로부터의 생성물 및 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 재조합 기술의 도움으로 생산된 생성물을 포함한다. 진핵 숙주는, 예를 들어, 효모 세포, 고등 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함한다. 재조합 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라, 발현된 단백질은 글리코실화 또는 비-글리코실화 형태일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 방법, UV-vis 분광분석법 또는 SDS 모세관 겔 전기영동 (예를 들어 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, GX 90 또는 바이오라드 바이오애널라이저 (Biorad Bioanalyzer) 기기에 의함)에 의해 측정 시 95 중량% 초과, 및 보다 바람직한 실시양태에서 99 중량% 초과의 정도로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기의 결정에 적합한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색의 도움으로 환원 또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 결정된 동질성의 정도로 정제된다.
통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1개의 단백질 정제 단계의 도움으로 수득된다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항원-결합 단편 또는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체의 항원-결합 단편은 scFv, Fab, Fab 단편 또는 F(ab)2 단편이다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편이다.
항-TWEAKR 항체
본 발명에 따르면, 항-TWEAKR 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-TWEAKR 항체" 또는 "TWEAKR에 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 TWEAKR (NCBI 참조 서열: NP_057723.1, 서열식별번호: 164)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 TWEAKR에 결합한다.
TWEAKR에 결합하는 항체의 예는, 예를 들어, WO2009/020933(A2), WO2009/140177 (A2), WO 2014/198817 (A1) 및 WO 2015/189143 (A1)에 개시되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
ITEM-4는 문헌 [Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825)]에 의해 기재된 항-TWEAKR 항체이다. CDR 그라프팅에 기초한 이 항체의 인간화 변이체는 문헌 [Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4):1052-62)] 및 WO 2009/020933에 기재되어 있다. ITEM-4의 인간화 변이체는 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 및 TPP-10337이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-TWEAKR 항체 TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 및 TPP-10337이 본 발명과 관련하여 바람직하다. 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 및 TPP-10337이 보다 바람직히다. 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337이 특히 바람직하다.
항-B7H3 항체
본 발명에 따르면, 항-B7H3 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-B7H3 항체" 또는 "B7H3에 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 B7H3 (NCBI 참조 서열: NP_001019907.1, 서열식별번호: 165)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 B7H3에 결합한다.
B7H3에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, WO201109400, EP1773884 및 WO2014061277에 기재되어 있다. EP2121008은 항-B7H3 항체 8H9 및 그의 CDR 서열을 기재한다.
이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-B7H3 항체의 바람직한 실시양태는 재조합 마우스 B7H3 (마우스 CD276; 유전자 ID: 102657) 및 인간 B7H3 (인간 CD276; 유전자 ID: 80381)을 발현하는 세포에 대해 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득되었다. 수득된 항체는 인간 IgG1 포맷으로 형질전환되었다. 항-B7H3 항체 TPP-8382는 바람직한 예이다.
항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567이 본 발명과 관련하여 바람직하다.
항-HER2 항체:
본 발명에 따르면, 항-HER2 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-HER2 항체" 또는 "HER2에 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 HER2 (NCBI 참조 서열: NP_004439.2, 서열식별번호: 166)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 HER2에 결합한다.
암 표적 분자 HER2에 결합하는 항체의 예는 트라스투주맙 (제넨테크)이다. 트라스투주맙은 특히 유방암의 치료에 사용되는 인간화 항체이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항-HER2 항체는 TPP-1015 (트라스투주맙 유사체)이다.
HER2에 결합하는 항체의 추가의 예는, 트라스투주맙 (INN 7637, CAS 번호 RN: 180288-69-1) 및 페르투주맙 (CAS 번호 380610-27-5)에 더하여, 또한 WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2, 또는 WO 2011/044368-A2에 개시된 바와 같은 항체이다. 항-HER2 접합체의 예는 트라스투주맙-엠탄신 (INN-번호 9295)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-HER2 항체 트라스투주맙 및 TPP-1015가 본 발명과 관련하여 특히 바람직하다.
항-EGFR 항체
본 발명에 따르면, 항-EGFR 항체를 사용하는 것이 가능하다.
표현 "항-EGFR 항체" 또는 "EGFR에 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 EGFR (NCBI 참조 서열: NP_005219.2, 서열식별번호: 167)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 EGFR에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 TPP-981 (세툭시맙), 파니투무맙, 니모투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 TPP-981 (세툭시맙)이다.
EGFR 항체의 추가 실시양태는 하기와 같다:
ㆍ 잘루투무맙 / 2F8 / 휴맥스(HuMax)-EGFr, 젠맙 에이/에스(Genmab A/S)로부터의 것 (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN 번호 8605)
ㆍ 네시투무맙 / 11F8, 임클론(ImClone) / IMC-11F8, 임클론 시스템 인크.(ImClone Systems Inc.)로부터의 것 [일라이 릴리 앤 캄파니(Eli Lilly & Co)] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1, US 2007/0264253-A1, US 7,598,350, WO 2005/090407-A1), INN 번호 9083)
ㆍ 마투주맙 / 항-EGFR MAb, 머크 카게아아 / 항-EGFR MAb, 다케다(Takeda) / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 및 EMD-55900 / MAb 425 / 모노클로날 항체 425, 머크 카게아아 / 다케다로부터의 것 (WO 92/15683, INN 번호 8103 (마투주맙))
ㆍ RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-5083945 / RO4858696 / RO5083945, 글리카르트 바이오테크놀로지 아게(Glycart Biotechnology AG) (로슈 홀딩 아게(Roche Holding AG))로부터의 것 (WO 2010/112413-A1, WO 2010/115554)
ㆍ GT-MAB 5.2-GEX / 세투젝스(CetuGEX), 글리코토프 게엠베하(Glycotope GmbH)로부터의 것 (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1, EP 01911766-A1, EP 02073842-A2, US 2010/0028947-A1)
ㆍ ISU-101, 이수 앱지스 인크.(Isu Abxis Inc.) (이수 케미칼 캄파니 리미티드(ISU Chemical Co Ltd)) / 스칸셀(Scancell)로부터의 것 (WO 2008/004834-A1)
ㆍ ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / 항-EGFR 모노클로날 항체 806, 루드윅 암 연구소(Ludwig Institute for Cancer Research) / 애보트(Abbott) / 라이프 사이언스 파마슈티칼스(Life Science Pharmaceuticals)로부터의 것 (WO 02/092771, WO 2005/081854 및 WO 2009/023265)
ㆍ SYM-004 (2종의 키메라 IgG1 항체 (992 및 1024)로 이루어짐), 심포겐 에이/에스(Symphogen A/S)로부터의 것 (WO 2010/022736-A2)
ㆍ MR1-1 /MR1-1KDEL, IVAX 코포레이션(IVAX Corp) (테바 파마슈티칼 인더스트리즈 리미티드(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)) (듀크 대학교)로부터의 것, (특허: WO2001/062931-A2)
ㆍ 결실 돌연변이체, EGFRvIII에 대한 항체, 암젠(Amgen)/아브게닉스(Abgenix)로부터의 것 (WO 2005/010151, US 7,628,986)
ㆍ SC-100, 스칸셀 리미티드로부터의 것 (WO 01/088138-A1)
ㆍ MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, 메다렉스(Medarex)/머크 카게아아, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb) (US) / 머크 카게아아 (DE) / 다케다 (JP)로부터의 것, (WO 91/05871, WO 92/15683)
ㆍ 항-EGFR-Mab, 젠코르(Xencor)로부터의 것 (WO 2005/056606)
ㆍ DXL-1218 / 항-EGFR 모노클로날 항체 (암), 인넥서스(InNexus), 인넥서스 바이오테크놀로지 인크.(InNexus Biotechnology Inc.)로부터의 것, 파마프로젝트 PH048638
항-카르보안히드라제 IX 항체
암 표적 분자 카르보안히드라제 IX에 결합하는 항체의 예는 WO 2007/070538-A2 (예를 들어 청구항 제1항 - 제16항)에 기재되어 있다.
항-CD123 항체
표현 "항-CD123 항체" 또는 "CD123에 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 CD123 (NCBI 참조 서열: NP_002174.1; 스위스프로트: P26951)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 CD123에 결합한다.
문헌 [Sun et al. (Sun et al., 1996, Blood 87(1)83-92)]은 IL-3Rα, CD123의 N-말단 도메인에 결합하는 모노클로날 항체 7G3의 생성 및 특성을 기재한다. 미국 특허 번호 6,177,078 (Lopez)은 항-CD123 항체 7G3에 관한 것이다. 이 항체의 키메라 변이체 (CSL360)가 WO 2009/070844에 기재되어 있고, 인간화 버전 (CSL362)이 WO 2012/021934에 기재되어 있다. 7G3 항체의 서열이 EP2426148에 개시되어 있다. 이 서열은 CDR 그라프팅에 의해 수득되는 인간화 항체에 대한 출발점을 구성한다.
세포 표면 항원 결합 후, 특히 잘 내재화되는 항체는 문헌 [Kuo et al. (Kuo et al., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82)]에 의해 개시된 항-CD123 항체 12F1이다. 항체 12F1은 항체 7G3보다 더 높은 친화도로 CD123에 결합하고, 세포 표면 항원 결합 후, 7G3보다 현저히 더 빠르게 내재화된다. 12F1에 기초한 이중특이적 scFv 면역융합 단백질이 WO 2013/173820에 개시되어 있다.
뮤린 7G3 및 12F1 항체의 인간화 변이체는 배선 서열에서의 CDR 그라프팅 및 후속 최적화에 기초하여 생성된다.
항-CXCR5 항체
표현 "항-CXCR5 항체" 또는 "CXCR5에 결합하는 항체"는 바람직하게는 진단 및/또는 치료 용도에 충분한 친화도를 갖는, 암 표적 분자 CXCR5 (NCBI 참조 서열: NP_001707.1)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)로 CXCR5에 결합한다.
CXCR5에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, EP2195023에 기재되어 있다.
래트 항체 RF8B2 (ACC2153)에 대한 하이브리도마 세포를 DSMZ로부터 구입하고 항체의 서열을 표준 방법에 의해 확인하였다. 이 서열은 CDR 그라프팅에 의해 수득되는 인간화 항체에 대한 출발점을 구성한다.
이 항체의 인간화 변이체는 배선 서열에서의 CDR 그라프팅에 기초하여 생성된다.
항-C4.4a 항체:
C4.4a 항체 및 항원-결합 단편의 예가 WO 2012/143499 A2에 기재되어 있다. 항체의 서열은 WO 2012/143499 A2의 표 1에 제공되며, 여기서 각각의 행은 제1열에 열거된 항체의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄의 각각의 CDR 아미노산 서열을 제시한다.
항-CD20 항체:
암 표적 분자 CD20에 결합하는 항체의 예는 리툭시맙 (제넨테크)이다. 리툭시맙 (CAS 번호: 174722-31-7)은 비-호지킨 림프종의 치료에 사용되는 키메라 항체이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD52 항체:
암 표적 분자 CD52에 결합하는 항체의 예는 알렘투주맙 (겐자임(Genzyme))이다. 알렘투주맙 (CAS 번호: 216503-57-0)은 만성 림프구성 백혈병의 치료에 사용되는 인간화 항체이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-메소텔린 항체:
항-메소텔린 항체의 예는, 예를 들어, WO2009/068204에 기재되어 있다. WO2009/068204에 개시된 모든 항체 및 항원-결합 단편은 본원에 개시된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, WO2009/068204에 개시된 항체는 MF-T이다.
항-CD30 항체
암 표적 분자 CD30에 결합하고 암, 예를 들어 호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 브렌툭시맙, 이라투무맙 및 WO 2008/092117, WO 2008/036688 또는 WO 2006/089232에 개시된 항체이다. 항-CD30 접합체의 예는 브렌툭시맙 베도틴 (INN 번호 9144)이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD22 항체
암 표적 분자 CD22에 결합하고 암, 예를 들어 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 이노투주맙 및 에프라투주맙이다. 항-CD22 접합체의 예는 이노투주맙 오자가미신 (INN 번호 8574) 또는 항-CD22-MMAE 및 항-CD22-MC-MMAE (각각 CAS RN: 139504-50-0 및 474645-27-7)이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD33 항체
암 표적 분자 CD33에 결합하고 암, 예를 들어 백혈병의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 겜투주맙 및 린투주맙 (INN 7580)이다. 항-CD33 접합체의 예는 겜투주맙-오자가미신이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-NMB 항체
암 표적 분자 NMB에 결합하고 암, 예를 들어 흑색종 또는 유방암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 글렘바투무맙 (INN 9199)이다. 항-NMB 접합체의 예는 글렘바투무맙 베도틴 (CAS RN: 474645-27-7)이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD56 항체
암 표적 분자 CD56에 결합하고 암, 예를 들어 다발성 골수종, 소세포 폐 암종, MCC 또는 난소 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 로르보투주맙이다. 항-CD57 접합체의 예는 로르보투주맙 메르탄신 (CAS RN: 139504-50-0)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD70 항체
암 표적 분자 CD70에 결합하고 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종 또는 신세포암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2007/038637-A2 및 WO 2008/070593-A2에 개시되어 있다. 항-CD70 접합체의 예는 SGN-75 (CD70 MMAF)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD74 항체
암 표적 분자 CD74에 결합하고 암, 예를 들어 다발성 골수종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 밀라투주맙이다. 항-CD74 접합체의 예는 밀라투주맙-독소루비신 (CAS RN: 23214-92-8)이다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD19 항체
암 표적 분자 CD19에 결합하고 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2008/031056-A2에 개시되어 있다. 추가의 항체 및 항-CD19 접합체 (SAR3419)의 예는 WO 2008/047242-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-뮤신 항체
암 표적 분자 뮤신-1에 결합하고 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 클리바투주맙 및 WO 2003/106495-A2, WO 2008/028686-A2에 개시된 항체이다. 항-뮤신 접합체의 예는 WO 2005/009369-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-CD138 항체
암, 예를 들어 다발성 골수종의 치료에 사용될 수 있는, 암 표적 분자 CD138에 결합하는 항체 및 그의 접합체의 예는 WO 2009/080829-A1, WO 2009/080830-A1에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-인테그린-알파V 항체
암 표적 분자 인테그린 알파V에 결합하고 암, 예를 들어 흑색종, 육종 또는 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 인테투무맙 (CAS RN: 725735-28-4), 압식시맙 (CAS RN: 143653-53-6), 에타라시주맙 (CAS RN: 892553-42-3) 및 US 7,465,449, EP 719859-A1, WO 2002/012501-A1 및 WO2006/062779-A2에 개시된 항체이다. 항-인테그린 알파V 접합체의 예는 인테투무맙-DM4 및 WO 2007/024536-A2에 개시된 다른 ADC이다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-TDGF1 항체
암 표적 분자 TDGF1에 결합하고 암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 02/077033-A1, US 7,318,924, WO 2003/083041-A2 및 WO 2002/088170-A2에 개시된 항체이다. 항-TDGF1 접합체의 예는 WO 2002/088170-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-PSMA 항체
암 표적 분자 PSMA에 결합하고 암, 예를 들어 전립선 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 97/35616-A1, WO 99/47554-A1, WO 01/009192-A1 및 WO2003/034903에 개시된 항체이다. 항-PSMA 접합체의 예는 WO 2009/026274-A1 및 WO 2007/002222에 개시되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-EPHA2 항체
암 표적 분자 EPHA2에 결합하고 접합체의 제조 및 암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2004/091375-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-SLC44A4 항체
암 표적 분자 SLC44A4에 결합하고 접합체의 제조 및 암, 예를 들어 췌장 또는 전립선 암종의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO2009/033094-A2 및 US2009/0175796-A1에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-HLA-DOB 항체
암 표적 분자 HLA-DOB에 결합하는 항체의 예는 암, 예를 들어 비-호지킨 림프종의 치료에 사용될 수 있는 항체 Lym-1 (CAS RN: 301344-99-0)이다. 항-HLA-DOB 접합체의 예는, 예를 들어, WO 2005/081711-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-VTCN1 항체
암 표적 분자 VTCN1에 결합하고 접합체의 제조 및 암, 예를 들어 난소 암종, 췌장암, 폐암 또는 유방암의 치료에 사용될 수 있는 항체의 예는 WO 2006/074418-A2에 개시되어 있다. 이들 항체 및 그의 항원-결합 단편은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
항-FGFR2 항체
항-FGFR2 항체 및 항원-결합 단편의 예는 WO2013076186에 개시되어 있다. 항체의 서열은 WO2013076186의 표 9 및 표 10에 제시되어 있다. M048-D01 및 M047-D08로 지칭되는 항체로부터 유래된 항체, 항체의 항원-결합 단편 및 변이체가 바람직하다.
본 발명에 따른 결합제-약물 접합체를 위한 바람직한 항체 및 항원-결합 항체 단편
본 출원에서, 결합제-약물 접합체와 관련하여, 하기 표에 제시된 바와 같은 하기 바람직한 항체를 참조한다: TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-7511, TPP-8382 및 TPP-8567.
표: 항체의 단백질 서열:
Figure pct00022
TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-7511, TPP-8382 및 TPP-8567은 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 경쇄의 가변 영역 (VL) 내에 상기 표에 명시된 CDR 서열 (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) 중 1개 이상을 포함하는 항체이다. 바람직하게는, 항체는 명시된 중쇄의 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 중쇄 (IgG 중쇄)의 명시된 영역 및/또는 경쇄 (IgG 경쇄)의 명시된 영역을 포함한다.
TPP-981은 서열식별번호: 2에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 3에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 4에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 6에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 7에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 8에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체이다.
TPP-1015는 서열식별번호: 12에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 13에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 14에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 17에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 18에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-2090은 서열식별번호: 22에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 23에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 24에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 26에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 27에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 28에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-2658은 서열식별번호: 32에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 33에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 34에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 36에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 37에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 38에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-5442는 서열식별번호: 42에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 43에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 44에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 46에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 47에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 48에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7006은 서열식별번호: 52에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 53에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 54에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 56에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 57에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 58에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7007은 서열식별번호: 62에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 63에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 64에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 66에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 67에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 68에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7510은 서열식별번호: 72에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 73에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 74에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 76에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 77에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 78에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-7511은 서열식별번호: 82에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 83에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 84에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 86에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 87에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 88에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-8382는 서열식별번호: 92에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 93에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 94에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 96에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 97에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 98에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8567은 서열식별번호: 102에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 103에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 104에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 106에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 107에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 108에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8825는 서열식별번호: 112에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 113에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 114에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 116에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 117에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 118에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10334는 서열식별번호: 122에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 123에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 124에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 126에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 127에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 128에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10335는 서열식별번호: 132에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 133에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 134에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 136에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 137에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 138에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10336은 서열식별번호: 142에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 143에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 144에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 146에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 147에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 148에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10337은 서열식별번호: 152에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 153에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 154에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 156에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 157에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 158에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-981은 바람직하게는 서열식별번호: 1에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 5에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체이다.
TPP-1015는 바람직하게는 서열식별번호: 11에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 15에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-2090은 바람직하게는 서열식별번호: 21에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 25에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-2658은 바람직하게는 서열식별번호: 31에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 35에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-5442는 바람직하게는 서열식별번호: 41에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 45에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7006은 바람직하게는 서열식별번호: 51에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 55에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7007은 바람직하게는 서열식별번호: 61에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 65에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7510은 바람직하게는 서열식별번호: 71에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 75에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-7511은 바람직하게는 서열식별번호: 81에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 85에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-8382는 바람직하게는 서열식별번호: 91에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 95에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8567은 바람직하게는 서열식별번호: 101에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 105에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8825는 바람직하게는 서열식별번호: 111에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 115에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10334는 바람직하게는 서열식별번호: 121에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 125에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10335는 바람직하게는 서열식별번호: 131에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 135에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10336은 바람직하게는 서열식별번호: 141에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 145에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10337은 바람직하게는 서열식별번호: 151에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 155에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-981은 바람직하게는 서열식별번호: 9에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 10에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-EGFR 항체이다.
TPP-1015는 바람직하게는 서열식별번호: 19에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 20에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-2090은 바람직하게는 서열식별번호: 29에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 30에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-2658은 바람직하게는 서열식별번호: 39에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 40에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-5442는 바람직하게는 서열식별번호: 49에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 50에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7006은 바람직하게는 서열식별번호: 59에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 60에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7007은 바람직하게는 서열식별번호: 69에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 70에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-7510은 바람직하게는 서열식별번호: 79에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 80에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-7511은 바람직하게는 서열식별번호: 89에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 90에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이다.
TPP-8382는 바람직하게는 서열식별번호: 99에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 100에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8567은 바람직하게는 서열식별번호: 109에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 110에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-B7H3 항체이다.
TPP-8825는 바람직하게는 서열식별번호: 119에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 120에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10334는 바람직하게는 서열식별번호: 129에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 130에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10335는 바람직하게는 서열식별번호: 139에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 140에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10336은 바람직하게는 서열식별번호: 149에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 150에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
TPP-10337은 바람직하게는 서열식별번호: 159에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 160에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이다.
LIG 결합제를 위한 링커 (Lb 및 Lc)
문헌은 펩티드 또는 단백질 예컨대 항체에 대한 유기 분자의 공유 커플링 (접합)에 대한 다양한 옵션을 개시한다 (예를 들어, 문헌 [K. Lang and J. W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294] 참조). 유리 티올로서 이미 존재하거나 또는 디술피드 가교의 환원에 의해 생성되는 항체의 시스테인 잔기의 1개 이상의 황 원자, 및/또는 항체의 리신 잔기의 1개 이상의 NH 기를 통한 항체에 대한 유기 라디칼의 접합이 본 발명에 따라 바람직하다. 그러나, 항체의 티로신 잔기, 글루타민 잔기, 비천연 아미노산의 잔기, 유리 카르복실 기 또는 당 잔기를 통해 KSP 억제제 또는 전구약물을 항체에 결합시키는 것이 또한 가능하다.
본 발명에 따르면, 약물 분자를 결합제의 특이적 접합 부위에 접합시키는 것이 또한 가능하고, 이는 생성물 동질성을 개선시킨다. 문헌은 접합 부위-특이적 접합의 다양한 방법을 기재한다 (Agarwal et al., Bioconjug. Chem. 26, 176-192 (2015); Cal et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.53, 10585-10587 (2014); Behrens et al., MAbs 6, 46-53 (2014); Panowski et al., MAbs 6, 34-45 (2014)). 이들 방법은 또한, 특히, 예를 들어, 트랜스글루타미나제 (TGase), 글리코실트랜스퍼라제 또는 포르밀글리신-생성 효소를 사용하는 효소적 접합 방법을 포함한다 (Sochaj et al., Biotechnology Advances 33, 775-784, (2015)).
본 발명에 따르면, 키네신 스핀들 단백질 억제제의 접합 부위-특이적 결합제 접합체를 제공하는 것이 가능하며, 여기서 키네신 스핀들 단백질 억제제는 결합제의 글루타민 측쇄에 접합된다.
결합제가 항체인 경우에, 이는 바람직하게는 불변 영역에서 수용자 글루타민을 함유한다. 이러한 수용자 글루타민은 글루타민으로의 적합한 위치의 돌연변이 (예를 들어 중쇄의 돌연변이 N297Q, 카바트 EU 넘버링) 또는 탈글리코실화 또는 비-글리코실화 항체의 생성 (예를 들어 PNGaseF에 의한 효소적 탈글리코실화 또는 중쇄의 돌연변이 N297X, 카바트 EU 넘버링 (여기서 X는 N을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음))을 통해 도입될 수 있다. 탈글리코실화 또는 비-글리코실화 항체의 후자의 경우에, 중쇄의 글루타민 잔기 Q295 (카바트 EU 넘버링)는 수용자 글루타민이 된다. N297A 또는 N297Q (카바트 EU 넘버링) 돌연변이를 함유하는 항체가 특히 바람직하다. 따라서, 본 발명에 기재된 모든 항체는 마찬가지로 이들 항체의 비-글리코실화 변이체를 포함하고, 이는 PNGaseF에 의한 탈글리코실화를 통해 또는 N을 제외한 임의의 다른 아미노산으로의 중쇄의 N297 (카바트 EU 넘버링) (항체의 카바트 넘버링 시스템, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조)의 돌연변이에 의해 생산된다. 또한, 본원에 기재된 모든 항체는 마찬가지로 조작에 의해, 트랜스글루타미나제-촉매 반응을 위한 1개 이상의 수용자 글루타민 잔기를 함유하는, 기재된 항체의 변이체를 함유한다.
이러한 접합 부위 특이적-접합을 위한 하나의 방법은 트랜스글루타미나제에 의한 결합제의 접합 부위-특이적 접합과 관련된 문헌에 기재된 접근법이다. 또한 박테리아 트랜스글루타미나제 (BTG) (EC 2.3.2.13)를 포함하는 트랜스글루타미나제 (TGase)는 글루타민의 γ-카르보닐-아미드 기와 리신의 1급 아민 기 사이의 공유 결합의 형성을 촉매하는 효소의 패밀리이다. 이러한 트랜스글루타미나제는 또한 아민 공여자로서 리신 이외의 기질을 수용하기 때문에, 이들은 적합한 수용자 글루타민에서 항체를 포함하는 단백질을 변형시키는 데 사용되었다 (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010); Josten et al., J. Immunol. Methods 240, 47-54 (2000); Mindt et al., Bioconjugate Chem. 19, 271-278 (2008); Dennler et al., in Antibody Drug Conjuagtes (Ducry, L., Ed.), pp 205-215, Humana Press. (2013)). 한편으로는, 트랜스글루타미나제는 유전 공학에 의해 항체 내로 도입된 수용자 글루타민 잔기인 인공 글루타민 태그를 함유하는 항체에 대한 약물의 접합에 사용되었다 (Strop et al., Chem. Biol. 20, 161-167 (2013)). 다른 한편으로는, 항체의 중쇄의 불변 영역의 보존된 글루타민 잔기 Q295 (카바트 EU 넘버링)가 비-글리코실화 IgG1 분자의 백본 내에 박테리아 트랜스글루타미나제 (EC 2.3.2.13)를 위한 유일한 γ-카르보닐-아미드 공여자이고, 따라서 수용자 글루타민인 반면에, 항체가 중쇄의 위치 N297 (카바트 EU 넘버링)에서 글리코실화된 경우에 수용자 글루타민은 IgG1의 백본 내에 존재하지 않는다는 것이 언급되었다 (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)). 요약하면, 박테리아 트랜스글루타미나제는 항체의 수용자 글루타민 잔기에서의 아민-공여자 기질, 예를 들어 약물-링커 구축물의 접합에 사용될 수 있다. 이러한 수용자 글루타민은 돌연변이에 의한 항체의 조작 또는 비-글리코실화 항체의 생성에 의해 도입될 수 있다. 이러한 비-글리코실화 항체는 N-글리코시다제 F (PNGase F)를 사용하는 탈글리코실화 또는 N을 제외한 임의의 다른 아미노산으로의 중쇄의 글리코실화 부위 N297 (카바트 EU 넘버링)의 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 박테리아 트랜스글루타미나제를 사용하는 이러한 비-글리코실화 항체의 효소적 접합은 돌연변이 N297D, N297Q (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) 또는 N297S (특허 출원 WO2013092998A1 및 WO2013092983A2 참조)를 함유하는 비-글리코실화 항체 변이체에 대해 기재되었다. 트랜스글루타미나제에 의한 이러한 비-글리코실화 항체의 효소적 접합은 일반적으로 2의 DAR을 갖는 ADC를 제공하며, 여기서 두 중쇄는 위치 Q295 (카바트 EU 넘버링)에서 특이적으로 관능화된다. 단지 중쇄의 돌연변이 N297Q만이 중쇄당 추가의 접합 부위를 제공한다. 이러한 변이체의 접합은 4의 DAR을 갖는 ADC로 이어지며, 여기서 두 중쇄는 위치 Q295 및 Q297에서 특이적으로 관능화된다. 중쇄가 돌연변이 Q295N 및 N297Q를 보유하는 항체 변이체는 중쇄당 위치 Q297 (카바트 넘버링)에서 단지 1개의 수용자 글루타민 잔기를 갖는다 (Simone Jeger, Site specific conjugation of tumour targeting antibodies using transglutaminase, Thesis at ETH Zurich (2009)). 박테리아 트랜스글루타미나제를 사용하는 비-글리코실화 항체의 접합 부위-특이적 접합을 기재하는 여러 예가 문헌에 존재한다 (예를 들어 문헌 [Dennler et al., Bioconjugate Chemistry 19, 569-578 (2014); Lhospice et al., Molecular Pharmaceutics 12, 1863-1871 (2015))). 비-글리코실화 항체의 트랜스글루타미나제-촉매 접합 부위-특이적 관능화의 전략이 도 1에 요약되어 있다.
커플링 - 접합 부위-특이적 및 접합 부위-비특이적 방식 둘 다 -은 링커로 지칭되는 것을 사용하여 달성된다. 링커는 생체내에서 절단될 수 있는 링커의 군 및 생체내에서 안정한 링커의 군으로 카테고리화될 수 있다 (문헌 [L. Ducry and B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)] 참조). 생체내에서 절단될 수 있는 링커는 생체내에서 절단될 수 있는 기를 갖고, 이는 차례로 생체내에서 화학적으로 절단가능한 기 및 생체내에서 효소적으로 절단가능한 기로 구별될 수있다. "생체내에서 화학적으로 절단가능한" 및 "생체내에서 효소적으로 절단가능한"은 링커 또는 기가 순환에서 안정하고 단지 표적 세포에서 또는 그 안에서 내부의 화학적으로 또는 효소적으로 상이한 환경 (보다 낮은 pH; 상승된 글루타티온 농도; 리소솜 효소 예컨대 카텝신 또는 플라스민, 또는 글리코시다제 예컨대, 예를 들어, β-글루쿠로니다제의 존재)에 의해 절단되어, 저분자량 KSP 억제제 또는 그의 유도체를 방출하는 것을 의미한다. 생체내에서 화학적으로 절단될 수 있는 기는 특히 디술피드, 히드라존, 아세탈 및 아미날이고; 생체내에서 효소적으로 절단될 수 있는 기는 특히 2-8-올리고펩티드 기, 특히 디펩티드 기 또는 글리코시드이다. 펩티드 절단 부위는 문헌 [Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869 및 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346 및 또한 Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626]에 개시되어 있다. 이들은, 예를 들어, 알라닌-알라닌-아스파라긴, 발린-알라닌, 발린-리신, 발린-시트룰린, 알라닌-리신 및 페닐알라닌-리신 (임의로 추가의 아미드 기를 가짐)을 포함한다.
유리 약물의 충분한 방출을 보증하기 위해, 임의로 효소적 절단 부위와 약물 사이에 자기 희생적 링커 요소 (SIG)로 칭해지는 것을 포함하는 것이 또한 가능하다 (Anticancer Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). 약물은 다양한 메카니즘, 예를 들어 친핵성 기의 초기 효소적 방출 후 전자 캐스케이드를 통한 후속 제거 (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71) 또는 상응하는 링커 요소의 고리화 (Bioorg. Med. Chem., 2003, 11, 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17, 2241) 또는 이 둘의 조합 (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378)에 의해 방출될 수 있다. 이러한 링커 요소의 예는 도면에 제시된다:
Figure pct00023
예를 들어 히스톤 데아세틸라제 및 카텝신 L에 의한 약물 방출을 위한 연속 효소적 단계의 예는 문헌 [Nat. Commun., 2013, 4, 2735]에 기재되어 있고 도 2에 예시되어 있다.
생체내에서 안정한 링커는 높은 안정성 (혈장에서 24시간 후 5% 미만의 대사물)에 의해 구별되고 상기 언급된 생체내에서 화학적으로 또는 효소적으로 절단가능한 기를 갖지 않는다.
링커 -Lb- 또는 -Lc-는 바람직하게는 하기 기본 구조 (i) 내지 (iv) 중 하나를 갖는다.
(i) -(C=O)m-SG1-L1-L2-
(ii) -(C=O)m -L1-SG-L1-L2-
(iii) -(C=O)m -L1-L2-
(iv) -(C=O)m -L1-SG-L2
여기서 m은 0 또는 1이고; SG는 생체내에서 (화학적으로 또는 효소적으로) 절단가능한 기 (특히 디술피드, 히드라존, 아세탈 및 아미날; 또는 레구마인, 카텝신 또는 플라스민에 의해 절단될 수 있는 2-8-올리고펩티드 기)이고, SG1은 올리고펩티드 기 또는 바람직하게는 디펩티드 기이고, L1은 서로 독립적으로 생체내에서 안정한 유기 기를 나타내고, L2는 결합제에 대한 커플링 기 또는 단일 결합을 나타낸다. 여기서, 커플링은 바람직하게는 항체의 시스테인 잔기 또는 리신 잔기에 대한 것이다. 대안적으로, 커플링은 항체의 티로신 잔기, 글루타민 잔기 또는 비천연 아미노산에 대한 것일 수 있다. 비천연 아미노산은, 예를 들어, 알데히드 또는 케토 기 (예컨대, 예를 들어, 포르밀글리신) 또는 아지드 또는 알킨 기를 함유할 수 있다 (문헌 [Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806] 참조).
기본 링커 구조 (iii)가 본 발명에 따라 특히 바람직하다. 기본 링커 구조 (iii)를 갖고 링커가 항체의 시스테인 또는 리신 잔기에 커플링된 본 발명에 따른 접합체의 투여는 대사를 통해 하기 화학식의 시스테인 또는 리신 유도체로 이어진다.
Figure pct00024
여기서 L1은 각각의 경우에 세포독성 약물, 예를 들어 저분자량 KSP 억제제, 예를 들어 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V), (VI) 또는 (VII)의 화합물에 연결된다.
특히 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), 또는 (V)의 화합물의 위치 R1에 결합하는 경우에, 특히 L1 기가 하기 구조 중 하나를 갖는 경우에 링커 기본 구조 (ii) 및 (iv)가 또한 본 발명에 따라 바람직하다.
(a) -NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-C(=O)-Y7 여기서
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H 또는 -C(=O)-CH3이고
Y7은 단일 결합 또는 -NH-(CH2)0-4-CHNH2-C(=O)-이고,
이에 따라, 절단 후, 상응하는 구조
-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH 또는
-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-C(=O)-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH가 수득된다.
(b) -CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-C(=O)- 여기서
x는 0 또는 1이고,
Y5는 -H 또는 -NHY6이고,
Y6은 -H 또는 -C(=O)-CH3이고,
이에 따라, 절단 후, 상응하는 구조
-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH
가 수득된다.
링커가 시스테인 측쇄 또는 시스테인 잔기에 연결된 경우에, L2는 바람직하게는 시스테인의 술프히드릴 기와 반응하는 기로부터 유래된다. 이들은 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화 화합물, 비닐술폰, 피리딜 디술피드, TNB 티올 및 디술피드-환원제를 포함한다. 이들 기는 일반적으로 친전자성 방식으로 술프히드릴 결합과 반응하여, 술피드 (예를 들어 티오에테르) 또는 디술피드 가교를 형성한다. 안정한 술피드 가교가 바람직하다.
L2는 바람직하게는 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00025
여기서
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
R22는 -COOH, -C(=O)-OR, -C(=O)R, -C(=O)-NHR 또는 -C(=O)N(R)2이고
R은 C1-3-알킬, -C(=O)-NH2 또는 -COOH이다.
여기서 R은 -COOH인 경우가 바람직하다.
L2는 하기 화학식 A3 및 A4를 갖는 본 발명의 화합물이 특히 바람직하다.
Figure pct00026
여기서
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 약물 분자에 대한 연결 부위이고,
x는 1 또는 2이고
R22는 -COOH, -C(=O)-OR, -C(=O)-R, -C(=O)-NR2, -C(=O)-NHR 또는 -C(=O)-NH2이고
R은 C1-3-알킬이다.
바람직하게는 이와 관련하여, R22는 -COOH이고, 특히, 이와 관련하여, x가 1인 경우에 R22는 -COOH이다.
본 발명에 따른 접합체에서 또는 본 발명에 따른 접합체의 혼합물에서, 항체의 시스테인 잔기에 대한 결합은 바람직하게는 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과 (각각의 경우에 항체에 대한 링커의 결합의 총수에 기초함)의 정도로, 보다 바람직하게는 화학식 A3 또는 A4의 2종의 구조 중 하나로서 존재한다. 여기서, 화학식 A3 또는 A4의 구조는 일반적으로 함께, 항체에 대한 결합의 수에 기초하여 바람직하게는 60:40 내지 40:60의 비로 존재한다. 이어서, 나머지 결합은 구조
Figure pct00027
로서 존재하며,
여기서
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고
#2는 약물 분자에 대한 연결 부위이다.
본 발명에 따르면, L1은 바람직하게는 화학식 #1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2에 의해 나타내어지며,
여기서
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고
#2는 약물 분자에 대한 연결 부위이고,
R10은 -H, -NH2 또는 C1-C3-알킬이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
Figure pct00028
이고
G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 이루어진, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 히드로카르빌 쇄이고, 이는 기 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(NH)NRy-, -C(=O)-NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-, -C(=O)-, -CRx=N-O-, 및/또는 N, O 및 S, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 추가적으로 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Ry는 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이들 각각은 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이다.
이와 관련하여, G1은 바람직하게는
Figure pct00029
이고 G1이 -NH-C(=O)- 또는
Figure pct00030
인 경우에 R10은 바람직하게는 -NH2가 아니다.
바람직하게는, G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 히드로카르빌 쇄이고, 이는 기 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 N, O 및 S, 또는 -S(=O)-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있다.
보다 바람직하게는, G2는
Figure pct00031
이고, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 추가적으로 -NH-C(=O)-NH2에 의해 치환될 수 있다.
G2는 추가로 바람직하게는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 히드로카르빌 쇄이고, 이는 기 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH- -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, -CRx=N-O-, 및/또는 N, O 및 S, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 추가적으로 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이다.
이와 관련하여, G2는 바람직하게는
Figure pct00032
이다.
바람직하게는, G2는 구조
Figure pct00033
의 개재기를 나타내며,
여기서
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이고,
#1은 KSP 억제제 또는 전구약물에 대한 결합이고
#2는 항체에 대한 커플링 기 (예를 들어 L2)에 대한 결합이다.
아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기의 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 일반적으로 각각 언급된 수의 탄소 원자를 갖는 α,ω-2가 알킬 라디칼을 포함한다. 바람직한 예는 하기를 포함한다: 메틸렌, 에탄-1,2-디일 (1,2-에틸렌), 프로판-1,3-디일 (1,3-프로필렌), 부탄-1,4-디일 (1,4-부틸렌), 펜탄-1,5-디일 (1,5-펜틸렌), 헥산-1,6-디일 (1,6-헥실렌), 헵탄-1,7-디일 (1,7-헥실렌), 옥탄-1,8-디일 (1,8-옥틸렌), 노난-1,9-디일 (1,9-노닐렌), 데칸-1,10-디일 (1,10-데실렌).
분지형 탄화수소 쇄는 직쇄형 탄화수소 쇄 또는 직쇄형 알킬렌 기 내의 1개 이상의 수소 원자가 C1-10-알킬 기에 의해 치환되어, 분지형 탄화수소 또는 측쇄를 형성한 것을 의미한다.
탄화수소 쇄는 추가적으로 시클릭 알킬렌 기 (시클로알칸디일), 예를 들어 1,4-시클로헥산디일 또는 1,3-시클로펜탄디일을 함유할 수 있다. 이들 시클릭 기는 불포화일 수 있다. 특히, 방향족 기 (아릴렌 기), 예를 들어 페닐렌은 탄화수소 쇄 내에 존재할 수 있다. 차례로 시클릭 알킬렌 기 및 아릴렌 기 내의 1개 이상의 수소 원자가 C1-10-알킬 기에 의해 임의로 치환되는 것이 또한 가능하다. 이러한 방식으로, 임의로 분지형 탄화수소 쇄가 형성된다. 이러한 탄화수소 쇄는 총 0 내지 100개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 50개, 특히 바람직하게는 2 내지 25개의 탄소 원자를 갖는다.
분지형 탄화수소 또는 측쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
탄화수소 쇄는 기 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있다.
여기서 기
Figure pct00034
가 바람직하다.
추가로 G2 내의 개재기는 바람직하게는
Figure pct00035
이다.
바람직하게는, 링커 L은 하기 화학식에 상응한다.
§-(C(=O))m-L1-L2-§§
여기서
m은 0 또는 1이고,
§는 약물 분자 또는 전구약물에 대한 결합이고,
§§는 결합제 펩티드 또는 단백질에 대한 결합이고,
L1 및 L2는 상기 주어진 정의를 갖는다.
보다 바람직하게는, 및 상기 정의를 참조하여, L1은 하기 단순화된 화학식에 상응한다.
-NR11B-
여기서
R11은 -H 또는 -NH2이고,
B는 -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- 기이고,
w는 0 내지 20이고,
x는 0 내지 5이고,
y는 0 또는 1이고,
z는 0 내지 5이고
X4는 -O-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)- 또는
Figure pct00036
이다.
바람직하게는, 링커 L은 화학식
Figure pct00037
를 가지며,
여기서
#3은 약물 분자 또는 전구약물에 대한 결합이고,
#4는 결합제 펩티드 또는 단백질에 대한 결합이고,
R11은 -H 또는 -NH2이고,
B는 -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- 기이고,
w는 0 내지 20이고,
x는 0 내지 5이고,
y는 0 또는 1이고,
z는 1 내지 5이고
X4는 -O-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)- 또는
Figure pct00038
이다.
상기 언급된 링커는 링커가 수소 원자의 치환에 의해 R1에 또는 절단가능한 링커 SG1과 함께 R4에 커플링된, 즉 R1은 -L-#1이거나 또는 R4는 -SG1-L-#1이며, 여기서 #1은 항체에 대한 결합인 화학식 (IIa)의 접합체에서 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 접합체에서 또는 본 발명에 따른 접합체의 혼합물에서, 항체의 시스테인 잔기에 대한 결합은 바람직하게는 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과 (각각의 경우에 항체에 대한 링커의 결합의 총수에 기초함)의 정도로 존재한다.
여기서 화학식 (A5) 및 (A6)의 2종의 구조가 특히 바람직하다.
Figure pct00039
여기서
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
R22는 -COOH, -C(=O)-OR, -C(=O)-R, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NR2 또는 -C(=O)-NHR이고
R은 C1-3-알킬이다.
보다 바람직하게는, R22는 -COOH이다.
화학식 A5 또는 A6의 구조는 일반적으로 여기서 함께, 항체에 대한 결합의 수에 기초하여 바람직하게는 60:40 내지 40:60의 비로 존재한다. 이어서, 나머지 결합은 구조
Figure pct00040
로 존재하며,
여기서
#1 및 #2는 상기 주어진 정의를 갖는다.
시스테인 측쇄 또는 시스테인 잔기에 결합된 링커 -Lb- 및 -Lc-는 화학식
Figure pct00041
를 가지며,
여기서
§는 약물 분자 또는 전구약물에 대한 결합이고,
§§는 결합제 펩티드 또는 단백질에 대한 결합이고,
m은 0, 1, 2, 또는 3이고,
n은 0, 1 또는 2이고,
p는 0 내지 20이고,
L3은 기
Figure pct00042
이며,
여기서
o는 0 또는 1이고,
G3은 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 히드로카르빌 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 추가적으로 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
§'는 -S(O)n 기에 대한 결합이고
§"는 고리 내의 질소 원자에 대한 결합이다.
바람직하게는, 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클은 5- 내지 10-원이다.
바람직하게는, G3은
Figure pct00043
이다.
화학식
Figure pct00044
의 화합물이 바람직하며,
여기서
m은 1이고,
p는 0이고,
n은 0이고,
L3은 기
Figure pct00045
이며
여기서
o는 0 또는 1이고,
G3은 -(CH2CH2O)s - (CH2)t - (C(=O)-NH)u - CH2CH2O)v - (CH2)w-이고,
s, t, v 및 w는 독립적으로 0 내지 20이고,
u는 0 또는 1이고,
§'는 -S(O)n 기에 대한 결합이고
§"는 고리 내의 질소 원자에 대한 결합이다.
상기 화학식 §-(C(=O))m-L1-L2-§§의 바람직한 기 L1은 하기 표에 열거된 것이며, 여기서 r은 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 15, 보다 바람직하게는 1 내지 20, 특히 바람직하게는 2 내지 10의 수이다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
L1의 추가의 예가 표 C에 제공되며, 여기서 이러한 기는 박스로 강조된다.
하기 표 A 및 A'는 링커 모이어티 L1의 예를 제공한다. 표는 또한 L1의 이들 예가 바람직하게는 결합되는 L2 기, 및 또한 바람직한 커플링 부위 (화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (V) 및 (VI)의 화합물의 R1 또는 R3) 및 m의 바람직한 값, 즉 L1 앞에 카르보닐 기가 존재하는지 여부 (§-(C(=O))m-L1-L2-§§ 참조)를 언급한다. 이들 링커는 바람직하게는 시스테인 잔기에 커플링된다. L2가 숙신이미드이거나 또는 그로부터 유래된 경우에, 이러한 이미드는 또한 전체적으로 또는 부분적으로 상기 기재된 바와 같은 가수분해된 개방쇄 숙신아미드의 형태로 존재할 수 있다. L1에 따라, 개방쇄 숙신아미드에 대한 이러한 가수분해의 정도는 다소 상당할 수 있거나 또는 심지어 부재할 수 있다.
표 A
(Subst. = 치환기)
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
**보다 바람직하게는, 이들 라인에 명시된 링커 L1은 화학식 (A7) 및 (A8)로부터 선택된 링커 L2에 연결된다.
Figure pct00067
여기서
#1은 결합제의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
R22는 바람직하게는 -COOH이다.
본 발명에 따른 접합체에서 또는 본 발명에 따른 접합체의 혼합물에서, 결합제의 시스테인 잔기에 대한 결합은 각각의 경우에 결합제에 대한 링커의 결합의 총수에 기초하여 바람직하게는 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과의 정도로, 및 보다 바람직하게는 화학식 (A7) 및 (A8)의 2종의 구조 중 하나로 존재한다.
이와 관련하여, 화학식 (A7) 및 (A8)의 구조는 일반적으로 함께, 결합제에 대한 결합의 수에 기초하여 바람직하게는 60:40 내지 40:60의 비로 존재한다. 이어서, 나머지 결합은 구조
Figure pct00068
로 존재하며,
여기서 #1 및 #2는 상기 주어진 정의를 갖는다.
표 A'
(Subst. = 치환기)
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
**: 표 A에 대한 주 **를 참조한다.
***: 이러한 구조 L2가 존재하는 경우에, 하기 화학식의 구조 L2가 동시에 존재할 수 있다.
Figure pct00100
상응하는 링커를 갖는 접합체의 예는 하기 구조를 가지며, 여기서 X1은 CH를 나타내고, X2는 C를 나타내고 X3은 N을 나타내고 L1은 상기 주어진 정의를 갖고, L2 및 L3은 L1과 동일한 정의를 갖고, AK1은 시스테인 잔기를 통해 결합된 항체이고 n은 1 내지 10의 수이다.
보다 바람직하게는, AK1은 항체 또는 항원-결합 항체이다. 항체는 바람직하게는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 특히 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
Figure pct00101
Figure pct00102
이와 관련하여,
AK1은 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이고
n은 1 내지 20의 수이다.
링커의 기본 구조 (i), (ii) 및 (iv)가 추가적으로 바람직하다.
(i) -(C=O)m-SG1-L1-L2-
(ii) -(C=O)m -L1-SG-L1-L2-
(iii) -(C=O)m -L1-SG-L2,
여기서 SG1 또는 SG는 카텝신-절단가능한 기를 나타내고, L1 및 L2는 표 A'에 열거된 정의를 갖는다. 하기 기가 특히 바람직하다.
-Val-Ala-C(=O)-NH- (알라닌의 C-말단 아미드에서 아미드 결합의 절단을 일으킴)
-NH-Val-Lys-C(=O)-NH- (리신의 C-말단 아미드에서의 아미드 결합의 절단)
-NH-Val-Cit-C(=O)-NH- (시트룰린의 C-말단 아미드에서의 아미드 결합의 절단)
-NH-Phe-Lys-C(=O)-NH- (리신의 C-말단 아미드에서의 아미드 결합의 절단)
-NH-Ala-Lys-C(=O)-NH- (리신의 C-말단 아미드에서의 아미드 결합의 절단)
-NH-Ala-Cit-C(=O)-NH- (시트룰린의 C-말단 아미드에서의 아미드 결합의 절단)
이와 관련하여, 화학식
Figure pct00103
에 따른 SG1 또는 SG가 특히 바람직하며,
여기서
X는 -H, 또는 C1-10-알킬 기이고 이는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 또는 술폰산에 의해 임의로 치환될 수 있다.
하기 표 C는 링커 모이어티 -SG1-L1- 또는 -L1-SG-L1-의 예를 제공하며, 여기서 SG1/SG는 카텝신-절단가능한 기이다. 표 C는 또한 -SG1-L1- 및 -L1-SG-L1-의 이들 예가 바람직하게는 결합되는 L2 기, 및 또한 바람직한 커플링 부위 (R1-R5) 및 m에 대한 바람직한 값, 즉 L1 앞에 카르보닐 기가 존재하는지 여부 (§-(C(=O))m-L1-L2-§§ 참조)를 언급한다. 이들 링커는 바람직하게는 시스테인 잔기에 커플링된다. L1 기가 박스로 강조된다. 그러나, 이들 L1 기는 상기 화학식 §-(C(=O))m-L1-L2-§§에 대해 명시된 L1 기 중 하나에 의해 대체될 수 있다. L2가 숙신아미드이거나 또는 그로부터 유래된 경우에, 이러한 아미드는 또한 전체적으로 또는 부분적으로 상기 기재된 바와 같은 가수분해된 개방쇄 숙신아미드의 형태로 존재할 수 있다.
표 C
(Subst. = 치환기)
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
링커의 기본 구조 (i)를 갖는 접합체의 예
(i) -(C=O)m-SG1-L1-L2-
여기서 m, SG1, L1 및 L2는 표 C에 주어진 정의를 갖고, 하기 구조 중 하나를 가지며,
Figure pct00114
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고,
X3은 N이고,
L4는 L1에 대해 표 C에 상기 명시된 바와 동일한 정의를 갖고,
AK1은 시스테인 잔기를 통해 결합된 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이고,
n은 1 내지 20의 수이고, 화학식 IIa에 따른 위치 R4 내의 (즉 -NH2 기 내의) 수소 원자는 본 발명에 따라 사용된 화학식 Ia의 레구마인-절단가능한 기에 의해 대체된다.
보다 바람직하게는, AK1은 항체 또는 항원-결합 항체이다. 항체는 바람직하게는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 특히 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007,TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
트랜스글루타미나제-촉매 접합의 경우에, 문헌은 접합 부위-특이적 방식의 결합제, 예를 들어 항체에 대한 유기 분자의 공유 커플링 (접합)에 대한 다양한 옵션을 개시한다 (예를 들어 문헌 [Sochaj et al., Biotechnology Advances, 33, 775-784, (2015), Panowski et al., MAbs 6, 34-45 (2014)] 참조). 트랜스글루타미나제를 사용하는 항체의 수용자 글루타민 잔기를 통한 항체에 대한 KSP 억제제 또는 전구약물의 접합이 본 발명에 따라 바람직하다. 이러한 수용자 글루타민 잔기는 항체의 조작 또는 비-글리코실화 항체를 생성하는 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 항체 내의 이들 수용자 글루타민의 수는 바람직하게는 2 또는 4개이다. 적합한 링커가 커플링 (접합)에 사용된다. 적합한 링커 구조는 트랜스글루타미나제에 적합한 기질을 구성하는 유리 아민 공여자 관능기를 보유하는 것이다. 링커는 다양한 방식으로 항체에 연결될 수 있다.
바람직하게는, 트랜스글루타미나제-촉매 접합의 경우에, 링커는 이미 상기 언급된 기본 구조 (i) 내지 (iv) 중 하나를 갖는다.
(i) -(C=O)m-SG1-L1-L2-
(ii) -(C=O)m -L1-SG-L1-L2-
(iii) -(C=O)m -L1-L2-
(iv) -(C=O)m -L1-SG-L2
여기서
L1, SG, SG1 및 m은 상기 주어진 정의를 갖지만,
그러나, L2는 바람직하게는, 하기 기 중 하나를 나타내며,
Figure pct00115
여기서
Ry는 -H, -C(=O)-NH-알킬, -NH-C(=O)-알킬, -C(=O)-NH2 또는 -NH2이고,
#1은 L1에 대한 연결 지점이고
#2는 결합제의 글루타민 잔기에 대한 연결 지점이다.
바람직하게는 이와 관련하여, Ry는 -H 또는 -NH-C(=O)-CH3이다.
상응하는 접합체의 예는 하기 구조를 가지며, 여기서 X1, X2, X3, Ry 및 L1은 상기 주어진 정의를 갖고, AK는 바람직하게는 항체인 결합제이고, n은 바람직하게는 2 또는 4이다.
Figure pct00116
특히 바람직한 KSP 억제제 접합체
결합제 또는 그의 유도체 (바람직하게는 항체)와 화학식 (X)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염으로 구성된 접합체가 또한 바람직하다.
Figure pct00117
여기서
AK는 결합제 (바람직하게는 항체) AK1, AK2, AK3, 또는 그의 유도체이고,
n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나;
또는
X1은 N이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나;
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나;
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나;
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고
A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2- 또는 -S(=O)2-NH-이고,
M은 기
(*)-C(=O)-NH-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-NH-C(=O)-CH(CH2-CH2-COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(**),
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
(*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
(*)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
(*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-C(=O)-NH-R12,
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
이고
R12는 기
(*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH, (*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH 또는
Figure pct00124
이고
R1은 수소 또는 기
Figure pct00125
이고
X는 -C(=O)-NH2이고,
Rx 및 Ry는 독립적으로 -CH3, -CH2-COOH, -(CH2)2-COOH, -CH2-C(=O)-NH2, -CH2OH 또는 -CH2R11이고,
R10은 메틸, -(C(=O))q-O-R11, -C(=O)-(CH2)m-R11이고,
q는 0 또는 1이고,
m은 0, 1 또는 2이고,
R11은 수소, 메틸, 벤질, 피리딜, 이미다졸릴 또는 기 -(O-CH2-CH2)p-O-CH3이고,
p는 1 내지 11이고,
R2는 -H이고,
R3은 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
n은 0, 1 또는 2이고,
Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH-(NHC(=OCH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R5는 -H, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, -CN, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실, -NO2, -NH2, -COOH 또는 할로겐이고,
R8은 C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, C4-10-시클로알킬, 플루오로-C4-10-시클로알킬 또는 -(CH2)0-2-(HZ2)이고,
HZ2는 N, O 및 S로부터 선택된 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 4- 내지 7-원 헤테로사이클이고, 이는 -OH, -COOH 또는 -NH2에 의해 치환될 수 있고,
R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
(*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
(**)는 결합제에 대한 결합이다.
이들 중 관심있는 것은
AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편이고,
n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N이고;
A는 -C(=O)-이고,
M은 기
(*)-C(=O)-NH-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-NH-C(=O)-CH(CH2-CH2-COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
(*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(**),
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
(*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
(*)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
(*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-C(=O)-NH-R12,
Figure pct00129
Figure pct00130
이고,
R12는 기
(*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH, (*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH 또는
Figure pct00131
이고
R1은 수소 또는 기
Figure pct00132
이고
X는 -C(=O)-NH2이고,
Rx 및 Ry는 독립적으로 -CH3, -CH2-COOH, -(CH2)2-COOH, -CH2-C(=O)-NH2, -CH2OH 또는 -CH2R11이고,
R10은 메틸, -(C(=O))q-O-R11, -C(=O)-(CH2)m-R11이고,
q는 0 또는 1이고,
m은 0, 1 또는 2이고,
R11은 수소, 메틸, 벤질, 피리딜, 이미다졸릴 또는 기 -(O-CH2-CH2)p-O-CH3이고,
p는 1 내지 11이고,
R2는 -H이고,
R3은 -CH2-OH 기이고,
R5는 -H이고,
R6 및 R7은 독립적으로 플루오린이고,
R8은 t-부틸이고,
R9는 -H이고,
(*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
(**)는 결합제에 대한 결합인
화학식 (X)의 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이다.
또한 관심있는 것은 결합제 또는 그의 유도체 (바람직하게는 항체)와 화학식 (XI) 및 (XI')의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염으로 구성된 접합체이다.
Figure pct00133
여기서
AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편이고,
n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나;
또는
X1은 N이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나;
또는
X1은 CH 또는 CF이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나;
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나;
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고
M은 기
Figure pct00134
Figure pct00135
및
-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-R12
이고
R12는 기
(*)-C(=O)-(**), (*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH,
(*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH
Figure pct00136
이고
R1은 기
Figure pct00137
이고
X는 -CH2-C(=O)-NH2, -C(=O)-NH2이고,
Rx 및 Ry는 -CH3, 프로필이고,
R10은 -C(=O)-(CH2)-R11, -C(=O)-(CH2-CH2-O)p-CH3이고,
R11은 수소, 피리딜이고,
p는 8 내지 12이고,
R5는 -H이고,
R6 및 R7은 독립적으로 플루오린이고,
R8은 t-부틸이고,
R9는 -H이고,
(*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
(**)는 결합제에 대한 결합이다.
이들 중 관심있는 것은
AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편이고,
n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N이고;
M은 기
Figure pct00138
Figure pct00139
및
-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-R12
이고
R12는 기
(*)-C(=O)-(**), (*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH,
(*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH
Figure pct00140
이고
R1은 기
Figure pct00141
이고
X는 -CH2-C(=O)-NH2, -C(=O)-NH2이고,
Rx 및 Ry는 -CH3, 프로필이고,
R10은 -C(=O)-(CH2)-R11, -C(=O)-(CH2-CH2-O)p-CH3이고,
R11은 수소, 피리딜이고,
p는 8 내지 12이고,
R5는 -H이고,
R6 및 R7은 독립적으로 플루오린이고,
R8은 t-부틸이고,
R9는 -H이고,
(*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
(**)는 결합제에 대한 결합인
화학식 (XI) 및 (XI')의 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이다.
하기 KSP-억제제 접합체가 본 발명에 따라 특히 바람직하다:
AK (AK1; AK2; AK3)는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 단편이고,
n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이다.
AK1은 바람직하게는 시스테인 잔기를 통해 KSP 억제제에 결합된 항체이다.
AK2는 바람직하게는 리신 잔기를 통해 KSP 억제제에 결합된 항체이다.
AK3은 바람직하게는 글루타민 잔기를 통해 KSP 억제제에 결합된 항체이다.
본원에 사용된 결합제 또는 항체는 바람직하게는 설명에서 바람직한 것으로서 기재된 결합제 및 항체이다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
특히 바람직한 접합체는 하기와 같다.
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
.
KSP 억제제-링커 중간체 또는 전구약물-링커 중간체 및 접합체의 제조
본 발명에 따른 접합체는 처음에 저분자량 KSP 억제제 또는 그의 전구약물에게 링커를 제공함으로써 제조된다. 이어서, 이러한 방식으로 수득된 중간체를 결합제 (바람직하게는 항체)와 반응시킨다.
바람직하게는, 시스테인 잔기에 대한 커플링의 경우, 하기 화합물 중 하나를 이러한 목적을 위해 임의로 부분적으로 환원된 시스테인-함유 결합제 예컨대 항체와 반응시킨다.
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
여기서
X1은 CH이고,
X2는 C이고,
X3은 N이고,
R은 -H 또는 -COOH이고,
K는 선형 또는 분지형, 임의로 C1-C6 알콕시- 또는 -OH-치환된 C1-C6 알킬이고,
SG1, L1, L2, L3 및 L4는 상기 주어진 정의를 갖는다.
상기 기재된 화학식, 및 또한 하기 반응식 및 구조식에서, 화학식 IIa에 따른 위치 R4 내의, 즉 -NH2 기 내의 수소 원자는 본 발명에 따라 사용된 화학식 Ia의 레구마인-절단가능한 기에 의해 대체될 수 있다.
각각의 상기 화합물 및 하기 화합물에서, tert-부틸 기는 시클로헥실에 의해 대체될 수 있다.
화합물은, 예를 들어, 그의 트리플루오로아세트산 염의 형태로 사용될 수 있다. 결합제, 예를 들어 항체와의 반응을 위해, 화합물은 바람직하게는 결합제에 대해 2- 내지 12-배 몰 과량으로 사용된다.
바람직하게는, 리신 잔기에 대한 커플링의 경우, 하기 화합물 중 하나를 리신-함유 결합제 예컨대 항체와 반응시킨다.
Figure pct00172
화학식에서,
X1은 CH이고,
X2는 C이고,
X3은 N이고
L4는 L1과 동일한 정의를 갖기며, 여기서 L1은 상기 기재된 바와 동일한 정의를 갖는다.
시스테인 잔기에 커플링시키는 중간체의 경우, 반응은 하기와 같이 예시될 수 있다.
Figure pct00173
다른 중간체 및 다른 항체가 상응하여 반응될 수 있다.
리신 잔기에 커플링시키는 중간체의 경우, 반응은 하기와 같이 예시될 수 있다.
Figure pct00174
본 발명에 따르면, 이는 하기 접합체를 제공한다.
Figure pct00175
이 반응 (개환)은 pH 7.5 내지 9, 바람직하게는 pH 8에서, 25℃ 내지 37℃의 온도에서, 예를 들어 교반함으로써 실시될 수 있다. 바람직한 교반 시간은 8 내지 30시간이다.
상기 화학식에서, X1은 CH를 나타내고, X2는 C를 나타내고 X3은 N을 나타내고, SG1 및 L1은 상기 기재된 바와 동일한 정의를 갖고, L2, L3 및 L4는 L1과 동일한 정의를 갖고; R 및 K는 상기 기재된 바와 동일한 정의를 갖는다.
AK1은 시스테인 잔기를 통해 커플링된 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이고, AK2는 리신 잔기를 통해 커플링된 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다. 보다 바람직하게는, AK1 및 AK2는 항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이다.
추가의 정의
또한 "TGase" 또는 "TG"로서 상호교환가능하게 사용되는 표현 "트랜스글루타미나제"는 펩티드-결합된 글루타민의 γ-카르복스아미드 기와 리신 또는 구조적으로 관련된 1급 아민, 예를 들어 아미노펜틸 기 또는, 예를 들어, 펩티드-결합된 리신의 ε-아미노 기 사이의 아실 전달 반응을 통해 단백질을 연결하여, 8-(γ-글루타밀)-리신 이소펩티드 결합을 생성하는 능력을 갖는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. TGase는 박테리아 트랜스글루타미나제 (BTG), 예를 들어 EC 참조 번호 2.3.2.13을 갖는 효소 (단백질-글루타민 γ-글루타밀트랜스퍼라제)를 포함한다.
표현 "수용자 글루타민"은, 항체의 아미노산 잔기를 지칭하는 경우에, 적합한 조건 하에, 트랜스글루타미나제에 의해 인식되고 트랜스글루타미나제 촉매작용 하에 이 특정한 글루타민과 리신 또는 구조적으로 관련된 1급 아민, 예를 들어 아미노펜틸 기 사이의 반응에 의해 그와 연결될 수 있는 글루타민 잔기를 의미한다. 수용자 글루타민은 표면-노출된 글루타민일 수 있다.
본원의 "아미노산 변형" 또는 "돌연변이"는 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 본원에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다. 본원의 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 단백질 서열 내의 주어진 위치에서의 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 교환을 의미한다. 예를 들어, 치환 Y50W는 위치 50에서의 티로신이 트립토판으로 교환된 모 폴리펩티드의 변이체를 기재한다. 폴리펩티드의 "변이체"는 참조 폴리펩티드, 전형적으로 천연 또는 "모" 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 기재한다. 폴리펩티드 변이체는 천연 아미노산 서열 내의 특정한 위치에서 1개 이상의 아미노산 교환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다.
표현 "접합 부위-특이적 접합체"는 1개 이상의 정의된 위치, 바람직하게는 글루타민 잔기에서 관능화된 결합제, 바람직하게는 항체와 잔기, 바람직하게는 링커-약물 잔기의 접합체를 기재한다. 박테리아 트랜스글루타미나제 (BTG) (EC 2.3.2.13)를 포함하는 트랜스글루타미나제 (TGase)는 글루타민-단백질 기질의 인식에 있어서 강한 특이성을 나타내고 "접합 부위-특이적 접합"을 촉매할 수 있다.
표현 "동종 접합체" 또는 "동종 ADC"는 결합제의 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%가 결합제당 동일한 수의 접합된 잔기를 갖는 접합 부위-특이적 접합체의 혼합물을 기재한다. 항체의 경우에, 이 수는 짝수, 바람직하게는 2 또는 4이어야 한다.
동위원소, 염, 용매화물, 동위원소 변형체
본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물의 모든 적합한 동위원소 변형체를 포괄한다. 본 발명의 화합물의 동위원소 변형체는 본원에서 본 발명의 화합물 내의 적어도 1개의 원자가 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 통상적으로 또는 우세하게 발생하는 원자 질량과 상이한 원자 질량을 갖는 또 다른 원자로 교환된 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘의 것, 예컨대 2H (중수소), 3H (삼중수소), 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36Cl, 82Br, 123I, 124I, 129I 및 131I이다. 본 발명에 따른 화합물의 특정한 동위원소 변형체, 특히 1개 이상의 방사성 동위원소가 혼입된 것은, 예를 들어, 체내 작용 메카니즘 또는 활성 성분 분포의 검사에 유익할 수 있고; 비교적 용이한 제조가능성 및 검출감도로 인해, 특히 3H 또는 14C 동위원소로 표지된 화합물은 이러한 목적에 적합하다. 또한, 동위원소, 예를 들어 중수소의 혼입은 화합물의 보다 큰 대사 안정성의 결과로서 특정한 치료 이익, 예를 들어 체내 반감기의 연장 또는 요구되는 활성 용량의 감소를 유도할 수 있고; 본 발명에 따른 화합물의 이러한 변형은 따라서 일부 경우에 또한 본 발명의 바람직한 실시양태를 구성할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 동위원소 변형체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 하기 추가로 기재된 방법 및 작업 실시예에 기재된 절차에 의해 각각의 시약 및/또는 출발 화합물의 상응하는 동위원소 변형을 사용함으로써 제조될 수 있다.
본 발명과 관련하여 바람직한 염은 본 발명에 따른 화합물의 생리학상 허용되는 염이다. 또한 그 자체로 제약 용도에 적합하지 않지만, 예를 들어, 본 발명에 따른 화합물의 단리 또는 정제에 사용될 수 있는 염이 포괄된다.
본 발명에 따른 화합물의 생리학상 허용되는 염은 무기 산, 카르복실산 및 술폰산의 산 부가염, 예를 들어 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 및 벤조산의 염을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 생리학상 허용되는 염은 또한 통상적인 염기의 염, 예로서 및 바람직하게는 알칼리 금속 염 (예를 들어 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염) 및 암모니아 또는 1 내지 16개의 탄소 원자를 갖는 유기 아민, 예로서 및 바람직하게는 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, 디메틸아미노에탄올, 프로카인, 디벤질아민, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 아르기닌, 리신 및 1,2-에틸렌디아민으로부터 유래된 암모늄 염을 포함한다.
본 발명과 관련하여 용매화물은 용매 분자와의 배위에 의해 고체 또는 액체 상태에서 착물을 형성하는 본 발명에 따른 화합물의 형태로서 기재된다. 수화물은 물과 배위가 이루어진 특정한 형태의 용매화물이다. 본 발명과 관련하여 바람직한 용매화물은 수화물이다.
본 발명은 추가적으로 또한 본 발명에 따른 화합물의 전구약물을 포괄한다. 본 발명과 관련하여 용어 "전구약물"은 그 자체로 생물학적 활성 또는 불활성일 수 있지만, 체내에서 그의 체류 시간 동안에 (예를 들어 대사적으로 또는 가수분해적으로) 반응되어 본 발명에 따른 화합물을 제공하는 화합물을 지칭한다.
특정한 실시양태
하기 실시양태가 특히 바람직하다.
실시양태 A:
화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 APDC이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 D1은 화학식 (IIe)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이며,
Figure pct00176
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나
또는
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고,
A는 -C(=O)-이고,
R1은 -L-#1, -H, -COOH, -C(=O)-NHNH2, -(CH2)1- 3NH2, -C(=O)-NZ"(CH2)1 - 3NH2 및 -C(=O)-NZ"CH2-COOH이고,
Z"는 -H 또는 -NH2이고,
R2는 -H이고,
R4는 화학식 (Ia)의 기이고
R3은 -L-#1, 또는 -OH, -O-알킬, -SH, -S-알킬, -O-C(=O)-알킬, -O-C(=O)-NH-알킬, -NH-C(=O)-알킬, -NH-C(=O)-NH-알킬, -S(=O)n-알킬, -S(=O)2-NH-알킬, -NH-알킬, -N(알킬)2 또는 -NH2에 의해 임의로 치환될 수 있는 C1-10-알킬 기이고,
R5는 -H 또는 -F이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬, 플루오로-C1-3-알킬, C2-4-알케닐, 플루오로-C2-4-알케닐, C2-4-알키닐, 플루오로-C2-4-알키닐, 히드록실 또는 할로겐이고,
R8은 분지형 C1-5-알킬 기 또는 시클로헥실 기이고,
R9는 -H 또는 -F이고,
-L-#1은 링커 기
§-(C(=O))m-L1-L2-§§
이며
여기서
m은 0 또는 1이고,
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
L2는 기
Figure pct00177
중 하나이고
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
L1은 기
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
이며
여기서
R10은 -H, -NH2 또는 C1-3-알킬이고,
G1은 -NHC(=O)- 또는
Figure pct00178
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, 또는 -S(=O)-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
#1은 KSP 억제제에 대한 결합이고,
#2는 항체에 대한 L2에 대한 결합이며,
여기서 치환기 R1 및 R3 중 하나는 링커 기 -L-#1이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'에서 언급된 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 n은 1 내지 10의 수이다.
바람직하게는, 여기서 항체는 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
여기서 R3은 알킬, 바람직하게는 C1-3 알킬로서 정의된 화학식 (IIe)의 화합물이 바람직하다.
이와 관련하여, G2는 바람직하게는
Figure pct00179
이다.
대안적으로, 링커 -L-#1은 리신 측쇄 또는 리신 잔기에 결합될 수 있다. 그러한 경우에, 이는 바람직하게는 하기 화학식을 갖는다.
-§-(SG)x-L4-C(=O)-§§
여기서
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
x는 0 또는 1이고,
SG는 절단가능한 기이고,
L4는 단일 결합 또는 기
-(C(=O))y-G4-
이고
y는 0 또는 1이고
G4는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
이와 관련하여, SG는 바람직하게는 2-8 올리고펩티드, 보다 바람직하게는 디펩티드이다.
바람직하게는, G4의 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는
Figure pct00180
에 의해 개재될 수 있다.
실시양태 B:
화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 APDC이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 D1은 화학식 (IIf)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이며,
Figure pct00181
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나,
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나,
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고,
A는 -C(=O)-이고,
R1은 -L-#1, -H, -COOH, -C(=O)-NHNH2, -(CH2)1- 3NH2, -C(=O)-NZ"(CH2)1 - 3NH2 및 -C(=O)-NZ"CH2C(=O)-OH이고,
Z"는 -H 또는 -NH2이고,
R2는 -H이고,
R4는 화학식 (Ia)의 기이고,
R3은 -L-#1, 또는 -OH, -O-알킬, -SH, -S-알킬, -O-C(=O)-알킬, -O-C(=O)-NH-알킬, -NH-C(=O)-알킬, -NH-C(=O)-NH-알킬, -S(=O)n-알킬, -S(=O)2-NH-알킬, -NH-알킬, -N(알킬)2 및 -NH2에 의해 임의로 치환될 수 있는 C1-10-알킬 기이고,
R5는 -H 또는 -F이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬, 플루오로-C1-3-알킬, C2-4-알케닐, 플루오로-C2-4-알케닐, C2-4-알키닐, 플루오로-C2-4-알키닐, 히드록실 또는 할로겐이고,
R8은 분지형 C1-5-알킬 기이고,
R9는 -H 또는 -F이고,
-L-#1은 기
§-(C(=O))m-L1-L2-§§
이며
여기서
m은 0 또는 1이고;
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
L2는 기
Figure pct00182
이고
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
L1은 기
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
이며
여기서
R10은 -H, -NH2 또는 C1-C3-알킬이고
G1은 -NH-C(=O)- 또는
Figure pct00183
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2.-, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, 또는 -S(=O)-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
#1은 KSP 억제제에 대한 결합이고,
#2는 항체에 대한 L2에 대한 결합이며,
여기서 치환기 R1 및 R3 중 하나는 링커 기 -L-#1이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'에서 언급된 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 n은 1 내지 10의 수이다.
바람직하게는, 여기서 항체는 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
여기서 R3은 알킬, 바람직하게는 C1-3 알킬로 정의된 화학식 (IIf)의 화합물이 바람직하다.
이와 관련하여, G2는 바람직하게는
Figure pct00184
이다.
대안적으로, 링커 -L-#1은 리신 측쇄 또는 리신 잔기에 결합될 수 있다. 그러한 경우에, 이는 바람직하게는 하기 화학식을 갖는다.
-§-(SG)x-L4-C(=O)-§§
여기서
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
x는 0 또는 1이고,
SG는 절단가능한 기이고,
L4는 단일 결합 또는 기
-(C=O)y-G4-
이고
y는 0 또는 1이고
G4는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
이와 관련하여, SG는 바람직하게는 2-8 올리고펩티드, 보다 바람직하게는 디펩티드이다.
바람직하게는, G4의 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는
Figure pct00185
에 의해 개재될 수 있다.
실시양태 C:
화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 APDC이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 D1은 화학식 (IIg)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이며,
Figure pct00186
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나
또는
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고,
A는 -C(=O)-이고,
R1은 -L-#1이고,
R2는 -H이고,
R4는 화학식 (Ia)의 기이고,
R3은 -OH, -O-알킬, -SH, -S-알킬, -O-C(=O)-알킬, -O-C(=O)-NH-알킬, -NH-C(=O)-알킬, -NH-C(=O)-NH-알킬, -S(=O)n-알킬, -S(=O)2-NH-알킬, -NH-알킬, -N(알킬)2 또는 -NH2에 의해 임의로 치환될 수 있는 C1-10-알킬 기이거나, 또는 -MOD이고,
-MOD는 기
-(NR10)n-(G1)o-G2-H
이고
R10은 -H 또는 C1-C3-알킬이고;
G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
Figure pct00187
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 -O-, -S-, -SO-, -S(=O)2, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-C(=O)- 또는 -CRx=N-O-에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 및/또는 분지형 탄화수소 쇄이며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이고,
Ry는 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이들 각각은 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
R5는 -H 또는 -F이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬, 플루오로-C1-3-알킬, C2-4-알케닐, 플루오로-C2-4-알케닐, C2-4-알키닐, 플루오로-C2-4-알키닐, 히드록실 또는 할로겐이고,
R8은 분지형 C1-5-알킬 기이고,
R9는 -H 또는 -F이고,
-L-#1은 링커 기
§-(C(=O))m-L1-L2-§§
이며
여기서
m은 0 또는 1이고,
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
L2는 기
Figure pct00188
중 하나이고
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
L1은 기
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
이며
여기서
R10은 -H, -NH2 또는 C1-3-알킬이고,
G1은 -NHC(=O)- 또는
Figure pct00189
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, 또는 -S(=O)-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
#1은 KSP 억제제에 대한 결합이고,
#2는 항체에 대한 L2에 대한 결합이며,
여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'에서 언급된 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 n은 1 내지 10의 수이다.
바람직하게는, 여기서 항체는 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
여기서 R3은 알킬, 바람직하게는 C1-3 알킬로 정의된 화학식 (IIg)의 화합물이 바람직하다.
이 경우에, -MOD는 바람직하게는 적어도 1개의 COOH- 기를 갖는다.
실시양태 D:
화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 APDC이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 D1은 화학식 (IIh)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이며,
Figure pct00190
여기서
X1은 N이고,
X2는 N이고
X3은 C이거나
또는
X1은 CH이고,
X2는 C이고
X3은 N이거나
또는
X1은 NH이고,
X2는 C이고
X3은 C이거나
또는
X1은 CH이고,
X2는 N이고
X3은 C이고,
A는 -C(=O)-이고,
R1은 -H 또는 -COOH이고,
R2는 -H이고,
R4는 화학식 Ia의 기이고,
R3은 -L-#1이고,
R5는 -H 또는 -F이고,
R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬, 플루오로-C1-3-알킬, C2-4-알케닐, 플루오로-C2-4-알케닐, C2-4-알키닐, 플루오로-C2-4-알키닐, 히드록실 또는 할로겐이고,
R8은 분지형 C1-5-알킬 기이고,
R9는 -H 또는 -F이고,
-L-#1은 링커 기
§-(C(=O))m-L1-L2-§§
이며
여기서
m은 0 또는 1이고,
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
L2는 기
Figure pct00191
중 하나이고
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
L1은 기
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
이며
여기서
R10은 -H, -NH2 또는 C1-3-알킬이고,
G1은 -NHC(=O)- 또는
Figure pct00192
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, 및 =N-, -O- 및 -S-, 또는 -S(=O)-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 3- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클에 의해 동일하게 또는 상이하게 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
#1은 KSP 억제제에 대한 결합이고,
#2는 항체에 대한 L2에 대한 결합이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'에서 언급된 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 n은 1 내지 10의 수이다.
바람직하게는, 여기서 항체는 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
이와 관련하여, G2는 바람직하게는
Figure pct00193
이다.
실시양태 E:
화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 APDC이며, 여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 D1은 화학식 (IIi)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염이며,
Figure pct00194
여기서
R1은 -L-#1이고,
-L-#1은 링커 기
§-(C(=O))m-L1-L2-§§
이며
여기서
m은 0 또는 1이고,
§는 KSP 억제제에 대한 결합을 나타내고,
§§는 항체에 대한 결합을 나타내고,
L2는 기
Figure pct00195
이고
R22는 -COOH, -C(=O)-O-C1-3-알킬, -C(=O)-C1-3-알킬, -C(=O)-NH-C1-3-알킬 또는 -C(=O)-NH2이고,
#1은 항체의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
#2는 L1에 대한 결합이고,
L1은 기
#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
이며
여기서
R10은 -H이고,
G1은 -NHC(=O)- 또는
Figure pct00196
이고,
n은 0 또는 1이고,
o는 0 또는 1이고,
G2는 C1-3-알킬이고,
#1은 KSP 억제제에 대한 결합이고,
#2는 항체에 대한 L2에 대한 결합이고,
R2 및 R5는 -H이고,
R3은 -CH2OH이고
R4는 화학식 (Ia)의 기이며,
여기서 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'에서 언급된 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 화학식 IVa' 또는 IVa" 또는 IVa"'의 n은 1 내지 10의 수이다.
R22는 -COOH인 화학식 (IIi)의 화합물이 바람직하다.
본 발명에 따른 접합체에서 또는 본 발명에 따른 접합체의 혼합물에서, 항체의 시스테인 잔기에 대한 결합은, 각각의 경우에 항체에 대한 링커의 결합의 총수에 기초하여, 바람직하게는 80% 초과의 정도로, 보다 바람직하게는 90% 초과의 정도로 존재한다.
여기서 L2로서, 기
Figure pct00197
를 갖는 접합체가 본 발명에 따라 특히 바람직하며,
여기서 R22는 상기 주어진 정의를 갖는다.
일반적으로, 두 종류의 L2 기를 갖는 접합체는 항체에 대한 결합의 수에 기초하여 바람직하게는 60:40 내지 40:60의 비로 존재한다.
이어서, 나머지 결합은 구조
Figure pct00198
로 존재하며, 여기서 #1 및 #2는 상기 주어진 정의를 갖는다.
바람직하게는, 여기서 항체는 항-TWEAKR 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체 또는 항-HER2 항체 또는 이들의 항원-결합 단편이다.
항-TWEAKR 항체 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337, 항-B7H3 항체 TPP-8382 및 TPP-8567, 항-EGFR-항체 세툭시맙 (TPP-981) 및 항-HER2-항체 트라스투주맙 및 TPP-1015, 또는 이들의 항원-결합 단편이 특히 바람직하다.
치료 용도
본 발명에 따른 화합물이 그의 치료에 사용될 수 있는 과다증식성 질환은 특히 암 및 종양 질환의 군을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 이들은 특히 하기 질환을 비제한적으로 의미하는 것으로 이해된다: 유방 암종 및 유방 종양 (관 및 소엽성 형태, 또한 계내를 포함하는 유방 암종), 기도의 종양 (소세포 및 비소세포 암종, 기관지 암종), 뇌 종양 (예를 들어 뇌간 및 시상하부의 것, 성상세포종, 상의세포종, 교모세포종, 신경교종, 수모세포종, 수막종 및 신경외배엽 및 송과체 종양), 소화 기관의 종양 (식도, 위, 담낭, 소장, 대장, 직장의 암종 및 항문 암종), 간 종양 (특히 간세포성 암종, 담관암종 및 혼합 간세포성 담관암종), 두경부 영역의 종양 (후두, 하인두, 비인두, 구인두, 구순 및 구강 암종, 구강 흑색종), 피부 종양 (기저세포암종, 가시세포암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 피부암, 비만 세포 종양), 연부 조직 종양 (특히 연부 조직 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 연골육종, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 지방육종, 림프육종 및 횡문근육종), 눈의 종양 (특히 안내 흑색종 및 망막모세포종), 내분비 및 외분비선 종양 (예를 들어 갑상선 및 부갑상선의 것, 췌장 및 타액선 암종, 선암종), 요로의 종양 (방광, 음경, 신장, 신우 및 요관의 종양) 및 생식 기관 종양 (여성에서의 자궁내막, 자궁경부, 난소, 질, 외음부 및 자궁의 암종 및 남성에서의 전립선 및 고환 암종). 이들은 또한 고형 형태로 및 순환 세포로서, 혈액, 림프계 및 척수의 증식성 질환, 예컨대 백혈병, 림프종 및 골수증식성 질환, 예를 들어 급성 골수성, 급성 림프모구성, 만성 림프구성, 만성 골수 및 모발상 세포 백혈병, 및 AIDS-관련 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 버킷 림프종 및 중추 신경계에서의 림프종을 포함한다.
인간에서 잘 특징화된 이들 질환은 또한 다른 포유동물에서 대등한 병인에 의해 발생할 수 있고 마찬가지로 본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 사용한 상기 언급된 암 질환의 치료는 고형 종양의 치료 및 그의 전이성 또는 순환 형태의 치료 둘 다를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 통상적인 의미로 사용되고 질환 또는 건강 이상을 퇴치하거나, 감소시키거나, 약화시키거나 또는 완화시키고, 이러한 질환에 의해, 예를 들어 암의 사건에서 손상된 생활 조건을 개선시키는 것을 목적으로 환자를 관리하고 간호하는 것을 의미한다.
본 발명은 따라서 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 화합물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 있어서의 본 발명의 화합물의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명은 유효량의 적어도 1종의 본 발명의 화합물을 사용하는, 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는, 필요한 경우에, 1종 이상의 다른 약리학적 활성 물질과 조합되어 사용될 수 있고, 단 이 조합은 바람직하지 않고 허용되지 않는 부작용을 유도하지 않는다. 따라서, 본 발명은 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 적어도 1종의 본 발명의 화합물 및 1종 이상의 추가의 약물을 포함하는 의약을 추가로 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 암 질환의 치료를 위해 공지된 항-과다증식성, 세포증식억제성 또는 세포독성 물질과 조합될 수 있다. 적합한 조합 약물의 예는 하기를 포함한다:
131I-chTNT, 아바렐릭스, 아비라테론, 아클라루비신, 아달리무맙, 아도-트라스트주맙 엠탄신, 아파티닙, 아플리베르셉트, 알데스류킨, 알렘투주맙, 알렌드론산, 알리트레티노인, 알트레타민, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 헥실 5-아미노레불리네이트, 암루비신, 암사크린, 아나스트로졸, 안세스팀, 아네톨 디티올에티온, 아네투맙 라브탄신, 안지오텐신 II, 항트롬빈 III, 아프레피탄트, 아르시투모맙, 아르글라빈, 삼산화비소, 아스파라기나제, 아테졸리주맙, 악시티닙, 아자시티딘, 벨로테칸, 벤다무스틴, 베실레소맙, 벨리노스타트, 베바시주맙, 벡사로텐, 비칼루타미드, 비산트렌, 블레오마이신, 블리나투모맙, 보르테조밉, 부세렐린, 보수티닙, 브렌툭시맙 베도틴, 부술판, 카바지탁셀, 카보잔티닙, 칼시토닌, 폴린산칼슘, 레보폴린산칼슘, 카페시타빈, 카프로맙, 카르바마제핀, 카르보플라틴, 카르보쿠온, 카르필조밉, 카르모푸르, 카르무스틴, 카투막소맙, 셀레콕시브, 셀모류킨, 세리티닙, 세툭시맙, 클로람부실, 클로르마디논, 클로르메틴, 시도포비르, 시나칼세트, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드론산, 클로파라빈, 코비메티닙, 코판리십, 크리산타스파제, 크리조티닙, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다라투무맙, 다브라페닙, 다사티닙, 다우노루비신, 데시타빈, 데가렐릭스, 데니류킨 디프티톡스, 데노수맙, 데프레오티드, 데슬로렐린, 덱스라족산, 디브로스피듐 클로라이드, 디안히드로갈락티톨, 디클로페낙, 도세탁셀, 돌라세트론, 독시플루리딘, 독소루비신, 독소루비신 + 에스트론, 드로나비놀, 에드레콜로맙, 엘립티늄 아세테이트, 엔도스타틴, 에노시타빈, 엔잘루타미드, 에피루비신, 에피티오스타놀, 에포에틴-알파, 에포에틴-베타, 에포에틴-제타, 엡타플라틴, 에리불린, 에를로티닙, 에소메프라졸, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에티닐에스트라디올, 에베롤리무스, 엑세메스탄, 파드로졸, 펜타닐, 플루옥시메스테론, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오르우라실, 플루타미드, 폴산, 포르메스탄, 포사프레피탄트, 포테무스틴, 풀베스트란트, 가도부트롤, 가도테리돌, 가도테르산 메글루민 염, 가도베르세타미드, 가독세트산 이나트륨 염 (Gd-EOB-DTPA 이나트륨 염), 질산갈륨, 가니렐릭스, 게피티닙, 겜시타빈, 겜투주맙, 글루카르피다제, 글루톡심, 고세렐린, 그라니세트론, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 히스타민 디히드로클로라이드, 히스트렐린, 히드록시카르바미드, I-125 시드, 이반드론산, 이브리투모맙 티욱세탄, 이브루티닙, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 이미퀴모드, 임프로술판, 인디세트론, 인카드론산, 인게놀 메부테이트, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론-감마, 이오비트리돌, 이오벤구안 (123I), 아이오메프롤, 이필리무맙, 이리노테칸, 이트라코나졸, 익사베필론, 익사조밉, 란레오티드, 란소프라졸, 란소프라졸, 라파티닙, 라소콜린, 레날리도미드, 렌바티닙, 레노그라스팀, 렌티난, 레트로졸, 류프로렐린, 레바미솔, 레보노르게스트렐, 레보티록신 소듐, 리페그필그라스팀, 리수리드, 로바플라틴, 로무스틴, 로니다민, 마소프로콜, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜라르소프롤, 멜팔란, 메피티오스탄, 메르캅토퓨린, 메스나, 메타돈, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 메틸 아미노레불리네이트, 메틸프레드니솔론, 메틸테스토스테론, 메티로신, 미파무르티드, 밀테포신, 미리플라틴, 미토브로니톨, 미토구아존, 미토락톨, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 모가물리주맙, 몰그라모스팀, 모피다몰, 모르핀 히드로클로라이드, 모르핀 술페이트, 나빌론, 나빅시몰스, 나파렐린, 날록손 + 펜타조신, 날트렉손, 나르토그라스팀, 네시투무맙, 네다플라틴, 넬라라빈, 네리드론산, 네투피탄트/팔로노세트론, 니볼루맙 펜테트레오티드, 닐로티닙, 닐루타미드, 니모라졸, 니모투주맙, 니무스틴, 닌테다닙, 니트라크린, 니볼루맙, 오비누투주맙, 옥트레오티드, 오파투무맙, 올라파립, 올라라투맙, 오마세탁신 메페숙시네이트, 오메프라졸, 온단세트론, 오르고테인, 오릴로티모드, 오시메르티닙, 옥살리플라틴, 옥시코돈, 옥시메톨론, 오조가미신, p53 유전자 요법, 파클리탁셀, 팔보시클립, 팔리페르민, 팔라듐-103 시드, 팔로노세트론, 파미드론산, 파니투무맙, 파노비노스타트, 판토프라졸, 파조파닙, 페가스파르가제, 펨브롤리주맙, peg 인터페론 알파-2b, 펨브롤리주맙, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페플로마이신, 퍼플루부탄, 퍼포스파미드, 페르투주맙, 피시바닐, 필로카르핀, 피라루비신, 픽산트론, 플레릭사포르, 플리카마이신, 폴리글루삼, 폴리에스트라디올 포스페이트, 폴리비닐피롤리돈 + 히알루론산나트륨, 폴리사카라이드-K, 포말리도미드, 포나티닙, 포르피머-소듐, 프랄라트렉세이트, 프레드니무스틴, 프레드니손, 프로카르바진, 프로코다졸, 프로프라놀롤, 퀴나골리드, 라베프라졸, 라코투모맙, 라듐-223 클로라이드, 라도티닙, 랄록시펜, 랄티트렉세드, 라모세트론, 라무시루맙, 라니무스틴, 라스부리카제, 라족산, 레파메티닙, 레고라페닙, 리세드론산, 레늄-186 에티드로네이트, 리툭시맙, 롤라피탄트, 로미뎁신, 로무르티드, 로니시클립, 사마륨 (153Sm) 렉시드로남, 사투모맙, 세크레틴, 실툭시맙, 시푸류셀-t, 시조피란, 소부족산, 소듐 글리시디다졸, 소니데깁, 소라페닙, 스타노졸롤, 스트렙토조신, 수니티닙, 탈라포르핀, 탈리모겐 라허파렙벡, 타미바로텐, 타목시펜, 타펜타돌, 타소네르민, 테세류킨, 테크네튬 (99mTc) 노페투모맙 메르펜탄, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-옥트레오티드, 테가푸르, 테가푸르 + 기메라실 + 오테라실, 테모포르핀, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스토스테론, 테트로포스민, 탈리도미드, 티오테파, 티말파신, 티로트로핀 알파, 티오구아닌, 토실리주맙, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라마돌, 트라스투주맙, 트레오술판, 트레티노인, 트리플루리딘 + 티피라실, 트라메티닙, 트릴로스탄, 트립토렐린, 트로포스파미드, 트롬보포이에틴, 우베니멕스, 발루비신, 반데타닙, 바프레오티드, 발라티닙, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈플루닌, 비노렐빈, 비스모데깁, 보리노스타트, 이트륨-90 유리 마이크로비드, 지노스타틴, 지노스타틴-스티말라머, 졸레드론산, 조루비신.
또한, 항체는 MPS1 억제제의 부류 또는 표적 OX-40, CD137 / 4-1BB, DR3, IDO1 / IDO2, LAG-3 및 CD40에 대한 항체로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 또한 방사선요법 및/또는 외과적 개입과 조합되어 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물과 다른 세포증식억제성 또는 세포독성 활성제와의 조합을 사용하여 하기 목적이 추구될 수 있다.
ㆍ 개별 활성 성분을 사용한 치료와 비교하여, 종양의 성장을 저속화시키거나, 그의 크기를 감소시키거나 또는 심지어 그를 완전히 제거시키는 데 있어서의 개선된 효능;
ㆍ 단독요법의 경우보다 더 낮은 투여량으로 사용되는 화학요법제의 사용 가능성;
ㆍ 개별 투여와 비교하여 보다 적은 부작용을 갖는, 보다 허용되는 요법의 가능성;
ㆍ 보다 광범위한 스펙트럼의 신생물성 장애의 치료 가능성;
ㆍ 요법에 대한 보다 높은 반응률의 달성;
ㆍ 현재 표준 요법과 비교하여 환자의 보다 긴 생존 시간.
또한, 본 발명에 따른 화합물은 또한 방사선요법 및/또는 외과적 개입과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 적어도 1종의 본 발명의 화합물을, 전형적으로 1종 이상의 불활성, 비독성, 제약상 적합한 부형제와 함께 포함하는 의약, 및 상기 언급된 목적을 위한 그의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 화합물은 전신으로 및/또는 국부로 작용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 이들은 적합한 방식으로, 예를 들어 비경구로, 가능하게는 흡입으로 또는 임플란트 또는 스텐트로서 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 전신으로 및/또는 국부로 작용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 이들은 적합한 방식으로, 예를 들어 경구, 비경구, 폐, 비강, 설하, 설측, 협측, 직장, 질, 피부, 경피, 결막 또는 귀 경로에 의해, 또는 임플란트 또는 스텐트로서 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 이들 투여 경로에 적합한 투여 형태로 투여될 수 있다.
경구 투여에 적합한 투여 형태는 선행 기술에 따라 기능하고 본 발명의 화합물을 급속하게 및/또는 변형된 방식으로 전달하는 것, 및 본 발명의 화합물을 결정질 및/또는 무정형 및/또는 용해된 형태로 함유하는 것, 예를 들어 정제 (비코팅된 또는 코팅된 정제, 예를 들어 장용 코팅 또는 불용성이거나 또는 지연 용해되고, 본 발명에 따른 화합물의 방출을 제어하는 코팅을 갖는 것), 구강 내에서 급속하게 붕해되는 정제, 또는 필름/웨이퍼, 필름/동결건조물, 캡슐 (예를 들어 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐), 당-코팅된 정제, 과립, 펠릿, 분말, 에멀젼, 현탁액, 에어로졸 또는 용액이다.
비경구 투여는 흡수 단계를 우회할 수 있거나 (예를 들어 정맥내로, 동맥내로, 심장내로, 척수내로 또는 요추내로) 또는 흡수를 포함할 수 있다 (예를 들어 근육내로, 피하로, 피내로, 경피로 또는 복강내로). 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물 또는 멸균 분말의 형태의 주사 및 주입을 위한 제제를 포함한다.
다른 투여 경로에 적합한 투여 형태는, 예를 들어, 흡입을 위한 제약 형태 (분말 흡입기, 네뷸라이저를 포함함), 점비제, 용액 또는 스프레이; 설측, 설하 또는 협측 투여를 위한 정제, 필름/웨이퍼 또는 캡슐, 좌제, 점안제, 안연고, 세안제, 안구 삽입물, 점이제, 스프레이, 분말, 세척제 또는 탐폰, 질 캡슐, 수성 현탁액 (로션, 진탕 혼합물), 친지성 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 연고, 크림, 경피 치료 시스템 (예를 들어 패치), 유제, 페이스트, 폼, 산포제, 임플란트 또는 스텐트이다.
비경구 투여, 특히 정맥내 투여가 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 언급된 투여 형태로 전환될 수 있다. 이는 그 자체로 공지된 방식으로 제약상 적합한 부형제와 혼합함으로써 달성될 수 있다. 이들 부형제는 하기를 포함한다:
ㆍ 충전제 및 담체 (예를 들어 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 예를 들어 아비셀(Avicel)®, 락토스, 만니톨, 전분, 인산칼슘, 예를 들어 디-카포스(Di-Cafos)®),
ㆍ 연고 베이스 (예를 들어 바셀린, 파라핀, 트리글리세리드, 왁스, 울 왁스, 울 왁스 알콜, 라놀린, 친수성 연고, 폴리에틸렌 글리콜),
ㆍ 좌제 베이스 (예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 코코아 버터, 경질 지방),
ㆍ 용매 (예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 중간-쇄 트리글리세리드 지방 오일, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀),
ㆍ 계면활성제, 유화제, 분산제 또는 습윤제 (예를 들어 소듐 도데실술페이트, 레시틴, 인지질, 지방 알콜, 예를 들어 라네트(Lanette)®, 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 스판(Span)®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 트윈(Tween)®, 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드, 예를 들어 크레모포르(Cremophor)®, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴록사머, 예를 들어 플루로닉(Pluronic)®),
ㆍ 완충제 물질, 및 또한 산 및 염기 (예를 들어 포스페이트, 카르보네이트, 시트르산, 아세트산, 염산, 수산화나트륨, 탄산암모늄, 트로메타몰, 트리에탄올아민),
ㆍ 등장화제 (예를 들어 글루코스, 염화나트륨),
ㆍ 흡착제 (예를 들어 미분된 실리카),
ㆍ 점도-증가제, 겔 형성제, 증점제 또는 결합제 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스-소듐, 전분, 카르보머, 폴리아크릴산, 예를 들어 카르보폴(Carbopol)®, 알기네이트, 젤라틴),
ㆍ 붕해제 (예를 들어 변형된 전분, 카르복시메틸 셀룰로스-소듐, 소듐 스타치 글리콜레이트, 예를 들어 엑스플로탑(Explotab)®, 가교 폴리비닐피롤리돈, 크로스카르멜로스-소듐, 예를 들어 액디솔(AcDiSol)®),
ㆍ 유동 조절제, 윤활제, 활택제 및 이형제 (예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 활석, 미분된 실리카, 예를 들어 에어로실(Aerosil)®),
ㆍ 필름용 코팅제 (예를 들어 당, 쉘락) 및 필름 형성제 또는 빠르게 또는 변형되어 용해되는 확산 막 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어 콜리돈(Kollidon)®, 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 예를 들어 유드라짓(Eudragit)®에 의함),
ㆍ 캡슐 물질 (예를 들어 젤라틴, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스),
ㆍ 합성 중합체 (예를 들어 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 예를 들어 유드라짓®, 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어 콜리돈®, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 아세테이트, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 공중합체 및 블록 공중합체),
ㆍ 가소제 (예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 트리아세틴, 트리아세틸 시트레이트, 디부틸 프탈레이트),
ㆍ 침투 증진제,
ㆍ 안정화제 (예를 들어 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 아스코르브산나트륨, 부틸히드록시아니솔, 부틸히드록시톨루엔, 프로필 갈레이트),
ㆍ 보존제 (예를 들어 파라벤, 소르브산, 티오메르살, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로르헥시딘 아세테이트, 벤조산나트륨),
ㆍ 염료 (예를 들어 무기 안료, 예를 들어 산화철, 이산화티타늄),
ㆍ 방향제, 감미제, 향미 및/또는 냄새 교정제.
본 발명은 적어도 1종의 본 발명에 따른 화합물을, 전형적으로 1종 이상의 제약상 적합한 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물, 및 상기 언급된 목적을 위한 그의 용도를 추가로 제공한다.
일반적으로, 비경구 투여의 경우에 유효한 결과를 달성하기 위해 체중의 약 0.1 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 약 0.3 내지 7 mg/kg의 양을 투여하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.
그럼에도 불구하고 일부 경우에, 구체적으로 체중, 투여 경로, 활성 성분에 대한 개별 반응, 제제의 속성 및 투여가 발생하는 시간 또는 간격의 함수로서 언급된 양으로부터 벗어나는 것이 필요할 수 있다. 따라서 일부 경우에 상기 언급된 최소량 미만으로 관리하는 것이 충분할 수 있는 반면에, 다른 경우에는 언급된 상한치를 초과해야만 한다. 보다 많은 양을 투여하는 경우에, 이들을 하루에 걸쳐 여러 개별 용량으로 나누는 것이 권장될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 동위원소 변형체의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 1종 이상의 동위원소 변형체, 특히 중수소-함유 화합물을 포괄한다.
용어 화합물 또는 시약의 "동위원소 변형체"는 그로부터 이러한 화합물이 구성되는 하나 이상의 동위원소의 비천연 분율을 갖는 화합물로서 정의된다.
용어 "본 발명에 따른 화합물의 동위원소 변형체"는 그로부터 이러한 화합물이 구성되는 하나 이상의 동위원소의 비천연 분율을 갖는 본 발명에 따른 화합물로서 정의된다.
표현 "비천연 분율"은 그의 천연 빈도보다 더 높은 이러한 동위원소의 분율을 의미하는 것으로 이해된다. 이와 관련하여 사용된 동위원소의 천연 빈도는 문헌 ["Isotopic Compositions of the Elements 1997", Pure Appl. Chem., 70(1), 217-235, 1998]에서 찾아볼 수 있다.
이러한 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘의 안정한 방사성 동위원소, 예컨대 2H (중수소), 3H (삼중수소), 11C, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36Cl, 82Br, 123I, 124I, 125I, 129I 및 131I이다.
본원에 명시된 장애의 치료 및/또는 예방과 관련하여, 본 발명에 따른 화합물의 동위원소 변형체(들)는 바람직하게는 중수소 ("본 발명에 따른 중수소-함유 화합물")를 함유한다. 1종 이상의 방사성 동위원소 예컨대 3H 또는 14C가 혼입된 본 발명에 따른 화합물의 동위원소 변형체는, 예를 들어, 의약 및/또는 기질 조직 분포 연구에서 유익하다. 그의 용이한 혼입가능성 및 검출감도로 인해, 이들 동위원소가 특히 바람직하다. 양전자-방출 동위원소 예컨대 18F 또는 11C를 본 발명에 따른 화합물에 혼입시키는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 화합물의 이들 동위원소 변형체는 생체내 영상화 용도에 사용하는 데 적합하다. 본 발명에 따른 중수소-함유 및 13C-함유 화합물은 전임상 또는 임상 연구 내에서 질량 분광측정법 분석에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물의 동위원소 변형체는 일반적으로 본원에 기재된 반응식 및/또는 실시예에 기재된 바와 같은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 시약을 시약의 동위원소 변형체, 바람직하게는 중수소-함유 시약으로 대체함으로써 제조될 수 있다. 목적하는 중수소화 부위에 따르면, 일부 경우에, D2O로부터의 중수소는 화합물에 직접 혼입될 수 있거나 또는 이러한 화합물의 합성에 사용될 수 있는 시약에 혼입될 수 있다. 중수소를 분자에 혼입시키는 데 유용한 또 다른 시약은 중수소 기체이다. 중수소의 혼입에 대한 급속 경로는 올레핀계 결합 및 아세틸렌계 결합의 촉매 중수소화이다. 관능기를 함유하는 탄화수소에서 수소를 중수소로 직접 교환하는 경우, 중수소 기체의 존재 하에 금속 촉매제 (즉 Pd, Pt 및 Rh)를 사용하는 것이 또한 가능하다. 다양한 중수소화 시약 및 합성 유닛은, 예를 들어, C/D/N 이소톱스(C/D/N Isotopes) (캐나다 퀘벡); 캠브리지 이소토프 래보러토리즈 인크.(Cambridge Isotope Laboratories Inc.) (미국 매사추세츠주 앤도버); 및 콤비포스 카탈리스츠, 인크.(CombiPhos Catalysts, Inc.), (미국 뉴저지주 프린스턴)와 같은 회사로부터 상업적으로 입수가능하다.
용어 "중수소-함유 화합물"은 1개 이상의 수소 원자가 1개 이상의 중수소 원자에 의해 대체되고 화학식 (I)의 화합물 내의 모든 중수소화 위치에서의 중수소의 빈도가 약 0.015%인 중수소의 천연 빈도보다 더 높은 본 발명에 따른 화합물로서 정의된다. 보다 특히, 본 발명에 따른 중수소-함유 화합물에서, 화학식 (I)의 화합물 내의 모든 중수소화 위치에서의 중수소의 빈도는 이 위치 또는 이들 위치에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과, 바람직하게는 90%, 95%, 96% 또는 97% 초과, 보다 추가로 바람직하게는 98% 또는 99% 초과이다. 모든 중수소화 위치에서의 중수소의 빈도는 다른 중수소화 위치에서의 중수소의 빈도와 독립적이라는 것이 명백할 것이다.
본 발명에 따른 화합물에의 1개 이상의 중수소 원자의 선택적 혼입을 통해, 분자의 물리화학적 특성 (예를 들어 산도 [C. L. Perrin, et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 4490], 염기도 [C. L. Perrin et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 9641], 친지성 [B. Testa et al., Int. J. Pharm., 1984, 19(3), 271]) 및/또는 대사 프로파일을 변경시키고 대사물 또는 형성된 대사물의 양에 대한 모 화합물의 비에서의 변화를 유발하는 것이 가능하다. 이러한 변화는 특정한 치료 이익으로 이어지고 따라서 특정한 상황 하에 바람직할 수 있다. 대사물의 비가 변화된 경우에, 대사 및 대사 스위칭의 감소된 속도가 보고되었다 (A. E. Mutlib et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 2000, 169, 102). 모 약물 및 대사물에 대한 노출에서의 이들 변화는 본 발명에 따른 중수소-함유 화합물의 약역학, 내약성 및 효능과 관련하여 중요한 결과를 가질 수 있다. 일부 경우에 중수소 치환은 목적하지 않거나 또는 독성 대사물의 형성을 감소시키거나 또는 제거하고 목적하는 대사물의 형성을 증진시킨다 (예를 들어 문헌 [Nevirapine: A. M. Sharma et al., Chem. Res. Toxicol., 2013, 26, 410; Efavirenz: A. E. Mutlib et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 2000, 169, 102]). 다른 경우에 중수소화의 주요 효과는 전신 클리어런스의 속도를 감소시키는 것이다. 그 결과, 화합물의 생물학적 반감기는 증가된다. 잠재적 임상 이익은 유사한 전신 노출을 감소된 피크 수준 및 증가된 최저 수준으로 유지하는 능력을 포함할 것이다. 이는 특정한 화합물의 약동학적/약역학적 관계에 따라 보다 낮은 부작용 및 증진된 효능을 일으킬 수 있다. 이러한 중수소 효과의 예는 ML-337 (C. J. Wenthur et al., J. Med. Chem., 2013, 56, 5208) 및 오다나카팁 (K. Kassahun et al., WO2012/112363)이다. 대사의 감소된 속도가 전신 클리어런스의 속도를 변화시키지 않으면서 약물의 노출의 증가를 일으킨다는 또 다른 경우가 보고되었다 (예를 들어 로페콕시브: 문헌 [F. Schneider et al., Arzneim. Forsch. Drug. Res., 2006, 56, 295]; 텔라프레비르: 문헌 [F. Maltais et al., J. Med. Chem., 2009, 52, 7993]). 이러한 효과를 나타내는 중수소화 약물은 감소된 투여 요건 (예를 들어 목적하는 효과를 달성하기 위한 보다 낮은 수의 용량 또는 보다 낮은 투여량)을 가질 수 있고/거나 보다 낮은 대사물 로드를 생성할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 대사에 대한 2개 이상의 잠재적 공격 부위를 가질 수 있다. 물리화학적 특성 및 대사 프로파일에 대한 상기 기재된 효과를 최적화하기 위해, 하나 이상의 중수소-수소 교환(들)의 특정 패턴을 갖는 본 발명에 따른 중수소-함유 화합물이 선택될 수 있다. 보다 특히, 본 발명에 따른 중수소-함유 화합물(들)의 중수소 원자(들)는 탄소 원자에 결합되고/거나 대사 효소, 예를 들어 시토크롬 P450에 대한 공격 부위인, 본 발명에 따른 화합물 내의 그러한 위치에 존재한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실행을 예시하고, 본 발명은 단지 이들 실시예에 제한되지 않는다.
달리 언급되지 않는 한, 하기 시험 및 실시예에서 백분율은 중량 백분율이고; 부는 중량부이다. 액체/액체 용액에 대한 용매 비, 희석 비 및 농도 데이터는 각각의 경우에 부피에 기초한다.
합성 경로:
작업 실시예에 대한 예로서, 하기 반응식은 예시적인 합성 경로를 나타낸다.
이들 반응식에서, 화학식 IIa에 따르면, 아미노 기 -NHR4 상의 R4 치환기는 Z1-(C=O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(=O)NH2)-C(=O)- 기일 수 있다.
이와 관련하여,
P2는 D-Gly, D-Pro, D-Ala, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Thr, D-Cys, D-Asn, D-Gln, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Arg, D-시트룰린 및 D-His의 군으로부터 선택된 D-아미노산이고,
P3은 군 Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, 시트룰린 및 His로부터 선택된 L- 또는 D-아미노산이고,
Z1은 C1-10-알킬, C5-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴, C5-10-헤테로시클로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, C5-10-헤테로아릴알콕시, C1-10-알콕시, C6-10-아릴옥시, C6-10-아릴-C1-10-알킬옥시 또는 C6-10-아르알콕시, C5-10-헤테로알콕시, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴옥시- 또는 C5-10-헤테로시클로알콕시 기이고 이는 -NH2, -C(=O)-, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NH-C(=O)-알킬, -N(알킬)-C(=O)-알킬, -S(=O)3-H, -S(=O)2-NH2, -S(=O)2-N(알킬)2, -COOH, -C(=O)NH2, -C(=O)-N(알킬)2 또는 -OH에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있거나,
-H 또는 -(CH2)0-1-Ox-(CH2CH2O)v-R1 기이고,
x는 0 또는 1이고,
v는 1 내지 20의 수이고
R1은 화학식 (II)에서 주어진 정의를 갖는다.
반응식 1:
Figure pct00199
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Z1-COOH, EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT 또는 Z1-COOH, HATU, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT 또는 Z1-COOSu, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
또한, 반응식 2 및 3에 따른 다른 중간체가 레구마인-절단가능한 ADC 전구체로 전환될 수 있다.
반응식 2:
Figure pct00200
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
반응식 3:
Figure pct00201
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
반응식 1-3에 제시된 벤질옥시카르보닐 기에 대한 대안으로서, 펩티드 화학에서 확립된 다른 보호기를 사용하고 마찬가지로 공지된 상응하는 방법에 의해 이들을 분리시키는 것이 가능하다. 보호기 전략의 선택은 분자에서 발생하는 다른 구조적 요소와의 상용성과 관련된, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 요건에 따라 이루어진다. 분자 내의 추가의 보호기가 여전히 존재하는 경우에, 이들은 최종 단계에서 제거될 수 있다.
합성은 또한 그의 순서의 관점에서 임의로 재배열될 수 있다.
또한, 링커 구조 L1-L2와 관련하여 단백질-반응성 기는 청구범위의 범주 내에서 달라질 수 있다.
반응식 4: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00202
[a): EDCI, HOBT, 디이소프로필에틸아민, RT; b) 에탄올, 피페리딘, 메틸아민, 물, RT; c) HATU, 디이소프로필에틸아민, RT; d) TFA, DCM, RT]
반응식 5: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00203
[a): 예를 들어 EDCI, HOBT, 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; b) 예를 들어 DCM/TFA 20:1, RT; c) 예를 들어 HATU, 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; d) 예를 들어 TFA, DCM, RT]
반응식 6: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00204
[a): 예를 들어 2-브로모-1-에틸피리디늄 테트라플루오로보레이트, 디이소프로필에틸아민, DCM, RT; b) 예를 들어 2M LiOH 용액, THF, 물, RT, 위치이성질체의 HPLC 분리; c) 예를 들어 EDCI, HOBT, 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; d) 예를 들어 TFA, DCM, RT]
반응식 7: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00205
[a): 예를 들어 H2, Pd-C, EtOH, RT; b) 예를 들어 p-니트로벤질 브로마이드, K2CO3, DMF; c) 예를 들어 에탄올, 물 중 40% 메틸아민 용액, 50℃; d) 예를 들어 디티온산이나트륨, THF, 물, 50℃; e) 예를 들어 HATU, 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; f) 예를 들어 피페리딘, 물 중 40% 메틸아민 용액, 에탄올, 50℃; g) 예를 들어 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; h) 예를 들어 피페리딘, DMF, RT; i) TFA, DCM, RT]
반응식 8: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00206
[a): 예를 들어 Et3N, DMF, RT; b) 예를 들어 H2, Pd-C, EtOH/에틸 아세테이트/THF (1:1:1), RT; c) 예를 들어 4-메틸모르폴린, DMF, RT; d) 예를 들어 HATU, HOAt, 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; e) 예를 들어 TFA, RT]
반응식 9: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00207
[a): 예를 들어 NaBH(OAc)3, HOAc, 디클로로메탄, RT; b) 예를 들어 클로로아세틸 클로라이드, NEt3, DCM, RT; c) 예를 들어 Cs2CO3, DMF, 50℃; d) 예를 들어 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 히드로클로라이드 (1:1), T3P(R), 디이소프로필에틸아민, MeCN, RT; e) 예를 들어 TFA, RT]
반응식 10: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00208
[a): 예를 들어 메탄술포닐 클로라이드, NEt3, 디클로로메탄, 0℃; b) 예를 들어 NaN3, DMF, 40℃; c) 예를 들어 H2, Pd-C, EtOH/에틸 아세테이트 (1:1), RT; d) 예를 들어 TBAF, THF, RT; e) 예를 들어 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온, NEt3, CaCO3, 1,4-디옥산, RT; f) 예를 들어 N-클로로숙신이미드, TEMPO, 테트라-n-부틸암모늄 클로라이드, 클로로포름, 0.05 N 탄산칼륨/0.05 N 탄산수소나트륨 용액 (1:1); g) 예를 들어 NaBH(OAc)3, HOAc, 디클로로메탄, RT; h) 예를 들어 클로로아세틸 클로라이드, NEt3, DCM, RT; i) 예를 들어 TBAF, THF, 물, RT; j) 예를 들어 4-메틸모르폴린, DMF, RT; k) 예를 들어 TFA, RT]
반응식 11: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00209
[a): 예를 들어 포름알데히드, Na2CO3, 물, RT; b) 예를 들어 Ac2O, 피리딘, THF, RT; c) 예를 들어 디-tert-부틸 말로네이트, KOtBu, THF, RT; d) 예를 들어 LiBH4, THF, RT; e) 예를 들어 TBDMSCl, 이미다졸, DCM, RT; f) 예를 들어 데스-마르틴 퍼아이오디난, DCM; g) 예를 들어 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, AcOH, DCM, RT; h) 예를 들어 nBu4NF, THF, RT; i) 예를 들어 SOCl2, THF, RT; j) 예를 들어 AcSK, nBu4NI, DMF, 90℃; k) 예를 들어 NaOH, MeOH, THF, RT; l) 예를 들어 TCEP, 디옥산, RT; m) 예를 들어 에피머의 분리; n) 예를 들어 6N 염산, THF, RT o) 예를 들어 Mal-dPEG(3)-Mal, PBS 완충제, ACN, RT]
반응식 12: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00210
[a): 예를 들어 Mal-dPEG(3)-Mal, PBS 완충제, ACN, RT]
반응식 13: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00211
[a): 예를 들어 BF3OEt2, THF, 0℃; b): 예를 들어 이소아밀 니트라이트, -10℃, 0.5시간; c): 예를 들어 메틸 2-클로로-3-옥소부타노에이트, 피리딘, 물, -5℃; d): 예를 들어 NEt3, 톨루엔, RT; e): 예를 들어 Et3SiH, TFA, RT; f): 예를 들어 LiBH4, THF, 60℃; g): 예를 들어 데스-마르틴 퍼아이오디난, DCM, RT; h): 예를 들어 (R)-(+)-메틸-2-프로판술핀아미드, 티타늄(IV) 이소프로폭시드, THF, RT; i): 예를 들어 tert-BuLi, 펜탄, THF, -78℃; j): 예를 들어 디옥산 중 HCl, THF, MeOH, RT; k): 예를 들어 3-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)프로판알, NaB(OAc)3H, AcOH, DCM, RT; l): 예를 들어 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트, NEt3, DCM, RT; m): 예를 들어 메틸아민, 물, EtOH, 50℃]
반응식 14: ADC 전구체 분자의 전구체의 합성
Figure pct00212
[a): 예를 들어 tert-부틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-5-옥소-L-노르발리네이트, NaB(OAc)3H, AcOH, DCM, RT; b): 예를 들어 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트, NEt3, DCM, RT; c): 예를 들어 메틸아민, 물, EtOH, 60℃; d): 예를 들어 THF, DCM, 50℃; e): 예를 들어 Boc2O, NEt3, DCM, RT; f): 예를 들어 트리플루오로아세트산 / 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (1:1), HATU, 디이소프로필에틸아민, DMF, RT; f): 예를 들어 TFA, DCM, RT]
반응식 15: 중간체의 합성
Figure pct00213
[a): 예를 들어 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, 아세트산, DCM, RT; b) 예를 들어 아세톡시아세틸 클로라이드, NEt3, DCM, RT; c) 예를 들어 LiOH, THF/물, RT; d) 예를 들어 H2, Pd-C, EtOH, RT; e) 예를 들어 Teoc-OSu, NEt3, 디옥산, RT; f) 예를 들어 Fmoc-Cl, 디이소프로필에틸아민, 디옥산/물 2:1, RT]
반응식 16: 중간체의 합성
Figure pct00214
[a): 예를 들어 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, 아세트산, DCM, RT; b) 예를 들어 아세톡시아세틸 클로라이드, NEt3, DCM, RT; c) 예를 들어 LiOH, 메탄올, RT; d) 예를 들어 TFA, DCM, RT; e) 예를 들어 Boc2O, 디이소프로필에틸아민, DCM, RT]
반응식 17: 중간체의 합성
Figure pct00215
[a): 예를 들어 벤질 브로마이드, Cs2CO3, DMF, RT; b) 예를 들어 Pd(dppf)2Cl2, DMF, Na2CO3, 85℃; c) 예를 들어 LiAlH4, THF, 0℃; MnO2, DCM, RT; d) 예를 들어 Ti(iOPr)4, THF, RT; e) 예를 들어 tBuLi, THF, -78℃; MeOH, NH4Cl; f) 예를 들어 HCl/1,4-디옥산]
반응식 18: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00216
[a): 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, 아세트산, DCM, RT; b) 아세톡시아세틸 클로라이드, 디이소프로필에틸아민, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) 트리플루오로아세트산 / 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (1:1) HATU, DMF, 디이소프로필에틸아민, RT; e) 염화아연, 트리플루오로에탄올, 50℃, EDTA.]
반응식 19: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00217
[a): HATU, DMF, 디이소프로필에틸아민, RT; b) 염화아연, 트리플루오로에탄올, 50℃, EDTA.]
반응식 20: 반응식 1에 따라 APDC로 전환될 수 있는 중간체 시리즈 F의 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00218
[a): 소듐 트리아세톡시보로히드라이드, 아세트산, DCM, RT; b) 아세톡시아세틸 클로라이드, 트리에틸아민, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) 트리플루오로아세트산 / 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 (1:1) HATU, DMF, 디이소프로필에틸아민, RT; e) 염화아연, 트리플루오로에탄올, 50℃, EDTA.]
반응식 21: 중간체 및 ADC 전구체의 합성에 대한 일반적 방법
Figure pct00219
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Z1-COOH, EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT 또는 Z1-COOH, HATU, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT 또는 Z1-COOSu, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
반응식 22: 레구마인-절단가능한 링커를 갖는 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00220
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
반응식 23: 레구마인-절단가능한 링커를 갖는 ADC 전구체 분자의 합성
Figure pct00221
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
또한, 반응식 21, 22 및 23에 따른 다른 중간체는 레구마인-절단가능한 ADC 및 APDC 전구체로 전환될 수 있다.
반응식 21-23에 제시된 벤질옥시카르보닐 기에 대한 대안으로서, 펩티드 화학에서 확립된 다른 보호기를 사용하고 마찬가지로 공지된 상응하는 방법에 의해 이들을 분리시키는 것이 가능하다. 보호기 전략의 선택은 분자에서 발생하는 다른 구조적 요소와의 상용성과 관련된, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 요건에 따라 이루어진다. 분자 내의 추가의 보호기가 여전히 존재하는 경우에, 이들은 최종 단계에서 제거될 수 있다.
합성은 또한 그의 순서의 관점에서 임의로 재배열될 수 있다.
반응식 24: 레구마인-절단가능한 머리기를 갖는 시스테인-결합된 ADC의 합성
Figure pct00222
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; b) 2-5 당량 TCEP, PBS pH7.2, 실온에서 30분 동안 교반; c) 실온에서 아르곤 하에 90분 동안 교반, 이어서 PD 10 칼럼 (세파덱스(Sephadex)® G-25, 지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 pH 8로 재완충 및 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반 및 초원심분리에 의해 후속 농축 및 pH 7.2에서 PBS를 사용하여 목적하는 농도 설정)]
반응식 25: 레구마인-절단가능한 링커를 갖는 리신-결합된 ADC의 합성
Figure pct00223
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT; b) H2, 10% Pd-C, 메탄올 1.5시간, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, 실온에서 밤새 교반; d) PBS 중 AK2, DMSO 중에 용해된 5 당량의 활성 에스테르 첨가, 실온에서 아르곤 하에 60분 동안 교반, DMSO 중에 용해된 또 다른 5 당량의 활성 에스테르 첨가, 실온에서 아르곤 하에 60분 동안 교반, 이어서 PBS 완충제 (pH 7.2)로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 의해 정제 및 초원심분리에 의해 후속 농축 및 PBS 완충제 (pH 7.2)를 사용하여 목적하는 농도 설정]
반응식 26: 레구마인-절단가능한 머리기를 갖는 ADC 전구체의 합성
Figure pct00224
[a): NaBH(OAc)3, HOAc, 디클로로메탄, RT; b) 클로로아세틸 클로라이드, NEt3, DCM, RT; c) L-시스테인, NaHCO3, DBU, 이소프로판올/물, 50℃; d) HATU, DMF, 디이소프로필에틸아민, RT; e) 염화아연, 트리플루오로에탄올, 50℃; f) d) HATU, DMF, 디이소프로필에틸아민, RT]
반응식 27: 트랜스글루타미나제 커플링을 통한 ADC의 합성
Figure pct00225
[a: DPBS pH 7.4 중 5 mg AK3 (c~10 mg/ml), 6 당량의 독성단-링커 전구체 (예를 들어 중간체 Q31-Q34), 물 중 12.5 μl (1.25 U)의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액 (100 U/ml) 및 37.5 μl의 DPBS pH 7.4의 50 μl의 용액 첨가, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션]
A. 실시예
약어 및 두문자어:
A498 인간 종양 세포주
ABCB1 ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 1 (P-gp 및 MDR1에 대한 동의어)
abs. 절대
Ac 아세틸
ACN 아세토니트릴
aq. 수성, 수용액
ATP 아데노신 트리포스페이트
BCRP 유방암 내성 단백질, 유출 수송체
BEP 2-브로모-1-에틸피리디늄 테트라플루오로보레이트
Boc tert-부톡시카르보닐
br. (NMR에서) 넓은
Ex. 실시예
BxPC3 인간 종양 세포주
ca. 약
CI (MS에서) 화학적 이온화
D (NMR에서) 이중선
D 일
TLC 박층 크로마토그래피
DCI (MS에서) 직접 화학적 이온화
DCM 디클로로메탄
Dd (NMR에서) 이중선의 이중선
DMAP 4-N,N-디메틸아미노피리딘
DME 1,2-디메톡시에탄
DMEM 둘베코 변형 이글 배지 (세포 배양을 위한 표준화된 영양 배지)
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸 술폭시드
D/P 염료 (형광 염료)/단백질 비
DPBS, D-PBS, PBS 둘베코 포스페이트-완충 염 용액
PBS = DPBS = D-PBS, pH 7.4, 시그마(Sigma)로부터의 것, 번호 D8537
조성:
0.2 g KCl
0.2 g KH2PO4 (무수)
8.0 g NaCl
1.15 g Na2HPO4 (무수)
H2O를 사용하여 총 1 l로 만듬
Dt (NMR에서) 삼중선의 이중선
DTT DL-디티오트레이톨
EDC N'-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드
EGFR 표피 성장 인자 수용체
EI (MS에서) 전자 충격 이온화
ELISA 효소-연결 면역흡착 검정
eq. 당량
ESI (MS에서) 전기분무 이온화
ESI-MicroTofq ESI-MicroTofq (질량 분광계의 명칭, Tof = 비행 시간 및 q = 사중극자)
FCS 소 태아 혈청
Fmoc (9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐
sat. 포화
GTP 구아노신-5'-트리포스페이트
H 시간
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HEPES 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산
HOAc 아세트산
HOAt 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물
HOSu N-히드록시숙신이미드
HPLC 고압, 고성능 액체 크로마토그래피
IC50 최대 억제 농도의 절반
i.m. 근육내로, 근육 내로의 투여
i.v. 정맥내로, 정맥 내로의 투여
conc. 진한
KPL-4 인간 종양 세포주
KU-19-19 인간 종양 세포주
LC-MS 액체 크로마토그래피-커플링된 질량 분광측정법
LLC-PK1 세포 루이스 폐 암종 돼지 신장 세포주
L-MDR 인간 MDR1 형질감염된 LLC-PK1 세포
LoVo 인간 종양 세포주
m (NMR에서) 다중선
MDR1 다중약물 내성 단백질 1
MeCN 아세토니트릴
min 분
MS 질량 분광측정법
MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드
NCI-H292 인간 종양 세포주
-Nme- 질소 원자에 결합된 메틸 기
NMM N-메틸모르폴린
NMP N-메틸-2-피롤리디논
NMR 핵 자기 공명 분광측정법
NMRI 해군 의료 연구 기관(Naval Medical Research Institute) (NMRI)으로부터 유래된 마우스 계통
누드 마우스 실험 동물
NSCLC 비소세포 폐암
PBS 포스페이트-완충 염 용액
Pd/C 활성탄 상 팔라듐
P-gp P-당단백질, 수송체 단백질
PNGaseF 당을 절단시키는 효소
quant. (수율에서) 정량적
Quart (NMR에서) 사중선
Quint (NMR에서) 오중선
Rf (TLC에서) 체류 지수
RT 실온
Rt (HPLC에서) 체류 시간
S (NMR에서) 단일선
s.c. 피하로, 피부 아래에의 투여
SCC-4 인간 종양 세포주
SCID 마우스 중증 복합 면역결핍을 갖는 시험 마우스
SK-HEP-1 인간 종양 세포주
t (NMR에서) 삼중선
TBAF 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드
TCEP 트리스(2-카르복시에틸)포스핀
TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실
Teoc 트리메틸실릴에톡시카르보닐
tert 3급
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라히드로푸란
T3P® 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드
U251 인간 종양 세포주
UV 자외선 분광측정법
v/v (용액의) 부피 대 부피 비
Z 벤질옥시카르보닐
아미노산 약어
Ala = 알라닌
Arg = 아르기닌
Asn = 아스파라긴
Asp = 아스파르트산
Cys = 시스테인
Glu = 글루탐산
Gln = 글루타민
Gly = 글리신
His = 히스티딘
Ile = 이소류신
Leu = 류신
Lys = 리신
Met = 메티오닌
Nva = 노르발린
Phe = 페닐알라닌
Pro = 프롤린
Ser = 세린
Thr = 트레오닌
Trp = 트립토판
Tyr = 티로신
Val = 발린
HPLC 및 LC-MS 방법:
방법 1 (LC-MS):
기기: 워터스 액퀴티(Waters ACQUITY) SQD UPLC 시스템; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.25 ml 99% 포름산, 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.25 ml 99% 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 1.2분 5% A → 2.0분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.40 ml/분; UV 검출: 208-400 nm.
방법 2 (LC-MS):
MS 기기 유형: 워터스 시냅트(Waters Synapt) G2S; UPLC 기기 유형: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: 워터스, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 μm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 2% B → 1.5분 2% B → 8.5분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 0.50 ml/분; UV 검출: 220 nm
방법 3 (LC-MS):
MS 기기: 워터스 (마이크로매스(Micromass)) QM; HPLC 기기: 애질런트(Agilent) 1100 시리즈; 칼럼: 애질런트 조르박스 익스텐드(Agilent ZORBAX Extend)-C18 3.0x50mm 3.5-마이크로미터; 용리액 A: 1 l 물 + 0.01 mol 탄산암모늄, 용리액 B: 1 l 아세토니트릴; 구배: 0.0분 98% A → 0.2분 98% A → 3.0분 5% A→ 4.5분 5% A; 오븐: 40℃; 유량: 1.75 ml/분; UV 검출: 210 nm
방법 4 (LC-MS):
MS 기기 유형: 워터스 시냅트 G2S; UPLC 기기 유형: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 10% B → 0.3분 10% B → 1.7분 95% B → 2.5분 95% B; 오븐: 50℃; 유량: 1.20 ml/분; UV 검출: 210 nm.
방법 5 (LC-MS):
기기: 워터스 액퀴티 SQD UPLC 시스템; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.25 ml 99% 포름산, 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.25 ml 99% 포름산; 구배: 0.0분 95% A → 6.0분 5% A → 7.5분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.35 ml/분; UV 검출: 210-400 nm.
방법 6 (LC-MS):
기기: 워터스 UPLC 액퀴티를 갖는 마이크로매스 쿼트로 프리미어(Micromass Quattro Premier); 칼럼: 써모 하이퍼실 골드(Thermo Hypersil GOLD) 1.9 μ 50 x 1 mm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.5 ml 50% 포름산, 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.5 ml 50% 포름산; 구배: 0.0분 97% A → 0.5분 97% A → 3.2분 5% A → 4.0분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.3 ml/분; UV 검출: 210 nm.
방법 7 (LC-MS):
기기: 애질런트 MS 쿼드(Quad) 6150; HPLC: 애질런트 1290; 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.25 ml 99% 포름산, 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.25 ml 99% 포름산; 구배: 0.0분 90% A → 0.3분 90% A → 1.7분 5% A → 3.0분 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 1.20 ml/분; UV 검출: 205-305 nm.
방법 8 (LC-MS):
MS 기기 유형: 워터스 시냅트 G2S; UPLC 기기 유형: 워터스 액퀴티 I-클래스; 칼럼: 워터스, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배: 0.0분 2% B → 2.0분 2% B → 13.0분 90% B → 15.0분 90% B; 오븐: 50℃; 유량: 1.20 ml/분; UV 검출: 210 nm.
방법 9: 실시예 181-191을 위한 LC-MS-정제용 정제 방법 (방법 LIND-LC-MS-정제용)
MS 기기: 워터스; HPLC 기기: 워터스; 워터스 엑스-브리지(X-Bridge) C18 칼럼, 19 mm x 50 mm, 5 μm, 용리액 A: 물 + 0.05% 암모니아, 용리액 B: 구배를 갖는 아세토니트릴 (ULC); 유량: 40 ml/분; UV 검출: DAD; 210-400 nm.
또는
MS 기기: 워터스; HPLC 기기: 워터스; 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 5μ C18 100A 칼럼, 악시아 테크.(AXIA Tech.) 50 x 21.2 mm, 용리액 A: 물 + 0.05% 포름산, 용리액 B: 구배를 갖는 아세토니트릴 (ULC); 유량: 40 ml/분; UV 검출: DAD; 210-400 nm.
방법 10: 실시예 181-191을 위한 LC-MS 분석 방법 (LIND_SQD_SB_AQ)
기기 MS: 워터스 SQD; 기기 HPLC: 워터스 UPLC; 칼럼: 조르박스 SB-Aq (애질런트), 50 mm x 2.1 mm, 1.8 μm; 용리액 A: 물 + 0.025% 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴 (ULC) + 0.025% 포름산; 구배: 0.0분 98%A - 0.9분 25%A - 1.0분 5%A - 1.4분 5%A - 1.41분 98%A - 1.5분 98%A; 오븐: 40℃; 유량: 0.600 ml/분; UV 검출: DAD; 210 nm.
방법 11 (HPLC):
기기: HP1100 시리즈
칼럼: 머크 크로모리스 스피드로드(Merck Chromolith SpeedROD) RP-18e, 50-4.6mm, 카탈로그 번호 1.51450.0001, 크로모리스 가드(Chromolith Guard) 카트리지 키트 전치칼럼, RP-18e, 5-4.6mm, 카탈로그 번호 1.51470.0001
구배: 유량 5 ml/분
주입 부피 5 μl
용매 A: 물 중 HClO4 (70%) (4 ml/l)
용매 B: 아세토니트릴
출발 20% B
0.50분 20% B
3.00분 90% B
3.50분 90% B
3.51분 20% B
4.00분 20% B
칼럼 온도: 40℃
파장: 210 nm
방법 12: (LC-MS):
MS 기기 유형 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) FT-MS; UHPLC+ 기기 유형 써모 사이언티픽 얼티메이트(Thermo Scientific UltiMate) 3000; 칼럼 워터스, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 μm; 용리액 A 1 l의 물 + 0.01% 포름산; 용리액 B 1 l의 아세토니트릴 + 0.01% 포름산; 구배 0.0분 10% B → 2.5분 95% B → 3.5분 95% B; 오븐 50℃; 유량 0.90 ml/분; UV 검출 210 nm/최적 통합 경로 210-300 nm
방법 13: (LC-MS):
MS 기기: 워터스 (마이크로매스) 쿼트로 마이크로; 기기 워터스 UPLC 액퀴티; 칼럼: 워터스 BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.01 mol 포름산암모늄, 용리액 B: 1의 아세토니트릴; 구배: 0.0분 95% A → 0.1분 95% A → 2.0분 15% A → 2.5분 15% A→ 2.51분 10% A → 3.0분 10% A; 오븐: 40℃; 유량: 0.5 ml/분; UV 검출: 210 nm
그의 제조가 하기 명백하게 기재되지 않은 모든 반응물 또는 시약은 일반적으로 접근가능한 공급원으로부터 상업적으로 구입하였다. 마찬가지로 그의 제조가 하기 기재되지 않고, 상업적으로 입수가능하지 않거나 또는 일반적으로 접근가능하지 않은 공급원으로부터 입수된 모든 다른 반응물 또는 시약의 경우, 그의 제조가 기재된 공개된 문헌을 참조한다.
방법 14: (LC-MS) (MCW-LTQ-포로쉘-TFA98-10분)
MS 기기 유형: 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) LTQ-오비트랩-XL; HPLC 기기 유형: 애질런트 1200SL; 칼럼: 애질런트, 포로쉘 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μm; 용리액 A: 1 l 물 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 용리액 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산; 구배: 0.0분 2% B → 0.3분 2% B → 5.0분 95% B → 10.0분 95% B; 오븐: 40℃; 유량: 0.75 ml/분; UV 검출: 210 nm
출발 화합물 및 중간체:
본 발명에 따른 화합물의 제조 및 적합한 중간체의 제조에 적합한 출발 화합물은 이미 WO2015/96982 A1에 기재되었다.
WO2015/96982 A1에 따른 중간체 C1 내지 C73, L1 내지 L73, F1 내지 F58 및 F82 내지 F91, F103 내지 F129, F142 내지 F156, F163 내지 F180, F192 내지 F196, F204 내지 F207, F209 내지 F218, F235, F236, F238, F241 내지 F245, F247, F248 및 F254는 본 출원의 개시내용의 일부를 형성한다. 특정한 번호를 갖는 화합물 (예를 들어 중간체 C1, L1 또는 F1)을 하기 언급하는 경우에, 이는 WO2015/96982 A1에 따른 이들 번호를 갖는 화합물을 의미한다. 추가의 출발 화합물 및 중간체가 하기 기재되어 있다.
중간체 C74
트리플루오로아세트산 2-(트리메틸실릴)에틸 3-아미노-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노일]-D-알라니네이트 (1:1)
Figure pct00226
75 mg (0.114 mmol)의 중간체 C58을 12.5 ml의 DMF에 녹이고 65 mg (0.11 mmol)의 HATU 및 79 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 78 mg (0.171 mmol)의 중간체 L75에 커플링시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제한 후, 중간체를 20 ml의 에탄올에 녹이고 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안 수소화시켰다. 이어서, 촉매를 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하고 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 아세토니트릴/물 1:1로부터 동결건조시켜 63 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 64%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.16분; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+.
중간체 C75
메틸 (2S)-4-[(아세톡시아세틸){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노에이트
Figure pct00227
4.3 g (12.2 mmol)의 중간체 C52를 525 ml의 DCM 중에 용해시키고, 3.63 g (17.12 mmol)의 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 및 8.4 ml의 아세트산을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, 175 ml의 DCM 중에 용해된 3.23 g (11.85 mmol)의 메틸 (2S)-4-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노에이트 ((3S)-3-아미노-4-메톡시-4-옥소부탄산으로부터 통상적인 방법에 의해 제조됨)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 45분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 DCM으로 희석하고 100 ml의 포화 탄산수소나트륨 용액에 이어서 포화 염화나트륨 용액으로 2회 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켜 4.6 g (이론치의 61%)의 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.97분; MS (ESIpos): m/z = 614.32 (M+H)+.
200 mg (0.33 mmol)의 이 중간체를 10 ml의 DCM 중에 용해시킨 다음, 105 μl의 트리에틸아민 및 77 μl (0.717 mmol)의 아세톡시아세틸 클로라이드를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 녹이고 포화 탄산수소나트륨 용액에 이어서 포화 염화나트륨 용액으로 2회 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 농축시켰다. 이와 같이 하여 213 mg (75%)의 표제 화합물을 베이지색 발포체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.46분; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
중간체 C76
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-카르복시프로필}-L-알라닌아미드
Figure pct00228
표제 화합물을 중간체 C75로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법 (염화아연에 의한 Teoc 보호기의 제거, HATU의 존재 하의 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발릴-L-알라닌에 의한 아실화 및 THF/물 중 수산화리튬에 의한 에스테르 절단)에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.23분; MS (ESIpos): m/z = 818 (M+H)+.
중간체 C77
S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-(4-tert-부톡시-4-옥소부타노일)-L-시스테인
Figure pct00229
4-tert-부톡시-4-옥소부탄산 (8.39 mg, 48.1 μmol)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 7.37 mg (48.1 μmol)의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물, 15.5 mg (48.1 μmol)의 (벤조트리아졸-1-일옥시)비스디메틸아미노메틸륨 플루오로보레이트 및 8.60 μl (48.1 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 40.0 mg (0.048 mmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 25.4 μl (141.9 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 혼합물을 반응물에 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실(Reprosil) 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 35.0 mg (이론치의 83%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.76분; MS (ESIpos): m/z = 873 [M+H]+
중간체 C78
11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라펜타데칸-15-산
Figure pct00230
197 mg (0.354 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)프로필]카르바메이트 (중간체 C11의 합성 참조)를 처음에 5.0 ml의 디클로로메탄 중에 충전하고, 혼합물을 40℃로 가열하였다. 이 온도에서, 240 μl (3.0 mmol)의 피리딘 및 220 μl (1.8 mmol)의 메틸 4-클로로-4-옥소부타노에이트를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 240 μl (3.0 mmol)의 피리딘 및 220 μl (1.8 mmol)의 메틸 4-클로로-4-옥소부타노에이트를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 240 μl (3.0 mmol)의 피리딘 및 220 μl (1.8 mmol)의 메틸 4-클로로-4-옥소부타노에이트를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기 상을 각각의 경우에 5% KHSO4 용액으로 3회 추출하였다. 유기 상을 포화 NaCl 용액으로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 74.1 mg (이론치의 31%)의 메틸 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라펜타데칸-15-오에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.49분; MS (ESIpos): m/z = 670 [M+H]+
78.3 mg (117 μmol)의 메틸 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라펜타데칸-15-오에이트를 처음에 4.0 ml의 THF 중에 충전하고, 800 μl의 메탄올, 160 μl의 물 및 230 μl (230 μmol)의 수성 LiOH 용액 (1M)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 아세트산으로 켄칭하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 64.8 mg (이론치의 85%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.61분; MS (ESIneg): m/z = 654 [M-H]-
중간체 C79
트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸 3-아미노-N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-D-알라니네이트 (1:1)
Figure pct00231
57.4 mg (81.8 μmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산 (중간체 C69)을 처음에 5.7 ml의 DMF 중에 충전하고, 74.0 mg (164 μmol)의 트리플루오로아세트산 2-(트리메틸실릴)에틸 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-D-알라니네이트 (1:1) (중간체 L75), 43 μl (250 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 62.2 mg (164 μmol)의 HATU를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 아세트산으로 켄칭하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 52.4 mg (이론치의 63%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-D-알라니네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.64분; MS (ESIpos): m/z = 1022 [M]+
아르곤 하에, 6.23 mg (27.7 μmol)의 아세트산팔라듐 (II)을 처음에 3.0 ml의 디클로로메탄 중에 충전하고, 12 μl (83 μmol)의 트리에틸아민 및 89 μl (550 μmol)의 트리에틸실란을 첨가하고 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 이어서, 3.0 ml의 디클로로메탄 중 56.7 mg (55.5 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-D-알라니네이트를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 거의 농축 건조시키고, 아세토니트릴/물을 첨가하고, 혼합물을 여과하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 37.4 mg (이론치의 67%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.15분; MS (ESIpos): m/z = 888 [M+H]+
중간체 C80
S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-(글리실아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00232
아르곤 하에, 43.4 mg (95.1 μmol)의 1-({N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-산 (중간체 L90)을 처음에 2.5 ml의 DMF 중에 충전하고, 14.6 mg (95.1 μmol)의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물, 30.5 mg (95.1 μmol)의 (벤조트리아졸-1-일옥시)비스디메틸아미노메틸륨 플루오로보레이트 및 16.5 μl (95.1 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 79.0 mg (95.1 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 2.5 ml의 DMF 중에 용해시키고, 49.5 μl (285.3 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고 혼합물을 반응물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 44.2 mg (이론치의 40%)의 화합물 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-({N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실}아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.57분; MS (ESIpos): m/z = 1156 [M+H]+
60.2 mg (52.1 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-({N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실}아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인을 3.0 ml의 에탄올 중에 현탁시키고, 6.0 mg의 활성탄 상 팔라듐 (10%)을 첨가하고 혼합물을 실온 및 표준 압력에서 1시간 동안 수소로 수소화시켰다. 6.0 mg의 활성탄 상 팔라듐 (10%)을 2회 첨가하고 혼합물을 실온 및 표준 압력에서 1시간 동안 수소로 수소화시켰다. 촉매를 여과하고 반응 혼합물에서 용매를 감압 하에 제거하고 고진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 29.4 mg (이론치의 50%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 3.77분; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+
중간체 C81
(R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-1-시클로헥실메탄아민
Figure pct00233
아르곤 하에 및 -78℃에서, 디에틸 에테르 중 18.7 ml (37.45 mmol)의 시클로헥실마그네슘 클로라이드 (2M)를 톨루엔 중 3.12 ml (6.24 mmol)의 디메틸아연 (2.0 M)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, THF 중 5.0 g (12.48 mmol)의 (R)-N-{(E/Z)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]메틸렌}-2-메틸프로판-2-술핀아미드의 용액을 -78℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반한 다음, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, -78℃에서, ml의 포화 염화암모늄 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 바이오타지 이솔레라(Biotage Isolera) (실리카 겔, 에틸 아세테이트/시클로헥산 25:75)를 사용하여 정제하였다. 이와 같이 하여 1.59 g (이론치의 26%)의 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.76분; MS (ESIneg): m/z = 483 [M-H]-
아르곤 하에, 264.0 mg (0.54 mmol)의 이 중간체를 처음에 0.5 ml의 1,4-디옥산 중에 충전한 다음, 1,4-디옥산 중 1.36 ml의 HCl 용액 (4.0 M)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄을 첨가하고, 반응 혼합물을 수성 1M 수산화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 메탄올/디클로로메탄 98:2)를 사용하여 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 탄산수소나트륨 용액으로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 148 mg (이론치의 72%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 13): Rt = 2.07분; MS (ESIpos): m/z = 364 [M-NH2]+
중간체 C82
2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]아미노}프로필)카르바메이트
Figure pct00234
아르곤 하에, 392.2 mg (1.85 mmol)의 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 및 91.29 mg (1.52 mmol)의 아세트산을 1.4 ml의 디클로로메탄 중 503.0 mg (1.32 mmol)의 1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-1-시클로헥실메탄아민 (중간체 C81)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 디클로로메탄 중 574.6 (2.38 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3-옥소프로필)카르바메이트의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 143 mg (0.66 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3-옥소프로필)카르바메이트를 첨가한 후, 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기 상을 각각의 경우에 포화 탄산나트륨 용액 및 포화 NaCl 용액으로 2회 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 g (이론치의 50%)의 표제 화합물을 수득하였다. 이와 같이 하여 488 g (이론치의 63%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.89분; MS (ESIpos): m/z = 582 (M+H)+.
중간체 C83
2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸](클로로아세틸)아미노}프로필)카르바메이트
Figure pct00235
280.0 mg (2.77 mmol)의 트리에틸아민 및 397.8 mg (3.52 mmol)의 클로로아세틸 클로라이드를 8.40 ml의 디클로로메탄 중 487.9 mg (0.84 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]아미노}프로필)카르바메이트 (중간체 C82)의 용액에 4 Å 분자체와 함께 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 염화암모늄 용액으로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 추가로 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 470 mg (이론치의 85%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.88분; MS (ESIpos): m/z = 680 (M+Na)+.
중간체 C84
S-{11-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일}-L-시스테인
Figure pct00236
322.1 mg (2.66 mmol)의 L-시스테인을 319.0 mg (3.80 mmol)의 탄산수소나트륨과 함께 0.19 ml의 물 중에 현탁시켰다. 1.90 ml의 이소-프로판올 중에 용해된 250.0 mg (0.38 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸](클로로아세틸)아미노}프로필)카르바메이트 (중간체 C83) 및 693.8 g (4.56 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3.5시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 276 mg (이론치의 97%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.34분; MS (ESIpos): m/z = 744 (M+H)+.
중간체 C85
S-{11-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일}-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인
Figure pct00237
34.8 mg (0.27 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 4.0 ml의 DMF 중 100 mg (0.13 mmol)의 S-{11-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일}-L-시스테인 (1:1) (중간체 C84) 및 41.5 mg (0.13 mmol)의 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온의 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 후처리 없이, 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 88 mg (이론치의 70%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.71분; MS (ESIpos): m/z = 936 (M+H)+.
중간체 C86
11-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산
Figure pct00238
161.65 mg (1.17 mmol)의 탄산칼륨을 7.45 ml의 메탄올 및 몇 방울의 물 중 220.0 mg (0.33 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3-{[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸](클로로아세틸)아미노}프로필)카르바메이트 (중간체 C83) 및 39.02 mg (0.37 mmol)의 3-술파닐프로판산의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가로 후처리 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 201 mg (이론치의 83%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.72분; MS (ESIneg): m/z = 726 (M-H)-.
중간체 C87
2-(트리메틸실릴)에틸 {13-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,7,12-트리옥소-10-티아-3,6,13-트리아자헥사데칸-16-일}카르바메이트
Figure pct00239
54.18 mg (0.28 mmol)의 N-(2-아미노에틸)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (중간체 L1), 71.01 mg (0.50 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민, 104.46 mg (0.27 mmol)의 HATU 및 DMF 중 0.23 ml (0.14 mmol)의 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 0.5 M을 1.37 ml의 DMF 중 100 mg (0.14 mmol)의 11-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산 (중간체 C86)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 추가의 후처리 없이, 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 41 mg (이론치의 33%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.61분; MS (ESIpos): m/z = 907 (M+H)+.
중간체 C88
tert-부틸 3-[({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)메틸]피롤리딘-1-카르복실레이트 트리플루오로아세트산 (1:1)
입체이성질체의 혼합물
Figure pct00240
1.71 g (8.05 mmol)의 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 및 0.40 g (6.61 mmol)의 아세트산을 51 ml의 디클로로메탄 중 2.04 g (5.75 mmol)의 (1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로판-1-아민 (중간체 C52)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 20 ml의 디클로로메탄 중 1.32 g (6.61 mmol)의 tert-부틸 3-포르밀피롤리딘-1-카르복실레이트의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기 상을 각각의 경우에 포화 탄산나트륨 용액 및 포화 NaCl 용액으로 2회 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 1.86 g (이론치의 50%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.99분; MS (ESIpos): m/z = 538 (M+H-CF3CO2H)+.
중간체 C89
tert-부틸 3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}피롤리딘-1-카르복실레이트
Figure pct00241
1.36 g (13.42 mmol)의 트리에틸아민 및 2.13 g (18.87 mmol)의 클로로아세틸 클로라이드를 42 ml의 디클로로메탄 중 2.89 g (4.19 mmol, 80% 순도)의 tert-부틸 3-[({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)메틸]피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C88)의 용액에 4 Å 분자체와 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 회전 증발에 의해 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 표제 화합물의 449 mg (이론치의 17%)의 이성질체 1 및 442 mg (이론치의 17%)의 이성질체 2를 수득하였다.
이성질체 1 LC-MS (방법 1): Rt = 2.74분; MS (ESIpos): m/z = 614 (M+H)+.
이성질체 2 LC-MS (방법 1): Rt = 2.78분; MS (ESIpos): m/z = 614 (M+H)+.
중간체 C90
S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-L-시스테인 (이성질체 1)
Figure pct00242
357.3 mg (0.58 mmol)의 L-시스테인을 488.7 mg (4.07 mmol)의 탄산수소나트륨과 함께 2.3 ml의 물 중에 현탁시켰다. 23.0 ml의 이소-프로판올 중에 용해된 357.0 mg (0.58 mmol)의 tert-부틸 3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C89, 이성질체 1) 및 1.06 g (6.98 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액으로 반복해서 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가로 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 255.0 mg (이론치의 62%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.09분; MS (ESIpos): m/z = 699 (M+H)+.
중간체 C91
S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-L-시스테인 (이성질체 2)
Figure pct00243
453.5 mg (3.74 mmol)의 L-시스테인을 449.2 mg (5.35 mmol)의 탄산수소나트륨과 함께 2.1 ml의 물 중에 현탁시켰다. 21.1 ml의 이소-프로판올 중에 용해된 3287.4 mg (0.54 mmol)의 tert-부틸 3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C89, 이성질체 2) 및 0.98 g (6.42 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액으로 반복해서 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가로 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 221.0 mg (이론치의 59%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.12분; MS (ESIpos): m/z = 699 (M+H)+.
중간체 C92
S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 (이성질체 1)
Figure pct00244
18.49 mg (0.14 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 3.3 ml의 DMF 중 50 mg (0.07 mmol)의 S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-L-시스테인 (중간체 C90) 및 22.06 mg (0.07 mmol)의 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온의 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 후처리 없이, 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 65 mg (이론치의 100%, 71% 순도)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.31분; MS (ESIpos): m/z = 892 (M+H)+.
중간체 C93
S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 (이성질체 2)
Figure pct00245
18.49 mg (0.14 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 3.0 ml의 DMF 중 50.0 mg (0.07 mmol)의 S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-L-시스테인 (중간체 C91) 및 22.06 mg (0.07 mmol)의 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온의 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 후처리 없이, 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 63 mg (이론치의 98%, 73% 순도)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 892 (M+H)+.
중간체 C94
S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-시스테인 (이성질체 1)
Figure pct00246
18.5 mg (0.14 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 3.3 ml의 DMF 중 50.0 mg (0.07 mmol)의 S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[-1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-L-시스테인 (중간체 C90) 및 18.0 mg (0.07 mmol)의 -{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온의 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 포화 NH4Cl 용액으로 반복해서 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 57 mg (이론치의 81%, 85% 순도)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.96분; MS (ESIpos): m/z = 836 (M+H)+.
중간체 C95
3-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]술파닐}프로판산 (이성질체 1)
Figure pct00247
302.5 mg (2.19 mmol)의 탄산칼륨을 14 ml의 메탄올 및 몇 방울의 물 중 384.0 mg (0.62 mmol)의 tert-부틸 3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C89, 이성질체 1) 및 73.0 mg (0.69 mmol)의 3-술파닐프로판산의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 추가로 후처리 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 358.0 mg (이론치의 84%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.33분; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H)+.
중간체 C96
3-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]술파닐}프로판산 (이성질체 2)
Figure pct00248
226.0 mg (1.64 mmol)의 탄산칼륨을 14 ml의 메탄올 및 몇 방울의 물 중 287.0 mg (0.45 mmol)의 tert-부틸 3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C89, 이성질체 2) 및 54.6 mg (0.51 mmol)의 3-술파닐프로판산의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 추가로 후처리 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 318.7 mg (이론치의 88%, 88% 순도)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.36분; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H)+.
중간체 C97
tert-부틸 3-[2-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-14-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,8,13-트리옥소-5-티아-2,9,12-트리아자테트라데스-1-일]피롤리딘-1-카르복실레이트 (이성질체 2)
Figure pct00249
아르곤 하에, 14.17 mg (0.11 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 27.80 mg (0.07 mmol)의 HATU를 2.81 ml의 DMF 중 25.0 mg (0.04 mmol)의 3-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]술파닐}프로판산 (중간체 C96)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 1.4 ml의 DMF 및 5 mg (0.04 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중 22.75 mg (0.07 mmol)의 N-(2-아미노에틸)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드-에탄 (1:1) 트리플루오로아세트산 (중간체 L1)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물과 혼합하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가로 후처리 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 26 mg (이론치의 84%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.39분; MS (ESIpos): m/z = 863 (M+H)+.
중간체 C98
tert-부틸 3-[2-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,8,13-트리옥소-5-티아-2,9,12-트리아자옥타데스-1-일]피롤리딘-1-카르복실레이트 (이성질체 2)
Figure pct00250
아르곤 하에, 14.17 mg (0.11 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 27.80 mg (0.07 mmol)의 HATU를 2.81 ml의 DMF 중 25.0 mg (0.04 mmol)의 3-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]술파닐}프로판산 (중간체 C96)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 1.4 ml의 DMF 및 5 mg (0.04 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중 37.30 mg (0.07 mmol)의 N-(2-아미노에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드-에탄 (1:1) 트리플루오로아세트산의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물을 첨가하고 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 22 mg (이론치의 63%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.54분; MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+.
중간체 C99
tert-부틸 3-[2-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-24-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,8,19-트리옥소-12,15-디옥사-5-티아-2,9,18-트리아자테트라코스-1-일]피롤리딘-1-카르복실레이트 (이성질체 2)
Figure pct00251
아르곤 하에, 14.17 mg (0.11 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 27.80 mg (0.07 mmol)의 HATU를 2.81 ml의 DMF 중 25.0 mg (0.04 mmol)의 3-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]술파닐}프로판산 (중간체 C96)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 1.4 ml의 DMF 및 5 mg (0.04 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중 35.05 mg (0.07 mmol)의 N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드-에탄 (1:1) 트리플루오로아세트산 (중간체 L82)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물을 첨가하고 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 25 mg (이론치의 60%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 4.52분; MS (ESIpos): m/z = 1007 (M+H)+.
중간체 C100
2-(트리메틸실릴)에틸 {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}카르바메이트
Figure pct00252
22.2 mg (0.068 mmol)의 (2R)-N-(2-아미노에틸)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판아미드 (1:1) 트리플루오로아세트산을 5.8 ml의 DMF 중 45 mg (0.068 mmol)의 (2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부탄산 (중간체 C58)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, 39 mg (0.10 mmol)의 HATU 및 36 mg (0.27 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 후처리 없이, 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 7 mg (이론치의 12%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.41분; MS (ESIpos): m/z 851 (M+H)+.
중간체 C101
트리플루오로아세트산 / 메틸 (2S)-4-[(아세톡시아세틸){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-아미노부타노에이트 (1:1)
Figure pct00253
4.3 g (12.2 mmol)의 중간체 C52를 525 ml의 DCM 중에 용해시키고, 3.63 g (17.12 mmol)의 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 및 8.4 ml의 아세트산을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, 175 ml의 DCM 중에 용해된 3.23 g (11.85 mmol)의 메틸 (2S)-4-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노에이트 ((3S)-3-아미노-4-메톡시-4-옥소부탄산으로부터 통상적인 방법에 의해 제조됨)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 45분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 DCM으로 희석하고 100 ml의 포화 탄산수소나트륨 용액에 이어서 포화 염화나트륨 용액으로 2회 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켜 4.6 g (이론치의 61%)의 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.97분; MS (ESIpos): m/z = 614.32 (M+H)+.
2.06 g (3.36 mmol)의 이 중간체를 처음에 76 ml의 DCM 중에 충전하고 2.1 ml의 트리에틸아민의 존재 하에 0.81 ml (7.17 mmol)의 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트로 아실화시켰다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 추가로 0.36 ml의 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트 및 0.94 ml의 트리에틸아민을 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 15분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 500 ml의 에틸 아세테이트로 희석하고 연속적으로 300 ml의 5% 시트르산으로 2회, 300 ml의 포화 탄산수소나트륨 용액으로 2회 및 100 ml의 포화 염화나트륨 용액으로 1회 추출한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켰다. 고진공 하에 건조시켜 2.17 g (이론치의 79%)의 보호된 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.48분; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
321 mg (0.342 mmol)의 이 중간체를 7 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 279.5 mg (2.05 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 599 mg (2.05 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 및 물 중 2 ml의 0.1% 트리플루오로아세트산 용액을 첨가한 다음, 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 60 mg (이론치의 26%)의 표제 화합물을 수득하였으며, 이는 여전히 탈아세틸화 화합물 중 일부를 함유하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분 및 0.95분; MS (ESIpos): m/z = 528 및 570 (M+H)+.
중간체 C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}부탄산
Figure pct00254
먼저, 중간체 C52를 벤질 (2S)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-4-옥소부타노에이트로 중간체 C2와 유사하게 환원적으로 알킬화시켰다. 이어서, 2급 아미노 기를 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트로 아실화시킨 다음, 2개의 에스테르 기를 메탄올 중 2M 수산화리튬 용액으로 가수분해시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.31분; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)-.
중간체 C103
2-(트리메틸실릴)에틸 N-[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]-N2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-글루타미네이트
Figure pct00255
표제 화합물을 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 151 mg (0.23 mmol)의 중간체 C102를 128 mg (0.234 mmol)의 중간체 L98과 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속적으로, Z 보호기를 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 표준 수소 압력 하에 30분 동안의 수소화에 의해 제거하여, 표제 화합물을 수득하였다.
수율: 2 단계에 걸쳐 이론치의 30%
LC-MS (방법 1): Rt = 1.14분; MS (ESIpos): m/z = 929 (M+H)+.
중간체 C104
2-(트리메틸실릴)에틸 (3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)메틸]-4-플루오로피롤리딘-1-카르복실레이트
Figure pct00256
56.0 ml의 디클로로메탄 중 2.24 g (6.31 mmol)의 (1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로판-1-아민의 용액에 4 Å 분자체와 함께 1.87 g (8.84 mmol)의 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 후속적으로, 2.20 g (7.58 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3R,4S)-3-플루오로-4-포르밀피롤리딘-1-카르복실레이트 (WO 2014/151030A1)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 물로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 1.39 g (이론치의 24%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.15분; MS (ESIpos): m/z = 600 (M+H)+.
중간체 C105
2-(트리메틸실릴)에틸 (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}-4-플루오로피롤리딘-1-카르복실레이트
Figure pct00257
8.7 ml의 디클로로메탄 중 692.8 mg (0.88 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)메틸]-4-플루오로피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C104)의 용액에 4 Å 분자체와 함께 295.0 mg (2.91 mmol)의 트리에틸아민 및 418.9 mg (3.71 mmol)의 클로로아세틸 클로라이드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 염화암모늄 용액으로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 4 Å 분자체와 함께 8.7 ml의 디클로로메탄 중에 다시 한 번 용해시키고 295.0 mg (2.91 mmol)의 트리에틸아민 및 418.9 mg (3.71 mmol)의 클로로아세틸 클로라이드를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 염화암모늄 용액으로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고 추가로 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 691 mg (이론치의 74%, 64% 순도)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.78분; MS (ESIpos): m/z = 676 (M+H)+.
중간체 C106
3-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(3R,4R)-4-플루오로-1-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]술파닐}프로판산
Figure pct00258
15 ml의 메탄올 및 몇 방울의 물 중 691.0 mg (0.65 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]-메틸}-4-플루오로피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C105) 및 76.3 mg (0.72 mmol)의 3-술파닐프로판산의 혼합물에 316 mg (2.29 mmol)의 탄산칼륨을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 잔류물을 추가로 후처리 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 502 mg (이론치의 67%, 65% 순도)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.48분; MS (ESIneg): m/z = 744 (M-H)-.
중간체 C107
S-{[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(3R,4R)-4-플루오로-1-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-L-시스테인
Figure pct00259
203.6 mg (1.68 mmol)의 L-시스테인을 201.7 mg (2.40 mmol)의 탄산수소나트륨과 함께 0.95 ml의 물 중에 현탁시켰다. 여기에 9.5 ml의 이소-프로판올 중에 용해된 170.0 mg (0.24 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]메틸}-4-플루오로피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 105) 및 438.5 g (2.40 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 혼합물에 첨가하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 152 mg (이론치의 83%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.26분; MS (ESIpos): m/z = 762 (M+H)+.
중간체 C108
2-(트리메틸실릴)에틸 N6-(N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐)-N2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-리시네이트
Figure pct00260
표제 화합물을 EDCI, HOBT 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 103 mg (0.16 mmol)의 중간체 C102를 110 mg (0.175 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 N6-베타-알라닐-N2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-리시네이트와 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속적으로, Z 보호기를 디클로로메탄/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 표준 수소 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 제거하여, 113 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 75%)의 수율로 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.17분; MS (ESIpos): m/z = 957 (M+H)+.
여기서 사용된 중간체를 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 HATU의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-(tert-부톡시카르보닐)-베타-알라닌 및 2-(트리메틸실릴)에틸 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리시네이트를 커플링시키고, Z 보호기를 가수소분해적 분리시키고, 트리메틸실릴에틸옥시카르보닐 (Teoc) 보호기를 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 도입하고 최종적으로 디클로로메탄 중 7.5% 트리플루오로아세트산 용액 중에서 45분 동안 교반함으로써 Boc 보호기를 완만하게 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 462 (M+H)+.
중간체 C109
디-tert-부틸 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-L-글루타메이트
Figure pct00261
먼저, 디펩티드 유도체 디-tert-부틸 베타-알라닐-L-글루타메이트를 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 HATU의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-베타-알라닌 및 디-tert-부틸 L-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1)를 커플링시키고 후속적으로 Z 보호기를 가수소분해적 분리시킴으로써 제조하였다. 이어서, 표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 이 중간체를 중간체 C102와 커플링시키고 후속적으로 Z 보호기를 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 표준 수소 압력 하에 45분 동안의 수소화에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.99분; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+.
중간체 C110
디벤질 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-L-글루타메이트
Figure pct00262
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, 에틸 아세테이트와 5% 탄산수소나트륨 용액 사이에 분배함으로써 그의 p-톨루엔술폰산 염으로부터 미리 방출된 디벤질 L-글루타메이트를 중간체 C61과 커플링시키고 후속적으로 Teoc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.09분; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
중간체 C110(D)
디벤질 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루타메이트
Figure pct00263
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, 에틸 아세테이트와 5% 탄산수소나트륨 용액 사이에 분배함으로써 그의 p-톨루엔술폰산 염으로부터 미리 방출된 디벤질 D-글루타메이트를 중간체 C61과 커플링시키고 후속적으로 Teoc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.08분; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
중간체 C111
디-tert-부틸 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루타메이트
Figure pct00264
표제 화합물을 중간체 C109와 유사하게 합성하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.06분; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+.
중간체 C112
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-1-[(2-아미노에틸)아미노]-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00265
먼저, (2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸 프로필}(글리콜로일)아미노]-2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]부탄산을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시켰다. 대안적으로, 중간체 C58을 반응물로서 사용하는 것이 또한 가능하다. 이어서 트리플루오로에탄올 중 4 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 5시간 동안 교반함으로써 Boc 보호기를 분리시켰다. 이어서, 수득된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L111에 커플링시켰다. 최종 단계에서, 표제 화합물을 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.8분; MS (ESIpos): m/z = 854 [M+H]+.
중간체 C113
트리플루오로아세트산 / 벤질 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-D-알라니네이트 (1:1)
Figure pct00266
먼저, 트리플루오로아세트산 / 벤질 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-D-알라니네이트 (1:1)를 상업적으로 입수가능한 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닌으로부터 EDC/DMAP의 존재 하에 벤질 알콜로 에스테르화시키고 후속적으로 Boc 보호기를 트리플루오로아세트산으로 분리시킴으로써 제조하였다. 이어서, 이 아미노산 단위를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 C58에 커플링시켰다. 최종 단계에서, 표제 화합물을 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반하고 정제용 HPLC에 의해 정제함으로써 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.05분; MS (ESIpos): m/z = 824 [M+H]+.
중간체 C114
트리플루오로아세트산 / tert-부틸 4-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)부타노에이트 (1:1)
Figure pct00267
먼저, 중간체 C102를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸 4-아미노부타노에이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시켰다. 후속적으로, 표제 화합물을 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.0분; MS (ESIpos): m/z = 655 [M+H]+.
중간체 C116
트리플루오로아세트산 / N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 (1:1)
Figure pct00268
트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)부탄아미드 (1:1) (81.0 mg, 100 μmol) (중간체 F104) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-아스파라기네이트 (43.0 mg, 131 μmol)를 5.0 ml의 DMF 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 N,N-디이소프로필에틸아민 (61 μl, 350 μmol)과 함께 실온에서 추가로 1시간 동안 교반한 다음, 정제용 RP-HPLC (칼럼: 크로마토렉스(Chromatorex) 125x30; 10μ, 유량: 75 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 84 mg (이론치의 88%)의 화합물 tert-부틸 [(2S)-4-아미노-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}아미노)-1,4-디옥소부탄-2-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.09분; MS (ESIpos): m/z = 907 [M+H]+
tert-부틸 [(2S)-4-아미노-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}아미노)-1,4-디옥소부탄-2-일]카르바메이트 (83.0 mg, 91.5 μmol)를 5.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 염화아연 (74.8 mg, 549 μmol)과 혼합하고 50℃에서 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (160 mg, 549 μmol)과 혼합하고 5.0 ml의 아세토니트릴/물로 희석하고, TFA (20 μl)를 첨가하고 혼합물을 추가로 10분 동안 교반하였다. 혼합물을 시린지 필터를 통해 여과하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 크로마토렉스 125x30; 10μ, 유량: 75 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 50 mg (이론치의 58%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.81분; MS (ESIpos): m/z = 807 [M+H]+
중간체 C117
트리플루오로아세트산 / 디벤질 N-[3-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)프로파노일]-베타-알라닐-L-글루타메이트 (1:1)
Figure pct00269
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 트리플루오로아세트산 / 디벤질 베타-알라닐-L-글루타메이트 (1:1) (중간체 L127)를 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산에 커플링시키고 후속적으로 Teoc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 염화아연에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.07분; MS (ESIpos): m/z = 938 [M+H]+.
중간체 C118
9H-플루오렌-9-일메틸 {3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]프로필}카르바메이트
Figure pct00270
9H-플루오렌-9-일메틸 [3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)프로필]카르바메이트 (2.50 g, 3.94 mmol) 및 트리에틸아민 (1.6 ml, 12 mmol)을 처음에 200 ml의 디클로로메탄 중에 충전하고 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, 클로로아세틸 클로라이드 (2.23 g, 19.7 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 염화암모늄 용액으로 3회 세척하였다. 유기 상을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 잔류물을 합성의 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 1.7 g (이론치의 63%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.52분; MS (ESIpos): m/z = 710 (M+H+)+.
중간체 C119
트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸 S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-(tert-부톡시카르보닐)-L-시스테이네이트 (1:1)
Figure pct00271
9H-플루오렌-9-일메틸 {3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]프로필}카르바메이트 (중간체 C118) (208 mg, 294 μmol) 및 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-시스테이네이트 (99.3 mg, 309 μmol) (중간체 L128)를 처음에 5.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 1.0 ml의 물 (0.1% TFA)과 혼합하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 252 mg (이론치의 86%)의 2-(트리메틸실릴)에틸 S-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(3-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}프로필)아미노]-2-옥소에틸}-N-(tert-부톡시카르보닐)-L-시스테이네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.76분; MS (ESIpos): m/z = 995 [M+H]+
2-(트리메틸실릴)에틸 S-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(3-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}프로필)아미노]-2-옥소에틸}-N-(tert-부톡시카르보닐)-L-시스테이네이트 (63.1 mg, 63.4 μmol)를 처음에 2.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 200 μl의 모르폴린을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1.0 ml의 물 (0.1% TFA)과 혼합하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 51 mg (이론치의 91%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.36분; MS (ESIpos): m/z = 773 [M+H]+
중간체 C120
N-{[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세틸}-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-1-[(2-아미노에틸)아미노]-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00272
이 중간체를 커플링에 대해 중간체 L129를 사용하여 중간체 C112와 유사하게 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.77분; MS (ESIpos): m/z = 972 [M+H]+
중간체 C121
디벤질 N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루타메이트
Figure pct00273
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, 에틸 아세테이트와 5% 탄산수소나트륨 용액 사이에 분배함으로써 그의 p-톨루엔술폰산 염으로부터 미리 방출된 디벤질 D-글루타메이트를 중간체 C61과 커플링시키고 후속적으로 Teoc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.05분; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
중간체 C122
tert-부틸 N-[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]-N2-(tert-부톡시카르보닐)-D-알파-글루타미네이트
Figure pct00274
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, 에틸 아세테이트와 5% 탄산수소나트륨 용액 사이에 분배함으로써 그의 p-톨루엔술폰산 염으로부터 미리 방출된 디벤질 D-글루타메이트를 중간체 C61과 커플링시키고 후속적으로 Teoc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.05분; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+.
중간체 C123
tert-부틸 N-[2-({(2S)-2-(L-아스파라기닐아미노)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]-N2-(tert-부톡시카르보닐)-D-알파-글루타미네이트
표제 화합물을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 4-니트로페닐 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-아스파라기네이트를 중간체 C122에 커플링시키고 후속적으로 Z 보호기를 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.98분; MS (ESIpos): m/z = 955 [M+H]+.
중간체 C124
8-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,9-디옥소-2-옥사-11-티아-4,8-디아자테트라데칸-14-산
Figure pct00276
9H-플루오렌-9-일메틸 [3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)프로필]카르바메이트 (3.50 g, 5.52 mmol) (중간체 C67) 및 트리에틸아민 (2.3 ml, 17 mmol)을 처음에 디클로로메탄 (700 ml, 11 mol) 중에 충전하였다. 클로로아세틸 클로라이드 (3.12 g, 27.6 mmol)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기 상을 먼저 10% 시트르산 용액으로 세척한 다음, 포화 탄산수소나트륨 용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 세척하였다. 유기 상을 포화 NaCl 용액으로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시켰다.
이와 같이 하여 수득된 9H-플루오렌-9-일메틸 {3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(클로로아세틸)아미노]프로필}카르바메이트 (350 mg, 493 μmol) 중간체를 3-술파닐프로판산 (93 μl, 990 μmol)과 함께 DMF (7.0 ml) 중에 용해시키고, 트리에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 다음, 반응을 3 ml의 물 + 0.1% TFA를 첨가하여 정지시켰다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 307 mg (80%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.40분; MS (ESIpos): m/z = 780 [M+H]+
중간체 C125
디-tert-부틸 N-[3-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)프로파노일]-D-아스파르테이트 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00277
DMF (3.0 ml) 중 8-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,9-디옥소-2-옥사-11-티아-4,8-디아자테트라데칸-14-산 (200 mg, 256 μmol, 중간체 C124) 및 디-tert-부틸-D-아스파르테이트 히드로클로라이드 염 (86.7 mg, 308 μmol)의 혼합물에 HATU (117 mg, 308 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (130 μl, 770 μmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 + 0.1% TFA로 켄칭하고 정제용 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.61분; MS (ESIpos): m/z = 1007 [M+H]+
수득된 중간체를 DMF (3.0 ml) 중에 용해시키고 모르폴린 (200 μl, 2.3 mmol)과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 다음, 물 + 0.1% TFA로 켄칭하고 정제용 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 182 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 3.84분; MS (ESIpos): m/z = 785 [M+H]+
중간체 C126
디-tert-부틸 (2R)-2-{[(2S,5R,8S)-2-아미노-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-14-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-5-메틸-3,6,9,15,20-펜타옥소-17-티아-4,7,10,14-테트라아자이코산-20-일]아미노}숙시네이트
Figure pct00278
표제 화합물을 N,N-디이소프로필에틸아민 및 HATU의 존재 하에 DMF 중에서 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴 (중간체 L108)을 중간체 C125에 커플링시키고 후속적으로 Z 보호기를 에틸 아세테이트/에탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.02분; MS (ESIpos): m/z = 1041 [M+H]+
중간체 C127
트리플루오로아세트산 디-tert-부틸-(2R)-2-{[(4S,7R,10S)-10-(2-아미노-2-옥소에틸)-16-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7-디메틸-2,5,8,11,17,22-헥사옥소-19-티아-3,6,9,12,16-펜타아자도코산-22-일]아미노}숙시네이트 염
Figure pct00279
디-tert-부틸 (2R)-2-{[(2S,5R,8S)-2-아미노-8-(2-아미노-2-옥소에틸)-14-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-5-메틸-3,6,9,15,20-펜타옥소-17-티아-4,7,10,14-테트라아자이코산-20-일]아미노}숙시네이트 (12.0 mg, 11.5 μmol, 중간체 C126) 및 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온 (3.20 mg, 12.7 μmol)을 DMF (1.0 ml) 중에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (4.0 μl, 23 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 물 + 0.1% TFA로 켄칭하고, 혼합물을 정제용 RP-HPLC에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.25분; MS (ESIpos): m/z = 1178 [M+H]+
중간체 C128
N2-아세틸-N-[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신아미드
Figure pct00280
DMF (2.8 ml) 중 (2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}부탄산 (17.0 mg, 26.2 μmol, 중간체 C102)의 용액에 N2-아세틸-N-(2-아미노에틸)-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신아미드 (9.54 mg, 28.9 μmol, 중간체 L135), HATU (18.0 mg, 47.2 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (9.1 μl, 52 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 용매를 고진공 하에 제거하고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.27분; MS (ESIpos): m/z = 960 [M+H]+
DCM/EtOH 중에 용해시키고 Z 보호기를 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.97분; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H]+
중간체 C129
L-알라닐-D-알라닐-N1-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(3-{[(1R)-1,2-디카르복시에틸]아미노}-3-옥소프로필)술파닐]아세틸}아미노)프로필]-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00281
중간체 C126을 트리플루오로에탄올 (2.0 ml) 중에 용해시키고, 이염화아연 (9.19 mg, 67.4 μmol)을 첨가하였다. 50℃에서 1시간 동안 교반한 후, 염화아연 (9.19 mg, 67.4 μmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (19.7 mg, 67.4 μmol)을 반응 혼합물에 첨가하였으며, 이를 간략하게 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 7.6 mg (이론치의 52%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 3): Rt = 0.84분; MS (ESIneg): m/z = 927 [M-H]-
중간체 L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)아세틸]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산
Figure pct00282
107 mg (0.335 mmol)의 tert-부틸 3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 및 93 mg (0.369 mmol)의 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 2-(2,5-디옥소피롤-1-일)아세테이트를 5 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 0.074 ml (0.671 mmol)의 N-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 0.048 ml (0.838 mmol)의 아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 133 mg (86%, 100% 순도)의 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)아세틸]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.82분; MS (ESIpos): m/z = 459 (M+H)+.
0.5 ml의 TFA를 5 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)아세틸]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (130 mg, 0.284 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 102 mg (90%, 순도 100%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.52분; MS (ESIpos): m/z = 402 (M+H)+.
중간체 L75
트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-D-알라니네이트 (1:1)
Figure pct00283
표제 화합물을 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닌으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법 (EDCI/DMAP를 사용한 2-트리메틸실릴에탄올에 의한 에스테르화 및 트리플루오로아세트산에 의한 Boc 보호기의 제거)에 의해 제조하였다. 이와 같이 하여 405 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 58%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.75분; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+.
중간체 L76
(2S)-2-브로모-4-옥소-4-[2-(트리메틸실릴)에톡시]부탄산
Figure pct00284
먼저, 적합하게 보호된 아스파르트산 유도체를 (3S)-4-(벤질옥시)-3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-4-옥소부탄산으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법 (EDCI/DMAP를 사용한 2-(트리메틸실릴)에탄올에 의한 에스테르화 및 Z 보호기 및 벤질 에스테르의 가수소분해적 제거)에 의해 제조하였다.
이러한 방식으로 수득된 470 mg (1.8 mmol)의 (2S)-2-아미노-4-옥소-4-[2-(트리메틸실릴)에톡시]부탄산을 10 ml의 물 중에 현탁시키고, 1.8 ml의 1 몰 염산 및 0.5 ml의 진한 황산에 이어서 863 mg (7.25 mmol)의 브로민화칼륨을 첨가하였다. 이어서, 10℃에서, 1 ml의 물 중 150 mg (2.175 mmol)의 아질산나트륨의 용액을 30분의 기간에 걸쳐 적가하고, 혼합물을 10-15℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 50 ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 포화 염화나트륨 용액으로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 260 mg (이론치의 48%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.03분; MS (ESIneg): m/z = 295 및 297 (M-H)-.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 및 3.2 (2dd, 2H), 4.18 (t, 2H), 4.57 (t, 1H).
중간체 L77
트리플루오로아세트산 / N-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-2-브로모아세트아미드 (1:1)
Figure pct00285
418 mg (2.05 mmol)의 tert-부틸 [2-(2-아미노에톡시)에틸]카르바메이트를 먼저 638 mg (2.46 mmol)의 브로모아세트산 무수물과 반응시킨 다음, Boc 보호기를 트리플루오로아세트산으로 제거하였다. 이와 같이 하여 551 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 63%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법): Rt = 0.32분; MS (ESIpos): m/z = 227 및 225 (M+H)+.
중간체 L78
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-베타-알라닌
Figure pct00286
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산으로부터 EDCI/HOBt 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸 베타-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시키고 후속적으로 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.32분; MS (ESIpos): m/z = 227 (M+H)+.
중간체 L79
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라닌
Figure pct00287
64.8 mg (0.357 mmol)의 tert-부틸 베타-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1) 및 100 mg (0.324 mmol)의 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온을 4 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 65.6 mg (0.649 mmol)의 N-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 0.048 ml (0.838 mmol)의 아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 84.5 mg (77%, 순도 100%)의 tert-부틸 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라니네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.78분; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+.
1.62 ml의 TFA를 8 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라니네이트 (82.8 mg, 0.244 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 62.7 mg (87%, 순도 95%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.75분; MS (ESIpos): m/z = 283 (M+H)+.
중간체 L80
2-(트리메틸실릴)에틸 3-[(15-아미노-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일)아미노]-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라니네이트
Figure pct00288
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닌 / N-시클로헥실시클로헥산아민 (1:1)으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법 (염으로부터의 방출 및 EDCI/DMAP를 사용한 2-(트리메틸실릴)에탄올에 의한 에스테르화, Z 보호기의 가수소분해적 제거, HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 상업적으로 입수가능한 3-옥소-1-페닐-2,7,10,13,16-펜타옥사-4-아자노나데칸-19-산에 대한 커플링 및 Z 보호기의 또 다른 가수소분해적 제거)에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.70분; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+.
중간체 L81
트리플루오로아세트산 / 벤질 {2-[(2-아미노에틸)술포닐]에틸}카르바메이트 (1:1)
Figure pct00289
250 mg (1.11 mmol)의 2,2'-술포닐디에탄아민을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 92.3 mg (0.37 mmol)의 1-{[(벤질옥시)카르보닐]옥시}피롤리딘-2,5-디온에 커플링시켰다. 후속적으로 HPLC에 의해 정제하여 70 mg (이론치의 47%)의 표제 화합물을 수득하였다.
C-MS (방법 12): Rt = 0.64분; MS (ESIpos): m/z = 257.11 (M+H)+.
중간체 L82
트리플루오로아세트산 / N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (1:1)
Figure pct00290
88.6 mg (0.357 mmol)의 N-Boc-2,2'-(에틸렌디옥시)디에틸아민 및 100 mg (0.324 mmol)의 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트를 4.0 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 0.071 ml (0.650 mmol)의 N-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 0.048 ml (0.838 mmol)의 아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 75 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 127 mg (이론치의 81%)의 tert-부틸 {2-[2-(2-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]아미노}에톡시)에톡시]에틸}카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.78분; MS (ESIpos): m/z = 442 (M+H)+.
2.0 ml의 TFA를 7.5 ml의 디클로로메탄 중 123 mg (225 μmol)의 tert-부틸 {2-[2-(2-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]아미노}에톡시)에톡시]에틸}카르바메이트의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 111 mg (이론치의 100%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.31분; MS (ESIpos): m/z = 342 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.04 (m, 2H), 2.98 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.39 (m, 4H), 3.56 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.72 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H).
중간체 L83
트리플루오로아세트산 / N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1)
Figure pct00291
200 mg (0.805 mmol)의 tert-부틸 {2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}카르바메이트, 150 mg (0.966 mmol)의 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산 및 560 μl (3.2 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 10 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 459 mg (1.21 mmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 유기 상을 5% 시트르산 용액으로 2회 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 칼럼 25 g 스냅, 디클로로메탄:메탄올 98:2)를 사용하여 정제하였다. 이와 같이 하여 276 mg (이론치의 89%)의 tert-부틸 {2-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]에틸}카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.67분; MS (ESIpos): m/z = 386 (M+H)+.
4 ml의 TFA를 15 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 {2-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]에틸}카르바메이트 (275 mg, 714 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 281 mg (이론치의 99%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.17분; MS (ESIpos): m/z = 286 (M+H)+.
중간체 L84
트리플루오로아세트산 / N-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (1:1)
Figure pct00292
200 mg (0.594 mmol)의 tert-부틸 (14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)카르바메이트 및 202 mg (0.654 mmol)의 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온을 4.0 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 0.130 ml (1.2 mmol)의 N-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 0.085 ml (1.5 mmol)의 아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 275 mg (이론치의 73%)의 tert-부틸 [21-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-16-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자헤니코스-1-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.81분; MS (ESIpos): m/z = 530 (M+H)+.
780 μl (10 mmol)의 TFA를 5.0 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 [21-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-16-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자헤니코스-1-일]카르바메이트 (268 mg, 505 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 266 mg (이론치의 97%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.46분; MS (ESIpos): m/z = 430 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.03 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.38 (m, 4H), 3.52 (m, 8H), 3.58 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H).
중간체 L85
트리플루오로아세트산 / N-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1)
Figure pct00293
200 mg (0.594 mmol)의 tert-부틸 (14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)카르바메이트, 111 mg (0.713 mmol)의 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산 및 410 μl (2.4 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 6 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 339 mg (0.892 mmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 130 mg (이론치의 43%)의 tert-부틸 [17-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-16-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자헵타데스-1-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.71분; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)+.
410 μl (5.3 mmol)의 TFA를 4.0 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 [17-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-16-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자헵타데스-1-일]카르바메이트 (126 mg, 267 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 124 mg (이론치의 95%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 13): Rt = 0.74분; MS (ESIpos): m/z = 374 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.99 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3.53 (m, 8H), 3.58 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 7.09 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 8.21 (m, 1H).
중간체 L86
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닌
Figure pct00294
100 mg (0.531 mmol)의 L-발릴-L-알라닌 및 134 mg (0.531 mmol)의 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온을 3 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 0.150 ml (1.1 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량; 50 ml/분, MeCN/물)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 71.5 mg (이론치의 41%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.42분; MS (ESIpos): m/z = 326 (M+H)+.
중간체 L87
3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로판산
Figure pct00295
250 mg (1.07 mmol)의 tert-부틸 3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노에이트, 151 mg (0.974 mmol)의 2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산, 224 mg (1.46 mmol)의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물 및 224 mg (1.17 mmol)의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 5.0 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 혼합물을 5% 시트르산 용액 및 포화 탄산수소나트륨 용액으로 2회 추출하였다. 유기 상을 포화 염화나트륨 용액으로 2회 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x40; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 267 mg (이론치의 64%)의 tert-부틸 3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로파노에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.73분; MS (ESIpos): m/z = 371 (M+H)+.
1.1 ml (14 mmol)의 TFA를 10 ml의 디클로로메탄 중 tert-부틸 3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로파노에이트 (263 mg, 710 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 240 mg (이론치의 94%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 0.57분; MS (ESIpos): m/z = 315 (M+H)+.
중간체 L88
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-L-알라니네이트
Figure pct00296
150 mg (0.797 mmol)의 L-발릴-L-알라닌 및 246 mg (0.797 mmol)의 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온을 4.0 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 0.220 ml (1.6 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량; 50 ml/분, MeCN/물)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 302 mg (이론치의 97%)의 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-L-알라닌을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.02분; MS (ESIpos): m/z = 382 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.82 (dd, 6H), 1.17 (m, 2H), 1.27 (d, 3H), 1.48 (m, 4H), 1.94 (m, 1H), 2.13 (m, 2H), 3.38 (t, 2H), 4.17 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 7.75 (d, 1H), 8.19 (d, 1H).
130 mg (0.531 mmol)의 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-L-알라닌을 6.5 ml의 디클로로메탄 중에 용해시키고, 58.8 mg (0.511 mmol)의 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온 및 78.4 mg (0.409 mmol)의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 첨가하였다. 또 다른 58.8 mg (0.511 mmol)의 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온 및 78.4 mg (0.409 mmol)의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 첨가하였다. 디클로로메탄을 첨가하고 혼합물을 물로 3회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 172 mg (이론치의 87%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.28분; MS (ESIpos): m/z = 479 (M+H)+.
중간체 L89
1-벤질-5-[2-(트리메틸실릴)에틸]-L-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1)
Figure pct00297
1.00 g (2.96 mmol)의 (4S)-5-(벤질옥시)-4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-5-옥소펜탄산을 처음에 13.0 ml의 THF 중에 충전하고, 510 μl (3.6 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에탄올 및 109 mg (889 μmol)의 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 682 mg (3.56 mmol)의 N-에틸-N'-3-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 유기 상을 0.1 N HCl 용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 2회 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 칼럼: 25 g 스냅, 시클로헥산:에틸 아세테이트 80:20)를 사용하여 정제하였다. 이와 같이 하여 649 mg (이론치의 50%)의 화합물 1-벤질-5-[2-(트리메틸실릴)에틸]-N-(tert-부톡시카르보닐)-L-글루타메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 4.6분; MS (ESIpos): m/z = 438 (M+H)+.
649 mg (1.48 mmol)의 1-벤질-5-[2-(트리메틸실릴)에틸]-N-(tert-부톡시카르보닐)-L-글루타메이트를 빙조 냉각시키면서 7.0 ml의 디옥산 중에 용해시키고, 디옥산 중 14 ml (59 mmol)의 4N HCl을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시키고 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 칼럼 25 g 스냅, 디클로로메탄:메탄올 90:10)에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 320 mg (이론치의 57%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.79분; MS (ESIpos): m/z = 338 (M+H)+.
중간체 L90
1-({N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-산
Figure pct00298
118 mg (566 μmol)의 N-[(벤질옥시)카르보닐]글리신을 처음에 5.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 200 mg (622 μmol)의 tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트, 130 mg (849 μmol)의 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물 및 130 mg (679 μmol)의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 혼합물을 5% 시트르산 용액 및 포화 탄산수소나트륨 용액으로 2회 추출하였다. 유기 상을 포화 염화나트륨 용액으로 2회 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 274 mg (이론치의 95%)의 tert-부틸 1-({N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.69분; MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)+.
820 μl (11 mmol)의 TFA를 5.0 ml의 디클로로메탄 중 274 mg (535 μmol)의 tert-부틸 1-({N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실}아미노)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 262 mg (이론치의 100%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.12분; MS (ESIpos): m/z = 457 (M+H)+.
중간체 L91
트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸 1-{[3-아미노-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닐]아미노}-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 (1:1)
Figure pct00299
표제 화합물을 상업적으로 입수가능한 3-옥소-1-페닐-2,7,10,13,16-펜타옥사-4-아자노나데칸-19-산으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법 (EDCI/DMAP를 사용한 2-트리메틸실릴에탄올에 의한 에스테르화, Z 보호기의 가수소분해적 제거, 상업적으로 입수가능한 N-(tert-부톡시카르보닐)-3-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-D-알라닌에 대한 커플링 및 Fmoc 보호기의 제거)에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.74분; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+.
중간체 L92
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00300
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-L-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트와 HATU 커플링시키고 후속적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.5분; MS (ESIpos): m/z = 409 (M+H)+.
중간체 L93
N-아세틸-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00301
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-L-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트와 HATU 커플링시키고, 후속적으로 Z 보호기를 DCM/메탄올 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 탈보호시키고, 이어서 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중 아세트산으로 아세틸화시키고 최종적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.16분; MS (ESIpos): m/z = 317 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.19 (2d, 6H), 1.82 (s, 3H), 2.5 (m, 2H), 4.26 (m, 2H), 4.48 (q, 1H), 6.9 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 8.0 (m, 3H), 12.54 (s, 1H).
중간체 L94
N-{4-옥소-4-[2-(트리메틸실릴)에톡시]부타노일}-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00302
먼저, 4-옥소-4-[2-(트리메틸실릴)에톡시]부탄산을 EDCI/DMAP의 존재 하에 DCM 중에서 4-(벤질옥시)-4-옥소부탄산을 2-(트리메틸실릴)에탄올과 반응시키고 후속적으로 벤질 에스테르를 가수소분해적 절단시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 217 (M-H)-.
또한, 트리플루오로아세트산 / 4-니트로벤질-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라기네이트 (1:1)를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐-L-알라닌을 4-니트로벤질 L-아스파라기네이트 히드로브로마이드 (1:1)와 커플링시킨 다음, 아미노 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.43분; MS (ESIpos): m/z = 410 (M+H)+.
이어서, 표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 이들 2종의 중간체를 커플링시킨 다음, p-니트로벤질 에스테르를 DCM-메탄올 1:9 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.79분; MS (ESIpos): m/z = 475 (M+H)+.
중간체 L95
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발릴-L-알라닌
Figure pct00303
이 중간체를 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발린 및 tert-부틸 L-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1)로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 323.16 (M+H)+.
중간체 L96
N-아세틸-L-발릴-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
Figure pct00304
이 중간체를 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발리네이트와 N5-카르바모일-L-오르니틴의 커플링으로 개시하고, 이어서 Z 보호기를 에탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 절단시키고 최종적으로 수득된 디펩티드를 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온과 반응시켜 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.25분; MS (ESIpos): m/z = 317 (M+H)+.
중간체 L97
1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27-옥타옥사-3-아자트리아콘탄-30-산
Figure pct00305
tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-오에이트 (100 mg, 201 μmol)를 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산 (46.8 mg, 301 μmol), 1-히드록시-1H-벤조트리아졸 수화물 (76.9 mg, 502 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (77.0 mg, 402 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 유기 상을 5% 시트르산 용액, 및 포화 탄산수소나트륨 용액에 이어서 포화 염화나트륨 용액으로 2회 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 19.1 mg (이론치의 13%)의 tert-부틸 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27-옥타옥사-3-아자트리아콘탄-30-오에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 635 [M+H]+
1.0 ml의 DCM 중 tert-부틸 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27-옥타옥사-3-아자트리아콘탄-30-오에이트 (19.1 mg, 30.1 μmol)의 용액에 TFA (62 μl, 600 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 물에 녹이고 동결건조시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 추가로 사용하였다. 이와 같이 하여 10.8 mg (이론치의 46%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.55분; MS (ESIneg): m/z = 577 [M-H]-.
중간체 L98
2,2-디메틸프로판산 / 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(2-아미노에틸)-N2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-글루타미네이트 (1:1)
Figure pct00306
먼저, (4S)-5-tert-부톡시-4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-5-옥소펜탄산을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트와 커플링시켰다. 후속적으로, DCM 중 트리플루오로아세트산에 의해, Boc 보호기 및 tert-부틸 에스테르를 분리시켰다. 이어서, 먼저 아미노 기를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 DMF/물 중 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온과의 반응에 의해 재보호시킨 다음, 카르복실 기를 EDCI/DMAP의 존재 하의 DCM 중 2-(트리메틸실릴)에탄올과의 반응에 의해 재보호시켰다. 최종 단계에서, 말단 아미노 기를 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 압력 하의 가수소분해에 의해 탈보호시켰다. 여과에 의해 촉매를 제거한 후, 농축시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제하고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결-건조시키고, 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.82분; MS (ESIpos): m/z = 434 (M+H)+.
중간체 L99
트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닐-베타-알라닐-L-리시네이트 (1:1)
Figure pct00307
먼저, 2-(트리메틸실릴)에틸 N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리시네이트를 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 제조하였다. 이어서, 이 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 표준 방법에 의해 제조된 트리펩티드 단위 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발릴-L-알라닐-베타-알라닌과 커플링시켰다. 이어서, Z 보호기를 메탄올 중의 가수소분해에 의해 제거하고 수득된 중간체를 HATU 및 N,N 디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산에 커플링시켰다. 최종 단계에서, 측쇄 아미노 기를 온화한 조건 하에 DMF 중 10% 트리플루오로아세트산 중에서 실온에서 1시간 동안 교반함으로써 탈보호시켰다. 농축시키고 아세토니트릴/물로부터 동결-건조시킨 후, 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.64분; MS (ESIpos): m/z = 625 (M+H)+
중간체 L100
3-[5-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]프로판산
Figure pct00308
120 ml의 에탄올 중 메틸 3-시아노프로파노에이트 (4 g, 35.4 mmol)의 용액에 3.69 g (53 mmol)의 히드록실아민 히드로클로라이드 및 15 ml (110 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시킨 다음, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 5 g (이론치의 97%)의 메틸 (4Z)-4-아미노-4-(히드록시이미노)부타노에이트를 수득하였다.
120.0 ml의 디옥산 중 메틸 (4Z)-4-아미노-4-(히드록시이미노)부타노에이트 (4.85 g, 33.19 mmol)의 용액에 6.91 g (36.50 mmol)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-베타-알라닌 및 8.22 g (39.82 mmol)의 1,3-디시클로헥실카르보디이미드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 잔류물을 물 중에 용해시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 6.0 g (이론치의 57%)의 메틸 (4E)-4-{[N-(tert-부톡시카르보닐)-베타-알라닐]아미노}-4-(히드록시이미노)부타노에이트를 수득하였다.
100 ml의 DMF 중 메틸 (4E)-4-{[N-(tert-부톡시카르보닐)-베타-알라닐]아미노}-4-(히드록시이미노)부타노에이트 (6.0 g, 18.9 mmol)의 용액을 120℃에서 5시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 4 g (이론치의 71%)의 메틸 3-(5-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에틸}-1,2,4-옥사디아졸-3-일)프로파노에이트를 수득하였다.
60 ml의 THF 중 메틸 (4E)-4-{[N-(tert-부톡시카르보닐)-베타-알라닐]아미노}-4-(히드록시이미노)부타노에이트 (4.00 g, 13.4 mmol)의 용액에 10 ml의 물 중 LiOH (1.60 g, 66.8 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. 물을 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 3.60 g (이론치의 87%)의 3-(5-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에틸}-1,2,4-옥사디아졸-3-일)프로판산을 수득하였다.
30 ml의 디클로로메탄 중 3-(5-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에틸}-1,2,4-옥사디아졸-3-일)프로판산 (2.0 g, 7.01 mmol)의 용액에 2.0 ml (26 mmol)의 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물과 혼합하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다. 이와 같이 하여 1.50 g (이론치의 72%)의 3-[5-(2-아미노에틸)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]프로판산/트리플루오로아세트산 (1:1)을 수득하였다.
25 ml의 DMF 중 3-[5-(2-아미노에틸)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]프로판산 (1.5 g, 5.01 mmol)의 용액에 1.30 g (5.52 mmol)의 1-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸]-1H-피롤-2,5-디온 및 1.52 g (15.04 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물과 혼합하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 774 mg (이론치의 47%)의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.67 (t, 2H), 2.91 (t, 2H), 3.03 (t, 2H), 3.46 (q, 2H), 4.28 (s, 2H), 7.01 (s, 2H), 8.37 (t, 1H), 12.28 (bs, 1H).
중간체 L101
tert-부틸 L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라기네이트
Figure pct00309
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-L-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트 히드로클로라이드와 HATU 커플링시키고, 이어서 Z 보호기를 메탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 7): Rt = 0.23분; MS (ESIneg): m/z = 329 (M-H)-.
중간체 L102
N-(38-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-일)-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00310
215 mg의 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-산 (365 μmol) 및 133 mg의 중간체 L101 (402 μmol)을 처음에 1.4 ml의 DMF 중에 충전하고, 146 mg의 HATU (384 μmol) 및 160 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 (910 μmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 물 (1.5 ml) 및 ACN (0.5 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 1:9 → 3:2)에 의해 정제하고 후속적으로 부톡시카르보닐 보호기를 2 ml의 DCM 중 2 ml의 TFA로 분리시켰다 (실온에서 3시간 동안 교반함).
LC-MS (방법 1): Rt = 0.56분; MS (ESIneg): m/z = 844.5 (M+H)+.
중간체 L103
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00311
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 4-피리딘아세트산과 상업적으로 입수가능한 tert-부틸 L-알라닐-L-알라니네이트의 커플링으로 개시하고, 이어서 트리플루오로아세트산으로 탈보호시키고, tert-부틸 L-아스파라기네이트에 커플링시키고 후속적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.15분; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
중간체 L104
N-이소니코티노일-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00312
표제 화합물을 이소니코틴산과 상업적으로 입수가능한 tert-부틸 L-알라닐-L-알라니네이트의 커플링으로 개시하여 중간체 L103과 유사하게 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.17분; MS (ESIpos): m/z = 380 (M+H)+.
중간체 L105
tert-부틸 N-{[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세틸}-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라기네이트 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00313
표제 화합물을 [2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세트산과 상업적으로 입수가능한 tert-부틸 L-알라닐-L-알라니네이트의 커플링으로 개시하여 중간체 L103과 유사하게 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.17분; MS (ESIpos): m/z = 380 (M+H)+.
중간체 L106
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-L-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00314
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-L-알라닌을 1-tert-부틸 4-[2-(트리메틸실릴)에틸]-L-아스파르테이트와 커플링시킴으로써 제조하였다. 이 아미노산 단위를 (3S)-4-tert-부톡시-3-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-4-옥소부탄산으로부터 EDCI 및 DMAP의 존재 하에 2-(트리메틸실릴)에탄올로 에스테르화시키고 후속적으로 tert-부톡시카르보닐 보호기를 DCM 중 5% 트리플루오로아세트산에 의해 완만하게 제거함으로써 제조하였다. 후속적으로, 745 mg (1.317 mmol)의 완전히 보호된 중간체를 43.5 ml의 DCM 중에 용해시키고 3.5 ml의 트리플루오로아세트산을 첨가하고 실온에서 5시간 동안 교반시킴으로써 tert-부틸 에스테르를 완만하게 가수분해시켰다. 168 mg (이론치의 25%)의 표제 화합물을 정제용 HPLC에 의해 정제한 후 생성된 생성물 혼합물로부터 단리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.95분; MS (ESIpos): m/z = 510 (M+H)+.
중간체 L107
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00315
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 HATU 커플링시키고, 후속적으로 Z 보호기를 메탄올 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 탈보호시키고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온으로 아실화시키고 최종적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산에 의해 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.18분; MS (ESIpos): m/z = 412 (M+H)+.
중간체 L108
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00316
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 HATU 커플링시키고 후속적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 실시예 L92와 유사하게 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 409 (M+H)+.
중간체 L109
N-이소니코티노일-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00317
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 HATU 커플링시키고, 후속적으로 Z 보호기를 가수소분해적 분리시키고, HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 이소니코틴산에 커플링시키고, 최종적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 13): Rt = 0.54분; MS (ESIpos): m/z = 380 (M+H)+.
중간체 L110
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00318
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 HATU 커플링시키고, 후속적으로 Z 보호기를 가수소분해적 분리시키고, HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 피리딘-4-일아세트산 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시키고, 최종적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 13): Rt = 0.5분; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
중간체 L111
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00319
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 HATU 커플링시키고, 후속적으로 카르복실 기를 트리플루오로아세트산으로 탈보호시키고, 이어서 Z 보호기를 가수소분해적 분리시키고, 최종적으로 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온에 커플링시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.17분; MS (ESIpos): m/z = 317 (M+H)+.
중간체 L112
트리플루오로아세트산 N-(2-아미노에틸)-N2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리신아미드 (1:1)
Figure pct00320
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 글리신을 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온과 반응시키고, 후속적으로 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 히드로클로라이드 (1:1)에 HATU 커플링시키고 최종적으로 Z 기를 가수소분해적 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.46분; MS (ESIpos): m/z = 262 (M+H)+.
중간체 L113
(5S,8R,11S)-5,8-디메틸-3,6,9-트리옥소-11-{2-옥소-2-[2-(트리메틸실릴)에톡시]에틸}-1-페닐-2-옥사-4,7,10-트리아자도데칸-12-산
Figure pct00321
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 1-tert-부틸-4-[2-(트리메틸실릴)에틸]-L-아스파르테이트에 HATU 커플링시키고 후속적으로 DCM 중 7.5% 트리플루오로아세트산 중에서 교반함으로써 tert-부틸 에스테르를 완만한게 분리시킴으로써 제조하였다. 표제 화합물을 정제용 HPLC에 의해 수득된 생성물 혼합물로부터 단리시켰다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.77분; MS (ESI neg): m/z = 508 (M-H)-.
중간체 L114
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌
Figure pct00322
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-카르보벤질옥시-L-알라닌을 D-알라닌 tert-부틸 에스테르 히드로클로라이드에 HATU 커플링시키고, 최종적으로 부톡시카르보닐 보호기를 TFA 및 DCM으로 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.61분; MS (ESIpos): m/z = 295 (M+H)+.
중간체 L115
tert-부틸 L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라기네이트
Figure pct00323
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸-L-아스파라기네이트 히드로클로라이드를 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌 (중간체 L114)에 HATU 커플링시키고, 최종적으로 Z 보호기를 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 3): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 331 (M+H)+.
중간체 L116
N-(38-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-일)-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00324
500 mg의 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-산 (849 μmol) 및 309 mg의 tert-부틸 L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라기네이트 (중간체 L115, 934 μmol)를 처음에 5.8 ml의 DMF 중에 충전하고, 420 mg의 HATU (1.104 mmol) 및 518 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 (2.97 mmol)을 첨가하고 혼합물을 0℃에서 40분 동안 교반하였다. 물 (1 ml) 및 ACN (2 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 1:9 → 3:2)에 의해 정제하고 후속적으로 부톡시카르보닐 보호기를 3 ml의 DCM 중 3 ml의 TFA로 분리시켰다 (실온에서 3시간 동안 교반함).
LC-MS (방법 1): Rt = 0.56분; MS (ESIneg): m/z = 843 (M-H)-.
중간체 L117
tert-부틸 L-알라닐-D-알라니네이트
Figure pct00325
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-카르보벤질옥시-L-알라닌을 D-알라닌 tert-부틸 에스테르 히드로클로라이드에 HATU 커플링시키고, 최종적으로 Z 보호기를 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 7): Rt = 0.29분; MS (ESIpos): m/z = 217 (M+H)+.
중간체 L118
N-(38-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-일)-L-알라닐-D-알라닌
Figure pct00326
223 mg의 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-산 (379 μmol) 및 90.4 mg의 tert-부틸 L-알라닐-D-알라니네이트 (중간체 L117, 417 μmol)를 처음에 1.2 ml의 DMF 중에 충전하고, 144 mg의 HATU (379 mmol) 및 198 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.14 mmol)을 첨가하고 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 물 (1 ml) 및 ACN (2 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 1:9 → 3:2)에 의해 정제하고 후속적으로 부톡시카르보닐 보호기를 1.5 ml의 DCM 중 1.5 ml의 TFA로 분리시켰다 (실온에서 90분 동안 교반함).
LC-MS (방법 1): Rt = 0.59분; MS (ESIneg): m/z = 729 (M-H)-.
중간체 L119
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-프롤릴-L-알파-아스파라긴 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00327
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 tert-부틸 D-프롤리네이트에 대한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닌의 HATU 커플링으로 시작하고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 합성하였다. 이어서 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 커플링시킨 다음, Z 보호기를 DCM/메탄올 1:1 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 표준 수소 압력 하에 가수소분해적 분리시켰다. 최종적으로, 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 4-피리딘아세트산에 커플링시키고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.16분; MS (ESIpos): m/z = 420 (M+H)+.
중간체 L120
트리플루오로아세트산 / N-(피리딘-4-일아세틸)-D-알라닐-D-알라닐-L-아스파르트아미드 (1:1)
Figure pct00328
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 tert-부틸 D-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1)에 대한 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닌의 HATU 커플링으로 시작하고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 합성하였다. 이어서 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 커플링시킨 다음, Z 보호기를 DCM/메탄올 1:1 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 표준 수소 압력 하에 가수소분해적 분리시켰다. 최종적으로, 수득된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 4-피리딘아세트산에 커플링시키고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.16분; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+.
중간체 L126
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-노르발릴-L-아스파라긴 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00329
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 tert-부틸 L-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1)에 대한 피리딘-4-일아세트산 히드로클로라이드의 HATU 커플링으로 시작하고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 합성하였다. 이어서 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 4-메틸벤젠술폰산-벤질-D-노르발리네이트에 커플링시킨 다음, 벤질 보호기를 THF/물 중 수산화리튬 1수화물로 실온에서 표준 수소 압력 하에 분리시켰다. 최종적으로, 수득된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸 L-아스파라기네이트에 커플링시키고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.18분; MS (ESIpos): m/z = 422 [M+H]+.
중간체 L127
트리플루오로아세트산 디벤질-베타-알라닐-L-글루타메이트 염
Figure pct00330
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 4-메틸벤젠술폰산 / 디벤질-L-글루타메이트 (1:1)를 N-(tert-부톡시카르보닐)-베타-알라닌에 커플링시키고 후속적으로 t-부틸 보호기를 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.72분; MS (ESIpos): m/z = 399 [M+H]+
중간체 L128
2-(트리메틸실릴)에틸 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-시스테이네이트
Figure pct00331
N,N'-비스(tert-부톡시카르보닐)-L-시스틴 (7.00 g, 15.9 mmol)을 80 ml의 아세토니트릴 중에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, 피리딘 (2.6 ml, 32 mmol), 2-(트리메틸실릴)에탄올 (2.5 ml, 17 mmol) 및 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (3.61 g, 17.5 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 필터케이크를 아세토니트릴로 세척하였다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 에틸 아세테이트/시클로헥산 1:2)를 사용하여 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.14 g (이론치의 41%)의 화합물 비스[2-(트리메틸실릴)에틸]-N,N'-비스(tert-부톡시카르보닐)-L-시스티네이트를 수득하였다.
아르곤 하에, 비스[2-(트리메틸실릴)에틸]-N,N'-비스(tert-부톡시카르보닐)-L-시스티네이트 (300 mg, 468 μmol)를 처음에 1.0 ml의 물 및 3.0 ml의 DMF 중에 충전하였다. 반응 혼합물을 TCEP (335 mg, 1.17 mmol)와 혼합하고 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물 및 포화 염화나트륨 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 농축시켰다. 잔류물을 바이오타지/이솔레라 (스냅 25 g) 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 시클로헥산/에틸 아세테이트 9:1을 사용하여 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 106 mg (이론치의 70%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.28분; MS (ESIneg): m/z = 320 [M-H]-
중간체 L129
N-{[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세틸}-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00332
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닌을 tert-부틸 L-아스파라기네이트 히드로클로라이드에 HATU 커플링시키고, 이어서 Z 보호기를 메탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 분리시킨 다음, [2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세트산에 또 다른 HATU 커플링시키고 후속적으로 tert-부틸 에스테르를 TFA로 절단시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.6분; MS (ESIpos): m/z = 491 (M+H)+.
중간체 L130
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐-D-아스파라기닐-L-아스파라긴
Figure pct00333
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N2-(tert-부톡시카르보닐)-D-아스파라긴을 4-니트로벤질-L-아스파라기네이트 히드로브로마이드 (1:1)에 HATU 커플링시키고, 이어서 Boc 보호기를 TFA로 절단시키고, 후속적으로 tert-부톡시카르보닐-L-알라닌을 마찬가지로 HATU에 의해 커플링시키고, 최종적으로 p-니트로벤질 에스테르를 디클로로메탄/메탄올 1:1 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.38분; MS (ESIpos): m/z = 418 (M+H)+.
중간체 L131
트리플루오로아세트산 / tert-부틸-N-(2-아미노에틸)-N2-(tert-부톡시카르보닐)-D-알파-글루타미네이트 (1:1)
Figure pct00334
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2R)-5-tert-부톡시-2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-5-옥소펜탄산을 벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 히드로클로라이드 (1:1)에 HATU 커플링시키고, 이어서 벤질 에스테르를 에탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.6분; MS (ESIpos): m/z = 346 (M+H)+.
중간체 L132
N2-아세틸-D-아스파라긴
Figure pct00335
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해, 먼저 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-D-아스파라긴을 DCM 중 EDCI/DMAP를 사용하여 (2-트리메틸실릴)에탄올로 에스테르화시키고, 이어서 벤질 에스테르를 DCM/메탄올 1:1 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 분리시킨 다음, N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온과 반응시키고 최종적으로 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 1시간 동안 교반함으로써 Teoc 보호기를 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.15분; MS (ESIneg): m/z = 173 (M-H)-.
중간체 L133
N2-아세틸-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신
Figure pct00336
THF/물/NaHCO3 용액 (15 ml/6 ml/12 ml) 중 N2-아세틸-L-리신 (947 mg, 5.03 mmol)의 용액에 5 ml의 THF 중에 용해된 벤질 카르보노클로리데이트 (944 mg, 5.53 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 물 및 에틸 아세테이트로 희석하였다. 4의 pH를 묽은 HCl로 확립하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 흡인으로 여과하고 농축시켰다. 잔류물 및 동결건조된 수성 상을 정제용 HPLC에 의해 함께 정제하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.65분; MS (ESIpos): m/z = 323 [M+H]+
중간체 L134
N2-아세틸-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리실-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴
Figure pct00337
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 tert-부틸 L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라기네이트 (중간체 L115) (100 mg, 303 μmol)에 대한 N2-아세틸-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 (97.6 mg, 303 μmol) (중간체 L133)의 HATU 커플링으로 시작하고 후속적으로 카르복실 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜 합성하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.58분; MS (ESIpos): m/z = 579 [M+H]+
중간체 L135
N2-아세틸-N-(2-아미노에틸)-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신아미드
Figure pct00338
표제 화합물을 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 N2-아세틸-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신을 벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 히드로클로라이드 (1:1)와 HATU 커플링시키고 후속적으로 Z 보호기를 DCM/메탄올 1:1 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.43분; MS (ESIpos): m/z = 331 (M+H)+.
중간체 F239
S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00339
아르곤 하에, 7.5 mg (0.05 mmol)의 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산을 처음에 1.5 ml의 DMF 중에 충전하고, 7.5 mg (0.05 mmol)의 HOBt, 15.5 mg (0.05 mmol)의 TBTU 및 6.2 mg (0.05 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 40.0 mg (0.05 mmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 1.5 ml의 DMF 중에 용해시킨 다음, 18.7 mg (0.14 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 11.2 mg (이론치의 25%)의 화합물 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.37분; MS (ESIpos): m/z = 854 (M+H)+.
10.9 mg (12.8 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-시스테인을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 10.4 mg (76.6 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 22.4 mg (0.08 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 7.5 mg (이론치의 65%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.92분; MS (ESIpos): m/z = 710 (M+H)+.
중간체 F255
R/S-(N-[19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자노나데칸-1-오일]-L-알파-글루타밀-S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸})호모시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00340
13.1 mg (0.04 mmol)의 (2S)-5-(벤질옥시)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-옥소펜탄산을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 5.4 mg (0.04 mmol)의 HOBt, 11.4 mg (0.04 mmol)의 TBTU 및 4.6 mg (0.04 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 30.0 mg (0.04 mmol)의 R/S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)호모시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C11)을 12.9 mg (0.1 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중에 용해시킨 다음, 1 ml의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 32 mg (73%)의 화합물 4-[2-[[(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필]-[3-(2-트리메틸실릴에톡시카르보닐아미노)프로필]아미노]-2-옥소에틸]술파닐-2-[[(2S)-5-벤질옥시-2-(벤질옥시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]부탄산을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.53분; MS (ESIpos): m/z = 1084 (M+H)+.
41.4 mg (0.038 mmol)의 4-[2-[[(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필]-[3-(2-트리메틸실릴에톡시카르보닐아미노)프로필]아미노]-2-옥소에틸]술파닐-2-[[(2S)-5-벤질옥시-2-(벤질옥시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]부탄산을 10 ml의 에탄올 중에 용해시키고, 4.2 mg의 Pd/C를 첨가하고 혼합물을 표준 압력 하에 수소화시켰다. 반응 혼합물을 카드보드 필터를 통해 여과하고 필터케이크를 에탄올로 세척하였다. 용매를 감압 하에 가열 없이 증발시켰다. 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x40; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 21.1 mg (56%)의 화합물 R/S-(L-알파-글루타밀-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일))호모시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.11분; MS (ESIpos): m/z = 860 (M+H)+.
20.4 mg (20.94 μmol)의 R/S-(L-알파-글루타밀-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일))호모시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)을 처음에 11.8 mg (23.04 μmol)의 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-{15-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사펜타데스-1-일}프로판아미드와 함께 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 4.2 mg (41.88 μmol)의 4-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 3.1 mg (0.05 mmol)의 아세트산을 첨가하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 9.5 mg (36%)의 화합물 R/S-(N-[19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자노나데칸-1-오일]-L-알파-글루타밀-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일))호모시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.66분; MS (ESIpos): m/z = 1259 (M+H)+.
9.4 mg (7.47 μmol)의 R/S-(N-[19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자노나데칸-1-오일]-L-알파-글루타밀-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일))호모시스테인을 1.5 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 6.1 mg (44.81 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 13.1 mg (0.05 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 6.9 mg (75%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 1114 (M+H)+.
중간체 F256
트리플루오로아세트산 / N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부틸}-N'-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에틸]숙신아미드 (1:1)
Figure pct00341
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 10 mg (0.014 mmol)의 중간체 C65 및 9.6 mg (0.027 mmol)의 트리플루오로아세트산 / N-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1)를 커플링시키고 후속적으로 중간체 F119에 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 8 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 64%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.84분; MS (ESIpos): m/z = 822 (M+H)+.
중간체 F257
R-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-[18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자옥타데칸-1-오일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00342
50.0 mg (0.06 mmol)의 R-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71) 및 29 mg (0.07 mmol)의 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)아세틸]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (중간체 L74)을 3.0 ml의 DMF 중에 용해시키고, 27.3 mg (0.07 mmol)의 HATU 및 23.3 mg (0.18 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 17.4 mg (26%)의 화합물 R-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자옥타데칸-1-오일]-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 1101 (M+H)+.
17 mg (0.02 mmol)의 R-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자옥타데칸-1-오일]-L-시스테인을 1.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 6.3 mg (0.05 mmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 13.5 mg (0.05 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 7.6 mg (46%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 957 (M+H)+.
중간체 F258
트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-[3-{2-[(브로모아세틸)아미노]에틸}아미노)-3-옥소프로필]부탄아미드 (1:1)
Figure pct00343
표제 화합물을 HATU를 사용하여 중간체 C58을 트리플루오로아세트산 / 벤질 [2-(베타-알라닐아미노)에틸]카르바메이트 (1:1)와 커플링시키고, 후속적으로 가수소분해시키고, 이어서 1-(2-브로모아세톡시)피롤리딘-2,5-디온에 커플링시키고 최종적으로 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 747 및 749(M+H)+.
중간체 F259
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸 프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-{[N-(브로모아세틸)글리실]아미노}-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00344
75 mg (0.114 mmol)의 중간체 C58을 12.5 ml의 DMF에 녹이고 65 mg의 HATU 및 79 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 존재 하에 78 mg (0.171 mmol)의 중간체 L75 (0.11 mmol)에 커플링시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제한 후, 중간체를 20 ml의 에탄올에 녹이고 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안 수소화시켰다. 이어서, 촉매를 여과하고, 용매를 감압 하에 제거하고 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 아세토니트릴/물 1:1로부터 동결건조시켜 63 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 64%)의 2-(트리메틸실릴)에틸 3-아미노-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)부타노일]-D-알라니네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.16분; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+.
이어서, 40 mg (0.047 mmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 HATU의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]글리신과 커플링시킨 다음, 한 번 더 가수소분해적 탈보호시켰다.
이어서, 표제 화합물을 4 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 10 mg (0.012 mmol)의 이 중간체를 7.7 mg (0.032 mmol)의 상업적으로 입수가능한 1-(2-브로모아세톡시)피롤리딘-2,5-디온과 커플링시키고 후속적으로 중간체 F119에 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 1.3 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 777 및 779 (M+H)+.
중간체 F260
N6-(N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐)-N2-{N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닐}-L-리신 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00345
표제 화합물을 중간체 F155와 유사하게 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.81분; MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+.
중간체 F261
트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-(2-{2-[(브로모아세틸)아미노]에톡시}에틸)-부탄아미드 (1:1)
Figure pct00346
표제 화합물을 HATU의 존재 하에 20 mg (0.03 mmol)의 중간체 C58을 25.8 mg (0.061 mmol)의 중간체 L77과 커플링시키고 후속적으로 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다. 이와 같이 하여 11.9 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 47%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.84분; MS (ESIpos): m/z = 722 및 720 (M+H)+.
중간체 F262
S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00347
30 mg (36 μmol)의 S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 처음에 16.9 mg (40 μmol)의 3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-[2-(2-{3-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-3-옥소프로폭시}에톡시)에틸]프로판아미드와 함께 1.5 ml의 DMF 중에 충전하고, 10.9 mg (108 μmol)의 4-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 7.58 mg (0.13 mmol)의 아세트산을 첨가하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 33.4 mg (이론치의 80%)의 화합물 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 1027 (M+H)+.
32.8 mg (32 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}-L-시스테인을 3.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 26.1 mg (192 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 56.0 mg (0.192 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 22.9 mg (이론치의 71%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 883 (M+H)+.
중간체 F263
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-베타-알라닐-S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00348
30.0 mg (0.036 mmol)의 R-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71) 및 9.8 mg (0.04 mmol)의 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-베타-알라닌 (중간체 L78)을 1.0 ml의 DMF 중에 용해시키고, 16.4 mg (0.04 mmol)의 HATU 및 14.0 mg (0.11 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.2 mg (13%)의 화합물 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-베타-알라닐-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 1.31분; MS (ESIpos): m/z = 925 (M+H)+.
11.3 mg (0.011 mmol)의 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-베타-알라닐-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 5.0 mg (0.04 mmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 10.7 mg (0.04 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.4 mg (40%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H)+.
중간체 F264
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라닐-S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00349
30.0 mg (0.036 mmol)의 R-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71) 및 12.2 mg (0.04 mmol)의 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라닌 (중간체 L79)을 1.0 ml의 DMF 중에 용해시키고, 16.4 mg (0.04 mmol)의 HATU 및 14.0 mg (0.11 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 8.9 mg (24%)의 화합물 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라닐-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 1.38분; MS (ESIpos): m/z = 981 (M+H)+.
15.3 mg (0.015 mmol)의 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-베타-알라닐-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 6.3 mg (0.045 mmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 13.5 mg (0.045 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 9.1 mg (62%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.92분; MS (ESIpos): m/z = 837 (M+H)+.
중간체 F265
트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-22-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-6,17-디옥소-10,13-디옥사-3-티아-7,16-디아자도코산-1-아미드 (1:1)
Figure pct00350
30.0 mg (42.7 μmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산 (중간체 C69) 및 25.3 mg (55.6 μmol)의 트리플루오로아세트산 / N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (1:1) (중간체 L82)를 처음에 1.9 ml의 아세토니트릴 중에 충전하고, 60 μl (340 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 에틸 아세테이트 중 33 μl (56 μmol)의 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드 50%를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (2.0 ml)을 첨가하고 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 26.7 mg (이론치의 60%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 [4-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-26-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,10,21-트리옥소-14,17-디옥사-7-티아-4,11,20-트리아자헥사코스-1-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.40분; MS (ESIpos): m/z = 1025 (M+H)+.
25.3 mg (24.7 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [4-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-26-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,10,21-트리옥소-14,17-디옥사-7-티아-4,11,20-트리아자헥사코스-1-일]카르바메이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 20.2 mg (148 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 43.3 mg (148 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 23.4 mg (이론치의 95%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 881 (M+H)+.
중간체 F266
트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,13-디옥소-6,9-디옥사-16-티아-3,12-디아자옥타데칸-18-아미드 (1:1)
Figure pct00351
30.0 mg (0.043 mmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산 (중간체 C69)을 처음에 22.2 mg (0.056 mmol)의 트리플루오로아세트산 / N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1) (중간체 L83)와 함께 1.9 ml의 아세토니트릴 중에 충전하였다. 이어서, 60 μl (0.34 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 33 μl (0.056 mmol)의 T3P (에틸 아세테이트 중 50%)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (2.0 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 20.5 mg (이론치의 49%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 [19-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,13,18-트리옥소-6,9-디옥사-16-티아-3,12,19-트리아자도코산-22-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.38분; MS (ESIpos): m/z = 969 (M+H)+.
19.1 mg (19.7 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [19-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,13,18-트리옥소-6,9-디옥사-16-티아-3,12,19-트리아자도코산-22-일]카르바메이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 16.1 mg (118 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 34.6 mg (118 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 13.9 mg (이론치의 75%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 825 (M+H)+.
중간체 F267
S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]-L-시스테이닐-베타-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00352
아르곤 하에, 13.4 mg (33.3 μmol)의 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-산 (중간체 L74)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 9.3 μl (54.4 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 12.6 mg (33.3 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 25.0 mg (27.7 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테이닐-베타-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 F216의 합성 참조)을 4.7 μl (27.7 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중에 용해시킨 다음, 1.0 ml의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 6.90 mg (이론치의 19%)의 화합물 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]-L-시스테이닐-베타-알라닌을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.44분; MS (ESIpos): m/z = 1172 (M+H)+.
6.70 mg (5.71 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]-L-시스테이닐-베타-알라닌을 1.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 4.67 mg (34.3 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 10 mg (34.3 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.4 mg (이론치의 67%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.85분; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+H)+.
중간체 F268
트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-28-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-6,23-디옥소-10,13,16,19-테트라옥사-3-티아-7,22-디아자옥타코산-1-아미드 (1:1)
Figure pct00353
30.0 mg (0.043 mmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산 (중간체 C69)을 처음에 30.2 mg (0.056 mmol)의 트리플루오로아세트산 / N-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (1:1) (중간체 L84)와 함께 2.0 ml의 아세토니트릴 중에 충전하였다. 이어서, 60 μl (0.34 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 33 μl (0.056 mmol)의 T3P (에틸 아세테이트 중 50%)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (2.0 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 27.9 mg (이론치의 59%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 [4-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-32-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,10,27-트리옥소-14,17,20,23-테트라옥사-7-티아-4,11,26-트리아자도트리아콘트-1-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.41분; MS (ESIpos): m/z = 1114 (M+H)+.
25.6 mg (23.0 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [4-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-32-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,10,27-트리옥소트리옥소-14,17,20,23-테트라옥사-7-티아-4,11,26-트리아자도트리아콘트-1-일]카르바메이트를 2.5 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 18.8 mg (138 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 40.3 mg (138 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 22.2 mg (이론치의 88%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.94분; MS (ESIpos): m/z = 969 (M+H)+.
중간체 F269
4-{[(8R,14R)-13-(3-아미노프로필)-14-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-15,15-디메틸-2,7,12-트리옥소-10-티아-3,6,13-트리아자헥사데칸-8-일]아미노}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00354
17.0 mg (0.0195 mmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-(4-tert-부톡시-4-옥소부타노일)-L-시스테인 (중간체 C77)을 처음에 4.99 mg (0.0253 mmol)의 N-(2-아미노에틸)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (중간체 L1)와 함께 1.0 ml의 아세토니트릴 중에 충전하였다. 이어서, 27 μl (0.16 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 15 μl (0.025 mmol)의 T3P (에틸 아세테이트 중 50%)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 (2.0 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 9.5 mg (이론치의 46%)의 화합물 tert-부틸 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-23-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,2-디메틸-6,12,17,22-테트라옥소-5-옥사-14-티아-7,11,18,21-테트라아자-2-실라트리코산-16-일]아미노}-4-옥소부타노에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.47분; MS (ESIpos): m/z = 1052 (M+H)+.
8.3 mg (7.89 μmol)의 tert-부틸 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-23-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,2-디메틸-6,12,17,22-테트라옥소-5-옥사-14-티아-7,11,18,21-테트라아자-2-실라트리코산-16-일]아미노}-4-옥소부타노에이트를 1.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 6.45 mg (47.3 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 6시간 동안 교반하였다. 6.45 mg (47.3 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 27.7 mg (94.6 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 1.10 mg (이론치의 14%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 852 (M+H)+.
중간체 F270
트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-N'-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)숙신아미드 (1:1)
Figure pct00355
아르곤 하에, 15.0 mg (22.9 μmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라펜타데칸-15-산 (중간체 C78)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 8.0 μl (45.8 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 10.4 mg (27.4 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 8.54 mg (27.4 μmol)의 트리플루오로아세트산 / N-(2-아미노에틸)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1) (중간체 L1)를 4.0 μl (22.9 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중에 용해시킨 다음, 1.0 ml의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 14.7 mg (이론치의 77%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 [3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{4-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-4-옥소부타노일}아미노)프로필]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 1.33분; MS (ESIpos): m/z = 835 (M+H)+.
13.2 mg (15.8 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{4-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-4-옥소부타노일}아미노)프로필]카르바메이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 12.9 mg (94.8 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 27.7 mg (94.6 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 10.9 mg (이론치의 83%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 691 (M+H)+.
중간체 F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-아미노프로필)-26-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-27,27-디메틸-2,19,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,18,25-트리아자옥타코산-20-일]아미노}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00356
아르곤 하에, 19.4 mg (22.2 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-(4-tert-부톡시-4-옥소부타노일)-L-시스테인 (중간체 C77)을 처음에 2.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 21.7 mg (44.4 μmol)의 트리플루오로아세트산 / N-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1) (중간체 L74), 12 μl (67 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 16.9 mg (44.4 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 18.1 mg (이론치의 66%)의 화합물 tert-부틸 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-35-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,2-디메틸-6,12,17,34-테트라옥소-5,21,24,27,30-펜타옥사-14-티아-7,11,18,33-테트라아자-2-실라펜타트리아콘탄-16-일]아미노}-4-옥소부타노에이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 4): Rt = 1.79분; MS (ESIpos): m/z = 1250 (M+Na)+.
18.1 mg (14.7 μmol)의 tert-부틸 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-35-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,2-디메틸-6,12,17,34-테트라옥소-5,21,24,27,30-펜타옥사-14-티아-7,11,18,33-테트라아자-2-실라펜타트리아콘탄-16-일]아미노}-4-옥소부타노에이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 12.0 mg (88.4 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 25.8 mg (88.4 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 12.3 mg (이론치의 73%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+H)+.
중간체 F272
트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-N'-[17-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-16-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자헵타데스-1-일]숙신아미드 (1:1)
Figure pct00357
아르곤 하에, 15.0 mg (22.9 μmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라펜타데칸-15-산 (중간체 C78)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 8.0 μl (45.8 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 10.4 mg (27.4 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 13.4 mg (27.4 μmol)의 트리플루오로아세트산 / N-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1) (중간체 L85)를 4.0 μl (22.9 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중에 용해시킨 다음, 1.0 ml의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 15.8 mg (이론치의 68%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 [23-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,19,22-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3,18,23-트리아자헥사코산-26-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.35분; MS (ESIpos): m/z = 1011 (M+H)+.
15.1 mg (14.9 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [23-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,19,22-트리옥소트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3,18,23-트리아자헥사코산-26-일]카르바메이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 12.2 mg (89.6 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 26.2 mg (89.6 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 10.3 mg (이론치의 70%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 867 (M+H)+.
중간체 F273
트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,19-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,18-디아자테트라코산-24-아미드 (1:1)
Figure pct00358
아르곤 하에, 20.0 mg (28.5 μmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라펜타데칸-17-산 (중간체 C69)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 10.0 μl (57.0 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 13.0 mg (34.2 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 16.7 mg (34.2 μmol)의 트리플루오로아세트산 / N-(14-아미노-3,6,9,12-테트라옥사테트라데스-1-일)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 (1:1) (중간체 L85)를 5.0 μl (28.5 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중에 용해시킨 다음, 1.0 ml의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 18.6 mg (이론치의 62%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 [25-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,19,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,18,25-트리아자옥타코산-28-일]카르바메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.37분; MS (ESIpos): m/z = 1057 (M+H)+.
17.1 mg (16.2 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 [25-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,19,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,18,25-트리아자옥타코산-28-일]카르바메이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 13.2 mg (97.0 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 28.4 mg (97.0 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 9.80 mg (이론치의 59%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 913 (M+H)+.
중간체 F274
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닐-S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00359
13.9 mg (0.0167 mmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 처음에 7.07 mg (0.0217 mmol)의 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닌 (중간체 L86)과 함께 2.0 ml의 아세토니트릴 중에 충전하였다. 이어서, 23 μl (0.13 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고, 13 μl (0.022 mmol)의 T3P (에틸 아세테이트 중 50%)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 3.70 mg (이론치의 19%)의 화합물 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닐-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.34분; MS (ESIpos): m/z = 1024 (M+H)+.
10.6 mg (10.3 μmol)의 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-L-알라닐-S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 8.46 mg (62.1 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 18.1 mg (62.1 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 5.60 mg (이론치의 54%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.69분; MS (ESIpos): m/z = 880 (M+H)+.
중간체 F275
N-[3-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)프로파노일]-N-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)-L-알파-글루타민 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00360
39.0 mg (55.6 μmol)의 11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-산 (중간체 C69)을 처음에 4.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 41.6 mg (111 μmol)의 1-벤질-5-[2-(트리메틸실릴)에틸]-L-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1) (중간체 L89), 29 μl (170 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 42.3 mg (111 μmol)의 HATU를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 아세트산으로 켄칭하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 53.1 mg (이론치의 93%)의 화합물 1-벤질-5-[2-(트리메틸실릴)에틸]-N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-L-글루타메이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.71분; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+
아르곤 하에, 7.60 mg (33.9 μmol)의 아세트산팔라듐 (II)을 처음에 3.0 ml의 디클로로메탄 중에 충전하고, 14 μl (100 μmol)의 트리에틸아민 및 110 μl (680 μmol)의 트리에틸실란을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, 3.0 ml의 디클로로메탄 중에 용해된 69.2 mg (67.7 μmol)의 1-벤질-5-[2-(트리메틸실릴)에틸]-N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-L-글루타메이트를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 카드보드 필터를 통해 여과하고 필터 케이크를 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 38.4 mg (이론치의 61%)의 화합물 (19S)-11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-19-{3-옥소-3-[2-(트리메틸실릴)에톡시]프로필}-5-옥사-14-티아-7,11,18-트리아자-2-실라이코산-20-산을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.53분; MS (ESIpos): m/z = 931 (M+H)+.
10.0 mg (10.7 μmol)의 (19S)-11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-19-{3-옥소-3-[2-(트리메틸실릴)에톡시]프로필}-5-옥사-14-티아-7,11,18-트리아자-2-실라이코산-20-산을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 6.73 mg (21.5 μmol)의 N-(2-아미노에틸)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트아미드 / 2,2,2-트리플루오로에탄-1,1-디올 (1:1) (중간체 L1), 5.6 μl (32 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 8.17 mg (21.5 μmol)의 HATU를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 아세트산으로 켄칭하고 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 6.90 mg (이론치의 58%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 N2-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-N-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)-L-알파-글루타미네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.57분; MS (ESIpos): m/z = 1110 [M+H]+
6.90 mg (6.21 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 N2-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-N-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)-L-알파-글루타미네이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 5.1 mg (37.2 μmol) 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 5.1 mg (37.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 5.1 mg (37.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 10.1 mg (74.4 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하고, 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 54.5 mg (186 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 2.4 mg (이론치의 39%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 866 (M+H)+.
중간체 F276
S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00361
아르곤 하에, 9.08 mg (28.9 μmol)의 3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로판산 (중간체 L87)을 처음에 1.0 ml의 DMF 중에 충전하고, 8.33 μl (48.2 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 11.0 mg (28.9 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 20.0 mg (27.7 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 4.67 μl (24.1 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 중에 용해시킨 다음, 1.0 ml의 DMF를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.70 mg (이론치의 19%)의 화합물 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}-L-시스테인을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 2.47분; MS (ESIpos): m/z = 1013 (M+H)+.
13.9 mg (13.7 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에톡시)에톡시]프로파노일}-L-시스테인을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 5.6 mg (41.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 5.6 mg (41.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 24.1 mg (82.4 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 10.8 mg (이론치의 80%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.58분; MS (ESIpos): m/z = 869 (M+H)+.
중간체 F277
N-[3-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)프로파노일]-3-[(브로모아세틸)아미노]-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (11)
Figure pct00362
8.90 mg (8.88 μmol)의 트리플루오로아세트산 / -2-(트리메틸실릴)에틸 3-아미노-N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-D-알라니네이트 (1:1) (중간체 C80) 및 2.31 mg (9.77 μmol)의 1-(2-브로모아세톡시)피롤리딘-2,5-디온을 1 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 2.9 μl (27 μmol)의 N-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 5.80 mg (이론치의 65%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-3-[(브로모아세틸)아미노]-D-알라니네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.57분; MS (ESIpos): m/z = 1008 (M+H)+.
5.80 mg (5.75 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-3-[(브로모아세틸)아미노]-D-알라니네이트를 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 4.70 mg (34.5 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 4.70 mg (34.5 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 5시간 동안 교반하였다. 20.2 mg (69.0 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 1.70 mg (이론치의 34%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.90분; MS (ESIpos): m/z = 764 (M+H)+.
중간체 F278
N-[3-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)프로파노일]-3-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00363
10.0 mg (9.98 μmol)의 트리플루오로아세트산 / -2-(트리메틸실릴)에틸 3-아미노-N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-D-알라니네이트 (1:1) (중간체 C80) 및 2.77 mg (11.0 μmol)의 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온을 1 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 3.3 μl (30 μmol)의 N-메틸모르폴린을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 2.0 μl (35 μmol)의 아세트산을 반응 혼합물에 첨가하였으며, 이를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 5.50 mg (이론치의 54%)의 화합물 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-3-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}-D-알라니네이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.51분; MS (ESIpos): m/z = 1024 (M+H)+.
5.50 mg (5.36 μmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 N-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12,17-트리옥소-5-옥사-14-티아-7,11-디아자-2-실라헵타데칸-17-일)-3-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}-D-알라니네이트를 1.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 4.39 mg (32.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 4.39 mg (32.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 4.39 mg (32.2 μmol)의 이염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 28.2 mg (96.5 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 2.70 mg (이론치의 56%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H)+.
중간체 F279
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}[({(2R)-2-카르복시-2-[(3-카르복시프로파노일)아미노]에틸}술파닐)아세틸]아미노)프로필]-L-알라닌아미드
Figure pct00364
12.2 mg (14 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-(4-tert-부톡시-4-옥소부타노일)-L-시스테인 (중간체 C77)을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 11.4 mg (83.8 μmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 24.5 mg (83.8 μmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.60 mg (이론치의 42%)의 화합물 4-{[(1R)-2-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)-1-카르복시에틸]아미노}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)+.
10.0 mg (12.7 μmol)의 4-{[(1R)-2-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)-1-카르복시에틸]아미노}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1) 및 7.41 mg (12.7 μmol)의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-L-알라니네이트 (중간체 L88)를 1.5 ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 4.4 μl (25 μmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2.0 μl (35 μmol)의 아세트산을 반응 혼합물에 첨가하였으며, 이를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물/0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 5.20 mg (이론치의 39%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.11분; MS (ESIpos): m/z = 1036 (M+H)+.
중간체 F280
트리플루오로아세트산 / N-[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)벤즈아미드 (1:1)
Figure pct00365
표제 화합물을 중간체 C64로부터 상업적으로 입수가능한 1-(3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카르보닐}페닐)-1H-피롤-2,5-디온에 커플링시키고 후속적으로 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 755 (M+H)+.
중간체 F281
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-{[N-(브로모아세틸)-베타-알라닐]아미노}-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00366
먼저, 변형된 아미노산 단위 N-(브로모아세틸)-베타-알라닌 및 2-(트리메틸실릴)에틸-3-아미노-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라니네이트를 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 제조하였다. 이어서, 이들을 HATU 및 모르폴린의 존재 하에 서로 커플링시켰다. 이어서, tert-부톡시카르보닐 보호기를 디클로로메탄 중 10% 트리플루오로아세트산을 사용하여 제거하여, 2-(트리메틸실릴)에틸 3-{[N-(브로모아세틸)-베타-알라닐]아미노}-D-알라니네이트 중간체를 수득하였다.
최종적으로, 표제 화합물을 HATU 및 4-메틸모르폴린의 존재 하에 이 중간체를 중간체 C58에 커플링시키고, 이어서 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 791 및 793 (M+H)+.
중간체 F282
트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-(3-{[N-(브로모아세틸)글리실]아미노}프로필)-부탄아미드 (1:1)
Figure pct00367
먼저, 중간체 트리플루오로아세트산 / N-(3-아미노프로필)-N2-(브로모아세틸)글리신아미드 (1:1)를 tert-부틸 글리시네이트 및 브로모아세트산 무수물로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 제조하였다.
최종적으로, 표제 화합물을 HATU 및 4-메틸모르폴린의 존재 하에 이 중간체를 중간체 C58에 커플링시키고, 이어서 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 747 및 749 (M+H)+.
중간체 F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)-2-카르복시에틸]-N2-(브로모아세틸)-L-알파-아스파라긴 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00368
먼저, 변형된 아미노산 단위 (2S)-2-[(브로모아세틸)아미노]-4-옥소-4-[2-(트리메틸실릴)에톡시]부탄산을 (2S)-2-아미노-4-옥소-4-[2-(트리메틸실릴)에톡시]부탄산 및 브로모아세트산 무수물로부터 제조하고, 아미노산 단위 2-(트리메틸실릴)에틸-3-아미노-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라니네이트를 상업적으로 입수가능한 3-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닌 / N-시클로헥실시클로헥산아민 (1:1)으로부터 제조하였다. 2개의 단위를 HATU 및 모르폴린의 존재 하에 서로 커플링시킨 다음, tert-부톡시카르보닐 보호기를 디클로로메탄 중 5% 트리플루오로아세트산을 사용하여 제거하여, 실릴에틸 에스테르 보호기를 수득하고 따라서 트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸-N-{(2R)-2-아미노-3-옥소-3-[2-(트리메틸실릴)에톡시]프로필}-N2-(브로모아세틸)-L-알파-아스파라기네이트 (1:1) 중간체를 수득하였다.
최종적으로, 표제 화합물을 HATU 및 4-메틸모르폴린의 존재 하에 이 중간체를 중간체 C58에 커플링시키고, 이어서 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.84분; MS (ESIpos): m/z = 835 및 837 (M+H)+.
중간체 F284
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-{[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]아미노}-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00369
먼저, 중간체 L80을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산에 커플링시킨 다음, tert-부톡시카르보닐 보호기를 디클로로메탄 중 16% 트리플루오로아세트산을 사용하여 제거하여, 실릴에틸 에스테르 보호기를 제거하였다.
최종적으로, 표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 이 중간체를 중간체 C58에 커플링시키고, 이어서 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.46분; MS (ESIpos): m/z = 984.45 (M+H)+.
중간체 F285
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-[(18-브로모-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자옥타데칸-1-오일)아미노]-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00370
먼저, 중간체 L80을 상업적으로 입수가능한 브로모아세트산 무수물로 아실화시킨 다음, tert-부톡시카르보닐 보호기를 디클로로메탄 중 20% 트리플루오로아세트산을 사용하여 제거하여, 실릴에틸 에스테르 보호기를 수득하였다.
최종적으로, 표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 이 중간체를 중간체 C58에 커플링시키고, 이어서 염화아연으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.85분; MS (ESIpos): m/z = 967 및 969 (M+H)+.
중간체 F286
1-[(N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}-D-알라닐)아미노]-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00371
먼저, 중간체 L91를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산에 커플링시킨 다음, Boc 보호기를 DCM 중 12.5% TFA로 제거하였다. 생성된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C58에 커플링시키킨 다음, 염화아연으로 탈보호시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.84분; MS (ESIpos): m/z = 984 (M+H)+.
중간체 F288
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-({N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-세릴}아미노)-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00372
35 mg (39 μmol)의 중간체 C74를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, tert-부틸 O-tert-부틸-L-세리네이트 및 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산으로부터 미리 제조된 N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-세린과 커플링시켰다. 염화아연으로 탈보호시키고 HPLC에 의해 정제하여 14 mg (이론치의 38%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.43분; MS (ESIpos): m/z = 824.34 (M+H)+.
중간체 F289
N2-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-N6-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-D-리신 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00373
먼저, 트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸-N6-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-D-리시네이트 (1:1)를 N6-[(벤질옥시)카르보닐]-N2-(tert-부톡시카르보닐)-D-리신으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 제조하였다.
이어서, 12.5 mg (25 μmol)의 이 중간체를 HATU 및 4-메틸모르폴린의 존재 하에 15 mg (23 μmol)의 중간체 C58과 커플링시켰다. 염화아연으로 탈보호시키고 HPLC에 의해 정제하여 14 mg (이론치의 53%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 779 (M+H)+.
중간체 F290
N2-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-N6-(브로모아세틸)-D-리신 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00374
먼저, 트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸-N6-(브로모아세틸)-D-리시네이트 (1:1)를 N6-[(벤질옥시)카르보닐]-N2-(tert-부톡시카르보닐)-D-리신으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해 제조하였다.
이어서, 12 mg (25 μmol)의 이 중간체를 HATU 및 4-메틸모르폴린의 존재 하에 15 mg (23 μmol)의 중간체 C58과 커플링시켰다. 염화아연으로 탈보호시키고 HPLC에 의해 정제하여 7 mg (이론치의 36%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 762 및 764 (M+H)+.
중간체 F291
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-N-{3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]프로필}-L-알라닌아미드
Figure pct00375
표제 화합물을 실시예 M9로부터 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-발릴-L-알라닌에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Z 보호기를 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안 수소화시킴으로써 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산에 커플링시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.21분; MS (ESIpos): m/z = 777 (M+H)+.
중간체 F293
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-3-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)벤조일]아미노}-D-알라닌 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00376
35 mg (39 μmol)의 중간체 C74를 4 ml의 DMF 중에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, 13.5 mg의 (43 μmol)의 상업적으로 입수가능한 1-(3-{[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]카르보닐}페닐)-1H-피롤-2,5-디온에 커플링시켰다. 염화아연으로 탈보호시키고 HPLC에 의해 정제하여 12 mg (이론치의 34%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 0.93분; MS (ESIpos): m/z = 799 (M+H)+.
중간체 F294
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-발릴-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-카르복시프로필}-L-알라닌아미드
Figure pct00377
12 ml의 메탄올 중에 용해된 41 mg (0.05 mmol)의 중간체 C76를 10 mg의 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 1시간 동안 수소 표준 압력 하에 수소화시켰다. 이어서, 촉매를 여과하고 용매를 감압 하에 제거하였다. 이와 같이 하여 32 mg (이론치의 92%)의 탈보호된 중간체를 수득하였다.
15 mg (0.022 mmol)의 이 중간체를 DMF 중에 용해시키고, 13 mg (0.039 mmol)의 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온 및 7 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시키고 잔류물을 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 9 mg (이론치의 45%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.08분; MS (ESIpos): m/z = 895 (M+H)+.
중간체 F295
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-발릴-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-카르복시프로필}-L-알라닌아미드
Figure pct00378
12 ml의 메탄올 중에 용해된 41 mg (0.05 mmol)의 중간체 C76을 10 mg의 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 1시간 동안 수소 표준 압력 하에 수소화시켰다. 이어서, 촉매를 여과하고 용매를 감압 하에 제거하였다. 이와 같이 하여 32 mg (이론치의 92%)의 탈보호된 중간체를 수득하였다.
15 mg (0.022 mmol)의 이 중간체를 4 ml의 DMF 중에 용해시키고, 10 mg (0.039 mmol)의 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온 및 7 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시키고 잔류물을 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 10 mg (이론치의 56%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.08분; MS (ESIpos): m/z = 821 (M+H)+.
중간체 F296
트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-{2-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)술포닐]에틸}부탄아미드 (1:1)
Figure pct00379
표제 화합물을 중간체 L81로부터 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C58에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Z 보호기를 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 30분 동안의 수소화에 의해 제거하였다. 이어서, 탈보호된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세트산에 커플링시키고 최종적으로 염화아연으로 탈보호시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 785 (M+H)+.
중간체 F297
S-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(피롤리딘-3-일메틸)아미노]-2-옥소에틸}-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (이성질체 1)
Figure pct00380
아르곤 하에, 15 mg (0.11 mmol)의 염화아연을 0.74 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 36 mg (0.03 mmol, 68% 순도)의 S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 (중간체 C92)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 7시간 동안 교반하였다. 이어서, 32 mg (0.11 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 6.4 mg (이론치의 25%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.95분; MS (ESIpos): m/z = 792 (M+H-CF3CO2H)+.
중간체 F298
S-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(피롤리딘-3-일메틸)아미노]-2-옥소에틸}-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (이성질체 2)
Figure pct00381
아르곤 하에, 19 mg (0.14 mmol)의 염화아연을 0.94 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 45 mg (0.04 mmol, 71% 순도)의 S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 (중간체 C91)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 42 mg (0.14 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 5.7 mg (이론치의 18%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.96분; MS (ESIpos): m/z = 791 (M+H-CF3CO2H)+.
중간체 F299
S-(2-{(3-아미노프로필)[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]아미노}-2-옥소에틸)-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00382
1.88 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 88.0 mg (0.09 mmol)의 S-{11-[(R)-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일](시클로헥실)메틸]-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일}-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 (중간체 C84)의 용액에 76.8 mg (0.57 mmol)의 염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 164.6 mg (0.57 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 31 mg (이론치의 35%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.82분; MS (ESIpos): m/z = 792 (M+H)+.
중간체 F300
(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에틸)부탄아미드
Figure pct00383
아르곤 하에 0.2 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 7 mg (0.08 mmol)의 2-(트리메틸실릴)에틸 {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로파노일]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}카르바메이트 (중간체 C100)의 용액에 11 mg (0.08 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 8시간 동안 교반하였다. 이어서, 14 mg (0.05 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 1.6 mg (이론치의 27%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H-CF3CO2H)+.
중간체 F302
S-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(피롤리딘-3-일메틸)아미노]-2-옥소에틸}-N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-시스테인 트리플루오로아세테이트 (1:1) (이성질체 1)
Figure pct00384
아르곤 하에 1.4 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 56.9 mg (58.2 mmol, 85% 순도)의 S-[2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(1-(tert-부톡시카르보닐)피롤리딘-3-일]메틸}아미노)-2-옥소에틸]-N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-시스테인 (중간체 C94)의 혼합물에 31.7 mg (0.23 mmol)의 염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 68.0 mg (0.23 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 7 mg (이론치의 13%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 736 (M+H-CF3CO2H)+.
중간체 F305
N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-22-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-6,17-디옥소-N-(피롤리딘-3-일메틸)-10,13-디옥사-3-티아-7,16-디아자도코산-1-아미드 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (이성질체 2)
Figure pct00385
0.65 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 24.80 mg (0.02 mmol)의 tert-부틸 3-[2-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-24-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,8,19-트리옥소-12,15-디옥사-5-티아-2,9,18-트리아자테트라코스-1-일]피롤리딘-1-카르복실레이트 (중간체 C99)의 용액에 13.42 mg (0.10 mmol)의 염화아연을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 8시간 동안 교반하였다. 이어서, 28.78 mg (0.10 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고 유기 상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 반복해서 세척하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 10 mg (이론치의 44%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 3.11분; MS (ESIpos): m/z = 907 (M+H-CF3CO2H)+.
중간체 F306
S-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(3-{[N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-아스파라기닐]아미노}프로필)아미노]-2-옥소에틸}-N-[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]-L-시스테인
Figure pct00386
실온에서 0.22 ml의 DMF 중 22 mg의 중간체 F257 (0.02 mmol)의 용액에 10.7 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.062 mmol) 및 10 mg의 N-알파-Boc-L-아스파라긴 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 물 (2 ml) 및 ACN (4 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 1:9 → 3:2)에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 21 mg (이론치의 87%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.07분; MS (ESIpos): m/z = 1171 (M+H)+.
중간체 F307
S-[2-([3-(L-아스파라기닐아미노)프로필]{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)-2-옥소에틸]-N-[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00387
1.5 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중 21 mg의 중간체 F306 (0.017 mmol)의 용액에 24.3 mg (0.178 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 60분 동안 교반하였다. 이어서, 52.1 mg (0.178 mmol)의 EDTA를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 물 (2 ml) 및 ACN (4 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 여과하고 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 1:9 → 3:2)에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 18 mg (이론치의 85%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 1071 (M+H)+.
APDC 또는 ADC 전구체 (중간체 시리즈 Q)의 합성에 대한 일반적 방법
APDC 전구체:
F 시리즈의 상기 기재된 중간체 (F1-F305) 또는 임의로 보호된 전구체는 임의로 최종 탈보호 이후에도 반응식 1에 따라 APDC 전구체 Q로 전환될 수 있다. 레구마인-절단가능한 머리기의 N-말단 아미노 기의 방출 및 다양한 구조의 치환기 Z1을 갖는 APDC 전구체 분자의 후속 변형 (반응식 1) 후, APDC의 특성의 프로파일의 개선이 또한 달성될 수 있다. 항체에 대한 APDC 전구체 분자의 부착을 위한 단백질-반응성 기는 위치 R1, R2 또는 R3에 존재할 수 있다.
예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
0.037 mmol의 중간체 F1-Fx를 1-20 ml, 바람직하게는 5-10 ml의 적합한 용매, 예를 들어 DMF, DMSO, DCM, 클로로포름, 톨루엔, THF, 메탄올 또는 그의 혼합물에 녹이고, 0.039 mmol의 N-말단 변형된 트리펩티드 유도체, 예를 들어 중간체 L92를 첨가하고, 0.041 mmol의 표준 커플링 시약, 예를 들어 HATU, EDCI/HOBT, BEP 등, 및 0.11 mmol의 표준 염기, 예를 들어 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 4-메틸모르폴린 등을 첨가한다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, 혼합물을 2 방울의 트리플루오로아세트산을 사용하여 산성화시키고 농축시킨다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제한다. 적절한 분획을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시킨다.
부착된 트리펩티드 유도체의 상기 N-말단 변형이 보호기인 경우에, 이는 후속적으로 공지된 방법에 의해 분리될 수 있고, 예를 들어 Z 보호기는 바람직하게는 가수소분해에 의해, Boc 보호기는 산 가수분해 또는 염화아연에 의해, Fmoc 보호기는 염기 가수분해에 의해 또는 Teoc 기는 플루오라이드 또는 염화아연에 의해 분리될 수 있다.
최종적으로, 따라서 방출된 아미노 기는 특성의 프로파일을 개선시키기 위해, 예를 들어 아민-반응성 기 예컨대 활성 에스테르, 산 클로라이드, 이소시아네이트 등으로, 또는 표준 커플링 시약, 예를 들어 HATU, EDCI/HOBT, BEP 등, 및 표준 염기, 예를 들어 N,N-디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 4-메틸모르폴린 등의 존재 하의 카르복실산 유도체에 대한 커플링에 의해 아실화 또는 알킬화될 수 있다. 분자 내의 추가의 보호기가 여전히 존재하는 경우에, 이들은 최종 단계에서 제거될 수 있다.
반응식 1:
Figure pct00388
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Z1-COOH, EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT 또는 Z1-COOH, HATU, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT 또는 Z1-COOSu, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
ADC 전구체:
또한 아직 단백질-반응성 기를 함유하지 않는 다른 중간체는 반응식 2 및 3에 따라 레구마인-절단가능한 ADC 전구체로 전환될 수 있다.
반응식 2:
Figure pct00389
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT]
반응식 3:
Figure pct00390
[a): HATU, DMF, N,N-디이소프로필에틸아민, RT 또는 EDCI, HOBT, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT b) H2, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온, N,N-디이소프로필에틸아민, DMF, RT
반응식 1-3에 제시된 벤질옥시카르보닐 기에 대한 대안으로서, 펩티드 화학에서 확립된 다른 보호기를 사용하고 이들을 마찬가지로 공지된 상응하는 방법에 의해 분리시키는 것이 가능하다. 보호기 전략의 선택은 분자에서 발생하는 다른 구조적 요소와의 상용성과 관련된, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 요건에 따라 이루어진다. 분자 내의 추가의 보호기가 여전히 존재하는 경우에, 이들은 최종 단계에서 제거될 수 있다.
합성은 또한 그의 순서의 관점에서 임의로 재배열될 수 있다.
또한, 링커 구조 L1-L2와 관련하여 단백질-반응성 기는 청구범위의 범주 내에서 달라질 수 있다.
중간체 R1
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00391
7.5 mg (0.009 mmol)의 중간체 F104를 2 ml의 DMF 중에 용해시키고, 5.3 mg (0.014 mmol)의 HATU, 5 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 5.8 mg (0.011 mmol)의 중간체 L108을 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 교반하였다. 후속적으로, 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 3.2 mg (이론치의 31%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.10분; MS (ESIpos): m/z = 1083 (M+H)+.
중간체 R2
N-이소니코티닐-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜릴)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00392
12.7 mg (0.016 mmol)의 중간체 F104를 7.8 mg (0.016 mmol)의 중간체 L109에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 4.5 mg (이론치의 24%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.74분; MS (ESIpos): m/z = 1054 (M+H)+.
중간체 R3
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세테이트 (1:1)
Figure pct00393
100 mg (0.124 mmol)의 중간체 F104를 75 mg (0.15 mmol)의 중간체 L110에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 58 mg (이론치의 39%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 1068 (M+H)+.
중간체 R4
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00394
20 mg (0.025 mmol)의 중간체 F104를 30.6 mg (0.062 mmol)의 중간체 L111에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 2.3 mg (이론치의 9%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.97분; MS (ESIpos): m/z = 991 (M+H)+.
중간체 R5
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1S)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00395
표제 화합물을 화합물 C110으로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 1시간 동안의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.94분; MS (ESIpos): m/z = 1107 [M+H]+.
중간체 R6
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1S)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00396
표제 화합물을 화합물 C110으로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 1.5시간 동안의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.95분; MS (ESIpos): m/z = 1181 [M+H]+.
중간체 R7
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-{[2-({5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}아미노)에틸]아미노}-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00397
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 tert-부틸 (2-아미노에틸)카르바메이트에 중간체 C102를 커플링시키고, 이어서 Z 보호기를 DCM-메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 표준 수소 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 분리시킨 다음, HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L110에 커플링시키고 후속적으로 트리플루오로에탄올 중에서 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 Boc 기를 분리시킴으로써 제조하였다. 최종 단계에서, 수득된 중간체를 DMF에 녹이고, N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.84분; MS (ESIpos): m/z = 1142 [M+H]+.
중간체 R8
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-({2-[(N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}글리실)아미노]에틸}아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00398
표제 화합물을 중간체 C102 및 중간체 L112로부터 중간체 R7과 유사하게 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 1199 [M+H]+.
중간체 R9
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00399
표제 화합물을 화합물 C111로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L107에 커플링시키고, 이어서 염화아연에 의해 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.9분; MS (ESIpos): m/z = 1107 [M+H]+.
중간체 R10
트리플루오로아세트산 / N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[13-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,7,12-트리옥소-10-티아-3,6,13-트리아자헥사데칸-16-일]-L-아스파르트아미드 (1:1)
Figure pct00400
15.0 mg (17.6 μmol)의 트리플루오로아세트산 / 3-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)-N-(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)프로판아미드 (1:1) (중간체 F240)를 처음에 11.6 mg (22.9 μmol)의 N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 L110)과 함께 2.0 ml의 아세토니트릴 중에 충전하였다. 이어서, 25 μl (0.14 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하고 14 μl (23 μmol)의 T3P (에틸 아세테이트 중 50%)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 5.70 mg (이론치의 26%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 1112 (M+H)+.
중간체 R11
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-({4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-4-옥소부틸}아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00401
20 mg (31 μmol)의 중간체 C114를 처음에 11.6 mg (22.9 μmol)의 N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라긴 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 L110)과 함께 5.0 ml의 DMF 중에 충전하였다. 이어서, 11 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 21 mg (55 μmol)의 HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 250x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이어서 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연을 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 tert-부틸 에스테르 기를 분리시켰다. 6 당량의 EDTA를 첨가한 후, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 최종 단계에서, 수득된 중간체를 DMF에 녹이고, 15 당량의 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온을 사용하고 5 당량의 HATU 및 5 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 60분 동안 교반함으로써 표제 화합물로 전환시켰다. 후자를 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.87분; MS (ESIpos): m/z = 1071 (M+H)+.
중간체 R12
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-알파-아스파라긴
Figure pct00402
표제 화합물을 화합물 F104로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L113에 커플링시키고, 이어서 염화아연에 의해 탈보호시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.1분; MS (ESIpos): m/z = 1084 [M+H]+.
중간체 R13
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-({2-[(N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-감마-글루타밀)아미노]에틸}아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00403
먼저, 중간체 C112를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (4S)-5-(벤질옥시)-4-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-옥소펜탄산에 커플링시켰다. 이어서 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 완전히 탈보호시켰다. 최종적으로, 표제 화합물을 3 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 5 당량의 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 1194 [M+H]+.
중간체 R14
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-{[(1R)-1-카르복시-2-({5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}아미노)에틸]아미노}-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00404
먼저, 중간체 C113을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L111에 커플링시켰다. 이어서 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 완전히 탈보호시켰다. 최종적으로, 표제 화합물을 3.5 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 2.5 당량의 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.92분; MS (ESIpos): m/z = 1109 [M+H]+.
중간체 R15
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-({2-[(N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-D-알파-글루타밀)아미노]에틸}아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00405
먼저, DMF 중 중간체 C112를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 상업적으로 입수가능한 (2R)-5-(벤질옥시)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-옥소펜탄산에 커플링시켰다. 이어서 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 1시간 동안의 수소화에 의해 완전히 탈보호시켰다. 최종적으로, 표제 화합물을 3 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 2.5 당량의 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.92분; MS (ESIpos): m/z = 1194 [M+H]+.
중간체 R16
N-(38-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-일)-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00406
20 mg (0.025 mmol)의 중간체 F104 및 23 mg의 중간체 L116 (0.027 mmol)을 0.2 ml의 DMF 중에 용해시키고, 11.3 mg (0.029 mmol)의 HATU 및 13 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.074 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 45분 동안 교반하였다. 물 (1 ml) 및 ACN (1 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 3:7 → 7:3)에 의해 정제하였다. 19 mg (이론치의 50%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 4): Rt = 1.19분; MS (ESIpos): m/z = 1519.8055 (M+H)+.
중간체 R17
N-(38-옥소-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-도데카옥사옥타트리아콘탄-38-일)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-20-카르복시-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,19,25-트리아자옥타코산-28-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00407
0.25 ml의 DMF 중 14.4 mg의 중간체 L118 (0.020 mmol)의 용액에 9 μl의 4-에틸모르폴린 (0.08 mmol) 및 5.78 mg의 HATU (0.015 mmol)를 첨가하고, 18 mg의 중간체 F307 (0.015 mmol)을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 물 (1.5 ml) 및 ACN (1.5 ml)을 첨가하였다. 반응 용액을 정제용 HPLC (용리액: ACN/물 + 0.1% TFA, 구배 = 35% → 65%)에 의해 정제하였다. 10 mg (이론치의 36%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 14): Rt = 5.44분; MS (ESIpos): m/z = 892.4320 (M+2H)2+.
중간체 R18
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-프롤릴-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00408
15 mg (0.019 mmol)의 중간체 F104를 12 mg (0.022 mmol)의 중간체 L119에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 4.7 mg (이론치의 23%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.85분; MS (ESIpos): m/z = 1094 (M+H)+.
중간체 R19
N-(피리딘-4-일아세틸)-D-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00409
15 mg (0.019 mmol)의 중간체 F104를 10.4 mg (0.02 mmol)의 중간체 L120에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 5.7 mg (이론치의 29%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 1068 (M+H)+.
중간체 R20
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-16,18-디카르복시-5,10,14-트리옥소-7-티아-4,11,15-트리아자옥타데스-1-일]-L-아스파르트아미드 / 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00410
표제 화합물을 화합물 C117로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 에탄올:에틸 아세테이트 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 밤새 수소화시킴으로써 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.94분; MS (ESIneg): m/z = 1223 [M-H]-.
중간체 R21
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-16,18-디카르복시-5,10,14-트리옥소-7-티아-4,11,15-트리아자옥타데스-1-일]-L-아스파르트아미드 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00411
표제 화합물을 화합물 C117로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 에탄올:에틸 아세테이트 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 밤새 수소화시킴으로써 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.97분; MS (ESIneg): m/z = 1205 [M-H]-.
중간체 R22
N-{[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세틸}-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00412
20 mg (0.025 mmol)의 중간체 F104를 11.9 mg (0.027 mmol)의 중간체 L129에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 13.4 mg (이론치의 49%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.98분; MS (ESIpos): m/z = 1109 (M+H)+.
중간체 R23
N-{[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세틸}-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-({2-[(N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-D-알파-글루타밀)아미노]에틸}아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00413
먼저, 중간체 C120을 HATU의 존재 하에 (2R)-5-(벤질옥시)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-5-옥소펜탄산에 커플링시켰다. 이어서, 벤질옥시카르보닐 보호기 및 벤질 에스테르를 10% 팔라듐/활성탄 상에서의 가수소분해에 의해 제거하였다. 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.94분; MS (ESIpos): m/z = 1312 [M+H]+.
중간체 R24
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00414
표제 화합물을 화합물 C121로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.92분; MS (ESIpos): m/z = 1181 [M+H]+.
중간체 R25
N-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-N-메틸-L-알라닐-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00415
먼저, 트리플루오로아세트산 / 4-니트로벤질-L-알라닐-D-알라닐-L-아스파라기네이트 (1:1)를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐-D-알라닌을 4-니트로벤질 L-아스파라기네이트 히드로브로마이드 (1:1)와 커플링시킨 다음, 아미노 기를 DCM 중 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킴으로써 제조하였다.
이 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 N-(tert-부톡시카르보닐)-N-메틸-L-알라닌에 커플링시켰다. 후속적으로, p-니트로벤질 에스테르를 DCM-메탄올 1:1 중에서 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 분리시켰다.
이와 같이 하여 수득된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 C121에 커플링시켰다. 후속적으로, Boc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 4 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 1시간 동안 교반함으로써 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.99분; MS (ESIpos): m/z = 1235 (M+H)+.
45 mg (33 μmol)의 이 중간체를 20.5 ml의 메탄올 중에서, 문헌 방법 (J. Org. Chem. 1993, 58, 2196)에 의해 미리 제조된 26 mg (200 μmol)의 6-옥소헥산산과 합하고, 7.6 μl의 아세트산 및 30 mg (320 μmol)의 보란-피리딘 착물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시키고 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 38 mg (이론치의 84%)의 중간체를 수득하였다.
38 mg (0.028 mmol)의 이 중간체를 10 ml의 DMF 중에 용해시키고, 53 mg (0.42 mmol)의 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온, 24.5 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민 및, 여러 부분으로, 총 77 mg (0.2 mmol)의 HATU를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 용액을 TFA를 사용하여 3-4의 pH로 조정한 다음, 농축시키고 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 39 mg (96%)의 보호된 중간체를 수득하였으며, 이어서 이를 15 ml의 에탄올에 녹였다. 활성탄 상 10% 팔라듐을 첨가한 후, 벤질 에스테르 기를 표준 수소 압력 하의 가수소분해에 의해 제거하고, 촉매를 여과한 후, 나머지 용액을 농축시킨 다음, 잔류물을 아세토니트릴/물 9:1로부터 동결건조시키고, 34 mg (이론치의 94%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.8분; MS (ESIpos): m/z = 1266 (M+H)+.
중간체 R26
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-아스파라기닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00416
15 mg (0.019 mmol)의 중간체 F104를 10.3 mg (0.022 mmol)의 중간체 L130에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 후속적으로, Boc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 분리시켰다. 최종 단계에서, 중간체를 4-피리딘아세트산에 커플링시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.84분; MS (ESIpos): m/z = 1111 (M+H)+.
중간체 R27
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-세릴-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00417
먼저, N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-세린을 피리딘-4-일아세트산 히드로클로라이드 (1:1) 및 tert-부틸 L-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1) 단위를 HATU에 의해 커플링시키고, 이어서 tert-부틸 에스테르를 DCM 중 TFA로 절단시키고, 벤질 D-세리네이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시키고 최종적으로 벤질 에스테르를 10% 팔라듐/활성탄 상에서 가수소분해적 절단시킴으로써 제조하였다.
이어서, 8.4 mg (25 μmol)의 이 중간체를 9.7 mg (25.5 μmol)의 HATU 및 18.5 μl의 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 20 mg (21.2 μmol)의 중간체 C116에 커플링시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.71분; MS (ESIpos): m/z = 1084 (M+H)+.
중간체 R28
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-{[2-({N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-D-알파-글루타밀}아미노)에틸]아미노}-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00418
표제 화합물을 중간체 R15와 유사하게 제조하였다. 최종 단계에서, 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온 대신에, 말레이미드 유도체 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온을 커플링에 사용하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 1121 (M+H)+.
중간체 R29
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-노르발릴-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-20-카르복시-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,19,25-트리아자옥타코산-28-일]-L-아스파르트아미드/ / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00419
표제 화합물을 화합물 C119로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L126에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Teoc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 염화아연에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-산과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 14): Rt = 5.28분; MS (ESIpos): m/z = 1360 [M+H]+.
중간체 R30
N-[(벤질옥시)카르보닐]-D-알파-아스파라길-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00420
표제 화합물을 화합물 C116으로부터 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2R)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속적으로, tert-부틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 분리시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제한 후, 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 1.06분; MS (ESIpos): m/z = 1056 [M+H]+.
중간체 R31
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-{[2-({N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-D-알파-글루타밀}아미노)에틸]아미노}-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00421
표제 화합물의 합성을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 중간체 L131에 대한 중간체 C102의 커플링으로 개시하였다. 이어서 Z 기를 표준 압력 하에 에탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 수소로 가수소분해적 분리시켰다. 이어서 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L110에 커플링시켰다. 이어서 Boc 보호기 및 tert-부틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 6시간 동안 교반함으로써 분리시켰다. 최종 단계에서, 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온에 커플링시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제한 후, 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = Rt = 1.49분; MS (ESIpos): m/z = 1197 [M+H]+.
중간체 R32
N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닐-D-알파-아스파라길-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00422
표제 화합물의 합성을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 (2R)-2-아미노-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산에 대한 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라니네이트의 HATU 커플링으로 개시하였다. 이어서, 수득된 중간체를 마찬가지로 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 HATU 커플링에 의해 중간체 C116과 반응시켰다. 최종 단계에서, tert-부틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.05분; MS (ESIpos): m/z = 1127 (M+H)+.
중간체 R33
N-아세틸-L-알라닐-D-알파-아스파라길-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00423
표제 화합물의 합성을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 (2R)-2-아미노-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산에 대한 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라니네이트의 HATU 커플링으로 개시하였다. 이어서 Z 기를 표준 압력 하에 에탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 수소로 가수소분해적 분리시켰다. 이어서, 반응을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온으로 실시하였다. 이어서, 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 HATU 커플링에 의해 중간체 C116과 반응시켰다. 최종 단계에서, tert-부틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.95분; MS (ESIpos): m/z = 1035 (M+H)+.
중간체 R34
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-D-알라닐-N1-{3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]프로필}-L-아스파르트아미드
Figure pct00424
표제 화합물을 화합물 M9로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Z 보호기를 DCM/메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 1.01분; MS (ESIpos): m/z = 937 [M+H]+.
중간체 R35
N-아세틸-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-20-카르복시-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,19,25-트리아자옥타코산-28-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00425
표제 화합물을 화합물 C119로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L111에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Boc 보호기 및 트리메틸실릴에틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 염화아연에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-산과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.78분; MS (ESIneg): m/z = 1253 [M-H]-.
중간체 R36
N-아세틸-L-알라닐-D-알파-아스파라길-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-{[2-({N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-D-알파-글루타밀}아미노)에틸]아미노}-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00426
표제 화합물의 합성을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 (2R)-2-아미노-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산에 대한 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라니네이트의 HATU 커플링으로 개시하였다. 이어서 Z 기를 표준 압력 하에 에탄올 중 10% 팔라듐/활성탄 상에서 수소로 가수소분해적 분리시켰다. 이어서, 반응을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온으로 실시하였다. 이어서, 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민 존재 하의 DMF 중의 HATU 커플링에 의해 중간체 C123과 반응시켰다. 이어서, tert-부틸 에스테르 및 Boc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 2시간 동안 교반함으로써 분리시켰다. 최종 단계에서, 표제 화합물을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온에 커플링시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 1164 (M+H)+.
중간체 R37
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-20-카르복시-1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18,24-트리옥소-6,9,12,15-테트라옥사-22-티아-3,19,25-트리아자옥타코산-28-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00427
표제 화합물을 화합물 C119로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L110에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Boc 보호기 및 트리메틸실릴에틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 염화아연에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-산과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 1332 [M+H]+.
중간체 R38
N-아세틸-D-알파-아스파라길-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00428
표제 화합물의 합성을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 DMF 중 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온과 (2R)-2-아미노-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산의 반응으로 개시하였다. 이어서, 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민 존재 하의 HATU 커플링에 의해 DMF 중에서 중간체 C116과 반응시켰다. 최종 단계에서, tert-부틸 에스테르를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 40분 동안 교반함으로써 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.92분; MS (ESIpos): m/z = 964 (M+H)+.
중간체 R39
N-아세틸-D-알파-아스파라길-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-{[2-({N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-D-알파-글루타밀}아미노)에틸]아미노}-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00429
표제 화합물의 합성을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 DMF 중 1-아세톡시피롤리딘-2,5-디온과 (2R)-2-아미노-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산의 반응으로 개시하였다. 이어서, 수득된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 HATU 커플링에 의해 DMF 중에서 중간체 C123과 반응시켰다. 이어서, tert-부틸 에스테르 및 Boc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 8 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 8시간 동안 교반함으로서 분리시켰다. 최종 단계에서, 표제 화합물을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온에 커플링시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.89분; MS (ESIpos): m/z = 1093 (M+H)+.
중간체 R40
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-알라닐-D-알라닐-N1-{3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]프로필}-L-아스파르트아미드
Figure pct00430
표제 화합물을 화합물 M9로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, Z 보호기를 DCM/메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 1.05분; MS (ESIpos): m/z = 919 [M+H]+.
중간체 R41
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-알라닐-D-알라닐-N1-{3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]프로필}-L-아스파르트아미드
Figure pct00431
표제 화합물을 화합물 C121로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.96분; MS (ESIpos): m/z = 1163 [M+H]+.
중간체 R42
N-(브로모아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00432
표제 화합물을 화합물 C121로부터, 먼저 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L108에 커플링시킴으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 모든 보호기를 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 제거한 다음, 탈보호된 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-(2-브로모아세톡시)피롤리딘-2,5-디온과 반응시킴으로써 표제 화합물로 전환시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.93분; MS (ESIpos): m/z = 1090 및 1092 [M+H]+.
중간체 R43
N-아세틸-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00433
81 mg (0.1 mmol)의 중간체 F104를 43 mg (0.13 mmol)의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-아스파라기네이트에 중간체 R1과 유사하게 커플링시켰다. 이어서 Boc 보호기를 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 20분 동안 교반함으로써 분리시켰다. 최종 단계에서, 표제 화합물을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 HATU에 의해 N-아세틸-D-알라닌에 커플링시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.77분; MS (ESIpos): m/z = 920 (M+H)+.
중간체 R44
N-아세틸-D-아스파라기닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00434
표제 화합물을 화합물 C116으로부터 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 L132에 커플링시킴으로써 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 963 [M+H]+.
중간체 R45
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-D-알파-아스파라길-N1-{3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)-아미노]프로필}-L-아스파르트아미드
Figure pct00435
표제 화합물을 화합물 M9로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 펩티드 화학의 방법에 의해 여러 단계에 걸쳐 제조하였다:
먼저 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 화합물 M9를 4-니트로페닐 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-아스파라기네이트에 커플링시킨 다음; 후속적으로 Z 보호기를 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 분리시킨 다음; 후속적으로 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 (2R)-2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-4-tert-부톡시-4-옥소부탄산에 커플링시킨 다음; 후속적으로 Z 보호기를 DCM/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 분리시킨 다음; 후속적으로 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 N-[(벤질옥시)카르보닐]-L-알라닌에 커플링시키고 Z 보호기를 또 다른 가수소분해적 분리시키고; 후속적으로 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 3시간 동안 교반함으로써 tert-부틸 에스테르를 절단시키고 최종적으로 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온과 반응시킨다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.98분; MS (ESIpos): m/z = 981 [M+H]+.
중간체 R46
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-알라닐-D-알파-아스파라길-N1-{3-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-프로필}-L-아스파르트아미드
Figure pct00436
표제 화합물을 중간체 R45와 유사하게 제조하였다. 그러나, 최종 단계에서, 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온 대신에 커플링에 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온을 사용하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = Rt = 0.99분; MS (ESIpos): m/z = 907 [M+H]+
중간체 R47
N-[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]-L-알라닐-D-알라닐-N1-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(3-{[(1R)-1,2-디카르복시에틸]-아미노}-3-옥소프로필)술파닐]아세틸}아미노)프로필]-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00437
중간체 C127을 트리플루오로에탄올 (2.0 ml) 중에 용해시키고, 이염화아연 (4.18 mg, 30.6 μmol)을 첨가하였다. 50℃에서 1시간 동안 교반한 후, 염화아연 (4.18 mg, 30.6 μmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이염화아연 (4.18 mg, 30.6 μmol)을 다시 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (8.95 mg, 30.6 μmol)을 반응 혼합물에 첨가하였으며, 이를 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 4.3 mg (이론치의 71%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.95분; MS (ESIneg): m/z = 1064 [M-H]-
중간체 R48
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-히스티딜-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(2-{[(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)아세틸]아미노}에틸)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드
Figure pct00438
표제 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C102를 tert-부틸 (2-아미노에틸)카르바메이트에 커플링시키고, 후속적으로 Z 보호기를 DCM-메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 1시간 동안의 수소화에 의해 분리시키고, 이어서 DMF 중에서 4-니트로페닐 N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-아스파라기네이트에 커플링시키고 후속적으로 Z 보호기를 에탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 표준 수소 압력 하에 실온에서 1시간 동안의 수소화에 의해 분리시킴으로써 제조하였다.
이 중간체를 후속적으로 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서, N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하의 DMF 중의 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-히스티딘과 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-옥시)피롤리딘-2,5-디온의 반응에 의해 미리 제조된 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-1-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-D-히스티딘에 커플링시켰다. 이어서, Fmoc 보호기를 DMF 중 피페리딘으로 분리시켰다. 탈보호된 화합물을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에, HATU에 의한 피리딘-4-일아세트산 히드로클로라이드 (1:1)와 tert-부틸 L-알라니네이트 히드로클로라이드 (1:1)의 반응에 의해 미리 제조된 N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닌 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시키고, 후속적으로 DCM 중 TFA로 tert-부틸 에스테르를 가수분해시켰다.
Boc 기를 수득된 중간체로부터 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 1시간 동안 교반함으로써 분리시켰다. 최종 단계에서, 표제 화합물을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1H-피롤-2,5-디온과 반응시킴으로써 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.75분; MS (ESIpos): m/z = 1134 [M+H]+.
중간체 R49
N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}-L-알라닐-D-알라닐-N1-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(3-{[(1R)-1,2-디카르복시-에틸]아미노}-3-옥소프로필)술파닐]아세틸}아미노)프로필]-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00439
L-알라닐-D-알라닐-N1-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}{[(3-{[(1R)-1,2-디카르복시에틸]아미노}-3-옥소프로필)술파닐]아세틸}아미노)-프로필]-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세트산 염 (7.60 mg, 6.57 μmol, 중간체 C129) 및 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온 (5.36 mg, 16.4 μmol)을 DMF (1.0 ml) 중에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (4.6 μl, 26 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. 이어서 물 + 01% TFA로 켄칭하고, 혼합물을 정제용 RP-HPLC에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 동결건조시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.97분; MS (ESIneg): m/z = 1138 [M-H]-
중간체 R50
N2-아세틸-L-리실-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-[(3-{[(1R)-1,3-디카르복시프로필]아미노}-3-옥소프로필)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 트리플루오로아세트산 염
Figure pct00440
표제 화합물을 화합물 C110D로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 펩티드 화학의 방법에 의해 여러 단계에 걸쳐 제조하였다:
먼저, 중간체 C110D를 N,N-디이소프로필에틸아민 및 HATU의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L134에 커플링시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.27분; MS (ESIpos): m/z = 1454 [M+H]+
후속적으로, Z 보호기를 디클로로메탄/메탄올 1:1 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 수소 표준 압력 하에 실온에서의 수소화에 의해 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.76분; MS (ESIpos): m/z = 1140 [M+H]+
중간체 R51
트리플루오로아세트산 N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-{(2S)-1-({2-[(N2-아세틸-L-리실)아미노]에틸}아미노)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-옥소부탄-2-일}-L-아스파르트아미드 염
Figure pct00441
표제 화합물을 화합물 C128로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 펩티드 화학의 방법에 의해 여러 단계에 걸쳐 제조하였다:
먼저, 중간체 C128을 N,N-디이소프로필에틸아민 및 HATU의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L110에 커플링시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.97분; MS (ESIpos): m/z = 1201 [M+H]+
후속적으로 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연과 함께 50℃에서 30분 동안 교반함으로써 tert-부틸 에스테르를 절단시켜 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.72분; MS (ESIpos): m/z = 1101 [M+H]+
B: 항체-약물 접합체 (ADC)의 제조
B-1. 항체의 생성에 대한 일반적 방법
사용된 항체의 단백질 서열 (아미노산 서열), 예를 들어 TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-7511, TPP-8382 및 TPP-8567을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 단백질을 코딩하는 DNA 서열 내로 형질전환시키고 일시적 포유동물 세포 배양에 적합한 발현 벡터 내로 삽입하였다 (문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems, edited by Michael R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 의해 기재된 바와 같음).
상업적으로 입수가능한 항체 세툭시맙 (TPP-981; 상표명: 에르비툭스(Erbitux))을 본원에 기재된 작업 실시예에 사용하였다.
B-2. 포유동물 세포에서의 항체의 발현에 대한 일반적 방법
항체, 예를 들어 TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-7511, TPP-8382 및 TPP-8567을 문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems, edited by Michael R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 기재된 바와 같이 일시적 포유동물 세포 배양에서 생산하였다.
B-3. 세포 상청액으로부터의 항체의 정제에 대한 일반적 방법
항체, 예를 들어 TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-7511, TPP-8382 및 TPP-8567을 세포 배양물 상청액으로부터 수득하였다. 세포 상청액을 세포의 원심분리에 의해 정화하였다. 이어서, 세포 상청액을 맙셀렉트 슈어(MabSelect Sure) (지이 헬스케어) 크로마토그래피 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이를 위해, 칼럼을 DPBS pH 7.4 (시그마/알드리치(Aldrich)) 중에서 평형화시키고, 세포 상청액을 적용하고 칼럼을 약 10 칼럼 부피의 DPBS pH 7.4 + 500 mM 염화나트륨으로 세척하였다. 항체를 50 mM 아세트산나트륨 pH 3.5 + 500 mM 염화나트륨 중에서 용리시킨 다음, DPBS pH 7.4 중에서 슈퍼덱스(Superdex) 200 (지이 헬스케어) 칼럼 상에서 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.
상업적으로 입수가능한 항체를 표준 크로마토그래피 방법 (단백질 A 크로마토그래피, 정제용 겔 여과 크로마토그래피 (SEC - 크기 배제 크로마토그래피))에 의해 정제하였다.
B-4. 시스테인 측쇄에 대한 커플링 대한 일반적 방법
하기 항체를 커플링 반응에 사용하였다:
실시예 a: 세툭시맙 (항-EGFR AK)
실시예 e: TPP-1015 (항-Her2 AK)
실시예 h1: 항-B7H3 AK (TPP-8382)
실시예 h2: 항-B7H3 AK (TPP-8567)
실시예 k: 항-TWEAKR AK (TPP-2658)
실시예 l1: 항-TWEAKR AK (TPP-7007)
실시예 l2: 항-TWEAKR AK (TPP-7006)
실시예 l3: 항-TWEAKR AK (TPP-10336)
실시예 l4: 항-TWEAKR AK (TPP-10337)
커플링 반응을 통상적으로 아르곤 하에 수행하였다.
PBS 완충제 중에 용해된 2 내지 5 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 15 mg/ml의 범위의 농도의 PBS 완충제 중 적절한 항체의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 내지 1시간 동안 교반하였다. 이러한 목적을 위해, 사용된 각각의 항체의 용액은 작업 실시예에 언급된 농도로 사용될 수 있거나, 또는 이는 또한 바람직한 농도 범위 내로 들어가기 위해 언급된 출발 농도의 약 절반으로 PBS 완충제로 임의로 희석될 수 있다. 후속적으로, 의도된 로딩에 따라, 커플링될 2 내지 12 당량, 바람직하게는 약 5-10 당량의 말레이미드 전구체 화합물 또는 할라이드 전구체 화합물을 DMSO 중 용액으로서 첨가하였다. 여기서, DMSO의 양은 총 부피의 10%를 초과해서는 안된다. 혼합물을 말레이미드 전구체의 경우에 실온에서 60-240분 동안 교반하고 할라이드 전구체의 경우에 실온에서 8 내지 24 시간 교반한 다음, PBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제로 용리시켰다. 일반적으로, 달리 나타내지 않는 한, PBS 완충제 중 5 mg의 해당 항체를 환원 및 후속 커플링에 사용하였다. 따라서 각각의 경우에 PD10 칼럼 상에서 정제하여 3.5 ml PBS 완충제 중 각각의 ADC의 용액을 수득하였다. 이어서, 샘플을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제로 임의로 재희석하였다. 필요한 경우에, 저분자량 성분의 보다 우수한 제거를 위해, 한외여과에 의한 농축을 PBS 완충제로 재희석한 후 반복하였다. 생물학적 시험을 위해, 필요한 경우에, 최종 ADC 샘플의 농도를 재희석에 의해 0.5-15 mg/ml의 범위로 임의로 조정하였다. 작업 실시예에 언급된, ADC 용액의 각각의 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 항체 로딩 (약물/mAb 비)을 B-7 하에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다.
링커에 따라, 실시예에 제시된 ADC는 또한 보다 적은 또는 보다 높은 정도로 항체에 연결된 가수분해된 개방쇄 숙신아미드의 형태로 존재할 수 있다.
특히 링커 구조
Figure pct00442
를 통해 항체의 티올 기에 연결된 KSP-I-ADC는 또한 임의로 개방쇄 숙신아미드를 통해 연결된 ADC를 통한 반응식 28에 따라 pH 8에서 약 20-24시간 동안 커플링시키고 교반한 후 재완충시킴으로써 선택적으로 제조될 수 있다.
#1은 항체에 대한 황 가교를 나타내고, #2는 변형된 KSP 억제제에 대한 부착 지점을 나타낸다.
가수분해된 개방쇄 숙신아미드를 통해 링커가 항체에 부착된 이러한 ADC는 또한 임의로 하기와 같은 예시적인 방법에 의해 선택적으로 제조될 수 있다.
소규모 커플링:
PBS 완충제 중에 용해된 2 내지 5 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위, 바람직하게는 약 5 mg/ml 내지 15 mg/ml의 범위의 농도의 PBS 완충제 중 2-5 mg의 적절한 항체의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 내지 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 의도된 로딩에 따라, 커플링될 2 내지 12 당량, 바람직하게는 약 5-10 당량의 말레이미드 전구체 화합물을 DMSO 중 용액으로서 첨가하였다. 여기서, DMSO의 양은 총 부피의 10%를 초과해서는 안된다. 혼합물을 실온에서 60-240분 동안 교반한 다음, pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5-7.5 ml의 부피로 희석한 다음, PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 후속적으로, 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다.
중규모 커플링:
아르곤 하에, PBS 완충제 중 2-5 당량, 바람직하게는 3 당량의 TCEP의 용액 (c ~ 0.2-0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.5 mg/ml)을 PBS 완충제 중 20-200 mg의 해당 항체 (c ~ 5-15 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, DMSO 중에 용해된 2-12, 바람직하게는 5-10 당량의 말레이미드 전구체 화합물을 첨가하였다. 실온에서 추가로 1.5시간-2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 희석하였다.
이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 PBS 완충제 pH 8로 1-7 mg/ml의 농도로 희석하였다. 이 용액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 필요한 경우에, 이어서, 용액을 pH 7.2로 재완충시켰다. ADC 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석한 다음, 임의로 약 10 mg/ml의 농도로 다시 농축시켰다.
작업 실시예에서 항체에 대한 다른 잠재적 가수분해-감수성 티아닐숙신이미드 가교는 하기 링커 하위구조를 함유하며, 여기서 #1은 항체에 대한 티오에테르 연결을 나타내고 #1은 변형된 KSP 억제제에 대한 연결 부위를 나타낸다.
Figure pct00443
이들 링커 하위구조는 항체에 대한 연결 단위를 나타내고 (추가의 링커 조성에 더하여) 종양 세포에서 형성되는 대사물의 구조 및 프로파일에 대해 유의한 효과를 갖는다.
제시된 구조식에서, AK1은 하기 의미를 갖는다:
실시예 a: 세툭시맙 (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 e: TPP-1015 (부분적으로 환원됨)- S§1
실시예 h1: 항-B7H3 AK (부분적으로 환원된 TPP-8382) - S§1
실시예 h2: 항-B7H3 AK (부분적으로 환원된 TPP-8567) - S§1
실시예 k: 항-TWEAKR AK (부분적으로 환원된 TPP-2658) - S§1
실시예 l1: 항-TWEAKR AK (부분적으로 환원된 TPP-7007) - S§1
실시예 l2: 항-TWEAKR AK (부분적으로 환원된 TPP-7006) - S§1
실시예 l3: 항-TWEAKR AK (부분적으로 환원된 TPP-10336) - S§1
실시예 l4: 항-TWEAKR AK (부분적으로 환원된 TPP-10337) - S§1
여기서
§1은 숙신이미드 기 또는 임의의 이성질체 가수분해된 개방쇄 숙신아미드 또는 그로부터 생성된 알킬렌 라디칼에 대한 연결을 나타내고,
S는 부분적으로 환원된 항체의 시스테인 잔기의 황 원자를 나타낸다.
B-5. 리신 측쇄에 대한 커플링에 대한 일반적 공정
하기 항체를 커플링 반응에 사용하였다:
실시예 a: 세툭시맙 (항-EGFR AK)
실시예 e: TPP-1015 (항-Her2 AK)
실시예 h1: 항-B7H3 AK (TPP-8382)
실시예 h2: 항-B7H3 AK (TPP-8567)
실시예 k: 항-TWEAKR 항체 (TPP-2658)
실시예 l1: 항-TWEAKR AK (TPP-7007)
실시예 l2: 항-TWEAKR AK (TPP-7006)
실시예 l3: 항-TWEAKR AK (TPP-10336)
실시예 l4: 항-TWEAKR AK (TPP-10337)
커플링 반응을 통상적으로 아르곤 하에 수행하였다.
커플링될 2 내지 8 당량의 전구체 화합물을 DMSO 중 용액으로서 의도된 로딩에 따라 1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위, 바람직하게는 약 10 mg/ml의 농도의 PBS 완충제 중 해당 항체의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 내지 6시간 동안 교반한 후, DMSO 중 동일한 양의 전구체 화합물을 다시 첨가하였다. 여기서, DMSO의 양은 총 부피의 10%를 초과해서는 안된다. 실온에서 추가로 30분 내지 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제로 용리시켰다. 일반적으로, 달리 나타내지 않는 한, PBS 완충제 중 5 mg의 해당 항체를 커플링에 사용하였다. 따라서 각각의 경우에 PD10 칼럼 상에서 정제하여 3.5 ml PBS 완충제 중 각각의 ADC의 용액을 수득하였다. 이어서, 샘플을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제로 임의로 재희석하였다. 필요한 경우에, 저분자량 성분의 보다 우수한 제거를 위해, 한외여과에 의한 농축을 PBS 완충제로 희석한 후 반복하였다. 생물학적 시험을 위해, 필요한 경우에, 최종 ADC 샘플의 농도를 재희석에 의해 0.5-15 mg/ml의 범위로 임의로 조정하였다.
작업 실시예에 언급된, ADC 용액의 각각의 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 항체 로딩 (약물/mAb 비)을 B-7 하에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다.
제시된 구조식에서, AK2는 하기 의미를 갖는다.
실시예 a: 세툭시맙 - NH§2
실시예 e: TPP-1015 - NH§2
실시예 h1: 항-B7H3 AK (TPP-8382) - NH§2
실시예 h2: 항-B7H3 AK (TPP-8567) - NH§2
실시예 k: 항-TWEAKR 항체 (TPP-2658) - NH§2
실시예 l1: 항-TWEAKR AK (TPP-7007) - NH§2
실시예 l2: 항-TWEAKR AK (TPP-7006) - NH§2
실시예 l3: 항-TWEAKR AK (TPP-10336) - NH§2
실시예 l4: 항-TWEAKR AK (TPP-10337) - NH§2
여기서
§2는 카르보닐 기에 대한 연결을 나타내고
NH는 항체의 리신 잔기의 측쇄 아미노 기를 나타낸다.
B-5a. 박테리아 트랜스글루타미나제에 의한 ADC 합성에 대한 일반적 방법
실시예 시리즈 t에서의 커플링 반응에서, 하기 항체를 사용하였다 (하기 항체-HC-N297Z 명명법은 아미노산 N297 (카바트 넘버링)이 둘 다의 중쇄에서 아미노산 Z로 교환된 항체를 의미하고, TPP-xxxx-HC-Q295N-HC-N297Q 명명법은 둘 다의 중쇄에서 아미노산 Q295 (카바트 넘버링)가 아미노산 N으로 교환되고 아미노산 N297 (카바트 넘버링)이 아미노산 Q로 교환된, TPP-XXXX를 갖는 항체를 의미한다. 원래 항체의 항체 명칭은 명칭 (예를 들어 트라스투주맙) 또는 TPP-XXXX (TPP 번호 XXXX를 갖는 항체)로서 보고될 수 있다):
AK3a: 항-TWEAKR 항체 (TPP-2658) (TPP-2090-HC-N297A에 상응함)
AK3b: 항-TWEAKR 항체 (TPP-5442) (TPP-2090-HC-N297Q에 상응함)
AK3c: 항-TWEAKR 항체 (TPP-8225) (TPP-2090-HC-Q295N-HC-N297Q에 상응함)
AK3d: 항-HER2 항체 (TPP-7510) (TPP-1015-HC-N297A에 상응함)
AK3e: 항-HER2 항체 (TPP-7511) (TPP-1015-HC-N297Q에 상응함)
2의 최대 DAR을 달성하기 위한 일반적 절차:
DPBS pH 7.4 중 5 mg의 상응하는 비-글리코 항체 변이체 (HC-N297A)의 용액 (c ~ 5-15 mg/ml)에 20 μl (6 당량)의 적합한 독성단 링커 전구체의 용액 (예를 들어 중간체 R50 및 R51; DMSO 중 10 mM 용액)을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 물 중 50 μl의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하(Zedira GmbH) (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.4로 2.5 ml의 총 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀(Amicon Ultracel)-30K 원심분리 (밀리포어(Millipore))에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 약 2.5 ml의 부피로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 12.5 μl의 DPBS 중 0.00625 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 작업 실시예에 언급된, ADC 용액의 각각의 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 항체 로딩 (약물/mAb 비)을 B-7 하에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다.
4의 최대 DAR을 달성하기 위한 일반적 절차:
DPBS pH 7.4 중 5 mg의 상응하는 비-글리코 항체 변이체 (HC-N297Q)의 용액 (c ~ 5-15 mg/ml)에 16-24 당량의 적합한 독성단 링커 전구체의 용액 (예를 들어 중간체 R50 및 R51; DMSO 중 10 mM 용액)을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 물 중 400 μl (10 U)의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.4로 2.5 ml의 총 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 (밀리포어)에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 약 2.5 ml의 부피로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 200 μl의 DPBS 중 0.1 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 작업 실시예에 언급된, ADC 용액의 각각의 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 항체 로딩 (약물/mAb 비)을 B-7 하에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다.
2의 최대 DAR을 수득하기 위한 보다 대규모 트랜스글루타미나제-매개 커플링에 대한 일반적 절차:
DPBS pH 7.4 중 30 mg의 특정한 항체의 비-글리코실화 변이체 (HC-N297A)의 용액 (c ~ 5-15 mg/ml)에 6 당량의 적절한 독성단 링커 전구체의 용액 (DMSO 중 10 mM)을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 물 중 200 μl (7.5 U)의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. ADC로부터 소분자 및 트랜스글루타미나제를 분리하기 위해 반응 혼합물을 DPBS pH 7.4 중 슈퍼덱스 200 칼럼 (지이 헬스케어) 상에서 겔 여과 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 튜브 (밀리포어)를 사용하여 5-25 mg/ml의 최종 농도로 농축시켰다. 이어서, 용액을 멸균-여과하였다.
작업 실시예에 보고된 ADC 용액의 각각의 농도를 결정하였다. 로딩을 챕터 B7에 기재된 방법에 의해 결정하였다. ADC 배치는 작업 실시예에 나타낸 바와 같이 특징화되었다.
4의 최대 DAR을 수득하기 위한 보다 대규모 트랜스글루타미나제-매개 커플링에 대한 일반적 절차:
DPBS pH 7.4 중 30 mg의 특정한 항체의 비-글리코실화 변이체 (HC-N297Q)의 용액 (c ~ 5-15 mg/ml)에 16-24 당량의 적절한 독성단 링커 전구체의 용액 (DMSO 중 10 mM)을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 물 중 2400 μl (60 U)의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. ADC로부터 소분자 및 트랜스글루타미나제를 분리하기 위해 반응 혼합물을 DPBS pH 7.4 중 슈퍼덱스 200 칼럼 (지이 헬스케어) 상에서 겔 여과 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 튜브 (밀리포어)를 사용하여 5-25 mg/ml의 최종 농도로 농축시켰다. 이어서, 용액을 멸균-여과하였다.
작업 실시예에 보고된 ADC 용액의 각각의 농도를 결정하였다. 로딩을 챕터 B7에 기재된 방법에 의해 결정하였다. ADC 배치는 작업 실시예에 나타낸 바와 같이 특징화되었다.
실시예 시리즈 t에 대해 제시된 구조식에서, 각각의 경우에 AK3은 하기 의미를 갖는다:
AK3a: 항-TWEAKR 항체 (TPP-2658) (TPP-2090-HC-N297A에 상응함) - CO-§2
AK3b: 항-TWEAKR 항체 (TPP-5442) (TPP-2090-HC-N297Q에 상응함) - CO-§2
AK3c: 항-TWEAKR 항체 (TPP-8825) (TPP-2090-HC-Q295N-HC-N297Q에 상응함) - CO-§2
AK3d: 항-HER2 항체 (TPP-7510) (TPP-1015-HC-N297A에 상응함) - CO-§2
AK3e: 항-HER2 항체 (TPP-7511) (TPP-1015-HC-N297Q에 상응함) - CO-§2
여기서
§2는 독성단 링커 전구체의 아미노 기에 대한 연결을 나타내고
CO는 항체의 글루타민 잔기의 측쇄 카르보닐 기를 나타낸다.
B-6a. 폐쇄 숙신이미드-시스테인 부가물의 제조에 대한 일반적 방법:
예시적 실시양태에서, 10 μmol의 상기 기재된 말레이미드 전구체 화합물을 3-5 ml의 DMF에 녹이고, 2.1 mg (20 μmol)의 L-시스테인을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 내지 24시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시킨 다음, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
B-6aa. 이성질체 개방 숙신아미드-시스테인 부가물의 제조에 대한 일반적 방법:
예시적 실시양태에서, 68 μmol의 상기 기재된 말레이미드 전구체 화합물을 15 ml의 DMF에 녹이고, 36 mg (136 μmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 ~20시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시킨 다음, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시킨 다음, 잔류물을 15 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 131 μl의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 1M 염산을 사용하여 중화시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 이론치의 ~50%의 위치이성질체 보호된 중간체를 무색 발포체로서 수득하였다.
최종 단계에서, 0.023 mmol의 이들 위치이성질체 가수분해 생성물을 3 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 12.5 mg (0.092 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 27 mg (0.092 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 가수분해된 개방 술파닐숙신아미드를 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
본 발명에 따른 접합체의 추가 정제 및 특징화
반응 후, 일부 경우에 반응 혼합물을, 예를 들어 한외여과에 의해 농축시킨 다음, 탈염시키고 크로마토그래피에 의해, 예를 들어 세파덱스® G-25 칼럼을 사용하여 정제하였다. 용리를, 예를 들어, 포스페이트-완충 염수 (PBS)를 사용하여 수행하였다. 이어서, 용액을 멸균 여과하고 동결시켰다. 대안적으로, 접합체를 동결건조시킬 수 있다.
B-7. 항체, 독성단 로딩 및 개방 시스테인 부가물의 비율의 결정
탈글리코실화 및/또는 변성 후 분자량 결정에 더하여 단백질 확인을 위해, 변성, 환원 및 유도체화 후, 발견된 트립신 펩티드를 통해 단백질의 정체를 확인하는 트립신 소화를 수행하였다.
작업 실시예에 기재된 접합체의 수득된 PBS 완충제 용액의 독성단 로딩을 하기와 같이 결정하였다.
리신-연결된 ADC의 독성단 로딩의 결정을 개별 접합체 종의 분자량의 질량 분광측정 결정에 의해 수행하였다. 여기서, 항체 접합체를 먼저 PNGaseF로 탈글리코실화시키고, 샘플을 산성화시키고, HPLC 분리/탈염 후, ESI-MicroTofQ (브루커 달토닉(Bruker Daltonik))를 사용하여 질량 분광측정법에 의해 분석하였다. TIC (총 이온 크로마토그램)에서의 신호 상 모든 스펙트럼을 부가하고 상이한 접합체 종의 분자량을 MaxEnt 디컨볼루션에 기초하여 계산하였다. 이어서, DAR (= 약물/항체 비)을 상이한 종의 신호 적분 후 계산하였다. 이러한 목적을 위해, 독성단 수에 의해 가중된 모든 종에 대한 적분 결과의 총 합계를 모든 종에 대한 단순 가중된 적분 결과의 총 합계로 나누었다.
시스테인-연결된 접합체의 독성단 로딩을 환원 및 변성된 ADC의 역상 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 구아니디늄 히드로클로라이드 (GuHCl) (28.6 mg) 및 DL-디티오트레이톨 (DTT)의 용액 (500 mM, 3 μl)을 ADC 용액 (1 mg/ml, 50 μl)에 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 HPLC에 의해 분석하였다.
HPLC 분석을 애질런트 1260 HPLC 시스템 상에서 220 nm에서 검출하여 수행하였다. 폴리머 래보러토리즈(Polymer Laboratories) PLRP-S 중합체 역상 칼럼 (카탈로그 번호 PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μm 입자 크기, 1000 Å)을 1 ml/분의 유량으로 하기 구배: 0분, 25%B; 3분, 25%B; 28분, 50%B로 사용하였다. 용리액 A는 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어지고, 용리액 B는 아세토니트릴 중 0.05% 트리플루오로아세트산으로 이루어졌다.
검출된 피크는 비-접합 항체의 경쇄 (L0) 및 중쇄 (H0)와의 체류 시간 비교에 의해 할당되었다. 접합된 샘플에서 독점적으로 검출된 피크는 1개의 독성단을 갖는 경쇄 (L1) 및 1, 2 및 3개의 독성단을 갖는 중쇄 (H1, H2, H3)에 할당되었다.
항체와 독성단의 평균 로딩을 HC 로드 및 LC 로드의 합계의 2배로서 적분에 의해 결정된 피크 면적으로부터 계산하였으며, 여기서 LC 로드는 모든 LC 피크의 단독 가중 적분 결과의 합계로 나눈 모든 LC 피크의 독성단 수평균 가중 적분 결과의 합계로부터 계산되고, 여기서 HC 로드는 모든 HC 피크의 단독 가중 적분 결과의 합계로 나눈 모든 HC 피크의 독성단 수평균 가중 적분 결과의 합계로부터 계산된다. 개별적 경우에, 일부 피크의 공동-용리로 인해, 독성단 로딩을 정확하게 결정할 수 없는 것이 가능하였다.
경쇄 및 중쇄가 HPLC에 의해 충분히 분리될 수 없는 경우에, 시스테인-연결된 접합체의 독성단 로딩의 결정을 경쇄 및 중쇄에서의 개별 접합체 종의 분자량의 질량 분광측정 결정에 의해 수행하였다.
이러한 목적을 위해, 구아니디늄 히드로클로라이드 (GuHCl) (28.6 mg) 및 DL-디티오트레이톨 (DTT)의 용액 (500 mM, 3 μl)을 ADC 용액 (1 mg/ml, 50 μl)에 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 ESI-MicroTofQ (브루커 달토닉)를 사용하여 온라인 탈염시킨 후 질량 분광측정법에 의해 분석하였다.
DAR 결정을 위해, 모든 스펙트럼을 TIC (총 이온 크로마토그램)에서의 신호 상에서 부가하고, 경쇄 및 중쇄에서의 상이한 접합체 종의 분자량을 MaxEnt 디컨볼루션에 기초하여 계산하였다. 항체와 독성단의 평균 로딩을 적분에 의해 결정된 피크 면적으로부터 HC 로딩 및 LC 로딩의 총 합계의 2배로서 결정하였다. 이와 관련하여, LC 로딩은 모든 LC 피크에 대한 단순 가중 적분 결과의 총 합계로 나눈, 독성단 수에 의해 가중된 모든 LC 피크에 대한 적분 결과의 총 합계로부터 계산되고, HC 로딩은 모든 HC 피크에 대한 단순 가중 적분 결과의 총 합계로 나눈, 독성단 수에 의해 가중된 모든 HC 피크에 대한 적분 결과의 총 합계로부터 계산된다.
개방 구축물의 경우에, 개방 시스테인 부가물의 비율을 결정하기 위해, 모든 단독 접합된 경쇄 및 중쇄 변이체의 폐쇄 대 개방 시스테인 부가물의 분자량 면적 비 (분자량 델타 18 달톤)를 결정하였다. 모든 변이체의 평균은 개방 시스테인 부가물의 비율을 산출하였다.
글루타민-연결된 접합체의 독성단 로딩을 환원 및 변성된 ADC의 역상 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 구아니디늄 히드로클로라이드 (GuHCl) (28.6 mg) 및 DL-디티오트레이톨 (DTT)의 용액 (500 mM, 3 μl)을 ADC 용액 (1 mg/ml, 50 μl)에 첨가하였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 HPLC에 의해 분석하였다.
HPLC 분석을 애질런트 1260 HPLC 시스템 상에서 220 nm에서 검출하여 수행하였다. 폴리머 래보러토리즈 PLRP-S 중합체 역상 칼럼 (카탈로그 번호 PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μm 입자 크기, 1000 Å)을 1 ml/분의 유량으로 하기 구배: 0분, 31% B; 1분, 31% B; 14분, 38% B, 16분, 95% B로 사용하였다. 용리액 A는 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어지고, 용리액 B는 아세토니트릴 중 0.05% 트리플루오로아세트산으로 이루어졌다.
검출된 피크는 비-접합 항체의 경쇄 (L0) 및 중쇄 (H0)와의 체류 시간 비교에 의해 할당되었다. 접합된 샘플에서 독점적으로 검출된 피크는 1 및 2개의 독성단을 갖는 중쇄 (H1, H2)에 할당되었다.
항체와 독성단의 평균 로딩을 HC 로드 및 LC 로드의 합계의 2배로서 적분에 의해 결정된 피크 면적으로부터 계산하였으며, 여기서 LC 로드는 모든 LC 피크의 단독 가중 적분 결과의 합계로 나눈 모든 LC 피크의 독성단 수평균 가중 적분 결과의 합계로부터 계산되고, 여기서 HC 로드는 모든 HC 피크의 단독 가중 적분 결과의 합계로 나눈 모든 HC 피크의 독성단 수평균 가중 적분 결과의 합계로부터 계산된다.
대안적으로, 글루타민-연결된 ADC의 독성단 로딩을 개별 접합체 종의 분자량의 질량 분광측정 결정에 의해 결정하였다. 이 경우에, 샘플을 산성화시키고, HPLC 분리/탈염 후, ESI-MicroTofQ (브루커 달토닉)를 사용하여 질량 분광측정법에 의해 분석하였다. TIC (총 이온 크로마토그램)에서의 신호 상 모든 스펙트럼을 부가하고 상이한 접합체 종의 분자량을 MaxEnt 디컨볼루션에 기초하여 계산하였다. 이어서, DAR (= 약물/항체 비)을 상이한 종의 신호 적분 후 계산하였다. 이러한 목적을 위해, 독성단 수에 의해 가중된 모든 종에 대한 적분 결과의 총 합계를 모든 종에 대한 단순 가중된 적분 결과의 총 합계로 나누었다.
B-8. ADC의 항원 결합의 확인
표적 분자에 결합하는 결합제의 능력을 커플링을 수행한 후 조사하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 다양한 방법에 친숙하고; 예를 들어, 접합체의 친화도는 ELISA 기술 또는 표면 플라즈몬 공명 분석 (비아코어(BIAcore)™ 측정)을 사용하여 조사될 수 있다. 접합체 농도는, 예를 들어 항체 접합체에 대한 단백질 결정에 의해 통상의 방법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 측정될 수 있다. (또한 문헌 [Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784 및 Polson et al., Blood 2007; 1102:616-623] 참조).
대사물의 작업 실시예
실시예 M1
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00444
1.8 mg (2 μmol)의 중간체 F104를 1 ml의 DMF에 녹이고, 2.7 mg (22 μmol)의 L-시스테인을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시킨 다음, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 0.6 mg (이론치의 26%)의 표제 화합물이 무색 발포체로서 잔류하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.80분; MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+.
실시예 M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-3-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
및
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-2-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00445
LC-MS (방법 1): Rt = 0.80분; MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+.
먼저, L-시스테인을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인으로 전환시켰다.
406 mg (1.53 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 10 ml의 DMF 중에 용해시키고, 157.5 mg (1.606 mmol)의 말레산 무수물을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 7.5 mg (0.01 mmol)의 중간체 C66을 130 μl의 이 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 10 mg (89%)의 보호된 중간체를 수득하였고; HPLC에 의해서도 LC-MS에 의해서도 위치이성질체를 분리하는 것은 가능하지 않았다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.38분; MS (EIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
최종 단계에서, 10 mg의 이 중간체를 2 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 12 mg (0.088 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 26 mg (0.088 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 8.3 mg (이론치의 99%)의 표제 화합물을 87:13의 비의 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.3분 및 2.43분; MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+.
1H NMR 주요 위치이성질체: (500 MHz, DMSO-d6): δ = 8.7 (m, 1H), 8.5 (m, 2H), 8.1 (m, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.5 (s, 1H) 7.4-7.15 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 1H), 6.85 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 4.9 및 5.2 (2d, 2H), 4.26 및 4.06 (2d, 2H), 3.5-3.8 (m, 5H), 3.0-3.4 (m, 5H), 2.75-3.0 (m, 3H), 2.58 및 2.57 (dd, 1H), 0.77 및 1.5 (2m, 2H), 0.81 (s, 9H).
대안적으로, 위치이성질체 표제 화합물을 하기와 같이 제조하였다:
먼저, L-시스테인을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인으로 전환시켰다.
55 mg (0.068 mmol)의 중간체 F104 및 36 mg (0.136 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 15 ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시킨 다음, 잔류물을 15 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 131 μl의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 1M 염산을 사용하여 중화시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 37 mg (이론치의 50%)의 위치이성질체 보호된 중간체를 무색 발포체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 3.33분 및 3.36분; MS (ESIpos): m/z = 976 (M+H)+.
최종 단계에서, 25 mg (0.023 mmol)의 이 중간체를 3 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 12.5 mg (0.092 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 27 mg (0.092 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 18.5 mg (이론치의 85%)의 표제 화합물을 21:79의 비의 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.37분 및 3.44분; MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+.
표제 화합물의 개별 위치이성질체의 표적화된 제조를 하기와 같이 수행하였다.
실시예 M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)-2-카르복시에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-3-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
및
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)-2-카르복시에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-2-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00446
먼저, L-시스테인을 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인으로 전환시켰다.
11 mg (0.013 mmol)의 중간체 F193 및 8 mg (0.016 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 3 ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시킨 다음, 잔류물을 2 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 19 μl의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 또 다른 19 μl의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 혼합물을 1M 염산을 사용하여 중화시키고, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 이와 같이 하여 4.1 mg (이론치의 38%)의 위치이성질체 보호된 중간체를 무색 발포체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.03분 (넓음); MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+.
최종 단계에서, 4.1 mg (0.004 mmol)의 이 중간체를 3 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 3 mg (0.022 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 6 mg (0.022 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 및 2 ml의 0.1% 수성 트리플루오로아세트산을 첨가하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 5 mg (정량적)의 표제 화합물을 20:80의 비의 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.78분 (넓음); MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.36분 및 2.39분; MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+.
실시예 M4
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에톡시]에틸}-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00447
3 mg (4 μmol)의 중간체 F248을 2 ml의 DMF에 녹이고, 0.9 mg (8 μmol)의 L-시스테인을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고, 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시킨 후, 1.1 mg (이론치의 32%)의 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.78분; MS (EIpos): m/z = 801 [M+H]+.
실시예 M5
(3R,7S)-7-아미노-17-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-3-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-4-글리콜로일-2,2-디메틸-8,16-디옥소-12-옥사-4,9,15-트리아자노나데칸-19-산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
및
(3R,7S)-7-아미노-18-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-3-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-4-글리콜로일-2,2-디메틸-8,16-디옥소-12-옥사-4,9,15-트리아자노나데칸-19-산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00448
8 mg (0.010 mmol)의 중간체 F248의 보호된 중간체 및 5.1 mg (0.02 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 3 ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 초음파 조에서 2시간 동안 처리하였다. 이어서, 혼합물을 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시킨 다음, 잔류물을 2 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 15 μl의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 1M 염산을 사용하여 ~3의 pH로 조정하고 20 ml의 염화나트륨 용액으로 희석하고 20 ml의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 농축시키고, 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 8.4 mg (2 단계에 걸쳐 이론치의 78%)의 위치이성질체 보호된 중간체를 무색 발포체로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.44분 및 3.43분; MS (ESIpos): m/z = 1107 (M+H)+.
최종 단계에서, 8 mg (0.007 mmol)의 이 중간체를 5 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 9.8 mg (0.072 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 4 mg (이론치의 59%)의 표제 화합물을 31:67의 비의 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.79분 및 0.81분; MS (ESIpos): m/z = 819 (M+H)+.
실시예 M6
2-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-({(14R)-13-(3-아미노프로필)-14-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-15,15-디메틸-2,7,12-트리옥소-10-티아-3,6,13-트리아자헥사데스-1-일}아미노)-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:2) 및
3-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-({(14R)-13-(3-아미노프로필)-14-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-15,15-디메틸-2,7,12-트리옥소-10-티아-3,6,13-트리아자헥사데스-1-일}아미노)-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:2)
Figure pct00449
18 mg (0.021 mmol)의 중간체 F213 및 11.2 mg (0.04 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 2 ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물 (21.2 mg)을 3 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 0.04 ml의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 0.02 ml의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 7.2 mg (0.12 mmol)의 아세트산을 사용하여 ~7의 pH로 조정하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 13 mg (2 단계에 걸쳐 57%)의 위치이성질체 보호된 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.03분; MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+.
최종 단계에서, 13 mg (0.01 mmol)의 이 중간체를 2 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 6.2 mg (0.05 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 7시간 동안 교반하였다. 이어서, 13.3 mg (0.05 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 10.3 mg (81.4%)의 표제 화합물을 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.03분; MS (ESIpos): m/z = 875 (M+H)+.
실시예 M7
S-(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)-L-시스테인/트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00450
6 mg (8 μmol)의 중간체 F119를 3 ml의 DMF에 녹이고, 1.8 mg (15 μmol)의 L-시스테인을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한 다음, 실온에서 3일 동안 정치하였다. 이어서, 반응물을 감압 하에 농축시키고, 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.81분; MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)+.
실시예 M8
(3R)-6-{(11S,15R)-11-아미노-15-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-14-글리콜로일-16,16-디메틸-2,5,10-트리옥소-3,6,9,14-테트라아자헵타데스-1-일}-5-옥소티오모르폴린-3-카르복실산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00451
실시예 135로부터의 4 mg (0.004 mmol)의 화합물을 4 ml의 THF/물 중에 용해시키고, 48 μl의 2-몰 수성 수산화리튬 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 농축시키고 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 농축시키고 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 2.4 mg (이론치의 60%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+.
실시예 M9
N-(3-아미노프로필)-N-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2-히드록시아세트아미드
Figure pct00452
150.0 mg (0.42 mmol)의 (1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로판-1-아민 (중간체 C52)을 처음에 2.0 ml의 디클로로메탄 중에 충전하고, 29.2 mg (0.49 mmol)의 HOAc 및 125.6 mg (0.59 mmol)의 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 첨가하고 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 98.9 mg (0.49 mmol)의 3-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)프로판알을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기 상을 포화 탄산나트륨 용액 2회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 실리카 겔 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 100:1) 상에서 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 188.6 mg (74%)의 화합물 2-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)프로필]-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.00분; MS (ESIpos): m/z = 541 [M+H]+.
171.2 mg (0.32 mmol)의 2-[3-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노)프로필]-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온을 처음에 5.0 ml의 디클로로메탄 중에 충전하고, 73.6 mg (0.73 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하였다. 0℃에서, 94.9 mg (0.70 mmol)의 아세톡시아세틸 클로라이드를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기 상을 포화 탄산수소나트륨 용액으로 2회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 황산마그네슘 상에서 건조시킨 후, 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 바이오타지 이솔레라 (실리카 겔, 칼럼 10 g 스냅, 유량 12 ml/분, 에틸 아세테이트/시클로헥산 1:3)를 사용하여 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 159.0 mg (77%)의 화합물 2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}[3-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)프로필]아미노)-2-옥소에틸 아세테이트를 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.35분; MS (ESIpos): m/z = 642 [M+H]+.
147.2 mg (0.23 mmol)의 2-({(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}[3-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)프로필]아미노)-2-옥소에틸 아세테이트를 처음에 4.0 ml의 에탄올 중에 충전하고, 356.2 mg (4.59 mmol)의 메탄아민 (물 중 40%)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 톨루엔으로 3회 공동증류시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (용리액: 디클로로메탄/메탄올 = 10:1) 상에서 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 67.4 mg (63%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.91분; MS (ESIpos): m/z = 470 [M+H]+.
실시예 M10
(2R,28R)-28-아미노-2-[({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)메틸]-25-(카르복시메틸)-4,20,24-트리옥소-7,10,13,16-테트라옥사-26-티아-3,19,23-트리아자노나코산-1,29-디온산 / 트리플루오로아세트산 (1:2) 및
(1R,28R,34R)-1-아미노-33-(3-아미노프로필)-34-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-35,35-디메틸-6,10,26,32-테트라옥소-14,17,20,23-테트라옥사-3,30-디티아-7,11,27,33-테트라아자헥사트리아콘탄-1,4,28-트리카르복실산 / 트리플루오로아세트산 (1:2)
Figure pct00453
20 mg (0.018 mmol)의 R-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-[19-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-17-옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자노나데칸-1-오일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 F209) 및 9.78 mg (0.036 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 2 ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물 (47.7 mg)을 3 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 0.08 ml의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 9.26 mg (0.15 mmol)의 아세트산을 사용하여 ~7의 pH로 조정하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 15.3 mg (2 단계에 걸쳐 29%)의 위치이성질체 보호된 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 12.26분 및 12.30분; MS (ESIpos): m/z = 1254 (M+H)+.
최종 단계에서, 15.3 mg (0.01 mmol)의 이 중간체를 2 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 6.1 mg (0.05 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 13.1 mg (0.05 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 11.9 mg (79.5%)의 표제 화합물을 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.85분; MS (ESIpos): m/z = 1110 (M+H)+.
실시예 M11
S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:2)
Figure pct00454
15.0 mg (0.018 mmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C71)을 1.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 7.4 mg (0.054 mmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 15.8 mg (0.054 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 11.1 mg (77%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.83분; MS (ESIpos): m/z = 573 (M+H)+.
실시예 M12
4-{[(1R)-2-({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)-1-카르복시에틸]아미노}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00455
12.2 mg (0.014 mmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-(4-tert-부톡시-4-옥소부타노일)-L-시스테인 (중간체 C77)을 2.0 ml의 트리플루오로에탄올 중에 용해시키고, 11.4 mg (0.084 mmol)의 이염화아연을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 24.5 mg (0.084 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 물 (0.1% TFA)을 첨가하였다. 정제를 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 실시하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 4.6 mg (42%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)+.
실시예 M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-2-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
위치이성질체 1, 에피머 1 (2R) 또는 (2S)
Figure pct00456
LC-MS (방법 5): Rt = 2.44분; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
먼저, 메틸 L-시스테이네이트 히드로클로라이드 (1:1)를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테이네이트로 전환시켰다.
408 mg (1.93 mmol)의 상업적으로 입수가능한 3-브로모-4-메톡시-4-옥소부탄산 및 180 mg (0.644 mmol)의 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테이네이트를 8 ml의 DMF 중에 용해시키고, 147 mg (0.97 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 또 다른 136 mg (0.64 mmol)의 3-브로모-4-메톡시-4-옥소부탄산 및 147 mg (0.97 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 12시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시켜 151 mg (이론치의 57%)의 4-메톡시-3-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부탄산을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.74분; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)-.
이 중간체의 145 mg을 키랄 칼럼을 통한 초임계 유체 크로마토그래피에 의해 개별 부분입체이성질체로 분리하여 (SFC; 칼럼 다이셀(DAICEL), AD-H 5u 250x20 mm; 유량 80 ml/분; 방법 AD-25%ETOH-80 ml; 압력 100 bar; 파장 210 nM), 63 mg (43%)의 에피머 1 및 58 mg (40%)의 에피머 2를 수득하였다.
에피머 1은 하기와 같이 특징화되었다:
LC-MS (방법 5): Rt = 2.94분; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)-.
1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.57 (d, 1H), 4.24 (m, 1H), 4.05 (t, 2H), 3.67 (t, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.05 (dd, 1H), 2.70-2.88 (m, 2H), 2.59 (dd, 1H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
에피머 2는 하기와 같이 특징화되었다:
LC-MS (방법 5): Rt = 2.95분; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)-.
1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.58 (d, 1H), 4.16-4.23 (m, 1H), 4.05 (t, 2H), 3.67 (dd, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.04 (dd, 1H), 2.88 (dd, 1H), 2.77 (dd, 1H), 2.61 (dd, 1H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
32.5 mg (0.079 mmol)의 에피머 1을 30 mg (0.079 mmol)의 HATU 및 13.4 mg (0.132 mmol)의 4-메틸모르폴린의 존재 하에 50 mg (0.066 mmol)의 중간체 C66과 커플링시켜, HPLC 정제 후, 43 mg (이론치의 57%)의 완전히 보호된 중간체 메틸 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]에틸}-2,2-디메틸-6,9,14-트리옥소-5-옥사-7,10,13-트리아자-2-실라펜타데칸-15-일]아미노}-2-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부타노에이트를 수득하였다.
이어서, 40 mg (0.035 mmol)의 이 중간체를 11 ml의 메탄올 중 0.9 ml의 2-몰 수산화리튬 용액과 함께 실온에서 20분 동안 교반하여, 둘 다의 메틸 에스테르 기의 절단을 일으켰다. HPLC에 의해 정제하여 12 mg (이론치의 31%)의 디카르복실산 유도체를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.74분; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
최종적으로, 10 mg (0.009 mmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 완전히 탈보호시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 2.6 mg (이론치의 30%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.44분; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-2-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
위치이성질체 1, 에피머 2 (2R 또는 2S)
Figure pct00457
LC-MS (방법 5): Rt = 2.44분; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M13에 기재된 중간체 에피머 2를 실시예 M13에서의 설명과 유사하게 반응시켰다.
32.5 mg (0.079 mmol)의 에피머 2를 30 mg (0.079 mmol)의 HATU 및 13.4 mg (0.132 mmol)의 4-메틸모르폴린의 존재 하에 50 mg (0.066 mmol)의 중간체 C66과 커플링시켜, HPLC 정제 후, 43 mg (이론치의 57%)의 완전히 보호된 중간체 메틸 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]에틸}-2,2-디메틸-6,9,14-트리옥소-5-옥사-7,10,13-트리아자-2-실라펜타데칸-15-일]아미노}-2-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부타노에이트를 수득하였다.
이어서, 40 mg (0.035 mmol)의 이 중간체를 11 ml의 메탄올 중 0.9 ml의 2-몰 수산화리튬 용액과 함께 실온에서 20분 동안 교반하여, 둘 다의 메틸 에스테르 기의 절단을 일으켰다. HPLC에 의해 정제하여 11 mg (이론치의 28%)의 디카르복실산 유도체를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.74분; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
최종적으로, 10 mg (0.009 mmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 완전히 탈보호시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 4.4 mg (이론치의 52%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.44분; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-3-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
위치이성질체 2, 에피머 1 (3R 또는 3S)
Figure pct00458
LC-MS (방법 5): Rt = 2.45분; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
742.8 mg (3.3 mmol)의 상업적으로 입수가능한 2-브로모-4-에톡시-4-옥소부탄산 및 802 mg (2.87 mmol)의 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테이네이트를 32 ml의 DMF 중에 용해시키고, 655.4 mg (4.31 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시켜 521 mg (이론치의 43%)의 4-에톡시-2-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부탄산을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 3.13분; MS (ESIpos): m/z = 424 (M+H)+.
이 중간체의 510 mg을 키랄 칼럼을 통한 초임계 유체 크로마토그래피에 의해 개별 부분입체이성질체로 분리하여 (SFC; 칼럼 다이셀, AD-H 5u 250x20 mm; 유량 80 ml/분; 방법 AD-10%ETOH-80 ml; 압력 100 bar; 파장 210 nM), 100 mg (20%)의 에피머 1 및 141 mg (28%)의 에피머 2를 수득하였다.
에피머 1은 하기와 같이 특징화되었다:
LC-MS (방법 1): Rt = 0.99분; MS (ESIneg): m/z = 422 (M-H)-.
1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.60 (d, 1H), 4.18-4.26 (m, 1H), 4.01-4.08 (m, 4H), 3.63 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H), 3.04 (dd, 1H), 2.92 (dd, 1H), 2.80 (dd, 1H), 2.63 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
에피머 2는 하기와 같이 특징화되었다:
LC-MS (방법 5): Rt = 2.95분; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)-.
1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.56 (d, 1H), 4.21-4.29 (m, 1H), 4.01-4.1 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (dd, 1H), 3.08 (dd, 1H), 2.85 (dd, 1H), 2.78 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
33.6 mg (0.079 mmol)의 에피머 1을 30 mg (0.079 mmol)의 HATU 및 13.4 mg (0.132 mmol)의 4-메틸모르폴린의 존재 하에 50 mg (0.066 mmol)의 중간체 C66과 커플링시켜, HPLC 정제 후, 51 mg (이론치의 63%)의 완전히 보호된 중간체 에틸 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]에틸}-2,2-디메틸-6,9,14-트리옥소-5-옥사-7,10,13-트리아자-2-실라펜타데칸-15-일]아미노}-3-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부타노에이트를 수득하였다.
이어서, 49 mg (0.042 mmol)의 이 중간체를 12 ml의 THF/물 1:1 중 0.5 ml의 2-몰 수산화리튬 용액과 함께 실온에서 30분 동안 교반하여, 둘 다의 메틸 에스테르 기의 절단을 일으켰다. 산성화시키고 HPLC에 의해 정제하여 11 mg (이론치의 24%)의 디카르복실산 유도체를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.68분; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
최종적으로, 11 mg (0.01 mmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 완전히 탈보호시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 3.7 mg (이론치의 39%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.45분; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-3-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
위치이성질체 2, 에피머 2 (3R 또는 3S)
Figure pct00459
LC-MS (방법 5): Rt = 2.44분; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M15에 기재된 에피머 2 중간체를 실시예 M15에서의 설명과 유사하게 전환시켰다.
33.6 mg (0.079 mmol)의 에피머 2를 30 mg (0.079 mmol)의 HATU 및 13.4 mg (0.132 mmol)의 4-메틸모르폴린의 존재 하에 50 mg (0.066 mmol)의 중간체 C66과 커플링시켜, HPLC 정제 후, 51 mg (이론치의 63%)의 완전히 보호된 중간체 에틸 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]에틸}-2,2-디메틸-6,9,14-트리옥소-5-옥사-7,10,13-트리아자-2-실라펜타데칸-15-일]아미노}-3-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부타노에이트를 수득하였다.
이어서, 49 mg (0.042 mmol)의 이 중간체를 12 ml의 THF/물 1:1 중 0.5 ml의 2-몰 수산화리튬 용액과 함께 실온에서 30분 동안 교반하여, 둘 다의 메틸 에스테르 기의 절단을 일으켰다. 산성화시키고 HPLC에 의해 정제하여 13.4 mg (이론치의 28%)의 디카르복실산 유도체를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.66분; MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+.
최종적으로, 13.4 mg (0.012 mmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 완전히 탈보호시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 7.5 mg (이론치의 66%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.44분; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M17
(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부탄산 히드로클로라이드 (1:1)
Figure pct00460
150 mg (0.2 mmol)의 중간체 C53을 15 ml의 DMF 중에 용해시키고, 2.29 g (20.39 mmol)의 DABCO를 첨가하였다. 반응 혼합물을 초음파 조에서 30분 동안 처리하였다. 이어서, 1.17 ml의 아세트산을 첨가하여 혼합물을 pH 3-4가 되게 하고, 이를 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하고 적절한 분획을 실온에서 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴/물 1:1에 녹이고, 5 ml의 4N 염산을 첨가한 다음, 혼합물을 동결건조시켰다. 이와 같이 하여 81 mg (이론치의 68%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.69분; MS (EIpos): m/z = 514 [M+H]+.
실시예 M18
N-[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]-L-글루타민 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00461
먼저, 트리플루오로아세트산 / 벤질 N-(2-아미노에틸)-N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-글루타미네이트 (1:1)를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상의 지식인 방법에 의해 제조하였다. 이어서, HATU의 존재 하에, 이 중간체를 중간체 C58에 커플링시켰다. 후속적으로, 먼저 벤질옥시카르보닐 보호기 및 벤질 에스테르를 가수소분해적 절단에 의해 제거한 다음, 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐 보호기를 염화아연을 사용하여 제거하였다.
LC-MS (방법 6): Rt = 1.91분; MS (EIpos): m/z = 685 [M+H]+.
실시예 M19
N6-(N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐)-L-리신 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00462
먼저, 트리플루오로아세트산 / 2-(트리메틸실릴)에틸-N2-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리시네이트 (1:1)를 펩티드 화학에 공지된 통상적인 보호기 작업을 사용하여 제조하였다. 이어서, HATU의 존재 하에, 이 중간체를 중간체 C61에 커플링시켰다. 후속적으로, 먼저 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐 보호기 및 2-(트리메틸실릴)에틸 에스테르를 염화아연을 사용하여 절단시켰다. 최종적으로, 표제 화합물을 벤질옥시카르보닐 보호기를 가수소분해적 절단시키고 정제용 HPLC에 의해 정제하여 수득하였다.
HPLC (방법 11): Rt = 1.65분;
실시예 M20
(1R,4R,27R,33R)-1-아미노-32-(3-아미노프로필)-33-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-34,34-디메틸-6,9,25,31-테트라옥소-13,16,19,22-테트라옥사-3,29-디티아-7,10,26,32-테트라아자펜타트리아콘탄-1,4,27-트리카르복실산 / 트리플루오로아세트산 (1:2)
Figure pct00463
먼저, 메틸 L-시스테이네이트 히드로클로라이드 (1:1)를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}옥시)피롤리딘-2,5-디온을 사용하여 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테이네이트로 전환시켰다.
408 mg (1.93 mmol)의 상업적으로 입수가능한 3-브로모-4-메톡시-4-옥소부탄산 및 180 mg (0.644 mmol)의 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테이네이트를 8 ml의 DMF 중에 용해시키고, 147 mg (0.97 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 또 다른 136 mg (0.64 mmol)의 3-브로모-4-메톡시-4-옥소부탄산 및 147 mg (0.97 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 12시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시켜 151 mg (이론치의 57%)의 4-메톡시-3-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부탄산을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.74분; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H)-.
3.66 mg (8.93 μmol)의 4-메톡시-3-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부탄산을 3.66 mg (8.93 μmol)의 HATU 및 1.6 μl (15 μmol)의 4-메틸모르폴린의 존재 하에 13.0 mg (7.44 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-(글리실아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C80)과 커플링시켜, HPLC 정제 후, 3.9 mg (이론치의 37%)의 완전히 보호된 중간체 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-비스(메톡시카르보닐)-2,2-디메틸-6,13-디옥소-5-옥사-10-티아-7-아자-2-실라트리데칸-13-일]글리실}아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인을 수득하였다.
이어서, 3.90 mg (2.76 μmol)의 이 중간체를 1.0 ml의 THF/물 3:1 중 35 μl의 2-몰 수산화리튬 용액과 함께 실온에서 15분 동안 교반하여, 둘 다의 메틸 에스테르 기의 절단을 일으켰다. HPLC에 의해 정제하여 3.60 mg (이론치의 94%)의 디카르복실산 유도체를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.83분; MS (ESIpos): m/z = 1385 [M+H]+.
최종적으로, 3.6 mg (2.6 μmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 완전히 탈보호시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 1.92 mg (이론치의 55%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.72분; MS (ESIneg): m/z = 1094 [M-H]-.
실시예 M21
(2R,24S,27R)-27-아미노-2-[({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)메틸]-24-(카르복시메틸)-4,20,23-트리옥소-7,10,13,16-테트라옥사-25-티아-3,19,22-트리아자옥타코산-1,28-디온산 / 트리플루오로아세트산 (1:2)
Figure pct00464
742.8 mg (3.3 mmol)의 상업적으로 입수가능한 2-브로모-4-에톡시-4-옥소부탄산 및 802 mg (2.87 mmol)의 메틸 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테이네이트를 32 ml의 DMF 중에 용해시키고, 655.4 mg (4.31 mmol)의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔을 첨가하였다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 혼합물을 감압 하에 농축시키고 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고 용매를 감압 하에 증발시켜 521 mg (이론치의 43%)의 4-에톡시-2-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부탄산을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 3.13분; MS (ESIpos): m/z = 424 (M+H)+.
4.36 mg (10.3 μmol)의 4-에톡시-2-{[(2R)-3-메톡시-3-옥소-2-({[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}아미노)프로필]술파닐}-4-옥소부탄산을 3.92 mg (10.3 μmol)의 HATU 및 1.9 μl (17 μmol)의 4-메틸모르폴린의 존재 하에 15.0 mg (8.59 μmol)의 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-(글리실아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 C80)과 커플링시켜, HPLC 정제 후, 3.6 mg (이론치의 26%)의 완전히 보호된 중간체 S-(11-{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-7,11-디아자-2-실라트리데칸-13-일)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-에톡시-2-옥소에틸)-8-(메톡시카르보닐)-2,2-디메틸-6,12-디옥소-5-옥사-10-티아-7-아자-2-실라도데칸-12-일]글리실}아미노)-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸-1-오일]-L-시스테인을 수득하였다.
이어서, 6.20 mg (2.82 μmol)의 이 중간체를 1.0 ml의 THF/물 1:1 중 35 μl의 2-몰 수산화리튬 용액과 함께 실온에서 15분 동안 교반하여, 둘 다의 에스테르 기의 절단을 일으켰다. 산성화시키고 HPLC에 의해 정제하여 3.60 mg (이론치의 92%)의 디카르복실산 유도체를 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 4.71분; MS (ESIpos): m/z = 1385 [M+H]+.
최종적으로, 3.60 mg (1.69 μmol)의 이 중간체를 상기 기재된 바와 같이 트리플루오로에탄올 중 염화아연으로 완전히 탈보호시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 0.88 mg (이론치의 39%)의 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.72분; MS (ESIneg): m/z = 1094 [M-H]-.
실시예 M22
(2R,27R)-27-아미노-2-[({2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}술파닐)메틸]-24-(카르복시메틸)-4,20,23-트리옥소-7,10,13,16-테트라옥사-25-티아-3,19,22-트리아자옥타코산-1,28-디온산 / 트리플루오로아세트산 (1:2) 및
(1R,27R,33R)-1-아미노-32-(3-아미노프로필)-33-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-34,34-디메틸-6,9,25,31-테트라옥소-13,16,19,22-테트라옥사-3,29-디티아-7,10,26,32-테트라아자펜타트리아콘탄-1,4,27-트리카르복실산 / 트리플루오로아세트산 (1:2)
Figure pct00465
16.5 mg (0.015 mmol)의 S-{2-[(3-아미노프로필){(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}아미노]-2-옥소에틸}-N-[1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-2,18-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자옥타데칸-18-일]-L-시스테인 / 트리플루오로아세트산 (1:1) (중간체 F257) 및 8.18 mg (0.031 mmol)의 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}-L-시스테인을 2 ml의 DMF 중에 용해시키고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물 (28.9 mg)을 3 ml의 THF/물 1:1 중에 용해시켰다. 0.046 ml의 2M 수성 수산화리튬 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 5.2 μl (0.092 mmol)의 아세트산을 사용하여 ~7의 pH로 조정하였다. 반응 혼합물을 정제용 RP-HPLC (칼럼: 레프로실 125x30; 10μ, 유량: 50 ml/분, MeCN/물, 0.1% TFA)에 의해 직접 정제하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 잔류물을 고진공 하에 건조시켰다. 이와 같이 하여 12.1 mg (2 단계에 걸쳐 58%)의 위치이성질체 보호된 중간체를 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.82분; MS (ESIpos): m/z = 1240 (M+H)+.
최종 단계에서, 12.1 mg (0.009 mmol)의 이 중간체를 2 ml의 2,2,2-트리플루오로에탄올 중에 용해시켰다. 7.3 mg (0.054 mmol)의 염화아연을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 15.7 mg (0.054 mmol)의 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산을 첨가하고, 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 농축시키고 잔류물을 아세토니트릴/물로부터 동결건조시켜 6.4 mg (59%)의 표제 화합물을 위치이성질체 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 1096 (M+H)+.
실시예 M23
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-L-글루탐산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00466
먼저, 디-tert-부틸 L-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1)를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C61과 커플링시켰다. 이어서 보호된 중간체를 트리플루오로에탄올에 녹이고 염화아연의 존재 하에 50℃에서 밤새 교반함으로써 완전히 탈보호시켰다. EDTA를 첨가한 후, 후처리를 정제용 HPLC에 의한 정제에 의해 실시하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.45분; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+.
실시예 M24
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-베타-알라닐-D-글루탐산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00467
먼저, 디-tert-부틸 L-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1)를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C61에 커플링시켰다. 이어서 보호된 중간체를 트리플루오로에탄올에 녹이고 염화아연의 존재 하에 50℃에서 교반함으로써 완전히 탈보호시켰다. EDTA를 첨가한 후, 후처리를 정제용 HPLC에 의한 정제에 의해 실시하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.41분; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+.
실시예 M25
N-{(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}-L-글루탐산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00468
먼저, 디-tert-부틸 L-글루타메이트 히드로클로라이드 (1:1)를 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 중간체 C61과 커플링시켰다. 후속 단계에서, Z 보호기를 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 45분 동안의 수소화에 의해 제거하였다. 이어서, 부분적으로 보호된 중간체를 트리플루오로에탄올에 녹이고 염화아연의 존재 하에 50℃에서 7시간 동안 교반함으로써 완전히 탈보호시켰다. EDTA를 첨가한 후, 후처리를 정제용 HPLC에 의한 정제에 의해 실시하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.44분; MS (ESIpos): m/z = 643 [M+H]+.
실시예 M26
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-2-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
위치이성질체 1, 에피머 혼합물
Figure pct00469
본 실시예는 실시예 13 및 실시예 14로부터의 화합물의 에피머 혼합물을 기재한다. 합성을 실시예 13과 유사하게 실시하며, 초임계 유체 크로마토그래피에 의한 2종의 에피머의 분리를 생략하고 표제 화합물을 에피머 혼합물로서 제조하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.43분; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-3-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]술파닐}-4-옥소부탄산 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
위치이성질체 2, 에피머 혼합물
Figure pct00470
본 실시예는 실시예 15 및 실시예 16으로부터의 화합물의 에피머 혼합물을 기재한다. 합성을 실시예 15와 유사하게 실시하여, 초임계 유체 크로마토그래피에 의한 2종의 에피머의 분리를 생략하고 표제 화합물을 에피머 혼합물로서 제조하였다.
LC-MS (방법 5): Rt = 2.45분; MS (EIpos): m/z = 832 [M+H]+.
실시예 M28
N6-{(3R,7S)-7-아미노-3-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-4-글리콜로일-2,2-디메틸-8,13,16,20-테트라옥소-4,9,12,15-테트라아자이코산-20-일}-L-리신 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00471
표제 화합물을 중간체 C66으로부터 펩티드 화학의 통상적인 방법에 의해, 먼저 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]-디피롤리딘-2,5-디온에 커플링시켜 2-(트리메틸실릴)에틸 [(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-({2-[(N-{5-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-5-옥소펜타노일}글리실)아미노]에틸}아미노)-1-옥소부탄-2-일]카르바메이트를 수득함으로써 제조하였다. 후속 단계에서, 마찬가지로 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서, tert-부틸 N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-리시네이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시킨 후, 최종 단계에서, 이어서, 보호기를 50℃에서 3시간 동안 교반함으로써 트리플루오로에탄올 중 6 당량의 염화아연으로 분리시켰다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.74분; MS (ESIpos): m/z = 855 [M+H]+.
실시예 M29
N6-(5-{[2-({(2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]부타노일}아미노)에틸]아미노}-5-옥소펜타노일)-L-리신 / 트리플루오로아세트산 (1:1)
Figure pct00472
먼저, (2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸 프로필}(글리콜로일)아미노]-2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]부탄산을 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시켰다. 이어서 Z 보호기를 메탄올 중 활성탄 상 10% 팔라듐 상에서 실온에서 수소 표준 압력 하에 45분 동안의 수소화에 의해 분리시켰다. 이어서, 실시예 M28과 유사하게, 1,1'-[(1,5-디옥소펜탄-1,5-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온에 커플링시켰다. 후속 단계에서, 중간체를 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 tert-부틸 N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-리시네이트 히드로클로라이드 (1:1)에 커플링시킨 후, 최종 단계에서, 이어서, 모든 보호기를 50℃에서 5.5시간 동안 교반함으로써 트리플루오로에탄올 중 8 당량의 염화아연으로 분리시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
LC-MS (방법 12): Rt = 1.28분; MS (ESIneg): m/z = 796 [M-H]+.
APDC 및 ADC의 작업 실시예
말레이미드 라디칼을 통해 항체의 시스테인 측쇄에 커플링된, 작업 실시예의 구조식에 제시된 APDC 및 ADC는 링커 및 커플링 절차에 따라, 주로 각각의 경우에 제시된 개환 또는 폐환 형태로 존재한다. 그러나, 제제는 작은 비율의 각각의 다른 형태를 포함할 수 있다.
커플링 반응을 아르곤 하에 수행하였다.
실시예 1a
Figure pct00473
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.028 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.25 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R1을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석한 다음, PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 이어서, 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.85 mg/ml
약물/mAb 비: 2.6
실시예 1e
유사한 방식으로, 중간체 R1을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.85 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 1k
유사한 방식으로, 중간체 R1을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.42 mg/ml
약물/mAb 비: 2.9
실시예 2a
Figure pct00474
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.27 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R2를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 1.942 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.99 mg/ml
약물/mAb 비: 2.6
실시예 2e
유사한 방식으로, 중간체 R2를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.6 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 2k
유사한 방식으로, 중간체 R2를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.05 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 3a
Figure pct00475
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.28 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R3을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응물을 pH 8로 미리 조정된 1.942 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.07 mg/ml
약물/mAb 비: 2.2
실시예 3e
유사한 방식으로, 중간체 R3을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.85 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 3h1
아르곤 하에, 0.75 ml의 PBS 완충제 (pH 7.2) 중 0.46 mg의 TCEP의 용액을 5.1 ml의 PBS 중 80 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382 (c = 15.7 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 585 μl의 DMSO 중에 용해된 4.41 mg (0.0037 mmol)의 중간체 R3을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 7.5 ml로 희석한 다음, PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 여러 부분으로 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 합하고, PBS 완충제 pH 8로 12.5 ml로 희석하고 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 7.2로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 7.2로 용리시켰다. 이어서 교차흐름 농축시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 13.86 mg/ml
약물/mAb 비: 4.8
실시예 3h2
유사한 방식으로, 중간체 R3을 50 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8567에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 9.64 mg/ml
약물/mAb 비: 4.3
실시예 3k
유사한 방식으로, 중간체 R3을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.47 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 3l1
아르곤 하에, 0.3 ml의 PBS 완충제 (pH 7.2) 중 0.172 mg의 TCEP의 용액을 3.4 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007 (c = 8.8 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 300 μl의 DMSO 중에 용해된 1.66 mg (0.0014 mmol)의 중간체 R3을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 5 ml로 희석한 다음, PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 여러 부분으로 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 합하고, PBS 완충제 pH 8로 7.5 ml로 희석하고 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 7.2로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 7.2로 용리시켰다. 이어서, 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하고 재농축시키고 다시 멸균-여과하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 8.86 mg/ml
약물/mAb 비: 4.4
실시예 3l2
유사한 방식으로, 중간체 R3을 4.16 ml의 PBS 중 48.5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7006 (c = 11.6 mg/ml)에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 11.4 mg/ml
약물/mAb 비: 2.5
실시예 3l3
유사한 방식으로, 중간체 R3을 2.61 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-10336 (c = 11.5 mg/ml)에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 7.72 mg/ml
약물/mAb 비: 2.5
실시예 3l4
유사한 방식으로, 중간체 R3을 2.78 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-10337 (c = 10.8 mg/ml)에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 9.33 mg/ml
약물/mAb 비: 2.7
실시예 4a
Figure pct00476
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.23 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R4를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 1.9 ml의 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석한 다음, PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 이어서, 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.29 mg/ml
약물/mAb 비: 2.5
실시예 4e
유사한 방식으로, 중간체 R4를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.75 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
실시예 4k
유사한 방식으로, 중간체 R4를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.73 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 5a
Figure pct00477
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R5를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 1.942 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 실온에서 아르곤 하에 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.91 mg/ml
약물/mAb 비: 2.7
실시예 5e
유사한 방식으로, 중간체 R5를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.40 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 5k
유사한 방식으로, 중간체 R5를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.85 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 6a
Figure pct00478
459 μl의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)을 여기서 중간체 R6에 대한 커플링에 사용하였다. 먼저, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.2 mg)의 중간체 R6을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.04 mg/ml
약물/mAb 비: 2.1
실시예 6e
유사한 방식으로, 중간체 R6을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.74 mg/ml
약물/mAb 비: 2.0
실시예 6k
유사한 방식으로, 중간체 R6을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.0 mg/ml
약물/mAb 비: 2.4
실시예 7a
Figure pct00479
아르곤 하에 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.19 mg)의 중간체 R7의 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.29 mg/ml
약물/mAb 비: 2.9
실시예 7e
유사한 방식으로, 중간체 R7을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.95 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 7k
유사한 방식으로, 중간체 R7을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.60 mg/ml
약물/mAb 비: 5.3
실시예 8a
Figure pct00480
아르곤 하에 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.2 mg)의 중간체 R8의 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 1.57 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 8e
유사한 방식으로, 중간체 R8을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.25 mg/ml
약물/mAb 비: 4.8
실시예 8k
유사한 방식으로, 중간체 R8을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.15 mg/ml
약물/mAb 비: 7.0
실시예 9a
Figure pct00481
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R9를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 1.9 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 실온에서 아르곤 하에 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.95 mg/ml
약물/mAb 비: 2.7
실시예 9e
유사한 방식으로, 중간체 R9를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.88 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
실시예 9h1
아르곤 하에, 0.5 ml의 PBS 완충제 (pH 7.2) 중 0.23 mg의 TCEP의 용액을 2.55 ml의 PBS 중 30 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382 (c = 15.69 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 250 μl의 DMSO 중에 용해된 2.07 mg (0.00187 mmol)의 중간체 R9를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 5 ml로 희석하고, 나눈 다음, 각각의 부분을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 합하고, PBS 완충제 pH 8로 7.5 ml로 희석하고 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 7.2로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 7.2로 용리시켰다. 이어서, 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하고 재농축시키고 다시 멸균-여과하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 8.46 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
실시예 9h2
유사한 방식으로, 중간체 R9를 3 ml의 PBS 중 30 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8567 (c = 10 mg/ml)에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 8.08 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 9k
유사한 방식으로, 중간체 R9를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.81 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
실시예 10k
Figure pct00482
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.028 mg의 TCEP의 용액을 0.24 ml의 PBS 중 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658 (c = 20.9 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 2.11 ml의 PBS 완충제로 희석하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 100 μl의 DMSO 중에 용해된 0.25 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R10을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.0
약물/mAb 비: 0
실시예 10h1
실시예 9h1과 유사한 방식으로, 중간체 R10을 30 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 10.95 mg/ml
약물/mAb 비: 4.4
실시예 11a
Figure pct00483
아르곤 하에 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.2 mg)의 중간체 R11의 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.2 mg/ml
약물/mAb 비: 4.0
실시예 11e
유사한 방식으로, 중간체 R11을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.13 mg/ml
약물/mAb 비: 4.4
실시예 11k
유사한 방식으로, 중간체 R11을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 0.98 mg/ml
약물/mAb 비: 6.0
실시예 12a
Figure pct00484
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.25 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R12를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응물을 pH 8로 미리 조정된 1.9 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.0 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 12e
유사한 방식으로, 중간체 R12를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.88 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
실시예 12k
유사한 방식으로, 중간체 R12를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.98 mg/ml
약물/mAb 비: 4.2
실시예 13a
Figure pct00485
아르곤 하에 0.55 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 9 mg/ml)에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.21 mg)의 중간체 R13의 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.1 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 13e
유사한 방식으로, 중간체 R13을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.01 mg/ml
약물/mAb 비: 4.1
실시예 13k
유사한 방식으로, 중간체 R13을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.07 mg/ml
약물/mAb 비: 4.5
실시예 14a
Figure pct00486
아르곤 하에 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.19 mg)의 중간체 R14의 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.04 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 14e
유사한 방식으로, 중간체 R14를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.79 mg/ml
약물/mAb 비: 5.9
실시예 14k
유사한 방식으로, 중간체 R14를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.07 mg/ml
약물/mAb 비: 5.4
실시예 15a
Figure pct00487
0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.9 mg/ml)을 아르곤 하에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.2 mg)의 중간체 R15의 용액과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.31 mg/ml
약물/mAb 비: 5.5
실시예 15e
유사한 방식으로, 중간체 R15를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.89 mg/ml
약물/mAb 비: 6.8
실시예 15h1
1.91 ml의 PBS 중 30 mg의 B7H3 항체 TPP-8382 (c=15.7 mg/ml)를 아르곤 하에 200 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (1.2 mg)의 중간체 R15의 용액과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 혼합물을 PBS 완충제 (pH7.2)로 2.5 ml로 희석하고 세파덱스 칼럼을 사용하여 정제하였다. 이어서, 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하고 재농축시키고 다시 멸균-여과하였다.
단백질 농도: 10.39 mg/ml
약물/mAb 비: 5.6
실시예 15k
유사한 방식으로, 중간체 R15를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.92 mg/ml
약물/mAb 비: 8.1
실시예 15l1
유사한 방식으로, 중간체 R15를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 과량의 R15는 여기서 10 당량 내지 5 당량으로 감소되었다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.64 mg/ml
약물/mAb 비: 2.2
실시예 16a
Figure pct00488
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.076 mg의 TCEP의 용액을 0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 150분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.811 mg (0.000533 mmol)의 중간체 R16을 첨가하였다. 실온에서 추가로 120분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 1.95 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.20 mg/ml
약물/mAb 비: 7.3
실시예 16e
유사한 방식으로, 중간체 R16을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.25 mg/ml
약물/mAb 비: 7.3
실시예 16h1
아르곤 하에, 0.4 ml의 PBS 완충제 중 0.77 mg의 TCEP의 용액을 3.19 ml의 PBS 중 50 mg의 B7H3 항체 TPP-8382 (c = 15.7 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 150분 동안 교반하였다. 이어서, 400 μl의 DMSO 중에 용해된 16 당량 (8.1 mg)의 중간체 R16을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 PBS 완충제 (pH8)로 5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 0.5 ml의 PBS 완충제 pH 8로 희석하고 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 9.56 mg/ml
약물/mAb 비: 7.2
실시예 16h2
2.79 ml의 PBS 중 40 mg의 B7H3 항체 TPP-8567 (c = 14.4 mg/ml)을 중간체 R16과 유사한 방식으로 커플링시켰다.
단백질 농도: 9.93 mg/ml
약물/mAb 비: 7.9
실시예 16k
유사한 방식으로, 중간체 R16을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.36 mg/ml
약물/mAb 비: 7.4
실시예 16l2
1.514 ml의 PBS 중 25 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7006 (c = 16.5 mg/ml)을 16h1 하에 기재된 바와 같이 중간체 R16에 커플링시켰다.
단백질 농도: 11.54 mg/ml
약물/mAb 비: 8.0
실시예 17a
Figure pct00489
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.086 mg의 TCEP의 용액을 0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10.92 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 150분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 1.07 mg (0.00060 mmol)의 중간체 R17을 첨가하였다. 실온에서 추가로 120분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 1.95 ml의 PBS 완충제로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.2 mg/ml
약물/mAb 비: 5.5
실시예 17e
유사한 방식으로, 중간체 R17을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.71 mg/ml
약물/mAb 비: 4.3
실시예 17h1
유사한 방식으로, 중간체 R17을 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.52 mg/ml
약물/mAb 비: 5.1
실시예 17k
유사한 방식으로, 중간체 R17을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.65 mg/ml
약물/mAb 비: 5.4
실시예 18a
Figure pct00490
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R18을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.82 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 18e
유사한 방식으로, 중간체 R18을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.7 mg/ml
약물/mAb 비: 4.1
실시예 18h1
유사한 방식으로, 중간체 R18을 5 mg의 항-B7H3 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.71 mg/ml
약물/mAb 비: 4.5
실시예 18k
유사한 방식으로, 중간체 R18을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.69 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 19a
Figure pct00491
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.25 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R19를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.88 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
실시예 19e
유사한 방식으로, 중간체 R19를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.7 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 19k
유사한 방식으로, 중간체 R19를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.35 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
실시예 20a
Figure pct00492
0.3 ml의 PBS 중 3 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)을 아르곤 하에 30 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.268 mg)의 중간체 R20의 용액과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.35 mg/ml
약물/mAb 비: 5.3
실시예 20e
유사한 방식으로, 중간체 R20을 3 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.94 mg/ml
약물/mAb 비: 7.1
실시예 20h1
유사한 방식으로, 중간체 R20을 3 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.12 mg/ml
약물/mAb 비: 5.9
실시예 20k
유사한 방식으로, 중간체 R20을 3 mg의 항-B7H3 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.21 mg/ml
약물/mAb 비: 6.8
실시예 21a
Figure pct00493
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.31 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R21을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.17 mg/ml
약물/mAb 비: 5.6
실시예 21e
유사한 방식으로, 중간체 R21을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.99 mg/ml
약물/mAb 비: 3.8
실시예 21h1
유사한 방식으로, 중간체 R21을 5 mg의 항-B7H3 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.08 mg/ml
약물/mAb 비: 4.6
실시예 21k
유사한 방식으로, 중간체 R21을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.13 mg/ml
약물/mAb 비: 4.4
실시예 22a
Figure pct00494
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R22를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.99 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
실시예 22e
유사한 방식으로, 중간체 R22를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.9 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 22h1
실시예 9h1과 유사한 방식으로, 중간체 R22를 3 ml의 PBS 중 30 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 8.74 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 22h2
유사한 방식으로, 중간체 R22를 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8567에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.11 mg/ml
약물/mAb 비: 4.7
실시예 22k
유사한 방식으로, 중간체 R22를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.79 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 23a
Figure pct00495
0.55 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 9.1 mg/ml)을 아르곤 하에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.24 mg)의 중간체 R23의 용액과 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.13 mg/ml
약물/mAb 비: 6.1
실시예 23e
유사한 방식으로, 중간체 R23을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.02 mg/ml
약물/mAb 비: 7.6
실시예 23h1
실시예 15h1과 유사한 방식으로, 중간체 R23을 30 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 9.97 mg/ml
약물/mAb 비: 6.4
실시예 23k
유사한 방식으로, 중간체 R23을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.24 mg/ml
약물/mAb 비: 7.3
실시예 24a
Figure pct00496
0.458 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c=10.9 mg/ml)을 아르곤 하에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.24 mg)의 중간체 R24의 용액과 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.2 mg/ml
약물/mAb 비: 4.7
실시예 24e
유사한 방식으로, 중간체 R24를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.89 mg/ml
약물/mAb 비: 5.8
실시예 24k
유사한 방식으로, 중간체 R24를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.21 mg/ml
약물/mAb 비: 5.7
실시예 24l1
2.52 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007의 용액 (c = 11.9 mg/ml)에, 아르곤 하에, 100 μl의 DMSO 중에 용해된 1.2 mg (0.001 mmol)의 중간체 R24를 첨가하였다. 실온에서 60분 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS (pH 7.2)로 재희석하고 재농축시키고 다시 멸균-여과하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 10.5 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 24l3
유사한 방식으로, 중간체 R24를 2.61 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-10336 (c = 11.5 mg/ml)에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 10.46 mg/ml
약물/mAb 비: 5.0
실시예 24l4
유사한 방식으로, 중간체 R24를 2.78 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-10337 (c = 10.8 mg/ml)에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 7.85 mg/ml
약물/mAb 비: 3.7
실시예 25a
Figure pct00497
0.55 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 9.1 mg/ml)을 아르곤 하에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.23 mg)의 중간체 R25의 용액과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.07 mg/ml
약물/mAb 비: 4.5
실시예 25e
유사한 방식으로, 중간체 R25를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.42 mg/ml
약물/mAb 비: 5.5
실시예 25h1
유사한 방식으로, 중간체 R25를 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.82 mg/ml
약물/mAb 비: 5.7
실시예 25k
유사한 방식으로, 중간체 R25를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.16 mg/ml
약물/mAb 비: 5.6
실시예 26a
Figure pct00498
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R26을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.94 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
실시예 26e
유사한 방식으로, 중간체 R26을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.86 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 26h1
유사한 방식으로, 중간체 R26을 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.0 mg/ml
약물/mAb 비: 4.0
실시예 26k
유사한 방식으로, 중간체 R26을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.75 mg/ml
약물/mAb 비: 3.7
실시예 27a
Figure pct00499
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.23 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R27을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.65 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
실시예 27e
유사한 방식으로, 중간체 R27을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.67 mg/ml
약물/mAb 비: 4.0
실시예 27h1
유사한 방식으로, 중간체 R27을 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.86 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 27k
유사한 방식으로, 중간체 R27을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.8 mg/ml
약물/mAb 비: 4.4
실시예 28a
Figure pct00500
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R28을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.68 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 28e
유사한 방식으로, 중간체 R28을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.55 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 28h1
유사한 방식으로, 중간체 R28을 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.95 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 28l1
아르곤 하에, 0.25 ml의 PBS 완충제 (pH 7.2) 중 0.17 mg의 TCEP의 용액을 2.5 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007 (c = 12 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 250 μl의 DMSO 중에 용해된 1.57 mg (0.0014 mmol)의 중간체 R28을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 5 ml로 희석하고, 나눈 다음, 각각의 부분을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 합하고, PBS 완충제 pH 8로 7.5 ml로 희석하고 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 7.2로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 7.2로 용리시켰다. 이어서, 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하고 재농축시키고 다시 멸균-여과하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 8.2 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
실시예 29a
Figure pct00501
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.34 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R29를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.66 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 29e
유사한 방식으로, 중간체 R29를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.24 mg/ml
약물/mAb 비: 3.8
실시예 29h1
유사한 방식으로, 중간체 R29를 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.54 mg/ml
약물/mAb 비: 2.6
실시예 29k
유사한 방식으로, 중간체 R29를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.63 mg/ml
약물/mAb 비: 3.8
실시예 30a
Figure pct00502
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R30을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.74 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 30e
유사한 방식으로, 중간체 R30을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.82 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 30k
유사한 방식으로, 중간체 R30을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.7 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 31a
Figure pct00503
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.26 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R31을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.4 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
실시예 31e
유사한 방식으로, 중간체 R31을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.76 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
실시예 31h1
실시예 9h1과 유사한 방식으로, 중간체 R31을 2 ml의 PBS 중 20 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 9.45 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 31l1
아르곤 하에, 0.3 ml의 PBS 완충제 (pH 7.2) 중 0.17 mg의 TCEP의 용액을 3.4 ml의 PBS 중 30 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007 (c = 8.8 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 250 μl의 DMSO 중에 용해된 1.68 mg (0.0014 mmol)의 중간체 R31을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 5 ml로 희석하고, 나눈 다음, 각각의 부분을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 통과시키고, PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 다시 합하고, PBS 완충제 pH 8로 7.5 ml로 희석하고 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 7.2로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 7.2로 용리시켰다. 이어서, 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하고 재농축시키고 다시 멸균-여과하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 8.06 mg/ml
약물/mAb 비: 4.1
실시예 32a
Figure pct00504
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.29 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R32를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.84 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 32e
유사한 방식으로, 중간체 R32를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.82 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 32k
유사한 방식으로, 중간체 R32를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.88 mg/ml
약물/mAb 비: 3.7
실시예 33a
Figure pct00505
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.27 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R33을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.13 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 33e
유사한 방식으로, 중간체 R33을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.93 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 33h1
유사한 방식으로, 중간체 R33을 5 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.81 mg/ml
약물/mAb 비: 4.5
실시예 33l1
유사한 방식으로, 중간체 R33을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.86 mg/ml
약물/mAb 비: 3.8
실시예 34a
Figure pct00506
0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)을 아르곤 하에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.15 mg)의 중간체 R34의 용액과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 1.84 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 34e
유사한 방식으로, 중간체 R34를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.75 mg/ml
약물/mAb 비: 4.3
실시예 34l1
유사한 방식으로, 중간체 R34를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.76 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 35a
Figure pct00507
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.32 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R35를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.72 mg/ml
약물/mAb 비: 4.3
실시예 35e
유사한 방식으로, 중간체 R35를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.57 mg/ml
약물/mAb 비: 4.4
실시예 35k
유사한 방식으로, 중간체 R35를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.73 mg/ml
약물/mAb 비: 4.3
실시예 35l1
중간체 R35를 2.5 ml의 PBS 중 25 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 실시예 31l1과 유사하게 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 11.55 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 36a
Figure pct00508
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.3 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R36을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.95 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
실시예 36e
유사한 방식으로, 중간체 R36을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.42 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
실시예 36l1
유사한 방식으로, 중간체 R36을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.94 mg/ml
약물/mAb 비: 2.7
실시예 37a
Figure pct00509
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.32 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R37을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.77 mg/ml
약물/mAb 비: 4.2
실시예 37e
유사한 방식으로, 중간체 R37을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.44 mg/ml
약물/mAb 비: 4.6
실시예 37k
유사한 방식으로, 중간체 R37을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.53 mg/ml
약물/mAb 비: 4.0
실시예 37l1
중간체 R37을 실시예 31l1과 유사하게 2.5 ml의 PBS 중 25 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 11.46 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 38a
Figure pct00510
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.4 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 12.5 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.23 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R38을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.02 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 38e
유사한 방식으로, 중간체 R38을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.77 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 38l1
유사한 방식으로, 중간체 R38을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.06 mg/ml
약물/mAb 비: 4.0
실시예 39a
Figure pct00511
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.3 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R39를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.01 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 39e
유사한 방식으로, 중간체 R39를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.85 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 39l1
유사한 방식으로, 중간체 R39를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.84 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 40a
Figure pct00512
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.31 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R40을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.85 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
실시예 40e
유사한 방식으로, 중간체 R40을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.05 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 40l1
유사한 방식으로, 중간체 R40을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.98 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 41a
Figure pct00513
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.27 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R41을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.02 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 41e
유사한 방식으로, 중간체 R41을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.08 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 41l1
유사한 방식으로, 중간체 R41을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.94 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 42a
Figure pct00514
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.29 mg (0.00027 mmol)의 중간체 R42를 첨가하였다. 실온에서 추가로 4시간 동안 교반한 후, 혼합물을 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.68 mg/ml
약물/mAb 비: 2.6
실시예 42e
유사한 방식으로, 중간체 R42를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.09 mg/ml
약물/mAb 비: 3.0
실시예 42l1
유사한 방식으로, 중간체 R42를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.7 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 43a
Figure pct00515
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.4 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 12.5 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.22 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R43을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.08 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
실시예 43e
유사한 방식으로, 중간체 R43을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.9 mg/ml
약물/mAb 비: 3.6
실시예 43l1
유사한 방식으로, 중간체 R38을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.57 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
실시예 44e
Figure pct00516
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.023 mg의 TCEP의 용액을 0.4 ml의 PBS 중 4 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.18 mg (0.00019 mmol)의 중간체 R44를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.59 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 44l1
유사한 방식으로, 중간체 R45를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.57 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 45a
Figure pct00517
0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c=10 mg/ml)을 아르곤 하에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.16 mg)의 중간체 R45의 용액과 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼 상에서 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 재희석하였다.
단백질 농도: 2.14 mg/ml
약물/mAb 비: 4.6
실시예 45e
유사한 방식으로, 중간체 R45를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.84 mg/ml
약물/mAb 비: 4.9
실시예 45l1
유사한 방식으로, 중간체 R45를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.01 mg/ml
약물/mAb 비: 4.3
실시예 46a
Figure pct00518
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.21 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R46을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.83 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
실시예 46e
유사한 방식으로, 중간체 R46을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.71 mg/ml
약물/mAb 비: 2.9
실시예 46l1
유사한 방식으로, 중간체 R46을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.78 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
실시예 47a
Figure pct00519
아르곤 하에, 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 0.45 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 11 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.275 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R47을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.77 mg/ml
약물/mAb 비: 3.9
실시예 47e
유사한 방식으로, 중간체 R47을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.43 mg/ml
약물/mAb 비: 4.0
실시예 47l1
유사한 방식으로, 중간체 R47을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.60 mg/ml
약물/mAb 비: 4.1
실시예 48a
Figure pct00520
아르곤 하에 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 0.05 ml의 PBS 완충제 중 0.029 mg의 TCEP의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 50 μl의 DMSO 중에 용해된 0.29 mg (0.00023 mmol)의 중간체 R48을 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 pH 8로 미리 조정된 PBS 완충제로 2.5 ml의 부피로 희석하였다. 이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH8로 용리시켰다. 용리액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다.
이어서, 이 용액을 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하였다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.75 mg/ml
약물/mAb 비: 4.1
실시예 48e
유사한 방식으로, 중간체 R48을 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.72 mg/ml
약물/mAb 비: 4.7
실시예 48l1
유사한 방식으로, 중간체 R48을 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.71 mg/ml
약물/mAb 비: 2.4
실시예 49a
Figure pct00521
아르곤 하에 0.5 ml의 PBS 중 5 mg의 세툭시맙 (c = 10 mg/ml)에 50 μl의 DMSO 중에 용해된 5 당량 (0.47 mg)의 중간체 R34의 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 동일한 양을 다시 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 후속적으로, 혼합물을 PBS 완충제 (pH 7.2)로 2.5 ml로 희석하고, 세파덱스 칼럼에 의해 정제한 다음, 초원심분리에 의해 농축시키고 PBS (pH 7.2)로 2.5 ml로 재희석하였다.
수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.31 mg/ml
약물/mAb 비: 5.6
실시예 49e
유사한 방식으로, 중간체 R34를 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-1015에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.12 mg/ml
약물/mAb 비: 7.1
실시예 49l1
유사한 방식으로, 중간체 R34를 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-7007에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.25 mg/ml
약물/mAb 비: 5.8
실시예 50dt-2
Figure pct00522
540 μl의 DPBS pH 7.2 중 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658 (TPP-2090-HC-N297A에 상응함)의 용액 (c ~ 10mg/ml)에 DMSO 중 20 μl의 중간체 R50의 10 mmol 용액을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션 후, 물 중 40 μl의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.2로 2.5 ml의 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 (밀리포어)에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 12.5 μl의 DPBS 중 0.005 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 수득된 ADC 용액은 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.71 mg/ml
약물/mAb 비: 1.9
실시예 50dt-4
Figure pct00523
DPBS pH 7.2 중 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-5442 (TPP-2090-HC-N297Q에 상응함)의 용액 (c = 7.4 mg/ml)에 DMSO 중 80 μl의 중간체 R50의 10 mmol 용액을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션 후, 물 중 400 μl의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.2로 2.5 ml의 총 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 (밀리포어)에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 약 2.5 ml의 부피로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 200 μl의 DPBS 중 0.1 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 수득된 ADC 용액은 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.69 mg/ml
약물/mAb 비: 3.7
실시예 50et-4
Figure pct00524
DPBS pH 7.2 중 5 mg의 항-HER2 항체 TPP-7511 (항-HER2 항체-HC-N297Q에 상응함)의 용액 (c = 10 mg/ml)에 DMSO 중 80 μl의 중간체 R50의 10 mmol 용액을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션 후, 물 중 400 μl의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.2로 2.5 ml의 총 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 (밀리포어)에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 약 2.5 ml의 부피로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 200 μl의 DPBS 중 0.1 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 수득된 ADC 용액은 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.64 mg/ml
약물/mAb 비: 3.8
실시예 51dt-2
Figure pct00525
530 μl의 DPBS pH 7.2 중 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658 (TPP-2090-HC-N297A에 상응함)의 용액 (c ~ 10mg/ml)에 DMSO 중 20 μl의 중간체 R51의 10 mmol 용액을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션 후, 물 중 50 μl의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 추가로 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.2로 2.5 ml의 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 (밀리포어)에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 12.5 μl의 DPBS 중 0.005 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 수득된 ADC 용액은 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 2.08 mg/ml
약물/mAb 비: 1.9
실시예 51dt-4
Figure pct00526
DPBS pH 7.2 중 5 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-5442 (TPP-2090-HC-N297Q에 상응함)의 용액 (c = 10 mg/ml)에 DMSO 중 53 μl의 중간체 R51의 10 mmol 용액을 첨가하였다. 37℃에서 5분 동안 인큐베이션 후, 물 중 400 μl의 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제 용액의 용액 (제디라 게엠베하 (독일 다름슈타트)로부터의 제품 번호 T001) (25 U/ml)을 첨가하고 인큐베이션을 37℃에서 24시간 동안 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 DPBS pH 7.2로 2.5 ml의 총 부피로 희석하고 DPBS-평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)을 통해 겔 여과에 의해 통과시키고 pH 7.4의 DPBS 완충제로 용리시켰다. 후속적으로, ADC 용액을 아미콘 울트라셀-30K 원심분리 (밀리포어)에 의해 농축시키고, 이를 DPBS로 약 2.5 ml의 부피로 다시 재희석하였다. 최종적으로, 200 μl의 DPBS 중 0.05 μmol의 b-트랜스글루타미나제 차단제 제디라 C100을 용액에 첨가하였다. 수득된 ADC 용액은 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 1.56 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
참조 실시예: 소분자, APDC 및 ADC
먼저, 다양한 조건 하의 레구마인-매개 절단 및 안정성을 검사하기 위해, 레구마인-절단가능한 전구약물 R3r-LLL 및 R3r-LDL을 제조하였다.
또한, 대표적인 참조 화합물로서, 본 발명에 따른 레구마인-절단가능한 APDC 및 ADC의 에피머를 제조하였으며, 여기서 레구마인-절단가능한 링커 내의 모든 아미노산은 천연 L 배위로 존재한다 (참조 실시예 R3a,e,k; R4a,e,k; R5a,e,k 및 R9a,e,k)
최종적으로, 종양 및 다른 조직에서의 활성 대사물의 농도를 결정하기 위해 (-> 챕터 C5b), 실시예 3k (레구마인-절단가능한 기를 포함함)와의 비교를 위해, 참조 ADC R10k 및 R10h1 (레구마인-절단가능한 기를 포함하지 않음)을 제조하였다. 둘 다의 ADC는 동일한 활성 대사물을 형성하기 때문에, 따라서 본 발명에 따른 레구마인-절단가능한 기의 그의 기관 분포에 대한 효과를 검사하는 것이 가능하다.
참조 실시예 R3r-LLL
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-L-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00527
먼저, 트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-메틸부탄아미드 (1:1)를 WO 2015096982 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 후속적으로, 이 중간체를 사용하여 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L103에 커플링시킴으로써 표제 화합물을 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.86분; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H]+.
참조 실시예 R3r-LDL
N-(피리딘-4-일아세틸)-L-알라닐-D-알라닐-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일]-L-아스파르트아미드
Figure pct00528
먼저, 트리플루오로아세트산 / (2S)-2-아미노-4-[{(1R)-1-[1-벤질-4-(2,5-디플루오로페닐)-1H-피롤-2-일]-2,2-디메틸프로필}(글리콜로일)아미노]-N-메틸부탄아미드 (1:1)를 WO 2015096982 A1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 후속적으로, 이 중간체를 사용하여 HATU 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재 하에 DMF 중에서 중간체 L110에 커플링시킴으로써 표제 화합물을 제조하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.88분; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H]+.
참조 실시예 R3a
Figure pct00529
제조를 실시예 3a와 유사하게 실시하였다.
단백질 농도: 1.99 mg/ml
약물/mAb 비: 2.6
마찬가지로, 유사한 방식으로, 참조 실시예 R3e를 항-HER2 항체 TPP-1015를 사용하여 제조하고, 참조 실시예 R3k를 항-TWEAKR 항체 TPP-2658을 사용하여 제조하였다:
참조 실시예 R3e
단백질 농도: 1.70 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
참조 실시예 R3k
단백질 농도: 1.71 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
참조 실시예 R4a
Figure pct00530
제조를 실시예 4a와 유사하게 실시하였다.
단백질 농도: 1.87 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
마찬가지로, 유사한 방식으로, 참조 실시예 R4e를 항-HER2 항체 TPP-1015를 사용하여 제조하고, 참조 실시예 R4k를 항-TWEAKR 항체 TPP-2658을 사용하여 제조하였다:
참조 실시예 R4e
단백질 농도: 1.70 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
참조 실시예 R4k
단백질 농도: 1.79 mg/ml
약물/mAb 비: 3.3
참조 실시예 R5a
Figure pct00531
제조를 실시예 5a와 유사하게 실시하였다.
단백질 농도: 2.02 mg/ml
약물/mAb 비: 3.5
마찬가지로, 유사한 방식으로, 참조 실시예 R5e를 항-HER2 항체 TPP-1015를 사용하여 제조하고, 참조 실시예 R5k를 항-TWEAKR 항체 TPP-2658을 사용하여 제조하였다:
참조 실시예 R5e
단백질 농도: 1.72 mg/ml
약물/mAb 비: 4.2
참조 실시예 R5k
단백질 농도: 1.79 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
참조 실시예 R9a
Figure pct00532
제조를 실시예 9a와 유사하게 실시하였다.
단백질 농도: 1.57 mg/ml
약물/mAb 비: 2.4
마찬가지로, 유사한 방식으로, 참조 실시예 R9e를 항-HER2 항체 TPP-1015를 사용하여 제조하고, 참조 실시예 R9k를 항-TWEAKR 항체 TPP-2658을 사용하여 제조하였다:
참조 실시예 R9e
단백질 농도: 1.79 mg/ml
약물/mAb 비: 3.1
참조 실시예 R9k
단백질 농도: 0.68 mg/ml
약물/mAb 비: 2.8
참조 실시예 R10k
Figure pct00533
아르곤 하에, 2 ml의 PBS 완충제 중 0.86 mg의 TCEP의 용액을 10.5 ml의 PBS 중 150 mg의 항-TWEAKR 항체 TPP-2658 (c = 14.28 mg/ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 1250 μl의 DMSO 중에 용해된 6.63 mg (0.008 mmol)의 중간체 F104를 첨가하였다. 실온에서 추가로 90분 동안 교반한 후, 반응물을 pH 8로 미리 조정된 1250 μl의 PBS 완충제로 희석하였다.
이어서, 이 용액을 PBS 완충제 pH 8로 평형화된 PD 10 칼럼 (세파덱스® G-25, 지이 헬스케어)에 적용하고 PBS 완충제 pH 8로 용리시켰다. 용리액을 PBS 완충제 pH 8로 22.5 ml의 총 부피로 희석하였다. 이 용액을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반한 다음, PD-10 칼럼을 사용하여 pH 7.2로 재완충시켰다. 이어서, 용리액을 초원심분리에 의해 농축시키고, PBS 완충제 (pH 7.2)로 재희석하고 다시 재농축시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 14.06 mg/ml
약물/mAb 비: 3.4
참조 실시예 R10h1
유사한 방식으로, 중간체 F104를 100 mg의 항-B7H3 항체 TPP-8382에 커플링시켰다. 수득된 ADC 배치는 하기와 같이 특징화되었다:
단백질 농도: 14.12 mg/ml
약물/mAb 비: 3.2
C: 생물학적 효능의 평가
본 발명에 따른 화합물의 생물학적 활성은 하기 기재된 검정에서 밝혀질 수 있다.
C-1a ADC의 세포독성 효과의 결정
ADC의 세포독성 효과의 분석을 다양한 세포주를 사용하여 수행하였다.
NCI-H292: 인간 점액표피양 폐 암종 세포, ATCC-CRL-1848, 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬(Biochrom); #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마; #F2442), TWEAKR-양성; EGFR-양성.
BxPC3: 인간 췌장 암종 세포, ATCC-CRL-1687, 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마; #F2442), TWEAKR-양성.
LoVo 인간 결장직장암 세포, ATCC 번호 CCL-229, MTT 검정을 위한 배양: 표준 배지: 카인 + L-글루타민 (인비트로젠 21127) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코로부터의 것, 번호 10500-064). CTG 검정을 위한 배양: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마 #F2442). TWEAKR-양성.
KPL4: 인간 유방암 세포주, 바이엘 파마 아게(Bayer Pharma AG) (정체가 DSMZ에서 2012년 7월 19일에 조사되고 확인됨), 표준 배지: RPMI 1640 (깁코로부터의 것; #21875- 059, stab. L-글루타민) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코로부터의 것, 번호 10500-064); HER2-양성.
SK-HEP-1: 인간 간암 세포주, ATCC 번호 HTB-52, 표준 배지: 얼 염을 포함하는 MEM + 글루타맥스(Glutamax) I (인비트로젠 41090) + 10% 열 불활성화 FCS (깁코로부터의 것, 번호 10500-064); EGFR-양성, TWEAKR-양성
KU-19-19: 인간 방광 암종 세포, DMSZ, 표준 배지: RPMI 1640 (바이오크롬; #FG1215, stab. 글루타민) + 10% FCS (시그마; #F2442), TWEAKR-양성.
SCC4: 인간 혀 기저 암종, 표준 배지: DMEM / 햄 F12; (바이오크롬; # FG 4815, 안정한 글루타민을 포함함), ATCC-CRL-1624+ 10% FCS (시그마 #F2442), TWEAKR-양성
해당 세포주에 대해 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(American Tissue Culture Collection) (ATCC) 또는 라이프니츠-인스티튜트 DSMZ-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ)에 의해 언급된 바와 같은 표준 방법에 의해 세포를 배양하였다.
CTG 검정
세포를 표준 방법에 의해 C-1a 하에 명시된 성장 배지와 함께 배양하였다. PBS 중 트립신 (0.05%) 및 EDTA (0.02%)의 용액 (바이오크롬 아게 #L2143)으로 세포를 분리시키고, 펠릿화하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 계수하고 96-웰 백색 바닥 배양 플레이트 (코스타 #3610)에 뿌리고 (75 μl/웰에서, 웰당 하기 세포 수는 하기와 같음: NCI-H292: 2500개 세포/웰, BxPC3 2500개 세포/웰, LoVo 3000개 세포/웰) 인큐베이터에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션함으로써 시험을 수행하였다. 24시간 후, 항체 약물 접합체를 25 μl의 배양 배지 (4-배 농축됨) 중에서 세포에 첨가하여 세포에 대해 3 x 10-7 M 내지 3 x 10-11 M의 최종 항체 약물 접합체 농도를 수득하였다 (삼중). 이어서, 세포를 인큐베이터에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 병행 플레이트 상에서, 약물 처리의 시작 시 (제0일) 세포 활성을 셀 타이터 글로(Cell Titer Glow) (CTG) 발광 세포 생존율 검정 (프로메가(Promega) #G7573 및 #G7571)을 사용하여 결정하였다. 이를 위해, 세포 배치당 100 μl의 기질을 첨가한 다음, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 플레이트 진탕기 상에서 180 rpm에서 2분 동안 진탕시키고, 실험실 벤치에 8분 동안 정치되도록 한 다음, 발광측정기 (빅터(Victor) X2, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 기질은 그의 강도가 세포의 생존율에 정비례하는 발광 신호를 생성하는 살아있는 세포에서의 ATP 함량을 검출한다. 항체 약물 접합체와 함께 72시간 동안 인큐베이션한 후, 이어서 이들 세포의 생존율을 또한 상기 기재된 바와 같은 셀 타이터 글로 발광 세포 생존율 검정을 사용하여 결정하였다. 측정된 데이터로부터, 성장 억제의 IC50을 DRC (용량 반응 곡선) 분석 스프레드시트 및 4-파라미터 피트를 사용하여 제0일과 비교하여 계산하였다. DRC 분석 스프레드시트는 IDBS E-워크북 스위트 플랫폼(IDBS E-WorkBook Suite platform) (IDBS: ID 비지니스 솔루션즈 리미티드(ID Business Solutions Ltd.) (영국 길포드)) 상의 바이엘 파마 아게 및 바이엘 비즈니스 서비시즈(Bayer Business Services)에 의해 개발된 바이오북 스프레드시트이다.
하기 표 1a는 본 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예에 대한 IC50 값을 열거한다:
표 1a
Figure pct00534
Figure pct00535
하기 표 1b는 본 발명에 따른 ADC 및 APDC의 대표적인 실시예와 레구마인-절단가능한 기의 모든 아미노산이 L 배위로 존재하는 상응하는 에피머 ADC 및 APDC (참조 실시예 시리즈 R)에 대한 비교 데이터를 열거한다. 명백한 유의한 차이는 없다.
표 1b)
Figure pct00536
보고된 활성 데이터는 나타낸 약물/mAB 비를 갖는, 본 실험 섹션에 기재된 작업 실시예에 관한 것이다. 값은 아마도 상이한 약물/mAB 비에 대해 벗어날 수 있다. IC50 값은 여러 독립적 실험의 평균 또는 개별 값이다. 항체 약물 접합체의 작용은 각각의 링커 및 독성단을 포함하는 각각의 이소형 대조군에 대해 선택적이었다.
MTT 검정
세포를 표준 방법에 의해 C-1a 하에 명시된 성장 배지와 함께 배양하였다. PBS 중 아큐타제의 용액 (바이오크롬 아게 #L2143으로부터의 것)으로 세포를 분리시키고, 펠릿화하고, 배양 배지 중에 재현탁시키고, 계수하고 96-웰 백색 바닥 배양 플레이트 (코스타 #3610으로부터의 것)에 뿌림으로써 (NCI H292: 2500개 세포/웰; SK-HEP-1: 1000개 세포/웰; KPL4: 1200개 세포/웰; 총 부피 100 μl) 시험을 수행하였다. 이어서, 세포를 인큐베이터에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 배지를 대체하였다. 이어서, 10-5M 내지 10-13M의 농도의 10 μl의 배양 배지 중 항체 약물 접합체를 세포에 피펫팅한 다음 (삼중으로), 검정을 인큐베이터에서 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하였다. 96시간 후, 세포 증식을 MTT 검정 (ATCC (미국 버지니아 마나사스), 카탈로그 번호 30-1010K)을 사용하여 검출하였다. 이를 위해, MTT 시약을 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 세제를 첨가하여 세포를 밤새 용해시켰다. 형성된 염료를 570 nm (인피니트 M1000 프로(Infinite M1000 pro), 테칸(Tecan))에서 검출하였다. 측정된 데이터를 사용하여 DRC (용량 반응 곡선)를 사용하여 성장 억제의 IC50을 계산하였다. 시험 물질로 처리되지 않았지만 그 외에는 동일하게 처리된 세포의 증식을 100% 수치로서 정의하였다.
하기 표 1c-f는 본 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예에 대한 IC50 값을 열거한다.
표 1c
Figure pct00537
Figure pct00538
하기 표 1d는 본 발명에 따른 ADC를 포함하는 대표적인 실시예와 레구마인-절단가능한 기의 모든 아미노산이 L 배위로 존재하는 상응하는 APDC (참조 실시예 시리즈 R)에 대한 비교 데이터를 열거한다. 명백하게 변경된 IC50 값은 NCI-H292 세포주 상에서 측정되지 않았다.
표 1d:
Figure pct00539
표 1e
Figure pct00540
Figure pct00541
하기 표 1f는 본 발명에 따른 ADC를 포함하는 대표적인 실시예와 레구마인-절단가능한 기의 모든 아미노산이 L 배위로 존재하는 상응하는 APDC (참조 실시예 시리즈 R)에 대한 비교 데이터를 열거한다. 유의하게 변경된 IC50 값은 측정되지 않았다.
표 1f:
Figure pct00542
보고된 활성 데이터는 나타낸 약물/mAB 비를 갖는, 본 실험 섹션에 기재된 작업 실시예에 관한 것이다. 값은 아마도 상이한 약물/mAB 비에 대해 벗어날 수 있다. IC50 값은 여러 독립적 실험의 평균 또는 개별 값이다. 항체 약물 접합체의 작용은 각각의 링커 및 독성단을 포함하는 각각의 이소형 대조군에 대해 선택적이었다.
C-1b 선택된 실시예에 의한 키네신 스핀들 단백질 KSP/ Eg5의 억제의 결정
인간 키네신 스핀들 단백질 KSP/Eg5 (테부-바이오(tebu-bio)/ 시토스켈레톤 인크.(Cytoskeleton Inc), 번호 027EG01-XL)의 모터 도메인을 10 nM의 농도로 50 μg/ml 탁솔 (시그마 번호 T7191-5MG)로 안정화된 미세관 (소 또는 돼지, 테부-바이오/ 시토스켈레톤 인크.)과 함께 15 mM PIPES, pH 6.8 (5 mM MgCl2 및 10 mM DTT, 시그마) 중에서 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 새로이 제조된 혼합물을 384 MTP (코닝(Corning)으로부터의 것)로 분취하였다. 이어서, 1.0 x 10-6 M 내지 1.0 x 10-13 M의 농도의 검사될 억제제 및 ATP (최종 농도 500 μM, 시그마)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. ATPase 활성을 말라카이트 그린 (바이오몰(Biomol))을 사용하여 형성된 무기 포스페이트를 검출함으로써 검출하였다. 시약을 첨가한 후, 검정을 실온에서 50분 동안 인큐베이션한 다음, 620 nm의 파장에서의 흡수를 검출하였다. 사용된 양성 대조군은 모나스트롤 (시그마, M8515-1mg) 및 이스피네시브 (AdooQ 바이오사이언스(AdooQ Bioscience) A10486)였다. 용량-활성 곡선의 개별 데이터는 8-배 결정치이다. IC50 값은 2회의 독립적 실험의 평균이다. 100% 대조군은 억제제로 처리되지 않은 샘플이었다.
하기 표 2는 기재된 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예의 IC50 값을 열거하고 상응하는 세포독성 데이터 (MTT 검정)를 요약한다:
표 2
Figure pct00543
Figure pct00544
보고된 활성 데이터는 본 실험 섹션에 기재된 작업 실시예에 관한 것이다.
C-1c 효소적 검정 및 안정성 연구
a: 카텝신 B 검정
검사될 모든 카텝신 B-절단가능한 전구약물에 대해, 혼합물을 마이크로 반응 용기 (0.5 ml, 에펜도르프(Eppendorf)로부터의 것)에서 구성하였다. 본원에 사용된 효소를 인간 간 조직으로부터 수득하였다. 2 μg의 카텝신 B (시그마 C8571 25 μg)를 처음에 충전하고 50mM Na 포스페이트 완충제, pH6.0, 2 mM DTT로 200 μl의 총 부피를 구성하였다. 이어서 검사될 50 μl의 기질 용액을 피펫팅하였다. 혼합물을 300 rpm에서의 일정한 교반 하에 40℃에서 써모블록 (써모 피셔 사이언티픽)에서 인큐베이션하였다. 효소적 반응을 동역학적으로 제어하였다. 이러한 목적을 위해, 10 μl 샘플을 상이한 시점에 취하였다. 효소적 반응을 정지시키기 위해 취한 샘플을 즉시 20 μl의 빙냉 메탄올과 혼합한 다음, -20℃에서 동결시켰다. 샘플링을 위해 선택된 시점은 10분, 2시간, 4시간 및 24시간 후였다. 이어서, 샘플을 RP-HPLC 분석 (역상 HPLC, 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 1200 시리즈)에 의해 분석하였다. 방출된 독성단의 결정은 효소적 반응의 반감기 t1/2의 결정을 가능하게 하였다.
b: 레구마인 검정
레구마인 검정을 재조합 인간 효소로 수행하였다. rh 레구마인 효소 용액 (카탈로그 # 2199-CY, 알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 50mM Na 아세테이트 완충제/ 100mM NaCl, pH4.0 중에서 목적하는 농도로 희석하고 37℃에서 2시간 동안 사전인큐베이션하였다. 이어서, rh 레구마인을 50 mM MES 완충제, 250mM NaCl, pH 5.0 중 1 ng/μl의 최종 농도로 조정하였다. 검사될 모든 레구마인-절단가능한 전구약물에 대해, 혼합물을 마이크로 반응 용기 (0.5 ml, 에펜도르프로부터의 것)에서 구성하였다. 이러한 목적을 위해, 기질 용액을 50 mM MES 완충제, 250 mM NaCl, pH 5.0을 사용하여 목적하는 농도 (이중 농도)로 조정하였다. 효소적 반응의 동역학적 측정을 위해, 250 μl의 레구마인 용액을 먼저 처음에 충전하고 효소 반응을 250 μl의 기질 용액 (최종 농도: 단일 농도)을 첨가함으로써 시작하였다. 상이한 시점에, 50 μl 샘플을 취하였다. 효소적 반응을 정지시키기 위해 이 샘플을 즉시 100 μl의 빙냉 메탄올과 혼합한 다음, -20℃에서 동결시켰다. 샘플링을 위해 선택된 시점은 0.5시간, 1시간, 3시간 및 24시간 후였다. 이어서, 샘플을 RP-HPLC 분석 및 LC-MS 분석에 의해 분석하였다. 방출된 독성단의 결정은 효소적 반응의 반감기 t1/2의 결정을 가능하게 하였다 (도 1).
대표적인 실시예에 의한 레구마인-매개 절단을 나타내기 위해, 레구마인 검정에서 제조된 기질은 중심 알라닌 단위에 대해 각각 S 및 R 배위를 갖는 입체이성질체 모델 화합물 A (= 참조 실시예 R3r-LLL) 및 B (= 참조 실시예 R3r-LDL)였다. 화합물 A는 상기 기재된 조건 하에 1.1시간의 반감기로 표적 화합물로 절단되었다. 화합물 B는 24시간 내에 약 20%의 정도로 표적 화합물로 절단되었다.
Figure pct00545
도 1: 모델 화합물 A (참조 실시예 R3r-LLL) 및 B (참조 실시예 R3r-LDL)의 레구마인-매개 절단
c: 래트 혈장에서의 안정성의 결정을 위한 검정
화합물 A 및 B의 안정성을 검사하기 위해, 각각의 경우에 1.5 ml 에펜도르프 튜브에서 1 ml의 래트 혈장을 에펜도르프 진탕기 상에서 37℃로 평형화하였다. 화합물 A 및 화합물 B에 대해 100 μg/ml의 농도를 갖는 원액 (9 아세토니트릴/1 DMSO)을 제조하였다. 각각의 경우에 10 μl의 원액을 1 μg/ml의 농도를 제공하기 위해 1 ml의 평형화된 래트 혈장으로 피펫팅하였다.
샘플을 450 rpm 및 37℃에서 24시간 동안 유지하였다. 0시간, 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 24시간의 각각의 샘플링 시점에, 50 μl를 취하고 150 μl의 메탄올로 피펫팅하였다. 내부 표준은 0.05 μg/ml의 농도의 메탄올의 초기 충전에 포함되었다. 간단한 볼텍싱 후, 300 μl의 10 mM 아세트산암모늄 완충제 (pH 6.8)를 첨가하고 1881 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 샘풀을 RP-HPLC 분석 및 LC-MS 분석에 의해 분석하였다.
본 검정에서, 화합물 A (참조 실시예 R3r-LLL) 및 화합물 B (참조 실시예 R3r-LDL) 둘 다는 24시간에 걸쳐 안정하였다.
d: 래트 간 리소솜에서의 안정성의 결정을 위한 검정
화합물 A 및 B의 리소솜 안정성을 결정하기 위해, 리소솜 효소를 래트 간 세포로부터 단리시켰다. 화합물 A 및 B를 리소솜 조건 하의 안정성을 검사하기 위해 각각 이 리소솜 추출물에 첨가하였다. 단백질분해 효소 레구마인은, 존재하는 경우에, 래트 간 리소솜에서 단지 매우 작은 양으로 발현된다 (Chen, J-M. et al. 1997). 리소솜 효소의 효소적 활성을 모니터링하기 위해, 카텝신-특이적 기질을 첨가하였다.
먼저, 신선한 래트 간을 제거하고, 칭량하고 즉시 균질화 배지 (0.25 M 수크로스, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH7) 중 얼음 상에 두었다. 간을 파분쇄하고 배지의 교체를 수행하였다. 래트 간을 포터 (비. 브라운(B. Braun))에서 750 rpm에서 래트 간 중량의 양의 4배로 균질화하였다. 균질물을 1000 g에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 여과하였다. 후속 단계에서, 초원심분리의 도움으로, "가벼운 미토콘드리아 분획" (LMF)을 26 500 g에서 20분에 걸쳐 상청액으로부터 원심분리하였다. 또한 리소솜이 미토콘드리아를 제외한 펠릿에 존재한다. 상청액을 폐기하고 펠릿을 0.8 ml/g의 균질화 배지로 재현탁시켰다.
LMF의 다른 세포 구성성분으로부터 리소솜 분획을 분리하기 위해, 6개의 옵티프렙(Optiprep) 밀도 구배를 옵티프렙 완충제 (100 mM MOPS, 20mM EDTA, 0.5% EtOH, pH 7.6) 중 8%, 12%, 16%, 19%, 22.5% 및 27%의 수크로스 함량으로 제조하였다. 수크로스를 특정한 백분율의 2.3 M 원액으로부터 첨가하였다. 2.5 ml의 단리된 LMF를 추가적으로 19%의 수크로스 함량을 갖는 밀도 단계에 첨가하였다. 후속적으로, 밀도 단계는 10 ml 원심분리 튜브에서 하나를 또 다른 것의 상단에 적층하고 48 500 g에서 17시간 동안 원심분리하였다. 분획 1-8은 구배의 상부 5.6 ml에 존재하고 폐기하였다. 분획 9 및 10은 아래 1.6 ml에 존재하고 구배로부터 분리하고 1.6 ml의 용해 완충제 (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% 트리톤 X100, pH 5)로 얼음 상에서 5분 동안 용해시켰다. 리소솜은 분획 9 및 10에 존재한다. 용해를 모니터링하기 위해, 용해된 리소솜 분획의 단백질 함량을 BCA 검정 (피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트)의 도움으로 모니터링하였다.
화합물 A 및 B의 리소솜 안정성을 검사하기 위해, 6 μl의 100 μg/ml 원액 (9 아세토니트릴 / 1 DMSO)을 290 μl의 90 mM 시트레이트 완충제 및 300 μl의 리소솜 추출물에 첨가하고 37℃에서 에펜도르프 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 시점의 50 μl를 0시간, 1시간, 2시간, 6시간, 24시간 및 48시간 후 인큐베이션 용액으로부터 취하고 150 μl의 MeOH로 피펫팅하였다. 내부 표준은 0.05 μg/ml의 초기 충전에 포함되었다. RP-HPLC LCMS 분석을 위해, 샘플을 300 μl의 10 mM 아세트산암모늄 완충제 (pH 6.8)로 희석하고 분석하였다.
리소솜 안정성 검정의 조건 하에, 화합물 A (참조 실시예 R3r-LLL)는 24시간 내에 약 6시간의 반감기로 약 80%의 정도로 절단된 한편, 화합물 B (참조 실시예 R3r-LDL)는 동일한 기간에 걸쳐 안정하였다.
C-2 내재화 검정
내재화는 항체 약물 접합체 (ADC)를 통한 항원-발현 암 세포에서의 세포독성 페이로드의 특이적이고 효율적인 제공을 가능하게 하는 주요 과정이다. 이러한 과정은 특이적 항체 및 이소형 대조군 항체의 형광 표지를 통해 모니터링된다. 먼저, 형광 염료를 항체의 리신에 접합시켰다. 접합을 pH 8.3의 2-배 몰 과량의 CypHer 5E 모노 NHS 에스테르 (배치 357392, 지이 헬스케어)를 사용하여 수행하였다. 커플링시킨 후, 반응 혼합물을 겔 크로마토그래피 (제바 스핀(Zeba Spin) 탈염 칼럼, 40K, 써모 사이언티픽, 번호 87768; 용리 완충제: 둘베코 PBS, 시그마-알드리치, 번호 D8537)에 의해 정제하여, 과량의 염료를 제거하고 pH를 조정하였다. 단백질 용액을 비바스핀(VIVASPIN) 500 칼럼 (사르토리우스 스테딤 바이오텍(Sartorius stedim biotec))을 사용하여 농축시켰다. 항체의 염료 로드를 분광광도측정 분석 (나노드롭) 및 후속 계산에 의해 결정하였다 (D: P = A염료 ε단백질:(A280-0.16A염료)ε염료).
여기서 검사된 항체 및 이소형 대조군의 염료 로드는 대등한 자릿수였다. 세포 결합 검정에서, 커플링이 항체의 친화도에 있어서 어떠한 변화도 유도하지 않았다는 것을 확인하였다.
표지된 항체를 내재화 검정에 사용하였다. 처리의 시작 전에, 세포 (2 x 104개/웰)를 96-웰 MTP (편평, 흑색, 투명 바닥 번호 4308776, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 것)에서 100 μl 배지에 뿌렸다. 37℃/5%CO2에서 18시간 인큐베이션 후, 배지를 대체하고 표지된 항체를 상이한 농도 (10, 5, 2.5, 1, 0.1 μg/ml)로 첨가하였다. 동일한 처리 프로토콜을 표지된 이소형 대조군 (음성 대조군)에 적용하였다. 선택된 인큐베이션 시간은 0시간, 0.25시간, 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 6시간 및 24시간이었다. 형광 측정을 인셀애널라이저(InCellAnalyzer) 1000 (지이 헬스케어로부터의 것)을 사용하여 수행하였다. 이어서 파라미터 과립 수/세포 및 총 과립 강도/세포의 측정을 통해 동역학적으로 평가하였다.
수용체에 결합한 후, 항체를 그의 내재화 능력에 대해 검사하였다. 이러한 목적을 위해, 상이한 수용체 발현 수준을 갖는 세포를 선택하였다. 표적-매개 특이적 내재화가 본 발명과 관련하여 이용된 항체에 의해 관찰된 한편, 이소형 대조군은 내재화를 나타내지 않았다.
C-3 세포 투과성을 결정하기 위한 시험관내 시험
물질의 세포 투과성은 Caco-2 세포를 사용하여 유동 검정에서 시험관내 시험에 의해 조사될 수 있다 [M.D. Troutman and D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. 이러한 목적을 위해, 세포를 24-웰 필터 플레이트 상에서 15-16일 동안 배양하였다. 투과의 결정을 위해, 각각의 시험 물질을 HEPES 완충제 중에서 세포에 정단으로 (A) 또는 기저로 (B) 적용하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 0시간 후 및 2시간 후, 샘플을 시스 및 트랜스 구획으로부터 취하였다. 샘플을 역상 칼럼을 사용하여 HPLC (애질런트 1200 (독일 뵈블링엔))에 의해 분리하였다. HPLC 시스템을 터보 이온 스프레이 인터페이스를 통해 삼중 사중극자 질량 분광계 API 4000 (에이비 사이엑스 도이칠란트 게엠베하(AB SCIEX Deutschland GmbH) (독일 다름슈타트)에 커플링시켰다. 투과성을 Papp 값에 기초하여 평가하였으며, 이를 문헌 [Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]]에 의해 공개된 식을 사용하여 계산하였다. Papp (A-B)에 대한 Papp (B-A)의 비 (유출 비)가 >2 또는 <0.5인 경우에 물질을 능동적으로 수송되는 것으로서 분류하였다.
세포내 방출되는 독성단에 결정적으로 중요한 것은 B에서 A로의 투과성 [Papp (B-A)] 및 Papp (A-B)에 대한 Papp (B-A)의 비 (유출 비)이다: 이 투과성이 보다 낮을 수록, Caco-2 세포의 단층을 통한 물질의 능동 및 수동 수송 과정이 보다 느리다. 추가적으로 유출 비가 어떠한 능동 수송도 나타내지 않을 경우에, 물질은, 세포내 방출 후, 세포에 보다 오래 남아있을 수 있다. 따라서, 또한 생화학적 표적 (이 경우에: 키네신 스핀들 단백질, KSP / Eg5)과의 상호작용에 이용가능한 시간이 보다 많이 존재한다.
하기 표 3은 본 검정으로부터의 대표적인 작업 실시예에 대한 투과성 데이터를 기재한다:
표 3
Figure pct00546
C-4 P-당단백질 (P-gp)에 대한 기질 특성을 결정하기 위한 시험관내 시험
많은 종양 세포는 약물을 위한 수송체 단백질을 발현하고, 이는 빈번하게 세포증식억제제에 대한 저항성의 발생을 동반한다. 따라서 이러한 수송체 단백질, 예컨대 P-당단백질 (P-gp) 또는 BCRP의 기질이 아닌 물질은, 예를 들어, 개선된 활성 프로파일을 나타낼 수 있다.
P-gp에 대한 물질 (ABCB1)의 기질 특성을 P-gp를 과다발현하는 LLC-PK1 세포 (L-MDR1 세포)를 사용하여 유동 검정에 의해 결정하였다 [A.H. Schinkel et al., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. 이러한 목적을 위해, LLC-PK1 세포 또는 L-MDR1 세포를 96-웰 필터 플레이트 상에서 3-4일 동안 배양하였다. 투과의 결정을 위해, 각각의 시험 물질을, 단독으로 또는 억제제 (예컨대, 예를 들어 이베르멕틴 또는 베라파밀)의 존재 하에, HEPES 완충제 중에서 세포에 정단으로 (A) 또는 기저로 (B) 적용하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 0시간 후 및 2시간 후, 샘플을 시스 및 트랜스 구획으로부터 취하였다. 샘플을 역상 칼럼을 사용하여 HPLC에 의해 분리하였다. HPLC 시스템을 터보 이온 스프레이 인터페이스를 통해 API 3000 삼중 사중극자 질량 분광계 (어플라이드 바이오시스템즈 어플레라(Applied Biosystems Applera) (독일 다름슈타트))에 커플링시켰다. 투과성을 Papp 값에 기초하여 평가하였으며, 이를 문헌 [Schwab et al. [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]]에 의해 공개된 식을 사용하여 계산하였다. Papp (A-B)에 대한 Papp (B-A)의 유출 비가 >2인 경우에 물질을 P-gp 기질로서 분류하였다.
P-gp 기질 특성의 평가에 대한 추가의 기준으로서, L-MDR1 및 LLC-PK1 세포에서의 유출 비 또는 억제제의 존재 또는 부재 하의 유출 비를 비교할 수 있다. 이들 값이 2배 초과하여 상이한 경우에, 해당 물질은 P-gp 기질이다.
C-5 약동학
C5a: 시험관내 내재화 후 ADC 대사물의 확인
방법 설명:
면역접합체를 사용한 내재화 연구를 수행하여 세포내 형성된 대사물을 분석한다. 이를 위해, 인간 폐 종양 세포 NCI H292 (3x105개/웰)를 6-웰 플레이트에 뿌리고 밤새 인큐베이션한다 (37℃, 5% CO2). 세포를 10 μg/ml (66 nM)의 검사될 ADC로 처리한다. 내재화를 37℃에서 및 5% CO2에서 수행하였다. 추가의 분석을 위해 세포 샘플을 다양한 시점 (0, 4, 24, 48, 72시간)에 취한다. 먼저, 상청액 (약 5 ml)을 수거하고, 원심분리 (2분, 실온, 1000 rpm 헤라우스 바리오퓨즈(Heraeus Variofuge) 3.0R) 후, -80℃에서 보관한다. 세포를 PBS로 세척하고 아큐타제로 분리시키고, 세포 수를 결정한다. 또 다른 세척 후, 정의된 수의 세포 (2 x 105개)를 100 ml의 용해 완충제 (포유동물 세포 용해 키트 (시그마 MCL1))로 처리하고 계속 진탕시키면서 (써모믹서(Thermomixer), 15분, 4℃, 650 rpm) 프로테인 로바인드(Protein LoBind) 튜브 (에펜도르프 카탈로그 번호 0030 108.116)에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 용해물을 원심분리하고 (10분, 4℃, 12000 g, 에펜도르프 5415R) 상청액을 수거한다. 수득된 상청액을 -80℃에서 보관한다. 이어서, 모든 샘플을 하기와 같이 분석한다.
메탄올 또는 아세토니트릴에 의한 단백질의 침전 후 배양물 상청액 또는 세포 용해물 중의 화합물의 측정을 삼중-사중극자 질량 분광계 (MS)에 커플링된 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수행한다.
50 μl의 배양물 상청액/세포 용해물의 후처리를 위해, 150 μl의 침전 시약 (메탄올)을 첨가하고 혼합물을 10초 동안 진탕시킨다. 침전 시약은 적합한 농도 (일반적으로 20-100 μg/l의 범위)로 내부 표준 (ISTD)을 함유한다. 1881 g에서 10분 동안 원심분리 후, 상청액을 오토샘플러 바이알로 옮기고, 용리액에 매칭된 300 μl의 완충제로 구성하고 다시 진탕시키고 1881 g에서 10분 동안 원심분리한다.
세포 용해물 및 상청액 샘플을 최종적으로 HPLC-커플링된 API6500 삼중-사중극자 질량 분광계 (에이비 사이엑스 도이칠란트 게엠베하로부터의 것)를 사용하여 분석한다.
보정을 위해, 블랭크 용해물 또는 블랭크 상청액을 적절한 농도 (0.1-1000 μg/l)로 혼합한다. 검출 한계 (LLOQ)는 약 0.2 μg/l이다.
유효성을 시험하기 위한 품질 대조군은 4 및 40 μg/l를 함유한다.
C5b: 생체내 ADC 대사물의 확인
이종이식편 마우스에서 10 mg/kg의 본 발명에 따른 다양한 접합체의 i.v. 투여 후, 이들 접합체의 투여 후 24시간에, 항체 및 잠재적 대사물의 혈장, 종양, 간 및 신장 농도를 측정하는 것이 가능하다. C-6 하에 이종이식편 모델에 관한 방법의 보다 구체적인 설명이 존재한다. 여기서 다루고자 하는 모든 것은 본 발명에 따른 접합체의 대사물 농도이다. 언급된 매트릭스에서의 대사물에 대한 측정은 추가적으로 혈장, 신장 및 간에서의 대사물 로드의 종양에서의 로드와 비교한 정도에 관한 정보를 제공한다.
잠재적 대사물의 정량화를 위한 분석
혈장, 종양, 간 및 신장에서의 화합물의 분석은 일반적으로 메탄올에 의한 단백질의 침전 후 삼중-사중극자 질량 분광계 (MS)에 커플링된 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 이어진다.
50 μl의 혈장의 후처리를 위해, 150 μl의 침전 시약 (일반적으로 메탄올)을 첨가하고 혼합물을 10초 동안 진탕시킨다. 침전 시약은 적합한 농도 (일반적으로 20-100 μg/l의 범위)로 내부 표준 (ISTD)을 함유한다. 1881 g에서 10분 동안 원심분리 후, 상청액을 오토샘플러 바이알로 옮기고, 용리액에 매칭된 300 μl의 완충제로 구성하고 다시 진탕시킨다.
종양 또는 기관 물질의 후처리에서, 특정한 물질을 3-20배의 양의 추출 완충제와 혼합한다. 추출 완충제는 50 ml의 조직 단백질 추출 시약 (피어스 (일리노이주 록포드)), 2개의 펠릿의 완전-프로테아제-억제제-칵테일 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) (독일 만하임)) 및 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (시그마 (미주리주 세인트루이스))를 1 mM의 최종 농도로 함유한다. 조직 유형 (경질: 종양; 연질: 간, 신장)에 따라, 프리셀리스(Prescellys) 24 용해 및 균질화 시스템 (베르탱 테크놀로지스(Bertin Technologies))의 용해 및 균질화 프로그램을 선택한다 (www.prescellys.com). 균질화된 샘플을 4℃에서 밤새 정치시킨다. 50 μl의 균질물을 오토샘플러 바이알로 옮기고 ISTD를 포함하는 150 μl의 메탄올로 구성하고, 10초 동안 교반한 다음, 5분 동안 정치시킨다. 300 μl의 아세트산암모늄 완충제 (pH 6.8)를 첨가하고 간단하게 교반한 후, 샘플을 1881 g에서 10분 동안 원심분리한다.
보정을 위해, 혈장 샘플을 위한 혈장 및 조직 샘플을 위한 상응하는 블랭크 매트릭스를 0.6-1000 μg/l의 농도와 혼합한다. 샘플 유형 또는 조직 유형에 따라, 검출 한계 (LOQ)는 1 내지 20 μg/l이다.
혈장 및 매트릭스 샘플을 최종적으로 HPLC-커플링된 API6500 삼중-사중극자 질량 분광계 (에이비 사이엑스 도이칠란트 게엠베하로부터의 것)를 사용하여 분석한다.
유효성을 시험하기 위한 품질 대조군은 4, 40 및 400 μg/l를 함유한다.
표 4: Ku-19-19 이종이식편 마우스에서 본 발명에 따른 접합체의 투여 24시간 후 이종이식편 마우스 (n = 3)의 종양, 혈장, 간 및 신장에서의 대사물 농도 (MW: 평균, SD: 표준 편차). LLOQ 종양: 3-20 μg/l; LLOQ 혈장: 1 μg/l; LLOQ 간 및 신장: 5 μg/l.
표 4:
Figure pct00547
실시예 3k 및 참조 실시예 R10k (레구마인-절단가능한 기 포함 및 불포함)로부터의 ADC는 Ku-19-19 모델에서 대등한 생체내 효과를 나타낸다 (챕터 C-6b 참조). 마찬가지로 실시예 3h1로부터의 ADC는 A498 모델에서 적어도 참조 실시예 R10h1 (레구마인-절단가능한 기 포함 및 불포함)과 대등한 생체내 효과를 나타낸다 (챕터 C-6c 참조).
그러나, 실시예 3k로부터의 ADC의 투여 후, 비교 ADC R10k의 투여 후보다 훨씬 더 낮은 농도의 활성 대사물이, 특히 간에서 측정된다. 실시예 R10k로부터의 효소적으로 절단가능한 기를 포함하지 않는 참조 ADC (209.4 μg/l)와 비교하여 실시예 3k로부터의 ADC (26 μg/l)의 투여 후 간에서의 활성 대사물 M26의 낮은 농도는 래트 간 리소솜에서의 챕터 C1c에 기재된 모델 화합물 B (참조 실시예 R3r-LDL)의 높은 안정성에 부합한다.
C-6 생체내 활성 시험
본 발명에 따른 접합체의 활성을, 예를 들어, 이종이식편 모델을 사용하여 시험하였다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 화합물의 활성이 시험되도록 하는 선행 기술의 방법에 친숙하다 (예를 들어, WO 2005/081711; 문헌 [Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64] 참조). 이를 위해, 결합제의 표적 분자를 발현하는 종양 세포주를 설치류 (예를 들어 마우스) 내로 이식하였다. 이어서, 본 발명에 따른 접합체, 이소형 항체 대조군 접합체, 대조군 항체 또는 등장성 염수를 이식 동물에게 투여하였다. 투여는 1회 또는 1회 초과 일어났다. 수일의 인큐베이션 시간 후, 종양의 크기를 접합체-처리된 동물과 대조군을 비교함으로써 결정하였다. 접합체-처리된 동물은 보다 작은 종양 크기를 나타냈다.
C-6a. 마우스에서의 실험 종양의 성장 억제 / 퇴행
항체-약물 접합체에 대한 항원을 발현하는 인간 종양 세포를 면역억제된 마우스, 예를 들어 NMRi 누드 또는 SCID 마우스의 측복부 내로 피하로 접종한다. 1-10백만 개의 세포를 세포 배양물로부터 분리시키고, 원심분리하고 배지 또는 배지 / 매트리겔 중에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 마우스의 피부 아래에 주사한다.
수일 내에, 종양이 성장한다. 처리는 종양이 대략 40 mm2의 종양 크기에서 확립된 후 개시된다. 보다 큰 종양에 대한 효과를 검사하기 위해, 처리는 단지 50-100 mm2의 종양 크기에서 개시될 수 있다.
APDC 및 ADC를 사용한 처리는 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 (i.v.) 경로를 통해 수행된다. ADC는 5 ml/kg의 부피로 투여된다.
처리 프로토콜은 항체의 약동학에 따라 달라진다. 표준으로서, 처리는 4일 마다 연속적으로 3회 일어난다. 저속-성장 종양의 경우에, 매주 처리가 옵션이다. 빠른 평가를 위해, 단일 처리를 사용한 프로토콜을 사용할 수 있다. 그러나, 처리는 또한 계속될 수 있거나, 또는 3 처리일의 제2 사이클이 나중에 이어질 수 있다.
표준으로서, 처리군당 8마리의 동물을 사용한다. 활성 물질이 투여되는 군에 더하여, 1개의 군은 대조군으로서 단지 완충제로만 동일한 프로토콜에 따라 처리된다.
실험 동안, 종양 면적을 캘리퍼를 사용하여 2종의 치수 (길이 / 폭)로 규칙적으로 측정한다. 종양 면적을 길이 x 폭으로서 결정한다. 대조군의 평균 종양 면적에 대한 처리군의 평균 종양 면적의 비는 T/C 면적으로서 언급된다.
처리의 종료 후, 실험의 모든 군이 동시에 종결되는 경우에, 종양은 제거되고 칭량될 수 있다. 대조군의 평균 종양 중량에 대한 처리군의 평균 종양 중량의 비는 T/C 중량으로서 언급된다.
C-6b. 다양한 이종이식편 모델에서의 항-TWEAKR APDC의 효능
종양 세포 (예를 들어 KU-19-19, NCI-H292, SCC4)를 암컷 NMRI-누드 또는 NOD.SCID 마우스 (장비에(Janvier))의 측복부 내로 피하로 접종한다. ~ 40 mm2의 종양 크기에서, 정맥내 처리를 항체-약물 접합체를 사용하여 실시한다. 처리 후, 종양 성장의 모니터링은 적절한 경우에 계속한다.
항-TWEAKR 항체-전구약물 접합체 (APDC)를 사용한 처리는 대조군 및 이소형-약물 접합체와 비교하여 종양 성장의 뚜렷하고 장기 지속적인 억제로 이어지고, 레구마인-절단가능한 기가 없는 상응하는 ADC (R10k)의 성장의 억제와 대등하다. 표 5는 처리의 시작 후 계산된, 대조군의 마지막 측정일에 종양 면적에 걸쳐 결정된 T/C 값을 언급한다. 레구마인-절단가능한 항-TWEAKR ADC (예를 들어 실시예 24l1)는 또한 강력하고 특이적인 항-종양 효과를 나타냈다.
표 5:
Figure pct00548
C-6c. 다양한 이종이식편 모델에서의 항-B7H3 APDC의 효능
종양 세포 (예를 들어 U251-MG, NCI-H292, SCC4, NCI-H1703)를 암컷 NMRI-누드 또는 NOD.SCID 마우스 (장비에)의 측복부 내로 피하로 접종한다. ~ 40 mm2의 종양 크기에서, 정맥내 처리를 항체-약물 접합체를 사용하여 실시한다. 처리 후, 종양 성장의 모니터링은 적절한 경우에 계속한다.
항-B7H3 항체-전구약물 접합체 (APDC)를 사용한 처리는 대조군 및 이소형-약물 접합체와 비교하여 종양 성장의 현저하고 장기 지속적인 억제를 일으킨다. 표 6은 다양한 이종이식편 모델에서 처리의 시작 후 계산된, 대조군의 마지막 측정일에 종양 면적에 걸쳐 결정된 다양한 항-B7H3 APDC의 T/C 값 및 참조 화합물 R10h1의 T/C 값을 언급한다.
표 6:
Figure pct00549
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharma Aktiengesellschaft <120> Prodrugs of cytotoxic drugs having enzymatically cleavable groups <130> BHC 16 3 005 <160> 167 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 2 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 3 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 4 Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 5 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 6 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 7 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 8 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 9 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 9 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 10 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody sequence <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 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1215 Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro 1220 1225 1230 Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245 Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 <210> 167 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210

Claims (44)

  1. 하기 화학식 Ia의 화합물.
    Figure pct00550

    여기서
    m은 0 내지 2이고;
    n은 0 또는 1이고;
    X는 -C(=O)-NH2 또는 -COOH이고,
    La는 자기 희생적 링커이고,
    A1은 아미노산 Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, 시트룰린 및 His 중 하나, 또는 각각의 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼이고,
    A2는 아미노산 D-Ala, D-Pro, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Thr, D-Cys, D-Asn, D-Gln, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Arg, D-시트룰린 또는 D-His 중 하나, 또는 각각의 N-알킬 아미노산 중 하나로부터 유래된 라디칼이고,
    R2는 -H- 또는 C1-C3-알킬이거나,
    또는
    R2는 A2가 D-Pro로부터 유래된 라디칼인 경우에 프롤린 고리의 메틸렌 기에 대한 결합이고,
    D는 -D1-(Lb)o-(LIG)p이고,
    D1은 세포독성 약물이고,
    LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
    Lb는 링커이고,
    o 및 p는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
    R은 Z1-(C=O)q-이고,
    q는 0 또는 1이고,
    Z1은 C1-10-알킬, C5-10-아릴 또는 C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로알킬, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴, C5-10-헤테로시클로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, C5-10-헤테로아릴알콕시, C1-10-알콕시, C6-10-아릴-C1-10-알킬옥시, C6-10-아릴옥시 또는 C6-10-아르알콕시-, C5-10-헤테로알콕시, C1-10-알킬-O-C6-10-아릴옥시- 또는 C5-10-헤테로시클로알콕시 기이고 이는 -NH2, -C(=O)-, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NH-C(=O)-알킬, -N(알킬)-C(=O)-알킬, -S(=O)3-H, -S(=O)2-NH2, -S(=O)2-N(알킬)2, -COOH, -C(=O)NH2, -C(=O)-N(알킬)2 또는 -OH에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있거나,
    또는 -H 또는 -(CH2)0-1-Ox-(CH2CH2O)v-R1 기이고,
    x는 0 또는 1이고,
    v는 1 내지 20의 수이고,
    R1은 -H, -알킬, -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH 또는 -CH2-CH2-NH2이거나,
    또는
    R은 LIG-(Lc)r-이고,
    LIG는 종양 세포 상의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서, 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
    Lc는 링커이고
    r은 0 또는 1이다.
  2. 제1항에 있어서, A2는 아미노산 D-Ala, D-Pro, D-Asp, D-Asn, D-His 및 D-Ser 중 하나로부터 유래된 라디칼인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2는 -H 또는 메틸 기, 바람직하게는 -H인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A1은 L 배위 또는 D 배위로 존재하는 것인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, A1은 Ala 또는 Val로부터 유래된 것인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, q는 1이고, Z1은 산소 원자에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 C1-10-알킬 (예를 들어 메틸 기 또는 임의로 알킬화된 올리고알킬렌 옥시드 쇄), C6-10-아르알킬, C5-10-헤테로아릴알킬, C6-10-아르알콕시 또는 C5-10-헤테로아릴알콕시 기를 나타내는 것인 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, La는 하기 기로부터 선택된 것인 화합물.
    Figure pct00551

    여기서 #1은 카르보닐 기에 대한 결합을 나타내고 #2는 D1의 히드록실 또는 아미노 기에 대한 결합을 나타낸다.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, D1은 미토마이신, 독소루비신, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 9-아미노캄프토테신, n8-아세틸스페르미딘, 1-(2-클로로에틸)-1,2-디메탄술포닐 히드라지드, 탈리소마이신, 시타라빈, 에토포시드, 캄프토테신, 탁솔, 에스페라미신, 포도필로톡신, 안구이딘, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 모르폴린-독소루비신, n-(5,5-디아세톡시펜틸)독소루비신, 두오카르마이신, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀 유도체, 칼리케아미신, 다우노루비신, 캄프토테신 DX8951 (엑사테칸) 또는 키네신 스핀들 단백질 억제제 (KSP 억제제)로부터 선택된 약물이고, 약물은 그의 히드록실 또는 아미노 기를 통해 화학식 I의 La (n = 1인 경우) 또는 카르보닐 기 (n = 0인 경우)에 결합된 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, KSP 억제제가 하기 화학식 (IIa)의 화합물 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염인 화합물.
    Figure pct00552

    여기서
    X1은 N이고,
    X2는 N이고
    X3은 C이거나,
    또는
    X1은 N이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이거나,
    또는
    X1은 CH 또는 CF이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이거나,
    또는
    X1은 NH이고,
    X2는 C이고
    X3은 C이거나,
    또는
    X1은 CH이고,
    X2는 N이고
    X3은 C이고
    A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2-, 또는 -S(=O)2-NH-이고,
    R1은 -H, -L-#1, -MOD 또는 -(CH2)0-3Z이고,
    Z는 -H, -NHY3, -OY3, -SY3, 할로겐, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z' 또는 -CH(CH2W)Z'이고,
    Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Z'는 -H, -NH2, -S(=O)3H, -COOH, -NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)C(=O)- 또는 -(C(=O)-NH-CHY4)1-3COOH이고,
    W는 -H 또는 -OH이고,
    Y4는 -NH-C(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
    R2는 -H, -L-#1, -MOD, -C(=O)-CHY4-NHY5 또는 -(CH2)0-3Z이고,
    Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
    Y4는 -NHC(=O)-NH2에 의해 임의로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬-이거나, 또는 -NH2에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 벤질이고,
    Y5는 -H 또는 -C(=O)-CHY6-NH2이고,
    Y6은 선형 또는 분지형 C1-6-알킬이고,
    R3은 -MOD, -L-#1, 또는 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
    n은 0, 1 또는 2이고,
    Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH(NHC(=O)CH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -C(=O)-OH이고,
    R4는 화학식 Ia', Ia" 및 Ia"'의 레구마인-절단가능한 기이고,
    R5는 -H, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
    Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
    R6 및 R7은 독립적으로 -H, -CN, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실, -NO2, -NH2, -COOH 또는 할로겐이고,
    R8은 C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, C4-10-시클로알킬, 플루오로-C4-10-시클로알킬 또는 -(CH2)0-2-(HZ2)이고,
    HZ2는 N, O 및 S로부터 선택된 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 4- 내지 7-원 헤테로사이클이고, 이는 -OH, -COOH, -NH2 또는 -L-#1에 의해 치환될 수 있고,
    R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
    -L-#1은 -(Lb)o-(LIG)p이고,
    LIG는 종양 세포의 표적 분자에 결합한 후, 종양 세포에 의해 내재화되고 세포내에서 및 바람직하게는 리소솜에서 프로세싱되는 결합제이고,
    Lb는 링커이고,
    o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고,
    -MOD는 -(NR10)n-(G1)o-G2-G3이고,
    R10은 -H 또는 C1-C3-알킬이고,
    G1은 -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH- 또는
    Figure pct00553
    이고,
    n은 0 또는 1이고;
    o는 0 또는 1이고
    G2는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -NRy-, -NRyC(=O)-, -C(=O)NRy-, -NRyNRy-, -S(=O)2-NRyNRy-, -C(=O)-NRyNRy-, -C(=O)-, -CRx=N-O-에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
    Ry는 -H, 페닐, C1-C10-알킬, C2-C10-알케닐 또는 C2-C10-알키닐이고, 이들 각각은 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드, 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있고,
    Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이고,
    G3은 -H 또는 -COOH이고,
    -MOD는 적어도 1개의 -COOH 기를 갖는다.
  11. 제10항에 있어서, R1 또는 R3은 -L-#1인 화합물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, X1은 CH이고, X2는 C이고 X3은 N인 화합물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R6 및 R7은 독립적으로 -H, C1-3-알킬 또는 할로겐인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, R6 및 R7은 F인 화합물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R8은 C1-4-알킬 (바람직하게는 tert-부틸) 또는 시클로헥실인 화합물.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, R9는 -H인 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, D 또는 R은 결합제 LIG를 함유하는 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, LIG는 옥트레오티드, GnRH-III, [D-Tyr6, β-Ala11, Phe13, Nle14]BN(6-14), NT(8-13), c(RGDfK), HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2 (서열식별번호: 161), NAP아미드, [Phe7, Pro34]NPY, HER2-표적화 펩티드, ATEPRKQYATPRVFWTDAPG (서열식별번호: 162), LQWRRDDNVHNFGVWARYRL (서열식별번호: 163)로부터 선택된 펩티드, 단백질 또는 그의 유도체, 또는 항체 또는 그의 단편 또는 유도체이고 이는 종양 세포의 세포외 표적 분자에 결합하고 추가로 세포독성 약물에 접합된 것인 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 III'를 갖는 화합물.
    Figure pct00554

    여기서
    m, n, r, LIG, La, Lc, D1, X, A2, R2 및 A1은 제1항에서 주어진 정의를 갖는다.
  20. 화학식 IIIa'의 화합물.
    Figure pct00555

    여기서
    m, n, r, La, Lc,D1, X, R2, A2 및 A1은 제1항에서와 동일한 정의를 갖고,
    AB는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이고
    s는 1 내지 20,
    바람직하게는 2 내지 8,
    보다 바람직하게는 2 내지 6이다.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 IV'를 갖는 화합물.
    Figure pct00556

    여기서
    m, n, o, R, LIG, La, Lb, D1, X, R2, A2 및 A1은 제1항에서와 동일한 정의를 갖는다.
  22. 화학식 IVa'의 화합물.
    Figure pct00557

    여기서
    m, n, o, R, La, Lb, D1, X 및 A1은 제1항에서와 동일한 정의를 갖고,
    AB는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이고
    s는 1 내지 20,
    바람직하게는 2 내지 8,
    보다 바람직하게는 2 내지 6이다.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 Lb 또는 Lc는 결합제, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 시스테인 측쇄 또는 시스테인 잔기에 결합되고, 하기 화학식을 갖는 것인 화합물.
    §-(C=O)m-L1-L2-§§
    여기서
    m은 0 또는 1이고;
    §는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고
    §§는 결합제에 대한 결합이고,
    -L2-는 기
    Figure pct00558

    이며,
    여기서
    #1은 결합제의 황 원자에 대한 연결 부위를 나타내고,
    #2는 L1 기에 대한 연결 부위를 나타내고,
    L1은 -(NR10)n-(G1)o-G2-이고,
    R10은 -H, -NH2 또는 C1-C3-알킬이고,
    G1은 -NHC(=O)- 또는
    Figure pct00559
    이고,
    n은 0 또는 1이고,
    o는 0 또는 1이고,
    G2는 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고, 이는 기 -O-, -S-, -S(=O)-, -S(=O)2, -NH-, -C(=O)-, -Nme-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, -C(=O)-NHNH-, 및 N, O 및 S, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클 (바람직하게는
    Figure pct00560
    ) 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며,
    여기서 측쇄는, 존재하는 경우에, -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, 술폰아미드, 술폰, 술폭시드 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있거나,
    또는 하기 기:
    Figure pct00561

    중 1개이며,
    여기서
    Rx는 -H, C1-C3-알킬 또는 페닐이다.
  24. 제23항에 있어서, L2는 하기 화학식 중 하나 또는 둘 다인 화합물.
    Figure pct00562

    Figure pct00563

    여기서
    #1은 결합제의 황 원자에 대한 연결 부위이고,
    #2는 L1 기에 대한 연결 부위이고,
    R22는 -COOH이고
    결합제의 황 원자에 대한 결합은 80% 초과 (결합제에 대한 링커 내의 결합의 총수에 기초함)의 정도로 이들 2개의 화학식 중 하나로 존재한다.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 탄화수소 쇄는 하기 기 중 1개에 의해 개재된 것인 화합물.
    Figure pct00564

    여기서
    X는 -H, 또는 C1-10-알킬 기이고 이는 -NH-C(=O)-NH2, -COOH, -OH, -NH2, -NH-CNNH2, 술폰, 술폭시드 또는 술폰산에 의해 임의로 치환될 수 있다.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물.
    Figure pct00565

    여기서
    #3은 약물 분자에 대한 결합이고,
    #4는 결합제에 대한 결합이고,
    R11은 -H 또는 -NH2이고,
    B는 -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z- 기이고,
    w는 0 내지 20이고;
    x는 0 내지 5이고;
    y는 0 또는 1이고;
    z는 0 내지 5이고;
    X4는 -O-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)- 또는
    Figure pct00566
    이다.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 -Lb- 및/또는 -Lc-는 시스테인 측쇄 또는 시스테인 잔기에 결합되고 하기 화학식을 갖는 것인 화합물.
    Figure pct00567

    여기서
    §는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
    §§는 결합제에 대한 결합이고,
    m은 0, 1, 2, 또는 3이고,
    n은 0, 1 또는 2이고,
    p는 0 내지 20이고,
    L3은 기
    Figure pct00568

    이며,
    여기서
    o는 0 또는 1이고,
    §'는 -S(O)n 기에 대한 결합이고
    §"는 고리 내의 질소 원자에 대한 결합이고
    G3은 아릴렌 기 및/또는 직쇄 및/또는 분지형 및/또는 시클릭 알킬렌 기로 구성된, 1 내지 100개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄이고 이는 기 -O-, -S-, -S(=O)-, S(=O)2-, -NH-, -C(=O)-, -NH-C(=O)-, -C(=O)-NH-, 및 N, O 및 S, -Nme-, -NHNH-, -S(=O)2-NHNH-, -C(=O)-NHNH-, -S(=O)- 또는 -S(=O)2-로부터 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 갖는 5- 내지 10-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클 (바람직하게는
    Figure pct00569
    ) 중 1개 이상에 의해 1회 또는 1회 초과 개재될 수 있으며, 여기서 측쇄는, 존재하는 경우에, -NHC(=O)-NH2, -COOH, -OH, 술폰, 술폭시드 또는 술폰산에 의해 치환될 수 있다.
  28. 제27항에 있어서, 링커 -Lb- 또는 -Lc-는 시스테인 측쇄 또는 시스테인 잔기에 결합되고 하기 화학식을 갖는 것인 접합체.
    Figure pct00570

    여기서
    §는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
    §§는 결합제에 대한 결합이고,
    m은 1이고;
    p는 0이고;
    n은 0이고,
    L3은 기
    Figure pct00571

    이며
    여기서
    o는 0 또는 1이고,
    G3은 -(CH2CH2O)s - (CH2)t - (C(=O)-NH)u - CH2CH2O)v - (CH2)w-이고,
    s, t, v 및 w는 독립적으로 0 내지 20이고,
    u는 0 또는 1이고,
    §'는 -S(O)n 기에 대한 결합이고
    §"는 고리 내의 질소 원자에 대한 결합이다.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, R2 또는 R3은 -L-#1인 화합물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 결합제 또는 그의 유도체 (바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편)로 구성된, 화학식 (X)의 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염.
    Figure pct00572

    여기서
    AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이고,
    n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
    X1은 N이고,
    X2는 N이고
    X3은 C이거나;
    또는
    X1은 N이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이거나;
    또는
    X1은 CH 또는 CF이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이거나;
    또는
    X1은 NH이고,
    X2는 C이고
    X3은 C이거나;
    또는
    X1은 CH이고,
    X2는 N이고
    X3은 C이고
    A는 -C(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)2- 또는 -S(=O)2-NH-이고,
    M은 기
    (*)-C(=O)-NH-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH2-CH2-COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(**),
    Figure pct00573

    Figure pct00574

    Figure pct00575

    (*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-C(=O)-NH-R12,
    Figure pct00576

    Figure pct00577

    Figure pct00578

    이고,
    R12는 기
    (*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH, (*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH 또는
    Figure pct00579

    이고
    R1은 수소 또는 기
    Figure pct00580

    이고
    X는 -C(=O)-NH2이고,
    Rx 및 Ry는 독립적으로 -CH3, -CH2-COOH, -(CH2)2-COOH, -CH2-C(=O)-NH2, -CH2OH 또는 -CH2R11이고,
    R10은 메틸, -(C(=O))q-O-R11, -C(=O)-(CH2)m-R11이고,
    q는 0 또는 1이고,
    m은 0, 1 또는 2이고,
    R11은 수소, 메틸, 벤질, 피리딜, 이미다졸릴 또는 기 -(O-CH2-CH2)p-O-CH3이고,
    p는 1 내지 11이고,
    R2는 -H이고,
    R3은 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬 기이고 이는 1 내지 3개의 OH 기, 1 내지 3개의 할로겐 원자, 1 내지 3개의 모노-, 디- 또는 트리할로겐화 알킬 기, 1 내지 3개의 -O-알킬 기, 1 내지 3개의 -SH 기, 1 내지 3개의 -S-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -O-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-알킬 기, 1 내지 3개의 -NH-C(=O)-NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)n-알킬 기, 1 내지 3개의 -S(=O)2-NH-알킬 기, 1-3개의 -NH-알킬 기, 1 내지 3개의 -N(알킬)2 기, 1 내지 3개의 NH2 기 또는 1 내지 3개의 -(CH2)0-3Z 기에 의해 치환될 수 있고,
    n은 0, 1 또는 2이고,
    Z는 -H, 할로겐, -OY3, -SY3, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2 또는 -C(=O)-OY3이고,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Y3은 -H, -(CH2)0-3-CH-(NHC(=OCH3)Z', -(CH2)0-3-CH(NH2)Z' 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
    R5는 -H, -NH2, -NO2, 할로겐, -CN, -CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, -SH 또는 -(CH2)0-3Z이고,
    Z는 -H, -OY3, -SY3, 할로겐, -NHY3, -C(=O)-NY1Y2, 또는 -C(=O)-OY3이고,
    Y1 및 Y2는 독립적으로 -H, -NH2, 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Y3은 -H 또는 -(CH2)0-3Z'이고,
    Z'는 -H, -S(=O)3H, -NH2 또는 -COOH이고,
    R6 및 R7은 독립적으로 -H, -CN, C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, 히드록실, -NO2, -NH2, -COOH 또는 할로겐이고,
    R8은 C1-10-알킬, 플루오로-C1-10-알킬, C2-10-알케닐, 플루오로-C2-10-알케닐, C2-10-알키닐, 플루오로-C2-10-알키닐, C4-10-시클로알킬, 플루오로-C4-10-시클로알킬 또는 -(CH2)0-2-(HZ2)이고,
    HZ2는 N, O 및 S로부터 선택된 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 4- 내지 7-원 헤테로사이클이고, 이는 -OH, -COOH 또는 -NH2에 의해 치환될 수 있고,
    R9는 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F 또는 -CHF2이고,
    (*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
    (**)는 결합제에 대한 결합이다.
  31. 제30항에 있어서,
    AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이고,
    n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
    X1은 CH이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이고;
    A는 -C(=O)-이고,
    M은 기
    (*)-C(=O)-NH-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH2-CH2-COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-(**),
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(**),
    Figure pct00581

    Figure pct00582

    Figure pct00583

    (*)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-NH-R12,
    (*)-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH2-C(=O)-NH-R12,
    Figure pct00584

    Figure pct00585

    Figure pct00586

    이고
    R12는 기
    (*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH, (*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH 또는
    Figure pct00587

    이고
    R1은 수소 또는 기
    Figure pct00588

    이고
    X는 -C(=O)-NH2이고,
    Rx 및 Ry는 독립적으로 -CH3, -CH2-COOH, -(CH2)2-COOH, -CH2-C(=O)-NH2, -CH2OH 또는 -CH2R11이고,
    R10은 메틸, -(C(=O))q-O-R11, -C(=O)-(CH2)m-R11이고,
    q는 0 또는 1이고,
    m은 0, 1 또는 2이고,
    R11은 수소, 메틸, 벤질, 피리딜, 이미다졸릴 또는 기 -(O-CH2-CH2)p-O-CH3이고,
    p는 1 내지 11이고,
    R2는 -H이고,
    R3은 -CH2-OH 기이고,
    R5는 -H이고,
    R6 및 R7은 독립적으로 플루오린이고,
    R8은 t-부틸이고,
    R9는 -H이고,
    (*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
    (**)는 결합제에 대한 결합인
    화학식 (X)의 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편으로 구성된, 화학식 (XI) 및 (XI')의 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염.
    Figure pct00589

    여기서
    AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이고,
    n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
    X1은 N이고,
    X2는 N이고
    X3은 C이거나;
    또는
    X1은 N이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이거나;
    또는
    X1은 CH 또는 CF이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이거나;
    또는
    X1은 NH이고,
    X2는 C이고
    X3은 C이거나;
    또는
    X1은 CH이고,
    X2는 N이고
    X3은 C이고
    M은 기
    Figure pct00590

    -(CH2)3-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-R12
    이고
    R12는 기
    (*)-C(=O)-(**), (*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH,
    (*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH
    Figure pct00591

    이고
    R1은 기
    Figure pct00592

    Figure pct00593

    이고
    X는 -CH2-C(=O)-NH2, -C(=O)-NH2이고,
    Rx 및 Ry는 -CH3, 프로필이고,
    R10은 -C(=O)-(CH2)-R11, -C(=O)-(CH2-CH2-O)p-CH3이고,
    R11은 수소, 피리딜이고,
    p는 8 내지 12이고,
    R5는 -H이고,
    R6 및 R7은 독립적으로 플루오린이고,
    R8은 t-부틸이고,
    R9는 -H이고,
    (*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
    (**)는 결합제에 대한 결합이다.
  33. 제32항에 있어서,
    AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이고,
    n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수이고,
    X1은 CH이고,
    X2는 C이고
    X3은 N이고;
    M은 기
    Figure pct00594

    Figure pct00595

    및
    -(CH2)3-NH-C(=O)-CH(CH2-C(=O)-NH2)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-(CH2)3-R12
    이고
    R12는 기
    (*)-C(=O)-(**), (*)-C(=O)-CH(**)-CH2-COOH,
    (*)-C(=O)-CH2-CH(**)-COOH
    Figure pct00596

    이고
    R1은 기
    Figure pct00597

    Figure pct00598

    이고
    X는 -CH2-C(=O)-NH2, -C(=O)-NH2이고,
    Rx 및 Ry는 -CH3, 프로필이고,
    R10은 -C(=O)-(CH2)-R11, -C(=O)-(CH2-CH2-O)p-CH3이고,
    R11은 수소, 피리딜이고,
    p는 8 내지 12이고,
    R5는 -H이고,
    R6 및 R7은 독립적으로 플루오린이고,
    R8은 t-부틸이고,
    R9는 -H이고,
    (*)는 약물 분자 또는 레구마인-절단가능한 기에 대한 결합이고,
    (**)는 결합제에 대한 결합인
    화학식 (XI) 및 (XI')의 접합체 및 그의 염, 용매화물 및 용매화물의 염.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    AK는 결합제, 바람직하게는 항체 또는 항원-결합 항체 단편 (AK1, AK2, AK3)이고,
    AK1은 바람직하게는 시스테인 잔기를 통해 KSP 억제제에 결합된 항체이고,
    AK2는 바람직하게는 리신 잔기를 통해 KSP 억제제에 결합된 항체이고
    AK3은 바람직하게는 글루타민 잔기를 통해 KSP 억제제에 결합된 항체이고,
    n은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 8 및 특히 2 내지 6의 수인
    하기 구조의 접합체:
    Figure pct00599

    Figure pct00600

    Figure pct00601

    Figure pct00602

    Figure pct00603

    Figure pct00604

    Figure pct00605

    Figure pct00606

    Figure pct00607

    Figure pct00608

    Figure pct00609

    Figure pct00610

    Figure pct00611

    Figure pct00612

    Figure pct00613

    Figure pct00614

    Figure pct00615

    Figure pct00616

    Figure pct00617

    Figure pct00618

    Figure pct00619

    Figure pct00620

    Figure pct00621

    Figure pct00622

    Figure pct00623

    Figure pct00624
    .
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편이 세포외 암 표적 분자에 결합하는 것인 화합물 또는 접합체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 항체 단편이, 표적 세포 상의 그의 세포외 표적 분자에 결합한 후, 결합을 통해 표적 세포에 의해 내재화되는 것인 화합물 또는 접합체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-B7H3 항체, 항-TWEAKR 항체, 또는 이들의 항원-결합 항체 단편인 화합물 또는 접합체.
  38. 제37항에 있어서, 항-TWEAKR 항체가 TPP-7006, TPP-7007, TPP-10336 및 TPP-10337로 이루어진 군으로부터 선택되고, 항-B7H3 항체가 TPP-8382 및 TPP-8567로 이루어진 군으로부터 선택되고, 항-EGFR 항체가 세툭시맙 (TPP-981)이고 항-HER2 항체가 트라스투주맙 및 TPP-1015로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물 또는 접합체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 (AK, AB, AK1, AK2, AK3)가
    (i) 서열식별번호: 2에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 3에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 4에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 6에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 7에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 8에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체이거나,
    (ii) 서열식별번호: 12에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 13에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 14에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 17에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 18에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (iii) 서열식별번호: 22에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 23에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 24에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 26에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 27에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 28에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (iv) 서열식별번호: 32에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 33에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 34에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 36에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 37에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 38에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (v) 서열식별번호: 42에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 43에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 44에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 46에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 47에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 48에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (vi) 서열식별번호: 52에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 53에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 54에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 56에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 57에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 58에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (vii) 서열식별번호: 62에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 63에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 64에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 66에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 67에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 68에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (viii) 서열식별번호: 72에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 73에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 74에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 76에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 77에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 78에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (ix) 서열식별번호: 82에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 83에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 84에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 86에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 87에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 88에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (x) 서열식별번호: 92에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 93에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 94에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 96에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 97에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 98에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이거나,
    (xi) 서열식별번호: 102에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 103에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 104에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 106에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 107에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 108에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이거나,
    (xii) 서열식별번호: 112에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 113에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 114에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 116에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 117에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 118에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xiii) 서열식별번호: 122에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 123에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 124에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 126에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 127에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 128에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xiv) 서열식별번호: 132에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 133에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 134에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 136에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 137에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 138에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xv) 서열식별번호: 142에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 143에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 144에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 146에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 147에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 148에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나, 또는
    (xvi) 서열식별번호: 152에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR1 서열 (H-CDR1), 서열식별번호: 153에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR2 서열 (H-CDR2) 및 서열식별번호: 154에 의해 제시된 바와 같은 중쇄의 가변 CDR3 서열 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄의 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 156에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR1 서열 (L-CDR1), 서열식별번호: 157에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR2 서열 (L-CDR2) 및 서열식별번호: 158에 의해 제시된 바와 같은 경쇄의 가변 CDR3 서열 (L-CDR3)을 포함하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나
    또는 이들 항체의 항원-결합 단편인 화합물 또는 접합체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 (AK, AB, AK1, AK2, AK3)가
    (i) 서열식별번호: 1에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 5에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-EGFR 항체이거나,
    (ii) 서열식별번호: 11에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 15에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (iii) 서열식별번호: 21에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 25에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (iv) 서열식별번호: 31에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 35에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (v) 서열식별번호: 41에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 45에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (vi) 서열식별번호: 51에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 55에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (vii) 서열식별번호: 61에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 65에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (viii) 서열식별번호: 71에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 75에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (ix) 서열식별번호: 81에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 85에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (x) 서열식별번호: 91에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 95에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이거나,
    (xi) 서열식별번호: 101에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 105에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-B7H3 항체이거나,
    (xii) 서열식별번호: 111에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 115에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xiii) 서열식별번호: 121에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 125에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xiv) 서열식별번호: 131에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 135에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xv) 서열식별번호: 141에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 145에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나, 또는
    (xvi) 서열식별번호: 151에 상응하는 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 155에 상응하는 경쇄의 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    또는 이들 항체의 항원-결합 단편인 화합물 또는 접합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 (AK, AB, AK1, AK2, AK3)가
    (i) 서열식별번호: 9에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 10에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-EGFR 항체이거나,
    (ii) 서열식별번호: 19에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 20에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (iii) 서열식별번호: 29에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 30에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (iv) 서열식별번호: 39에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 40에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (v) 서열식별번호: 49에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 50에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (vi) 서열식별번호: 59에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 60에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (vii) 서열식별번호: 69에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 70에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (viii) 서열식별번호: 79에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 80에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (ix) 서열식별번호: 89에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 90에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-HER2 항체이거나,
    (x) 서열식별번호: 99에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 100에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-B7H3 항체이거나,
    (xi) 서열식별번호: 109에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 110에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-B7H3 항체이거나,
    (xii) 서열식별번호: 119에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 120에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xiii) 서열식별번호: 129에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 130에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xiv) 서열식별번호: 139에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 140에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    (xv) 서열식별번호: 149에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 150에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나, 또는
    (xvi) 서열식별번호: 159에 상응하는 중쇄의 영역 및 서열식별번호: 160에 상응하는 경쇄의 영역을 포함하는 항-TWEAKR 항체이거나,
    또는 이들 항체의 항원-결합 단편인 화합물 또는 접합체.
  42. 제1항 내지 제29항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 불활성 비-독성 제약상 적합한 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
  43. 제1항 내지 제29항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한 화합물.
  44. 제1항 내지 제29항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 및/또는 혈관신생 장애의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한 화합물.
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