CN101328159B - 紫杉烷前体抗癌药及其药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种式(I)的可被生物还原的紫杉烷前体抗癌药或其在药学上可接受的盐，式(I)其中R₁-R₅的定义如说明书中所述。本发明还提供含有式I化合物的药物组合物及式I化合物在制备治疗增殖性疾病的药物中的应用。

Description

紫杉烷前体抗癌药及其药物组合物和用途

技术领域

本发明属于抗癌药物或其它增殖性疾病药物的领域，具体涉及一种新型的紫杉烷前体药及其药物组合物和用途。

背景技术

肿瘤的进行性发展和不良的预后与肿瘤的缺氧生长有直接关系。肿瘤生长快速，在瘤体内部不断地建立新生的血管，依靠血液的流通供应氧气、养分和进行代谢维持肿瘤的快速生长。但肿瘤内部的新生血管是不成熟又不完整的，因此血液流动不正规而造成部分肿瘤细胞缺氧，最后瘤细胞对缺氧的条件发生耐受。此类缺氧细胞对化疗药和放疗有很大的耐受性，使各种化疗和放疗失效，所以这些细胞是肿瘤发生转移和恶化的根本原因。

当肿瘤大于直径1毫米时就会形成缺氧细胞。(Coleman，1988，J.Nat.Cane.Inst.80：310；and Vaupel et al.，Cancer Res.49：6449)，缺氧不但是瘤细胞的基本特色，也在其它一些增殖性疾病例如类风湿或肠道炎等疾病中发生。由于缺氧和瘤细胞抗化疗和放疗有关，因此瘤细胞缺氧的程度与恶性程度和用药的效果有直接的关系。

紫杉烷系列药(Taxoids)是著名的抗癌药物。现在已知紫杉烷类药物的抗癌作用是阻止细胞分裂过程中的微管解聚，从而干扰癌细胞在G2相的分裂。(Wani et at.，J Am

Chem Soc，1971，93：2325-2327；Schiff et al.，Nature(Lond)，1979，277：665-667)。其中紫杉醇是一个天然化合物，是从红豆杉的树皮和树叶中分离得到的。由于红豆杉来源十分有限而且破坏生态，于是寻找替代品，这导致发明了多烯紫杉醇(Taxotere)。多烯紫杉醇是一个从10-deacetylbaccatin III开始的半合成品，它和细胞微管的亲和力比紫杉醇大二倍(Ringel et al.，J Natl Cancer Inst.，1991，83：288-291)。紫杉醇和多烯紫杉醇都是已经广泛地在临床使用的广谱抗癌药，尤其对卵巢癌、乳腺癌、肺癌等(Rowinski et al.，Semin Oncol.，1992，19：646-662)。紫杉醇和多烯紫杉醇的水溶性很差，也不溶于其它常规溶剂。所以是使用聚氧乙烯篦麻油等特殊的溶剂进行静脉输液。但是溶剂聚氧乙烯篦麻油本身会引起很大的副作用，包括影响造血、引起外周神经毒和过敏等。由于使用了这种特殊溶剂，在给病人用药的时候还需事先给其它药物缓冲而降低其副作用而且要非常缓慢地输液，于是病人输液的时候往往需在医院过夜，负担额外的费用。

对紫杉醇结构的研究发现自由的2’位羟基是重要的活性中心(Kingston J.Nat.Prod.2000，63,726-734)。于是通过在2’位羟基上接各种基团来检验其失去活性的情况，包括合成了2′-叔丁基二甲基硅烷基紫杉醇等，发现其活性基本失去。这在一方面证明2’位羟基的重要性，也为改造紫杉醇分子创造了条件。更进一步的证明是合成了2’-乙酰紫杉醇和2’，7-双乙酰紫杉醇，发现在体内可以被水解，在细胞培养条件下显出了活性。

在2’位和7位羟基上做过的研究很多，不完全的统计有羟基的盐、胺、磺酸、氨基酸、磷酸、以及其它功能基团等(Deutsch et al，J.Med.Chem.1989，32，788-792，Mathew etal，J.Med.Chem.1992，35，145-151，U.S.Pat.No.5,059,699)，可惜这些化合物都不够稳定。有人试图用3-5个碳原子的化合物来修饰紫杉醇，像美国专利号：U.S.Pat.No.4,942,184、U.S.Pat.No.20030203961A1等公开的紫杉醇衍生物，但是以上发明的化合物的可溶性较差。

专利WO94/13324公开了一种水溶性的前体紫杉醇，但保留一定的疏水性才更容易地和癌细胞的类脂细胞膜接合。

专利U.S.Pat.No.6482850公开了一种疏水紫杉醇衍生物，据说可以通过脂质载体的给药途径而成为一种脂溶性的抗癌药。

专利U.S.Pat.No.6602902公开了一种紫杉醇前体药叫DHA-紫杉醇，这种紫杉醇的衍生物在细胞试验中降低了毒性，其细胞毒从～10^-9M降到了～10^-6，毒性降低可以加大临床剂量，可惜在体内试验中它过快被分解还原成为紫杉醇。

关于前体还原性药的文献还有：Deman et al报告的紫杉醇的1，6位消除(1，6-elimination)或1，8位消除(Bioorg Med Chem.2002，10(1)：71-7)，可惜此药对癌细胞没有特异性杀伤而对于正常细胞的毒性太大。

综上所述，关于前体药的研究已经很多，之所以尚未在实际上用于临床的原因是还没有找到一种恰到好处的，使前体药达到既能暂时封闭药效又能及时在癌细胞的条件下被解开的，毒性小效率高的药物。然而在客观上极需要对肿瘤有靶向性的新药，这样的靶向药在大大地提高疗效的同时降低其毒副作用，同时其制备技术可行，成本又是可以被接受的。

因此，提供一种可以被生物还原的紫杉烷前药是合乎需要的。本申请人发明了一种紫杉烷前药，此前体紫杉烷在被还原降解后释出紫杉醇或紫杉醇的衍生物。本发明的特点是经特殊设计的化学结构能使此前体药在正常组织中不被分解，但可在处于缺氧条件下的癌细胞内通过还原作用而被激活，激活后的药物就对癌细胞造成杀伤。因此，该前体药能在降低对正常细胞的毒性的同时对癌细胞造成针对性的杀伤。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的式(I)的紫杉烷前体药或其药学上可接受的盐：

其中R₁，R₂和R₃独立地为氢、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀链烯基或被卤素、氨基、硫酸根、磷酸根取代的C₄-C₁₀芳香基或如式(Ia)所示的基团：

L代表-YCR6R7-、-CR6R7-、-CR6R7CR8R9-、-CR9R10Y-；Y代表O、S、或NR10；R6、R7、R8、R9和R10独立地代表氢或C₁-C₁₀烷基、C₁-C₈烷氧基、C₂-C₁₀链烯基或C₄-C₁₀芳香基；X₁、X₂、X₃和X₄独立地代表NO₂、CN、OH、卤素、CO₂H、CO₂Na、OPO(ONa)₂、被取代(或不被取代)的C₁-C₁₀烷基、C₁-C₈烷氧基、被取代(或不被取代)的C₂-C₁₀链烯基或C₄-C₈芳香基；

R₄是C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₂-C₁₀链烯基或C₄-C₁₀芳香基；

R₅代表C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₂-C₈链烯基或C₄-C₁₀芳香基；

烷基还可以在不影响活性的位置被多个取代基取代，这些取代基可以是卤素、C₁-C₆烷氧基，羟基、氰基、氨基或硝基；

芳香基可以被1-5个下列取代基取代：卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基氨基，羟基、氰基、氨基、羧酸、C₁-C₆烷氧羰基、苄氧基、哌啶基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基酰胺基；

这里R₁，R₂和R₃中至少一个代表式(Ia)。

L优选为被取代(或不被取代)的C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₂-C₆链烯基或C₄-C₆芳香基等。

X₁、X₂、X₃和X₄代表NO₂、CN、OH、卤素、CO₂H、CO₂Na、OPO(ONa)₂、被取代(或不被取代)的C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、被取代(或不被取代)的C₂-C₆链烯基或C₄-C₈芳香基；

在上面的式(I)中，R₁、R₂和R₃中至少有一个基团优选氢或C₁-C₆烷基。R₄优选C₄-C₁₀烷基或被氯、氨或烷基氨基取代的C₄-C₁₀芳香基等。R₅优选C₄-C₁₀烷基、C₄-C₁₀芳香基、C₄-C₆烷氧基。优选的烷基取代物可以是甲基、乙基、丙基、正丁基和叔丁基等。

在通式(I)中，L优选-YCR6R7-、-CR6R7-、-CR6R7CR8R9-、-CR9R10Y-，这里Y是氧、硫或NR10；R6、R7、R8，R9和R10是氢或取代(不取代)的C₁-C₁₀烷基、C₁-C₈烷氧基、C₂-C₁₀链烯基、或C₄-C₈芳香基，优选取代(或不取代)的C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₂-C₆链烯基、或C₄-C₈芳香基等。X₁、X₂、X₃和X₄选用NO₂、CN、OH、卤素、CO₂H、CO₂Na、OPO(ONa)₂的取代(或不取代)的C₁-C₁₀烷基、C₁-C₈烷氧基，被取代(或不被取代)的C₂-C₁₀烯基或C₄-C₈芳香基等。X₁、X₂、X₃和X₄优选NO₂、CN、OH、卤素、CO₂H、CO₂Na、OPO(ONa)₂、取代(或不取代)的C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、被取代(或不被取代)的C₂-C₆链烯基或C₄-C₈芳香基等。

本发明还包括式(I)的紫杉烷前体药的药学上可接受的盐。

如果没有另外指出，以下的术语具有如下的含义：

术语“卤素”或“卤”是指一价卤元素，包括氯、溴、碘和氟。卤化物代表1个到多个卤素的取代。

术语“烷基”涉及具有衍生基团的烷烃例如C₁-C₆烷基或任何含有1-6碳原子的烷基基团。烷基可以是直链，也可以是支链或环状。低级的烷基涉及1-6个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、异丁基、戊基、异戊基、仲丁基、叔丁基、叔戊基等。高级烷基涉及7个以上碳原子，如正庚基、正辛基、正壬基、正癸基及其支链化合物等。优选的环烷基为6个碳原子左右的环烷基，如环丙基，环丁基，环己基。烷基还可以在不影响活性的位置被多个(例如1-5个)取代基取代。这些取代基可以是卤素、低级烷氧基，羟基、氰基、氨基或硝基等。

术语“烷氧基”涉及一价基团RO-，其中R是烷基，例如1-8个碳原子的烷氧基，涉及所有的含有1-8碳原子的烷氧基。优选1-6个碳原子的烷氧基、例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、正戊氧基、正己氧基、异丙氧基、异丁氧基、异戊氧基、异己氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、叔戊、环六氧基、正庚氧基、2-乙基己氧基等。这些烷氧基还可以在不重要的位置在不影响药效的条件下被1-5个取代基取代。烷基还可以被1-5个其它独立的基团取代，取代基可以是卤素、低级烷基、低级烷氧基、羟基、氰基、硝基或氨基等。

术语“C₂-C₁₀链烯基”代表具有2-10个碳原子的链烯基，可以是直链的，也可以带有支链基团，特别是天然或非天然的脂肪酸；可能有1个或更多的(特别是2-4个)双键。这样的例子有：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、2-甲基-1丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、4-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1-辛烯基等。链烯基可以任选被多个卤原子、低级烷基、低级烷氧基、羟基、氰基、硝基或氨基取代。

术语“C₄-C₁₀芳香基”涉及芳基或杂芳基，例如苯基、萘基、呋喃基、咪唑基。芳香基可以被1-5个下列取代基取代：卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级烷氨基，羟基、氰基、氨基、羧酸、低级烷氧羰基、苄氧基、哌啶基、烷基羰基、烷基酰胺基，优选被卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷氨基取代。典型的实例有4-氯苯、2-氟苯、4-氟苯、3-氟苯、4-甲基苯、4-三氟基甲苯和2-甲基苯等。

术语生物还原部分是指任何分子在酶还原过程中被除去的部分。生物还原部分本身不反应，但在酶存在下可以促进反应。在本发明中这部分生物还原分子优选能在还原激活过程中提供电子造成分子内重排而变成新药的分子。

术语药学上可接受的盐是指式I的化合物与酸或碱形成的盐。式(I)化合物的1个或多个功能性基团具有碱性或酸性，则它们可以制备成药学上可以接受的盐。可以用于制药的酸有：盐酸、溴酸、磷酸、硫酸、亚硫酸、烷基磺酸、芳基磺酸、醋酸、苯甲酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、和酒石酸等。碱式盐有碱金属的盐，例如钠或钾盐，还有镁或钙盐等。至于有机盐则有吗啉、毒芹侧碱或二甲胺形成的盐等。

通式(I)可以产生立体异构物和/或平面异构物，具备抗癌活性的所有异构物也包括在本发明范围之内。本发明公开的化合物的单一的对映体(enantiomer)或其混合物也包括在本发明范围之内。

式I的化合物或其盐形成的溶剂化物(最常见为水合物)也是本发明的目的。

提供式(I)化合物的制备方法是本发明的另一目的。下面叙述式(I)化合物的制备方法：首选2’位取代。式(I)的2’位取代可以通过紫杉醇与式(II)反应(为便于描述，将反应式中的第2个化合物称为式(II))将生物还原物接到紫杉醇的分子上；还可以将式(II)中的羧酸变为相应的酰氯后再与紫杉醇反应(反应式1)

反应式1(其中的R₂-R₅、L、X₁-X₄的定义同前文中的定义)

反应可在惰性溶剂中进行，包括四氢呋喃，二乙醚或二氧杂芑等，或在芳香碳氢化物如苯或甲苯，或非质子传递溶剂如二甲基甲酰胺，或在三乙胺，二异丙基乙胺，二甲胺基吡啶，氢氧化钾，氢氧化钠等提供的碱性基础上进行，优选三乙胺或二异丙基乙胺，在适当的温度下反应。

也可以使用相同的方法在7位羟基引进基团Ia。为在7位引入功能性基团需先将2’位羟基封闭。需优选保护基，有一个卓越的基团是三乙基甲硅烷基。这个基团可以通过在甲醇中用盐酸处理，或吡啶中被氢氟酸处理而很容易地从2’位被拿掉。也可以使用2，2，2-三氯乙基-氧羰基，这个保护基可以选择性地被锌和醋酸除掉。

反应式2是一个这类转变的例子：紫杉烷通过氯三乙基硅烷的处理可以得到可观产量的2’-三乙基硅基紫杉烷。2’-三乙基硅基紫杉烷和基团Ia对应的酸可得到7位酰化产物，而2’-三乙基甲硅烷基团可以被除掉。

反应式2(其中R₃-R₅、L、X₁-X₄的定义同前式(I)中的定义)

反应使用二甲基甲酰胺和甲基亚砜为溶剂，当使用一个当量的二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量的胺时，优选仲胺或叔胺，产物可以过柱纯化。于是紫杉烷可以在DCM、THF、DMF或DMSO的条件下反应，在存在DCC和4-二甲胺基吡啶的情况下得到2’-TES中间体，它可以容易地在一定的条件下被除去。

紫杉烷通式(I)的第10位取代过程在反应式3中表示。当紫杉烷用氯化三乙基硅(TESCl)处理时可以产生2’，7-二(三乙基甲硅烷)紫杉烷。2’，7-二(三乙基甲硅烷)紫杉烷和基团(Ia)对应的酸在一定的条件下可以生成10位酰化产物，三乙基甲硅基可以被除去而获得10位取代的紫杉烷衍生物。

反应式3(其中R₄-R₅、L、X₁-X₄的定义同前式(I)中的定义)本发明中反应式2和反应式3可使用的酸类的范例如下：

紫杉烷中引进生物还原的部分也可通过应用含有氯化酰基的中间体来进行，反应式2和3中的酸类可用相应的酰氯化物来代替：可用相当于1-10倍分子的酰氯化合物，2-50倍分子的碱和催化量的DMAP处理而得到产品。

也可以用二步法制备通式(I)的紫杉烷前体药：首先，紫杉醇的羟基可以被某些试剂例如4-硝基苯氯甲酸酯激活形成活化的中间体C(反应式4)。反应可以在惰性的溶剂中进行。用TLC监控。一旦获得激活的中间体后被活化的紫杉烷中间体C便可以和含有1个功能团的试剂(D)反应，从而产生所需要的产物(E)和一个副产品硝基苯酚。例如被活化的紫杉烷C可用含有羟基或氨基功能团的硝基化合物与催化量的DMAP的混合物反应。分离出来的有机相用5％NaHCO3和盐水洗，用硫酸纳干燥，然后浓缩。将残留物过硅胶柱用二氯甲烷/甲醇洗脱，得到产品E，产量约为10-80％。

反应式4(其中R₂-R₅、L、X₁-X₄的定义同前式(I)中的定义)

反应式4的醇或胺(D)可从下面的化合物中选用，这里L的定义应为-YCR6R7和-CR9R10-Y，Y应为O或NR10，其含胺基功能团的化合物可以根据反应式5所示由相应的醇来制备。

反应式5(R′，R’₁、R’₂为氢或C₁-C₄烷基，X为X₁，X₂，X₃或X₄，X-X₄如式(I)中定义)

如果反应式4中的产物(E)含有氨基则可以通过加入药物学通用的酸而变成酸性盐。适用的酸有无机酸和有机酸，包括盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、溴酸、硝酸、醋酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、甲基磺酸、对位甲苯磺酸、棕榈酸、水杨酸和硬脂酸等酸的盐。盐类可以通过在合适的溶剂中结晶而纯化，或在水中溶化后冻干。

反应式4中的(D)可以购买也可自行制备，也可将含有至少一个硝基的硝基芳香族化物转化为其它含硝基的芳香化物。合适的硝基化试剂有硝酸。溶剂有酸酐如醋酸酐或酸例如磺酸、醋酸、四氟硼酸硝酐等。在特定的溶剂例如醚、四氢呋喃、二乙醚、硝化丙酮、冰醋酸或氯化溶剂像二氯甲烷或芳香溶剂如苯或甲苯中进行反应。

本发明公开的化合物属于紫杉烷和其衍生物的前体药。紫杉烷的衍生物具有十分活跃的抗癌性但也很毒，然而我们发明的紫杉烷的衍生物能在发挥其固有的杀癌能力的同时大大地降低其毒性。因此它将是一个十分有意义的抗癌良药，在低毒性的基础上其抗癌作用却像紫杉醇一样具有十分广泛的抗癌谱包括骨髓源的急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴肉瘤、骨髓瘤、慢性白血病、淋巴肉瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、骨瘤、消化系癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、脑癌、肾癌、子宫癌、尿道癌、胃肠癌和其它肿瘤等。这个药可以用于单独化疗或与其它药联合化疗，也可以与放疗联用。

本发明的前体紫杉烷可以与所有具有不同机理的抑制、拮抗或干扰有丝分裂的抗癌药联用，也可以与调节免疫的辅助药物联用。举例可以联合使用的药物例如：长春碱、长春新碱、顺铂、卡铂、奥沙利铂；氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、瘤可宁、白消安、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、胞核嘧啶、阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、甲胺蝶呤、羟基脲、阿霉素、博来霉素；、天门冬氨酸酶、局部异构酶、依托泊甙、替尼泊苷、拓扑替康、雷替曲塞、干扰素、依决可单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗和曲妥珠单抗等、吉非替尼、伊马替尼和埃罗替尼等、三苯氧胺、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑等。组合疗法可以同时合并给药也可以分前后单独给药。联合用药将随着临床经验的积累而丰富。

本发明还包括包含组合药。任何含有式(I)化合物的药物可以和其它药物制成组合药。本发明的药物可以制成组方成药，其活性物质可以和其它不相冲突的或互相促进的活性物质联合使用。本发明的给药途径适应于一切常规的途径，包括通过口服、肠胃道、静脉、皮下、皮内、吸入或局部给药等等。制剂可以使用液相或固相。

口服药的剂型有片剂、锭剂、胶囊、香油药、悬浮剂、糯米纸囊剂、糖浆剂、口嚼胶等。口服胶囊和片剂的大致配方是：敷料使用微晶体纤维素、黄芪胶或明胶；赋型剂有淀粉或乳糖，分散剂例如藻酸、玉米淀粉等；润滑剂例如硬脂酸镁、藻酸、二氧化硅等；甜味剂如蔗糖或糖精；香味剂和调味剂有薄荷、甲基水杨酸盐或桔精等。如果使用胶囊，胶囊内除有效成分外也可以加其它成分来改善其物理性质。

糖浆的制备除药物本身外可加蔗糖和稳定剂以及食用色素和芳香剂等。所有添加物需符合无毒和可以食用与可以被制药业接受的条件。赋型剂有羰甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙乙基纤维素藻酸钠盐、聚乙烯吡咯烷酮类、黄芪胶等；甜味剂和防腐剂有蔗糖或糖精；调味品如薄荷，甲基水杨酸盐防腐剂等；稳定剂有阿拉伯树胶；增湿剂如天然的磷酸盐例如卵磷脂、氧化乙烯和脂肪酸的缩合物例如多氧乙烯硬脂酸、氧化乙烯和直长链醇的缩合物例如氧化乙烯和己糖醇缩合物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸盐变来的酯的缩合物；水化的悬浮液也可以含有一种或更多的防腐剂例如乙基或n-丙基对羟基苯甲酸；一种或多种色素；一种或多种香料；一种或多种甜味剂像蔗糖、味精、糖精等等。

油性的悬浮液可以通过将本发明的活性物质和植物油混合的方法制备。可以使用花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油等，或矿物油例如液体石蜡。油剂可以加入蜂蜜或硬性石蜡或十六烷醇使其变稠；甜味剂可以在片剂中使用。加入抗氧化剂例如维生素C防止制剂的氧化。

本发明作为液体悬浮剂的粉剂和颗粒在加入润湿剂和稳定剂后可以形成稳定的具有活性的药物。

本发明也可以制备成油乳剂，油相可以用蔬菜油例如橄榄油或花生油或矿物油例如液体石蜡或它们的混合体等。合适的乳化剂包括天然的胶例如阿拉伯胶和黄芪胶，天然的磷脂如大豆卵磷脂，从脂肪酸衍化而来的酯或偏酯和己糖醇酐如脱水山梨糖醇，单油酸盐和这些偏酯和乙烯氧化物的缩合物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸盐。本发明可以和甘油、山梨醇、蔗糖等甜味剂配伍。配方中还可以加入缓和剂、防护剂、芳香剂、色素等。药物可以在消毒后制成水剂或油剂的注射用药，悬浮液的制备可以使用分散剂、润湿剂和悬浮剂等按照既有的技术进行。

本发明可制成无菌的注射液或悬液，所有无毒的溶剂和稀释剂都可应用。无菌的油类可以用作溶剂或用作悬浮液的介质。凡是无毒的油都可以使用，包括合成的一价或二价的甘油脂油。此外，也可以用脂肪酸例如油酸制备注射剂型。灭菌可以用常规消毒法例如通过过滤，辐射或高压灭菌等。

水剂如水包油乳剂、糖浆、甘香酒剂和可以注射的制剂等均需调节适当的pH以达到稳定。调节pH可采用常规方法，使用合适的缓冲液维持制剂的pH值的稳定。

本发明也可以用脂质体或微囊的形式给药，本发明推荐的脂质体是类脂，类脂可以形成微囊。能形成脂质体的类脂很多，比较好的有天然或人工的，有中性或带负电的磷脂或神经鞘脂类和甾醇例如胆固醇。选择磷脂的标准需考虑其分子大小和其在血液中的稳定性。

脂质体呈微囊状，在脂质中包有液体或多聚体的膜，有多种制备方法。制备合适脂质体的方法见专利WO-9318749-A1和EP-276783-A。常用的方法是将类脂成分和有机溶剂混合，干燥后在水溶液中重建脂质体，通过使用象挤压法等方法形成所需要的粒度。还有其它的方法例如.U.S.Pat，No.5,976,567公开了用洗涤剂透析自动组合法制造粒子，这个方法可以节省时间和便于大规模干燥和重建。也可以使用连续水化法进行大规模的制备。

脂质体紫杉烷的制备是将药物装入脂质内部，装载可以是被动的也可以是主动的。一般被动装载需将药物在重组阶段加到缓冲液中，在药物为非脂溶性和微囊完整的情况下可将药物圈进脂质体内。

载药：可通过调节pH和离子梯度将大多数化疗药100％地装进脂质体微囊(Mayer，etal.，Biochim.Biophys.Acta 1025：143-151(1990)and Madden，et al.，Chem.Phys.Lipids53：3746(1990))。有各种方法通过适当的梯度将脂相物引入到脂质体内，在维持梯度的情况下，保持长时间的稳定。

至于针剂给药可将药制成溶液或悬液，用于注射的溶剂可以是水、生理盐水或油剂、聚氧乙烯、甘油、丙二醇或其它的合成溶剂；抗菌剂例如苄基醇或4--羟基苯甲酸甲酯等；抗氧化剂如抗坏血酸或二亚硫酸钠等；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液如醋酸、柠檬酸或磷酸缓冲液；氯化钠或右旋葡萄糖则用于调节。针剂可以封闭在安瓿或一次性使用的针管中或各种玻璃或塑料容器内。药物可以制成消毒的溶液、分散剂、乳液或消毒的粉末等。

药物的最终产物必须是稳定的而且适宜于在储存中保质、保消毒、防细菌或真菌的污染。经过合适配方制备好的可以用于注射的药剂需要进行消毒，消毒可以用过滤法。

给药可以有多种方法，包括缓慢输液或多次注射等，一般1-8天为一个疗程，也可以隔日或隔数日给药。

典型的分散法是将药物和辅助剂的成分加入到含有分散剂的介质中处，粉末的无菌工艺优选真空干燥或真空冷冻干燥法。

合适的药物介质有水、生理盐水、葡萄糖的水溶液、含有氧化乙烯的聚氧乙烯篦麻油、液体酸、低分子链脂肪醇；油类可选玉米油、花生油、芝麻油和其它油类，乳化剂例如脂肪酸的一级或二级甘油酯或磷酸盐例如卵磷脂和其类似物、乙二醇、聚乙二醇、悬浮于水质介质中的羧甲基纤维素钠、藻类酸钠、聚乙烯砒硌烷酮和其类似物等加上适当的分散剂如卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸盐和它们的类似物等。介质也可含有调节剂例如稳定剂、润湿剂、乳化剂与增渗透剂等，通过选择适当的溶剂和赋型剂调节适当的粘度。

本发明的剂量很大程度上决定于病人的条件、给药途径、病情和药物是单用还是和其它抗癌药联用等。因此只有医生才可以根据病人的实际情况决定用药的剂量而且根据全发明的系列产品的不同性质建议每天的剂量范围在0.001至200mg/kg内，最佳剂量当为0.5至100mg/kg。凡式(I)化合物对于预防肿瘤、减低其发病率和治疗都是十分有效的。

在典型的细胞增殖病变中的细胞均有缺氧生长的特性，因此本发明的药物除可以治疗和预防癌症和减少其发病率外还对类风湿关节炎、牛皮癣、糖尿病视网膜炎或老年性色斑退化等疑难病有效。特别是针对癌症，因为癌症是典型的缺氧生长，尤其是对缺氧的实体瘤或白血病细胞更为合适，其中典型的白血病细胞累及脾脏和骨髓或儿童急性淋巴白血病，典型的实体瘤范围广泛，在上文中已经提到。

此外，已经开发的所有药物增强手段都可以用于本发明的增强。有不少酶可以还原芳硝基和杂芳硝基，于是通过在肿瘤实体中促进这类酶活性的方法同时促进硝基还原前体紫杉烷的抗癌活力。这类方法包括将酶连接到抗肿瘤的抗体分子上，将酶-抗体偶联物注射进瘤体内，当它在瘤体内定位后再给予病人前体紫杉烷。这个方法被称为抗体联酶前体药疗法。

也可以在给予前体药之前先使瘤体内编码此酶的基因选择性地表达，此方法被称为基因联酶前体药疗法。专利WO 00047725公开了硝基还原酶和其在GDEPT中的应用。专利WO 00064864公开了硝基芳香族和硝基异芳香族前体药在GDEPT中的应用。

本发明用以下的实例进一步示范，实例不影响和限制根据本发明的原理的进一步发展，这里DMF代表二甲基甲酰胺、THF代表四氢呋喃、MeOH代表甲醇、EtOAc代表乙酸乙酯、DCM代表二氯甲烷、TLC代表薄层层析、MeCN代表乙腈、TFA代表三氟乙酸、LC-RT代表滞留时间，反应可以通过所有有机化学现代检察手段例如高级液相色谱仪等检测。层析分离可使用C18号柱(100×3.2mm)配以不同的洗脱溶剂例如A：10％乙腈、水、或B：5％乙腈、0.1％TEA和C：乙腈等，洗脱速度为0.5ml/分。

附图说明

图1为诱变紫杉醇对卵巢癌细胞作用的示意图；

图2为普通紫杉醇对卵巢癌细胞作用的示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明作进一步说明。

实施例1

2’-(2-(2-硝基)苯乙酰)紫杉醇的制备：

方法A：将紫杉醇(100mg)溶解于DCM(5mL)，在0℃下加入三乙胺50微升(0.36mmol)，再加入2-(2-硝基)苯乙酰氯(2-(2-nitrophenyl)acetyl chloride)24mg，(0.12mmol)。将混合物在室温搅拌，加入DCM和饱和碳酸氢钠，混合物用乙醚提取。有机相用盐水洗后用无水硫酸镁干燥，过滤，真空干燥。残留物过硅胶柱，产品白色。方法B：将紫杉醇100mg(0.12mmol)溶于DCM(5mL)，在0℃加入三乙胺50微升(0.36mmol)，再加2-(2-硝基)苯乙酰氯24mg(0.12mmol)，混合物在室温搅拌，混合物加入饱和的碳酸氢钠，用乙醚提取，有机相用盐水洗，用无水硫酸镁干燥后过滤，真空浓缩。残留物过硅胶柱，洗脱溶剂为己烷/DCM(1/1)，产物白色。

以下为本产品的核磁共振谱相：

1H NMR(CDCl3，500MHz)：8.12(d，J＝7.6Hz，2H)，8.07(d，J＝7.6Hz，1H)，7.72(d，J＝7.1Hz，2H)，7.58(m，2H)，7.50(m，4H)，7.41(m，2H)，7.35(m，4H)，7.24(m，2H)，6.80(s，1H)，6.26(s，1H)，6.23(t，J＝8.6Hz，1H)，5.92(dd，J＝9.1，3.3Hz，1H)，5.66(d，J＝7.1Hz，1H)，5.48(d，J＝3.3Hz，1H)，4.95(dd，J＝9.7，1.8Hz，1H)，4.42(m，1H)，4.30(d，J＝8.5Hz，1H)，4.19(m，2H)，4.08(m，3H)，3.78(d，J＝7.1Hz，1H)，3.48(m，2H)，2.54(m，1H)，2.47(d，J＝4.1Hz，1H)，2.41(d，3H)，2.23(m，1H)，2.12(s，3H)，2.12(m，1H)，1.91(m，1H)，1.89(s，3H)，1.67(s，3H)，1.24(s，3H)，1.13(s，3H).ESI-MS：质谱理论值为C55H56N2O17Na(M+Na)+：1039.实测值为：1039。

实施例2

2’2’-(2-(2-硝基苯乙酰))多烯紫杉醇的制备：

方法和例1同，ESI-MS：质谱理论值为C51H59N2O17(M+H)+：972.实测值为：972.

实施例3

7--[2-(2-硝基苯)乙酰]-紫杉醇

将紫杉醇的二氯甲烷溶液和咪唑和氯化三乙基硅烷相混。混合物在室温搅拌，用氯甲烷稀释，再水洗，饱和氯化钠洗，干燥，浓缩。新鲜的过柱物为2’-三乙基硅基烷紫杉醇，将此物的氯甲烷溶液在室温和在氩气的保护下加上吡啶和2-(2-硝基苯)乙酰氯混合物，在室温搅拌4小时，用乙醚稀释，将有机相浓缩。硅胶柱分离后制得2’-三乙基甲硅烷-7-[2-(2-硝基苯)乙酰紫杉醇的中间体。此中间体的甲醇溶液和盐酸的水溶液混合，在相同的温度下搅拌。用乙酸乙酯冲稀后，用饱和的碳酸氢钠冲洗。有机相用盐水洗，用无水硫酸镁干燥过滤后浓缩，粗制品用新鲜的硅胶柱提纯，产品为7--[2-(2-硝基苯)乙酰基]-紫杉醇。ESI-MS：质谱理论值为C55H56N2O17Na(M+Na)+：1O39.实测：1039。

实施例4

7--[2-(2-硝基苯)乙酰基]-多烯紫杉醇的制备：

本产品7-[2-(2-硝基苯)乙酰]-多烯紫杉醇的制备同实例3。ESI-MS：质谱理论值为C51H59N2O17(M+H)+：972.实测值为：972。

实施例5

10-[2-(2-硝基)乙酰]-多烯紫杉醇的制备：

多烯紫杉醇的二氯甲烷溶液加入砒啶，加氯化三乙基硅烷，在室温搅拌。用氯甲醇稀释，水洗，饱和氯化钠洗，干燥，浓缩。新鲜的过柱物为2’，7-二(三乙基硅基)-多烯紫杉醇。此物的氯甲醇溶液和氢化钠混合，再加入2-(2-硝基苯)乙酰氯。将混合物在室温搅拌，用乙醚稀释，将有机层浓缩。粗制品用新鲜的硅胶柱提纯，产品为2’，7-双(三乙基硅基)-10-[2-(2-硝基苯)乙酰]多西紫杉醇。将此中间体的甲醇溶液在氩气的保护下在0℃和盐酸的水溶液混合，在室温搅拌。再用乙酸乙酯稀释后加饱和的碳酸氢钠。有机相用盐水洗，用无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。粗制品用新鲜的硅胶柱提纯得到产品10-[2-(2-硝基苯)乙酰基]多烯紫杉醇。检测：ESI-MS：质谱理论值为：C51H59N2O17(M+H)+：972.实测：972。

实施例6

紫杉醇的N-(4-硝基苯酚基)甲酸酯的制备

在含有紫杉醇100mg(0.12mmol)和4-硝基苯酚基甲酰氯24mg(0.12mmol)的二氯甲烷溶液10ml中加入三乙胺20ml(0.24mmol)和4-二甲氨基吡啶10mg，在室温中搅拌12小时。用碳酸氢钠水溶液洗，用水洗。有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩。残留物过新鲜的硅胶柱淂到一黄色物。ESI-MS：质谱理论值为C54H54N2NaO18(M+Na)+：1042.实测：1042。

实施例7

紫杉醇的N-(4-硝基苄酚基)甲酸酯的制备

在含有紫杉醇100mg(0.12mmol)和(4-硝基)苄氧基甲酰氯26mg(0.12mmol)的二氯甲烷溶液10ml中加入三乙胺20ml(0.24mmol)和4-二甲氨基吡啶10mg，在室温中搅拌12小时。用碳酸氢钠水溶液洗，用水洗。有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩。残留物过新鲜的硅胶柱淂到一黄色物。ESI-MS：质谱理论值为C55H56N2NaO18(M+Na)+：1056.

实测：1056。

实施例8

紫杉醇的N-(2-硝基苄基)-N-甲基氨基甲酸酯的制备：

在含有紫杉醇的N-(4-硝基苯酚基)甲酸酯的二氯甲烷溶液(实施例6)的混合物中加入N-甲基-1-(2-硝基苯)甲氨60mg(0.36mmol)，在室温搅拌，用碳酸氢钠水溶液洗，用水洗。有机层用无水硫酸钠干燥后浓缩。残留物过新鲜的硅胶柱淂到一黄色物(二步法得率50％)。ESI-MS：质谱理论值为C56H59N3NaO17(M+Na)+：1069.实测：1069。

实施例9

多烯紫杉醇的甲基(2-硝基苄酯)氨基甲酸酯的制备：

本例的制备方法同实施例6。ESI-MS：质谱理论值为：C52H61N3NaO17(M+Na)+1023，实测；1023。

实施例10

多烯紫杉醇的甲基(4-氯-2-硝基苄酯)氨基甲酸酯

本例的制备方法同实施例6，应用实施例8制备的N-甲基-1-(4-氯-2-硝基苯)甲氨合成。ESI-MS：质谱理论值为：C52H60ClN3NaO17(M+Na)+：1057，实测；1057。

实施例11

本例证明前体药被生物还原酶细胞色素P450还原后被激活的例子。细胞色素P450是在人体的肿瘤中和正常组织中广泛存在的生物还原酶的一种，其功能是催化生物还原反应。

将实例1制备的2’-(2-(2-硝基苯)乙酰紫杉醇溶解于DMSO，浓度为625mM，本溶液20mL加入到含20ml(10mM)的还原辅酶II NADPH的60ml磷酸钾缓冲液(pH 7.4(2.4mL)中，37℃培育，此培育物的培育环境在加入化合物前减少供氮20分钟，在加入化合物后则增加供氮。

在反应间隔中取若干样品加入到等体积的乙腈中，14,300RPM离心2分钟，然后用HPLC分析出现被还原的紫杉醇。

分析表明实施例1的前体药在低氧分压的条件下被细胞色素酶p450选择性地还原激活。

实施例12

本例可证明生物激活前体药在整细胞内的活化。

以下的分析可以证明前体药可被培养的缺氧细胞分解为目的药。

将A549细胞(癌细胞.4×105每孔1)培养于6孔培养板，在加入试验物前在37℃培养在空气或0.2％的氧气的条件下过夜。加入试验物75ml，溶于DMSO)，用细胞培养液稀释到药物的最终浓度为5μM)。继续培养，间隔取样，由HPLC分析，证明化合物在0.2％氧分压条件下产生紫杉醇的速度明显地低于比有氧条件下产生的量。

实施例13

本例证明生物还原前体药的细胞毒效应。

本发明的原理是要求通式(1)的化合物的细胞毒性比由它在缺氧的条件下释放的相应的药物紫杉醇的细胞毒性小。用本发明的化合物进行体外细胞毒试验发现在有氧条件下对于卵巢癌细胞的杀伤作用被封闭而在缺氧条件下细胞毒得到恢复，即对癌细胞恢复了杀伤作用。下面二个图表清晰的显示出本发明的理论的到了验证(见图1和图2)。

图1是一张诱变紫杉醇(前体紫杉醇)对于卵巢癌细胞的作用：纵坐标表示癌细胞的活度，用细胞存活的百分比表示；横坐标表示用药的剂量，单位用纳克分子表示。兰线(图1中标为VC6-N)为有氧培养，红线(图1中标为VC6-H)为缺氧培养，本图表显示诱变紫杉醇在有氧条件下对于癌细胞的杀伤曲线几乎平行，这说明基本上对细胞不造成杀伤；红线代表缺氧培养，细胞活度明显地随着药物浓度的增加而降低，表明药物的杀伤作用随着药物浓度的增加而加强。

相反的情况出现在紫杉醇(没有接上分子锁)的细胞活度曲线中(见图2)。本图显示没有装上分子锁的紫杉醇对卵巢癌细胞的作用曲线。兰线(图2中标为Paclitaxel-N)代表有氧培养，红线(图2中标为Paclitaxel-H)代表缺氧培养，曲线表明无论有氧还是缺氧都对癌细胞造成杀伤，这就意味着药物对于正常细胞并无保护作用。

如果比较图1和图2，可以看出诱变紫杉醇能够识别正常细胞和癌细胞的区别，在对正常细胞相对低毒的前提下有效地针对癌细胞造成杀伤。

实施例14

本例证明由生物还原激活的前体药在肝脏的匀浆中释放具有活性的药。

在缺氧条件下从生物还原前体药释放出原药可以利用肝脏匀浆内的还原酶得到证明。这种酶也存在于实体肿瘤内。另一方面，关于化合物的代谢稳定性和在肝区有氧条件下不希望有的释放也可以用此法测定。

将1克鼠肝在50mmol dm^-3冰冷的磷酸钾缓冲液(pH7.4)中打成匀浆。1000RPM离心10分钟，将上清储存在冰中。

5μmol dm^-3前体药在有氧条件下的代谢可以在0.5ml的肝匀浆中(大约含有2mg肝匀浆蛋白质)测定。反应的体系包括：100μmol dm^-3NADPH，50mmol dm^-3的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)37℃孵育。在一定的间隔取60μL的样品，加入到等体积的乙腈(acetonitrile)中，14，300RPM离心2分钟，然后HPLC分析。分析结果显示，本发明的样品在氮气条件下能够释放核苷酸样(nucleoside analogues)的细胞毒，而在有氧条件下，其释放的速度很慢。

实施例15

本例证明生物还原激活的前体药在肿瘤的匀浆中释放出药物的活性。用新鲜切除的CaNT肿瘤大约0.5至1g，匀浆于15ml冰冷的50mmol dm^-3磷酸钾缓冲液内(pH7.4)。匀浆用1000RPM离心1分钟，上清储存于冰浴中，将5μmol dm^-3的前体药分别在空气中和N2中和0.5ml的肿瘤匀浆(大约3mg蛋白质)，和100μmol dm^-3NADPH在in 50mmol dm^-3在磷酸钾缓冲液中(pH 7.4)混合后孵育于37℃。按一定间隔取出60μl的样品，加入到等体积的乙腈中，混合后于14，300RPM离心2分钟，用HPLC分析。在这个试验中，前体紫杉醇在氮气的环境下以100pmol/min/mg蛋白质的速度释放出紫杉醇，而在氧气的环境下，仅以8pmol/min/mg蛋白的速度释放。

实施例16

本例用小鼠直接证明本发明的急性毒性下降：

使用C3H/HeJ种小鼠，体重18-22克。用标准方法测定40天最大耐受剂量(MTD40)方法根据Gad and Chengelis(see，for example，Toxicology Testing，ō2^nd Ed.，Shayne O.Gad and Christopher P.Chengelis，pp.186-195(Academic Press).)。使用3只小鼠，分别给予低剂量(20mg/kg)和中等剂量(40mg/kg)。如果不发生死亡，则开始新一轮试验以1.5倍的剂量递增直到致死。之后开始用小鼠进行新一轮最高耐受剂量的试验，这时的剂量递增为1.15。结果得出二组数据，一组为非致死剂量，另外一组为致死剂量。每一个剂量需要使用6只小鼠。如果在低剂量组没有发生严重的致死反应而在高剂量组至少发生一只以上的致死，于是这个低剂量组就是最大耐受剂量MTD。

本领域技术人员应当理解的是，可以对本发明的优选实施方案进行多种变化和改进，而且该变化和改进并不背离本发明的精神。因此，所附权利要求涵盖了落入本发明精神和范围内的所有等价的方案。

Claims (18)

1.一种紫杉烷前体抗癌药或其药学上可接受的盐，具有式(I)结构：

其中R₁，R₂和R₃独立地为氢、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀链烯基或被卤基、氨基取代的C₄-C₁₀芳香基，或如式(Ia)所示的基团：

L代表-CR6R7-、-CR6R7CR8R9-；R6、R7、R8和R9独立地代表氢或C₁-C₁₀烷基、C₁-C₈烷氧基、C₂-C₁₀链烯基或C₄-C₁₀芳香基；X₁、X₂、X₃和X₄独立地代表NO₂、CN、OH、卤素、CO₂H、CO₂Na、OPO(ONa)₂、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₈烷氧基、C₂-C₁₀链烯基或C₄-C₈芳香基；

R₄是C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₂-C₁₀链烯基或C₄-C₁₀芳香基；

R₅代表C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₂-C₈链烯基或C₄-C₁₀芳香基；

这里R₁，R₂和R₃中至少一个代表式(Ia)。

2.权利要求1所述的化合物，其中R6、R7、R8和R9独立地为C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₂-C₆链烯基或C₄-C₆芳香基，X₁、X₂、X₃和X₄独立地代表NO₂、CN、OH、卤素、CO₂H、CO₂Na、OPO(ONa)₂、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₂-C₆链烯基或C₄-C₈芳香基。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R₂和R₃为氢，R₁为式(Ia)。

4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R₁和R₃是氢，R₂为式(Ia)。

5.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R₁和R₂是氢，R₃为式(Ia)。

6.根据权利要求1或2所述的化合物，其中基团R₁、R₂和R₃中只有一个是氢。

7.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃均为式(Ia)。

8.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R₄为苯。

9.根据权利要求1所述的化合物，其中R₅为OCMe₃或苯基。

10.根据权利要求1-9任何一项所述的化合物或其药物学可以接受的盐在制备治疗增殖性疾病药物中的应用。

11.根据权利要求要求10所述的应用，其中增殖性疾病为癌症、类风湿病、牛皮癣类疾病、糖尿病性视网膜病或老年退行性疾病。

12.根据权利要求10所述的应用，其中增殖性疾病是以缺氧为特征的疾病。

13.根据权利要求10所述的应用，其中所述的增殖性疾病是实体癌或血液肿瘤。

14.根据权利要求13所述的应用，其中实体癌为肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、脑癌、肾癌、子宫癌、卵巢癌、泌尿系癌或肠胃系统癌。

15.根据权利要求13所述的应用，其中所述的血液肿瘤为白血病。

16.一种药物组合物，包含一种或几种如权利要求1-9任何之一项所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药物学可接受的载体和/或赋形剂。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于其剂型为：片剂、锭剂、胶囊、香油药、悬浮剂、糯米纸囊剂、糖浆剂、口嚼胶、口服液、针剂以及药物学可接受的其它剂型。

18.一种药物组合物，包含一种或几种如权利要求1-9所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。

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