KR100733933B1 - 전립선 특이적 막 항원에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

전립선 특이적 막 항원에 대한 인간 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합 부위에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 항체 또는 그의 일부를 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭을 수행하여 다수의 인간 모노클로날 항체 아이소타입을 생산할 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스에서 생산할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 인간 항체를 생산하는 비인간 형질전환 동물 및 하이브리도마, 및 상기 인간 항체를 사용한 치료 및 진단 방법에 관한 것이다.
전립선 특이적 막 항원, 모노클로날 항체, 하이브리도마.

Description

전립선 특이적 막 항원에 대한 인간 모노클로날 항체 {Human Monoclonal Antibodies to Prostate Specific Membrane Antigen}
전립선 암은 매우 만연되어 있는 암이며 사람의 질병 및 사망을 일으키는 주된 원인이다. 전립선 암의 치료에는 수술요법, 호르몬요법, 방사선요법 및 화학치료법이 포함된다. 종래에는 전이성 전립선 질환을 위한 효과적인 치료법이 거의 없었으며, 따라서 정확한 진단 및 예후용 표시자를 나타내는 유전자 및(또는) 유전자 산물뿐 아니라 치료 대상을 확인하는 것은 중요하다. 전립선 특이적 항원 (PSA)은 전립선 암의 임상 진단 및 단계화에 있어 중요한 가치를 갖는 암 표시자의 하나이다. 그러나, PSA는 전립선염 또는 전립선 암으로부터 양성 전립선 증식 (BPH)을 4 내지 10 ng/ml의 범위로 분화시킬 수 없으며, 따라서 적절한 진단을 위한 세포학적 및(또는) 조직학적 평가를 필요로 한다 (9).
전립선 특이적 막 항원 (PSMA)은 아미노산 750개로 이루어진, 트랜스페린 수용체와 54 %의 상동성을 갖는 약 110 kD 크기의 타입 II 막횡단 당단백질이다. PSM'은 세포질에 위치하는 PSMA의 선택적으로 스플라이싱된 형태이다. PSMA는 아미노산 19개의 세포내 도메인, 아미노산 24개의 막횡단 도메인 및 아미노산 707개의 세포외 도메인을 포함하는 3개의 구조적 도메인을 갖는다. PSMA 단백질은 뉴로카르복시펩티다제 및 폴레이트 히드롤라제 활성을 나타내며, 따라서 전립선 성장 및 분화에 대한 신경내분비 조절에 관여할 수 있다 (7).
PSMA 발현에 대한 연구 결과는 PSMA가 전립선 상피 세포에 의해 주로 발현되는 새로운 마커라는 사실을 암시한다. 또한, PSMA의 발현은 전립선 암, 특히 불충분하게 분화된 전이성 및 호르몬 난치성 암에서 증가한다 (8,11). 따라서, PSMA는 전립선 암에서 유용한 진단, 예후 및 치료의 대상을 나타낸다. 낮은 수준의 PSMA 발현은 또한 소장, 침샘, 십이지장 점막, 인접 신세뇨관 및 뇌와 같은 전립선외 조직에서 관찰된다 (11).
뇌에서 PSMA는 신경전달물질 NAAG의 HAA 및 유리 글루타메이트로의 전환에 관여하며, 이는 다발성 경화증, 근위축성측삭경화증, 알쯔하이머병 및 정신분열증과 같은 신경학적 질환의 발병에 있어서 중요할 수 있다 (12). PSMA 발현은 또한 신장세포암 및 결장암을 비롯한 몇몇 악성종양의 종양주위 및 종양내 부위에서 모세혈관의 내피에서 관찰되지만, 정상 조직 유래의 혈관에서는 관찰되지 않으며, 이 사실은 PSMA 발현이 또한 종양 혈관신생과 관련이 있을 수 있음을 시사한다 (11).
<발명의 요약>
본 발명은 전립선-특이적 막 항원 (PSMA)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 이러한 항체를 1종 이상 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 항체의 특징은 인간 항체는 높은 친화도로 PSMA에 결합하여, 인간 이펙터 세포 (예를 들어, 다형핵 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포)의 존재 하에 (생체내 및 시험관내에서) PSMA 발현 세포의 생장을 억제하고(하거나) PSMA 발현 세포의 세포 사멸 (예를 들어, 용해 또는 식세포작용)을 매 개하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내 및 시험관내에서 진단제 및 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명의 단리된 인간 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE와 같은 다양한 항체 이소타입을 포함한다. 전형적으로, 이들 인간 항체는 IgG1 (예를 들어, IgGlk) 및 IgM 이소타입을 포함한다. 상기 항체는 전장일 수 있거나 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 항원-결합 부위 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)만을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 재조합 인간 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 인간 항체는 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는, 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 얻은 B 세포가 불멸 세포에 융합된 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다. 구체적 실시양태에서, 인간 항체는 본원에서 4A3, 7F12, 8A11, 16F9 및 8C12로 불리는 하이브리도마에 의해 생산된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항-PSMA 항체는 하나 이상의 하기 성질을 특징으로 한다.
a) PSMA에 대한 특이성;
b) 친화 상수가 약 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 109 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 1010 M-I 내지 1011 M-I 또는 그 이상인, PSMA와의 결합 친화성;
c) 약 103 이상, 바람직하게는 약 104, 보다 바람직하게는 약 105 M-1 S-1의, PSMA와의 결합 상수 (Kassoc);
d) 약 10-3 s-1, 바람직하게는 약 10-4 s-1, 보다 바람직하게는 10-5 s-1, 가장 바람직하게는 10-6 s-1의, PSMA로부터의 해리 상수 (Kdis);
e) PSMA를 발현하는 세포를 옵소닌화(opsonization)하는 능력; 또는
f) (예를 들어, 시험관내에서) 인간 이펙터 세포의 존재 하에 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 PSMA 발현 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 생장을 억제하는 능력 및(또는) PSMA 발현 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 능력.
본 발명의 인간 항체에 의해 표적화될 수 있는 종양 세포의 예로는 전립선, 신장 및 결장의 종양 세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 인간 항체는 약 107 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 가장 바람직하게는 약 1010 내지 1011 M-l 또는 그 이상의 친화 상수로 PSMA 항원에 결합하고, 시험관내에서 약 1 x l0-7 M 이하의 IC50 또는 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 PSMA 발현 세포의 생장을 억제하고(하거나) 인간 이펙터 세포, 예를 들어, 다형핵 세포 (PMN), 단핵구 및 대식세포에 의한 PSMA 발현 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체 코딩 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이 벡터로 형질감염된 숙주 세포 뿐만 아니라, 이들 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 포함된다.
PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 다양한 이소타입 (예컨대, IgG, IgA 및(또는) IgM)을 발현할 수 있는 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 단리된 B 세포는 정제된 PSMA 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) PSMA를 발현하는 세포로 면역화된 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻는다. 바람직하게는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스에는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈이 있다. 이어서, 단리된 B-세포를 불멸화하여 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 공급원 (예를 들어, 하이브리도마)를 제공한다.
따라서, 본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 하이브리도마는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖고 불멸 세포에 융합되어 있는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함한다. 형질전환 비인간 동물은 정제된 PSMA 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) PSMA를 발현하는 세포로 면역화시켜 항체-생산 하이브리도마를 만들 수 있다. 본 발명의 구체적 하이브리도마로는 4A3, 7F12, 8A11, 16F9 및 8C12가 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 형질전환 마우스 (본원에서 "HuMAb"로 불림)와 같은 형질전환 비인간 동물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 형질전환 비인간 동물은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스이다. 상기 형질전환 비인간 동물은 정제된 PSMA 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) PSMA를 발현하는 세포로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입 (예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들어, 전형적인 이소타입 전환 또는 비전형적 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PSMA와 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스를 정제된 PSMA 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) PSMA를 발현하는 세포로 면역화시키는 것을 포함한다. 이어서, 상기 동물의 B 세포 (예를 들어, 비장 B 세포)를 얻어 골수종 세포와 융합시켜 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
본 발명의 단리된 항-PSMA 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 유도화될 수 있거나 또 다른 기능성 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단 백질 (예컨대, Fab' 단편)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 1종 이상의 다른 분자, 예컨대, 또 다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체)에 기능적으로 연결될 수 있다 (예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로 연결될 수 있음). 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 PSMA에 대한 제1 결합 특이적 부위 및 Fc 수용체, 예컨대, 인간 FcγRI 또는 인간 Fcα수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 하나 이상 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다.
본 발명의 다중특이적 분자는 또한 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 항-상승 인자 (EF) 부위, 예를 들어, 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하는 분자를 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 1종 이상의 인간 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 완전하게 인간 항체 또는 그의 일부, 또는 "키메라" 또는 "인간화" 항체 부위 또는 그의 일부 (예를 들어, 인간 유래의 부위가 남아 있는 비인간 항체 (예컨대, 뮤린)로부터 유래된 가변 영역 또는 적어도 상보성 결정 영역 (CDR)을 가짐)이다.
한 실시양태에서, 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자의 하나 이상의 항체 또는 그의 단편은 인간 IgG 수용체, 예를 들어, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD 16)와 같은 Fc-감마 수용체 (FcγR)에 결합한다. 바람직한 Fcγ 수용체는 고친화성 Fcγ수용체인 FcγRI이다. 그러나, 다른 Fc 수용체, 예를 들어 인간 IgA 수용체 (FcαRI)도 표적화될 수 있다. Fc 수용체는 바람직하게는 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 또는 활성화된 다형핵 세포의 표면 상에 위치한다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 Fc 수용체의 이뮤노글로불린 Fc (예를 들어, IgG 또는 IgA) 결합 부위와 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 분자와 다중특이적 분자의 결합은 이뮤노글로불린의 생리학적 농도에 의해 방해받지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 특징은 치료 잔기, 예를 들어, 세포독성 약물, 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 방사선동위원소, 또는 소분자 항암제에 결합된 인간 항-PSMA 항체 또는 그의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 수용체를 발현하는 이펙터 세포, 예를 들어, 대식세포 또는 활성화된 PMN 세포를 포함하는 표적-특이적 이펙터 세포 및 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체, 및 PSMA에 특이적으로 결합하는 본 발명의 1종 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 포함하는, 조성물, 예를 들어, 제약 및 진단 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 배합물을 포함하며, 상기 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위 각각은 상이한 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이펙터 세포의 존재 하에 표적 세포의 고효율적 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 PSMA를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 또 다른 인간 모노클로날 항체와 병용할 수 있다. 따라서, 이러한 병용은 최대 치료 효과를 제공하도록 맞춰진 다양한 치료법을 제공한다. 본 발명의 1종 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위와 본 발명의 1종 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 분자의 배합물을 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물도 본 발명의 범위내에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체)를 사용하여 인간 이펙터 세포, 예컨대, 인간 다형핵 세포 (PMN), 단핵구 및 마크로파지에 의한 표적 세포의 생장을 억제하고(하거나) 상기 표적 세포의 식세포작용 및(또는) 사멸을 유도시킴으로써 PSMA를 발현하는 세포의 증식 및(또는) 분화를 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 PSMA를 발현하는 세포를 시험관내 또는 생체내에서 인간 이펙터 세포의 존재 하에 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위 중 하나 또는 이들의 배합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 배양물, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외 (예컨대, PSMA를 발현하는 세포 및 이펙터 세포를 발현하는 세포를 포함하는 배양물) 중에서 이용할 수 있다. 예를 들어, PSMA를 발현하는 세포 및 이펙터 세포를 함유하는 샘플을 시험관내에서 배양하여 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자)와 혼합할 수 있다. 별법으로, 상기 방법은 대상체, 예를 들어, 생체내 (예컨대, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 대상체내에서 수행할 수 있다.
생체내 방법의 경우, 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자)는 PSMA-관련 질환, 예를 들어 전립선암, 신장암 및 결장암을 앓는 인간 환자에게 투여하여 PSMA를 발현하는 세포의 생장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 Fc 수용체, 예컨대, Fcα 수용체 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들어, 상승시키거나 억제하는 약제, 예를 들어, 사이토킨으로 더 치료할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자로 치료하는 동안 투여하기에 바람직한 사이토킨으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 있다.
본 발명의 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 다른 공지된 치료법, 예를 들어, 항암요법과 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료할 수 있거나 (예를 들어, 완화시킬 수 있거나) 예방할 수 있는 예시적 질환으로는 종양발생 질환이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 종양발생 질환으로는 전립선암, 신장암 및 결장암이 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중의 PSMA 항원의 존재를 시험관내에서 또는 생체내에서 검출하기 위한 방법, 예를 들어, PSMA-관련 질환을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 대조구 샘플과 함께 시험할 샘플을, 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 PSMA 사이의 결합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 이중특이적 또는 다중특이적 분자)와 접촉시킴으로써 달성된다. 이어서, (예를 들어, ELISA를 이용하여) 두 샘플에서 결합체 형성을 검출하고, 두 샘플 사이의 결합체의 형성에 있어서 임의의 통계학적으로 유의한 차이점은 PSMA 항원이 시험 샘플에 존재함을 나타낸다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 neo 카세트가 μ1 엑손의 SmaI 부위로 표적화 삽입되는 것을 나타내는 개요도이다. 패널 A는 μ좌위의 게놈 구조를 나타내며, 여기서 내용이 기입된 테두리한 부분은 μ엑손을 나타낸다. 패널 B는 CmD 표적화 벡터의 개요도이다. 패널 C는 neo 카세트가 μ1내에 삽입되어 있는 표적화된 μ좌위를 나타낸다.
도 2는 형질전환 마우스를 면역화하여 PSMA, PSMA 및 CD89 (FcαR)에 대한 IgG1K 인간 모노클로날 항체 (HuMab)를 생산하는 방법에 대한 개요도이다.
도 3은 CD89 (FcαR) 및 PSMA에 결합하는 완전한 인간 이중특이적 분자 14.1 x 8C12를 나타낸다. 이 분자는 디술피드 결합에 의해 항-PSMA Fab' 항체 단편 (인간 모노클로날 항-PSMA 항체, 8C12로부터 유도됨)에 화학적으로 연결되는 항-CD89 Fab' 항체 단편 (인간 모노클로날 항-CD89 항체, 14.1로부터 유도됨)을 포함한다.
도 4는 ELISA에 의해 평가된 바와 같이 인간 항-PSMA 모노클로날 항체와, 인간 전립선 선암종 LNCaP 및 PC3 세포로부터의 막 분획과의 반응성을 나타낸다. 405 nm에서의 배경 흡광도는 0.05이었다.
도 5는 유동세포계수분석에 의해 평가된 바와 같이 인간 항-PSMA 항체의 LNCaP 및 PC3 종양 세포로의 결합을 나타낸다. 녹색 히스토그램-LNCaP 세포에 대한 결합; 분홍색 히스토그램-PC3 세포에 대한 결합; 자주색 히스토그램-관련 없는 인간 IgG1. 패널 A: 항체 4A3; 패널 B: 항체 7F12; 패널 C: 항체 8A11; 패널 D: 항체 8C12; 패널 E: 항체 16F9.
도 6은 도 3에 나타낸 14.1 x 8C12 이중특이적 분자가 PSMA-발현 LNCaP 세포로 결합하는 것을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타내는 그래프이다. 결합은 평균 형광 강도에 의해 측정하였다.
도 7은 도 3에 나타낸 14.1 x 8C12 이중특이적 분자가 CD89-발현 U937 세포로 결합하는 것을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타내는 그래프이다. 결합은 평균 형광 강도에 의해 측정하였다.
도 8은 인간 항-PSMA 특이적 항체를 사용하여 LNCaP 세포 디터전트 용해물로부터 PSMA를 면역침전시키는 것을 나타낸다. 레인 1: LNCaP 세포 용해물; 레인 2 내지 7: 각각 인간 IgG1 및 16F9를 사용한 면역침전. 쥐 항-PSMA 항체 4D8을 사용하여 SDS 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 면역 복합체를 분석하였다.
도 9는 인간 항-PSMA 항체 결합에 대한 단리된 PSMA의 열변성 효과를 보여준다.
도 10은 유동세포계수법에 의해 측정된 바와 같이 인간 항-PSMA 항체에 대한 경쟁적 결합 분석을 나타낸다. 관련 없는 인간 IgG1 (내부가 색칠된 자주색 히스토그램); 4A3 (황색 히스토그램); 7F12 (녹색 히스토그램); 8A11 (청색 히스토그 램); 8C12 (분홍색 히스토그램); 및 16F9 (오렌지색 히스토그램) 항체를 사용하여 전처리를 수행하였다. 패널 A: FITC A43; 패널 B: FITC 7F12; 패널 C: FITC 8A11; 및 패널 D: FITC 8C12.
도 11은 유동세포계수법에 의해 측정된 바와 같이 인간 항-PSMA 항체 대 쥐 항-PSMA 구조 항체의 경쟁적 결합 분석을 나타낸다. 관련 없는 IgG1 (내부가 색칠된 자주색 히스토그램); 4A3 (황색 히스토그램); 7F12 (녹색 히스토그램); 8A11 (청색 히스토그램); 8C12 (분홍색 히스토그램); 및 16F9 (오렌지색 히스토그램) 항체를 사용하여 전처리를 수행하였다. 패널 A: FITC 1G9; 패널 B: FITC 3C6; 및 패널 C: FITC 4D4.
도 12에서 패널 A는 도 3에 나타낸 14.1 x 8C12 이중특이적 분자를 통한 PSMA-발현 세포의 단핵구-매개된 항체 의존성 세포독성을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타내는 그래프이다. 결과는 저해제를 첨가하지 않은 비 세포 용해율(%), 유리 항-FcRαR (14.1)F(ab')2 50 ㎍/ml를 사용한 비 세포 용해율 및 유리 항-FcγRI(H22)F(ab')2 50 ㎍/ml를 사용한 비 세포 용해율로 측정되었다. 패널 B는 이펙터:표적 비율 100:1의 이중특이적 분자 14A8 x 8C12 및 모노클로날 항체 8C12를 통한 LNCaP 세포의 단핵구-매개된 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 나타내는 그래프이다. 패널 C는 저해제의 부재하에 또는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에 이펙터:표적 비율 100:1의 14A8 x 8C12 이중특이적 분자를 통한 LNCaP 세포의 단핵구-매개된 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 나타내는 그래프이다.
도 13에서 패널 A는 도 3에 나타낸 14.1 x 8C12 이중특이적 분자를 통한 PSMA-발현 세포의 호중구-매개된 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타내는 그래프이다. 결과는 저해제를 첨가하지 않은 비 세포 용해율(%), 유리 항-FcRαR (14.1)F(ab')2 25 ㎍/ml를 사용한 비 세포 용해율 및 유리 항-FcγRI(H22)F(ab')2 25 ㎍/ml를 사용한 비 세포 용해율로 측정되었다. 패널 B는 저해제의 부재하에 또는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에 이펙터:표적 비율 200:1의 14A8 x 8C12 이중특이적 분자를 통한 LNCaP 세포의 호중구-매개된 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 나타내는 그래프이다.
도 14에서 패널 A는 도 3에 나타낸 14.1 x 8C12 이중특이적 분자를 통한 PSMA-발현 세포의 전혈-매개된 항체 의존성 세포독성 (ADCC)을 이중특이적 분자 농도의 함수로 나타내는 그래프이다. 결과는 저해제를 첨가하지 않은 비 세포 용해율(%), 유리 항-FcRαR (14.1)F(ab')2 25 ㎍/ml를 사용한 비 세포 용해율 및 유리 항-FcγRI(H22)F(ab')2 25 ㎍/ml를 사용한 비 세포 용해율로 측정되었다. 패널 B는 저해제의 부재하에 또는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에 14A8 x 8C12 이중특이적 분자를 통한 LNCaP 세포의 전혈-매개된 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 나타내는 그래프이다.
도 15는 단핵구 유도된 대식세포 (MDM)(원형)에 의한 PSMA 발현 (LnCAP) 세포의 이중특이적 분자 (14.1 x 8C12)-매개된 식세포작용을 나타내는 그래프이다. 결과는 저해제로 과량의 14.1 항체 (정사각형) 및 대조군으로 H22 항체 (다이아몬드형) 둘 다의 존재 및 부재하의 식세포작용 비율로 측정되었다.
도 16은 단핵구-유도된 대식세포 (MDM)에 의한 LnCAP 종양 세포의 이중특이적 분자 (14A8 x 8C12)-매개된 식세포작용 및 항체 (8C12)-매개된 식세포작용을 나타내는 그래프이다.
도 17은 단핵구-유도된 대식세포 (MDM)(원형)에 의한 LnCAP 종양 세포의 이중특이적 분자 (14A8 x 8C12)-매개된 식세포작용을 나타내는 그래프이다. 삽입된 그래프는 과량의 14A8 F(ab')2 또는 H22 F(ab')2의 존재하에 14A8 x 8C12 이중특이적 분자 (1 ㎍/ml)에 의해 매개된 식세포작용을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 전립선-특이적 막 항원 (본원에서 "PSMA"로 불림) 및(또는) 관련 분자의 발현, 특히 과발현을 특징으로 하는 질환의 치료 및 진단을 위한 신규 항체-기재 치료법을 제공한다. 본 발명의 치료법은 PSMA 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 사용한다. 한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입 (예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예컨대, 형질전환 마우스에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면은 항체 및 항체 단편, 및 그의 제약학적 조성물 뿐만 아니라, 비 인간 형질전환 동물, 및 상기 모노클로날 항체를 생산하기 위한 B- 세포 및 하이브리도마를 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 PSMA 또는 관련된 교차-반응성 성장인자 수용체를 발현하는 세포를 검출하거나 시험관내 또는 생체내에서 PSMA를 발현하는 세포의 생장, 분화 및(또는) 이동을 억제하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 일부 용어를 먼저 정의한다. 추가 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
용어 "전립선-특이적 막 항원", "PSMA" 및 "PSMA 항원"은 모두 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 인간 PSMA의 임의의 변이체, 이소폼 및 종 상동체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 PSMA-항원의 결합은 PSMA를 발현하는 세포 (예컨대, 종양 세포)의 생장을 억제한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 PSMA-항원의 결합은 PSMA를 발현하는 세포의 이펙터 세포-매개 식세포작용 및 사멸을 매개한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호결합된 두 개 이상의 중쇄 (H) 및 두 개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 한 개의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 골격 영역 (FR)으로 불리며 보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자와 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 항체의 "항원 결합 부위" (또는 단순히 "항체 일부"란 용어는 항원 (예컨대, PSMA)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 1종 이상의 항체 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 보여진 바 있다. 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 있다. 더욱이, Fv 단편의 VL 및 VH 도메인이 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하더라도, 재조합 방법을 사용하여, 이들 두 도메인이 페어링(pairing)하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질로서 만들어지도록 하는 합성 링커에 의해 이들 두 도메인을 연결시킬 수 있다 (상기 1가 분자는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어, 문헌 (Bird et al., (1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)을 참조함). 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 것이다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻고, 유용한 단편은 온전한 항체의 경우와 동일한 방식으로 스크리닝한다.
용어 "이중특이적 분자"는 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 결합체를 포함하고, 이들 물질은 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체와 결합하거나 상호작용하는 두 가지 다른 결합 특이성을 갖는다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체 및 (c) 1종 이상의 다른 성분과 결합하거나 상호작용하는 두 가지 이상의 다른 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 결합체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 PSMA와 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 다른 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "이중특이적 항체"는 디아보디(diabody)를 추가로 포함한다. 디아보디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 발현되는 이가 이중특이적 항체이지만, 동일한 사슬 상의 상기 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하기 때문에 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 상기 도메인들이 페어링되어 두 개의 항원-결합 부위가 형성된다 [예를 들어, 문헌 (Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123)을 참조].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 항체"는 두 가지 이상의 항체, 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab) 및 유도체, 또는 항원-결합 영역들이 연결된 영역 (이들 중 적어도 두 개의 영역은 다른 특이성을 갖음)을 말한다. 이들 다른 특이성에는 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성, 및 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발이나 생체내 체세포 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 이식된 항체는 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자로 된 제제를 말한다. 모노크로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 보인다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스 로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 유전자 (하기 단락 I에 더 자세히 기재됨)로 형질전환된 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용시 발현되는 항체; 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 또는 다른 DNA 서열에 대한 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내에서 돌연변이시켜 (또는 인간 Ig 서열로 형질전환된 동물이 사용된 경우에는, 생체내에 체세포 돌연변이를 유발하여) 얻은 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포의 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이 서열과 관련되어 있지만 생체내에서 인간 생식세포의 항체 레파토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에 사용된 용어 "이종 하이브리드 항체"는 이러한 항체를 생산하는 형질전환 비인간 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 형질전환 비인간 동물로 구성되지 않고 대체적으로 형질전환 비인간 동물의 종 이외의 종으로부터 유래된 유기체에서 발견된 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로하이브리드 항체"는 다양한 유기체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 연결된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다. 헤테로하이브리드 항체의 예로는 전술된 키메라 항체 및 인간화 항체가 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 (예를 들어, PSMA 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는, PSMA에 특이적으로 결합하는 단리된 항체)를 말한다. 그러나, 인간 PSMA의 에피토프, 이소폼 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예컨대, 다른 종으로부터 유래된 다른 관련 항원 (예를 들어, PSMA 종 동족체)와 교차 반응할 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다양한 특이성을 갖는, "단리된" 모노클로날 항체의 배합물은 잘 정의된 조성물 중에서 배합한다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 미리 결정된 항원과 항체의 결합을 말한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 약 1 x 107 M-1의 친화도로 미리 결정된 항원과 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 매우 관련된 항원 이외의 비특이적 항원 (예컨대, BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도보다 2배 이상 더 높은 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어와 상호교환 가능하게 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화도"란 용어는 약 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 109 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 1010 M-1 , 1011 M-1, 1012 M-1 또는 그 이상, 예를 들어, 1013 M-1 또는 그 이상의 결합 친화도를 말한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소타입마다 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "고친화성" 결합은 약 1 x 107 M-1 이상의 결합 친화도를 말한다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc"는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 말한다.
본원에 사용된 용어 "Kdis"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 말한다.
본원에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대, IgM 또는 IgG)를 말한다.
본원에 사용된 "이소타입 전환"은 항체의 클래스 또는 이소타입이 한 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 바뀌는 현상을 말한다.
본원에 사용된 "전환되지 않은 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않은 경우 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 말하는데, 전환되지 않은 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 전형적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 아래에 위치한 전형적인 제1 CH 유전자이다. 이소타입 전환은 고전적인 이소타입 전환 또는 비고전적인 이소타입 전환으로 분류된다. 고전적인 이소타입 전환은 트랜스진내의 전환 서열 영역을 하나 이상 수반하는 재조합 과정에 의해 일어난다. 비전환적 이소타입 전환은 예를 들어, 인간 σμ과 인간 Σμ(δ-관련 결실) 사이의 상동 재조합에 의해 일어날 수 있다. 트랜스진 간의 재조합 및(또는) 염색체 간의 재조합과 같은 별도의 비고전적 전환 메커니즘이 일어나 이소타입 전환을 수행할 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "전환 서열"은 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 말한다. 전형적인 μ전환 영역인 "전환 공여자 (donor)" 서열은 전환 재조합 동안 결실되는 작제물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실된 작제물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대, γ, ε등) 사이에 있을 것이다. 재조합이 항상 일어나는 특정 부위가 없기 때문에, 일반적으로 작제물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없을 것이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 보다 구체적으로 이뮤노글로불린 단백질에 공유 결합된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비인간 형질전환 동물의 종의 상기 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 상기 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 형질전환 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에서 자연적으로 발생되는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 한 대상체에게 적용되는 "자연-발생"이란 용어는 상기 대상체를 자연 상태에서 발견할 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들어, 자연 상태의 공급원으로부터 단리할 수 있고 실험실에서 인간에 의해 고의적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적인 서열이다.
본원에 사용된 용어 "재배열된"은 V 단편이 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 구조로 D-J 또는 J 단편과 바로 인접한 위치에 있는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위의 구성을 말한다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자 좌위는 생식세포의 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 1종 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 원소가 있을 것이다.
V 단편에 대해 본원에 사용된 용어 "재배열되지 않은 구성" 또는 "생식세포 구성"이란 용어는 재조합되지 않아 V 단편이 D 또는 J 단편에 바로 인접하는 구성을 말한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, PSMA와 결합하는 항체 또는 항체 일부 (예를 들어, VH, VL, CDR3)을 코딩하는 핵산에 대한 용어 "단리된 핵산 분자"는 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에는 PSMA 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열이 없고 다른 서열이 인간 게놈 DNA 내의 핵산을 자연적으로 플랭킹할 수 있는 핵산 분자를 말한다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"이란 적당한 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되어 있는 두 핵산 또는 그의 특정 서열이 최적으로 정렬되어 비교될 때 뉴클레오티드의 약 80% 이상, 통상적으로 약 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98 내지 99.5% 이상 동일함을 의미한다. 또는, 실질적인 상동성은 단편이 선택적인 혼성화 조건 하에서 상기 단편 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
두 서열 사이의 동일성%은 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 서열에 의해 나누어진 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/ 위치의 총 # X 100). 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성%의 측정은 하기 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성%은 NWSgapdna CMP 메트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성%은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용한 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)내로 도입되는 알고리즘 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989))]를 이용하여 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성%은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램내로 도입되는 니들만 및 웬치 [Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))] 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "의문 서열"로 사용하여 공개 데이터베이스를 검색함으로써 예컨대, 관련된 서열을 확인할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다.
NBLAST 프로그램 (점수 = 100, 단어길이 = 12)으로 BLAST 뉴클레오티드를 검색하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램 (점수 =50, 단어길이 =3)으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교하기 위한 갭 정렬을 얻기 위해서는 갭 BLAST를 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조).
핵산은 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 전체 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 기술을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 분리되어 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한 형태가 된"다 (F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한효소 부위 등은 제외함), 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이들 돌연변이는 원하는 아미노산 서열에 영향을 줄 수 있다. 특히, 천연 V, D, J 불변 서열 및 전환 서열 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유도된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유도된"은 한 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또는 다른 서열로부터 변형된 것임을 의미함).
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 놓여 있을 때 "작동 가능하게 연결되어" 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 이들이 서열의 전사에 영향을 주다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열의 경우, 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고, 필요한 경우, 두 개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터 중 한 유형은 추가 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 말하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러 스 벡터인데, 이 벡터에서 추가 DNA 단편은 바이러스 게놈내로 결찰될 수 있다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀형 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비에피좀형 포유동물 벡터)도 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈내로 삽입되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 일부 벡터는 이들과 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순하게 "발현 벡터")로 불린다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환 가능하게 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 동일한 기능을 갖는 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 단순하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 말하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 후속 세포에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"란 용어의 범위에 여전히 포함된다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 단락에 더 자세히 기재된다.
I. PSMA에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, 표준 체세포 혼성화 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975))을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 원리적으로 바람직하다고 하더라도, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스 또는 온코진 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하는 데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 제조는 매우 잘-확립된 방법이다. 융합용 면역화 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예컨대, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 수반하는 형질전환 마우스를 이용하여 발생시킬 수 있다. 본원에서 "HuMAb" 마우스로 불리는 이들 형질전환 마우스는, 내생 μ쇄 및 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌위를 함유한다 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). 따라서, 상기 마우스는 마우스의 IgM 또는 Kκ의 감소된 발현을 보이고, 면역화에 반응하여 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 일어나 고친화성 인간 IgGκ모노클로날 항체가 생산된다 (Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546). HuMab 마우스의 제조는 하기 단락 II 및 문헌 (Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)에 자세히 기재되어 있고, 이들의 전체 개시 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호 (Lonberg and Kay, and GenPharm International); 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.); 1998년 6월 11일 공개된 WO 98/24884; 1994년 11월 10일 공개된 WO 94/25585; 1993년 6월 24일 공개된 WO 93/1227; 1992년 12월 23일 공개된 WO 92/22645; 1992년 3월 19일 공개된 WO 92/03918도 참조할 수 있는데, 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 별법으로, 실시예 2에 기재된 HC012 형질전환 마우스를 사용하여 인간 항- PSMA 항체를 생산할 수 있다.
HuMab 면역화
PSMA에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 문헌 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and WO 98/24884)에 기재된 바와 같이 HuMab 마우스를 정제된 PSMA 항원 제제 또는 이 항원이 풍부한 제제, 및(또는) PSMA 발현 세포로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 첫 관주시 6-16주 된 것이다. 예를 들어, 단리된 PSMA 항원 제제 또는 PSMA 항원이 풍부한 제제(예를 들어, PSMA 발현 LNCaP 세포로부터 정제됨) (5-20 ㎍)를 사용하여 HuMab 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 정제된 PSMA 항원 제제 또는 PSMA 항원이 풍부한 제제를 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않을 경우, PSMA을 발현하는 세포, 예컨대, 종양 세포주로 마우스를 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수 있다.
다양한 항원을 사용한 중복 실험은 HuMAb 형질전환 마우스를 프로인트 완전 면역보강제 (complete Freund's adjuvant) 중의 항원을 사용하여 복강내로 (IP) 초기 면역화시킨 후 프로인트 불완전 면역보강제 (incomplete Freund's adjuvant) 중의 항원으로 (총 6회까지) 매주 IP 면역화하는 경우, 상기 HuMAb 형질전환 마우스가 가장 잘 반응한다는 것을 보인 바 있다. 면역 반응은 안와후 출혈에 의해 얻어지는 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 경로에 걸쳐 관찰할 수 있다. 혈장을 ELISA (하기에 기재함)에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-PSMA 인간 이뮤노글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적 출하기 3일 전에 항원으로 정맥내 부스팅시킬 수 있다. 각 항원에 대해 2-3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있음이 예측된다. 각 항원에 대해 6마리의 마우스를 면역화시킬 것이다. 예를 들어, HC07 및 HC012 계통의 총 12마리 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.
PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생산
표준 프로토콜을 기초로 하여 마우스 비장세포를 단리하고 PEG로 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다 (8, 13). 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 사용하여 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스의 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6에 상응하는 수의 세포와 융합시킨다. 대략 2 x 105 만큼의 세포를 평편 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 상태조절 배지, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글라타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캡토에타놀, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 젠타마이신 및 1 X HAT (Sigma; HAT는 융합으로부터 24시간 후 첨가함)이 함유된 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, ELISA에 의해 개별 플레이트 웰을 인간 항-PSMA 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 생장이 일어나면, 통상 10-14일 후 배지를 관찰한다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크 리닝하고, 인간 IgG, 항-PSMA 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 제한 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 다음으로, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 조직 배양 배지 중의 소량의 항체를 생산하여 특징규명에 사용하였다.
PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 결합의 특징규명
본 발명의 인간 모노클로날 PSMA 항체의 결합의 특징을 규명하기 위해, 면역화 마우스로부터의 혈청을 예를 들어, ELISA로 시험할 수 있다. 요약하건대, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 정제된 PSMA 0.25 ㎍/ml으로 코팅한 후, PBS 중의 5% 소혈청 알부민 (BSA)으로 블로킹한다. PSMA-면역화 마우스로부터 얻은 혈장 희석액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 알카리성 포스패타제에 결합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트는 pNPP 기질 (1 mg/ml)를 사용하여 현상하고, 405-650의 OD에서 분석한다. 바람직하게는, 가장 높은 역가를 보이는 마우스를 융합에 사용할 것이다.
상기한 바와 같은 ELISA 분석법을 이용하여 PSMA 면역원과의 양성 반응성을 보이는 하이브리도마에 대해 스크리닝할 수도 있다. PSMA에 대한 높은 결합력으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 그 특징을 더 규명할 것이다. (ELISA로 분석할 때) 모세포의 반응성을 보유하는, 각 하이브리도마로부터 얻은 한 개의 클론을 선택하여 -140℃에 저장되는 5-10개의 바이알 세포 뱅크를 제조할 수 있고 항체를 정제할 수 있다.
인간 항-PSMA 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 2 리터 스피너-플라스크에서 생장시켜 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상등액을 여과하고 단백질 A-세파로스를 사용한 친화 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 전에 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교체할 수 있고, 1.43 흡광 계수를 사용한 OD280에 의해 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에 저장할 수 있다.
선별된 인간 항-PSMA 모노클로날 항체가 특정한 에피토프에 결합하는지를 알아보기 위해, 시판되는 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 각 항체를 바이오티닐화할 수 있다. 상기한 바와 같은 PSMA 코팅-ELISA 플레이트를 사용하여 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 바이오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 바이오티닐화 mAb 결합은 스트렙-아비딘 알칼리성 포스패타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 10 ㎍/ml의 항-인간 Ig로 밤새 코팅할 수 있다. 5% BSA로 블로킹한 후, 주위 온도에서 상기 플레이트를 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조구와 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스패타제-결합 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전술한 바와 같이 현상하고 분석한다.
PSMA를 발현하는 살아 있는 세포와 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해, 플로우 사이토메트리를 이용할 수 있다. 요약하면, PSMA를 발현하는 세포주 (표준 생장 조건 하에서 생장한 것)를 0.1% Tween 80 및 20% 마우스 혈청이 함유된 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 상기 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에서 형광물질-표지 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 광, 및 단일 세포 상에서 나타나는 측면 산란성을 이용한 FACScan 기구로 샘플을 분석할 수 있다. 형광 현미경을 이용한 다른 분석법을 플로우 사이토메트리 분석법과 함께 또는 플로우 사이토메트리 분석법 대신에 사용할 수 있다. 상기와 동일하게 세포를 염색하고 형광 현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법으로 개별 세포를 볼 수 있지만, 항원의 밀도에 따라 민감성이 감소될 수 있다.
웨스턴 브로팅으로 항-PSMA 인간 IgG와 PSMA 항원의 반응성에 대해 더 시험할 수 있다. 요약하면, PSMA를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 준비하여 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막에 옮기고 20% 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스패타제를 이용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 현상할 수 있다.
PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 식세포작용 활성 및 세포 사멸 활성
PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항-PSMA 항체의 능력 이외에, PSMA를 발현하는 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항-PSMA 항체의 능력에 대해 시험할 수 있다. 모노클로날 항체 활성의 시험관내 시험은 생체내 모델에서 시험하기 전에 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 요약하면, 건강한 공여자의 다형핵 세포 (PMN) 또는 다른 이펙터 세포는 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리 후 오염 적혈구를 용해시켜 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10% 열-불활성화 소 태아 혈청이 보충된 RPMI에 현탁시키고, 종양 세포에 대한 이펙터 세포의 다양한 비율로 (-이펙터 세포:종양 세포) PSMA를 발현하는 51Cr 표지 세포와 혼합할 수 있다. 그 다음, 정제된 인간 항-PSMA IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관련없는 인간 IgG를 음성 대조구로 사용할 수 있다. 분석은 37℃에서 0 내지 120분 동안 수행할 수 있다. 배양 상등액으로 방출되는 51Cr을 측정함으로써 샘플을 세포용해에 대해 분석할 수 있다.
항-PSMA 모노클로날 항체는 세포용해가 다수의 모노클로날 항체로 상승되는지 상승되지 않는지를 알아보기 위해 서로 배합된 상태로 시험할 수도 있다.
PSMA에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예컨대, 마우스)에서 시험하여 PSMA를 발현하는 세포, 예를 들어, 종양 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 데 있어서의 상기 항체의 효능을 알아볼 수도 있다. 이들 항체는 예컨대, 하기 기준을 기초로 하여 선별할 수 있고, 하기 기준은 제한되지 않는다:
1) PSMA를 발현하는 살아 있는 세포와의 결합;
2) PSMA와의 높은 결합 친화도;
3) PSMA 상의 특정한 에피토프와의 결합 (함께 사용될 경우 상보적 활성을 갖는 모노클로날 항체가 동일한 에피토프와 경쟁적으로 결합한다는 가정은 제외함);
4) PSMA를 발현하는 세포의 옵소닌작용;
5) 인간 이펙터 세포의 존재 하에 PSMA를 발현하는 세포의 생장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸의 매개.
본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 이들 기준을 하나 이상, 바람직하게는 모두 총족시킨다. 구체적인 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 예를 들어, 1종 이상의 항-PSMA 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물로서 함께 사용된다. 예를 들면, 다르지만 상보적인 활성을 갖는 인간 항-PSMA 모노클로날 항체를 단일 치료법에서 함께 사용하여 원하는 치료 및 진단 효과를 얻을 수 있다. 이것의 예로는 PSMA를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 또 다른 인간 항-PSMA 모노클로날 항체와 함께, 이펙터 세포의 존재 하에 표적 세포가 매우 효율적으로 사멸하도록 매개하는 항-PSMA 인간 모노클로날 항체를 함유하는 조성물이 있다.
II. 인간 모노클로날 항-PSMA 항체를 생성하는 인간 이외의 형질전환 동물의 생성
또다른 측면으로, 본 발명은 PSMA에 대해 특이적으로, 바람직하게는 높은 친화성을 가지며 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현시킬 수 있는 인간 이외의 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 이외의 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스(HuMab 마우스)는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유한다. 한 실시양태에서, 인간 이외의 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 정제되거나 풍부한 PSMA 항원 제제 및(또는) PSMA 발현 세포로 면역화된다. 바람직하게는, 인간 이외의 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 아이오타입 스위칭을 수행함으로써 PSMA에 대한 수개의 인간 모노클로날 항체 아이소타입(예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있다. 아이소타입 스위칭은, 예를 들어 전형적이거나 비전형적인 아이소타입 스위칭에 의해 발생될 수 있다.
이종 항체 레퍼토리를 사용하여 외래 항원 자극에 대해 반응하는 인간 이외의 형질전환 동물을 디자인하는데는, 이종 이뮤노글로불린 트랜스진이 형질전환 동물내에 포함되어 있고 B-세포 발생 경로를 통해 정확하게 작동하는 것을 필요로 한다. 바람직한 실시양태에서, 이종 중쇄 트랜스진의 정확한 작동에는 아이소타입 스위칭이 포함된다. 따라서, 본 발명의 트랜스진은 아이소타입 스위칭, 및 (1) 높은 수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능성 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 대립유전자 배제에 대한 반응, (4) 주요 레퍼토리의 충분한 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이, 및 (7) 면역 반응 동안의 트랜스진 항체 좌위의 우성화 중 하나 이상을 나타내도록 구성된다.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들어, 형질전환 동물의 내부 이뮤노글로불린 좌위의 기능이 손상된 실시양태의 경우, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화할 필요가 없다. 또한, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 실시양태의 경우, 기능적 유전자 재배 열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 필요치 않다. 분자 면역학의 배경 기술에 대하여는, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는데 사용되는 간 이외의 형질전환 동물은 형질전환 동물의 생식세포에서 재배열된 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 포함한다. 중쇄 트랜스진은 각각 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 형질전환 동물의 B-세포에서 수개의 CH 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 아이소타입 스위칭을 뒷받침할 수 있는 기능성 아이소타입 스위치 서열을 포함할 수 있다. 이러한 스위치 서열은 트랜스진 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 생식세포 이뮤노글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것이거나 또는 이 트랜스진 구조물을 수용하게 될 종 (형질전환 동물)에서 발생하는 것들로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 마우스를 생성하는데 사용되는 인간 트랜스진 구조물은 이 구조물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 스위치 서열을 포함하는 경우, 아마도 마우스 스위치 서열은 마우스 스위치 리컴비나제 효소 시스템을 사용하여 작동이 최적화되지만 인간 스위치 서열의 경우에는 그렇지 못한 것과 같이, 아이소타입 스위칭 반응을 더 높은 빈도로 나타낼 수 있다. 스위치 서열은 통상의 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나 또는 이뮤노글로불린 스위치 영역 서열과 관련되는 공개된 서열 정보를 기초로 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 드 노보(de novo)로 합성할 수 있다 [본원에 참고로 포함되는 문헌(Mills et al., Nucl. Acids Res. 15: 7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989)]. 상기 형질전환 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진은 형질전환 동물의 B-세포내에 상당한 비율 (10 % 이상)로 존재한다.
본 발명의 형질전환 동물을 생성하는데 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변(variable) 유전자 단편, 하나의 변화(diversity) 유전자 단편, 하나의 연결(joining) 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 보유한다. 이뮤노글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 단편, 하나의 연결(joining) 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 유전자 단편은 그가 인간 이외의 형질전환 동물로 이루어지지 않은 종으로부터의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 DNA로부터 유도되거나 또는 그와 상응한다는 점에서 인간 이외의 형질전환 동물에 대하여 이종성 이다. 본 발명의 한 측면으로, 트랜스진은 각 유전자 단편이 재배열되지 않도록, 즉 기능성 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게끔 구성된다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 단편의 재조합 (기능적 재배열)을 뒷받침하며, 바람직하게는 PSMA 항원에 노출되는 경우 인간 이외의 형질전환 동물에서 생성된 재배열된 이뮤노글로불린 중쇄내의 D 영역 유전자 단편의 전부 또 는 일부의 혼입을 뒷받침한다.
다른 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니로커스"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 통상적으로 C, D 및 J 단편뿐 아니라 V 유전자 단편 하위군의 실질적인 부분을 포함한다. 이와 같은 트랜스진 구조물에서, 다양한 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 클래스 스위치 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여체 및 스플라이스-수용체 서열 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유도된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 인간 이외의 형질전환 동물과 동일한 종 또는 그와 관련된 종 유래의 트랜스진내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 유전자 단편은 형질전환 마우스에서 사용되는 설치류 이뮤노글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스진에 연결될 수 있다. 또는, 합성 조절 서열은 이 합성 조절 서열이 포유류의 게놈에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 기능성 DNA 서열과 상동성이 아닌 경우에 트랜스진에 포함될 수 있다. 합성 조절 서열은 예를 들어 스플라이스-수용체 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 규칙에 따라 디자인된다. 예를 들어, 미니로커스는 자연 발생적인 생식세포 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 부위 (예를 들어, 개입 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부(즉, 그 부위의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 갖는 게놈 이뮤노글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, PSMA에 대한 인간 항체를 생산하는데 사용되는 형질전환 동물은 그 내용이 본원에 포함되는 WO98/24884의 실시예 12에 기재된 트랜스진(예를 들어, pHC1 또는 pHC2)을 한 카피 이상, 통상적으로 2 내지 10 카피, 때로는 25 내지 50 카피 또는 그 이상을 포함하며, WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 포함하는 동물과 교배되며, 그 자손은 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 JH 결실된 동물과 교배된다. 동물을 교배하여 이 세가지 특질 각각에 대한 동형접합체를 만들어 낸다. 이들 동물은 다음의 유전자형을 갖는다: 재배열되지 않은 인간 중쇄 미니로커스의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨), 재배열된 인간 K 경쇄 구조물의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨), 및 기능성 JH 단편의 전부를 제거하는 마우스의 내부 중쇄 좌위 각각에서의 결실 (WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨). 이러한 동물을 JH 단편의 결실에 대하여 동형접합인 마우스 (WO 98/24884의 실시예 10)와 교배하여 JH 결실에 대하여 동형접합이고 인간 중쇄 및 경쇄 구조물에 대하여는 반접합인 자손을 생성하였다. 생성된 동물에 항원을 주입하고, 이 동물을 사용하여 이들 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.
이러한 동물로부터 단리된 B 세포는 이들이 각 유전자의 단일 카피만을 포함하고 있기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대하여 단일특이적이다. 또한, 이들은 내부 마우스 중쇄 유전자의 카피가 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 JH 영역에 걸친 결실에 의해 비기능적으로 되기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대하여 단일특이적일 것이다. 또한, B 세포의 실질적인 부분은 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 카피의 발현이 B 세포의 실질적인 부분에서 내부 마우스 κ및 람다 쇄 유전자의 재배열을 대립유전자적으로, 아이소타입적으로 배제할 것이기 때문에 인간 또는 마우스 경쇄에 대하여 단일특이적일 것이다.
바람직한 실시양태의 형질전환 마우스는 천연 마우스의 이뮤노글로불린과 이상적, 실질적으로 유사한, 중요한 레퍼토리를 포함하는 이뮤노글로불린을 생산할 것이다. 따라서, 예를 들어, 내부 Ig 유전자가 불활성화되는 경우의 실시양태에서, 총 이뮤노글로불린 수준은 혈청의 약 0.1 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/ml, 이상적으로는 약 1.0 mg/ml 이상의 범위일 것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 수행할 수 있는 트랜스진이 형질전환 마우스에 도입되는 경우, 성체 마우스의 혈청내 IgG 대 IgM의 비율은 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비율은 비성숙 마우스에서는 훨씬 더 낮을 것이다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10 % 초과, 바람직하게는 40 내지 80 %가 인간 IgG 단백질을 독점적으로 발현시킨다.
레퍼토리는 이상적으로는 비-형질전환 마우스에서 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 그의 약 10 % 이상일 것이며, 바람직하게는 25 내지 50 % 이상일 것이다. 일반적으로, 약 1,000 가지 이상의 다른 이뮤노글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 그의 104 내지 106 가지 이상이 마우스 게놈내에 도입된 다른 V, J 및 D 영역의 수에 주로 의존하여 생산될 것이다. 이러한 이뮤노글로불린은 통상적으로 고도로 항원성인 단백질, 예를 들어 스태필로코쿠스 (staphylococcus) 단백질 A 의 대략 절반 이상을 인식할 것이다. 통상적으로, 이러한 이뮤노글로불린은 미리 선택된 항원에 대하여 약 107M-1 이상, 바람직하게는 약 109M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1 이상, 예를 들어, 1013M-1 이하 또는 그를 초과하는 친화도를 나타낼 것이다.
몇몇 실시양태에서, 미리 결정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하기 위해서는 미리 결정된 레퍼토리를 갖는 마우스를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 미리 결정된 레퍼토리를 갖는 중쇄 트랜스진은 예를 들어 인간에서 미리 결정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 주로 사용되는 인간 VH 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 몇몇 VH 유전자는 여러가지 이유 때문에 (예를 들어, 미리 결정된 항원에 대한 고 친화성 V 영역을 코딩할 가능성이 낮기 때문에; 체세포 돌연변이 및 친화성 증대를 수행할 성향이 낮기 때문에; 또는 어떤 인간에 대하여 면역원성이기 때문에) 정의된 레퍼토리로부터 배제될 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 단편을 포함하는 트랜스진의 재배열에 앞서, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 서열화함으로써 형질전환 동물 이외의 다른 생물 종으로부터의 이러한 유전자 단편을 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 형질전환 마우스를 상기 기재된 바와 같이 정제되거나 풍부한 PSMA 항원 제제 및(또는) PSMA 발현 세포로 면역화할 수 있다. 이 마우스는 트랜스진내의 스위치 재조합(시스-스위칭)을 통해 클래스-스위칭을 수행하여 PSMA에 반응성인 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 이뮤노글로불린은 인 간 서열 항체일 수 있으며, 여기서 그의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이에 의해 유도되는 서열 및 V 영역 재조합 연결부뿐만 아니라 생식세포-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 이뮤노글로불린 서열은, 체세포 돌연변이 및 특이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-생식세포 서열이 존재할지라도, 인간 VL 또는 VH 유전자 단편 및 인간 JL 또는 JL 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 이러한 인간 항체 서열에 대하여, 각 쇄의 가변 영역은 인간 생식세포 V, J, 및 중쇄의 경우에는 D 유전자 단편에 의해 통상적으로 80 % 이상 코딩되고, 종종 가변 영역의 85 % 이상은 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식세포 서열에 의해 코딩되며, 흔히 가변 영역 서열의 90 또는 95 % 이상은 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식세포 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-생식세포 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히, 마우스의 생식세포내의 인간 트랜스진내에 존재하는 인간 V, D 또는 J 유전자 단편에 의해 코딩되지 않는 일부 가변 영역 서열 (보다 덜 흔하게는 불변 영역 서열)을 가질 것이다. 통상적으로, 이러한 비-생식세포 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 밀집되어 있는 것으로 알려진 영역내에 밀집되어 있을 것이다.
미리 결정된 항원에 결합하는 인간 항체 서열은, 인간 서열 γ쇄 (예를 들어, γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예를 들어, K)를 포함하는 인 간 항체가 생산되도록, 아이소타입 스위칭으로부터 형성될 수 있다. 이러한 아이소타입-스위치된 인간 서열 항체는 흔히, 항원에 의한 B 세포의 친화도 성숙 및 선택에 이어서 특히 2차 (또는 그 이후의) 항원 투여의 결과로, 통상적으로는 가변 영역내에, 흔히 CDR의 잔기 약 10개 또는 그 내부에 하나 이상의 체세포 돌연변이를 포함한다. 이와 같은 고 친화도 인간 항체 서열은 1 x 109M-1 이상, 통상적으로 5 x 109M-1 이상, 흔히 1 x 1010M-1 이상, 때로는 5 x 1010 M-1 내지 1 x 1011M-1 이상의 결합 친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 PSMA와 고 친화도 (예를 들어, 2 x 109 M-1 초과)로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있는 마우스 유래의 B 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 이러한 하이브리도마는 2 x 109M-1 이상의 친화도 상수 (Ka)를 가지고 PSMA와 결합하는 이뮤노글로불린을 포함하는 조성물을 생산하는데 사용되며, 여기서 상기 이뮤노글로불린은,
(1) 인간 VL 유전자 단편 및 인간 JL 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL 유전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 이루어진 인간 경쇄 서열, 및
(1) 인간 VH 유전자 단편, 임의로 D 영역, 및 인간 JH 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 불변 영역으로 이루어진 인간 중쇄 서열을 포함한다.
PSMA에 대한 고 친화성 인간 모노클로날 항체의 발생은 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스에서 인간 가변 영역 유전자 단편의 레퍼토리를 확장하는 방법에 의해 촉진되며, 이 방법은 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진에는 존재하지 않는 V 영역 유전자 단편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈내에 도입하는 것을 포함한다. 흔히, V 영역 트랜스진은, 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 또는 재조합 방법에 의해 서로 단독으로 스플라이싱될 수 있는 것으로서, 인간 VH 또는 VL(VK) 유전자 단편 분석의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체이며, 순서를 벗어나거나 또는 생략된 V 유전자 단편을 포함할 수 있다. 흔히, 다섯 이상의 기능성 V 유전자 단편은 YAC에 포함되어 있다. 이 방법의 변형법에서, V 레퍼토리 확장 방법에 의해 생산되는 형질전환 마우스를 만들 수 있으며, 이 마우스는 V 영역 트랜스진상에 존재하는 V 영역 유전자 단편 및 인간 Ig 트랜스진에서 코딩되는 C 영역에 의해 코딩되는 가변 영역 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 쇄를 발현시킨다. V 레퍼토리 확장 방법에 의해, 다섯 이상의 다른 V 유전자를 갖는 형질전환 마우스를 만들 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 포함하는 마우스도 만들 수 있다. 몇몇 V 유전자 단편은 비-기능적일 수 있 으며 (예를 들어, 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 단편은 보유되거나 또는 원한다면 당업자에게 공지된 재조합 방법에 의해 선택적으로 결실시킬 수 있다.
마우스 생식세포가, 실질적으로 J 및 C 유전자 단편을 포함하는 인간 Ig 트랜스진에는 존재하지 않는 확장된 V 단편 레퍼토리를 갖는 기능적 YAC를 포함하도록 조작한다면, 확장된 V 단편 레퍼토리를 갖는 기능적 YAC가 다른 인간 Ig 트랜스진을 갖는 마우스 생식세포내로 도입되는 경우의 배경을 비롯하여 특질이 다른 유전적 배경으로 전달되고 도입될 수 있다. 확장된 V 단편 레퍼토리를 갖는 수개의 기능적 YAC는 인간 Ig 트랜스진 (또는 수개의 인간 Ig 트랜스진)으로 수행하는 생식세포내에 도입될 수 있다. 본원에서 YAC 트랜스진으로 언급되기는 하지만, 게놈으로 통합되는 경우, 이러한 트랜스진에는 효모에서의 자발적 복제에 필요한 서열 등의 효모 서열이 실질적으로는 결여되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 다음(즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전접합체로의 도입에 앞서) 유전자 조작 (예를 들어, 제한 절단 및 펄스-필드(pulsed-field) 겔 전기영동 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 서열 발현의 특질을 증대시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진, 및 임의로는 확장된 V 단편 레퍼토리를 갖는 기능적 YAC를 보유하는 형질전환 마우스를 기르는 것을 포함한다. VH 및 VL 유전자 단편은 둘 다 YAC상에 존재할 수 있다. 이 형질전환 마우스를, 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 배경을 비롯하여 당업자 에 의해 요구되는 어떤 배경에 도입시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레퍼토리 YAC 트랜스진을 갖는 형질전환 마우스에 의해 생산되는 고 친화도 인간 이뮤노글로불린 서열을 제공한다. 상기에는 본 발명의 형질전환 동물의 바람직한 실시양태에 대하여 기술되어 있지만, 하기의 네가지 카테고리로 분류된 다른 실시양태도 본 발명에서 고려된다.
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물,
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물, 및
IV. 재배열된 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물.
이러한 형질전환 동물 카테고리 중에서, 바람직한 순서는 II > I > III > IV (여기서, 내부 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동성 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 녹아웃됨) 및 I > II > III > IV (여기서, 내부 경쇄 유전자는 녹아웃되지 않으며, 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III. PSMA에 결합하는 이중특이적/다중특이적 분자
본 발명의 또다른 실시양태에서, PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, Fab' 단편)에 유도체화 또는 연결하여 수개의 결합 부위 또는 표적 에피토프와 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위를 (예를 들어, 화학적 연결, 유전자 융합 또는 비공유결합 등에 의해) 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체 등의 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 PSMA에 대하여 적어도 하나의 제1 결합 특이적 부위 및 제2 표적 에피토프에 대하여 제2 결합 특이적 부위를 갖는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 PSMA를 발현시키는 표적 세포에 둘 다 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 PSMA 발현 세포를 이펙터 세포로 표적화하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 유사하게, PSMA 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 수퍼옥사이드 음이온 생성 등의 Fc 수용체-매개 이펙터 세포의 활성을 개시한다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-PSMA 결합 특이성 이외에도 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 결합 특이성은 항-상승 (anti-enhancement) 인자 (EF) 부위, 예를 들어 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질과 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응 을 증가시키는 분자이다. "항-상승 인자 부위"는 소정의 분자, 예를 들어, 항원 또는 수용체와 결합함으로써 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정자의 효과를 증대시키는 항체, 기능적 항체 단편, 또는 리간드일 수 있다. "항-상승 인자 부위"는 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 또는, 항-상승 인자 부위는 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 실체와는 다른 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-상승 인자 부위는 세포독성 T-세포와 (예를 들어, 표적 세포에 대한 면역 반응의 증가를 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해) 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이성으로서, 예를 들어 Fab, Fab', F (ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv를 비롯하여, 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 본원에 그 내용이 참고로 포함되는, 1990년 8월 7일 허여된 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 것과 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Fv 또는 단쇄 구조물과 같은 그의 어떤 최소 단편일 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 이펙터 세포의 표면상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 결합 특이성, 및 표적 세포 항원, 예를 들어 PSMA에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 모노클로날 항체에 의해 제공되며, 그의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는 다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자들 중 어떤 것을 의미한다. 이 유전자들은 3가지 Fcγ수용체 클래스, 즉 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12가지의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소폼을 코딩한다. 바람직한 한 실시양태에서, Fcγ수용체는 인간의 고 친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 대한 고 친화도 (108 - 109M-1)를 나타내는 72 kDa 크기의 분자이다.
이와 같은 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특성화는 그 내용이 본원에 참고로 포함되는 팡거 (Fanger) 등의 PCT 출원 WO88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ결합 부위와는 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 에피토프에 결합하며, 따라서 이들의 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해서는 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 HB9469)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에서 분양받을 수 있다. 항-FcγRI mAb 22, mAb 22의 F(ab')2 단편은 메다렉스, 인크 (Medarex, Inc.; Annandale, N.J.)로부터 입수할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산 및 특성화는 문헌 [Graziano et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 및 PCT/US93/10384]에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 HA022CL1 명칭으로 기탁되어 기탁번호 CRL 11177을 배정받았다.
또다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 그의 결합이 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린A (IgA)에 의해 차단되지 않는 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공된다. 용어 "IgA 수용체"는 19번 염색체 상에 위치하는 하나의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa 크기의 선택적으로 스플라이싱된 여러 막횡단 이소폼을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립세포에서는 구성적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대하여 배지 친화도 (약 5 x 107M-1)를 갖는데, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF 등의 사이토카인에 노출되는 경우에 증가한다 (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). IgA 리간드 결합 도메인의 외부의 FcαRI과 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 네가지 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 문헌 (Monteiro, R. C. et al., 1992, J. Immunol. 148: 1764)에 기재되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI는 (1) 이들이 주로 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상세포에서 주로 발현되고; (2) 높은 수준 (예를 들어, 세포 당 5,000 내지 100,000)으로 발현되고; (3) 세포독성 활성 (예를 들어, ADCC, 식세포작용)의 매개자이며; (4) 이들에게 표적화되는 항원 (자가-항원을 포함)의 항원 제시의 증가를 매개하기 때문에 본 발명에서 사용되는 바람직한 개시 수용체이다다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 표적 세포 항원 (예를 들어, PSMA)을 인식하는, 예를 들어 그와 결합하는 결합 특이성을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 결합 특이성은 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다.
본원에 사용된 "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합하는 항체 또는 기능성 항체 단편을 의미한다. 본 발명에 사용되는 바람직한 항체는 내부 이뮤노글로불린에 의해 결합되지 않는 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는, 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대립되는, 면역 반응의 작용 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 전형적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어, 림프구 (예를 들어, 세포용해성 T 세포 (CTL)를 비롯한 B 세포 및 T 세포), 살(killer)세포, 자연살세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립세포, 비만 세포 및 호염구가 포함된다. 몇몇 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현시키며, 특이적 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체-의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있고, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현시키는 단핵구, 대식세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키는 것, 항원을 면역계의 다른 성분에 제시하는 것 또는 항원을 제시하는 세 포에 결합하는 것에 관여한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식세포작용할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인 등의 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 알려져 있다. 이러한 발현 증가는 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식세포작용하거나 용해시킬 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는 대상 (예를 들어, 인간 또는 동물)에서의 바람직하지 않은 어떤 세포를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 PSMA를 발현 또는 과다발현시키는 세포이다. PSMA를 발현시키는 세포로는 통상적으로 전립선, 신장 및 결장의 종양 세포 등의 종양 세포가 포함된다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 쥐 (또는 다른 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 절단하여 쥐 Fc를 코딩하는 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동등한 부위를 치환한다 [문헌 [Robinson et al., International Patent Publication PCT/US86/02269; Akira, et al., European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et al., European Patent Application 173,494; Neuberger et al., International Application WO 86/01533; Cabilly et al. U. S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent Application 125,023; Better et al. (1988 Science 240: 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559]을 참조].
키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역의 동등한 서열로 대체함으로써 추가로 인간화할 수 있다. 인간화 키메라 항체에 대한 포괄적인 검토에 대하여는 문헌[Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207 and by Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214]에 제시되어 있다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나로부터의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현시키는 것이 포함된다. 이러한 핵산의 공급원은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항-GPIIbIIIa 항체 생산 하이브리도마인 7E3으로부터 얻을 수 있다. 이어서, 키메라 항체를 코딩하는 재조합 DNA 또는 그의 단편을 적합한 발현 벡터내에 클로닝할 수 있다. 적합한 인간화 항체는 문헌[U. S. Patent 5,225,539; Jones et al. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239: 1534; and Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141: 40534060]에 기재된 CDR 치환법에 의해 선택적으로 생산할 수 있다.
특정 인간 항체의 모든 CDR은 적어도 비-인간 CDR의 일부로 대체되거나 또는 CDR의 일부만이 비-인간 CDR로 대체될 수 있다. 단지 인간화 항체의 Fc 수용체로의 결합에 필요한 CDR의 수를 대체하는 것이 필요한 뿐이다.
인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 비-인간 항체로부터 유도된 CDR로 대체할 수 있는 임의 방법에 의해 항체를 인간화할 수 있다. 윈터(Winter)는 본 발명의 인간화 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 방법을 그의 내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌[1987년 3월 26일 출원된 영국 특허 출원 GB 2188638A]에 기재하고 있다. 제목이 "인간 단핵성 식세포상의 이뮤노글로불린G의 Fc 수용체에 대한 인간화 항체 (Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)"인 국제 특허 출원 공개 WO 94/10332에 기재된 올리고뉴클레오티드 부위-지시적 돌연변이유발을 이용하여 인간 CDR을 비-인간 CDR로 대체할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체도 본 발명의 범위내이다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 항원에 대한 결합을 증가시키기 위해 프레임워크 영역내에 아미노산 치환부를 갖는다. 예를 들어, 마우스 CDR을 갖는 인간화 항체에서, 인간 프레임워크 영역내에 위치하는 아미노산은 마우스 항체의 상응하는 부위에 위치하는 아미노산으로 대체할 수 있다. 이러한 치환은 몇몇 경우에서 인간화 항체와 항원의 결합을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 원에서는 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체를 수식된 항체 또는 변형된 항체로 부른다.
또한, 변형된 항체라는 용어는 예를 들어 항체 일부를 결실, 부가 또는 치환하여 변형시킨 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 등의 항체를 포함하는 의미이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역을 결실시키고 이를 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시키는 불변 영역으로 대체함으로써 항체를 변형시킬 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자가 FcγR에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 영역을 가지고 한가지 이상의 이펙터 기능을 개시하는 한 임의 변형은 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술 [예를 들어, 문헌[D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 5807]을 참조], "폴리도마 (polydoma)" 기술 [미국 특허 제4,474,893호 참조] 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본원에 제공된 실시예 부분에 기술된 방법을 이용하여 성분 결합 특이성, 예를 들어 항-FcR 결합특이성과 항-PSMA 결합 특이성을 연결하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각 결합 특이성을 별도로 형성한 다음, 서로 연결할 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 가교결합제를 사용하여 공유결합시킬 수 있다. 가교결합제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스 (2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다 [예를 들어, 문헌[Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648]을 참조]. 다른 방법으로는 문헌[Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), and Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)]에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 연결제는 SATA 및 술포 SMCC이며, 이들 둘 다는 피어스 케미칼 코포레이티드 (Pierce Chemical Co. (Rockford, IL))사로부터 입수할 수 있다.
결합 특이성이 항체 (예를 들어, 두 인간화 항체)인 경우, 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 이들을 연결시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 연결에 앞서 홀수의 술프히드릴 잔기를, 바람직하게는 하나 포함하도록 변형된다.
또는, 이들 두 결합 특이성은 동일한 벡터내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F (ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특이 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단쇄 분자, 예를 들어 단쇄 이중특이적 항체, 하나의 단쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자, 또는 두개의 결합 결정자를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단쇄 분자이거나 또 는 둘 이상의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 동 제5,455,030호; 동 제4,881,175호; 동 제5,132,405호; 동 제5,091,513호; 동 제5,476,786호; 동 제5,013,653호; 동 제5,258,498호; 및 동 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자가 이들의 특이적 표적으로 결합하는 것은 효소 연결 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사면역분석법 (RIA), FACS 분석법, 생분석법 (예를 들어, 증식 억제) 또는 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석법에 의해 확인할 수 있다. 이들 각 분석법은 일반적으로 대상 결합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특정 대상의 단백질-항체 결합체의 존재를 검출한다. 예컨대, FcR-항체 결합체는 예를 들어 항체-FcR 결합체를 인식하여 그와 특이적으로 결합하는 효소-연결 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 또는, 이 결합체는 다양한 기타 면역분석법 중 어떤 것을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 방사성면역분석법 (RIA)에서 항체를 방사성 표지하여 사용할 수 있다 [예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌[Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986]을 참조]. 방사성 동위원소는 γ계수법 또는 섬광계수법에 의하거나 또는 오토라디오그래피법에 의해 검출할 수 있다.
IV. 항체 결합체/면역독소
다른 측면으로, 본 발명은 치료를 위한 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 또는 방사성 동위원소에 결합된 인간 항-PSMA 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 특 징으로 한다. 세포독소에 결합되는 경우, 이들 항체 결합체는 "면역독소"라 부른다. 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의 물질이 포함된다. 그 예로는 탁솔, 사이토칼라신B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제로는 항-대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (종전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (종전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-분열유발제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체를 방사성 동위원소, 예를 들어 방사성 요오드에 연결하여 PSMA-관련 질환, 예를 들어 암의 치료를 위한 세포독성 방사성 약제를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 결합체를 사용하여 소정의 생물학적 반응을 변화시킬 수 있으며, 이 약물 잔기가 전형적인 화학 치료제로 한정되는 것으로 생각하여서는 안된 다. 예를 들어, 약물 잔기는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소 활성 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변경자, 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립세포 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립세포 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 결합시키는 기술은 잘 알려져 있다 [예를 들어, 문헌[Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985);"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)]을 참조한다].
V. 제약 조성물
다른 측면으로, 본 발명은 조성물, 예를 들어 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위 중 하나 또는 이들의 조합을 포함하는, 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이 조성물은 본 발명의 수개 (예를 들어, 2 이상)의 단리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 각각은 PSMA의 미리 선택된 다른 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 보완적 활성을 갖는 인간 항-PSMA 모노클로날 항체들을, 예를 들어 2종 이상의 인간 항-PSMA 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물로서 사용한다. 예를 들어, 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포의 사멸을 매우 효과적으로 매개하는 인간 모노클로날 항체를, PSMA를 발현시키는 세포의 증식을 억제하는 다른 인간 모노클로날 항체와 병용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자 중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다 (예를 들어, Fc 수용체에 대한 한가지 이상의 결합 특이성 및 PSMA에 대한 한가지 이상의 결합 특이성을 포함한다).
본 발명의 제약 조성물은 또한 배합 치료법으로, 즉 다른 물질과 배합하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 배합 치료법은 본 발명의 조성물을 1종 이상의 항-종양제 또는 다른 통상의 요법과 함께 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡 수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화합물을 실활화할 수 있는 산의 작용 및 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
"제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고, 바람직하지 못한 어떤 독성학적 효과도 부여하지 않는 염을 의미한다 [예를 들어, 문헌[Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19]을 참조]. 이러한 염의 예로는 산 부가 염 및 염기 부가 염이 포함된다. 산 부가 염으로는 비독성 무기 산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 아인산 등으로부터 유래하는 것들뿐 아니라 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐치환된 알카노산, 히드록시 알카노산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래하는 것들이 포함된다. 염기 부가 염으로는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유래하는 것들뿐 아니라 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유래하는 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및(또는) 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체, 예를 들어 이식물, 경피 패치 및 미세캅셀화 전달계를 비롯한 조절 방출형 제제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 고분자, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 조성물의 제조를 위한 많은 방법은 특허가 허여되었거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다 [예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조].
본 발명의 화합물을 어떤 투여 경로로 투여하기 위해서는, 화합물의 실활화를 방지하는 물질로 화합물을 코딩하거나 또는 그 물질과 함께 화합물을 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적합한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제에 넣어 대상에게 투여할 수 있다. 제약상 허용되는 희석제로는 염수 및 수성 완충액이 포함된다. 리포좀으로는 수중유중수 CGF 에멀젼뿐 아니라 통상의 리포좀도 포함된다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
제약상 허용되는 담체로는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 주사용 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말제가 포함된다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 용도는 당업계에 공지된 것이다. 임의 통상의 매질 또는 물질이 활성 화합물과 비상용성이라는 점 외에는, 본 발명의 제약 조성물 중 그의 사용도 고려된다. 또한, 보충 활성 화합물을 조성물 중에 포함시킬 수도 있다.
치료 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 통상적으로 무균적이며 안정해야 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 다른 규칙적 형태의 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적합한 이들의 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴 등의 코딩을 사용하여, 분산액의 경우 소정의 입자 크기를 유지하여, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 주사용 조성물을 오랜 시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.
주사용 멸균 용액은 소정량의 활성 화합물을 상기 언급된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 중에 포함시키고, 필요에 따라, 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 언급된 것들로부터 필요한 기타 성분을 포함하는 무균 비히클 중에 활성 화합물을 포함시켜 제조한다. 주사용 멸균 용액의 제조를 위한 무균 분말제의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 활성 성분 이외에 상기 그의 멸균 여과된 용액으로부터 목적하는 임의 다른 성분의 분말을 생성하는 진공 건조법 및 동결건조법 (동결건조)이 있다.
투여 방법을 조정하여 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 단일한 환제를 투여하거나, 시간에 따라 투여량을 여러 번에 나누어 투여하거나, 또는 긴박한 치료 상황에 의해 지시되는 바와 같이 투여량을 비례적으로 줄이거나 늘려서 투여할 수 있다. 용이한 투여 및 균일 투여량을 위해서 는 비경구용 조성물을 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에 사용된 단위 투여 형태는 치료될 대상을 위한 단위 투여량으로서 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 의미하며, 각 단위는 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 필요한 제약 담체와 함께 포함한다. 본 발명의 단위 투여 형태는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특이적 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감도의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 혼합하는 기술에서의 고유한 제한에 의하거나 이에 직접 의존하는 것으로 설명되어 있다.
제약상-허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 소듐 메타비술피트 및 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이트화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸레이트화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등이 포함된다.
치료용 조성물의 경우, 본 발명의 제제는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의 방법에 의해서 제조할 수 있다. 담체 물질과 배합되어 단위 투여 형태를 형성시킬 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 배합되어 단위 투여 형태를 형성시킬 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 %를 기준으로, 이 양 은 활성 성분의 약 0.01 % 내지 약 99 %, 바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 70 %, 가장 바람직하게는 약 1 % 내지 약 30 % 범위일 것이다.
또한, 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에서 적합한 것으로 알려져 있는 담체를 함유하는 펫사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말체 또는 스프레이 제제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은, 무균 조건하에, 제약상 허용되는 담체 및 필요할 수 있는 임의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합될 수 있다.
본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여하다"라는 어구는 장내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내(intrathecal), 피막내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어, 코팅 물질 (예, 레시틴)을 사용하여, 분산액의 경우 소정의 입자 크기를 유지하여, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이 조성물은 보조제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 방법[상기 문헌] 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등의 사용에 의해 보장할 수 있다. 등장성 물질, 예를 들어 당 및 염화나트륨 등을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 주사용 약제를 장시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 약제로서 인간 및 동물에게 투여하는 경우, 이들은 단독으로 투여하거나 또는 예를 들어 활성 성분 0.01 내지 99.5 % (더 바람직하게는 0.1 내지 90 %)를 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와는 관계 없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 조성물을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 대상에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양, 조성물 및 대상에게 독성이 없는 투여 방식을 성취하기 위해서는 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및(또는) 물질, 치료될 대상의 연 령, 성별, 체중, 증상, 전체적인 건강 및 의학적 기왕력를 비롯한 다양한 약물동태학적 요소 및 의학 분야에 잘 알려진 유사한 요소에 따라 달라질 것이다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있을 것이다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 목적하는 치료 효과를 달성하기 위하여 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 시작하여 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 나타내기에 효과적인 가장 낮은 투여량인 화합물의 양일 것이다. 이 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 기술된 요소에 따라 달라질 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여되는 것이 바람직하다. 필요하다면, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량은 하루 동안 적절한 시간 간격으로, 임의로 단위 투여 형태로 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 이상으로 투여량을 나누어 투여하는 것과 같이 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있지만, 본 발명의 화합물은 제약 제제 (조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 기기를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 바늘이 달려 있지 않은 피하 주사기, 예를 들어 미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호에 개시된 기기를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 이식물 및 모듈의 예로는 조절된 속도로 약물을 투여하는 이식용 미세주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 기기를 개시하는 동 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시하는 동 제4,447,233호; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름의 이식용 주입 장치를 개시하는 동 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 동 제4,439,196호; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 동 제4,475,196호가 포함된다, 이 특허 문헌들은 본원에 참고로 포함된다. 많은 다른 이식물, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체가 생체내에서 적절히 분포될 수 있도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)는 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 (원한다면) BBB를 통과하도록 하기 위하여, 치료 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 대하여는, 미국 특허 제4,522,811호; 동 제5,374,548호; 및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, 따라서 표적으로의 약물 전달을 증가시킨다 [예를 들어, 문헌[V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685]을 참조]. 표적화 잔기의 예로는 폴레이트 또는 비오틴 [예를 들어, 로우(Low) 등의 미국 특허 제5,416,016호]; 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 계면활성 제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), 그의 다른 종은 본 발명의 제제뿐 아니라 발명된 분자의 성분을 포함할 수 있음; p120 [문헌(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); 또한 문헌(K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4 : 273)을 참조]가 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀으로 제제화되며, 보다 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 환제를 주사하여 리포좀내 치료 화합물을 종양 또는 감염 근처의 부위로 전달한다. 조성물은 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 상태하에서 안정성이 있어야 하며, 세균 및 진균 등의 미생물 오염 작용에 대하여 보호되어야 한다.
"치료 유효 투여량"이란 바람직하게는 처리되지 않은 대상에 비하여 종양 생장을 약 20 % 이상, 보다 바람직하게는 약 40 % 이상, 보다 더 바람직하게는 약 60 % 이상, 가장 바람직하게는 약 80 % 이상 억제하는 양을 말한다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 나타내는 동물 모델계에서 평가할 수 있다. 또는, 조성물의 이러한 특성은 당업자에게 공지된 분석에 의해 시험관내에서 암을 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가할 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 대상에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자라면 대상의 사이즈, 대상의 증상의 심도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로 등의 요소를 기초로 하여 투여량을 정할 수 있을 것이다.
조성물은 멸균된 것이어야 하며, 주사기로 투여할 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 물 이외에, 담체는 등장성의 완충 염 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴 등의 코딩을 사용하여, 분산액의 경우 소정의 입자 크기를 유지하여, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사용 조성물을 장시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.
활성 화합물이 상기 기술된 바와 같이 적절하게 보호되면, 화합물을 예를 들어 비활성 희석제 또는 흡수가능한 식용성 담체와 함께 경구로 투여할 수 있다.
VI. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 조성물 (예를 들어, PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체 및 그의 유도체/결합체)은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도를 갖는다. 예컨대, 이 분자들은 예를 들어 시험관내 또는 생체외 배양 세포 또는 예를 들어 대상의 생체내 세포에 투여하여 각종 질병을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대상"이라는 용어는 인간 및 인간 이외의 동물을 포함하는 의미이다. 바람직한 인간 동물로는 PSMA의 발현, 통상적으로 PSMA의 이상 발현 (예를 들어, 과다발현)을 특징으로 하는 질환을 앓는 인간 환자가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 종양발생 질환, 예를 들어 전립선, 결장 및 신장 (신장)의 종양 세포를 비롯하여 PSMA를 발현시키는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 앓는 환자를 치료할 수 있다. 본 발명의 "인간 이외의 동물"에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 포유류 이외의 동물, 예를 들어 인간 이외의 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등이 포함된다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 먼저 시험관내 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대하여 시험할 수 있다. 예를 들어, ELISA 및 하기 실시예에 기재된 유동세포계수분석법을 이용하여 본 발명의 조성물을 시험할 수 있다. 또한, PSMA를 발현시키는 세포의 세포용해를 비롯하여 한가지 이상의 이펙터-매개된 이펙터 세포 활성을 개시하는 이들 분자의 활성을 분석할 수 있다. 이펙터 세포-매개된 식세포작용에 대한 분석 프로토콜은 하기 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 PSMA 관련 질환의 치료 및 진단에 있어서 추가의 용도를 갖는다. 예컨대, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자를 사용하여 예를 들어 생체내 또는 시험관내에서 다음의 생물학적 활성 중 하나 이상을 유도할 수 있다: PSMA를 발현시키는 세포를 옵소닌처리(opsonization)하는 활성; 인간 이펙터 세포의 존재하에 PSMA를 발현시키는 세포의 식세포작용 또는 세포용해를 매개하는 활성; 또는 PSMA를 발현시키는 세포의 증식을 억제하는 활성.
특정의 실시양태에서, 인간 항체 및 그의 유도체를 사용하여 생체내에서 각종 PSMA 관련 질환을 치료, 예방 또는 진단하였다. PSMA 관련 질환의 예로는 각종 암, 예를 들어 전립선암, 신장암 및 결장암이 포함된다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 항체)을 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 환자의 연령 및 체중, 및 사용된 특정 약물에 따라 달라질 것이다. 문헌[Goldenberg, D. M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360] 및 유럽 특허 제0365997호에 기재된 바와 같이 분자를 방사선핵종 (radionuclide), 예를 들어 131I, 90Y 및 105Rh 등에 연결시킬 수 있다. 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 또한 항-감염제에 연결할 수도 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터 세포를 또한 치료제로 사용할 수도 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 자연살세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 필요하다면, 이펙터 세포는 치료받을 환자로부터 입수할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학적으로 허용되는 용액 중 세포의 현탁액으로 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 108 내지 109일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 이 양은 표적 세포, 예를 들어 PSMA를 발현시키는 종양 세포에서 위치를 결정하고, 예를 들어 식세포작용에 의해 세포를 사멸시키는데 충분할 것이다. 투여 경로가 달라질 수도 있을 것이다.
표적-특이적 이펙터 세포를 사용한 치료법을, 표적 세포를 제거하는 다른 기술과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및(또는) 이들 조성물을 공급받은 이펙터 세포를 사용한 항-종양 요법을 화학요법과 병용할 수 있다. 추가로, 병용 면역요법을 이용하여 두가지 다른 세포독성 이펙터 집단을 종양 세포 거부 반응으로 지시할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마RI 또는 항-CD3에 연결된 항-PSMA 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어 세포 표면 상의 수용체를 캡핑 및 제거함으로써 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcαR 수준을 조절할 수 있다. 이러한 목적을 위해서는 항-Fc 수용체 혼합물을 사용할 수도 있다.
또한, 보체 결합 부위, 예를 들어 보체와 결합하는 IgG1, -2 또는 -3, 또는 IgM으로부터의 부위를 갖는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 보체의 존재하에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 보체 또는 보체 함유 혈청을 가하여 표적 세포를 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포와 함께 포함하는 세포 집단을 생체외 치료하는 것을 보완할 수 있다. 보체 단백질을 결합시켜 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포작용을 향상시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 보체에 의해 용해시킬 수도 있다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 은 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위내이다. 이러한 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자의 근처에 위치하고 있다는 점에서 유리하다. 또는, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 및 보체 또는 혈청을 별도로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및 사용 지침을 포함하는 킷트도 본 발명의 범위내이다. 이 킷트는 적어도 하나의 추가 시약, 예를 들어 보체, 또는 본 발명의 1종 이상의 다른 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와는 다른 PSMA 항원의 에피토프와 결합하는 보체 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 사이토카인을 사용하여 환자를 치료함으로써, Fcγ또는 Fcα수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어 증가시키거나 억제시키는 물질을 사용하여 환자를 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자를 사용하는 치료 동안 투여되는 바람직한 사이토카인으로는 과립세포 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립세포-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 FcγR 또는 PSMA를 발현하는 세포를 표적화하는데, 예를 들어 이러한 세포를 표지하는데 사용할 수 있다. 이렇게 사용되는 경우, 검출될 수 있는 분자에 결합제를 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예를 들어 FcγR, 또는 PSMA를 발현시키는 세포를 생체외 또는 시험관내에서 위치 결정하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 PSMA 사이의 결합체 형성을 허용하는 조건하에 시료 및 대조 시료를 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 접촉시키는 것을 포함하는, 시료 중 PSMA 항원의 존재를 검출하거나 또는 PSMA 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 결합체의 형성을 검출하는데, 여기서 대조 시료와 비교할 때 시료 사이의 결합체 형성에서 차이가 나는 것은 시료 중 PSMA 항원이 존재함을 암시한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 Fc-발현 세포의 존재를 검출하는 방법 또는 그의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 검출용 마커에 결합된 본 발명의 조성물 (예를 들어, 다중특이적 또는 이중특이적 분자) 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 검출용 마커를 검출하는 방법을 상기 환자에게 적용하여 Fc-발현 세포를 포함하는 부위를 확인하는 단계를 포함한다. 하기 실시예는 본 발명에 대한 추가의 설명이지만, 본 발명이 이 실시예로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 이 출원 명세서에 인용된 모든 도면 및 참고 문헌, 특허 문헌 및 공개 특허 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1: 항-PSMA 인간 항체의 생산을 위한 Cmu 표적화된 마우스의 생성
CMD 표적화 벡터의 작제
플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리로부터 얻어진, mu 유전자를 포함하는 쥐 Ig 중쇄 좌위의 EcoRI/XhoI 단편을 포함한다 (Marcu et al. Cell 22: 187,1980). 이 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H의 XhoI/EcoRI 부위에 서브클로닝하였다 (Marsh et al; Gene 32,481-485, 1984). pICEmu에 포함된 중쇄 서열은 mu 인트론 인핸서의 3'에 위치하는 EcoRI 부위의 하류로부터, mu 유전자의 마지막 막횡단 엑손의 약 1 kb 하류에 위치하는 XhoI 부위까지 뻗어있지만, mu 스위치 반복 영역의 많은 부분은 이. 콜라이 (E. coli)에서 계대배양에 의해 결실되었다.
표적화 벡터를 다음과 같이 작제하였다 (도 1 참조). 1.3 kb HindIII/SmaI 단편을 pICEmu로부터 절단하여 HindIII/SmaI 절단된 pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA)에 서브클로닝하였다. 이 pICEmu 단편은 Cmul 5'의 약 1 kb에 위치하는 HindIII 부위로부터 Cmul내에 위치하는 SmaI 부위까지 뻗어있다. 생성된 플라스미드를 SmaI/SpeI에서 절단하고, Cmul 3'의 SmaI 부위로부터 마지막 Cmu 엑손의 하류에 위치하는 XbaI 부위까지 뻗어있는, pICEmu로부터의 약 4 kb SmaI/XbaI 단편을 삽입하였다. 생성된 플라스미드 pTAR1을 SmaI 부위에서 선형화하고, neo 발현 카세트를 삽입하였다. 이 카세트는 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (pgk) 프로모터 (XbaI/TaqI 단편; Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74)의 전사 조절하에 있는, pgk 폴리아데닐화 부위 (PvuII/HindIII 단편; Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308)를 포함하는 neo 유전자로 구성된다. 이 카세트는 neo 카세트가 EcoRI/HindIII 단편으로 절단되고, EcoRI/HindIII 절단된 pGEM-7Zf(+)내에 서브클로닝되어 pGEM-7 (KJ1)이 생성된 플라스미드 pKJ1 [문헌[Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기재되어 있음]으로부터 얻었다. EcoRI/SalI 절단에 의해 neo 카세트를 pGEM-7 (KJ1)으로부터 절단하고, 평활 말단화하여 플라스미드 pTARI의 SmaI 부위에 게놈 Cmu 서열의 반대 방향으로 서브클로닝하였다. 문헌[Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352]에 기재된 바와 같이, 생성된 플라스미드를 NotI으로 선형화하고, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 카세트를 삽입하여 상동 재조합체를 보유하는 ES 클론을 증가시켰다. 이 카세트는, 문헌[Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기재된 바와 같이, 마우스 pgk 프로모터 및 폴리아데닐화 부위에 의해 둘러싸여진 tk 유전자의 코딩 서열로 이루어져 있다. 생성된 CMD 표적화 벡터는 중쇄 좌위와 총 약 5.3 kb의 상동성을 포함하며, neo 발현 카세트가 제1 Cmu 엑손의 유일한 SmaI 부위에 삽입된 변이체 mu 유전자를 생성하도록 디자인된다. 표적화 벡터는 전기천공법에 의해 ES 세포내로 도입되기에 앞서 플라스미드 서열내를 절단하는 PvuI으로 선형화된다.
표적화된 ES 세포의 생성 및 분석
본질적으로는 문헌[Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112]에 기재된 바와 같이, AB-1 ES 세포 (McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085)를 분열 불활성인 SNL76/7 세포 공급층상 에서 배양하였다 (ibid.). 선형화된 CMD 표적화 벡터를 문헌[Hasty et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nature 350: 243-246)]에 기재된 방법에 의해 전기천공하여 AB-1 세포내에 도입하였다. 전기천공된 세포를 100 mm 디쉬내에 1 - 2 x 106 세포/디쉬의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후에, G418 (200 ㎍/활성 성분(ml)) 및 FIAU (5 x 10-7 M)를 배지에 첨가하고, 약물-내성 클론을 8 내지 9일에 걸쳐 발생시켰다. 클론을 골라내어 트립신처리하고, 두 부분으로 나누어 추가로 확장시켰다. 이어서, 각 클론으로부터 유도된 세포의 절반을 동결시키고 다른 나머지 절반은 벡터와 표적 서열 사이의 상동 재조합에 대하여 분석하였다.
서든 블롯 혼성화에 의해 DNA 분석을 수행하였다. 문헌[Laird et al. (Laird, P. W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293)]게 기재된 바와 같이 클론으로부터 DNA를 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 SpeI으로 절단하였고, mu 인트론 인핸서와 mu 스위치 영역 사이의 서열과 혼성화하는, 915 bp SacI 단편인 프로브 A (도 1 참조)로 프로빙하였다. 프로브 A는 야생형 좌위로부터의 9.9 kb SpeI 단편, 및 CMD 표적화 벡터와 상동 재조합되는 mu 좌위로부터의 진단용 7.6 kb 밴드를 검출한다 (neo 발현 카세트는 SpeI 부위를 포함한다). 서던 블롯 분석에 의해 스크리닝된 1132, G418 및 FIAU 내성 클론 중에서, 세번째가 mu 좌위에서 상동 재조합을 나타내는 7.6 kb SpeI 밴드를 나타내었다. 이 세 클론을 효소 BglI, BstXI 및 EcoRI으로 추가로 절단하여, 벡터가 mu 유전자내에 상동적으로 통합되었음을 확인하였다. 프로브 A와 혼성화되는 경우, 야생형 DNA를 BglI, BstXI 또는 EcoRI으로 절단하여 서던 블롯 분석한 결과, 각각 15.7, 7.3 및 12.5 kb 크기의 단편이 생성되었지만, 표적화된 mu 대립유전자의 존재는 각각 7.7, 6.6 및 14.3 kb 크기의 단편으로 나타났다. SpeI 절단에 의해 검출되는 세가지 양성 클론은 모두 neo 카세트의 Cmul 엑손으로의 삽입의 특징을 나타내는 예상 BglI, BstXI 및 EcoRI 제한 단편을 나타내었다.
변이 mu 유전자를 보유하는 마우스의 발생
번호 264, 272 및 408로 명명된 세 표적화된 ES 클론을 문헌[Bradley (Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151)]에 기재된 바와 같이 해동시키고 C57BL/6J 배반포에 주입하였다. 주입된 배반포를 가임신 상태의 암컷 자궁내에 착상시켜 주입 ET 세포 및 숙주 배반포로부터 유도되는 세포의 혼합물을 나타내는 키메라 마우스를 발생시켰다. 키메라에 대한 ES 세포 분포의 정도는 흑색 C57BL/6J 배경상에서 ES 세포주로부터 유도되는 아구티(agouti) 외피의 착색량에 의해 시각적으로 평가할 수 있다. 클론 272 및 408은 단지 낮은 비율의 키메라 (즉, 낮은 아구티 착색 비율)를 생산하였지만, 클론 264는 높은 비율의 수컷 키메라를 생산하였다. 이 키메라를 C57BL/6J 암컷과 교배하여 아구티 자손을 발생시켰으며, 이는 생식세포에 의한 ES 세포 게놈의 전달을 암시한다. 표적화된 mu 유전자의 스크리닝을 꼬리 생체검사법으로부터 BglI 절단된 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 (ES 세포 DNA의 분석에 대하여 상기 기재된 바와 같이) 수행하였다. 아구티 자손의 약 50 %는 15.7 kb의 야생형 밴드 이외에도 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴 드를 나타내었으며, 이는 생식세포에 의한 표적화된 mu 유전자의 전달을 증명하였다.
mu 유전자의 기능적 불활성화에 대한 형질전환 마우스의 분석
neo 카세트의 Cmul로의 삽입이 Ig 중쇄 유전자를 불활성화하는지를 결정하기 위해, JH 유전자 단편의 결실로 인해 중쇄 발현을 불활성화하는 JHD 돌연변이에 대하여 동형접합인 마우스와 클론 264 키메라를 교배하였다 (Chen et al, (1993) Immunol. 5: 647-656). 아구티 자손이 4마리 발생되었다. 1개월령의 이들 동물로부터 혈청을 채취하여 ELISA법에 의해 쥐 IgM의 존재에 대하여 분석하였다. 자손 네마리 중 둘에는 IgM이 완전히 결여되어 있었다 (표 1 참조). 꼬리 생체검사법에서 BglI 절단 및 프로브 A (도 1 참조)와의 혼성화, 및 StuI 절단 및 475 bp EcoRI/StuI 단편과의 혼성화 (ibid)에 의해 DNA를 서던 블롯 분석하여 네마리 동물의 유전자형을 결정함으로써, 혈청 IgM을 발현시키지 못하는 동물은 중쇄 좌위의 한 대립유전자가 JHD 돌연변이를 보유하며 다른 대립유전자는 Cmul 돌연변이를 포함하는 동물이라는 사실을 입증하였다. JHD 돌연변이에 대하여 이형접합인 마우스는 야생형 수준의 혈청 Ig를 나타내었다. 이 데이타는 Cmul 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성화함을 입증한다.
마우스 혈청 IgM (㎍/ml) IgH 쇄 유전자형
42 < 0.002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 < 0.002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129 x BL6F1 153 +/+
JHD < 0.002 JHD/JHD

표 1은 CMD 및 JHD 돌연변이 둘 다를 보유하는 마우스 (CMD/JHD), JHD 돌연변이에 대하여 이형접합인 마우스 (+/JHD), 야생형 (129Sv x C57BL/6J) FI 마우스 (+/+), 및 JHD 돌연변이에 대하여 동형접합인 B 세포 결실 마우스 (JHD/JHD)에 대하여 ELISA에 의해 검출된 혈청 IgM의 수준을 나타낸다.
실시예 2: 항-PSMA 인간 항체의 생산을 위한 HCO12 형질전환 마우스의 생성
HC012 인간 중쇄 트랜스진
pHC2의 80 kb 삽입물 및 pVx6의 25 kb 삽입물의 공동주입에 의해 HCO12 트랜스진을 생성시켰다 (Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591). 플라스미드 pVx6를 하기 기재된 바와 같이 작제하였다.
생식세포 인간 VH1-18 (DP-14) 유전자를 약 2.5 kb의 5' 플랭킹 및 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열과 함께 포함하는 8.5 kb HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72 (Promega, Madison, WI)내에 서브클로닝하여 플라스미드 p343.7.16을 생성시켰다. 생식세포 인간 VH5-51 (DP-73) 유전자를 약 5 kb의 5' 플랭킹 및 1 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열과 함께 포함하는 7 kb BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322계 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295)내에 클로닝하여 플라스미드 p251f를 생성시켰다. pGP1f로부터 유도된 새 클로닝 벡터 pGP1k를 EcoRV/BamHI으로 절단하여 생식세포 인간 VH3-23 (DP47) 유전자를 약 4 kb의 5' 플랭킹 및 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열과 함께 포함하는 10 kb EcoRV/BamHI DNA 단편에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드 p112.2RR.7을 BamHI/SalI으로 절단하여 p251f의 7 kb 정제된 BamHI/SalI 삽입물과 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드 pVx4를 XhoI로 절단하여 p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 삽입물과 라이게이션하였다.
VH1-18 유전자를 다른 두 V 유전자와 동일한 방향으로 포함하고 있는 클론을 얻었다. 이어서, pVx6로 명명된 이 클론을 NotI으로 절단하고, 문헌[Hogan et al. (B.Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)]에 기재된 바와 같이, 정제된 26 kb 삽입물을 pHC2의 정제된 80 kb NotI 삽입물과 함께 1/2일 (C57BL/6J x DBA/2J)F2 배의 전핵내에 1:1의 몰 비율로 공동주입하였다. 주입된 배로부터 발생한 마우스로부터 Vx6 및 HC2 둘 다로부터의 서열을 포함하는 형질전환 마우스의 세 독립 계통을 확립하였다. 이 계통들을 (HC012) 14881, (HC012) 15083 및 (HC012) 15087로 명명하였다. 이어서, 이 계통 각각을 실시예 1에서 설명된 CMD 돌연변이, JKD 돌연변이(Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) 및 (KCo5) 9272 트랜스진(Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851)을 포함하는 마우스와 교배하였다. 생성된 마우스는 내부 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 좌위의 파괴에 대하여 동형접합인 배경에서 인간 이뮤노글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현시킨다.
실시예 3: PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체 및 이중특이적 항체의 생산
PSMA를 발현시키는 LNCaP 세포로부터 정제된 PSMA 항원 및 LNCaP 세포로부터의 조 막 제제를 사용하여 HuMAb 마우스의 HC07 및 HC012 균주를 면역화시켜 인간 항-PSMA 모노클로날 항체를 생성하였다.
전체 개시 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,770,429호 및 동 제5,545,806호에 기재된 바와 같이 HC07 HuMAb 마우스를 발생시켰다.
특히, HC07 및 HC012 마우스를 먼저 프러이드 완전 보조제 (Complete Freund's Adjuvant) 중에 유화된 항원으로 면역화하였다. 차후의 면역화에서, 항원을 프러이드 불완전 보조제 (Incomplete Freund's Adjuvant)와 함께 혼합하였다. 마지막으로, 비장절제술에 앞서 정제된 항원을 보조제 없이 사용하여 항원을 정맥내 투여하였다. 마우스는 2 내지 3주 마다 면역화하였다. 세번째 및 그 이후의 면역화 후에, ELISA법에 의해 (하기 기재된 바와 같이) 인간 IgG 항-PSMA 역가를 결정하였다. 정제된 항원을 항-PSMA IgG 반응을 나타내는 마우스에 비장절제술 시술 전 3일 동안 또는 3일 및 4일 동안 정맥내 투여하였다. 반응하는 마우스로부터 비장을 적출하여 단일 세포로 분산시켰다.
항-PSMA 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 항-PSMA 항체를 함유하는 혈장을 갖는 마우스의 비세포(splenocyte)를 P3X63-Ag8.653 세포 (ATCC에 기탁명 ATCC CRL 1580로 기탁된 비분비성 마우스 골수종 세포) 및 PEG와 융합시켰다. 하이브리도마를 (약 10 내지 14일) 배양한 다음, ELISA법에 의해 하이브리도마를 포함하는 각 웰을 항-인간 IgG를 사용한 인간 IgG의 생산에 대하여 스크리닝하였다.
하기 특성을 기준으로 양성 하이브리도마를 스크리닝하여 선별하였다: (1)인간 IgG1 κ항체의 생산, (2) 정제된 PSMA에 결합, 및 (3) PSMA-발현 종양 세포에 결합. DNA 서열 분석에 의해 항-PSMA 항체가 인간 이뮤노글로불린 트랜스진의 V(D)J 재배열에 의해 코딩되었음을 확인하였다.
요컨대, 인간 항-PSMA 항체의 분석을 위해 고상 ELISA 기초 분석을 이용하였다. LNCaP 세포로부터 면역친화성 정제된 PSMA를 Maxi-Sorp 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Nunc, Rochester, NY)상에 코팅하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS-0.2% Tween-20로 세척하고 실온에서 1시간 동안 PBS 중 5 % 소 혈청 알부민으로 차단시켰다. 항-PSMA 생산 하이브리도마로부터의 상등액 (50 ㎕) 및 정제된 항체 (PBS 중 1 내지 5 g/ml)를 웰에 가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 PBS/Tween으로 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 HRP-결합된 토끼-항-인간 IgG (1: 5000; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 50 ㎕와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, ABTS (0.1 M 시트르산 500 ml 중 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) 150 mg, pH 4.35) / H202 (ABTS 용액 10 ml 당 30% H202 10 ㎕) 크로마겐/기질 용액 100 ㎕를 각 웰에 가하고 405 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 시료를 판독하였다.
ELISA에 의해 PSMA와 결합한 인간 IgG를 생산하는 하이브리도마는 아이소타입에 대하여 ELISA 및 유동세포계수법에 의해 분석한 결과, 하기 기재된 바와 같이, PSMA를 발현시키는 종양 세포에 결합하는 것 및 PSMA-음성 세포에의 결합이 결여된 것을 추가의 특징으로 지니고 있었다. 이러한 특성을 나타내는 상등액을 포함하는 하이브리도마를 서브클로닝하고, 이들에 대한 항체를 정제한 다음 추가로 특성화하였다.
1 내지 5 % Fetalclone (Hyclone, Logan, UT)을 함유하는 HyQ-CCM1 배지를 사용하여 모노클로날 항체를 Cellmax 생물반응기 (Cellco, Laguna Hills, CA)로부터 단리하고, 제조자의 설명서에 따라 단백질 G-아가로스 칼럼 (KPL, Gaithersburg, MD)상에서 크로마토그래피하여 정제하였다.
형광 이소티오시아네이트 (FITC)를 사용하여 표지하는 경우, 정제된 모노클로날 항체를 0.3 M 탄산나트륨 완충액 (pH 9.5)에 대하여 전체적으로 투석하였다. DMSO 1 ml 중 고체 FITC 1 mg을 용해시켜 모 FITC 용액을 제조하였다. 항체 단백질 1 mg 당 FITC 50 ㎍을 제공하는 양으로 모 FITC를 계속적으로 혼합하면서 적가하였다. FITC를 첨가한 다음, 용액을 실온에서 1 내지 3시간 동안 암조건하에 인큐베이션하였다. FITC 표지된 항체를 PBS 중 평형화된 Sephadex G-10 칼럼상에서 결 여과에 의해 단리하였다.
스크리닝된 몇몇 하이브리도마는, ELISA 및 유동세포계수법에 의해 평가한 바로는, PSMA에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1κ항체 (예를 들어,4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9)를 생산하였다. ELISA에 의해 검출된 바와 같이, PSMA에 상당히 결합하는 것으로 나타난 하이브리도마 8C12 상등액으로부터 정제된 모노클로날 항체는 10-9 이상의 특이적 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 하였다.
표준 가교결합법을 이용하여 인간 항 CD89 항체 14.1 또는 14A8로 명명된 14.1 항체의 서브클론으로부터의 Fab'2 단편과 인간 항-PSMA 항체인 8C12를 디술피 드 결합을 통해 화학적으로 연결시켜 14.1 x 8C12 (도 3에 나타냄) 및 14A8 x 8C12로 명명된 이중특이적 분자를 제조하였다.
실시예 4: PSMA에 대한 인간 모노클로날 항체의 특성화
I. 종양 세포에 대한 인간 항-PSMA 항체의 결합
ELISA에 의해 검출된 바와 같이 PSMA에 대한 상당한 결합을 나타낸 하이브리도마 상등액으로부터 정제된 모노클로날 항체 (예를 들어, 4A3,7F12, 8A11, 8C12 및 16F9)를, PSMA를 높은 수준으로 발현시키는 종양 세포에 결합하는 능력에 대하여 추가로 시험하였다.
LNCaP 및 PC3 세포 둘 다로부터 유도된 혈장 막 분획을 사용하는 고상 ELISA에 의해 인간 항-PSMA 특이적 항체의 결합 특성을 연구하였다. LNCaP 및 PC3 세포로부터 세포 막 분획을 제조하기 위해, 세포를 플라스틱 디쉬에서 긁어내고, PBS 중에서 전체적으로 세척하고, 10배 용량의 탈이온수 중에 재현탁시키고, 다운스 (Dounce) 균질화기를 사용하여 3회 충격을 주어 균질화하였다. 막 분획을 15,000 x g에서 45분 동안 원심분리하여 단리하고 펠릿을 PBS 중에 재현탁시켰다. Pierce (Rockford, IL) BSA 킷트를 사용하여 막 펠릿의 단백질 농도를 결정하였다.
LNCaP 및 PC3 막 분획을 96-웰 플레이트에서 단계적으로 희석하고 공기 중에서 건조시켰다. 상기 기재된 바와 같이 표준 ELISA법을 이용하여 검출하기에 앞서 플레이트를 5% BSA로 차단하고 PBS 중 인간 항-PSMA 항체 5 ㎍/ml로 1시간 동안 처리하였다. 도 4에 제시된 결과는 독립적인 인간 모노클로날 항체에 대한 결과를 나타낸다. 이 항체들은 항원 농도 범위에 걸쳐 LNCaP 세포막에 대한 높은 친화도 를 나타냈지만, 상기 배경에서 PC3 세포막에 결합하는 항체는 거의 또는 전혀 없었다.
또한, 생존 LNCaP 및 PC3 종양 세포에 결합하는 인간 항-PSMA 항체를 유동세포계수법에 의해 연구하였다. 요컨대, 종양 세포를 조직 배양으로부터 새로 수획하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 세포 약 100만개를 0.5 % BSA 함유 PBS 중에 재현탁시키고 빙상에서 30분 동안 FITC-표지된 인간 항-PSMA 항체 50 내지 200 ㎍/ml와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 0.1% BSA, 0.01% NaN3 함유 PBS로 2회 세척하고, CellQuest 획득 소프트웨어를 구비한 FACSCalibur 세포측정기 (Becton-Dickinson, San Jose, CA) 상에서 형광 염색하여 분석하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 항-PSMA 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9은 PSMA를 발현시키는 생존 LNCaP 세포에 강하게 특이적으로 결합하는 것으로 입증되었다. 대조적으로, PC3 세포의 경우 또는 아이소타입 매치된 관련 없는 인간 항체를 LNCaP와 함께 사용하는 경우 음성 염색이 관찰되었다.
또한, 유사한 분석법을 이용하여 이중특이적 분자 14.1 x 8C12를 PSMA 발현 LNCaP 세포 (도 6) 및 CD89-발현 U937 세포 (도 7)에 결합하는 능력에 대하여 시험하였다. 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자는 LNCaP 및 U937 세포 둘 다와 투여량에 의존하는 방식으로 결합한다.
II. 인간 항-PSMA 항체의 결합 특이성
LNCaP 세포로부터의 단백질 용해물을 면역침전시켜 항-PSMA 항체 4A3,7F12, 8A11, 8C12 및 16F9의 결합 특이성을 추가로 연구하였다. 요컨대, 1% NP-40를 함유하는 PBS를 LNCaP 세포에 가한 다음, 1시간 동안 인큐베이션하고, 원심분리하여 미립자 물질을 제거함으로써 LNCaP 세포의 티터전트 용해물을 제조하였다. 용해물 1 ml 당 관련 없는 인간 IgG1 150 ㎍을 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 용해물 1 ml 당 충전된 단백질 G-세파로스 비즈 150 ㎕를 가하여 용해물을 미리 투명하게 만들었다. 상등액 분획을 원심분리하여 비즈를 제거한 후 사용하였다.
미리 투명하게 된 LNCaP 세포 용해물 분획 (100 ㎕)을 각 인간 항-PSMA 항체 5 ㎍과 함께 혼합하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS를 사용하여 비즈를 전체적으로 세척한 다음, SDS 시료 완충액을 가하였다. 결합된 면역 복합체를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 TBS/5% 무지방 밀크중에서 밤새 차단시키고, TBS 1 ml 당 쥐 선형 PSMA 서열 에피토프 특이적 항체 4D8 5 ㎍과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 0.5% Tween-20 (TBS-T) 함유 TBS를 사용하여 5회 세척하고 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG (1:5000)와 함께 인큐베이션하였다. TBS-T를 사용하여 5회 세척한 다음, LumiGLO 화학발광 기질 킷트 (KPL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 블롯을 현상하고 X-선 필름에 노출시켜 시각화하였다.
결과는 도 8에 나타나 있다. PSMA, 및 N-말단으로부터 처음 아미노산 57개가 결실된 선택적 스플라이스 변이체인 PSM'는 화살표로 나타내었다. 레인 1은 LNCaP 세포 용해물 중에 존재하는 PSMA 및 PSM'의 웨스턴 블롯 반응성을 나타낸다. 레인 2는 아이소타입 매치된 (IgG1) 관련 없는 인간 항체를 사용한 면역침전의 결과를 보여준다. 레인 3에서 7은 각각 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9을 사용한 면역침전의 결과를 나타낸다. 각 경우에서, PSMA 및 PSM' 둘 다에 대응하는 강한 밴드가 관찰되며, 이는 이들 항체가 아미노산 잔기 44에서 750에 걸쳐 있는 영역인 단백질의 세포외 도메인내에 존재하는 단백질 에피토프에 결합한다는 사실을 암시한다.
천연 및 열 변성된 PSMA에 결합하는 항체를 시험하여 결합 특이성에 대한 단백질 형태의 중요성을 결정하였다. LNCaP 세포로부터 면역친화성 정제된 PSMA 분획 (PBS 중 40 ㎍/ml)을 10분 동안 비등시켜 열변성시키고 빙상에서 냉각시켰다. 열변성된 PSMA, 및 비-변성된 PSMA의 동일한 분획을 PBS 중 1:4로 희석시키고, 96-웰 Maxi-Sorp 플레이트 (Nunc)의 웰에 가하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 후에, PBS 중 5 % BSA를 사용하여 플레이트를 1시간 동안 차단시키고, PBS 중 세척하고, 인간 항-PSMA 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 분석하였다. 단백질의 N-말단으로부터 처음 6개의 아미노산으로 이루어진 에피토프에 대해 특이적인 쥐 항-PSMA 모노클로날 항체 7E11을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 열변성은 7E11 항체 결합에 대하여 영향을 주지 않았으며, 이는 그가 선형 서열 에피토프를 인식한다는 사실과 일치하였다. 이러한 결과와는 대조적으로, 인간 항-PSMA 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9는 모두 정제된 천연 PSMA에 강하게 결합하였지만, PSMA의 열 변성은 항체 결합을 실질적으로 파괴하였다. 이 결과는, 단백질의 천연 형태가 인간 항-PSMA 항체 결합을 위해 필요함을 암시한다. 이러한 결과와 일치하는 것으로, 항체 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9은 웨스턴 블롯 분석에서 PSMA를 검출하는데 비효과적이었다.
III. 항체 결합 경쟁 연구
유동세포계수분석을 이용한 항체 결합 경쟁 연구를 수행하여 인간 항-PSMA 항체 각각이 PSMA상의 유사한 또는 다른 에피토프에 결합하였는지를 결정하였다. 이 실험에서, LNCaP 세포에 대한 FITC-표지된 항-PSMA 항체의 결합을 차단시키는 비표지된 항-PSMA 항체의 능력을 시험하였다. LNCaP 세포에 대한 FITC 표지화의 강도는 유동세포계수법에 의해 결정하였다.
PBS 중 정제된 인간 항-PSMA 항체 또는 관련 없는 인간 IgG1 항체 200 ㎍/ml를 사용하여 빙상에서 1시간 동안 LNCaP 세포 약 100만개의 분획을 전처리하였다. 세포를 전체적으로 세척하고, 빙상에서 1시간 동안 FITC-결합된 인간 항-PSMA 항체 (또는, 어떤 실험에서는 FITC-결합된 쥐 PSMA 특이적 항체, 예를 들어 1G9, 3C6 및 4D4) 50 ㎍/ml와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 세척 후에, 요오드화 프로피듐 10 ㎍/ml를 사용하여 세포를 염색하고, CellQuest 소프트웨어를 구비한 FACSCalibur 상에서 유동세포계수법에 의해 분석하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 각 경우에서 관련 없는 인간 IgG1으로 전처리한 LNCaP 세포를 사용하여 FITC-표지된 인간 항-PSMA 항체의 강한 결합을 관찰하였다. 대조적으로, 인간 항-PSMA 항체 각각을 사용한 전처리에 의해 각 경우에서 FITC-표지된 인간 항-PSMA 항체의 결합을 실질적으로 억제하였다. 다른 항체 쌍을 사용하자 결합 억제 정도가 약간 변하는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 8C12는 4A3, 8A11 및 8C12 결합을 효과적으로 억제하지만, 7F12에 대한 영항은 훨씬 적다. 이를 함께 고려하면, 이 데이타는 7F12 및 16F9과 다른 인간 항-PSMA 항체의 경쟁적 결합 작용이 가장 유사하다는 사실을 시사한다. 전체적으로, 인간 항-PSMA 항체 각각은 약간 다르지만 밀접하게 분포되어 있는 PSMA 상의 구조적 에피토프를 인식하는 것으로 보인다.
인간 항-PSMA 항체가 쥐 항체와 공통적으로 에피토프를 인식하는지를 결정하기 위해, 단백질의 구조적 에피토프에 대하여 지시되는, 1G9, 3C6 및 4D4로 명명된 쥐 PSMA-특이적 항체의 작은 패널을 사용하여 항체 경쟁 연구를 수행하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 각각의 인간 항-PSMA 항체를 사용하여 LNCaP 세포를 전처리한 다음, FITC-쥐 4D4 및 1G9를 사용하여 표지한 결과, 분명한 억제는 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, FITC-쥐 3C6 결합은 인간 항-PSMA 항체 7F12, 8A11, 8C12 및 16F9에 의해 상당히 억제되는 것으로 관찰되었으며, 이는 이들 항체 각각이, 3C6에 의해 인식되는 것과 같은, 유사하거나 또는 밀접하게 분포된 에피토프에 결합한다는 사실을 암시한다. 인간 항-PSMA 항체 4A3을 사용한 결과, FITC-표지된 쥐 구조 항체의 억제는 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 이 항체가 각각의 쥐 1G9, 3C6 또는 4D4와 다른 에피토프에 결합한다는 사실을 시사한다.
실시예 5: 인간 항-PSMA 항체의 활성
I. 인간 항-PSMA 항체 및 이중특이적 항체를 사용한 인간 종양 세포 증식의 억제
상기 입증된 바와 같이, PSMA에 특이적으로 결합하는 것으로 나타난 항-PSMA 항체 및 이중특이적 항체를, PSMA를 발현시키는 인간 종양 세포의 증식을 억제하는 능력에 대하여 시험할 수 있었다. 요컨대, 정제된 항체를 보통 배양 조건하에 종양 세포와 함께 인큐베이션할 수 있었으며, 세포 밀도는 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 염색법에 의해 측정할 수 있었다.
II. 인간 항-PSMA 항체 및 이중특이적 항체의 항체 의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 활성
표지된 PSMA-발현 종양 세포의 다형핵 세포-매개된 ADCC 사멸에 대하여 이중특이적 분자 14.1 x 8C12 (도 3에 나타냄) 및 14A8 x 8C12, 및 모노클로날 항체 8C12를 시험하였다.
특히, 건강한 공여자로부터 단핵 세포 (단핵구 및 호중구), 및 전혈을 단리하여 이중특이적 분자 14.1 x 8C12의 존재하에 51Cr 표지된 PSMA 발현 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. 약 4시간 후에, 웰로부터 배양물 상등액을 수획하고, 감마 계수기로 51Cr 방출을 측정하였다. 비 용해율을 다음 식에 따라 결정하였다: (실험상 CPM - 표적 누출 CPM) / (디터전트 용해 CPM - 표적 누출 CPM) x 100 %. 도 12A, 13A 및 14A에 나타낸 결과는, 14.1 x 8C12가 대조군 항체에 비해 각각 단핵구, 호중구 및 전혈에 의한 종양 세포의 투여량 의존적 용해를 매개한다는 사실을 입증하였다.
단핵 세포 및 전혈을 또한 이중특이적 분자 14A8 x 8C12 또는 모노클로날 항체 8C12의 존재하에 51Cr 표지된 LNCaP 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다 (도 12B, 12C, 13B 및 14B). LNCaP 세포를 단핵 세포, 전혈, 및 여러 농도의 이중특이 적 또는 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하기에 앞서 37 ℃ (5% CO2)에서 1시간 동안 51Cr 100 μCi로 표지하였다. 16시간 동안 인큐베이션한 다음, 상등액을 쉬획하여 상기 기재된 바와 같이 방사활성에 대하여 분석하였다.
단핵구 유도된 ADCC
도 12A에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 8C12는 단핵구에 의한 PSMA 발현 종양 세포의 세포 사멸을 투여량 의존적인 방식으로 매개하였다. 14.1 Fab'2 50 ㎍/ml를 첨가하여 이중특이적 분자 14.1 x 8C12 1 ㎍/ml에 의한 종양 세포의 ADCC를 완전히 차단시켰으며, 이는 표적 세포 사멸이 오로지 이펙터 세포 상의 CD89에 의해서만 매개되었음을 입증한다. 도 12B에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8 x 8C12 및 모노클로날 항체 8C12는 또한 LNCaP 종양 세포의 단핵구에 의한 투여량 의존적 용해를 매개하였다. 또한, 과량의 14A8 F(ab)'2를 첨가하여 H22 F(ab)'2 (인간화 항-FcγRI)에 비해 이중특이적 분자 14A8 x 8C12에 의한 종양 세포의 ADCC를 완전히 억제하였으며, 이는 표적화된 세포 사멸이 CD89를 통해 매개되었음을 암시한다 (도 12C 참조).
호중구 유도된 ADCC
도 13A에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 8C12는 호중구에 의한 PSMA 발현 종양 세포의 세포 사멸을 투여량 의존적인 방식으로 매개하였다. 14.1 Fab'2를 25 ㎍/ml 첨가하자 이중특이적 분자에 의한 종양 세포의 ADCC가 상당히 차 단되었으며, 이는 표적화된 세포 사멸이 이펙터 세포에 결합하는 CD89에 의해 특이적으로 매개되었음을 입증한다. 도 13B에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8 x 8C12는 또한 호중구에 의한 LNCaP 종양 세포의 투여량 의존적 용해를 매개하였다. 과량의 14A8 F(ab)'2를 첨가하여 H22 F(ab)'2 (인간화 항-FcγRI)에 비해 14A8 x 8C12에 의한 종양 세포의 ADCC를 완전히 억제하였으며, 이는 표적화된 세포 사멸이 CD89를 통해 매개되었음을 암시한다.
전혈 유도된 ADCC
도 14A에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 8C12는 전혈에 의한 PSMA 발현 종양 세포의 세포 사멸을 투여량 의존적인 방식으로 매개하였다. 14.1 Fab'2를 25 ㎍/ml 첨가하여 이중특이적 분자에 의한 종양 세포의 ADCC를 상당히 차단하였으며, 이는 마찬가지로, 표적화된 세포 사멸이 이펙터 세포에 결합하는 CD89에 의해 특이적으로 매개되었음을 입증한다. 마찬가지로, 도 14B에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8 x 8C12는 또한 LNCaP 종양 세포의 전혈에 의한 투여량 의존적 용해를 매개하였다. 과량의 14A8 F(ab)'2의 첨가는 H22 F(ab)'2 (인간화 항-FcγRI)에 비해 14A8 x 8C12에 의한 종양 세포의 ADCC를 완전히 억제하였으며, 이는 표적화된 세포 사멸이 CD89를 통해 매개되었음을 암시한다.
III. 인간 항-PSMA 항체 및 이중특이적 항체는 인간 이펙터 세포의 존재하에 PSMA 발현 종양 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개한다
이중특이적 분자 14.1 x 8C12 및 14A8 x 8C12, 및 모노클로날 항체 8C12를, 대조군으로서 과량의 14.1 (인간 항-FcαR) Fab'2 항체 또는 과량의 H22 (인간화 항-FcγRI) Fab'2 항체의 존재하에, 표지된 PSMA 발현 종양 세포 (LnCAP 세포) 단독의 식세포작용을 매개하는 이들의 능력에 대하여 시험하였다.
요컨대, 단핵구 유도된 대식세포 (MDM)에 의한 LnCAP 세포의 이중특이적-매개된 식세포작용을 문헌[Munn et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 231-237]에 기재된 방법을 변형하여 조사하였다. 정상 성인 공급원 류코팩(leukopacs)(ABI)으로부터 정제된 단핵구를 7 내지 12일 동안 10% FBS 및 M-CSF 1O ng/ml를 보충한 대식세포 혈청 무함유 배지 (Gibco, Grand Island, NY) 중 24-웰 플레이트 (1 x 106/ml)에서 분화시켰다. LnCAP 세포를 지질친화성 붉은 형광 염료인 PKH 26 (Sigma, St. Louis, MO)로 표지하였다. 표지된 LnCAP 세포를 이중특이적 항체 (또는 대조군 항체)의 존재 또는 부재하에 MDM를 함유하는 웰에 가하고 37 ℃에서 5 내지 24시간 동안 (5% C02) 인큐베이션하였다. 트립신을 사용하여 MDM 및 비-식세포작용 LnCAP 세포를 회수하고, (4 ℃) 빙상에서 1시간 동안 FITC-표지된 항-CD33 mAb (251) 및 항-CD14 mAb (AML-2-23)로 염색하였다. 세포를 세척하여 FACScan을 사용한 2-색 형광에 의해 분석하였다. 식세포작용 비율(%)은 이중-양성 표적 세포 (MDM에 의해 분해됨)의 수를 표적 세포의 총 수로 나누고 여기에 100을 곱하여 계산하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 8C12는 종양 세포의 특이적 식세포작용 증가를 투여량 의존적 방식으로 매개하였다. 14.1 Fab'2를 가하여 이중특이적 분자에 의한 종양 세포의 식세포작용을 상당히 차단하였으며, 이는 마찬가지로, 표적화된 식세포작용이 이펙터 세포에 결합하는 CD89에 의해 특이적으로 매개되었음을 입증한다. 마찬가지로, 도 16에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14A8 x 8C12 및 모노클로날 항체 8C12는 또한 LNCaP 세포의 식세포작용을 투여량 의존적인 방식으로 매개하였다. 도 17은 LNCaP 종양 세포의 14A8 x 8C12 매개된 식세포작용이, H22 F(ab)'2 (인간화 항-FcγRI)에 비해 과량의 14A8 F(ab)'2 첨가에 의해 억제된 바와 같이, CD89를 통해 매개됨을 보여준다 (도 17 참조).
상기 실시예는 PSMA에 대해 고 친화성으로 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체 및 이중특이적 항체의 생성을 입증하였다. 이들 항체 및 이중특이적 항체는 선형 아미노산 서열에 의해 형성되는 에피토프보다는 분자의 세포외 도메인에 존재하는 천연 구조의 단백질 에피토프를 인식하는 것으로 보인다. 또한, 인간 항-PSMA 항체 및 그의 이중특이적 분자는 PSMA를 높은 수준으로 발현시키는 인간 종양 세포에 대하여 이펙터 세포의 존재하에 세포 사멸 및 식세포작용을 매개한다. 이러한 결과는 PSMA에 대한 본 발명의 완전한 인간 모노클로날 항체 및 그의 단편, 및 그의 이중특이적 분자가 PSMA 관련 질환의 진단 및 치료에 유용하다는 결론을 뒷받침한다.
동등물
당업자라면 불필요한 실험 없이도 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태의 많은 동등물을 확인할 수 있음을 알 것이다. 하기 청구의 범위는 이러한 동등 물을 포함되는 것으로 의도된다.
<참고문헌>
Figure 112002002768391-pct00001

Claims (47)

  1. (a) 시험관내에서 인간 이펙터 세포의 존재 하에 10 ㎍/ml 이하의 농도로 인간 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 발현 세포의 세포용해를 매개하는 능력을 갖고;
    (b) 시험관내에서 1 X 10-7 M 이하의 IC50으로 인간 이펙터 세포에 의한 PSMA 발현 세포의 세포용해를 매개할 수 있는,
    107 M-1 이상의 친화 상수로 PSMA에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 108 M-1 이상의 친화 상수로 인간 PSMA에 결합하는 것인 인간 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 109 M-1 이상의 친화 상수로 인간 PSMA에 결합하는 것인 인간 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 PSMA 발현 종양 세포의 생장을 40% 이상 억제하는 것인 인간 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체가 PSMA 발현 종양 세포의 생장을 60% 이상 억제하는 것인 인간 항체.
  6. 제1항에 있어서, PSMA가 인간 PSMA인 인간 항체.
  7. 제1항에 있어서, IgG1 또는 IgG3 중쇄를 포함하는 인간 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체가 천연 인간 PSMA에는 결합하지만 열 변성된 인간 PSMA에는 결합하지 않는 것인 인간 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    a) 104 M-1s-1 이상의 결합 상수 (Kassoc);
    b) 10-4 s-1의 해리 상수 (Kdis); 또는
    c) PSMA를 발현하는 세포를 옵소닌화(opsonization)하는 능력
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인 인간 항체.
  10. 제1항에 있어서, 항체 단편 또는 단쇄 항체인 인간 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 PSMA 발현 세포가 전립선 종양 세포인 인간 항체.
  12. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물로부터 얻어지며 불멸 세포와 융합되어 있는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산되는 인간 항체.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물로부터 얻어지며 불멸 세포와 융합되어 있는 B 세포를 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  17. 제16항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  18. 삭제
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체를 발현하며, 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물.
  20. 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물을, PSMA 또는 PSMA를 발현하는 세포로 면역화시켜 상기 동물의 B 세포에 의해 항체가 생산되도록 하는 단계;
    상기 동물의 B 세포를 단리하는 단계; 및
    상기 B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 PSMA에 대해 특이적인 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체의 생산 방법.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체, 및 Fc 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 Fc 수용체가 인간 Fcγ수용체 또는 인간 Fcα수용체인 이중특이적 분자.
  23. 제21항에 있어서, Fc 수용체의 이뮤노글로불린 결합 부위와 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합하는 이중특이적 분자.
  24. 제21항에 있어서, Fc 수용체에 결합하는 제2 결합 특이적 부위가 인간 모노클로날 항체인 이중특이적 분자.
  25. 제21항에 있어서, 단일쇄 또는 Fab' 융합 단백질인 이중특이적 분자.
  26. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체, Fc 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위, 및 PSMA 이외의 종양 항원에 대한 제3 결합 특이적 부위를 포함하는 다중특이적 분자.
  27. 제26항에 있어서, Fc 수용체가 인간 Fcγ수용체 또는 인간 Fcα수용체인 다중특이적 분자.
  28. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 인간 모노클로날 항체 또는 제21항의 이중특이적 분자 또는 제26항의 다중특이적 분자, 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, PSMA의 상이한 에피토프에 각각 특이적으로 결합하는 2종 이상의 단리된 인간 항체의 배합물을 포함하는 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제28항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 Fc 수용체에 대해 결합 특이적으로 결합되는 것인 제약 조성물.
  35. 제28항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 세포독소에 결합되어 있는 것인 제약 조성물.
  36. 삭제
  37. 제28항에 있어서, 암이 전립선 암인 제약 조성물.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 세포독성제에 연결되어 있으며 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 제21항의 이중특이적 분자 또는 제26항의 다중특이적 분자를 포함하는 면역독소.
  41. PSMA 발현 세포를 세포 생장이 억제되도록 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 제21항의 이중특이적 분자 또는 제26항의 다중특이적 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, PSMA 발현 세포의 생장을 억제하는 생체외 방법.
  42. PSMA 발현 세포를 세포용해가 일어나도록 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 제21항의 이중특이적 분자 또는 제26항의 다중특이적 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, PSMA 발현 세포의 세포용해를 유도하는 생체외 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 Fc 수용체에 대해 결합 특이적으로 결합되는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 Fc 수용체에 대해 결합 특이적으로 결합되는 것인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 세포독소에 결합되어 있는 것인 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 세포독소에 결합되어 있는 것인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 세포독소에 결합되어 있는 것인 방법.
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