CN104718190B - 用于光动力疗法的吡啶酮化合物 - Google Patents

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Abstract

一种化合物，其是式(I)的化合物或其任何盐：

Description

用于光动力疗法的吡啶酮化合物
技术领域
本发明涉及新的化合物和其制备以及应用，并且涉及包括该化合物的组合物。
背景技术
光动力疗法(PDT)是在治疗浅表皮肤恶性肿瘤中常规采用的疗法并且正在研究用于另外肿瘤类型的范围。PDT的大部分应用涉及使用称为光敏剂的活性化合物，以及光源，可选择所述光源的波长以适合激发光敏剂以生产活性氧物质。这导致对任何组织的破坏，所述组织选择性摄取光敏剂或已经局部曝光。
例如，人皮肤癌的PDT治疗可涉及下述步骤。首先，将光敏剂前体施用至患者。光敏剂前体被细胞摄取并且转化成光敏剂。然后，将待治疗的区域暴露于适当波长的光。光敏剂吸收光并且与附近的组织氧反应，产生活性氧物质。这些活性氧物质与生物分子反应，致命性破坏进行治疗的区域中的一些细胞。
尤其已经发现了PDT在治疗皮肤病肿瘤中的小生态环境，其中光可以容易地施加至皮肤表面；临床上大量的皮肤瘤亚型难以通过常规的疗法治疗(因为尺寸、位点或存在多处损伤)。在治疗皮肤病况时，可局部施用光敏剂或光敏剂前体，并且由光源局部激发。另一方面，在局部治疗内部癌症细胞时，光敏剂或光敏剂前体可例如被静脉内施用，并且光可使用内窥镜和光纤导管传送至靶区域。与普通健康的组织相比，大部分类型的癌症细胞在吸收和积累光敏剂时尤其活跃，其使得癌症细胞对PDT特别敏感，因为在PDT期间，细胞中存在的光敏剂越多，则对细胞产生更多的损伤。
目前皮肤病学PDT中采用的光敏剂前体包括氨基乙酰丙酸(ALA)、乙酰丙酸甲酯(MAL)和乙酰丙酸己酯(HAL)。如果ALA、MAL或HAL被用作光敏剂前体，其被细胞转化成光敏剂原卟啉IX(PpIX)。
长期以来认为卟啉是适当的用于肿瘤光诊断和肿瘤PDT的试剂，因为癌症细胞对于卟啉展示与正常静息组织相比显著更大的吸收和亲和性；所以癌症细胞天然积累卟啉。
光敏剂原卟啉IX(PpIX)的另外的特征是其发荧光的能力，加上癌症细胞天然积累卟啉，这就允许肿瘤的光诊断(PD)。PD已经被外科医生用于实现更加精确地去除肿瘤，比如脑肿瘤。
PpIX以低浓度天然存在于所有的成核哺乳类的细胞中；其是生物合成血红素的中间体。在血红素生物合成中，ALA转化成PpIX(经许多中间步骤)，其后通过铁螯合酶这种酶将Fe2+离子插入PpIX，从而PpIX转化成血红素。
为了使PDT有效，必须增加细胞中存在的PpIX的量。这样做的一个方式是将更多的ALA、MAL或HAL添加至细胞，其将会转化成PpIX。但是，血红素生物合成通路具有最大值限度，超过其之后，另外的前体施用不产生任何另外的益处。此外，已经表明过量的ALA口服施用诱导人的肝毒性。通常，游离血红素的存在起到抑制ALA合成的负反馈机制的作用。但是，外源性施用大量的ALA或MAL绕过该负反馈信号并且导致细胞中PpIX的临时积累，因为Fe2+插入PpIX形成血红素是相对缓慢的。此外，通过减缓插入Fe2+将PpIX转化成血红素的步骤，PpIX可在细胞中积累得甚至更多，这可通过限制细胞中的铁供应而实现。Bech,O.等，JPhotochem Photobiol B,1997,41,136-144；Curnow,A.等，BJC,1998,78,1278-1282；Pye,A.等，Photochem Photobiol，2007，83(3)，766-73；和Blake,E.等，Photochem Photobiol，2010，86(5)，1154-60描述了如何组合使用下面显示的铁螯合剂CP94以及ALA来增加PpIX的积累。
但是仍需要新的光敏剂前体，其在光动力疗法中具有改进的活性特征，尤其因为目前光动力疗法并不是对于所有的肿瘤类型都有效；例如，对于更厚的结节性基底细胞癌(BCC)的清除率仍比对于浅层BCC的更低。
本发明的目的是提供新的化合物，其可用作光敏剂前体，并且在光动力疗法中可显示改进的活性特征。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了化合物，其是式(I)的化合物或其任何盐：
其中
R1是C1-C6烷基基团，
R2是H或C1-C6烷基基团，
R3是H或C1-C6烷基基团，和
n是0至5的整数。
在一种实施方式中，根据本发明第一方面的化合物是如上定义的式(I)的化合物，式(Ia)的盐或式(Ib)的盐：
其中
R1、R2、R3和n是如上定义的；和
每个X-独立地选自一价抗衡离子。
在一种实施方式中，根据本发明第一方面的化合物是如上定义的式(I)的化合物，或式(Ia)的盐。在一种实施方式中，根据本发明第一方面的化合物是如上定义的式(I)的化合物。在一种实施方式中，根据本发明第一方面的化合物是如上定义的式(Ia)的盐。
一价抗衡离子X-可以是任何常见酸的共轭碱。例如，X-可以是卤离子、硫酸氢根、硝酸根、或羧酸根(比如乙酸根或甲酸根)。
在一种实施方式中，X-是卤离子，比如，例如F-、Cl-、Br-或I-。在一种实施方式中，X-是Cl-。
烷基基团可以是直链或支链烷基基团。
在根据本发明第一方面的化合物中，R1是C1-C6烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和己基。在一种实施方式中，R1是C1-C5烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和叔戊基。在一种实施方式中，R1是C1-C4烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。在一种实施方式中，R1是C1-C3烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一种实施方式中，R1是C1-C2烷基基团，即甲基或乙基。在一种实施方式中，R1是C2烷基基团，即乙基。
在根据本发明第一方面的化合物中，R2是H或C1-C6烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和己基。在一种实施方式中，R2是H或C1-C5烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和叔戊基。在一种实施方式中，R2是H或C1-C4烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。在一种实施方式中，R2是H或C1-C3烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一种实施方式中，R2是H或C1-C2烷基基团，即甲基或乙基。在一种实施方式中，R2是H。
在根据本发明第一方面的化合物中，R3是H或C1-C6烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基和己基。在一种实施方式中，R3是H或C1-C5烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和叔戊基。在一种实施方式中，R3是H或C1-C4烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。在一种实施方式中，R3是H或C1-C3烷基基团，其包括，例如甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一种实施方式中，R3是H或C1-C2烷基基团，即甲基或乙基。在一种实施方式中，R3是H。
在一种实施方式中，R2和R3是H。
在根据本发明第一方面的化合物中，n是0至5的整数。在一种实施方式中，n是0至4，或0至3，或0至2，或0至1，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2。在一种实施方式中，n是1。
在一种实施方式中，R1是甲基或乙基；R2是H、甲基或乙基；R3是H、甲基或乙基；n是1。
在一种实施方式中，R1是乙基，R2和R3是H，n是1。该化合物和其盐形式有效地是已经通过酯键连接的ALA和铁螯合化合物CP94的结合。令人吃惊地，该连接的化合物比ALA和CP94分开作为活性剂的组合具有更好的活性特征。
这由于许多原因非常令人吃惊。首先，递送连接形式的(而不是分开的)ALA和CP94可能期望改变化合物进入细胞的方式；较大的分子不如较小的分子有效地进入细胞并且可能使用不同的转运蛋白。事实上，认为ALA和MAL可通过不同膜转运蛋白进入细胞，并且因此对于ALA和CP94相连接的本发明化合物，也可能是这样。所以，该新的实体不能保证产生与ALA和CP94分开作为试剂时甚至相同水平的结果，更不用提更好的结果了。
除此之外，难以预测连接的形式将如何影响其所依赖的固有细胞生物化学，以产生天然光敏剂PpIX。ALA通常由线粒体中的ALA合酶形成，然后在细胞溶液中进入血红素生物合成通路部分。将铁插入PpIX卟啉环以形成血红素的稍后的步骤发生在线粒体中。为了以PpIX积累的这种方式影响该通路，铁螯合剂需要能够直接或间接消除铁的线粒体水平。但是，ALA和CP94相连接的本发明的化合物首先需要被细胞溶液中存在的酯酶分离成活性试剂。所以，期望相连接的形式能改变以独立的化合物结束时的细胞区室(比如细胞溶液和线粒体)，其可也改变血红素生物合成通路的调节。另外，理论上可能看到更好地是在ALA之前递送CP94，以便螯合铁然后再产生PpIX，而以连接的形式递送试剂意味着同时递送试剂。这些因素进一步有助于使得本发明化合物的用途更加令人吃惊。
此外，铁螯合剂CP94是二配位基的，所以用三个CP94分子结合一个Fe2+离子。除此之外，血红素生物合成通路中两个分子的ALA二聚化形成胆色素原，其后四分子的胆色素原被缩合、重排并且环化以产生尿卟啉原III；接着其经辅前卟啉原III转化成原卟啉IX。所以，需要八分子的ALA以形成一个PpIX分子，其结合至一个Fe2+离子以形成一分子的血红素。所以，从简单的生物合成角度，每个Fe2+离子需要的ALA：CP94的理论比例是8ALA：3CP94，即ALA超过CP94的两倍。尽管这样，本发明人已经非常令人吃惊地发现，在具体连接形式的本发明的化合物中等量的ALA和CP94产生卓越的活性特征。不希望被理论限制，回顾过去可能是这样的情况，为了使得减少从PpIX形成血红素，为了耗尽细胞内铁储存，可能需要比理论上预测的更多的CP94。
如上所陈述，在活细胞内部的环境中有许多不同的因素会影响添加至活细胞中的任何活性剂的活性特征，使得难以预测活性剂的成功。所以，非常令人吃惊地发现在本发明化合物的具体连接的形式下等量的ALA和CP94产生如此卓越的活性特征。
在一种实施方式中，根据本发明第一方面的化合物是式(Ic)的盐：
从实施例2B可见，式(Ic)的盐能够相对于ALA、MAL、相对于作为独立活性剂的ALA和CP94的组合、相对于作为独立活性剂的MAL和CP94的组合，产生PpIX积累的显著增加。此外，从实施例2C可见，也发现式(Ic)的盐在PDT之后降低细胞活力方面显著更好，尤其在低浓度下。
所以，式(Ic)的盐的临床应用可产生对经历皮肤病PDT和其他PDT应用的患者的实质益处。
根据本发明的第二方面，提供了包括根据本发明第一方面的化合物和药学上可接受的载体的药学组合物。遍及本说明书，术语“药学”包括兽医的。在一种实施方式中，组合物是局部皮肤治疗制剂。
根据本发明的第三方面，提供了制备根据本发明第一方面的化合物的方法，方法包括下述步骤：
(a)通过酯化反应使式(II)的化合物与式(III)的化合物反应，以形成式(IV)的化合物；
其根据下述反应方案：
其中R1、R2、R3和n如为第一方面所定义；和
RPG1和RPG2是保护基团。
术语“保护基团”意思是能够保护氧原子或氮原子的基团，该保护基团可在采用保护的反应之后去除而不干扰剩余的分子。保护基团是熟知的并且列举在标准教科书中，比如Kocienski P.J.,保护基团(Protecting Groups)，第三版，Georg Thieme Verlag，NewYork，2005；和Greene T.W.,Wuts P.G.M.，有机合成中的保护基团(Protective Groups InOrganic Synthesis)，第3版，John Wiley&Sons，New York，1998。
在一种实施方式中，RPG1是保护基团，其选自苄基、苯甲酰基、甲氧甲基(MOM)、甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、四氢吡喃基(THP)，和硅保护基团比如三甲基硅烷基(TMS)、三乙基硅烷基(TES)、三异丙基硅烷基(TIPS)、三苯基硅烷基(TPS)、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)、(二甲基)叔己基硅烷基和2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基(SEM)。
RPG1是醇保护基团。醇保护基团是本领域技术人员熟知的并且列举在比如上面提到的那些标准教科书中。
在一种实施方式中，RPG2是保护基团，其选自苯甲酰基和聚氨酯型保护基团，比如羧苄基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)、4-甲氧苄氧羰基、4-硝基苄氧基羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。
RPG2是伯胺保护基团。伯胺保护基团是本领域技术人员熟知的并且列举在比如上面提到的那些标准教科书中。
在一种实施方式中，根据第三方面的方法进一步包括下述步骤：
(b1)将式(IV)的化合物去保护从而产生式(I)的化合物；
其根据下述反应方案：
保护和去保护可以以本领域技术人员已知的常见方式进行；这些是化学合成中的常规步骤。
在一种实施方式中，根据第三方面的方法进一步包括下述步骤：
(b2)将式(IV)的化合物在存在H+X-酸的情况下去保护，以产生式(Ia)的盐；
其根据下述反应方案：
在一种实施方式中，根据第三方面的方法进一步包括下述步骤：
(b3)将式(IV)的化合物在存在H+X-酸的情况下去保护，以产生式(Ib)的盐；
根据下述反应方案：
根据本发明的第四方面，提供了根据本发明第一方面的化合物在治疗中的应用。
根据本发明的第五方面，提供了根据本发明第一方面的化合物在光动力疗法的应用。
在一种实施方式中，根据本发明的第五方面应用的化合物是用于通过光动力疗法治疗由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况。
在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物是用于通过光动力疗法治疗癌症。在一种实施方式中，化合物用于通过光动力疗法治疗皮肤癌。在一种实施方式中，化合物用于通过光动力疗法治疗内部癌症细胞。
在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于通过光动力疗法治疗硬皮病(scleroderma)、硬化性苔癣(lichen sclerosus)、牛皮癣(psoriasis)或疣(warts)。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于通过光动力疗法治疗慢性创伤。例如，这种慢性创伤可以是老年人中的腿部溃疡。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于通过光动力疗法治疗痤疮。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于通过光动力疗法治疗微生物感染。例如，这种微生物感染可能由细菌、真菌、病毒和/或酵母引起。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于通过光动力疗法治疗寄生虫感染。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于通过光动力疗法治疗风湿性关节炎。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物用于在治疗白血病时通过光动力疗法的骨髓净化。
在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物是局部施用的。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物是口服施用的。在一种实施方式中，根据本发明第五方面应用的化合物是静脉内施用的。
根据本发明的第六方面，提供了根据本发明第一方面的化合物在美容目的的光动力治疗中的应用。
在一种实施方式中，化合物用于下述美容目的的光动力治疗：增生性瘢痕(hypertrophic scar)、痤疮伤疤、皱纹(幼纹(rhytides))、光化损伤的皮肤(也称为光损伤的皮肤或太阳损伤的皮肤)、酒渣鼻、光化角化症(actinic keratosis)、皮脂腺增生、雀斑、多毛症、毛细管扩展(telangiectasias)、酒色痣、红疹(erythema)、皮肤异色病(poikiloderma)、黄褐斑、皮肤变色(poikiloderma)、色素沉着过度、杂色的(mottled)或斑点状(blotchy)色素沉着、粗糙皮肤斑块、差的皮肤质地、放大的毛孔和/或皮肤松弛。
在一种实施方式中，化合物用于通过光动力治疗的皮肤美容光子嫩肤。
根据本发明的第七方面，提供了根据本发明第一方面的化合物用于在人体或动物体上实施的诊断方法。在一种实施方式中，诊断方法是诊断由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况的方法。在一种实施方式中，由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况是癌症。
如上述，PpIX具有发荧光能力，这使得能实现肿瘤的光诊断(PD)。所以，在显著更短的时间内通过使用根据本发明第一方面的化合物产生显著更高水平的PpIX，这可也引起改善的PD。
根据本发明的第八方面，提供了根据本发明第一方面的化合物在人体或动物体上实施的诊断方法之外的诊断方法中的应用。在一种实施方式中，诊断方法是体外诊断方法。例如，PD可用于增强肿瘤的组织学和/或显微镜分析；这可有助于进一步区分样品中的正常细胞与异常细胞。
在一种实施方式中，诊断方法是诊断由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况的方法。在一种实施方式中，由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况是癌症。
根据第九方面，提供了根据本发明第一方面的化合物在制备用于通过光动力疗法治疗由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况的药物中的应用。在一种实施方式中，由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况是癌症。
根据本发明第一方面的化合物也可用于制备通过光动力疗法治疗任何与本发明的第五方面有关的病况的药物。
根据本发明的第十方面，提供了治疗遭受或处在遭受由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况风险中的人或动物患者的方法，方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明第一方面的化合物，以及作为光动力疗法的一部分，将患者包含化合物的区域暴露于光。在一种实施方式中，由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况是癌症。
根据本发明第一方面的化合物也可用于治疗遭受或处在遭受任何与本发明的第五方面有关的病况的风险中的人或动物患者的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明第一方面的化合物，以及作为光动力疗法的一部分，将患者包含化合物的区域暴露于光。
遍及本说明书的描述和权利要求，词语“包括”和“包含”和该词语的各种变型，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，意思是“包括但不限于”，不排除其他部分、添加剂、组分、整体或步骤。而且单数包括复数，除非上下文另外规定：尤其，在使用不定冠词的情况下，说明书理解为考虑复数以及单数，除非上下文另外规定。
本发明每个方面的优选的特征可如联系任何其他方面来描述。本发明的其他特征将在下述实施例中变得显而易见。一般而言，本发明扩展至本说明书中(包括任何随附的权利要求和附图)公开的特征的任何新的特征，或任何新的组合。因此结合本发明的具体方面、实施方式或实施例描述的特征、整体、特点、化合物、化学部分或基团理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非它们不相容。而且除非另外指明，本文公开的任何特征可被用于相同或类似目的的替代特征替换。
当为某一性质引用上限和下限的情况下，也可暗示由任何上限与任何下限的组合限定的值的范围。
在本说明书中，提及化合物特性比如旋光度是–除非另外指明–指在环境条件下，即在大气压和在16至22或25℃、或18至22或25℃、例如约20℃或约25℃的温度测量的特性。
现将参考下述非限制性实施例和示意性附图进一步描述本发明，其中：
图1显示来自中性红吸收试验的结果，以评估化合物AP2-18(8)具备的固有(黑暗)毒性的水平；***指示在P<0.001水平的显著性(学生t-检验)。
图2A显示暴露于i)化合物AP2-18(8)、ii)单独ALA、iii)ALA和CP94(3)、iv)单独MAL，和v)MAL和CP94(3)之后，随着时间的推移，人真皮成纤维细胞(84BR)中PpIX荧光性的积累(+/-平均数标准误差)。
图2B显示表1和图2A中，人真皮成纤维细胞(84BR)的PpIX积累数据的统计分析的结果；图2B显示测试的三个浓度的化合物AP2-18(8)的每一个与测试的其他化合物(ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)和其他浓度的AP2-18(8))的统计比较(通过双向ANOVA及Bonferroni事后检验以比较重复的平均数获得)。
图3A显示暴露于i)化合物AP2-18(8)、ii)单独ALA、iii)ALA和CP94(3)、iv)单独MAL，和v)MAL和CP94(3)之后，随着时间的推移，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)中PpIX荧光性的积累(+/-平均数标准误差)。
图3B显示表2和图3A中，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)的PpIX积累数据的统计分析的结果；图3B显示测试的三个浓度的化合物AP2-18(8)的每一个与测试的其他化合物(ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)和其他浓度的AP2-18(8))的统计比较(通过双向ANOVA及Bonferroni事后检验以比较重复的平均数获得)。
图4A显示暴露于i)化合物AP2-18(8)、ii)单独ALA、iii)ALA和CP94(3)、iv)单独MAL，和v)MAL和CP94(3)之后，随着时间的推移，人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)中PpIX荧光性的积累(+/-平均数标准误差)。
图4B显示表3和图4A中，人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)的PpIX积累数据的统计分析的结果；图4B显示测试的三个浓度的化合物AP2-18(8)的每一个与测试的其他化合物(ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)和其他浓度的AP2-18(8))的统计比较(通过双向ANOVA及Bonferroni事后检验以比较重复的平均数获得)。
图5A显示暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、和化合物AP2-18(8)之后，人真皮成纤维细胞(84BR)中在照射后立即发生PpIX光漂白的百分数。
图5B显示暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、和化合物AP2-18(8)并用红光照射之后，对人真皮成纤维细胞(84BR)活力的影响。
图5C显示表5和图5B中，人真皮成纤维细胞(84BR)的细胞活力数据的统计分析的结果；图5C显示测试的三个浓度的化合物AP2-18(8)的每一个与测试的其他化合物(ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)和其他浓度的AP2-18(8))的统计比较(通过单向ANOVA与Tukey事后检验比较所有的列对获得)。
图6A显示暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、和化合物AP2-18(8)之后，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)中在照射后立即发生PpIX光漂白的百分数。
图6B显示暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、和化合物AP2-18(8)并用红光照射之后，对人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)活力的影响。
图6C显示表7和图6B中人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)的细胞活力数据的统计分析的结果；图6C显示测试的三个浓度的化合物AP2-18(8)的每一个与测试的其他化合物(ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)和其他浓度的AP2-18(8))的统计比较(通过单向ANOVA与Tukey事后检验比较所有的列对获得)。
图7A显示暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、和化合物AP2-18(8)之后，人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)中在照射后立即发生PpIX光漂白的百分数。
图7B显示暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、和化合物AP2-18(8)并用红光照射之后，对人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)的活力的影响。
图7C显示表9和图7B中，人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)的细胞活力数据的统计分析的结果；图7C显示测试的三个浓度的化合物AP2-18(8)的每一个与测试的其他化合物(ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)和其他浓度的AP2-18(8))的统计比较(通过单向ANOVA与Tukey事后检验比较所有的列对获得)。
图8显示随着增加剂量(250，500或1000μM)的(A)ALA+/-CP94，(B)MAL+/-CP94和(C)AP2-18，在不同的孵育时间之后(2、3或4小时)，A431细胞中测量的平均PpIX荧光性；*、**和***指示分别在0.050、0.010和0.001水平下的统计显著性。
图9显示随着增加剂量(250，500或1000μM)的ALA+/-CP94，MAL+/-CP94和AP2-18，在A(i)2小时、B(i)3小时和C(i)4小时的孵育时间之后，A431细胞中测量的平均PpIX荧光性，每个时间段的相应统计分析分别表示在A(ii)、B(ii)和C(ii)中。
图10显示随着增加剂量(250、500或1000mM)的(A)ALA+/-CP94、(B)MAL+/-CP94和(C)AP2-18，在不同的孵育时间之后(2、3或4小时)A431细胞的平均细胞活力；*、**和***指示分别在0.050、0.010和0.001水平下的统计显著性。
图11显示随着增加剂量(250、500或1000mM)的ALA+/-CP94，MAL+/-CP94和AP2-18，在A(i)2小时、B(i)3小时和C(i)4小时的孵育时间之后A431细胞的平均细胞活力，每个时间段的相应统计分析分别表示在A(ii)、B(ii)和C(ii)中；DLI表示‘药物-光间隔’，即在发生照射之前细胞已经暴露于药物的孵育时间。
实施例
实施例1-合成1-(2-(5-氨基-4-氧代戊酰氧基)乙基)-2-乙基-3,4-二羟基吡啶氯化物盐酸盐(AP2-18)，8
通过苄氧基羰基-保护的氨基乙酰丙酸5与CP94类似物6的连接来实现AP2-18(8)的合成。
通过在碱性条件下，将ALA.HCl(4)(获得自Sigma-Aldrich)暴露于氯甲酸苄酯，以产生苄氧基-保护的ALA 5，从而合成ALA-衍生物5。
从乙基麦芽糖醇(1)通过苄基保护然后用乙醇胺胺化，合成互补的连接配偶体，CP94类似物6。
通过DCC/DMAP的促进，平稳进行5和6的酯化，以产生连接的产物7，产物7通过氢解作用去保护，以产生目标化合物AP2-18(8)：
化合物AP2-18(8)是根据本发明第一方面的化合物，并且对应式(Ic)的盐。
下面给出这些步骤的完整实验流程。
1A.ALA-衍生物5
ALA-衍生物5是已知的化合物，其可以例如通过Neuberger A.等，生物化学杂志(Biochemistry Journal)，1956，64，137-145中的流程获得。
1B.CP94类似物6
根据先前公开的流程(Dobbin，P.S.，等，J Med Chem，1993.36(17)：2448-58页；Liu，Z.D.等，J.Pharm.Pharmacol，1999，51，555-564)制备CP94类似物6。
1C.2-(3-(苄氧基)-2-乙基-4-氧吡啶-1(4H)-基)乙基5-(苄氧基羰基氨基)-4-氧戊酸酯，7
将4-(二甲氨基)吡啶(3.3mg，0.0274mmol)添加至二氯甲烷(8mL)中的3-(苄氧基)-2-乙基-1-(2-羟乙基)吡啶-4(1H)-酮(6)(149mg，0.547mmol)、5-(苄氧基羰基氨基)-4-氧戊酸(5)(145mg，0.547mmol)和N,N′-二环己基碳二亚胺(118mg，0.574mmol)的搅拌溶液。24h之后，通过棉绒过滤所得悬液，用二氯甲烷洗脱。真空浓缩滤液并且通过二氧化硅凝胶上的快速色谱纯化残渣，用乙酸乙酯然后用甲醇洗脱，产生如无色油状的目标化合物7(247mg，87％)，RF 0.7(MeOH)；δH(300MHz；CDCl3)7.46-7.20(11H，m，Ar和Pyr 6-H)，6.40(1H，d，J 9.0Hz，Pyr 5-H)，5.97(1H，br s，NH)，5.22(2H，s，PhCH2)，5.09(2H，s，PhCH2)，4.22(2H，t，J 6.0Hz，OCH2CH2)，4.10-3.95(4H，m，HNCH2和OCH2CH2)，2.71-2.50(6H，m，CH3CH2和C(O)CH2CH2)和0.99(3H，t，J 7.0Hz，CH3)；δC(75MHz；CDCl3)204.7，174.3，172.3，156.9，146.2，139.4，138.0，136.8，129.1，128.9，128.8，128.7，128.5，128.4，128.3，117.8，73.3，67.3，63.3，51.5，50.9，34.4，27.9，19.8和13.5。
1D. 1-(2-(5-氨基-4-氧代戊酰氧基)乙基)-2-乙基-3,4-二羟基吡啶氯化物盐酸盐(AP2-18)，8
通过添加盐酸(37％aq.)，将6:1v/v乙醇：水(3.5mL)的2-(3-(苄氧基)-2-乙基-4-氧吡啶-1(4H)-基)乙基5-(苄氧基羰基氨基)-4-氧戊酸酯(7)(247mg，0.475mmol)的搅拌溶液酸化至pH＝1。添加活性炭上的钯(11mg，10％w/w)，排空反应容器，然后充满氢气并且在氢气氛下(在大气压下)搅拌反应2h。所得悬液通过过滤，用乙醇洗脱然后真空浓缩滤液，以产生作为单盐和二盐的混合物的产物。水中进行三轮溶解，添加盐酸(37％aq.)，然后真空浓缩，产生作为棕色油的目标化合物8(169mg，96％)，δH(300MHz；D2O)7.82(1H，d，J8.0Hz，Ar 6-H)，6.92(1H，d，J 8.0Hz，Ar 5-H)，4.27(2H，t，J 6.0Hz，OCH2CH2)，3.91(2H，s，H3N+CH2)，3.74(2H，t，J6.0Hz，OCH2CH2)，2.80(2H，q，J 7.0Hz，CH3CH2)，2.66(2H，t，J 6.0Hz，C(O)CH2)，2.45(2H，t，J 6.0Hz，C(O)CH2)和0.98ppm(3H，t，J 7.0Hz，CH3)；δC(75MHz；D2O)204.3，176.9，158.6，147.7，142.5，139.5，111.0，60.6，57.8，47.3，34.6，27.6，20.1和11.3ppm；m/z(ES+)297.1445(100％，[M-H-2Cl]+)，C14H21N2O5需要M，297.1445。
比较实施例1-合成CP94(3)
根据先前公开的流程(Dobbin，P.S.，等，J Med Chem，1993。36(17)2448-58页)制备化合物CP94(3)。对乙基麦芽糖醇(1)进行苄基保护并且胺化以产生2；并且通过氢解作用去保护产生CP94(3)，如下所示。
实施例2-AP2-18(8)的实验测试
NB：除非另外规定，所有呈现的数据是三个独立实验的平均值，每个由每个条件的三个内部重复组成。
2A.毒性测试
为了确定化合物AP2-18(8)是否具备任何固有的毒性特性，在标准细胞培养基(包含1％(v/v)胎牛血清(FBS)、200mM L-谷氨酰胺、200U mL-1青霉素和200μg mL-1链霉素的最低必需培养基(MEM))中制备1000μM测试溶液(在该研究中测试的最高浓度)。将其施加至MRC-5(人胚胎肺成纤维细胞)细胞，在减少的光条件下，并且在黑暗中静置4小时(选择该时间段，因为其等于在皮肤病学PDT临床中的时间段)，并且此后使用中性红吸收(NRU)试验测定细胞活力。中性红是由活力(活的)细胞积极摄取和储存的惰性染料，其是不能被非活力细胞进行的活动，所以摄取的中性红水平与存在并暴露的活力细胞数量直接成比例。染料摄取之后，裂解细胞并且使用反应盘检测仪(plate reader)量化中性红的水平。
在标准细胞培养基中孵育对照细胞。也将细胞暴露于作为NRU试验阳性对照的0.01％(v/v)过氧化氢。从图1中可见，暴露于0.01％(v/v)过氧化氢导致细胞活力的显著下降。用AP2-18(8)处理的确导致活力细胞数量非常轻微的减少，但是，在统计分析上没有发现其与标准细胞培养基中孵育的对照细胞有显著的不同。所以，当与仅仅暴露于细胞培养基的细胞比较时，AP2-18(8)对MRC-5(肺成纤维细胞)细胞没有固有毒性。
2B.PpIX荧光性积累
使用下面描述的完善的先前已经验证的基于荧光性的试验监测原卟啉IX(PpIX)积累的水平：Blake，E.等，光化学和光生物学(Photochem Photobiol)，2011，87(6)，1419-26；Blake，E.等，Photochem Photobiol，2010，86(5)，1154-60；Curnow，A.等，J EnvironPathol Toxicol Oncol，2007，26(2)，89-103；和Pye，A.等，J Cancer Res Clin Oncol，2008，134(8)，841-9。
简言之，以2x 104个细胞每孔在96孔板中接种细胞并且静置以附着过夜。在试验当天制备测试溶液并且施加至细胞。使用具备400(±30)nm激发滤光片和645(±40)nm发射滤光片的多孔荧光性反应盘检测仪监测产生的PpIX的水平，产生的荧光性水平与存在的PpIX水平直接成比例。每小时读数进行6小时，并且在低光条件下进行，以减少PpIX的光漂白。
为了评估AP2-18(8)造成细胞中PpIX积累增加的能力，制备一系列浓度(250μM；500μM；1000μM)，这些浓度反映我们课题组先前使用的那些的浓度(见上面提到的引用)。将它们与等摩尔浓度的ALA、ALA和CP94(3)、MAL、和MAL和CP94(3)一起测试，所有的测试化合物在人真皮成纤维细胞(84BR；图2A和2B)、人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431；图3A和3B)和人胶质母细胞瘤细胞(U87MG；图4A和4B)中研究。
结果显示在下面的表中：表1显示对应图2A和2B的用人真皮成纤维细胞(84BR)测试的结果；表2显示对应图3A和3B的用人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)测试的结果；表3显示对应图4A和4B的用人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)测试的结果。
表1：人真皮成纤维细胞(84BR)中的PpIX积累
表2：人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)中的PpIX积累-缺失的数据是由于在该重复中这些孔中存在感染所以丢弃该数据
表3：人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)中的PpIX积累
在检查的三种细胞类型的每一个中，通过所研究的每个前药(AP2-18(8)、ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3))产生的PpIX荧光性的积累随着时间的推移而增加。发现新的化合物AP2-18(8)，即根据本发明第一方面的化合物显著增加所有三种细胞类型中的PpIX积累，高于和超过用单独施用ALA或MAL或与铁螯合剂CP94(3)组合使用实现的PpIX积累。这些发现提示了体外AP2-18(8)是一种在可能的显著更短时间内产生显著更高水平PpIX的化合物，并且因此AP2-18(8)具有根本上改善PpIX-诱导的PDT的潜能。进行进一步的实验，以确定PpIX积累的这种显著增加是否可转化成照射时对细胞杀伤的增加。
2C.PDT效力
为了评估AP2-18(8)对PpIX-诱导的PDT效力的作用，将相同的三种细胞类型暴露于等摩尔浓度的ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、AP2-18(8)(如先前所描述)，并在黑暗中孵育4小时。接着，如之前那样，量化PpIX积累的水平，然后用红光照射(37J/cm2；635±2nm；Aktilite，Galderma，UK)。也测定在照射后立即存在的剩余PpIX水平，并且计算PpIX水平(PpIX光漂白)的改变的百分数(图5A、6A和7A)。然后，使用NRU试验评估细胞活力(如先前所描述)，将这些数据针对空白对照细胞(暴露于正常细胞培养基)归一化，并且表示为活力细胞的百分数(图5B、6B和7B)。随后进行的统计分析的结果分别呈现在图5C、6C和7C中。
用人真皮成纤维细胞(84BR)测试的结果显示在下面表4和5，以及图5A、5B和5C中。用人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)测试的结果显示在下面表6和7中，以及显示在图6A、6B和6C中。用人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)测试的结果显示在下面表8和9中，以及显示在图7A、7B和7C中。
表4：照射之后，人真皮成纤维细胞(84BR)中的PpIX光漂白-缺失的数据是由于在该重复中的这些孔中存在感染所以丢弃数据
表5：照射之后，人真皮成纤维细胞(84BR)细胞活力
表6：照射之后，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)中的PpIX光漂白-缺失的数据是由于在该重复中的这些孔中存在感染所以丢弃数据
表7：照射之后，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)的细胞活力-缺失的数据是由于在该重复中的这些孔中存在感染所以丢弃数据
表8：照射之后，人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)中的PpIX光漂白-缺失的数据是由于在该重复中的这些孔中存在感染所以丢弃数据
表9：照射之后，人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)的细胞活力-缺失的数据是由于在该重复中的这些孔中存在感染所以丢弃数据
在研究的大量处理组中观察实质的PpIX光漂白(即光照期间PpIX荧光性的减少)(见图5A、6A和7A)。这表明光处理期间消耗PpIX，并且表明在所有研究的三种细胞类型中发生PDT。但是，在这里采用的具体处理参数下很少实现完全的PpIX光漂白。
细胞活力结果的分析(见图5B和5C、6B和6C和7B和7C)揭示空白对照和过氧化氢阳性对照组在所有三种细胞类型中成功，分别产生很少的细胞毒性和大量的细胞死亡。在人真皮成纤维细胞(84BR；图5B和5C)中，铁螯合剂CP94(3)的使用以浓度依赖性方式改善了ALA和MAL的PDT效果，但是发现对于新的化合物AP2-18(8)而言，当考虑采用最低浓度(250μM)时在PDT之后在减少细胞活力方面(比任何其他所研究的处理参数)显著更好。在没有实现显著性的更高的剂量下，AP2-18(8)产生的细胞杀伤的水平等于(或优于)用其他处理组观察的水平。在人上皮鳞状的癌细胞(A431；图6B和6C)中也观察到了非常类似的趋势和细胞活力的显著减小。所以可得出结论，这些具体的细胞类型中，AP2-18(8)是PpIX-诱导的PDT的有效前药，其比在配合或不配合铁螯合剂CP94(3)的情况下施用ALA或MAL能以更低的浓度实现该效果。但是，在人胶质母细胞瘤细胞(U87MG；图7B和7C)中用AP2-18(8)观察到了超过和优于在配合和不配合铁螯合剂CP94(3)的情况下施用的其他前药的对细胞杀伤的较不显著的改善，因为这些细胞好像对较低剂量的PpIX-PDT的细胞毒素作用更易感。尽管这样，AP2-18(8)也在该细胞类型中仍产生非常有效的PpIX-诱导的PDT细胞杀伤。
用化合物AP2-18(8)进行的对PpIX-诱导的PDT观察到的细胞毒性的显著增加可潜在地转化成临床PDT设置，从而为经历皮肤病学PDT和其他PDT应用的患者产生大量的益处。
2D.在不同的孵育时间中，人上皮鳞状的癌细胞(A431)中的PDT效力
人上皮鳞状的癌细胞(A431)暴露于等摩尔浓度的ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、AP2-18(8)(如先前所描述的)并且在黑暗中孵育2、3或4小时的孵育时间。然后测量PpIX积累的水平；结果显示在下面表10中，并且显示在图8A(ALA、ALA和CP94(3))、图8B(MAL、MAL和CP94(3))和图8C(CP94(3))中。图9为，将人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)用化合物(一种或多种)孵育2小时(图9A(i))、3小时(图9B(i))和4小时(图9C(i))之后，暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、AP2-18(8)之后，测量人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)中的PpIX积累的水平，对该PpIX积累的水平进行比较。对于每个孵育时间的相应的统计分析的结果呈现在图9A(ii)(2小时)、图9B(ii)(3小时)和图9C(ii)(4小时)中。
在相关的孵育时间之后，用红光照射细胞(37J/cm2；635±2nm；Aktilite，Galderma，UK)。然后使用the NRU试验评估细胞活力(如先前所描述的)；细胞活力测试的结果显示在下面表11中。将这些数据针对空白对照细胞(其暴露于正常细胞培养基)归一化并且在图10A(ALA、ALA和CP94(3))、10B(MAL，MAL和CP94(3))和10C(AP2-18(8))中呈现为活力细胞的百分数。图11比较在细胞已经用化合物(一种或多种)孵育2小时(图11A(i))、3小时(图11B(i))和4小时(图11C(i))之后，暴露于ALA、ALA和CP94(3)、MAL、MAL和CP94(3)、AP2-18(8)之后活力细胞的百分数。每个孵育时间的相应的统计分析的结果呈现在图11A(ii)(2小时)、图11B(ii)(3小时)和图11C(ii)(4小时)中。
表10：在不同的孵育时间之后，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)中测量的PpIX荧光性
表11：在不同的孵育时间之后，人上皮鳞状的细胞癌细胞(A431)的细胞活力–在3小时时间点进行额外的活力实验(另外三个重复)，其在该时间点产生比在2小时或4小时更多的数据。
图8和9指示所有三种研究的PpIX-前药的PpIX水平随时间增加。清楚的是，尽管将铁螯合剂CP94(3)添加至ALA或MAL孵育时间改善PpIX水平，但是这不如组合的铁螯合PpIX-前药AP2-18(8)(A431人鳞状的上皮癌细胞中1000μM AP2-18(8)的四小时孵育产生相比于所研究的任何其他处理参数在统计学上显著更高的PpIX水平)。也应注意，最低剂量的AP2-18(8)(250μM)在研究的最短孵育时间(2小时)下也产生比在最长孵育时间(4小时)下采用的最高剂量的ALA或MAL(1000μM)更多的PpIX。重要地，用AP2-18(8)观察的增加的PpIX积累也在照射(图10和11)时，转换成细胞杀伤在统计学上的显著增加(当与ALA或MAL所产生的相比较时)，在4小时产生最大的细胞毒性。

Claims (19)

1.一种化合物，其是式(I)的化合物或其任何盐：
其中
R1是C1-C6烷基基团，
R2是H或C1-C6烷基基团，
R3是H或C1-C6烷基基团，和
n是0至5的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其是如权利要求1所定义的式(I)的化合物，式(Ia)的盐或式(Ib)的盐：
其中
R1、R2、R3和n如权利要求1中所定义；和
每个X-独立地选自一价抗衡离子，所述一价抗衡离子是任何常见酸的共轭碱。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中X-是Cl-。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中R1是乙基，R2和R3是H，n是1。
5.根据权利要求4所述的化合物，其是式(Ic)的盐:
6.一种药学组合物，其包括根据权利要求1-3中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
7.一种药学组合物，其包括根据权利要求4-5中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
8.一种制备根据权利要求1-5中任一项所述的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)通过酯化反应使式(II)的化合物与式(III)的化合物反应，以形成式(IV)的化合物；
其根据下述反应方案：
其中R1、R2、R3和n如权利要求1中所定义；和
RPG1和RPG2是保护基团，所述保护基团是能够保护氧原子或氮原子的基团。
9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括下述步骤：
(b1)将式(IV)的化合物去保护，以产生式(I)的化合物；
其根据下述反应方案：
10.根据权利要求8所述的方法，进一步包括下述步骤：
(b2)将式(IV)的化合物在存在H+X-酸的情况下去保护，以产生式(Ia)的盐；
其根据下述反应方案：
其中X-独立地选自一价抗衡离子，所述一价抗衡离子是任何常见酸的共轭碱。
11.根据权利要求8所述的方法，进一步包括下述步骤：
(b3)将式(IV)的化合物在存在H+X-酸的情况下去保护，以产生式(Ib)的盐；
其根据下述反应方案：
其中X-独立地选自一价抗衡离子，所述一价抗衡离子是任何常见酸的共轭碱。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备一种应用于光动力疗法的药物中的用途。
13.根据权利要求4-5中任一项所述的化合物在制备一种应用于光动力疗法的药物中的用途。
14.根据权利要求12或13所述的用途，用于通过光动力疗法治疗由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况。
15.根据权利要求12或13所述的用途，用于通过光动力疗法治疗癌症。
16.根据权利要求12或13所述的用途，用于通过光动力疗法治疗硬皮病、硬化性苔癣、牛皮癣、疣、慢性创伤、痤疮、微生物感染、寄生虫感染、或风湿性关节炎；或用于在治疗白血病时通过光动力疗法的骨髓净化。
17.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物的在制备一种应用于诊断病况的方法的药物中的用途，其中所述病况由细胞的异常增殖引起和/或加剧。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备一种治疗遭受或处在遭受由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况的风险中的人或动物患者的方法中的药物中的用途，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，以及作为光动力疗法的一部分，将患者包含所述化合物的区域暴露于光。
19.根据权利要求4-5中任一项所述的化合物在制备一种治疗遭受或处在遭受由细胞的异常增殖引起和/或加剧的病况的风险中的人或动物患者的方法中的药物中的用途，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求4-5中任一项所述的化合物，以及作为光动力疗法的一部分，将患者包含所述化合物的区域暴露于光。
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