CN115703801A - 一种光敏剂、光敏剂前药及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光敏剂、光敏剂前药及其制备方法和应用，涉及光动力疗法领域。该化合物能够靶向肿瘤细胞中的多胺转运系统，在pH 7.4的血液循环系统和正常组织细胞中没有暗毒性和光毒性中，而在肿瘤酸性的细胞外液(pH 6.5–6.8)和癌细胞溶酶体(pH 4.5–5.0)中光照下能够产生活性氧，有光毒性。该化合物可以用作光动力治疗中的光敏剂前药，在实验小鼠体内有效抑制肿瘤体积的增长。该光敏剂前药具有如下结构：
Description
技术领域
本发明涉及光动力疗法领域，是一种能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的材料及其制备方法。
背景技术
光动力疗法(PDT)是一种安全且微创的疗法，目前作为癌症治疗的有效替代方案正逐渐获得认可[参见：M.Triesscheijn,P.Baas,J. H.M.Schellens,F.A.Stewart,Oncologist 2006,11,1034-1044]。光动力疗法主要是使用特定波长的光照射光敏剂以产生活性氧(ROS)，尤其是单线态氧，以此杀死癌细胞。因此，光敏剂是光动力疗法中最关键的组成部分。由于产生的活性氧对所有细胞都具有杀伤力，为避免产生治疗过程中的副作用，光敏剂的肿瘤靶向性就尤为重要。通常，光敏剂通过在肿瘤组织中的适度积累来获得初步的选择性，在肿瘤部位进行选择性的光照提供了进一步的选择性[参见：N.Solban,I.Rizvi,T. Hasan,Laser Surg Med 2006,38,522-531]。提高光敏剂的肿瘤靶向性可以选择性的减少非靶组织中的背景积累，从而抑制包括水肿、荨麻疹等副作用。理想的光敏剂在非肿瘤组织中应该是无活性的，而在肿瘤组织中呈现可以产生活性氧的活性形式。这些可以通过修饰经典的靶向基团和前药策略来实现[参见：F.Borgia,R.Giuffrida,E.Caradonna, M.Vaccaro,F.Guarneri,S.P.Cannavo,Biomedicines 2018,6.]。通常，这些策略都是利用了肿瘤组织和正常组织之间的生理/形态异质性。经典的靶向策略包括主动靶向和被动靶向。被动靶向策略主要是纳米类载体、胶束制剂等常用的高渗透长滞留效应(Enhanced Permeability and Retention effect，EPR)，但其存在局限性(早期肿瘤没有EPR效应)[参见：D.Peer,J.M.Karp,S.Hong,O.C.FaroKHzad,R.Margalit,R. Langer,NatNanotechnol 2007,2,751-760.]。而对于主动靶向，一般是通过将具有靶向性的配体与光敏剂或载体相结合，这些修饰有靶向性配体的光敏剂或载体可以在肿瘤组织中过表达，以达到靶向性[参见： N.Shirasu,S.O.Nam,M.Kuroki,Anticancer Res 2013,33,2823-2831.]。最近，使用可激活的PDT试剂作为光敏剂的前药引起了人们的关注。前药可以利用肿瘤组织和正常组织之间生理/形态特异性而选择性的在肿瘤组织中激活而转变成具有光动力治疗能力的光敏剂。这种策略不仅可以实现对肿瘤组织的靶向性治疗，还可以减少治疗过程中的副作用[参见：C.J.Wang,J.G.Delcros,L.Cannon,F.Konate,H.Carias,J.Biggerstaff,R.A.Gardner,O.Phanstiel,J Med Chem 2003,46, 5129-5138；R.A.Gardner,J.G.Delcros,F.Konate,F.Breitbeil,B.Martin, M.Sigman,M.Huang,O.Phanstiel,J Med Chem 2004,47,6055-6069；Y. G.Wang,K.J.Zhou,G.Huang,C.Hensley,X.N.Huang,X.P.Ma,T. Zhao,B.D.Sumer,R.J.DeBerardinis,J.M.Gao,NatMater 2014,13, 204-212；R.Perera,S.Stoykova,B.N.Nicolay,K.N.Ross,J.Fitamant,M.Boukhali,J.Lengrand,V.Deshpande,M.K.Selig,C.R.Ferrone,J. Settleman,G.Stephanopoulos,N.J.Dyson,R.Zoncu,S.Ramaswamy,W. Haas,N.Bardeesy,Nature2015,524,361-U251.]。然而，目前的大多数策略仍然基于内源性靶向受体或过表达的酶，这些策略可能会受到肿瘤异质性和肿瘤相关刺激物在健康细胞上的不良表达的阻碍，因此，设计一种适合多种肿瘤的通用策略仍然极具挑战性。一种可选的策略是针对肿瘤无处不在的特征——比如酸性细胞外液——而不是内源性的生物标志物。然而设计一种能够在弱碱性(pH 7.4)的血液循环系统中无光动力活性并且能够在肿瘤酸性细胞外液中激活的光敏剂前药极具挑战。
发明内容
本发明内容是设计并提供了一种能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的材料及其制备方法。
在本发明中，我们巧妙的设计了一类含精胺、氟硼和碘原子的非共轭体系化合物，它在pH 7.4的血液循环系统中几乎没有光动力活性，精胺官能团使分子能够靶向肿瘤组织升高的多胺转运系统，使化合物在肿瘤组织中富集。在肿瘤组织中，化合物被肿瘤微环境中的酸性细胞外液(pH 6.5–6.8)中、癌细胞的溶酶体(pH 4.5–5.0)中激活，具有光动力活性，能够在光照下产生单线态氧，进而选择性地杀伤癌组织和癌细胞，减少对正常组织和细胞的伤害。
为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种光敏剂前药,具有如下结构：
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：一种光敏剂，具有如下结构：
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的光敏剂的制备方法，等摩尔量的丙二酸二乙酯、1H-吡咯-2-甲醛、盐酸甲胺与醋酸钠同时加入到甲醇中,反应2-4小时，得到黄色油状化合物；将上述黄色油状化合物与苯甲醛以摩尔比1：2的比例在氮气保护下溶解在干燥的二氯甲烷中，用铝箔覆盖，同时加入三氟乙酸(TFA)作为催化剂，催化剂用量为苯甲醛摩尔量的1-5倍，在60℃-100℃温度下搅拌48-96小时，然后加入与苯甲醛等摩尔量的2，3-二氯-5，6- 二氰基-1，4苯醌在室温下搅拌30-60分钟进行氧化；后立即加入过量的三乙胺和三氟化硼乙醚(，回流12-48小时，纯化后用二氯甲烷/ 正己烷进行重结晶，得到具有蓝色金属光泽的固体；将上述具有蓝色金属光泽的固体溶解在超干乙腈中，室温搅拌下加入三氟乙酸作为催化剂，催化剂用量为蓝色金属光泽固体摩尔量的5-10倍和过量的N- 碘代丁二酰亚胺；80℃-120℃加热回流1.5-5小时后恢复室温；提纯并用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到墨绿色有金属光泽的目标化合物光敏剂1；反应路线如下：
了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的光敏剂前药的制备方法,所述光敏剂1与精胺在溶液中等比例发生反应制得光敏剂前药；反应路线如下:
优选的，包括以下步骤:等摩尔量的丙二酸二乙酯、1H-吡咯-2- 甲醛、盐酸甲胺与醋酸钠同时加入到甲醇中室温反应2-4小时，反应结束后，用二氯甲烷进行萃取，萃取结束后，用无水硫酸钠进行干燥，通过硅胶色谱柱使用二氯甲烷作为溶剂进行纯化，得到黄色油状化合物；
将上述黄色油状化合物与苯甲醛以摩尔比1：2的比例在氮气保护下溶解在干燥的二氯甲烷中，用铝箔覆盖，同时加入三氟乙酸(TFA)作为催化剂，催化剂用量为苯甲醛摩尔量的1-5倍，在60℃-100℃温度下搅拌48-96小时，然后加入与苯甲醛等摩尔量的2，3-二氯-5，6- 二氰基-1，4苯醌在室温下搅拌30-60分钟进行氧化；后立即加入过量的三乙胺和三氟化硼乙醚，回流12-48小时，得到的蓝色溶液(有强粉色荧光)用水及饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，通过硅胶色谱柱使用含8％乙酸乙酯的二氯甲烷作为溶剂进行纯化；纯化后用二氯甲烷/正己烷进行重结晶，得到具有蓝色金属光泽的固体；
将上述具有蓝色金属光泽的固体溶解在超干乙腈中，室温搅拌下加入三氟乙酸作为催化剂，催化剂用量为蓝色金属光泽固体摩尔量的 5-10倍和过量的N-碘代丁二酰亚胺；80℃-120℃加热回流1.5-5小时后恢复室温。用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤3次，洗掉多余N-碘代丁二酰亚胺，后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过展开剂二氯甲烷使用硅胶色谱柱提纯；用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到墨绿色有金属光泽的光敏剂1；
取上述墨绿色有金属光泽的光敏剂1溶解于二甲亚砜中，溶液颜色为蓝紫色，向其中加入等摩尔的精胺水溶液，混合均匀，待溶液颜色变为近无色时停止反应，将溶液冻干后得到目标产物光敏剂前药 1-spm。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：一种所述药物组合物，包括所述的光敏剂前药化合物和药学上可接受的载体。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：一种所述的药物组合物，由活性成分为所述的光敏剂前药，以及药学上可接受的药用辅料组合制成临床适用的注射剂、冻干粉针剂。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的光敏剂前药化合物在制备用于光动力诊疗的药物中的应用。
一种能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物，名为1-spm,它有如下结构：
一种制备上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm的方法,它包括下列步骤:
丙二酸二乙酯(1.59mL)、1H-吡咯-2-甲醛(1.05g)、盐酸甲胺(0.36 g)与醋酸钠(0.89g)同时加入到50mL甲醇中室温反应2-4h，反应结束后，用二氯甲烷进行萃取，萃取结束后，用无水硫酸钠进行干燥，通过硅胶色谱柱使用二氯甲烷作为溶剂进行纯化，得到黄色油状化合物。此黄色油状化合物(480mg)与苯甲醛(200μL)在氮气保护下溶解在干燥的二氯甲烷(50mL)中，用铝箔覆盖，同时加入0.5mL三氟乙酸(TFA)作为催化剂，在60℃温度下搅拌48h，然后加入2， 3-二氯-5，6-二氰基-1，4苯醌(460mg)在室温下搅拌30min进行氧化。加入三乙胺(3mL)和三氟化硼乙醚(10mL)，回流12h，得到的蓝色溶液(有强粉色荧光)用水及饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，通过硅胶色谱柱使用含8％乙酸乙酯的二氯甲烷作为溶剂进行纯化。纯化后用二氯甲烷/正己烷进行重结晶，得到具有蓝色金属光泽的晶体。将此具有蓝色金属光泽的晶体(1.2g)溶解在超干乙腈中，室温搅拌下加入三氟乙酸(0.5mL)和N-碘代丁二酰亚胺(2.2g)。 80℃加热回流1.5h后恢复室温。用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤3次，洗掉多余NIS，后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过展开剂二氯甲烷使用硅胶色谱柱提纯。用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到墨绿色有金属光泽的晶体。取此墨绿色有金属光泽的晶体12mg溶解于10mL二甲亚砜中，溶液颜色为蓝紫色，向其中加入10μL精胺水溶液(1M)，混合均匀，待溶液颜色变为近无色时停止反应，将溶液冻干后得到目标产物。
本发明的有益效果
本发明与现有技术相比,其显著优点是：发明了一种全新的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的材料。
可激活的光敏剂前药可以利用肿瘤组织和正常组织之间生理/形态特异性而选择性的在肿瘤组织中激活而转变成具有光动力治疗能力的光敏剂。这种策略不仅可以实现对肿瘤组织的靶向性治疗，还可以减少治疗过程中的副作用。例如，由于mTORC1复合物的激活会促进细胞生长，而将mTORC1富集到溶酶体表面对其激活至关重要。因此，在一些快速增殖的肿瘤细胞中会发现溶酶体的丰度会增加。例如，与正常的胰腺细胞相比，胰腺导管腺癌中溶酶体的丰度要增加很多(参见：R.Perera,S.Stoykova,B.N.Nicolay,K.N.Ross,J.Fitamant,M. Boukhali,J.Lengrand,V.Deshpande,M.K.Selig,C.R.Ferrone,J.Settleman,G.Stephanopoulos,N.J.Dyson,R.Zoncu,S.Ramaswamy,W. Haas,N.Bardeesy.Nature.2015,524,361-U251；Y.Rabanal-Ruiz,V.I.Korolchuk.Int.J.Mol.Sci.2018,19.)。开发靶向溶酶体的光敏剂，一方面可以通过抑制mTORC1的激活来有效抑制肿瘤的生长，另一方面，由于相对于肿瘤细胞，正常细胞中溶酶体含量较少，从而导致对正常细胞的伤害较小。另一方面，肿瘤细胞表面过表达的多胺转运系统是另外一个靶向目标。多胺(精胺、亚精胺等)是关键的细胞生长因子，对细胞增殖、分化、染色质构象维持等具有重要作用。生理条件下，细胞内多胺水平受到细胞膜上的多胺转运系统的精密调控，以维持细胞周期的正常运转(参见：C.J.Wang,J.G.Delcros,L.Cannon,F.Konate,H.Carias,J.Biggerstaff,R.A.Gardner,O.Phanstiel.J.Med. Chem.2003,46,5129-5138；R.A.Gardner,J.G.Delcros,F.Konate,F. Breitbeil,B.Martin,M.Sigman,M.Huang,O.Phanstiel；J.Med.Chem. 2004,47,6055-6069；C.Moinard,L.Cynober,J.P.deBandt.；Clin.Nutr. 2005,24,184-197.)。肿瘤的发生发展过程中，往往伴随着多胺代谢异常。因为肿瘤细胞的增殖需要细胞内高水平的多胺以促进DNA复制、蛋白质合成和肿瘤组织血管的生成，导致了肿瘤细胞膜表面多胺转运系统的高表达，方便其从外界摄取多胺进入细胞中进行增殖活动。
在本发明中，利用肿瘤组织与正常组织之间的差异性，在光敏剂前药分子上修饰精胺基团靶向肿瘤组织表面过表达的多胺转运系统。另外，针对肿瘤组织微环境的弱酸性和肿瘤组织的细胞中丰度增加的溶酶体，本发明的光敏剂前药可以在酸性条件下转化成光敏剂，从而使具有pH敏感的光敏剂前药在进入肿瘤细胞后，会因为溶酶体内的低pH而迅速转换成具有单线态氧产生能力的光敏剂，优先对溶酶体产生破坏，进而杀伤整个癌细胞。
本发明中的光敏剂前药可以制成注射液或者冻干剂进行使用，并已在肿瘤细胞和荷瘤小鼠中验证了其光动力治疗效果。
综上所述，本发明中的光敏剂前药可以在组织和细胞两个层面提供双靶向功能，并且该材料在血液循环系统中几乎无光动力活性，只在肿瘤组织和癌细胞中选择性地被激活，进一步降低了对正常组织的伤害，减少对机体的副作用。
附图说明
图1为本发明的光敏剂1的1H NMR谱图；
图2为本发明的光敏剂1的高分辨质谱谱图；
图3为本发明的光敏剂前药的化合物1-spm的1H NMR谱图；
图4为本发明的光敏剂前药的化合物1-spm的高分辨质谱谱图；
图5为本发明的光敏剂前药1-spm及光敏剂1之间可逆反应的示意图；
图6为本发明的光敏剂前药1-spm及光敏剂1之间可逆反应的紫外吸收光谱；
图7为本发明的光敏剂前药1-spm随pH变化而变化的紫外吸收光谱；
图8为本发明的光敏剂前药1-spm不能产生单线态氧的紫外吸收光谱；
图9为本发明的光敏剂1产生单线态氧能力的紫外吸收光谱；
图10为本发明的光敏剂前药1-spm的光稳定性；
图11为本发明的光敏剂1-spm的光稳定性；
图12为本发明的光敏剂前药1-spm的水溶性；
图13为本发明的光敏剂前药1-spm在4T1细胞中的光毒性和暗毒性；
图14为本发明的光敏剂前药1-spm在细胞中产生单线态氧；
图15为本发明的光敏剂前药1-spm在光动力治疗过程中杀死癌细胞；
图16为本发明的光敏剂前药1-spm在荷瘤小鼠体内具有肿瘤靶向性；图17为本发明的光敏剂前药1-spm在荷瘤小鼠体内的光动力治疗效果。
具体实施方式
实施例1：一种制备上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂1及光敏剂前药1-spm的合成：
丙二酸二乙酯(1.59mL)、1H-吡咯-2-甲醛(1.05g)、盐酸甲胺(0.36 g)与醋酸钠(0.89g)同时加入到50mL甲醇中室温反应2-4h，反应结束后，用二氯甲烷进行萃取，萃取结束后，用无水硫酸钠进行干燥，通过硅胶色谱柱使用二氯甲烷作为溶剂进行纯化，得到黄色油状化合物。此黄色油状化合物(480mg)与苯甲醛(200μL)在氮气保护下溶解在干燥的二氯甲烷(50mL)中，用铝箔覆盖，同时加入0.5mL三氟乙酸(TFA)作为催化剂，在60℃温度下搅拌48h，然后加入2， 3-二氯-5，6-二氰基-1，4苯醌(460mg)在室温下搅拌30min进行氧化。加入三乙胺(3mL)和三氟化硼乙醚(10mL)，回流12h，得到的蓝色溶液(有强粉色荧光)用水及饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，通过硅胶色谱柱使用含8％乙酸乙酯的二氯甲烷作为溶剂进行纯化。纯化后用二氯甲烷/正己烷进行重结晶，得到具有蓝色金属光泽的晶体。将此具有蓝色金属光泽的晶体(1.2g)溶解在超干乙腈中，室温搅拌下加入三氟乙酸(0.5mL)和N-碘代丁二酰亚胺(2.2g)。80℃加热回流1.5h后恢复室温。用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤3次，洗掉多余NIS，后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过展开剂二氯甲烷使用硅胶色谱柱提纯。用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到墨绿色有金属光泽的光敏剂1。光敏剂1的高分辨质谱(图1)及1H NMR谱图(图2)：计算m/z[M]-为1111.8002，测得1111.8006。1H NMR(500 MHz,CDCl2)δ7.79(s,2H),7.70–7.65(m,3H),7.38–7.26(m,2H), 4.41–4.36(m,4H),4.23–4.18(m,4H),1.40(t,J＝7.1Hz,6H),1.19(t, J＝7.1Hz,6H)
取光敏剂1的固体12mg溶解于10mL二甲亚砜中，溶液颜色为蓝紫色，向其中加入10μL精胺水溶液(1M)，混合均匀，待溶液颜色变为近无色时停止反应，将溶液冻干后得到目标产物光敏剂前药 1-spm。产物为淡黄色粉末。高分辨质谱(图3)及1H NMR谱图(图4)：计算m/z[M]-为1313.0081，测得1313.0084。1H NMR(500MHz, CDCl2)δ8.12(s,1H),7.52(s,2H),7.19(d,J＝19.6Hz,3H),4.23–4.19 (m,4H),3.36(s,4H),2.83–2.58(m,10H),1.31(s,12H).
实施例2：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm与具有单线态氧产生能力的光敏剂1之间可以互相转化(图5)。
在具有单线态氧产生能力的光敏剂1的二氯甲烷溶液中加入少量精胺，1会迅速反应生成不具有单线态氧产生能力的前光敏剂1-spm。而在1-spm的溶液中加入少量的三氟乙酸，1-spm会转变为1，该反应是可逆的(图6)。由于精胺直接反应在光敏剂1的中心碳位置(图5)，导致共轭体系断裂，而不能在激光照射下产生单线态氧。
实施例3：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm随pH变化的电子吸收光谱(图7)。
在四氢呋喃、水(v/v＝1：1)的混合溶液中，在pH为8.0时，1-spm 的电子吸收光谱的吸收峰为375nm，随着pH的下降，375nm吸收峰逐渐下降，在583nm出现一个新的吸收峰。在pH为2时，583nm 处的吸光度达到最大。本实施例说明了1-spm在酸化条件下可以由非共轭状态转变为共轭状态。
当光敏剂前药1-spm在肿瘤部位富集时，而由于肿瘤组织液为偏酸性(pH＝6.5–6.8),会使部分1-spm在低pH下转变为光敏剂1以达到在光照下杀伤肿瘤细胞的作用。
实施例4：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm及光敏剂1的单线态氧产生能力(图8、图9)。
在二氯甲烷中测试了化合物1-spm的单线态氧产生能力。使用1,3 二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕获剂。当有机溶液中产生单线态氧时，作为单线态氧捕获剂的DPBF在415nm处的紫外吸收会下降。如图8所示，经过激光器(590nm，100mW)照射不同时间后，采集一次紫外吸收数据。在经过光照后，DPBF在415nm处的紫外吸收几乎无变化这说明1-spm在光照下不能够产生单线态氧。
同样在二氯甲烷中采用同样的方法测试共轭状态的光敏剂1的单线态氧产生能力。如图9所示，使用激光器(590nm，100mW)照射不同时间后，DPBF在415nm处的紫外吸收不断降低，在100秒后到达底端，说明光敏剂1在光照下可以产生单线态氧。
实施例5：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm的光稳定性和水溶性及光敏剂1光稳定性(图10、图11)。
因为在进行光动力治疗时，往往要进行长时间的光照，因此光敏剂的光稳定性非常重要。使用激光光源(590nm，500mW)持续照射二氯甲烷中的前光敏剂1-spm及光敏剂1。在3小时内，光敏剂前药1-spm及光敏剂1的紫外吸收光谱无明显变化，说明这两种化合物具有良好的光稳定性。
实施例6：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药1-spm的水溶性(图12)。
为了探索将前光敏剂1-spm制成注射剂的可能性，我们对前光敏剂1-spm的水溶性做了如下测试：在不同含水量的四氢呋喃/水溶液中加入同浓度的1-spm并分别测试紫外吸收光谱。在含水量不同的四氢呋喃溶液中，1-spm的紫外吸收光谱没有明显变化，显示了其具有良好的水溶性。
实施例7：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm的光毒性及暗毒性(图13)。
光敏剂前药1-spm在细胞中，可以在细胞中的酸性细胞器，如溶酶体中转变成光敏剂1，在光照下，可以起到杀伤癌细胞的作用。在接种了4T1细胞并已长至对数期的96孔板中，加入不同浓度的1-spm，共孵育30分钟后，使用激光器(590nm，500mW)每孔照射10分钟后，放入细胞培养箱继续培养12小时，后用MTT法测试孔板中的细胞活力。另外，在不进行光照的相同条件的96孔板中测试1-spm 的暗毒性作为对照。
经过光照后，根据1-spm浓度的不同，对细胞活力有不同程度的影响，细胞半数致死浓度(IC50)为2.11微摩尔。未经过光照的细胞中，不同浓度的1-spm均为显示出明显的细胞毒性，说明1-spm的暗毒性较低，生物相容性较好。
实施例8：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm在细胞中产生活性氧(图14)。
使用经典的细胞内活性氧荧光探针DCFH-DA作为检测试剂。 DCFH-DA本身没有荧光且可以通过细胞膜进入细胞内，进入细胞后，可以被细胞内酯酶水解成为同样没荧光的DCFH，因为DCFH不能通过细胞膜进而可以对细胞中的活性氧进行标记。细胞中的活性氧可以使无荧光发射的DCFH氧化为有绿色荧光发射的DCF。将1-spm与 10μM的DCFH-DA在细胞中共孵育30分钟后，放到激光共聚焦显微镜下观察。结果如图14所示，使用590nm(500mW)的激光器照射 1min后，细胞中即出现了绿色荧光，说明使用激光器照射1分钟即可在细胞中产生单线态氧。使用590nm(500mW)的激光器照射10 分钟后，细胞中的绿色荧光强度有所增强，说明随着激光器照射时间的增加，细胞中单线态氧的产量也随之增加。实施例8说明了1-spm 在细胞中能够在光照条件下产生活性氧。
实施例9：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm在光动力治疗过程中杀死癌细胞(图15)。
在使用1-spm进行光动力治疗过程中，我们使用钙黄绿素(Calcein AM)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)对不同组的细胞进行了活/死细胞染色。死细胞会发出红色荧光，活细胞则发出绿色荧光。结果如图15所示，未加入1-spm的对照组及未经过激光器照射的加药组均观察到有强绿色的荧光发射且无红色荧光，说明细胞活性良好。而经过590nm(500mW)激光照射10min后的加入1-spm的分组中，绿色荧光强度大大降低，且能够清晰的观察到大量的在细胞核处的红色荧光，这说明细胞出现大量的死亡，PI才可以通过死亡细胞已经不再完整的细胞膜而进入到细胞核中，从而使细胞核发出红色荧光。而在活细胞中，因为PI无法通过完整的细胞膜，所以活细胞中的细胞核不会被PI染成红色。另一方面，经过维生素C(可以清除单线态氧)处理过的光照加药组中，并未观察到细胞核处的红色荧光，这说明光敏剂是通过产生单线态氧的方式导致细胞死亡的。而具有还原性的维生素C可以清除细胞中的活性氧从而避免细胞的死亡。实施例9证明了 1-spm在光动力治疗过程中能够产生单线态氧并杀死癌细胞。
实施例10：注射液的制备，处方如下(以1000支处方量计)：
取实施例1中的光敏剂1 100mg，用二甲基亚砜100mL溶解，后加入精胺20mg制成光敏剂前药1-spm，加注射用水至1000mL。混合均匀，过滤，将所得溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中，制成1 mL/瓶的注射液，活性成分含量为0.12mg/瓶
实施例11：上述光敏剂前药的化合物1-spm在荷瘤小鼠体内的靶向性(图16)。
在BALB/c小鼠腋下种入4T1乳腺癌肿瘤，并在肿瘤长到100mm3后在小鼠尾静脉注入实施例10中的注射液，后在不同时间点放入到小动物成像仪下拍照观察，如图16所示，在注射4h后，1-spm即在肿瘤部位富集(图16)。实施例11说明1-spm在实验动物体内具有肿瘤靶向性。
实施例12：上述的能够靶向肿瘤组织并且在肿瘤组织的酸性环境和癌细胞的溶酶体中激活的光敏剂前药的化合物1-spm在荷瘤小鼠体内的光动力治疗(图17)。
将移植了4T1乳腺癌肿瘤且肿瘤大小达到100mm3时的BALB/c 小鼠作为研究对象并按照磷酸盐缓冲溶液、加药组和加药光照组分为三组，其中加药组和加药光照组小鼠每两天注射一次实施例7中注射液，磷酸盐缓冲溶液组注射相同剂量的磷酸盐缓冲溶液。如图17a所示，荷瘤小鼠在整个光动力治疗过程中，不同的分组，小鼠的体重均没有明显的差异。说明1-spm对机体没有明显的毒副作用。在移植了 4T1乳腺肿瘤后，注射磷酸盐缓冲溶液的对照组中的小鼠肿瘤大小随着移植时间的推移而增大，而给予治疗组光照后(590nm，500mW， 30min)，治疗组中小鼠肿瘤大小并未有明显的增长，未经光照处理的加药组中的小鼠肿瘤大小的增长趋势与对照组相似(图17b、c)。16 天的治疗结束后，将各组荷瘤小鼠的肿瘤取出，可以更加明显的看出经过光动力治疗后肿瘤的大小(图17d)。对照组和加药组的肿瘤体积分别从初始的0.108cm3和0.104cm3增长到1.565cm3和1.239cm3。而治疗组的初始肿瘤体积和治疗结束后的肿瘤体积分别为0.103cm3和0.218cm3，抑瘤率为86.04％。实施例12说明了1-spm在实验动物体内能够有效抑制肿瘤生长。
实施例13：除实施例10外的注射液还可以制成冻干粉：
将上述光敏剂前药1-spm按照实施例1的方法合成，反应结束并提纯后，冻干保存，使用时，取所需质量的冻干粉配置即可。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种光敏剂前药，其特征在于：具有如下结构：
2.一种光敏剂，其特征在于：具有如下结构：
3.根据权利要求2所述的光敏剂的制备方法，其特征在于：等摩尔量的丙二酸二乙酯、1H-吡咯-2-甲醛、盐酸甲胺与醋酸钠同时加入到甲醇中,反应2-4小时，得到黄色油状化合物；将上述黄色油状化合物与苯甲醛以摩尔比1：2的比例在氮气保护下溶解在干燥的二氯甲烷中，用铝箔覆盖，同时加入三氟乙酸(TFA)作为催化剂，催化剂用量为苯甲醛摩尔量的1-5倍，在60℃-100℃温度下搅拌48-96小时，然后加入与苯甲醛等摩尔量的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4苯醌在室温下搅拌30-60分钟进行氧化；后立即加入过量的三乙胺和三氟化硼乙醚(，回流12-48小时，纯化后用二氯甲烷/正己烷进行重结晶，得到具有蓝色金属光泽的固体；将上述具有蓝色金属光泽的固体溶解在超干乙腈中，室温搅拌下加入三氟乙酸作为催化剂，催化剂用量为蓝色金属光泽固体摩尔量的5-10倍和过量的N-碘代丁二酰亚胺；80℃-120℃加热回流1.5-5小时后恢复室温；提纯并用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到墨绿色有金属光泽的目标化合物光敏剂1；反应路线如下：
4.根据权利要求1所述的光敏剂前药的制备方法，其特征在于：所述光敏剂1与精胺在溶液中等比例发生反应制得光敏剂前药；反应路线如下:
5.根据权利要求4所述的光敏剂前药的制备方法，其特征在于：包括以下步骤:等摩尔量的丙二酸二乙酯、1H-吡咯-2-甲醛、盐酸甲胺与醋酸钠同时加入到甲醇中室温反应2-4小时，反应结束后，用二氯甲烷进行萃取，萃取结束后，用无水硫酸钠进行干燥，通过硅胶色谱柱使用二氯甲烷作为溶剂进行纯化，得到黄色油状化合物；
将上述黄色油状化合物与苯甲醛以摩尔比1：2的比例在氮气保护下溶解在干燥的二氯甲烷中，用铝箔覆盖，同时加入三氟乙酸(TFA)作为催化剂，催化剂用量为苯甲醛摩尔量的1-5倍，在60℃-100℃温度下搅拌48-96小时，然后加入与苯甲醛等摩尔量的2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4苯醌在室温下搅拌30-60分钟进行氧化；后立即加入过量的三乙胺和三氟化硼乙醚，回流12-48小时，得到的蓝色溶液(有强粉色荧光)用水及饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，通过硅胶色谱柱使用含8％乙酸乙酯的二氯甲烷作为溶剂进行纯化；纯化后用二氯甲烷/正己烷进行重结晶，得到具有蓝色金属光泽的固体；
将上述具有蓝色金属光泽的固体溶解在超干乙腈中，室温搅拌下加入三氟乙酸作为催化剂，催化剂用量为蓝色金属光泽固体摩尔量的5-10倍和过量的N-碘代丁二酰亚胺；80℃-120℃加热回流1.5-5小时后恢复室温。用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤3次，洗掉多余N-碘代丁二酰亚胺，后经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过展开剂二氯甲烷使用硅胶色谱柱提纯；用二氯甲烷/正己烷重结晶，得到墨绿色有金属光泽的光敏剂1；
取上述墨绿色有金属光泽的光敏剂1溶解于二甲亚砜中，溶液颜色为蓝紫色，向其中加入等摩尔的精胺水溶液，混合均匀，待溶液颜色变为近无色时停止反应，将溶液冻干后得到目标产物光敏剂前药1-spm。
6.一种根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于：包括所述的光敏剂前药化合物和药学上可接受的载体。
7.一种根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：由活性成分为所述的光敏剂前药，以及药学上可接受的药用辅料组合制成临床适用的注射剂、冻干粉针剂。
8.根据权利要求1所述的光敏剂前药化合物在制备用于光动力诊疗的药物中的应用。
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