CN112979491B - 一种包含过氧化氢/组织蛋白酶l响应性保护基的化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体提供了一种包含过氧化氢/组织蛋白酶L（H2O2/CTSL）响应性保护基的化合物及其制备方法、和其在荧光探针和前药等方面的应用，特别涉及肿瘤相关活性等方面的应用，尤其是在结肠癌或非小细胞肺癌等肿瘤方面的应用。本发明的H2O2/CTSL响应性保护基可以与细胞生长抑制剂和用于检测的荧光探针的OH、NH2等官能团相连，实现选择性释放。

Description

一种包含过氧化氢/组织蛋白酶L响应性保护基的化合物及其 应用
技术领域
本发明涉及一种包含过氧化氢/组织蛋白酶L响应性保护基的化合物及其应用，具体涉及一种H2O2/CTSL响应性保护基的制备方法和用途，特别是在肿瘤相关活性等方面的应用，属于药学技术领域。
背景技术
目前癌症治疗的一个主要局限是对肿瘤细胞的低选择性。大多数化疗药物影响肿瘤细胞和正常细胞共同的功能，造成不良反应，导致治疗效果有限。尽管最近在免疫治疗和靶向治疗方面取得了进展，但仍迫切需要高选择性药物来消灭癌细胞，同时保留健康组织。在肿瘤发生发展过程中，为了便于生长和生存，肿瘤细胞发生异常变化，表型特征改变。因此，广泛的研究致力于寻找相对于正常细胞的癌症特异性靶分子。在潜在的靶分子中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶CTSL在肿瘤进展和转移的多个阶段发挥关键作用。有证据表明，CTSL的升高是转移性癌症的一个标志。CTSL作为一种内肽酶，可在肿瘤微环境中水解蛋白，以此修饰和调节许多细胞内外蛋白(Nature Chemical Biology,2019,13:415-424)。因此，CTSL被视为癌症治疗的有效靶点。其次，癌细胞的H2O2水平(5–1000μM)明显高于正常细胞(0.001-0.7μM)(Chemical Communications,2019,55:12904-12907)。
紫杉醇是一种具有良好抗癌活性的二萜生物碱性化合物，在临床上被广泛用于癌症治疗。紫杉醇的强疏水性和副作用限制了其在癌症治疗上的应用，因此提高紫杉醇的水溶性和靶向性是当今研究的重点。文献报道的一些大分子结合型紫杉醇前药，往往存在药物释放困难的问题，在体内的循环周期中不能有效地释放紫杉醇，导致作用效果较差。目前上市的紫杉醇制剂有Taxol和Abraxane。Taxol有一个非常明显的缺陷：溶媒中使用了聚氧乙基代蓖麻油，会刺激机体释放组胺，导致严重的过敏反应。Abraxane被证明能降低紫杉醇的毒性作用。然而，这种制剂的制备相当复杂，并且一旦在盐水中复溶，稳定性将降低(在2℃至8℃下冷藏最长8小时)。因此，复原粉末必须迅速注射到患者体内(Clinal CancerResearch,2006,12:1317-24)。由于这些原因，紫杉醇的替代制剂仍在积极开发中。
发明内容
目的：本发明提供一种包含H2O2/CTSL响应性保护基的化合物及其荧光探针及前药的制备方法与用途；本专利中，将肿瘤中高表达的H2O2和CTSL结合起来作为一种序贯裂解工具，开发出了一种基于肿瘤微环境的激活启动子，并将其应用到近红外探针中，验证H2O2和CTSL为治疗癌症提供了选择性环境。
本发明在紫杉醇活性必需基团2’-OH上连接我们设计的激活启动子，设想前药试剂将选择性被癌细胞裂解，导致紫杉醇释放，从而降低其毒副作用，实现肿瘤选择性杀伤效果。此外，我们还对目标化合物的抗肿瘤活性及安全性进行了评估。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种H2O2/CTSL响应性保护基，如式I所示：
Figure BDA0002950233120000021
其中，R＝氨基保护基，
在一些实施例中，所述氨基保护基R选自：
Figure BDA0002950233120000022
进一步的，在一些实施例中，所述化合物选自：
Figure BDA0002950233120000031
一种荧光探针，为将上述的化合物与荧光染料直接相连，或通过自杀式连接子结合。
作为本文使用的表述“自杀式连接子”包括任何能够结合至少两个残基、由此将所述残基化学连接在一起的基团。因此，本发明所述“连接子部”没有限定，并可以是适于将上述定义的式Ⅰ的α-C原子的末端COOH基团与荧光染料或细胞生长抑制剂两者结合的任何化学部分。根据本发明的优选实施方案，上述定义的可裂解连接子部(Y)选自由对氨基苄氧羰基(PABC)。
作为在本发明的荧光探针中定义的荧光染料没有特别限定，选自由化学因子、生物因子、激素、寡核苷酸、药物、毒素、亲和配体、用于检测的探针组成的组。具体实施方案的化合物的实例如下所示：
Figure BDA0002950233120000032
分析实验表明该荧光探针能在体内及体外响应H2O2/CTSL，释放近红外荧光。
一种前药，为将上述的化合物与细胞生长抑制剂直接相连，或通过自杀式连接子结合。
作为在本发明的前药中定义的细胞生长抑制剂没有特别限定，选自由化学因子、生物因子、激素、寡核苷酸、药物、毒素、亲和配体、用于检测的探针组成的组。具体实施方案的化合物的实例如下所示：
Figure BDA0002950233120000041
药理实验证明，该紫杉醇前药在肺癌细胞系，结肠癌细胞系上体现出强力的生长抑制作用，其中对A549的活性最优，且该化合物对正常细胞系表现出低毒性。进一步的研究表明该化合物表达出与紫杉醇相当的活性，且安全性显著提高。
本发明的另一目的在于提供本发明式I化合物的制备方法，化合物合成路线如下：
Figure BDA0002950233120000042
化合物DCM-CC及化合物CC-PTX的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0002950233120000051
Figure BDA0002950233120000061
Figure BDA0002950233120000071
Figure BDA0002950233120000081
制备方法包括：
步骤(1)(化合物1)2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酸和(化合物2)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)赖氨酸反应制得(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基))羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸；
步骤(2)(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸和(化合物3)(4-氨基苯基)甲醇反应后得到(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯；
步骤(3)(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己酮-2-基)氨基甲酸酯和(化合物5)4-硝基苯基碳酰氯反应得到(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯；
步骤(4)(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧代己基-2-基)氨基甲酸酯和(化合物DCM-OH)(E)-2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚甲基)丙二腈反应得到(化合物DCM-CC)(9H-芴-9-基)甲基(E)-(1-((4-(((((4-(2-(4-(二氰基亚甲基)-4H-苯并吡喃-2-基)乙烯基)苯氧基)羰基)氧)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯；
步骤(5)(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧代己基-2-基)氨基甲酸酯和化合物PTX紫杉醇反应得到(化合物CC-PTX)(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-9-(((((4-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰胺基)六氨基)苄基)氧基)羰基)氧基)-3-苯甲酰胺基-3-苯基丙酰基)氧基)-12-(苯甲酰氧基)-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a-十氢-1H-7，11-甲基环十[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-6，12b(2aH)-二乙酸二乙酯。
具体的，包括：
步骤(1)、在氩气保护下，将化合物1和缩合剂HATU溶于无水有机溶剂DMF中，再加入有机碱DIEA，室温下搅拌一定时间后加入化合物2，反应得化合物A；
步骤(2)包括：在氩气保护下，将化合物A和缩合剂HATU溶于无水有机溶剂DMF中，再加入有机碱DIEA，室温下搅拌一定时间后加入化合物3，反应得化合物4；
步骤(3)包括：将化合物4用有机溶剂四氢呋喃溶解，再加入吡啶混合均匀；在氩气保护及冰浴下，滴加化合物5的四氢呋喃溶液，并在冰浴下搅拌反应得化合物6；
步骤(4)包括：将DCM-OH用有机溶剂二氯甲烷溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺混合均匀；在氩气保护及冰浴下搅拌，滴加化合物6的有机溶剂溶液；反应液在冰浴下搅拌，后在室温下反应一定时间，得到化合物DCM-CC；
步骤(5)包括：将紫杉醇PTX用有机溶剂二氯甲烷溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺混合均匀；在氩气保护及冰浴下搅拌，滴加化合物6的有机溶剂溶液；反应液在冰浴下搅拌，后在室温下反应一定时间；反应完全后通过柱层析得到化合物CC-PTX。
在一些实施例中，步骤(1)具体是指：在氩气保护下，将(化合物1)2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酸和缩合剂溶于无水有机溶剂中，再加入有机碱，室温下搅拌30分钟后加入(化合物2)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)赖氨酸，继续反应。反应结束后，将反应液直接倒入水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机层并分别用水和盐水洗涤，Na2SO4干燥，合并有机相后，通过快速柱色谱法进一步纯化产物，得(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基))羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸；
步骤(2)具体是指：在氩气保护下，将(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸和缩合剂溶于无水有机溶剂中，再加入有机碱，室温下搅拌30分钟后加入(化合物3)(4-氨基苯基)甲醇，继续反应。反应结束后，将反应液直接倒入水中，用乙酸乙酯萃取。合并有机层并分别用水和盐水洗涤，Na2SO4干燥，合并有机相后，通过快速柱色谱法进一步纯化产物，得(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯；
步骤(3)具体是指：将(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯用有机溶剂溶解，再加入吡啶混合均匀。在氩气保护及冰浴下，滴加(化合物5)对硝基苯基氯甲酸酯的有机溶剂溶液，并在冰浴下搅拌约2h。反应完成后旋蒸除去有机溶剂得到粗产物，(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯；
步骤(4)具体是指：将(化合物DCM-OH)(E)-2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚甲基)丙二腈用有机溶剂溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺混合均匀。在氩气保护及冰浴下，滴加(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯的有机溶剂溶液。反应液在冰浴下搅拌约1h，后在室温下反应6h。反应完全后通过柱层析得到(化合物DCM-CC)(9H-芴-9-基)甲基(E)-(1-((4-(((((4-(2-(4-(二氰基亚甲基)-4H-苯并吡喃-2-基)乙烯基)苯氧基)羰基)氧)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯。
步骤(5)具体是指：将化合物PTX紫杉醇用有机溶剂溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺混合均匀。在氩气保护及冰浴下，滴加(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯的有机溶剂溶液。反应液在冰浴下搅拌约1h，后在室温下反应6h。反应完全后通过柱层析得到(化合物CC-PTX)(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-9-(((((4-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰胺基)六氨基)苄基)氧基)羰基)氧基)-3-苯甲酰胺基-3-苯基丙酰基)氧基)-12-(苯甲酰氧基)-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a-十氢-1H-7，11-甲基环十[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-6，12b(2aH)-二乙酸二乙酯。
作为优选方案，步骤(1)中，所述的无水有机溶剂选用N，N-二甲基甲酰胺，缩合剂选用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐，有机碱选用N，N-二异丙基乙胺。
步骤(2)中，所述的无水有机溶剂选用N，N-二甲基甲酰胺，缩合剂选用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐，有机碱选用N，N-二异丙基乙胺。
步骤(3)中，所述有机溶剂为四氢呋喃。
步骤(4)中，所述有机溶剂为二氯甲烷。
步骤(5)中，所述有机溶剂为二氯甲烷。
另一方面，提供所述的化合物、所述的荧光探针、所述的前药在制备诊断和/或治疗与肿瘤(尤其是结肠癌或非小细胞肺癌)有关疾病的药物中的应用。
有益效果：本发明设计、合成了一种H2O2/CTSL响应性保护基，并将其应用到荧光探针及前药中，通过一系列分析验证了荧光探针DCM-CC的选择性，并开展了一系列药理实验证明紫杉醇前药CC-PTX抗肿瘤效果及安全性。紫杉醇前药可以成功被H2O2/CTSL连续激活，在细胞水平及动物体内表现出与紫杉醇相当的抗肿瘤活性，且安全性显著提高。
附图说明
图1是实施例6制备的荧光探针的1H-NMR谱图(in DMSO-d6，500MHz)；
图2是实施例7制备的紫杉醇前药的1H-NMR谱图(in DMSO-d6，500MHz)；
图3是实施例8中荧光探针的吸收及激发光谱；
图4是实施例8中荧光探针在不同细胞系的响应荧光信号强度；
图5是实施例8中荧光探针在裸鼠中的实时成像；
图6是实施例9中紫杉醇前药的释放曲线图；
图7是实施例10短期毒性检测中的各组的体重变化曲线及生存率曲线，证明本发明紫杉醇前药在ICR小鼠体内安全性优于紫杉醇；
图8是实施例10体内活性研究中的抑瘤结果，证明本发明紫杉醇前药在BALB/c裸鼠体内的抗肿瘤效果与紫杉醇相当；
图9是实施例10中各组织病理切片扫描图。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
化合物的合成路线为：
Figure BDA0002950233120000131
实施例1
(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基))羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸：
Figure BDA0002950233120000141
在氩气保护下，将(化合物1)4-硝基苯乙醛酸(780mg，4.00mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，2267mg，5.96mmol)用30mL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1038μL，5.96mmol)，室温下搅拌30分钟后加入(化合物2)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)赖氨酸(Fmoc-Lys-OH，1470mg，4.00mmol)。薄层液相色谱(TLC)监测反应完全后将反应液直接倒入水中。用乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，Na2SO4干燥，减压旋蒸。以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基))羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸；实验数据如下：Yield 61％,黄色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.57(s,1H),9.05(t,J＝5.7Hz,1H),8.38–8.30(m,2H),8.24–8.13(m,2H),7.88(d,J＝7.5Hz,2H),7.71(d,J＝7.4Hz,2H),7.65(d,J＝8.1Hz,1H),7.40(t,J＝7.3Hz,2H),7.31(t,J＝7.4Hz,2H),4.26(d,J＝7.6Hz,2H),4.23–4.18(m,1H),3.93(td,J＝9.5,4.7Hz,1H),3.26(dd,J＝12.1,6.2Hz,2H),1.78–1.63(m,2H),1.58–1.46(m,2H),1.45–1.31(m,2H).13C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ188.5,173.9,165.8,163.3,156.2,150.4,150.0,143.8,143.8,140.7,137.8,131.3,130.7,127.6,127.1,125.3,125.2,123.9,123.7,120.1,65.6,53.7,46.6,38.4,30.4,28.2,23.1；HR-ESI-MS m/z 546.1842[M+H]+(calcd.for 546.1832,C29H28N3O8).
实施例2
(化合物B)N2-((苄氧基)羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰基)赖氨酸：
Figure BDA0002950233120000151
在氩气保护下，将(化合物1)4-硝基苯乙醛酸(780mg，4.00mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，2267mg，5.96mmol)用30mL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1038μL，5.96mmol)，室温下搅拌30分钟后加入(化合物7)(S)-2-((2S,3R)-2-氨基-3-羟基丁酰氨)-4-甲基戊酸(1120mg，4.00mmol)。薄层液相色谱(TLC)监测反应完全后将反应液直接倒入水中。用乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，Na2SO4干燥，减压旋蒸。以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得化合物BN2-((苄氧基)羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰基)赖氨酸；实验数据如下：Yield 76％,黄色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.56(s,1H),9.06(s,1H),8.38(d,J＝8.4Hz,2H),8.23(d,J＝8.5Hz,2H),7.59(d,J＝7.9Hz,1H),7.35(s,5H),5.03(d,J＝2.3Hz,2H),3.95(dd,J＝13.0,9.0Hz,1H),3.25(d,J＝6.4Hz,2H),1.78–1.63(m,2H),1.58–1.46(m,2H),1.41–1.31(m,2H).13C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ189.1,174.4,163.9,156.7,150.9,138.3,137.5,131.8,130.1,128.8,128.3,128.2,124.4,65.8,54.3,38.8,38.7,29.5,23.5；HR-ESI-MS m/z 458.1589[M+H]+(calcd.for 458.1519,C22H24N3O8).
实施例3
(化合物C)N2-((新戊氧基)羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰基)赖氨酸：
Figure BDA0002950233120000161
在氩气保护下，将(化合物1)4-硝基苯乙醛酸(780mg，4.00mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，2267mg，5.96mmol)用30mL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1038μL，5.96mmol)，室温下搅拌30分钟后加入(化合物8)(S)-6-氨基-2-((叔丁氧羰基)氨基)己酸(984mg，4.00mmol)。薄层液相色谱(TLC)监测反应完全后将反应液直接倒入水中。用乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，Na2SO4干燥，减压旋蒸。以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得(化合物C)N2-((新戊氧基)羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰基)赖氨酸；实验数据如下：Yield 52％,黄色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.41(s,1H),9.06(t,J＝5.7Hz,1H),8.39(d,J＝8.8Hz,2H),8.23(d,J＝8.8Hz,2H),7.08(d,J＝7.9Hz,1H),4.11(dd,J＝10.4,7.2Hz,1H),3.25(d,J＝6.0Hz,2H),1.78–1.63(m,2H),1.58–1.46(m,2H),1.38(s,12H),1.36–1.31(m,2H).13C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ189.1,174.8,163.9,156.1,155.0,150.9,138.3,131.8,130.1,124.4,78.4,53.1,41.0,38.8,29.3,28.7,28.6,23.6；HR-ESI-MS m/z446.1533[M+Na]+(calcd.for 446.1575,C19H25N3NaO8).
实施例4
(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯：
在氩气保护下，将(化合物A)N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基))羰基)-N6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰基)赖氨酸(545mg，1.0mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，570mg，1.5mmol)用15mL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，再加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA，171μL，1.5mmol)，室温下搅拌30分钟后加入(化合物3)对氨基苯甲醇(185mg，1.5mmol)。薄层液相色谱(TLC)监测反应完全后将反应液直接倒入水中。用乙酸乙酯萃取3次，有机层合并，Na2SO4干燥，减压旋蒸。以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯。实验数据如下：Yield88％,棕色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.97(s,1H),9.06(s,1H),8.38(d,J＝8.7Hz,2H),8.25(d,J＝8.7Hz,2H),7.91(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(d,J＝7.5Hz,2H),7.64(d,J＝7.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.44(t,J＝7.3Hz,2H),7.35(t,J＝7.3Hz,2H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H),5.09(s,1H),4.46(d,J＝5.4Hz,2H),4.37–4.28(m,1H),4.25(d,J＝6.8Hz,2H),4.18(m,1H),3.30–3.28(m,2H),1.84–1.44(m,6H).
实施例5
(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯：
将(化合物4)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯(780mg，1.0mmol)用20mL四氢呋喃溶解，再加入两滴吡啶混合均匀。在氩气保护及冰浴下，滴加(化合物5)对硝基苯基氯甲酸酯(604.68mg，3.0mmol)的四氢呋喃溶液，并在冰浴下搅拌约2h。薄层液相色谱(TLC)监测，反应完全后将反应液减压旋蒸，得到中间体(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯，无需纯化直接投下一步反应。实验数据如下：Yield 83％,黄色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),9.04(s,1H),8.38(d,J＝8.4Hz,2H),8.34(d,J＝8.8Hz,2H),8.25(d,J＝8.5Hz,2H),7.91(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(d,J＝4.3Hz,2H),7.68(d,J＝8.0Hz,3H),7.59(d,J＝8.8Hz,2H),7.44(d,J＝6.7Hz,4H),7.34(s,2H),5.28(s,2H),4.31(d,J＝6.4Hz,2H),4.25(d,J＝6.8Hz,1H),4.23–4.17(m,1H),3.30–3.28(m,2H),1.74–1.46(m,6H).
实施例6
(化合物DCM-CC)(9H-芴-9-基)甲基(E)-(1-((4-(((((4-(2-(4-(二氰基亚甲基)-4H-苯并吡喃-2-基)乙烯基)苯氧基)羰基)氧)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯：
Figure BDA0002950233120000181
将(化合物DCM-OH)(E)-2-(2-(4-羟基苯乙烯基)-4H-苯并吡喃-4-亚甲基)丙二腈(31.1mg，100μmol)用二氯甲烷溶解，再加入两滴N,N-二异丙基乙胺混合均匀。在氩气保护及冰浴下，滴加(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯(102.47mg，120μmol)的10mL二氯甲烷溶液。反应液在冰浴下搅拌约1h，后在室温下反应6h。薄层液相色谱(TLC)监测，反应完全后将反应液减压旋蒸，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得(化合物DCM-CC)(9H-芴-9-基)甲基(E)-(1-((4-(((((4-(2-(4-(二氰基亚甲基)-4H-苯并吡喃-2-基)乙烯基)苯氧基)羰基)氧)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯即荧光探针DCM-CC。实验数据如下：Yield 84％,黄色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),9.06(t,J＝5.4Hz,1H),8.74(d,J＝8.3Hz,1H),8.36(d,J＝8.7Hz,2H),8.22(d,J＝8.6Hz,2H),7.94(t,J＝7.9Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.84(d,J＝8.6Hz,2H),7.82–7.59(m,8H),7.53(d,J＝16.1Hz,1H),7.41(s,4H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.32(d,J＝3.8Hz,2H),7.06(s,1H),5.23(s,2H),4.29(d,J＝6.7Hz,2H),4.24–4.15(m,2H),3.28(m,J＝6.3Hz,2H),1.71–1.43(m,6H).13C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ188.9,171.7,163.8,160.9,138.2,136.0,131.7,129.9,129.8,128.1,127.6,125.8,124.3,122.4,120.7,119.7,119.6,117.7,107.4,70.36,66.14,61.1,55.9,47.1,31.9,30.3,28.9,23.5；HR-ESI-MS m/z 989.3178[M+H]+(calcd.for989.3102,C57H45N6O11).
实施例7
(化合物CC-PTX)(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-9-(((((4-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰胺基)六氨基)苄基)氧基)羰基)氧基)-3-苯甲酰胺基-3-苯基丙酰基)氧基)-12-(苯甲酰氧基)-4,11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a-十氢-1H-7，11-甲基环十[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-6，12b(2aH)-二乙酸二乙酯：
Figure BDA0002950233120000191
将紫杉醇(81.5mg，100μmol)用二氯甲烷溶解，再加入两滴N，N-二异丙基乙胺混合均匀。在氩气保护及冰浴下，滴加(化合物6)(9H-芴-9-基)甲基(1-((4-((((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧代乙酰胺基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酸酯(102.47mg，120μmol)的10mL二氯甲烷溶液。反应液在冰浴下搅拌约1h，后在室温下反应6h。薄层液相色谱(TLC)监测，反应完全后将反应液减压旋蒸，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得(化合物CC-PTX)(2aR，4S，4aS，6R，9S，11S，12S，12aR，12bS)-9-(((((4-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-(2-(4-硝基苯基)-2-氧乙酰胺基)六氨基)苄基)氧基)羰基)氧基)-3-苯甲酰胺基-3-苯基丙酰基)氧基)-12-(苯甲酰氧基)-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a-十氢-1H-7，11-甲基环十[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-6，12b(2aH)-二乙酸二乙酯即紫杉醇前药CC-PTX。实验数据如下：Yield 43％,黄色固体；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),9.27(d,J＝8.4Hz,1H),9.07(t,J＝5.8Hz,1H),8.35(d,J＝8.7Hz,2H),8.21(d,J＝8.7Hz,2H),7.98(d,J＝7.5Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.81(d,J＝7.3Hz,2H),7.72(dd,J＝9.9,5.9Hz,3H),7.64(t,J＝7.6Hz,3H),7.60(d,J＝8.4Hz,2H),7.53(d,J＝7.4Hz,1H),7.48–7.39(m,8H),7.33–7.30(m,4H),7.19(t,J＝6.5Hz,1H),6.31(s,1H),5.83(t,J＝8.9Hz,1H),5.53(t,J＝8.6Hz,1H),5.42(d,J＝7.1Hz,1H),5.35(d,J＝8.8Hz,1H),5.14(s,2H),4.92(dd,J＝12.9,8.8Hz,2H),4.65(s,1H),4.27(d,J＝4.7Hz,1H),4.22(d,J＝7.0Hz,1H),4.14(m,2H),4.02–4.00(m,3H),3.59(d,J＝7.1Hz,1H),3.31–3.23(m,2H),2.36–2.29(m,1H),2.26(s,3H),2.10(s,3H),1.99(s,1H),1.81(s,3H),1.75–1.42(m,11H),1.03(s,3H),1.00(s,3H).13C NMR(500MHz,DMSO-d6)δ202.8,189,171.8,170.8,170.2,169.4,169.2,166.8,165.7,163.8,156.6,154.3,150.8,147.6,147.5,144.3,144.2,141.2,139.8,139.6,138.2,137.4,134.5,133.9,132,131.7,130.4,130.1,130,130,129.8,129.2,129.2,128.8,128.1,128,127.9,127.5,125.8,124.8,124.7,124.3,120.6,119.6,84.1,80.7,77.6,77.1,75.8,75.2,74.9,71.6,70.9,70.1,66.1,60.2,57.9,56.5,55.8,54.4,47.1,46.5,43.4,38.9,37,35,31.6,30.3,26.8,23.6,23,22.6,21.2,21.1,14.6,10.2；HR-ESI-MS m/z 1530.5587[M+H]+(calcd.for 1530.5512,C84H84N5O23).
实施例8测试本发明合成的荧光探针的荧光特性：
1、紫外吸收光谱及荧光光谱的测定
采用紫外及荧光分光光度计，在DMSO/PBS缓冲溶液(pH＝7.4,V/V＝3/7)中测定DCM-OH(100μM)和DCM-CC(100μM)的紫外吸收和荧光光谱。在DCM-CC(100μM)的缓冲液中添加H2O2和CTSL，在2mL EP管中37℃下孵育1小时后，测量其荧光光谱。
2、化合物DCM-CC在不同细胞系中的荧光强度测定
将不同细胞以4000-6000个/孔的密度接种到96孔板中，贴壁过夜。次日，添加指定浓度的本发明荧光探针，N-乙酰-半胱氨酸及Z-FY-CHO共同孵育12h，细胞给药结束后，使用荧光酶标仪在560nm/680nm Ex/Em下测定荧光信号强度。
3、体内实时成像
利用A549细胞在BALB/c品系雌性裸鼠体内建立移植瘤模型。当肿瘤直径约1cm时，将DCM-CC静脉注射到荷瘤裸鼠体内。未治疗的荷瘤小鼠作为对照组。采用Tanon ABL成像系统实时记录注射后不同时间间隔(0-2h)的体内成像，λex＝560nm，λem＝680nm。
实施例9测试本发明合成的紫杉醇前药在体外H2O2/CTSL环境下的释放效果：
将紫杉醇前药CC-PTX溶于DMSO，得到储备溶液(10mM)。向PBS缓冲液中添加储备溶液(10mM)以获得最终浓度100μM，然后添加H2O2和CTSL。将该溶液在37℃下孵育，在适当的时间间隔取样并通过HPLC进行分析。使用安捷伦HP1100型高效液相色谱仪和UV检测器：Agilent C18色谱柱(4.6×150mm，3.5μm)；流动相：80％甲醇+0.1％甲酸；流速：1.0mL/min。
实施例10下面是本发明的化合物药理试验及结果：
1、抗肿瘤活性评价
1.1CCK-8实验：将细胞以4000-6000个/孔的密度接种到96孔板中，贴壁过夜。次日，添加指定浓度的本发明紫杉醇前药共同孵育24h，细胞给药结束后，加入每孔10μl的CCK-8，继续避光孵育3小时。结束后取出96孔板，摇晃10min，荧光酶标仪测量每孔的吸光值，检测波长为450nm。肿瘤细胞的生长抑制率：增殖抑制率(％)＝(1﹣A实验组/A对照组)×100％。结果显示：本发明紫杉醇前药在肺癌细胞A549，结肠癌细胞HT29上表现出与紫杉醇相当的抗肿瘤活性，且对于正常肝细胞L02和正常结肠上皮细胞NCM-460，本发明紫杉醇前药相比紫杉醇，毒性降低约20倍。
1.2体内急性毒性检测：在该实验中，紫杉醇前药CC-PTX实验组、阳性药紫杉醇组、阳性药Abraxane组的ICR小鼠分别被分为7个实验组，每组6只(雌雄各半)，每组对应不同的给药剂量(17.65mg/kg,25.21mg/kg,36.02mg/kg,51.45mg/kg,73.50mg/kg,105mg/kg,150mg/kg)进行尾静脉注射给药。这些小鼠在给药后的两周内，对其异常行为和死亡情况进行观察。结果表明，阳性药紫杉醇组测得的最大耐受量(MTD值)为20mg/kg，阳性药Abraxane组测得的最大耐受量(MTD值)为85mg/kg，期间小鼠出现明显的体重下降、食欲低下等情况；而紫杉醇前药CC-PTX实验组即便在最高的150mg/kg剂量下，也未出现死亡，体重也未出现明显变化。该结果显示紫杉醇前药CC-PTX在小鼠体内的MTD值比阳性药紫杉醇至少有着7倍的提升，该结果即表明其在体内安全性的提升。
1.3体内短期毒性检测:在ICR小鼠上进行了短期毒性的检测，分为紫杉醇前药CC-PTX实验组(40mg/kg)、阳性药紫杉醇组(20mg/kg)、阳性药Abraxane组(40mg/kg)和溶媒空白对照组。随机分配40只小鼠，分为4小组(10只/小组，雌雄各半)。进行尾静脉注射，隔天给药一次，持续14天，记录小鼠体重和死亡情况。
1.4体内活性研究：利用A549细胞在BALB/c品系雌性裸鼠体内建立移植瘤模型，利用抗肿瘤药物紫杉醇来作为阳性对照。我们将人肺癌细胞A549植入到雌性裸鼠体内并建立起适当大小的实体瘤，之后，这些小鼠被随机分为4组(每组6只)，分别为生理盐水空白给药组、5mg/kg给药组、10mg/kg给药组和10mg/kg阳性药紫杉醇组。记录瘤体积和裸鼠体重变化。
1.5苏木精-伊红染色：利用A549细胞在BALB/c品系雌性裸鼠体内建立移植瘤模型，利用抗肿瘤药物Taxol来作为阳性对照。我们将人肺癌细胞A549植入到雌性裸鼠体内并建立起适当大小的实体瘤，之后，这些小鼠被随机分为4组(每组6只)，分别为生理盐水空白给药组、5mg/kg给药组、10mg/kg给药组和10mg/kg阳性药紫杉醇组，给药十四天后处死，取心、肝、脾、肺、肾等组织进行苏木精-伊红染色，考察各组织病变情况。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构式如下：
Figure FDA0003476192280000011
2.一种前药，其特征在于，所述前药的化学结构式如下：
Figure FDA0003476192280000012
3.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure FDA0003476192280000021
Figure FDA0003476192280000031
4.权利要求2所述前药的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure FDA0003476192280000041
Figure FDA0003476192280000051
5.权利要求1所述的荧光探针在制备诊断与结肠癌或非小细胞肺癌肿瘤有关疾病的药物中的应用。
6.权利要求2所述的前药在制备治疗与结肠癌或非小细胞肺癌肿瘤有关疾病的药物中的应用。
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