CN113350503A - 一种无载体杂合纳米组装体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无载体杂合纳米组装体及其制备方法与应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域。一种无载体杂合纳米组装体，所述无载体杂合纳米组装体由卟啉类光敏剂和化疗药物依托泊苷(VP‑16)共组装而成，或者由卟啉类光敏剂、VP‑16和PEG修饰剂共组装而成。本发明所述的无载体杂合纳米组装体能引起肿瘤细胞DNA损伤的化疗药VP‑16和光敏剂PPa共组装纳米粒具有强效的抗肿瘤活力，并且具有很高的安全性。本发明的共组装纳米制剂为开发药物的递送、光动化疗的联合应用提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效多样化疗联合光动制剂的迫切需求。

Description

一种无载体杂合纳米组装体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型技术领域，具体涉及一种光敏剂与介导DNA损伤的化疗药依托泊苷(VP-16)共组装形成的纳米粒，具体涉及包括光敏剂，介导DNA损失的化疗药依托泊苷(VP-16)共组装纳米粒的构建以及其在药物传递中的应用。
背景技术
目前，人类健康不断受到多种恶性肿瘤的威胁，尽管各种新兴的治疗方法已经被开发用于癌症治疗，化疗仍然是临床实践中最常用的治疗方法之一。由于大多数常规化疗药物的理化性质较差，肿瘤靶向能力较差，导致临床化疗结果往往不尽人意。此外，由于治疗窗口狭窄，一些化疗药物通常会导致严重的全身毒性。近年来，具有良好的治疗选择性和安全性的光动力疗法(PDT)被公认为是癌症的有前途的治疗选择。近几十年来，已开发出多种光敏剂(PSs)用于肿瘤局部生成大量的活性氧(ROS)。在近红外(NIR)激光照射下，肿瘤细胞中细胞毒性ROS的过度积累会诱导DNA、脂质、蛋白质和其他生物大分子的氧化损伤，最终导致肿瘤细胞死亡，特别是ROS诱导的DNA损伤，例如DNA双链断裂(DSBs)和碱基损坏会直接导致肿瘤细胞功能失活和生长停滞。但是，肿瘤细胞可以立即启动细胞内DNA修复途径来对抗这种DNA损伤。尤其是以非同源末端连接(NHEJ)途径和同源重组(HR)途径为代表来处理DSB的修复机制。
内在的DNA修复途径已被认为是阻碍以产生DNA损伤为主的治疗方式的主要障碍，比如PDT中ROS所诱导的DNA损伤。在之前的研究中发现PDT与DSBs诱导剂的组合能够协同加重肿瘤细胞中的DNA损伤，从而导致多模式DNA损伤从而导致肿瘤细胞凋亡。作为典型的拓扑异构酶II抑制剂，依托泊苷(VP-16)不仅抑制TOP II，但也有效作用于Ku70蛋白，该蛋白在DNA的复制和修复过程中起着至关重要的作用。尽管在癌症治疗中得到了广泛应用，但由于VP-16的治疗窗狭窄和体内脱靶现象的存在，考虑到DSBs和ROS引起的DNA损伤的协同作用机制，VP-16和光敏剂的组合不仅有望实现DNA损伤的联合疗法，而且还能通过降低VP-16剂量来降低毒性。
然而，尽管联合癌症疗法具有突出的优势，但要在体内实现多种药物的同步高效联合递送仍然具有挑战性。重要的是，生物医学纳米技术已经从根本上改变了药物的递送方式。纳米颗粒药物递送系统(nano-DDS)的合理设计在药物递送方面显示出显着的优势，例如改善了药物的理化性质，延长了体内的药物作用时间，促进了药物的释放。然而，由于不同药物与载体材料之间的亲和力不同，长期以来，研究表明将两种药物封装到常规的纳米DDS中会导致药物共载效率低，存在药物过早泄漏和剂量调整不便等诸多问题。此外，长期以来，由于复杂的制备工艺和载体材料，纳米药物的临床应用一直受到极大的阻碍，并存在潜在的毒性。因此，有必要开发新的策略来进行治疗。
近年来，通过纯药物自组装的无载体纳米颗粒(NPs)成为有前途的纳米药物，特别是某些特定的抗癌药物被发现无需载体材料即可自组装成稳定的NPs。构建具有多种药物分子的杂合纳米组装体具有作为联合疗法的通用纳米平台的潜力。
发明内容
基于背景技术所述的技术问题，本发明进一步为了解决化疗药物疏水性差、难溶于水、包载于聚合物中导致载药量低、药物泄露和辅料相关毒性差等问题，设计一种光敏剂PS与化疗药物共组装形成的无载体杂合纳米组装体，其最佳剂量比为1：2(化疗药物/光敏剂)，从而实现载药量高、稳定性好、毒副作用低等技术效果，进而解决了单药的治疗效果不理想问题，提高了化疗和光动力学的联合治疗效果。在血液中，利用少量的DSPE-PEG2K(20wt％)，制备PEG化的纳米组装体(VP-16@PS PEG2K纳米粒)。正如预期的那样，VP-16@PSPEG2K纳米粒表现出超高的药物共载率，在血液中的长循环，在肿瘤中良好的生物分布，有效的细胞摄取以及激光照射下的多重DNA损伤，以及在4T1乳腺癌BALB/c小鼠异种移植模型中产生了有效的抗肿瘤功效。
本发明的目的是以化疗药物依托泊苷(VP-16)以及光敏剂PS形成共组装纳米粒(VP-16@PS纳米粒)，包括光敏剂PS和VP-16单独组装而成，或光敏剂PS和VP-16和PEG修饰剂(DSPE-PEG2K)组装而成的纳米粒。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种无载体杂合纳米组装体，所述无载体杂合纳米组装体由卟啉类光敏剂和化疗药物共组装而成，或者由卟啉类光敏剂、化疗药物和PEG修饰剂共组装而成；所述化疗药物为细胞周期特异性抗肿瘤药物。
进一步地，所述卟啉类光敏剂包括焦脱镁叶绿酸a(PPa)、叶绿素a、脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a己醚、二氢卟吩e6中的一种、两种或两种以上。
进一步地，优选为焦脱镁叶绿酸a。
进一步地，所述的PEG修饰剂包括PCL-PEG、DSPE-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG中的一种、两种或两种以上，PEG修饰剂的分子量为200-20000。
进一步地，优选为DSPE-PEG2K。
进一步地，所述细胞周期特异性抗肿瘤药物包括依托泊苷VP-16、鬼臼毒素或替尼泊苷VM-26。
进一步地，无载体杂合纳米组装体中化疗药物和卟啉类光敏剂的摩尔比为4:1～1:4；化疗药物和PEG修饰剂的摩尔比为17:1～3:1。
本发明提供了一种无载体杂合纳米组装体的制备方法，包括如下步骤：
将化疗药物和卟啉类光敏剂，溶解到四氢呋喃溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，自发形成均匀的纳米粒，然后除去有机溶剂，即得由卟啉类光敏剂和化疗药物共组装而成的无载体杂合纳米组装体；
或者，将化疗药物、卟啉类光敏剂和PEG修饰剂，溶解到四氢呋喃溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，自发形成均匀的纳米粒，然后除去有机溶剂，即得由卟啉类光敏剂、化疗药物和PEG修饰剂共组装而成的无载体杂合纳米组装体。
进一步地，所述四氢呋喃的溶剂中VP-16的浓度为0.4-1.6mol/L。
进一步地，除去有机溶剂的方法包括透析法或溶剂蒸发法。
本发明提供了上述方法制备的光敏剂与化疗药VP-16与PEG修饰剂共组装形成的纳米粒。
本发明提供了无载体杂合纳米组装体在制备药物传递系统中的应用。
本发明提供了无载体杂合纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述药物传递系统或抗肿瘤药物的给药形式包括注射给药、口服给药或局部给药。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明制备了一种光敏剂与化疗药VP-16形成的共组装纳米粒或光敏剂与化疗药VP-16与PEG修饰剂形成的共组装纳米粒，均可用于癌症治疗，VP-16导致肿瘤细胞的DNA损伤并阻碍的细胞的DNA修复通路，并且光敏剂在特定激光照射下产生的ROS与内源性ROS协同促进化疗药依托泊苷(VP-16)的DNA损伤作用，和化疗药物VP-16协同使用，提高了化疗和光动力学的联合治疗效果。PEG修饰剂可以使得纳米粒更加稳定，从而增强细胞摄取以及延长在生物体内的作用。
2.本发明的光敏剂与VP-16共组装纳米粒或光敏剂与VP-16与PEG修饰剂共组装纳米粒实现载药量高、稳定性好、毒副作用低等技术效果，满足临床中对高效低毒制剂的迫切需求，为同型协同药物纳米粒的组装提供了一个新策略，为开联合给药纳米递送系统以及化疗-光动力治疗提供了一个有效的纳米平台。
附图说明
图1为本发明实施例1的VP-16@PPa和VP-16@PPa PEG2K纳米粒图。
图2为本发明实施例1的VP-16@PPa和VP-16@PPa PEG2K纳米粒的透射电镜图。
图3为本发明实施例2的VP-16和PPa分子对接图。
图4为本发明实施例3的VP-16@PPa和VP-16@PPa PEG2K纳米粒的胎牛血清介质中稳定性图。
图5为本发明实施例4的VP-16溶液剂、VP-16@PPa、VP-16@PPa PEG2K纳米粒和VP-16@PPa和VP-16@PPa PEG2K纳米粒加光照中VP-16的累积释放情况。
图6为本发明实施例5在不同条件下体外单线态氧产生定量图。A，空白对照；B，VP-16溶液剂；C，PPa溶液剂+光照；D，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；E，VP-16@PPa纳米粒；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图7为本发明实施例6的PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒的细胞摄取图。
图8为本发明实施例7的VP-16溶液剂，PPa溶液剂，VP-16/PPa混合溶液剂，VP-16/PPa混合溶液剂+光照，VP-16@PPa纳米粒，VP-16@PPa纳米粒+光照，VP-16@PPa PEG2K纳米粒，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照的4T1细胞毒图。
图9为本发明实施例7的VP-16溶液剂，PPa溶液剂，VP-16/PPa混合溶液剂，VP-16/PPa混合溶液剂+光照，VP-16@PPa纳米粒，VP-16@PPa纳米粒+光照，VP-16@PPa PEG2K纳米粒，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照的CT 26细胞毒图。
图10为本发明实施例8的DNA损伤免疫荧光图。A，空白对照；B，VP-16溶液剂；C，VP-16@PPa纳米粒；D，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；E，PPa溶液剂+光照；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图11为本发明实施例8的DNA损伤免疫荧光定量图。A，空白对照；B，VP-16溶液剂；C，VP-16@PPa纳米粒；D，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；E，PPa溶液剂+光照；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图12为本发明实施例9的DNA损伤彗星实验图。A，空白对照；B，VP-16溶液剂；C，VP-16@PPa纳米粒；D，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；E，PPa溶液剂+光照；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图13为本发明实施例9的DNA损失彗星实验定量图。A，空白对照；B，VP-16溶液剂；C，VP-16@PPa纳米粒；D，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；E，PPa溶液剂+光照；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图14为本发明实施例10的Western Blot图。A，生理盐水对照组；B，VP-16溶液剂；C，PPa溶液剂+光照；D，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；E，VP-16@PPa纳米粒；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图15为本发明实施例11的PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
图16为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒2h的组织分布图。
图17为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒2h的组织分布定量图。
图18为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒4h的组织分布图。
图19为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒4h的组织分布定量图。
图20为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒8h的组织分布图。
图21为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒8h的组织分布定量图。
图22为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒12h的组织分布图。
图23为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒12h的组织分布定量图。
图24为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒24h的组织分布图。
图25为本发明实施例12中PPa溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒24h的组织分布定量图。
图26为本发明实施例13在体抗肿瘤实验的肿瘤生长曲线图。A，生理盐水对照组；B，VP-16溶液剂；C，PPa溶液剂+光照；D，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；E，VP-16@PPa纳米粒；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图27为本发明实施例13在体抗肿瘤实验的小鼠体重变化图。A，生理盐水对照组；B，VP-16溶液剂；C，PPa溶液剂+光照；D，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；E，VP-16@PPa纳米粒；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图28为本发明实施例13的肝肾功能图。A，生理盐水对照组；B，VP-16溶液剂；C，PPa溶液剂+光照；D，VP-16/PPa混合溶液剂+光照；E，VP-16@PPa纳米粒；F，VP-16@PPa纳米粒+光照；G，VP-16@PPa PEG2K纳米粒；H，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照。
图29为本发明实施例13的生理盐水对照组，VP-16溶液剂，PPa溶液剂+光照，VP-16/PPa混合溶液剂+光照，VP-16@PPa纳米粒，VP-16@PPa纳米粒+光照，VP-16@PPa PEG2K纳米粒，VP-16@PPa PEG2K纳米粒+光照的病理切片图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1：VP-16@PPa纳米粒的制备
将不同摩尔比的VP-16和焦脱镁叶绿酸a(PPa)溶解到200μL的四氢呋喃中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，PPa和VP-16自发形成均匀的纳米粒，然后在25℃条件下于去离子水中透析(8KD)除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
检测所制备的纳米制剂的粒径、粒径分布及VP-16和PPa的协同指数，结果见表1。
表1.VP-16@PPa纳米粒的粒径、粒径分布以及VP-16和PPa的协同指数
Figure BDA0003075949440000081
如表1所示，纳米粒的粒径都在80-130nm之间，协同指数0.35-0.65。其中VP-16：PPa＝1:2时，VP-16@PPa纳米粒的分布较均匀，VP-16溶液剂和PPa溶液剂协同指数较高。初步优选VP-16和PPa的比例为1:2。
(1)非PEG化的VP-16@PPa纳米粒的制备方法：精密称取1mg VP-16和二倍摩尔量的焦脱镁叶绿酸a(PPa)，用200μL四氢呋喃溶液将其溶解，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，自发形成均匀的VP-16@PPa纳米粒，然后在25℃条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液(图1)。
(2)PEG修饰的VP-16@PPa纳米粒的制备方法：精密称取0.2mg PEG修饰剂(DSPE-PEG2K)、1mg VP-16和二倍摩尔量的PPa，用200μL四氢呋喃溶液将其溶解，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到2mL去离子水中，自发形成均匀的VP-16@PPa PEG2K纳米粒。然后在25℃条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液(图1)。
通过动态光散射法检测所制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒的粒径、粒径分布、Zeta电位和载药量，结果见表2。
表2.VP-16@PPa纳米粒的粒径、粒径分布、Zeta电位和载药量
Figure BDA0003075949440000082
如表2所示，VP-16@PPa纳米粒的粒径在130nm左右，Zeta电位在-18mV左右，PPa载药量64.9％；VP-16@PPa PEG2K纳米粒粒径在155nm左右，Zeta电位在-27mV左右，PPa载药量51.9％。
通过透射电子显微镜测定实施例1中制备的VP-16@PPa纳米粒和PEG修饰的VP-16@PPa PEG2K纳米粒的粒径和形态，结果如图2，透射电镜图表明纳米粒为均一的球形，粒径在130-150nm左右。
实施例2：VP-16@PPa组装机理分析
通过计算机模拟，探索VP-16@PPa组装的机理，采用殷赋云计算平台的Vina方案完成分子对接计算。化合物VP-16@PPa在MMFF94力场下进行能量最小化获得3D结构，形成稳定纳米组装体。采用AutoDock Vina程序进行半柔性对接，结果如图3所示，PPa和VP-16，分子之间存在多种作用力，如π-π堆积、疏水作用力和氢键作用，这些作用力对PPa和VP-16的共组装做出了巨大贡献。
实施例3：纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例1中制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒取出1mL，加入到10mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育72小时，并且在预定的时间点(0，1，2，4，6，8，12，24，36，48和72小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图4所示，与非PEG修饰的VP-16@PPa纳米粒相比，VP-16@PPa PEG2K纳米粒胶体稳定性较好，在72小时内粒径没有发生明显的变化。优选PEG修饰的VP-16@PPa纳米粒。
实施例4:体外药物释放
通过体外透析方法评价了VP-16溶液剂，VP-16@PPa纳米粒，VP-16@PPa纳米粒+光照，VP-16@PPa PEG2K纳米粒和VP-16@PPa PEG2K NPs+光照的释放行为。含有10％四氢呋喃的PBS(pH 7.4)作为释放介质。VP-16@PPa纳米粒+光照和VP-16@PPa PEG2K NPs+光照激光处理5分钟(660nm，20mW/cm2)。然后将1mL VP-16溶液，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒(相当于0.33mmol/mL VP-16)添加到透析膜(8KD)中，并在锥形瓶中放置30mL释放介质。将烧瓶置于37℃的振动台(100rpm)中。在预设的时间点(0小时，0.17小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时)取出1mL释放介质，并将相同体积的释放介质加入锥形瓶中。通过HPLC确定VP-16的累积释放量。色谱分离条件：C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A：乙腈，30％；流动相B：含有0.033mol/L乙酸钠的水溶液，70％。流速为1.0mL/min，VP-16的检测波长为254nm。
我们探讨了VP-16溶液剂，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒在含有10％THF的PBS(pH 7.4)中有激光照射5分钟(660nm，20mW/cm2)的情况下是否促进释放。少量的THF用于将疏水性VP-16溶解在水性释放介质中。如图5所示，VP-16溶液显示出初始的突释行为，超过50％的VP-16在2小时内释放。相比之下，VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒表现出持续释放的行为，在相同条件下只有约15％的VP-16被释放。更有趣的是，由于对PPa进行光漂白破坏时，共组装体被破坏，激光辐照进一步加速了VP-16从纳米组装体中的释放。激光辐照促进的VP-16从纳米粒中的释放必将有益于其抗肿瘤作用。
实施例5：纳米粒的体外单线态氧检测
用单态氧荧光探针(DCFH-DA)检测在激光照射下产生的单线态氧。将相同体积的与DCFH-DA(20nM)混合的PPa溶液剂(200nM)、与DCFH-DA(20nM)混合的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒(200nM，PPa当量)在37℃条件下孵育30分钟，在激光照射(660nm，20mW cm-2)不同时间或没有照射的情况下，检测各组制剂中产生的单线态氧，荧光信号强度通过Nikon Corp倒置显微镜分析。
结果如图6所示，在激光照射情况下，与PPa溶液剂相比，纳米粒的单线态氧产生量明显较多。
实施例6：纳米粒的细胞摄取
采用共聚焦显微镜测定实施例1中制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒在4T1细胞中的摄取情况。将4T1细胞以5×104cells mL-1的密度接种到24孔板上，置培养箱中孵育24h使其贴壁，待细胞贴壁后分别加入PPa溶液、VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPaPEG2K纳米粒，PPa的浓度均为2.5μg mL-1，在37℃孵化0.5小时、2小时和4小时后，清洗细胞，收集细胞并分散在PBS中，之后通过超声破碎、离心和沉淀蛋白法提取PPa，最后用共聚焦显微镜(C2，Nikon)分析细胞对各种制剂的摄取情况。
实验结果如图7所示，摄取4小时实验组，纳米粒处理的细胞比游离PPa处理的细胞具有更高的细胞内荧光强度。因此，制备的VP-16@PPa PEG2K纳米粒具有比游离PPa更高的细胞摄取效率。
实施例7：纳米粒的细胞毒性
采用MTT法考察VP-16@PPa PEG2K纳米粒对小鼠乳腺癌(4T1)细胞和小鼠结肠癌(CT26)细胞的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至2000个细胞/毫升的细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加PPa溶液剂或VP-16@PPa纳米粒或VP-16@PPa PEG2K纳米粒。本实验使用1640培养液来配制和稀释药物溶液与纳米粒制剂，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔。对照组即不加待测药液，单一补加100μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。涉及激光照射实验组，于加药后4小时后，激光照射(660nm，20mW cm-2)，44小时后，将96孔板取出，每孔加入5mg mL-1MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4小时后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。
细胞毒性结果如图8和图9所示，避光时，PPa溶液剂几乎无细胞毒性，VP-16溶液剂以及PPa和VP-16的混合溶液剂表现出一定的细胞毒性，VP-16@PPa PEG2K纳米粒细胞毒性相对混合溶液剂较弱些。然而，结合激光照射后，VP-16@PPa PEG2K纳米粒细胞毒性明显增强，表现出几乎与PPa和VP-16的溶液剂相近的细胞毒性，论证了纳米粒增强激活和光动协同的细胞毒性。
实施例8：免疫荧光表征DNA损伤
采用共聚焦显微镜测定细胞DNA损伤。以小鼠乳腺癌(4T1)细胞分为8组进行考察，组别为：空白组、PPa溶液剂+激光、VP-16溶液剂、VP-16和PPa的混合溶液剂+激光、实施例1制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa纳米粒+激光和VP-16@PPa PEG2K纳米粒和VP-16@/PPaPEG2K纳米粒+激光。将4T1细胞以5×104cells mL-1的密度接种到24孔板上，置培养箱中孵育12h使其贴壁后以上述处方孵育细胞4h(PPa为750nM)。光照组以激光照射5min(660nm，20mWcm-2)。光照后细胞继续在黑暗条件下孵育20h。然后将含药培养基移出并用冷PBS溶液洗涤3次，以4％多聚甲醛溶液固定细胞。细胞以含有0.1％Triton X-100和1％牛血清白蛋白的PBS溶液(1mL/孔)孵育15min。一抗(γ-H2AX)溶于上述PBS溶液(1:100)，将细胞以γ-H2AX在黑暗4℃条件下孵育12h。孵育后将一抗移出，并以冷PBS溶液洗涤细胞，然后以溶于PBS溶液的二抗(1:100)在室温下孵育细胞2h。以Hoechst 33342将细胞核染色10min。最后，所有荧光都以共聚焦显微镜进行测定(C2，Nikon，Japan)。
实验结果如图10和图11所示，光照实验组比未光照实验组具有更高的荧光强度，光照组的纳米粒处理的细胞比游离PPa处理的细胞具有更高的细胞内荧光强度。因此，光照组比非光照组具有更强的DNA损伤作用，制备的VP-16@PPa PEG2K纳米粒在光照条件下具有最强的DNA损伤作用。
实施例9：彗星实验
将4T1细胞以5×104cells/孔的密度接种在24孔板中并培养12h。之后以PPa溶液剂、VP-16溶液剂、VP-16和PPa的混合溶液剂、实施例1制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPaPEG2K纳米粒孵育细胞4h(PPa为750nM)。光照组以激光照射5min(660nm，20mW cm-2)。光照后细胞继续在黑暗条件下孵育20h。首先，将80μL正常熔点的琼脂糖NMA(0.5％，在56℃下预热)滴到在相同条件下预热的磨砂玻璃表面上，并迅速用干净的盖玻片覆盖并在4℃下固化10分钟。然后在37℃下将25μL含有5000个细胞的PBS与25μL低熔点琼脂糖LMA(0.5％)混合。移开盖玻片并将含细胞的LMA滴到凝胶层上，用新的干净盖玻片覆盖凝胶载玻片，并在4℃固化10分钟。最后，将85μL预热的LMA(0.5％)添加到固化的LMA层中，并进一步固化凝胶载玻片。
此后，移开盖玻片，将载玻片浸入细胞裂解液中4小时，并用PBS洗涤两次。将碱性电泳缓冲液倒入水平电泳仪中，并将载玻片放入其中20分钟。在25V和300mA的条件下电泳20分钟。电泳后将载玻片取出，并用Tris-HCl(pH 7.5)溶液中和15分钟。然后在黑暗条件下，将50μL的乙基溴(EB)溶液(30μg mL-1)滴在每个载玻片上，并染色20分钟。通过EclipseTi-U倒置显微镜(Nikon Corp，Tokyo，Japan)记录红色荧光信号。
如图12和图13所示，在空白对照组中未进行任何药物处理的情况下，发现规则的圆形核无明显的彗尾。相比之下，用PPa溶液，VP-16/PPa混合溶液，VP-16@PPa NPs和VP-16@PPa PEG2K NPs处理的细胞显示出显着的彗尾，并带有大量彗尾DNA，VP-16@PPa PEG2K NPs显示出优于其他配方的独特优势。这进一步证实了VP-16@PPa PEG2K NPs对肿瘤DNA损伤的增强。
实施例10：蛋白质印记法
将4T1细胞(5×104细胞/孔)接种到24孔板中，培养12小时。用VP-16溶液，PPa溶液，VP-16/PPa溶液，VP-16@PPa NPs和VP-16@PPa PEG2K NPs处理细胞。制剂分别以VP-16为375nM当量和PPa为750nM当量的剂量给药。然后通过(RIPA)-裂解缓冲液裂解细胞。利用(BCA)测定法(Invitrogen，CA)确定细胞中的蛋白质浓度。用SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并转移至PVDF。加入一抗(γ-H2AX，Ku70)并在4℃与细胞孵育过夜。二抗孵育后，添加ECLWestern Blotting底物使蛋白质条带可视化。
如图14所示，在VP-16溶液，VP-16/PPa混合溶液+激光组和VP-16@PPa DSPE-PEG2KNPs+激光组处理的细胞中，Ku70的表达受到明显抑制，表明VP-16的对Ku70蛋白有抑制作用。除了Ku70，鉴于DSBs诱导了γ-H2AX蛋白在细胞核中的积累，γ-H2AX蛋白的表达已被广泛用于评估细胞中的DNA损伤。值得注意的是，VP-16@PPa PEG2K NPs在激光照射下对Ku70蛋白γ-H2AX蛋白与表现出最强的抑制作用，这可能是由于其良好的稳定性和有效的细胞摄取。
实施例11：纳米粒的药代动力学研究
取体重在200-250g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射PPa溶液剂以及实施例1制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa PEG2K纳米粒，二者PPa给药剂量均为2.5mg kg-1，于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。之后通过超声破碎、离心和沉淀蛋白法提取PPa，最后用varioskan lux多模式酶标仪(激发415nm，发射675nm)分析细胞对各种制剂的摄取情况。
实验结果如图15所示，由于半衰期短，PPa溶液剂实验组的PPa从血液中清除速度较快。相比于PPa溶液剂，VP-16@PPa PEG2K纳米粒的循环时间明显延长，明显提高了PPa的AUC，为药物在体内肿瘤的蓄积提高了很好基础。
实施例12：纳米粒的组织分布实验
将4T1细胞悬液接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到400mm3时，尾静脉注射给药：PPa溶液剂、VP-16@PPa纳米粒或VP-16@PPa PEG2K纳米粒，二者PPa给药剂量均为6mg kg-1，2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后，将小鼠处死，分离出主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤，用活体成像仪进行分析。
结果如图16-25所示，与PPa溶液剂相比，VP-16@PPa PEG2K纳米粒组在肿瘤组织的荧光强度显著增加。且在4小时达到最大蓄积。这一结果与其药代动力学行为完全一致，VP-16@PPa PEG2K纳米粒稳定性最好，体内循环时间最长，因此表现出最好的肿瘤蓄积能力。
实施例13：纳米粒的在体抗肿瘤实验
将4T1细胞悬液(5x106 cells/100μL)接种于雌性小鼠腹侧皮下。待肿瘤体积生长至150mm3时，将小鼠随机分组，每组六只，分别给与生理盐水、PPa溶液剂+激光、VP-16溶液剂、VP-16和PPa的混合溶液剂+激光、实施例1制备的VP-16@PPa纳米粒和VP-16@PPa纳米粒+激光，VP-16@PPa PEG2K纳米粒和VP-16@/PPa PEG2K纳米粒+激光。每隔1天给药1次，连续给药5次，按PPa计算，给药剂量为6mg kg-1。光照组在给药4小时后给与激光光照，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。最后一次给药后，间隔3天后将小鼠处死，获取器官和肿瘤，进一步分析评价。收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏)和肿瘤组织并用4％组织固定液固定用于H&E染色。
实验结果如图26所示，与生理盐水组相比，PPa溶液剂表现出一定的肿瘤抑制活性。VP-16@PPa PEG2K纳米粒表现出比VP-16和PPa的混合溶液剂更强的抗肿瘤活性，肿瘤体积增长缓慢。正如预期，VP-16@PPa PEG2K纳米粒并给与激光的治疗组抗肿瘤效果最为明显，有效的抑制了肿瘤增长，治疗后期，肿瘤体积甚至出现了下降的趋势。结果表明纳米粒的稳定性、细胞毒性、药动学、组织分布均会影响最终的抗肿瘤效果。
如图27所示，各实验组小体重没有明显变化。从图28和29可知，各组小鼠的主要脏器功能无明显异常，这些结果说明VP-16@PPa PEG2K纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全有效的抗癌药物传递系统。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种无载体杂合纳米组装体，其特征在于，所述无载体杂合纳米组装体由卟啉类光敏剂和化疗药物共组装而成，或者由卟啉类光敏剂、化疗药物和PEG修饰剂共组装而成；所述化疗药物为细胞周期特异性抗肿瘤药物。
2.如权利要求1所述的无载体杂合纳米组装体，其特征在于，所述卟啉类光敏剂包括焦脱镁叶绿酸a、叶绿素a、脱镁叶绿酸a、焦脱镁叶绿酸a己醚、二氢卟吩e6中的一种、两种或两种以上。
3.如权利要求1所述的无载体杂合纳米组装体，其特征在于，所述的PEG修饰剂包括PCL-PEG、DSPE-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG中的一种、两种或两种以上，PEG修饰剂的分子量为200-20000。
4.如权利要求1所述的无载体杂合纳米组装体，其特征在于，所述细胞周期特异性抗肿瘤药物包括依托泊苷VP-16、鬼臼毒素或替尼泊苷VM-26。
5.如权利要求1所述的无载体杂合纳米组装体，其特征在于，无载体杂合纳米组装体中化疗药物和卟啉类光敏剂的摩尔比为4:1～1:4；化疗药物和PEG修饰剂的摩尔比为17:1～3:1。
6.权利要求1-5中任一项所述的无载体杂合纳米组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将化疗药物和卟啉类光敏剂，溶解到四氢呋喃溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，自发形成均匀的纳米粒，然后除去有机溶剂，即得由卟啉类光敏剂和化疗药物共组装而成的无载体杂合纳米组装体；
或者，将化疗药物、卟啉类光敏剂和PEG修饰剂，溶解到四氢呋喃溶剂中，搅拌条件下，缓缓滴加到去离子水中，自发形成均匀的纳米粒，然后除去有机溶剂，即得由卟啉类光敏剂、化疗药物和PEG修饰剂共组装而成的无载体杂合纳米组装体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，除去有机溶剂的方法包括透析法或溶剂蒸发法。
8.权利要求1-4中任一项所述的无载体杂合纳米组装体在制备药物传递系统中的应用。
9.权利要求1-4中任一项所述的无载体杂合纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述药物传递系统或抗肿瘤药物的给药形式包括注射给药、口服给药或局部给药。
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