CN108478794A - 光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药及其自组装纳米粒的构建 - Google Patents

光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药及其自组装纳米粒的构建 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及光敏剂‑化疗药“光化一体”小分子前药，将化疗药与光敏剂通过酯键或单硫醚键相连实现化疗药和光敏剂的高效共载和同步递送。本发明以紫杉醇作为化疗药，以焦脱镁叶绿素a作为光敏剂合成光敏剂‑化疗药，并制备了前药自组装纳米递药系统，评价了其协同释药、体内药动学和抗肿瘤效果。本发明制备工艺简单，纳米粒粒径小且均一，有利于纳米粒通过EPR效应富集于肿瘤部位；超高的载药量；易于表面修饰，能有效避免网状内皮系统摄取并且提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取；进行光动力学治疗的同时，协同触发药物在肿瘤细胞内选择性释放。本发明设计的“光化一体”小分子前药自组装纳米递药能显著提高光敏剂和化疗药的协同抗肿瘤效果。

Description

光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药及其自组装纳米粒的 构建
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及光敏剂-化疗药“光化一体”前药及其合成方法，还涉及所述的“光化一体”前药自组装纳米粒的构建，以及其在药物传递系统中的应用。
背景技术
癌症仍是威胁人类健康的一大病症。据世界卫生组织统计，全球每年有超过 800万人死于癌症。化疗是癌症治疗的一个重要手段，但大部分化疗药是细胞毒性药物，治疗窗窄，且传统的化疗药溶液剂经静脉给药后，肿瘤靶向性较差，导致疗效不佳且毒副作用严重。近年来，纳米技术在药物传递领域的广泛应用极大地丰富了药物递送策略，且已经有多个纳米制剂成功上市。然而，最新的临床数据分析结果显示，尽管提高了化疗的安全性，但与传统剂型相比，脂质体等纳米制剂并没有显著提高临床抗肿瘤效果。诚然，导致这一结果的原因是多方面的。其中，单一疗法的临床疗效非常有限，而多种药物或治疗手段的联合应用具有更好的应用前景。近年来，化疗与光动治疗的联合应用已经成为研究的热点。光动治疗的抗肿瘤机制是当光敏剂在肿瘤部位被特定波长的激光激发后，将能量传递给周围的氧气等物质而产生活性氧(ROS)，活性氧能诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。与化疗药有所不同，未经激发的光敏剂几乎没有细胞毒性。因此，光动治疗被认为是一种更安全且具有选择性的癌症治疗策略。随着激光技术、光导纤维和医学光照设备的不断进步和发展，光动治疗在癌症治疗领域的应用日益广泛。而化疗与光动治疗的联合应用能显著提高抗肿瘤效果，具有以下优势：(1)增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，提高化疗效果；(2)减少化疗药的剂量，降低毒副作用；(3)多种作用机制促进肿瘤细胞的凋亡和坏死，克服肿瘤的多药耐药，发挥高效的协同抗肿瘤作用。因此，化疗与光动治疗的联合应用具有良好的临床应用前景。
然而，因化疗药和光敏剂在理化性质和药动学性质上存在显著差异，如何实现二者的高效同步递药仍是一个亟待解决的难题。纳米载体能将多个药物或光敏剂包载其中，为化疗药和光敏剂的共同载药和同步递送提供了新的选择。目前，大部分的化疗药和光敏剂是通过物理包埋的方式被共载于纳米载体，这种非共价方式的共载策略存在载药量低、稳定性差、以及化疗药和光敏剂易在载体中结晶或提前泄露等问题。此外，将光敏剂包载于纳米载体，还易导致光敏剂的聚集淬灭效应。因此，亟需构建更高效的新型药物传递系统用于化疗药和光敏剂的联合递药。相比于传统纳米载体存在的不足，小分子前药自组装纳米递药系统能有效防止药物的结晶和提前泄露。同时，因小分子前药自身作为纳米结构的主体而使得载药量非常高，高达50％。高载药量则意味着减小载体材料的用量，减少甚至避免因载体材料的大量使用而导致的辅料相关不良反应。
此外，智能触发母药在靶部位的选择性释放对于制剂的有效性和安全性都非常重要。与正常细胞相比，肿瘤细胞内存在更高浓度的活性氧(ROS)，这种特殊的肿瘤细胞微环境已广泛用于设计氧化敏感的药物传递系统。
与传统纳米载体(如聚合物胶束和脂质体等)不同，小分子前药自组装纳米递药系统由前药自组装而成，不仅载药量高，随着前药的水解和药物的释放，其纳米结构会逐渐解体。因此，对于光敏剂而言，小分子前药自组装纳米递药系统能有效避免因载体包埋作用而产生的聚集淬灭效应。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明拟设计合成ROS触发释药的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药，并构建自增敏型ROS触发释药的“光化一体”小分子前药自组装纳米递药系统，通过共价键合的方式实现卟啉类光敏剂和化疗药的高效共载和同步递送。“光化一体”小分子前药自组装纳米递药系统将具备双重“自增敏”作用：一是能增加药物释放的敏感性，在肿瘤细胞内，经激光照射，光敏剂产生ROS进行光动治疗的同时，与细胞内原有的ROS协同促进氧化敏感的药物释放，即“自增敏”活性氧触发释药；二是光动治疗能增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，化疗联合光动治疗发挥高效的协同抗肿瘤作用，即“自增敏”协同抗肿瘤。本发明的目的将为化疗联合光动治疗提供一种新的药物传递策略。
我们的研究发现单硫醚键具有良好的氧化敏感性。在肿瘤细胞内，硫醚易被 ROS氧化为强亲水的亚砜或砜的结构，触发母药的快速释放，发挥高效的抗肿瘤作用。而光敏剂在激光照射下会产生大量ROS，能进一步提升肿瘤细胞微环境的ROS水平。因此，基于化疗药和光敏剂构建ROS触发释药的小分子前药自组装纳米给药系统，不仅能实现它们的高效共载和同步递送，还将加速ROS触发的药物释放过程，发挥更高效的协同抗肿瘤作用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药，是将化疗药与光敏剂通过酯键或单硫醚键相连。其中，化疗药即抗肿瘤药物，如紫杉醇(PTX)等，光敏剂为卟啉类光敏剂，如焦脱镁叶绿素a(PPa)和二氢卟吩e6(Ce6)等。
以紫杉醇作为化疗药，分别以焦脱镁叶绿素a和二氢卟吩e作为光敏剂的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药的结构式为：
本发明提供的所述的系列光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药合成方法，包括如下步骤：光敏剂先与乙二醇(或乙二胺)反应成酯(或成酰胺)，化疗药与硫代二乙酸酐或戊二酸酐反应成酯或成酰胺，最后上述两步反应产物再进行反应，最终合成得到“光化一体”前药化合物。
进一步地，包括如下步骤：
(1)将光敏剂、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-羟基苯并三唑(HOBt)和1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)溶于二氯甲烷中，然后与乙二醇 (或乙二胺)反应成酯(或成酰胺)，得到焦脱镁叶绿酸a-乙二醇酯；
(2)将化疗药、硫代二乙酸酐(或戊二酸酐)和DMAP溶于二氯甲烷中，搅拌反应，液相纯化得中间产物；
(3)将步骤(2)的中间产物、DMAP，HOBt和EDCI溶于二氯甲烷中，搅拌反应，加入步骤(1)得到焦脱镁叶绿酸a-乙二醇酯，反应即得。
具体地，本发明提供了ROS敏感键和非ROS敏感键相连的焦脱镁叶绿素a- 紫杉醇小分子前药的合成方法，
ROS敏感键相连的卟啉-紫杉醇小分子前药的合成：将焦脱镁叶绿素a(PPa)， 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-羟基苯并三唑(HOBt)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入乙二醇并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时。通过薄层色谱监测反应过程。用制备液相色谱纯化目标产物，得到焦脱镁叶绿酸a-乙二醇酯 (PPa-EG)。将PTX，硫代二乙酸酐和DMAP溶于二氯甲烷中。将反应溶液在 25℃氮气保护的条件下搅拌12小时。用TLC监测反应过程。使用制备型液相色谱纯化目标产物，得到中间产物。将中间产物，DMAP，HOBt和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入PPa-EG，并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时。使用制备型液相色谱纯化目标产物。
非ROS敏感键相连的卟啉-紫杉醇小分子前药的合成：将PPa，DMAP，HOBt 和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入乙二醇并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时，得到PPa-EG。将PTX，戊二酸酐和DMAP溶于二氯甲烷中。将反应溶液在25℃氮气保护的条件下搅拌12小时得到中间产物。将中间产物，DMAP，HOBt和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入PPa-EG并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时即得。
本发明还提供了所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药自组装纳米粒，所述的小分子前药纳米粒可以为非PEG化的小分子前药纳米粒、PEG修饰的小分子前药纳米粒和主动靶向的小分子前药纳米粒。
所述的小分子前药自组装纳米粒的制备方法如下：
将一定量的小分子前药或小分子前药与PEG修饰剂的混合物溶解到适量的无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂(无水乙醇与四氢呋喃的比例为90:10～70:30)中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。最后，采用透析法除去制剂中的无水乙醇与四氢呋喃，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG等，优选的PEG修饰剂为DSPE-PEG。所述PEG的分子量为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。
(1)非PEG化的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的前药溶解到适量的无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂(无水乙醇与四氢呋喃的比例为 90:10～70:30)中(前药的浓度范围为1mg/mL～30mg/mL)，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。
(2)PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的PEG修饰剂(TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG或PE-PEG)和前药溶解到适量的无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂(无水乙醇与四氢呋喃的比例为90:10～70:30) 中(前药的浓度范围为1mg/mL～30mg/mL)搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。其中，小分子前药与PEG修饰剂的比例为95:5～70:30。
(3)主动靶向的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的茴香胺修饰的DSPE-PEG(DSPE-PEG-AA)以及前药溶解到适量的无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂(无水乙醇与四氢呋喃的比例为90:10～70:30)中(前药的浓度范围为1mg/mL～30mg/mL)，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。所述小分子前药与DSPE-PEG-AA的比例为95:5～70:30。
本发明的卟啉-紫杉醇小分子前药首次被发现可以自组装形成均匀的纳米体系。该纳米药物传递系统的优势在于：(1)采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单，易于产业化；(2)粒径小且均一(～100nm)，有利于纳米粒通过EPR 效应富集于肿瘤部位；(3)超高的载药量，有利于减小因辅料和生物材料而引发的不良反应；(4)易于表面修饰，可通过PEG和主动靶向修饰以有效避免网状内皮系统摄取和提高肿瘤细胞对纳米粒的摄取；(5)增加药物释放的敏感性，在肿瘤细胞内，经激光照射，光敏剂产生活性氧进行光动治疗的同时，与细胞内原有的活性氧协同促进氧化敏感的药物释放，即“自增敏”活性氧触发释药；(6) 小分子前药自组装纳米递药系统能有效避免聚集淬灭效应；(7)光动治疗能增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性，化疗联合光动治疗发挥高效的协同抗肿瘤作用，即“自增敏”协同抗肿瘤。
本发明具有以下有益效果：1.设计合成了卟啉-紫杉醇小分子前药，合成方法简单易行；2.制备了均匀的小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，实现光敏剂和化疗药的高效共载；3.在肿瘤细胞内高氧化的微环境中，细胞内原有的ROS会触发紫杉醇的快速释放，此外，激光照射光敏剂也会产生ROS，进一步触发紫杉醇的快速释放，即协同触发药物释放；4.伴随着ROS 触发的药物释放，前药纳米粒解体，能有效避免光敏剂的聚集淬灭效应；5.PEG 修饰的小分子前药自组装纳米粒能有效延长药物在血液中的循环时间，且紫杉醇与光敏剂通过共价相连的方式能实现体内同步递送，蓄积在肿瘤部位；6.紫杉醇产生的化疗与光敏剂产生的光动力学治疗具有良好的联合抗肿瘤效果，即协同抗肿瘤作用。
附图说明
图1为本发明实施例1的ROS敏感键相连的卟啉-紫杉醇前药(PPa-S-PTX) 的1HNMR谱图以及质谱图。
图2为本发明实施例2的非ROS敏感键相连的卟啉-紫杉醇前药 (PPa-C-PTX)的1HNMR谱图以及质谱图。
图3为本发明实施例3卟啉-紫杉醇前药紫外光谱谱图。
图4为本发明实施例3卟啉-紫杉醇前药荧光光谱谱图。
图5为本发明实施例4的小分子前药自组装纳米粒的透射电子显微镜图。
图6为本发明实施例5的小分子前药自组装纳米粒的粒径-存储时间图。
图7为本发明实施例6的小分子前药自组装纳米粒的光敏剂聚集淬灭效应实验图。
图8为本发明实施例7的小分子前药自组装纳米粒在体外产生单线态氧的检测结果图。
图9为本发明实施例8的小分子前药自组装纳米粒的体外释放实验图。
图10为本发明实施例9的小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性图。
图11为本发明实施例10的小分子前药自组装纳米粒的细胞内释放实验图。
图12为本发明实施例12的小分子前药自组装纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
图13为本发明实施例13的小分子前药自组装纳米粒的组织分布图。
图14为本发明实施例14的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验肿瘤体积变化图。图15为本发明实施例13的小分子前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验小鼠体重变化图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：ROS敏感键相连的焦脱镁叶绿素a-紫杉醇前药(PPa-S-PTX)的合成
将PPa，DMAP，HOBt和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌 2小时，然后加入乙二醇并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时。通过TLC 监测反应过程。用制备液相色谱纯化目标产物，得到PPa-EG。将PTX，硫代二乙酸酐和DMAP溶于二氯甲烷中。将反应溶液在25℃氮气保护的条件下搅拌12 小时。用TLC监测反应过程。使用制备型液相色谱纯化。将产物与DMAP，HOBt 和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入PPa-EG 并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时。使用制备型液相色谱纯化目标产物，得到PPa-S-PTX。采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例1中前药的结构，选用的溶剂为CDCl3，结果如图1，波谱解析结果如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ9.43,9.32,8.47(each s,1H,meso-H,PPA),8.11 (d,2H,Ar-H,J＝7.3Hz,PTX),7.92(m,1H,J＝17.9Hz,3a-H,PPA),7.69(d,2H,Ar-H, J＝7.4Hz,PTX),7.57(t,1H,Ar-H,J＝7.4Hz,PTX),7.44-7.27(Ar-H,10H,PTX),7.10 (d,1H,J＝9.2Hz,-NH-,PTX),6.23(s,1H,10-H,PTX),6.22(t,1H,J＝8.6Hz,13-H, PTX),6.09-6.12(m,2H,J＝19.2Hz,3b-H,PPA),5.99(dd,1H,J＝3.0Hz,J＝6.4Hz, 3'-H,PTX),5.63(d,1H,J＝7.0Hz,2-H,PTX),5.43(d,J＝3.5Hz,1H,H-2’,PTX), 4.92-5.10(dd,J＝20.0Hz,2H,13b-H,PPA),4.90(d,1H,J＝8.0Hz,5-H,PTX),4.42 (dd,1H,J＝6.5Hz,J＝4.2Hz,7-H,PTX),4.41(m,1H,18-H,PPA),4.31(d,1H, J＝8.4Hz,20α-H,PTX),4.25(dd,1H,17-H,PPA),4.20(d,1H,J＝8.4Hz,20β-H, PTX),4.14(m,4H,-OCO-CH2-CH2-OCO-),3.76(d,1H,J＝7.0Hz,3-H,PTX),3.63(q, J＝7.6Hz,2H,8a-CH2,PPA),3.54,3.32,3.18(each s,each 3H,-CH3,PPA), 3.04-3.29(m,4H,-CH2-S-CH2-),2.40-2.80(m,2H,17b-CH2,PPA),2.55(m,1H,6α-H,PTX),2.40(s,3H,4-COCH3,PTX),2.33(m,2H,14-H,PTX),2.15-2.37(m,2H, 17a-CH2,PPA),2.14(s,3H,10-COCH3,PTX),1.87(t,1H,6β-H,PTX),1.79(s,3H, 18-CH3,PTX),1.73(d,J＝7.4Hz,3H,18-CH3,PPA),1.62(s,3H,19-CH3,PTX),1.53 (t,J＝7.6Hz,3H,8b-CH3,PPA),1.16(s,3H,17-CH3,PTX),1.06(s,3H,16-CH3, PTX).
实施例2：非ROS敏感键的卟啉-紫杉醇前药(PPa-C-PTX)的合成
将PPa，DMAP，HOBt和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入乙二醇并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时。通过TLC 监测反应过程。用制备液相色谱纯化目标产物，得到PPa-EG。将PTX，戊二酸酐和DMAP溶于二氯甲烷中。将反应溶液在25℃氮气保护的条件下搅拌12小时。用TLC监测反应过程。使用制备型液相色谱纯化。将产物与DMAP，HOBt 和EDCI溶于二氯甲烷中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后加入PPa-EG并在37℃氮气保护的条件下继续反应48小时。使用制备型液相色谱纯化目标产物，得到PPa-C-PTX。采用核磁共振测定1H-NMR氢谱来确定实施例2中前药的结构，选用的溶剂为CDCl3，结果如图2，波谱解析结果如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ9.41,9.31,8.47(each s,1H,meso-H,PPA),8.09 (d,2H,Ar-H,J＝7.3Hz,PTX),7.92(m,1H,J＝17.9Hz,3a-H,PPA),7.69(d,2H,Ar-H, J＝7.4Hz,PTX),7.52(t,1H,Ar-H,J＝7.4Hz,PTX),7.46-7.28(Ar-H,10H,PTX),7.14 (d,1H,J＝9.2Hz,-NH-,PTX),6.23(s,1H,10-H,PTX),6.22(t,1H,J＝8.6Hz,13-H, PTX),6.09-6.12(m,2H,J＝19.2Hz,3b-H,PPA),5.93(dd,1H,J＝3.0Hz,J＝6.4Hz, 3'-H,PTX),5.63(d,1H,J＝7.0Hz,2-H,PTX),5.43(d,J＝3.5Hz,1H,H-2’,PTX), 4.94-5.13(dd,J＝20.0Hz,2H,13b-H,PPA),4.90(d,1H,J＝8.0Hz,5-H,PTX),4.40 (dd,1H,J＝6.5Hz,J＝4.2Hz,7-H,PTX),4.38(m,1H,18-H,PPA),4.25(d,1H, J＝8.4Hz,20α-H,PTX),4.23(dd,1H,17-H,PPA),4.20(d,1H,J＝8.4Hz,20β-H, PTX),4.10(m,4H,-OCO-CH2-CH2-OCO-),3.75(d,1H,J＝7.0Hz,3-H,PTX),3.62 (q,J＝7.6Hz,2H,8a-CH2,PPA),3.55,3.35,3.18(each s,each 3H,-CH3,PPA), 2.40-2.80(m,2H,17b-CH2,PPA),2.55(m,1H,6α-H,PTX),2.38(s,3H,4-COCH3, PTX),2.33(m,2H,14-H,PTX),2.15-2.37(m,2H,17a-CH2,PPA),2.14(s,3H, 10-COCH3,PTX),1.87(t,1H,6β-H,PTX),1.81(m,2H,-OCO--CH2-CH2 -CH2-OCO-), 1.79(s,3H,18-CH3,PTX),1.74(d,J＝7.4Hz,3H,18-CH3,PPA),1.61(s,3H,19-CH3, PTX),1.55(t,J＝7.6Hz,3H,8b-CH3,PPA),1.15(s,3H,17-CH3,PTX),1.06(s,3H, 16-CH3,PTX).
实施例3：卟啉-紫杉醇前药紫外和荧光光谱分析
将PPa，PPa-EG，PPa-S-PTX和PPa-C-PTX以相同浓度的PPa(2μM)溶解于DMSO中，然后使用多功能酶标仪获得它们的紫外光谱，以及在415nm的激发波长下发射荧光光谱。结果如图3和图4所示，紫外光谱和荧光光谱的峰位和强度没有发现明显的变化，表明化学修饰对PPa光学性质无太大的影响。
实施例4：小分子前药自组装纳米粒的制备。
将DSPE-PEG2k(20wt％)和前药(PPa-S-PTX或PPa-C-PTX，4mg)溶解于1mL混合溶剂(乙醇/四氢呋喃＝80/20，v/v)中。在搅拌下(1200rpm)将混合溶液滴加到4mL去离子水中。在25℃的条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂，即得到PPa-S-PTX/DSPE-PEG2k纳米粒(简称为PSP纳米粒) 和PPa-C-PTX/DSPE-PEG2k纳米粒(简称为PCP纳米粒)。如表1所示，PTX 和PPa的载药量都很高，实现了光敏剂和化疗药的高效共载。
表1.卟啉-紫杉醇前药自组装纳米粒中PTX和PPa的载药量
使用动态光散射法测量小分子前药纳米粒的粒径，并且使用透射电子显微镜测定实施例4中制备的小分子前药纳米粒的粒径和形态，结果如图5，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在100nm左右。
实施例5：小分子前药自组装纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例4中制备的PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒PSP纳米粒和 PCP纳米粒(0.1mg·mL-1)在37℃的条件下在含有10％FBS的PBS(pH为7.4) 中孵育24h，并且在预定的时间点(0,1,4,8,12或24h)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图6所示，PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒在24小时内粒径无明显变化，显示出良好的胶体稳定性。
实施例6：小分子前药自组装纳米粒的光敏剂聚集淬灭效应实验
将PSP纳米粒和PCP纳米粒(PPa量为2μM)加入到1mL空白释放介质或含有H2O2(0,1,5或10mM)的释放介质中，在37℃的条件下孵育0,1,2或4h。然后使用多功能酶标仪在激发波长415nm和发射波长675nm下分别扫描上述溶液的荧光光谱。
如图7所示，空白介质(0mM H2O2)中PSP纳米粒的发射荧光强度比含 H2O2的培养基弱得多，荧光强度随着H2O2浓度的增大以及时间的延长而显著增强。荧光强度的增加应归因于H2O2引发PPa-S-PTX降解后导致的纳米粒的破坏。相比之下，PCP纳米粒产生了严重的荧光淬灭现象，即使加入H2O2后实验结果也是类似的。同样地，在发射荧光光谱中结果也是相似的。这些结果说明ROS 响应的前药纳米系统能有效避免光敏剂的聚集淬灭效应，提高光动力效率。
实施例7：小分子前药自组装纳米粒在体外产生单线态氧的检测
将混合有单线态氧检测试剂盒SOSG(2μM)的PSP纳米粒和PCP纳米粒 (PPa量为2μM)加入到1mL含有H2O2(0,1,5或10mM)的释放介质中，在37℃的条件下放置0,1,2或4h。在这些固定的时间点用激光照射5分钟后，评估这些样品中单线态氧的产生。使用多功能酶标仪在504nm的激发波长和525 nm的发射波长的条件下测定上述溶液的荧光信号。
结果如图8所示，激光照射下SOSG的荧光信号明显增强，游离的PPa和 PPa-EG的荧光强度比前药纳米粒强，并且不受H2O2浓度的影响。由于聚集淬灭效应的影响，即使使用激光处理，当在空白介质(不含H2O2)中孵育4h后，PSP纳米粒和PCP纳米粒的荧光强度都较低。相比之下，PSP纳米粒在10mM H2O2中孵育4h后荧光强度显著增加，但在相同的条件下对ROS不敏感的PCP 纳米粒并没有改善，这是由严重的聚集淬灭效应导致的。因此，ROS敏感的PSP纳米粒能有效应对光敏剂的聚集淬灭效应，在相同的条件下，比ROS非敏感的 PCP纳米粒产生更多的单线态氧。
实施例8：小分子前药自组装纳米粒的体外释放实验
使用含乙醇的PBS(pH为7.4)作为释放介质来评价前药自组装纳米粒的体外释放行为。由于光动力作用，PPa在光照处理下会被破坏。因此使用高效液相色谱法(HPLC)在227nm的波长下测定紫杉醇的累积释放量。
为了测定在H2O2存在的条件下药物的释放情况，温度为37℃时，将PSP纳米粒和PCP纳米粒(紫杉醇量为200μg)加入到含有0,1,5或10mM H2O2的30 mL的释放介质中。在固定的时间点取出100μL释放介质用于HPLC分析剩余的前药和从前药中水解的紫杉醇的量。为了评价在激光照射条件下的ROS响应的药物释放情况，在37℃的条件下，将PSP纳米粒或PCP纳米粒(紫杉醇量为 200μg)在不含H2O2的30mL释放介质中用激光照射(波长为660nm，200mW·cm-2)，于1,5,10分钟取出100μL释放介质，并用HPLC分析剩余的前药和从前药中水解的紫杉醇的量。为了研究在激光照射和H2O2都存在的条件下自增敏双协同ROS响应纳米粒的释放情况，在37℃的条件下，将PSP纳米粒和 PCP纳米粒(紫杉醇量为200μg)加入到含有5mMH2O2的释放介质中，并用激光(波长为660nm，200mW·cm-2)照射5min。在固定的时间点，取出100μL 释放介质用于HPLC分析从前药水解的紫杉醇的量。
如图9所示，PSP纳米粒的释放随着H2O2浓度的升高而增加，当H2O2浓度为10mM时，PSP纳米粒可以释放约90％的紫杉醇。相比之下，非ROS敏感的 PCP纳米粒中紫杉醇几乎不释放。此外，将PSP纳米粒置于空白释放介质中并且用光照射(波长为660nm，200mW·cm-2，光照时间为10min)后，药物的释放量也有所增加，在12h内PSP纳米粒中紫杉醇的释放量超过了40％。相比之下，在相同条件下PCP纳米粒几乎没有释放紫杉醇。在PBS(5mM H2O2，pH 7.4)中孵育并用激光照射(200mW·cm-2，光照时间为5min)之后，超过80％的紫杉醇从PSP纳米粒中释放，这比在无激光照射的PBS(5mM H2O2，pH7.4)或在用激光照射(200mW·cm-2，光照时间为5min)的空白介质中所释放的紫杉醇的量都要高。这些结果表明H2O2和激光照射产生的单线态氧能够协同触发紫杉醇从ROS敏感的PSP纳米粒中快速释放出来。
实施例9：小分子前药自组装纳米粒的细胞毒性实验
采用MTT法考察PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒对人口腔上皮癌细胞 (KB细胞)和鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至5000cells/mL的细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加泰素溶液，PPa， PPa-EG，PTX/PPa，PTX/PPa-EG，PSP纳米粒和PCP纳米粒，并进一步孵育 48小时，用未处理的细胞用作对照。孵育结束时，每孔加入20μLMTT(5 mg·mL-1)，在37℃的条件下孵育4h。弃去培养基，用200μLDMSO代替培养基溶液，用酶标仪在波长为570nm处测定吸光度。
采用MTT法检测前药纳米粒对KB细胞和4T1细胞的化学-光动力学细胞毒性。细胞预孵育24h后，用连续稀释的泰素，PPa溶液，PPa-EG溶液，泰素/PPa 溶液，泰素/PPa-EG溶液，PSP纳米粒和PCP纳米粒处理细胞。在黑暗条件下孵育4h后，调整激光源以保持整个96孔板被照射。然后用功率为58mW·cm-2的激光装置(660nm)照射96孔板6min，并进一步孵育44h。接下来将培养基弃去，并在孔中加入20μL的MTT(5mg·mL-1)，再次在37℃的条件下培育4h。弃去培养基，用200μL DMSO代替培养基溶液，用酶标仪在570nm处测定吸光度。
如图10所示，由于延缓了紫杉醇释放速度，前药纳米粒体外细胞毒性比泰素溶液更小。但是PSP纳米粒与PCP纳米粒相比更能有效地杀死癌细胞。并且在激光照射下(58mW·cm-2,光照时间为6min)观察到PSP纳米粒具有较强的协同化学-光动力学细胞毒性，然而PCP纳米粒在100nM的浓度范围内几乎没有细胞毒性，但是在光照处理下并且浓度更高(>200nM)时显示一定的细胞毒性。PPa溶液和PPa-EG溶液几乎没有显示出细胞毒性，但在光照处理(58 mW·cm-2光照时间为6min)后对三种细胞表现出光动力学细胞毒性。泰素/PPa 溶液和泰素/PPa-EG溶液在无激光照射的情况下显示出与紫杉醇相似的细胞毒性，但激光照射后可以更有效地杀死癌细胞，表现出协同化学-光动力学的细胞毒性。实验结果表明ROS敏感的PSP纳米粒由于化疗-光动力学的双协同作用，其细胞毒性明显高于ROS不敏感的PCP纳米粒，能够有效促进肿瘤细胞的凋亡。
实施例10：小分子前药自组装纳米粒的细胞内释放实验
将KB细胞以每孔5×10 4个细胞的密度接种到24孔板中并培养24h。然后，用PSP纳米粒和PCP纳米粒(50,100和200nM)处理细胞。将细胞在黑暗条件下进一步孵育4h，然后用激光(58mW·cm-2，波长为660nm)照射24孔板6min。利用未经激光处理的细胞作为对照。在48h后，将细胞以及含有药物的培养基一起收集起来，通过超声破碎细胞，离心(1×104rpm，光照时间为5min)后，通过UPLC-MS-MS分析上清液中游离紫杉醇的浓度。
结果如图11所示，PSP纳米粒中紫杉醇的释放量远多于PCP纳米粒，并且激光处理可以进一步促进PSP纳米粒中紫杉醇的释放。相比之下，PCP纳米粒的释放量非常少，即使在激光辐射下也没有增加。该结果说明在肿瘤细胞中产生的内源性ROS与光动力作用产生的ROS能够有效协同促进紫杉醇在细胞内的释放。
实施例11：小分子前药自组装纳米粒的药代动力学研究
使用SD大鼠(220-250g)进行药代动力学研究。将大鼠随机分为5组(n＝ 5)，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射泰素，PPa溶液，PPa-EG溶液， PSP纳米粒和PCP纳米粒，静脉注射剂量为2.9μmol·kg-1(紫杉醇的量为2.5 mg·kg-1，PPa的量为1.6mg·kg-1)。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
如图12所示，PSP纳米粒和PCP纳米粒在血液中的滞留时间明显延长，并且血液中从前体药物纳米粒中释放的游离紫杉醇，PPa或PPa-EG的量非常少，这意味着大多数紫杉醇和PPa在静脉给药后依然以前药的形式在体内循环。相比之下，紫杉醇，PPa溶液和PPa-EG溶液由于其半衰期短而迅速从血液中清除。药代动力学结果提示，紫杉醇和PPa通过化学偶联并自组装形成纳米粒明显延长了其在血液中的循环时间，这种现象可能是由于纳米粒表面的DSPE-PEG2k营造了一个亲水环境，避免了网状内皮系统对纳米粒的清除。该实验结果表明，PEG 化的小分子前药自组装纳米粒能显著延长紫杉醇在血液中的循环时间，同时通过化学偶联的方式能够实现PPa和PTX的同步药物递送。
实施例12：小分子前药自组装纳米粒的组织分布实验
将4T1细胞(100μL中的5×10 6个细胞)在皮下接种到雌性裸鼠上。当肿瘤体积生长到约为400mm3时，将PPa溶液，PPa-EG溶液，PSP纳米粒和PCP 纳米粒(PPa为1mg·kg-1)静脉注射给药(每组三只)。注射后4,12或24h后，处死小鼠，分离出主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤组织，使用活体成像系统分析主要器官和肿瘤中的荧光信号。
结果如图13所示，PPa溶液和PPa-EG溶液在所有组织器官中分布比较均一，并且在给药后被迅速清除。相反，PSP纳米粒和PCP纳米粒在肝脏和肿瘤中观察到比较强的荧光信号，并且肿瘤中的荧光信号随着时间的延长而增加。这些结果与药代动力学研究结果一致，前药纳米粒在肿瘤内蓄积量的增加应归因于血液循环时间长以及纳米粒通过增加渗透滞留效应(EPR)聚集于肿瘤部位。
实施例13：小分子前药自组装纳米粒的体内抗肿瘤和安全性评价
建立KB细胞荷瘤裸鼠动物模型，将KB细胞(100μL中含5×10 6个细胞) 皮下接种至雌性裸鼠。当肿瘤体积长至150-180mm3左右时，将荷瘤裸鼠随机分为10组(每组5只小鼠)；将生理盐水，泰素溶液，PPa溶液(加激光)，PPa-EG 溶液(加激光)，泰素/PPa溶液(加激光)，泰素/PPa-EG溶液(加激光)，PCP 纳米粒，PCP纳米粒(加激光)，PSP纳米粒和PSP纳米粒(加激光)每隔一天静脉给药，总计注射5次，剂量为9.4μmol·kg-1(8mg·kg-1紫杉醇和5mg·kg-1PPa)，注射24h后施加激光组用激光照射(波长为660nm，200mW·cm-2) 6min，每天测量肿瘤体积和体重。
如图14所示，给予生理盐水和PCP纳米粒(无激光)的组别肿瘤体积迅速增加(在第11天约为700-900mm3)，并且激光处理的PCP纳米粒组显示出更好的抗肿瘤活性(小于500mm3)。PPa溶液和PPa-EG溶液能够在一定程度上抑制肿瘤生长，但在第11天肿瘤体积仍然达到约500mm3。泰素/PPa溶液和泰素/PPa-EG溶液比单纯的PPa溶液和PPa-EG溶液显示出更好的抗肿瘤效力，但与泰素溶液组相比并没有显示出显著的差异。由于紫杉醇和PPa的药代动力学性质差异很大，共递送效率很低，所以游离药物进行联合给药的治疗效果没有达到预期，同时静脉注射不能等同于体内同步给药。相比之下，PSP纳米粒(加激光) 组抗肿瘤效果优于其他组，并且显著遏制了肿瘤生长。抗肿瘤效果与体外释放结果和细胞毒性结果保持一致，化疗联合光动治疗协同抗肿瘤的“双协同”作用可显著提高抗肿瘤的效果。
如图15所示，各组裸鼠体重没有明显变化。结果说明这些PEG化的小分子前药自组装纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全有效的抗癌药物传递系统。

Claims (10)

1.光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药，其特征在于，将化疗药与光敏剂通过ROS敏感键或ROS非敏感键相连。
2.如权利要求1所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药，其特征在于，所述的化疗药为抗肿瘤药物，优选为紫杉醇或紫杉烷类化合物；所述的光敏剂为卟啉类光敏剂，优选为焦脱镁叶绿酸a、二氢卟吩e6、5-氨基酮戊酸、血卟啉单甲醚或叶绿素衍生物。
3.如权利要求1或2所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药，其特征在于，其结构式为：
4.如权利要求1所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药，其特征在于，所述的ROS敏感键为单硫醚键、二硫醚键、单硒键、二硒键或间隔二硫醚键，所述的ROS非敏感键为酯键或酰胺键。
5.如权利要求1所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药的合成方法，其特征在于，采用如下步骤制备：
光敏剂先与乙二醇或乙二胺反应成酯或酰胺，化疗药与硫代二乙酸酐反应成酯或酰胺，最后上述两步反应产物再进行反应，最终合成得到“光化一体”前药化合物。
6.光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，将一定量的小分子前药或小分子前药与PEG修饰剂的混合物溶解到适量的无水乙醇和四氢呋喃混合溶剂，其中，无水乙醇与四氢呋喃的比例为90:10～70:30中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，最后，采用透析法除去制剂中的无水乙醇和四氢呋喃，得到纳米胶体溶液。
7.根据权利要求6所述的小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的小分子前药纳米粒为非PEG化的小分子前药纳米粒、PEG修饰的小分子前药纳米粒、包载疏水性药物的小分子前药纳米粒或主动靶向的茴香胺修饰的PEG小分子前药纳米粒，其中，所述的PEG为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG，小分子前药与PEG修饰剂的比例为95:5～70:30，小分子前药与茴香胺修饰的PEG的比例为95:5～70:30。
8.权利要求1-4任何一项所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药或权利要求6-7任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
9.权利要求1-4任何一项所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药或权利要求6-7任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-4任何一项所述的光敏剂-化疗药“光化一体”小分子前药或权利要求6-7任何一项所述的小分子前药自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
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