CN112263566B - 白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒、制备方法及用途,该复合纳米粒,由二聚体前药分子通过自组装包载光敏剂而成,所述二聚体前药分子由两分子具有抗肿瘤效果的药物分子通过ROS敏感键连接而成。该纳米粒同时负载抗肿瘤药物和光敏剂,实现协同治疗效果,该载药纳米粒为肿瘤治疗相关纳米递药系统提供了新的设计思路。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域,特别涉及白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒、制备方法及用途。
背景技术
目前,针对肺癌的主要治疗方式包括外科手术、化疗和放疗,其中化疗可有效地抑制肿瘤的发展,对于所有分期的患者均能改善其生活质量、延长其生存期,但传统化疗药物细胞毒性大,选择性低,在发挥抗肿瘤疗效的同时也会损伤一些正常组织,常常伴随着骨髓抑制和肝肾功能损坏等副作用。光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)作为一种极具潜力的肿瘤治疗方式,具有非侵入性、高效率和可控性,产生相对较少的疼痛和出血倾向。光动力疗法目前的临床应用主要包括治疗多种实体肿瘤(皮肤肿瘤、头颈部肿瘤、肺部肿瘤)、癌前病变、皮肤黏膜病变、血管疾病、眼科和牙科疾病等,特别是对早期肿瘤和体表浅表肿瘤有根治效果,临床应用前景十分广阔。但光动力疗法的应用由于其自身的缺点而面临许多挑战,包括缺乏足够的肿瘤靶向性、激发光穿透深度有限以及环境光暴露诱导的潜在光毒性等。因此,需要设计相应的药物递送系统以提高光动力疗法对肿瘤组织的选择性。
针对肿瘤组织微环境存在的低pH(6.5-7.0)、低氧气浓度、高活性氧(reactiveoxygen species,ROS)、高谷胱甘肽(glutathione,GSH)的特点,在药物递送领域涌现出了许多刺激响应型纳米载体。刺激响应型纳米载体是可响应于内部或外部物理或生化刺激,从而改变自身结构、组成或者构象以释放其包封的活性组分的智能载体,可分为化学响应型、生物化学响应型和物理响应型,化学响应型的因素包括pH和氧化还原(GSH和ROS)等,生物化学响应型的因素包括酶和蛋白等,物理响应型的因素包括温度、光和磁等。刺激响应型纳米载体特异性地在病变组织裂解释药,减少药物在非病变组织的泄露,降低毒副作用。
另外,药物和光敏剂等的血液循环时间短也是肿瘤治疗过程中一个亟待解决的问题。目前,提高药物在血液中半衰期的主要策略是采用聚乙二醇(PEG)及其衍生物对药物递送系统进行修饰,但长期使用PEG会产生PEG抗体,出现加速血液清除(Accelerated BloodClearance,ABC)现象,降低其长循环效果。而白蛋白是血浆中最丰富的蛋白,具有稳定性、低免疫原性、肿瘤靶向性和长循环效果,可以通过在纳米递药系统上修饰白蛋白的锚定位点马来酰亚胺基团,原位结合白蛋白,赋予制剂长循环效果。
发明内容
发明目的:本发明的第一目的是提供白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒,以提高化疗药物和光敏剂在体内的循环时间,达到更好的抗肿瘤效果。
本发明的第二目的是提供该纳米粒的制备方法。
本发明的第三目的是提供该纳米粒的用途。
技术方案:本发明提供的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒由二聚体前药分子通过自组装包载光敏剂而成,所述二聚体前药分子由两分子具有抗肿瘤效果的药物分子通过ROS敏感键连接而成。
进一步地,所述的具有抗肿瘤效果的药物分子为具有活性羟基的紫杉醇、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱或双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)。
进一步地,所述的ROS敏感键为草酸酯键、单硫醚键、单硒键、二硫键、二硒键、间隔二硫醚键。
进一步地,所述的光敏剂为酞菁锌、二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)、5-氨基酮戊酸、原卟啉、锌原卟啉、苯卟啉、血卟啉单甲醚、焦脱镁叶绿酸a或叶绿素衍生物。
所述白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒的制备方法是将二聚体前药分子与光敏剂的混合物溶于有机溶剂中,在搅拌条件下加到水中,透析除去有机溶剂,即得纳米粒;或将壳材料溶于水中,将二聚体分子与光敏剂的混合物溶于有机溶剂中后滴加到上述水溶液中,透析除去有机溶剂,即得纳米粒,所述壳材料是在含活性氨基的聚合物上修饰6-(2-硝基咪唑)己酸和6-马来酰亚胺基己酸。
进一步地,所述的有机溶剂为二甲基亚砜、乙醇、四氢呋喃。
进一步地,所述含活性氨基的聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺。
所述羧甲基壳聚糖衍生物,其结构式为:
本发明提供的以羧甲基壳聚糖为母核的聚合物的合成方法,包括以下步骤:在2-硝基咪唑上修饰长链羧基,然后用其接枝含活性氨基的聚合物,随后再通过一步酰胺反应在聚合物上接枝6-马来酰亚胺基己酸,得到修饰有6-(2-硝基咪唑)己酸和6-马来酰亚胺基己酸的聚合物。
本发明优选二氢卟吩e6作为光敏剂,双氢青蒿素作为抗肿瘤药物,将两分子双氢青蒿素通过硫代二乙酸结构连接,得到具有ROS响应性的二聚体分子(DHA-S-DHA)。另外,将两分子双氢青蒿素通过戊二酸结构连接得到二聚体分子(DHA-C-DHA)作为对照;
其中,DHA-S-DHA的结构式为:
DHA-C-DHA的结构式为:
本发明提供所述二聚体前药分子和对照二聚体的合成方法,包括以下步骤:
双氢青蒿素等具有抗肿瘤效果的药物分子和酸酐反应得到中间产物,中间产物继续与一分子双氢青蒿素等具有抗肿瘤效果的药物分子反应,得到二聚体分子。
所述的酸酐选自:硫代羟基乙酸酐、硒代羟基乙酸酐、戊二酸酐等。
本发明中所述的双氢青蒿素可以用其他含有活性羟基的药物分子替代,如紫杉醇、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、双氢青蒿素等。
所述的光敏剂可以用其他酞菁类或卟啉类光敏剂替代,如原卟啉等。
所述的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒在抗肿瘤治疗药物中的用途。
有益效果:本发明具有如下优势:
(1)该复合纳米粒粒径小于110nm,粒径均一,稳定性良好;
(2)具有光引发效果,激光照射后光动力过程消耗大量氧气的同时产生大量ROS,触发壳材料的缺氧响应性和二聚体的ROS响应性,使壳材料解聚,引发特异性药物释放,降低对正常组织的毒性;
(3)该自组装纳米粒中包载的光敏剂和双氢青蒿素能够实现光动力和化疗的协同抗肿瘤效果;
(4)该纳米粒壳材料表面修饰的马来酰亚胺基团可在血浆中捕获白蛋白,从而使制剂避免调理素的调理作用,提高了化疗药物和光敏剂在体内的循环时间,达到长效抗肿瘤效果,具备重要的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体(DHA-S-DHA)的1H-NMR谱图;
图2为本发明实施例1中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体(DHA-S-DHA)的ESI-MS谱图;
图3为本发明实施例2中碳单键连接的双氢青蒿素二聚体(DHA-C-DHA)的1H-NMR谱图;
图4为本发明实施例2中碳单键连接的双氢青蒿素二聚体(DHA-C-DHA)的ESI-MS谱图;
图5为本发明实施例3中化合物6-(2-硝基咪唑)己酸的1H-NMR谱图;
图6为本发明实施例3中以羧甲基壳聚糖为母核的聚合物CMCTS-MAL&NI(CMN)的1H-NMR谱图(A代表羧甲基壳聚糖的信号峰,B代表脂肪酸链的信号峰,C代表2-硝基咪唑和马来酰亚胺基团的信号峰);
图7为本发明实施例4中双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的纳米粒Ce6&DHA-S-DHA、Ce6&DHA-S-DHA@TPGS和Ce6&DHA-S-DHA@CMN的透射电子显微镜图;
图8为生理溶液中的粒径-时间变化图,其中a、b图分别为本发明实施例5中三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的纳米粒在PBS和含4mg/mL BSA的PBS溶液中的粒径-时间变化图;
图9为本发明实施例6中壳材料CMN在常氧和缺氧条件下的紫外吸收图谱;
图10为本发明实施例7中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN经缺氧处理前后的形貌变化图;
图11为本发明实施例8中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN经激光照射后不同时间点的外观形貌变化图;
图12为本发明实施例9的体外释药图;
图13为本发明实施例10中三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒与血浆蛋白孵育后形成蛋白冕的蛋白质谱分析图,其中图a为结合白蛋白百分比分析图,图b为结合总蛋白种类分析图;
图14为细胞毒性图,其中a、b图分别为本发明实施例11中游离Ce6和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒对小鼠肺癌细胞LLC的光毒性和对人正常肝细胞L02的暗毒性图;
图15为本发明实施例12中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN对LLC细胞的暗毒性图;
图16为本发明实施例13的细胞摄取图;
图17为本发明实施例13的细胞摄取荧光定量结果图;
图18为本发明实施例14的细胞内药物释放图;
图19为本发明实施例14中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN在常氧和缺氧条件下细胞内药物释放图;
图20为本发明实施例15的缺氧探针荧光图;
图21为本发明实施例16的监测ROS荧光图;
图22为本发明实施例17中游离DHA-S-DHA和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的药时曲线图;
图23为药时曲线图,其中a、b图分别为本发明实施例17中单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@TPGS和Ce6&DHA-S-DHA@CMN前后两次给药的药时曲线图;
图24为本发明实施例18中游离Ce6和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的离体器官荧光成像图;
图25为本发明实施例19的小鼠肿瘤体积-时间曲线图。
具体实施方式
实施例1
单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体的合成(DHA-S-DHA)
称取双氢青蒿素(227.48mg,0.80mmol)和二甲氨基吡啶(9.77mg,0.08mmo)溶于无水二氯甲烷中,搅拌10min后,将溶于无水二氯甲烷的硫代羟基乙酸酐(126.85mg,0.96mmol)逐滴加入上述溶液,4h后终止反应。将上述反应产物直接投入下一步反应,加入1-羟基苯并三唑(181.60mg,1.34mmol)和N,N-二异丙基乙胺(352.02μL,2.13mmol),冰浴下搅拌30min后,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg,1.06mmol)加入其中,继续冰浴下搅拌1h。随后将双氢青蒿素(154.68mg,0.54mmol)溶于二氯甲烷,逐滴加入,冰浴下反应1h,转至室温继续反应过夜。反应结束后用饱和NaCl水溶液洗涤三次,用无水硫酸钠干燥后通过柱色谱分离纯化。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例1中所合成的化合物结构,选用氘代溶剂为CDCl3,结果如图1,解析结果如下:1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):5.79(d,2H),5.44(s,2H),3.48(s,4H),2.66-2.51(m,2H),2.44-2.30(m,2H),2.03(m,2H),1.95-1.84(m,2H),1.83-1.68(m,4H),1.63(m,6H),1.43(s,6H),1.37-1.22(m,6H),0.96(d,6H),0.88(d,6H).
通过LC-MS确定实施例1中所合成的化合物的分子量,结果如图2,单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体的理论分子量为682.30,LC-MS结果图中显示[M+NH4]+:700.3355,[M+Na]+:705.2914。
实施例2
碳单键连接的双氢青蒿素二聚体的合成(DHA-C-DHA)
称取双氢青蒿素(227.48mg,0.80mmol)和二甲氨基吡啶(9.77mg,0.08mmo)溶于无水二氯甲烷中,搅拌10min后,将溶于无水二氯甲烷的戊二酸酐(109.54mg,0.96mmol)逐滴加入上述溶液,4h后终止反应。将上述反应产物直接投入下一步反应,加入1-羟基苯并三唑(181.60mg,1.34mmol)和N,N-二异丙基乙胺(352.02μL,2.13mmol),冰浴下搅拌30min后,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(204.16mg,1.06mmol)加入其中,继续冰浴下搅拌1h。随后将双氢青蒿素(154.68mg,0.54mmol)溶于二氯甲烷,逐滴加入,冰浴下反应1h,转至室温继续反应过夜。反应结束后用饱和NaCl水溶液洗涤三次,用无水硫酸钠干燥后通过柱色谱分离纯化。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例2中所合成的化合物结构,选用氘代溶剂为CDCl3,结果如图3,解析结果如下:1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):5.78(d,2H),5.43(s,2H),2.62-2.50(m,2H),2.47(t,4H),2.40-2.29(m,2H),2.05(m,2H),2.01-1.95(m,2H),1.93-1.83(m,2H),1.81-1.67(m,4H),1.62(m,6H),1.43(s,6H),1.33-1.23(m,6H),0.96(d,6H),0.84(d,6H).
通过LC-MS确定实施例2中所合成的化合物的分子量,结果如图4,碳单键连接的双氢青蒿素二聚体的理论分子量为664.35,LC-MS结果图中显示[M+NH4]+:682.3800,[M+Na]+:687.3357。
实施例3
以羧甲基壳聚糖为母核的聚合物CMCTS-MAL&NI的合成
将2-硝基咪唑(0.50g,4.43mmol)、6-溴己酸乙酯(1.04g,4.65mmol)和碳酸钾(4.90g,35.40mmol))溶于乙腈中,60℃加热6天。反应结束后,通过添加适量K2CO3将所得溶液的pH值调节至7-8。然后在真空下蒸干溶剂,并加入适量乙酸乙酯和水,通过萃取分离两相。有机相用水洗涤三次,无水硫酸钠干燥,过滤并蒸干溶剂,得到乙基-(2-硝基咪唑基)己酸乙酯。然后,将乙基-(2-硝基咪唑基)己酸乙酯(1.13g,4.43mmol)置于浓盐酸中,室温剧烈搅拌过夜。次日真空蒸干溶剂,得到黄色油状产物6-(2-硝基咪唑)己酸。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例3中所合成的化合物6-(2-硝基咪唑)己酸的结构,选用氘代溶剂为DMSO-d6,结果如图5,解析结果如下:1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.15(d,1H),7.10(d,1H),4.42(t,2H),2.38(t,2H),1.89(m,2H),1.70(m,2H),1.47-1.33(m,2H).
将合成得到的6-(2-硝基咪唑)己酸(227.22mg,1.00mmol)和6-马来酰亚胺基己酸(211.21mg,1.00mmol)溶于甲酰胺中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(766.8mg,4.00mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(460.36mg,4.00mmol)活化30min后,逐滴加入到羧甲基壳聚糖甲酰胺/水(5∶1)溶液中,继续反应24h。反应结束后,将反应产物逐滴加入丙酮中,离心收集沉淀,并用丙酮洗涤3次,得到壳材料CMN。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)确定实施例3中所合成的终产物CMCTS-MAL&NI的结构,选用氘代溶剂为D2O,结果如图6。
实施例4
双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的制备
称取10mg实施例1中所制备的单硫醚键连接的二聚体分子DHA-S-DHA和5mg Ce6,溶于0.8mL二甲基亚砜中,在搅拌下将该二甲基亚砜溶液缓慢滴加到3.2mL水溶液中,通过透析除去有机溶剂,超滤浓缩至2.5mL,即得到所述纳米粒Ce6&DHA-S-DHA(相当于2mg/mLCe6)。
称取10mg实施例1中所制备的单硫醚键连接的二聚体分子DHA-S-DHA、5mg Ce6和3mg TPGS,溶于0.8mL二甲基亚砜中,在搅拌下将该二甲基亚砜溶液缓慢滴加到3.2mL水溶液中,通过透析除去有机溶剂,超滤浓缩至2.5mL,即得到所述纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@TPGS(相当于2mg/mL Ce6)。
将3mg实施例3中所制备的以羧甲基壳聚糖为母核的聚合物溶于3.2mL水中,称取10mg实施例1中所制备的单硫醚键连接的二聚体分子DHA-S-DHA和5mg Ce6,溶于0.8mL二甲基亚砜中,在搅拌下将该二甲基亚砜溶液缓慢滴加到上述水溶液中,通过透析除去有机溶剂,超滤浓缩至2.5mL,即得到所述纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN(相当于2mg/mL Ce6)。
将3mg实施例3中所制备的以羧甲基壳聚糖为母核的聚合物溶于3.2mL水中,称取10mg实施例2中所制备的碳单键连接的二聚体分子DHA-C-DHA和5mg Ce6,溶于0.8mL二甲基亚砜中,在搅拌下将该二甲基亚砜溶液缓慢滴加到上述水溶液中,通过透析除去有机溶剂,超滤浓缩至2.5mL,即得到所述纳米粒Ce6&DHA-C-DHA@CMN(相当于2mg/mL Ce6)。
通过透射电子显微镜观察纳米粒Ce6&DHA-S-DHA、Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS的外观形貌,结果如图7,在没有壳材料的情况下,Ce6&DHA-S-DHA疏水纳米粒表面不规则,形状不均一。而Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-C-DHA@TPGS纳米粒外观呈光滑的球形,粒径分布均一,且具有明显的核壳结构。
实施例5
三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的稳定性
取2mL实施例4中所制备的三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA、Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS分散于PBS(pH7.4)及含4mg/mL BSA的PBS溶液中,通过马尔文激光粒度仪监测纳米粒的粒径变化。图8a、b分别显示24h内三种纳米制剂在PBS和含4mg/mL BSA的PBS中的粒径基本稳定,证实了三种纳米粒在模拟生理环境中的稳定性。
实施例6
壳材料CMN在常氧和缺氧条件下的紫外吸收图谱
称取2mg实施例3中所制备的壳材料CMN溶于超纯水中,加入NADPH(100mM)并通氮气保护,模拟缺氧环境,搅拌反应过夜;另称取2mg壳材料CMN,加入NADPH,与大气相通,模拟常氧环境,通过紫外分光光度计监测缺氧和常氧条件下的紫外图谱差异。结果(图9)显示,在缺氧条件(NADPH,N2保护)下,壳材料CMN原来340nm处的2-硝基咪唑峰转变为293nm处的2-氨基咪唑峰,证实了壳材料的缺氧响应性。
实施例7
单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN经缺氧处理后的外观形貌变化
取2mL实施例4中所制备的单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的自组装纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN,加入NADPH(100mM)并通氮气保护,模拟缺氧环境,搅拌反应4h,常氧组与大气相通,观察缺氧和常氧条件下纳米粒的形态变化。结果如图10所示,在缺氧条件下,壳材料中疏水性的2-硝基咪唑转变为亲水性的2-氨基咪唑,破坏了原有两亲性胶束的稳定结构,从而从制剂表面脱落,制剂不稳定,粒径变大,纳米粒出现明显破裂,证实了纳米粒的缺氧响应性。
实施例8
单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN经激光照射后的外观形貌变化
取2mL实施例4中所制备的单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的自组装纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN,经过激光(635nm,300mW/cm2)照射8min后,通过透射电镜观察光照后8h内纳米粒的形态变化。结果如图11所示,经激光照射后,纳米粒的边界逐渐变得模糊,外壳逐渐消失,说明纳米粒结构被破坏。激光处理8h后纳米粒结构已完全消失,内容物大量释放,证实了制剂在光触发下实现药物释放。
实施例9
双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-C-DHA@CMN在不同条件下的的体外药物释放
取稀释后的实施例4中所制备的单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的自组装纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN和碳单键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的自组装纳米粒Ce6&DHA-C-DHA@CMN(300μg/mL Ce6)分别置于透析袋(MWCO=3500Da)中,细胞外液根据组别不同分别为PBS、含2mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)的PBS、含100μM NADPH的PBS、含100μM NADPH的PBS(氮气保护),光照组额外给予激光照射8min。在0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h时间点分别取出20μL,另加入等体积培养液补足。加入100μL甲醇对取出的培养液进行破乳,0.22μm滤膜过滤,通过HPLC进样测定DHA-S-DHA或DHA-C-DHA的释放量。结果如图12所示,在没有激光照射的情况下,几乎没有药物释放出来,当激光照射后有大量药物释放,说明了制剂的光响应性,而对照组Ce6&DHA-C-DHA@CMN因不具有ROS敏感性的连接键,经激光照射后,仅由于壳材料的缺氧响应性,出现部分药物释放。当加入NAC(ROS抑制剂)孵育后再进行光照处理,48h的释放量减少到49.9%,此时主要依靠壳材料的缺氧响应性进行释药。从之后的模拟缺氧环境组也可以看出来,在缺氧条件下的药物释放量大于常氧条件,证实了制剂具备光引发的缺氧和ROS响应性释放特性。
实施例10
三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒与血浆蛋白孵育后形成蛋白冕的蛋白质谱分析
取0.5mL实施例4中所制备的三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒和0.5mL新鲜大鼠血浆37℃孵育1h,30000rpm离心后PBS洗涤三次,得到结合血浆蛋白的纳米粒,进行蛋白质谱分析。图13a显示Ce6&DHA-S-DHA@CMN组结合白蛋白的百分比最大,证实了其对白蛋白的选择性,从图13b可以看到,由于共价结合的白蛋白对其他蛋白的吸附抑制作用,屏蔽了部分杂蛋白的结合,其结合蛋白种类也减少,进一步降低了被清除的几率。
实施例11
游离Ce6和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒对小鼠肺癌细胞LLC的光毒性和对人正常肝细胞L02的暗毒性
将处于对数生长期的LLC或L02细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中,培养至细胞汇合度达70%。将梯度浓度的实施例4中所制备的纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN或游离光敏剂Ce6分别加入各孔中,设置三个复孔,每孔100μL。孵育4h后,激光照射细胞1min,再经过20h孵育后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,37℃继续孵育4h。随后弃去上清液,加入100μLDMSO溶解,用酶标仪在492nm下测定吸光度,测定制剂或游离药物的光毒性,暗毒性实验省略了光照一步,其他操作同上。对LLC细胞的光毒性结果如图14a所示,与游离Ce6组相比,三种复合纳米粒均具有更强的细胞毒性,且Ce6&DHA-S-DHA@CMN纳米粒的细胞毒性最强,说明了DHA-S-DHA化疗和Ce6光动力疗法能够发挥协同抗肿瘤效果。从对L02细胞的暗毒性的结果(图14b)来看,游离Ce6和三种制剂均没有明显暗毒性,其中,Ce6&DHA-S-DHA@CMN对L02正常细胞的毒性是最小的,证明了光动力疗法的光选择性,降低了对正常组织的毒性。
实施例12
单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN对LLC细胞的暗毒性
将处于对数生长期的LLC以5000个/孔的密度接种于96孔板中,培养至细胞汇合度达70%。将梯度浓度的实施例4中所制备的纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN加入各孔中,设置三个复孔,每孔100μL,缺氧组放入缺氧培养箱培养,常氧组放入普通细胞培养箱培养。孵育4h后,激光照射细胞1min,再经过20h孵育后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,37℃继续孵育4h。随后弃去上清液,加入100μL DMSO溶解,用酶标仪在492nm下测定吸光度,测定纳米粒在缺氧和常氧条件下对LLC细胞的暗毒性。暗毒性结果(图15)显示Ce6&DHA-S-DHA@CMN在缺氧条件下对LLC细胞的毒性明显强于常氧条件,从侧面说明了缺氧条件有助于壳材料的脱落、药物的释放,提高了细胞毒性。
实施例13
游离Ce6和单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN的细胞摄取实验
将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞LLC细胞以5×104个/mL的密度接种于共聚焦皿中,37℃培养24h后,将游离Ce6和实施例4中所制备的Ce6&DHA-S-DHA@CMN纳米粒(相当于10μg/mL Ce6)加入,分别培养0.5h和4h,PBS清洗细胞3次,4%多聚甲醛固定10min,加入1mLDAPI染液进行细胞核染色,10min后用PBS再次清洗细胞3次,通过激光共聚焦显微镜观察,DAPI采用405nm激发,Ce6采用640nm激发。细胞摄取实验结果如图16所示,在0.5h和4h两个时间点,相比于游离Ce6组,Ce6&DHA-S-DHA@CMN纳米粒孵育的细胞内均呈现出更强的红色荧光,图17中的荧光定量结果和定性结果一致,说明其摄取效果明显优于游离光敏剂Ce6,具有更高的细胞摄取效率。
实施例14
双氢青蒿素二聚体包载Ce6和尼罗红(Nile Red,NR)形成的复合纳米粒Ce6&NR&DHA-S-DHA@CMN、Ce6&NR&DHA-C-DHA@CMN和Ce6&NR&DHA-S-DHA@TPGS的细胞内药物释放实验
称取尼罗红10mg,用DMSO配制成10mg/mL。按照实施例4中负载Ce6的方法同时负载Ce6和NR(0.3%,w/w),分别制备复合纳米粒Ce6&NR&DHA-S-DHA@CMN、Ce6&NR&DHA-C-DHA@CMN和Ce6&NR&DHA-S-DHA@TPGS。将处于对数生长期的LLC细胞以5×104个/mL的密度接种于共聚焦皿中,培养至细胞汇合度达70%。将适量复合纳米粒Ce6&NR&DHA-S-DHA@CMN、Ce6&NR&DHA-C-DHA@CMN和Ce6&NR&DHA-S-DHA@TPGS(相当于0.6μg/mL Ce6)分别加入,孵育4h后,PBS洗涤3次,激光照射细胞1min,放入细胞培养箱中孵育2h,4%多聚甲醛固定15min,PBS清洗3次,加入DAPI染液进行细胞核染色10min,PBS再次清洗3次,通过激光共聚焦显微镜观察,DAPI采用405nm激发,尼罗红采用561nm激发。NAC加光照组在给药前提前加入2mM NAC孵育20min,常氧组和缺氧组分别放入普通细胞培养箱和缺氧培养箱培养。从图18可以看到,在激光照射下,有大量药物释放,而在提前加入NAC孵育后荧光明显减弱,说明光动力疗法产生大量ROS,触发制剂的ROS响应性。而对照制剂组Ce6&DHA-C-DHA@CMN在光照后仅由于缺氧程度加重,荧光强度稍有增强。从图19可以看到,缺氧条件下的Ce6&DHA-S-DHA@CMN组的药物释放强于常氧条件,而Ce6&DHA-S-DHA@TPGS组常氧和缺氧条件下的药物释放没有明显差异,证实了壳材料CMN的缺氧响应性。
实施例15
单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN经激光照射后诱导细胞缺氧
将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞LLC细胞以5×104个/mL的密度接种于共聚焦皿中,37℃培养24h后,将实施例4中所制备的Ce6&DHA-S-DHA@CMN纳米粒(相当于1.5μg/mLCe6)加入,并设置加入空白DMEM培养基的对照组,孵育4h后,用PBS洗两次,加入缺氧探针Image-iTTM Green Hypoxia Reagent,孵育30min,PBS洗2次,激光照射1min后通过激光共聚焦显微镜观察,采用488nm作为激发波长,520nm作为发射波长。结果如图20所示,在激光照射后,细胞出现明显绿色荧光,说明光动力过程消耗大量氧气,加重了肿瘤微环境缺氧程度,有利于壳材料上缺氧响应性2-硝基咪唑的转变,使壳材料不稳定而从制剂表面脱落。
实施例16
游离Ce6、DHA-S-DHA及其混合物和单硫醚键连接的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA@CMN光照后的ROS产生情况
将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞LLC细胞以5×104个/mL的密度接种于共聚焦皿中,37℃培养24h后,将游离Ce6、DHA-S-DHA及其混合物和实施例4中所制备的Ce6&DHA-S-DHA@CMN纳米粒(相当于1.5μg/mL Ce6)加入,4h后用激光照射1min,继续培养12h,PBS清洗细胞3次,用DCFH-DA探针孵育20min,用PBS再次清洗细胞3次,通过激光共聚焦显微镜观察,采用488nm激发。结果如图21所示,在没有光照条件下,各组几乎没有ROS产生,而在光照条件下,Ce6、DHA-S-DHA&Ce6和Ce6&DHA-S-DHA@CMN纳米粒组均产生较强的绿色荧光,证明了光动力疗法通过激光照射后产生ROS对肿瘤细胞造成杀伤。
实施例17
游离DHA-S-DHA和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的药动学实验
实验开始前将雄性SD大鼠禁食12h,自由饮水。将游离DHA-S-DHA、实例4中制备的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA、Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS(相当于5mg/kg Ce6)通过尾静脉注射SD大鼠,分别于给药后0、0.083、0.16、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24h经大鼠眼底静脉丛取血约0.3mL,置于1.5mL肝素化离心管中,8000r/min离心10min,分离血浆,加入过氧化氢和甲酸作为稳定剂,经过前处理后通过LC-MS/MS进样分析。一周后对同一批鼠进行二次给药、取血和药动学测定,监测制剂是否具有加速血液清除(accelerated blood clearance,ABC)现象。从图22可以看出,Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS组具有较长的循环时间,在12h时血液中仍存在大量游离DHA-S-DHA,而Ce6组和Ce6&DHA-S-DHA组在4h时几乎被完全代谢掉。从前后间隔一周的两次药代动力学结果(图23)来看,Ce6&DHA-S-DHA@TPGS组在第二次注射后血药浓度出现明显下降,这是由于在第一次注射时小鼠体内PEG抗体的出现,而Ce6&DHA-S-DHA@CMN前后两次注射时在12h内均保持较高血药浓度,避免了ABC现象。
实施例18
游离Ce6和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的活体成像实验
将游离Ce6、实例4中制备的双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒Ce6&DHA-S-DHA、Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS(相当于5mg/kg Ce6)通过尾静脉注射C57BL/6荷瘤黑鼠,于注射后4、24h解剖分离出小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤,通过活体成像仪拍摄荧光图像,观察纳米粒的组织分布。结果如图24所示,相比于游离Ce6组和Ce6&DHA-S-DHA组,Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS组在肿瘤部位有更多药物富集,且在24h时仍有大量药物富集于肿瘤部位,证实了Ce6&DHA-S-DHA@CMN和Ce6&DHA-S-DHA@TPGS纳米粒具有良好的肿瘤靶向性和长循环效果。
实施例19
游离Ce6、DHA-S-DHA和三种双氢青蒿素二聚体包载Ce6形成的复合纳米粒的体内药效学实验将C57BL/6荷瘤黑鼠分成7组,分别为生理盐水、DHA-S-DHA、Ce6、Ce6&DHA-S-DHA、Ce6&DHA-S-DHA@TPGS、Ce6&DHA-S-DHA@CMN非光照组和光照组(相当于5mg/kg Ce6),每组5只,间隔两天尾静脉给药一次,共给药5次,每两天测量肿瘤体积。结果如图25所示,Ce6&DHA-S-DHA@CMN光照组的肿瘤杀伤效果最好,可能与其良好的肿瘤靶向性和长循环效果有关,Ce6&DHA-S-DHA@TPGS组次之,而Ce6&DHA-S-DHA组因为纳米粒表面没有壳材料的保护,容易被血液循环清除,半衰期较短,对肿瘤的治疗效果较差。
Claims (6)
1.一种白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒,其特征在于:制备方法是将壳材料溶于水中,将二聚体前药分子与光敏剂的混合物溶于有机溶剂中后滴加到上述水溶液中,透析除去有机溶剂,即得纳米粒,所述壳材料是在含活性氨基的聚合物上修饰6-(2-硝基咪唑)己酸和6-马来酰亚胺基己酸,
所述二聚体前药分子由两分子具有抗肿瘤效果的药物分子通过ROS敏感键连接而成;
所述的具有抗肿瘤效果的药物分子为10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱或双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA);
所述的光敏剂为酞菁锌、二氢卟吩e6(Chlorin e6, Ce6);
所述二聚体前药分子通过自组装包载光敏剂。
2.根据权利要求1所述的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒,其特征在于:所述的ROS敏感键为草酸酯键、单硫醚键、单硒键、二硫键、二硒键、间隔二硫醚键。
3.权利要求1所述的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒的制备方法,其特征在于:将壳材料溶于水中,将二聚体前药分子与光敏剂的混合物溶于有机溶剂中后滴加到上述水溶液中,透析除去有机溶剂,即得纳米粒,所述壳材料是在含活性氨基的聚合物上修饰6-(2-硝基咪唑)己酸和6-马来酰亚胺基己酸。
4.根据权利要求3所述的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒的制备方法,其特征在于:所述的有机溶剂为二甲基亚砜、乙醇、四氢呋喃。
5.根据权利要求3所述的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒的制备方法,其特征在于:所述含活性氨基的聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺。
6.权利要求1所述的白蛋白结合型缺氧氧化双响应性复合纳米粒在制备抗肿瘤药物中的用途。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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