KR101604597B1 - 포르포빌리노겐을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

포르포빌리노겐을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포르포빌리노겐 또는 포르포빌리노겐 유도체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 암 세포에만 선택적으로 독성효과를 일으켜 사멸시키는 암 치료용 약학적 조성물이며, 다량 투여하거나 체내에 축적되어도 독성이나 부작용이 없는 조성물에 대한 발명이다.

Description

포르포빌리노겐을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treatmenet of cancer comprising porphobilinogen as active ingredients}
본 발명은 포르포빌리노겐, 포르포빌리노겐 유도체 또는 포르포빌리노겐 염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암의 치료에는 외과적 치료, 화학적 치료 및 방사선 치료 등이 병행된다. 화학적 치료는 주로 항암제를 투여하는 방법으로 항암제로 이용되는 대부분의 화학물질은 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 강한 세포독성을 나타내므로 많은 부작용이 유발되어 천연물을 이용한 항암제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
포르포빌리노겐(porphobilinogen, 이하 PBG)은 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, 이하 ALA)으로부터 포르피린이 생합성되는 과정의 중간체로 알려져 있다. 포르피린(phorphyrin)은 테트라피롤 고리(tetrapyrrolic macrocycles) 내에 고정된 금속 이온 복합체로 생명체에서 중요한 여러 기능을 수행하는데 이용된다. 예를 들면 식물에서는 광합성의 기반이 되는 엽록소(chlorophylls)는 포르피린을 모핵으로 하는 Mg2 + 복합체이며, 동물에서 산소운반을 하는 헤모글로빈(hemoglobin)과 미오글로빈(myoglobin)은 포르피린을 모핵으로 하는 Fe2 + 복합체이다.
PBG를 거쳐 포르피린이 합성되는 과정은 구체적으로, 생체 내에서 생성되는 ALA가 미토콘드리아 내에서 5-아미노레불린산디하이드라타아제(5-aminolevulinic acid dehydratase, 이하 ALAD) 효소에 의해 탈수되면서 이량체(dimer)로서 PBG가 생성되고, PBG가 유로포르피린 (uroporphyrin)를 거쳐 광과민제인 프로토포르피린(protoporphyrin IX, 이하 PPIX)로 전환된다 (Rimington, Acta Med Scand 445(1966)).
ALA가 광과민제인 PPIX로 전환되는 것을 이용하여, 여드름 치료제나 피부암의 광역동치료에 이용되는 성분으로 활용되고 있고, 이를 이용한 기술 개발도 이루어지고 있다(대한민국 등록특허 10-1254758). PBG 역시 광역동치료를 위한 화합물로 제시되기는 하였으나, PBG는 합성, 정제의 어려움이 있어 비용적인 측면에서 ALA가 주로 쓰이고 있다.
PBG는 ALA에서 PBG를 합성하는 효소인 ALAD에 의해 합성되는데, ALAD는 대부분의 세포에서 존재한다. 그러나, ALAD는 pH에 민감한 특징을 가지기 때문에, 정상세포보다 더 많은 젖산(lactic acid)의 축적에 의해 약산성을 나타내는 암 세포에서는 ALAD의 활성이 매우 저해되어 PBG의 전환이 매우 어렵다는 문제점이 있다. 즉, 종양세포의 경우에 ALA로부터 PBG의 전환에 어려움이 있어, 피부암 등 경피투여가 가능한 질병의 치료외에는 광역동치료를 수반한다 하여도 체내 암세포에서 ALA을 이용한 연구에는 어려움이 있었다.
이에 본 발명자들은 여러 암 세포주에 직접 PBG를 포함한 조성물을 처리하여 연구하던 중, PBG가 특정파장의 빛을 쪼여주는 광역동치료 방법을 수반하지 않고도 여러 암 세포주에서 세포독성효과가 있음을 확인하였다.
대한민국 등록특허 10-1254758
본 발명은 암 세포에 선택적으로 세포독성 효과를 가지는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 포르포빌리노겐(porphobilinogen, 이하 PBG), 이의 유도체 또는 염을 포함한 암치료용 조성물로서 일반적으로 PPIX가 체내에서 분해되는 시간 이 후 암 세포주에서 세포독성 효과가 있음을 확인하여 광역동치료를 수반하지 않고도 다양한 암에 유용한 치료제로 사용될 수 있는 조성물을 제공한다.
본 발명은 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 포함한 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 다량 투여하거나 체내에 축적되어도 독성이나 부작용이 없는 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 유효성분으로 하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 정상세포에는 독성이 없고 종양세포에만 선택적으로 독성효과를 일으켜 사멸시키는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일정시간 이후 종양세포에만 선택적 독성효과를 보이는 암 치료용 약학적 조성물이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 PPIX가 체내에서 분해되는 24 시간 내지 48시간 이후에 종양세포에만 선택적 독성효과를 보이므로, 광역동치료를 수반하지 않는 암 치료용 약학적 조성물이다.
종양세포에서 ALAD의 활성 감소로 인해 충분한 PBG 합성이 진행되지 않는 것을 인식하여, PBG를 유효성분으로 포함한 조성물을 직접 투여하였다. 이로인해 종양세포에서도 정상세포와 같이 충분한 PBG가 제공될 수 있었고, 이 과정에서 상기 조성물에 의한 예상하지 못한 다음의 효과를 확인하였다.
본 발명에 따른 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 포함한 조성물은 본 발명의 일 실시예의 결과를 통해 특히 투여 72시간 후 현저한 암 세포 사멸효과를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 포함한 조성물은 과량 사용에 따른 독성이 없어, 투여용량의 한계로 적용증이 제한적인 기존의 항암 치료와 달리 투여용량에 제한되지 않고 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 포함한 조성물은 PPIX가 체내에서 분해되는 24 시간 내지 48시간 이후에 종양세포에만 선택적 독성효과를 보이므로, 광역동치료를 수반하지 않는 암 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 포함한 조성물은 그 자체로 암 치료용 조성물로 이용될 수 있으나, 광역동치료를 수반하여 조기에 더욱 향상된 암 세포 사멸 효과를 가질 수 있다.
도 1은 본 발명의 조성물을 EAhy926 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 2은 본 발명의 조성물을 A431 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 3는 본 발명의 조성물을 HT-1080 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 4은 본 발명의 조성물을 SKOV3 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 조성물을 HEP1-6 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 조성물을 HT29 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 7는 본 발명의 조성물을 H460 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 조성물을 U343 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 조성물을 TPC-1 세포주에 처리한 후 각각 24시간 및 72시간 후의 세포 생존능력을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 조성물의 A431 세포주에 처리한 후 0, 24, 48, 72, 96시간의 각 시간대별 세포 생존능력을 측정한 사진이다.
도 11은 본 발명의 조성물을 HT-1080 세포주에 처리한 후 0, 24, 48, 72, 96시간의 각 시간대별 세포 생존능력을 측정한 사진이다.
본 발명은 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 포함한 조성물에 관한 발명으로, 상기 조성물을 종양세포에 투여하여, 정상세포에 비해 PBG가 충분히 합성되지 않는 문제를 해결하고자 하는 과정에서 예상하지 못한 효과를 확인하였다. 이하에서 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용에 대하여 기재한다.
본 발명에서 따로 정의하지 않는 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 사용하고 이해할 수 있는 용어로 해석된다. 또한, 본 발명에 대한 설명 및 도면에서는 발명의 요지를 흐릴 수 있는 공지의 내용은 기재하지 않을 수 있다.
본 발명은 암의 치료용 약학적 조성물로서 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
PBG는 포르포빌리노겐(porphobilinogen) 또는 3-[5-(아미노메틸)-4-(카복시메틸)-1H-피롤-3-일]프로판산(3-[5-(Aminomethyl)-4-(carboxymethyl)-1H-pyrrol-3-yl]propanoic acid)이고 불리고, 분자식 C10H14N2O4로 알려져 있다.
본 발명에서 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염은 하기 화학식(I) 및 화학식(II)로 표현될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
화학식(I)
Figure 112014075877744-pat00001
상기 화학식(I)의 X1 및 X2는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알카리금속, 알칼리토금속 또는 전이 금속이고, Y는 H, 아세틸 또는 벤조일이다.
화학식(II)
Figure 112014075877744-pat00002
상기 화학식(II)에서 X3는 H, 알킬, 알칼리토금속 또는 전이금속이다.
상기 화학식 (I) 및 (II)로 표현되는 각 화합물은 서로 적당한 조건에 의해 (I)에서 (II)로 또는 (II)에서 (I)로 전환될 수 있으며 이는 본 발명의 분야에서 공지의 사실에 해당한다. 예를 들면, 화학식 (I)에서 DCC(dicyclohexylcarbodiimide)등을 사용해 화학식 (II)로 전환될 수 있으며, 화학식 (II)에서 산 또는 염기 조건에서 화학식 (I)로 다시 돌아갈 수 있으나, 상기 조건들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 PBG, PBG 유도체 또는 PBG의 염의 합성방법은 이미 공지된 여러 방법이 있고 어느 방법에 의해서든 합성 및 정제될 수 있다. 대표적으로, 급성 포르피린증에 걸린 환자의 오줌에서부터 분리하거나 분리하여 제조할 수 있다(Westall,R.G. Nature, 170, p614 (1952)). 또한 본 발명의 상기 물질들은 유기 합성하여 제조할 수도 있으며(Peter A.Jacobi, J.Am.Chem.Soc, 123, 9307 (2001), Alan R.Battersby, J. Chem. Soc. Chem.Comm, p493 (1975)), ALA을 원료로 하여 소나 토끼, 사람의 간에서 분리한 ALAD(또는 PBG 합성효소)를 이용한 효소 합성 등 공지의 어떤 방법에 의해서든 제조 및 정제 될 수 있다(K.D.Gibson, Biochem. J., 61, p618 (1955), Ephraim.Y, J.Biol Chem, vol242, No18, p4248 (1967)).
본 발명에서 암은 일반적으로 종양으로 불리는 비정상적인 세포를 의미하며,양성(benign)종양 및 악성(malignant)종양을 모두 포함하고, 바람직하게는 피부암, 섬유육종암, 난소암, 간암, 직장암, 폐암, 뇌암 및 갑상선암 등을 치료 대상으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 시럽제 또는 현탁액 등의 경구투제형 또는 주사제로 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에는 다른 약효성분, 영양제, 담체 등의 다른 성분을 첨가할 수 있으며, 임의성분으로 결정성 셀룰로오스, 젤라틴, 유당, 전분, 스테아린산마그네슘, 활석(talcum), 지방, 유지, 껌 및 폴리알킬렌글리콜 등 약학적으로 허용되는 담체, 결합제, 안정화제, 용제, 분산매, 증량제, 부형제, 희석제, 완충제, 가용화제, 붕괴제, 용해 보조제 및 등장제 등 조제용 배합 성분을 첨가할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여법으로는 경구투여 및 정맥주사, 발포제 및 좌약 등에 의한 경피투여가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 상세히 설명한다.
하기의 실시예는 본 발명 실시를 위한 바람직한 예시에 해당하며, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<제조예> PBG, PBG 유도체 또는 PBG 염의 제조
PBG 제조에 관련하여는 기 공지되어 있는 합성 및 정제 방법을 사용하였다.(K.D. Gibson, Biochem.J. 58, 618 (1955), Ephraim.Y, J.Biol Chem, vol242, No18, p4248 (1967) 및 A.R.Battersby, J. Chem.Soc, Chem. Comm 493 (1975)) 한편, PBG HCl salt 및 PBG 락탐(lactam) 합성에 관해서는 G.H.Cookson, Biochem. J. 57,476 (1954)의 내용을 참조하였다. 그밖에 PBG와 PBG 락탐(lactam) 합성에 관련하여는 여러 다른 경로의 방법이 공지되어 알려져 있다.
효소에 의한 생합성 방법
소의 신선한 간 2.5kg을 저속 믹서로 분쇄하여 아세톤 12kg에 넣고 30분간 교반했다. 고체를 필터한 다음 아세톤 1.5kg로 세척하고, diethyl ether 1.5kg으로 세척한 다음, 상온에서 자연 건조하였다. 이렇게 얻은 고체를 증류수 23kg 에 넣고 1시간 동안 교반하였다. 부직포로 일차 필터한 다음, 1,000rpm 15분 원심분리하였다. 고체를 제거한 다음, 상기 원심분리액을 54~56℃로 올려서 5분간 유지한 다음 빠르게 냉각한 다음 5,000rpm 10분 원심분리로 고체를 제거하였다. 고체가 제거된하여 얻은 원심분리액을 교반하면서 황산암모늄(ammonium sulfate) 4.9kg을 30분간 천천히 투입하였다. 10분 더 교반 후, 5,000rpm, 10분 원심분리로 고체를 다시 제거하였다. 이 액을 다시 교반하면서 황산암모늄(ammonium sulfate) 2.2kg을 20분간 천천히 투입하였다. 10분 더 교반 후, 5,000rpm, 10분 원심분리 한 다음, 액체를 제거하고 동결건조하여 고체 효소를 얻었다.
2L 3구 flask에 온도계, 질소 bubbling을 설치하였다. cysteine HCl 13.0g, 트리스 20.0g, 증류수 1,700g을 넣고 자력교반기를 이용하여 잘 저어주면서 질소를 1시간동안 불어 넣어주었다. 앞에서 얻은 동결건조한 고체 효소 10g 을 넣고 30분 더 교반 후, 온도를 38℃로 맞추어 주었다. ALA 12.5 g을 넣고 18시간 동안 반응하였다. 10도 이하로 냉각 후, 20% HClO4 200ml를 투여하여 침전을 5,000rpm, 15분 원심분리로 제거하였다. 5% NaOH용액으로 pH를 5~6으로 조절하였다. 아세테이트 음이온으로 치환시킨 음이온 교환수지(Trilite, SAR20MB, 삼양사)에 이 액을 흘려보낸 다음, 충분한 증류수로 세정하고 6% 아세트산으로 PBG를 용출시킨 다음, 액을 동결건조하여 분홍색의 결정 PBG 모노수화물을 얻었다.
<실시예 1> PBG를 유효성분으로 포함하는 조성물의 조제
상기 제조예에 또는 그외 공지의 방법에 따라 제조한 PBG의 염인 PBG HCl salt를 칭량(LA239S, Sartorius, Germany)하여 각각의 용기에 넣고 부형제인 주사용수를 일부 가하여 용해시킨 다음, 부형제인 주사용수를 가하여 볼텍스믹서(vortex mixer)로 교반하여 26.3mg/ml 저장액(stock solution)상태의 조성물을 조제하였다. 이 후 상기 조성물을 단계 희석하여 규정농도 26.3, 13.1, 6.6, 3.3, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0 mg/ml로 조제하였다. 상기 제조한 조성물은 처리 직전 무혈청배지(serum-free medium)로 10배 희석하여 처리하였다.
<실시예 2>
실시예1에 따라 제조된 조성물을 이용하여 MTT assay를 이용한 세포 생존능력 측정하였다. MTT assay를 위한 세포 배양액 및 세포주는 다음과 같이 준비한다. 세포 배양액의 조성은 하기 표 1 및 표 2와 같이 혼합하여 사용하였다. 세포 배양은 각 세포주의 구입처의 권장방법에 따라 배양하였고, 구체적인 방법은 아래와 같다.(표 1은 완전배지(complete medium)의 조성이고 표 2는 무혈청배지(serum-free midium)의 조성)
세포주 배지 Penicillin-streptomycin(ml) FBS(ml) Total volume(ml)
종류 사용량(ml)
EAhy926 DMEM 89 1 10 100
A431 DMEM 89 1 10
HT-1080 RPMI1640 89 1 10
SKOV3 DMEM 89 1 10
Hep1-6 DMEM 89 1 10
HT29 DMEM 89 1 10
H460 RPMI1640 89 1 10
U343 RPMI1640 89 1 10
TPC-1 RPMI1640 89 1 10
- EAhy926 (American Type Culture Collection, ATCC, USA) : 인간 혈관내피세포
- A431(American Type Culture Collection, ATCC, USA):인간 유래 피부암 세포주(Human skin cancer cell line)
- HT-1080 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea):인간 유래 섬유육종암 세포주(Human fibrosarcoma cell line)
- SKOV3 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea) : 인간 유래 난소암 세포주
- Hep1-6 (American Type Culture Collection, ATCC, USA) : 인간 유래 간암 세포주
- HT29 (American Type Culture Collection, ATCC, USA): 인간 유래 직장암 세포주
- H460 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea): 인간 유래 폐암 세포주
- U343 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea): 인간 유래 뇌암 세포주
- TPC-1 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea): 인간 유래 갑상선암 세포주
- DMEM(Dulbecco`s modification of Eagle`s medium)
- FBS(fetal bovine serum)
- RPMI(Roswell Park Memorial Institute　medium)
세포주 배지 Penicillin-streptomycin(ml) Total volume(ml)
종류 사용량(ml)
EAhy926 DMEM 99 1 100
A431 DMEM 99 1
HT-1080 RPMI1640 99 1
SKOV3 DMEM 99 1
Hep1-6 DMEM 99 1
HT29 DMEM 99 1
H460 RPMI1640 99 1
U343 RPMI1640 99 1
TPC-1 RPMI1640 99 1
세포를 세포 배양용 플라스크에 넣고 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-20AIC, Sanyo, Japan)에서 밤새 배양하였다. 배양 종료 후 세포를 수거하여 원심분리 튜브에 넣고 1,000rpm에서 5분간 원심분리(Union 32R plus, Hanil Science, Korea)를 실시하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 팰렛(pellet)을 새로운 배지를 넣어 세포부유액을 만들었다.
세포부유액을 만든 후 MTT assay를 위해 96 well plate에 각각 1×104및 1×105cells/mL 농도로 준비된 EAhy926, A431, HT-1080, SKOV3, Hep1-6, HT29, H460, U343, TPC-1 세포부유액을 각 well에 200㎕씩 분주(2×103 및 2×104cells/well)하였다. 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양 후 각 well의 배양액을 제거하였다. 실시예 1에서 조제한 조성물을 각 농도별(26.3, 13.1, 6.6, 3.3, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0 mg/ml)로 각각의 well에 200㎕씩 넣었고, 각 농도당 4well씩 넣었다. 음성 대조는 부형제인 희석버퍼를 처리하였다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 2×103 cells/well의 세포 부유액으로 분주된 plate는 96 시간 배양하고 2×104cells/well의 세포 부유액으로 분주된 plate는 24 시간 배양하였다. 배양 완료 후, MTT solution (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, 5 mg/mL, Lot No.: MKBJ2415V, Sigma-Aldrich Co., U.S.A.)을 각 well에 50㎕씩 첨가 하였다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 배양하고 배양 완료 후, 각 well의 배양액을 제거하였다. 각 well에 150㎕의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)용액을 넣어서 세포를 용해시켰다.
ELISA reader(PowerWaveXS, BioTex instruments, Inc., U.S.A.)를 이용하여 570nm에서 흡광도(optical density; OD)를 측정하였다. 음성대조군의 흡광도를 기준으로 각 농도별 시험물질을 처리한 well의 흡광도를 다음 계산식에 대입하여 세포 생존도(cell viability)를 계산하였다. 세포증식 억제가 관찰된 경우, 회귀분석법을 이용하여 50% 세포증식 억제농도(IC50)를 계산하였다.
Cell viability(%)=[1 ―(B ―A) / B]×100
A : 실시예 1에서 제조된 조성물로 처리된 각각의 well의 평균 흡광도 값(mean OD value of well treated with each test substance group)
B : 음성 대조군으로 처리된 well의 평균 흡광도 값(mean OD value of well treated with negative control)
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 EAhy296에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 111.4, 117.6, 121.2, 121.9, 124.6, 122.1, 115.6, 117.1, 102.1%로 모든 농도에서 100% 이상의 세포 생존율이 나타났고, 조성물 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 112.7, 114.0, 111.8, 117.9, 120.7, 126.5, 127.1, 122.2, 103.6%로 모든 농도에서 100% 이상의 세포 생존율이 나타나 정상세포에서는 독성이 없고 오히려 성장을 촉진하는 효과가 나타났다. (표 3 및 도 1).
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 EAhy296 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 101.2 102.9 102.1 0.8
0.02 115.0 119.2 117.1 2.1
0.04 111.7 119.5 115.6 3.9
0.08 121.2 122.9 122.1 0.8
0.16 121.9 127.3 124.6 2.7
0.33 122.8 121.0 121.9 0.9
0.66 120.4 121.9 121.2 0.8
1.31 120.1 115.1 117.6 2.5
2.63 110.5 112.3 114.4 0.9
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 104.2 102.7 103.6 0.6
0.02 121.9 122.4 122.2 0.3
0.04 128.4 125.8 127.1 1.3
0.08 128.0 124.9 126.5 1.6
0.16 119.3 122.1 120.7 1.4
0.33 113.9 121.9 117.9 4.0
0.66 110.3 113.2 111.8 1.5
1.31 117.1 110.8 114.0 3.2
2.63 113.7 111.6 112.7 1.0
- IC50 : 50% 저해 농도
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 A431에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 92.3, 112.4, 100.3, 104.9, 104.6, 109.5, 117.0, 101.8, 101.7%로 모든 농도에서 50% 이상의 세포 생존율이 나타나 항암 효과가 전혀 없는 것으로 나타났다. 하지만 조성물 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 21.8, 17.0, 32.4, 61.3, 75.0, 89.1, 89.0, 86.3, 86.9%로 0.68 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다(표 4 및 도 2).
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 A431 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 116.5 86.8 101.7 21.0
0.02 101.4 102.1 101.8 0.5
0.04 117.9 116.1 117.0 1.3
0.08 109.4 109.7 109.5 0.2
0.16 104.7 104.6 104.6 0.1
0.33 112.8 97.1 104.9 11.1
0.66 130.6 97.0 100.3 4.7
1.31 119.2 105.6 112.4 9.6
2.63 87.4 97.2 92.3 6.9
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.68
0.01 84.8 88.9 86.9 2.0
0.02 88.4 84.2 86.3 3.0
0.04 88.7 89.4 89.0 0.5
0.08 90.4 87.9 89.1 0.5
0.16 79.7 70.2 75.0 6.7
0.33 65.7 56.9 61.3 6.2
0.66 32.5 32.2 32.4 0.2
1.31 17.6 16.3 17.0 0.9
2.63 22.5 21.1 21.8 1.0
- IC50 : 50% 저해 농도
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 HT-1080에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 19.4, 80.2, 101.2, 94.4, 110.8, 103.5, 102.1, 109.3, 91.9%로 2.63mg/ml의 농도에서 50% 이하의 세포 생존율이 나타났고 IC50 값은 1.92 mg/ml로 나타났다. 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 13.9, 24.8, 18.8, 18.7, 17.7, 42.1, 49.4, 50.7, 86.3%로 0.03 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 5 및 도 3)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 HT-1080 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 1.9
0.01 106.5 77.3 91.9 20.6
0.02 105.3 113.2 109.3 5.6
0.04 99.0 105.3 102.1 4.4
0.08 113.0 94.1 103.5 13.3
0.16 114.9 106.7 110.8 5.8
0.33 107.0 81.9 94.4 17.8
0.66 117.0 85.3 101.2 22.5
1.31 79.7 80.7 80.2 0.7
2.63 33.8 5.0 19.4 20.3
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.03
0.01 85.2 87.4 86.3 1.6
0.02 70.4 31.1 50.7 27.7
0.04 65.0 33.7 49.4 22.1
0.08 54.8 29.5 42.1 17.8
0.16 18.0 17.4 17.7 0.4
0.33 20.5 16.9 18.7 2.5
0.66 19.6 17.9 18.8 1.1
1.31 28.6 20.9 24.8 5.5
2.63 14.2 13.5 13.9 0.5
- IC50 : 50% 저해 농도
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 SKOV3에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 90.5, 103.2, 101.0, 110.7, 120.5, 123.0, 132.4, 136.0, 135.0%로 모든 농도에서 50% 이상의 세포 생존율이 나타나 항암 효과가 전혀 없는 것으로 나타났다. 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 23.0, 25.9, 45.0, 65.0, 78.1, 89.6, 157.5, 143.0, 135.5%로 0.75 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 6 및 도 4)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 SKOV3 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 134.0 136.0 135.0 1.0
0.02 142.0 129.9 136.0 6.1
0.04 130.5 134.2 132.4 1.9
0.08 120.3 125.6 123.0 2.7
0.16 122.1 118.9 120.5 1.6
0.33 111.3 110.1 110.7 0.6
0.66 102.1 99.9 101.0 1.1
1.31 110.1 96.3 103.2 6.9
2.63 88.9 92.1 90.5 1.6
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.75
0.01 133.4 137.5 135.5 2.1
0.02 141.0 145.0 143.0 2.0
0.04 155.9 159.1 157.5 1.6
0.08 91.3 87.9 89.6 1.7
0.16 77.2 78.9 78.1 0.8
0.33 72.1 57.9 65.0 7.1
0.66 44.2 45.8 45.0 0.8
1.31 21.8 29.9 25.9 4.0
2.63 22.8 23.1 23.0 0.1
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 Hep1-6에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 102.4, 108.5, 106.3, 122.6, 127.5, 119.6, 110.3, 109.1, 101.3%로 모든 농도에서 50% 이상의 세포 생존율이 나타나 항암 효과가 전혀 없는 것으로 나타났다. 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 30.3, 39.0, 45.5, 69.9, 83.6, 93.1, 115.1, 106.4, 101.8%로 0.55 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 7 및 도 5)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 Hep1-6 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 101.2 101.3 101.3 0.0
0.02 109.2 108.9 109.1 0.1
0.04 110.4 110.2 110.3 0.1
0.08 108.9 130.2 119.6 10.7
0.16 122.9 132.1 127.5 4.6
0.33 112.3 132.9 122.6 10.3
0.66 109.9 102.6 106.3 3.7
1.31 107.8 109.2 108.5 0.7
2.63 110.1 94.7 102.4 7.7
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.55
0.01 102.3 101.2 101.8 0.5
0.02 109.8 102.9 106.4 3.5
0.04 110.9 119.3 115.1 4.2
0.08 92.9 93.2 93.1 0.1
0.16 90.0 77.2 83.6 6.4
0.33 73.5 66.3 69.9 3.6
0.66 47.1 45.9 45.5 0.6
1.31 38.8 39.2 39.0 0.2
2.63 29.4 31.2 30.3 0.9
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 HT29에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 95.1, 124.0, 123.0, 138.6, 134.8, 132.8, 110.7, 123.4, 109.9%로 모든 농도에서 50% 이상의 세포 생존율이 나타나 항암 효과가 전혀 없는 것으로 나타났다. 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 33.7, 46.9, 60.9, 90.2, 95.8, 100.2, 130.5, 122.7, 108.2%로 1.23mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 8 및 도 6)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 HT29 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 109.5 110.2 109.9 0.4
0.02 122.2 124.6 123.4 1.2
0.04 109.2 112.1 110.7 1.4
0.08 132.1 133.5 132.8 0.7
0.16 136.7 132.9 134.8 1.9
0.33 134.8 142.3 138.6 3.8
0.66 123.2 122.7 123.0 0.3
1.31 112.4 135.6 124.0 11.6
2.63 99.2 91.0 95.1 4.1
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 1.23
0.01 110.1 106.3 108.2 1.9
0.02 112.9 132.5 122.7 9.8
0.04 132.1 128.8 130.5 1.7
0.08 101.1 99.2 100.2 0.9
0.16 99.4 92.1 95.8 3.7
0.33 92.1 88.3 90.2 1.9
0.66 62.4 59.3 60.9 1.6
1.31 49.2 44.6 46.9 2.3
2.63 33.2 34.1 33.7 0.4
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 H460에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 21.6, 21.8, 29.5, 61.9, 101.2, 123.8, 126.7, 127.6, 110.7%로 0.66, 1.31, 2.63mg/ml의 농도에서 50% 이하의 세포 생존율이 나타났고 0.43 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었고, 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 17.7, 18.6, 20.0, 28.5, 57.3, 85.9, 120.0, 133.1, 115.2%로 0.18 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 9 및 도 7)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 H460 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.43
0.01 110.1 111.3 110.7 0.6
0.02 123.1 132.1 127.6 4.5
0.04 134.1 119.2 126.7 7.4
0.08 122.4 125.1 123.8 1.4
0.16 103.1 99.2 101.2 1.9
0.33 68.1 55.6 61.9 6.3
0.66 25.6 33.4 29.5 3.9
1.31 21.4 22.1 21.8 0.4
2.63 21.1 22.0 21.6 0.4
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.18
0.01 109.3 121.1 115.2 5.9
0.02 133.6 132.6 133.1 0.5
0.04 121.0 119.0 120.0 1.0
0.08 86.9 84.9 85.9 1.0
0.16 58.3 56.2 57.3 1.0
0.33 29.8 27.1 28.5 1.4
0.66 17.9 22.1 20.0 2.1
1.31 19.3 17.8 18.6 0.8
2.63 17.4 17.9 17.7 0.3
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 U343에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 40.3, 57.5, 75.6, 102.8, 137.3, 132.9, 131.8, 118.1, 116.3%로 1.31, 2.63mg/ml의 농도에서 50% 이하의 세포 생존률이 나타났고 2.55 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었고, 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 25.1, 29.8, 47.2, 70.2, 82.3, 105.4, 140.0, 125.4, 108.8%로 0.61 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 10 및 도 8)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 U343 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 2.55
0.01 100.4 132.1 116.3 15.9
0.02 110.9 125.2 118.1 7.1
0.04 130.2 133.4 131.8 1.6
0.08 128.4 137.4 132.9 4.5
0.16 132.5 142.1 137.3 4.8
0.33 94.9 110.6 102.8 7.8
0.66 69.3 81.9 75.6 6.3
1.31 53.2 61.8 57.5 4.3
2.63 33.5 47.1 40.3 6.8
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 0.61
0.01 108.2 109.3 108.8 0.5
0.02 121.5 129.3 125.4 3.9
0.04 142.1 137.9 140.0 2.1
0.08 101.7 109.1 105.4 3.7
0.16 88.1 76.4 82.3 5.8
0.33 74.1 66.2 70.2 3.9
0.66 51.0 43.4 47.2 3.8
1.31 22.8 36.8 29.8 7.0
2.63 21.1 29.1 25.1 4.0
음성 대조군의 세포 생존율을 100%로 볼 때 TPC-1에 2.63, 1.31, 0.66, 0.33, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, 0 mg/ml 의 농도로 MTT assay를 실시한 결과는 조성물 처리 후 24시간 째에는 각각 94.0, 110.9, 114.7, 121.9, 131.7, 129.3, 113.8, 125.9, 105.8%로 모든 농도에서 50% 이상의 세포 생존율이 나타나 항암 효과가 전혀 없는 것으로 나타났다. 시험 물질 처리 후 72 시간이 지난 후에는 각각 31.5, 49.7, 58.2, 88.7, 94.7, 99.7, 131.2, 121.0, 102.2%로 1.08 mg/ml 의 IC50 값을 나타내었다.(표 11 및 도 9)
처리 후
시간		 농도
(mg/ml)		 TPC-1 세포 생존도(음성대조군 대비 %)
측정값 1 측정값 2 평균 표준편차(S.D) IC50(mg/ml)
24시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 -
0.01 101.2 110.4 105.8 4.6
0.02 132.5 119.2 125.9 6.7
0.04 108.1 119.5 113.8 5.7
0.08 136.7 121.8 129.3 7.4
0.16 136.1 127.3 131.7 4.4
0.33 122.8 121.0 121.9 0.9
0.66 119.2 110.2 114.7 4.5
1.31 112.4 109.4 110.9 1.5
2.63 99.5 88.4 94.0 5.5
72시간 0.00 100.0 100.0 100.0 0.0 1.08
0.01 101.1 103.2 102.2 1.0
0.02 121.1 120.9 121.0 0.1
0.04 133.2 129.1 131.2 2.1
0.08 100.1 99.2 99.7 0.4
0.16 98.3 91.1 94.7 3.6
0.33 90.2 87.2 88.7 1.5
0.66 55.3 61.1 58.2 2.9
1.31 44.2 55.1 49.7 5.4
2.63 32.1 30.9 31.5 0.6
각 세포주에 대한 MTT assay실험결과 U343, H460 및 HT-1080 세포주에서는 24시간 후에도 세포독성 효과가 나타났지만, 72시간 후에 더 낮은 IC50을 가져 시간이 72시간 후가 24시간 후보다 더 향상된 효과가 있는 것을 알 수 있다. 또한, 모든 암 세포주에서 72시간 후에 현저한 세포독성효과가 나타나는 것은 PBG 염을 포함한 조성물의 처리 효과가 PPIX에 의해 발생하는 효과 외의 다른 작용에 의해 상기 각 암 세포주에 선택적으로 세포독성효과를 나타내는 것을 보여준다.
본 실시예에 따른 결과를 통해 PBG를 포함한 조성물이 암 세포의 사멸에 충분한 효과를 나타내는 것을 알 수 있으며, 사멸효과가 72시간 후에 더 효과적인 특징이 있고, 72시간 후에는 저농도의 조성물 농도로도 효과가 지속되는 것을 알 수 있다.

Claims (2)

  1. 화학식(I)로 표시되는 포르포빌리노겐, 포르포빌리노겐 유도체 또는 포르포빌리노겐의 염을 유효성분으로 포함하고, 피부암, 섬유육종암, 난소암, 간암, 직장암, 폐암, 뇌암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암을 치료하기 위한 암 치료용 약학적 조성물.
    화학식(I)
    Figure 112016010672445-pat00003

    (상기 화학식(I)의 X1 및 X2는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알카리금속, 알칼리토금속 또는 전이 금속이고, Y는 H, 아세틸 또는 벤조일이다.)
  2. 삭제
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Helson, L., et al. Neurochemical research, 1993, 18(12), 1255-1258

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