CN113713117B - 一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域。本发明设计并合成了一系列白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，其是将抗肿瘤药物分别于胱胺、硬脂酸以及马来酰亚胺连接，通过特定的结构如胱胺铜离子络合物，硬脂酸，马来酰亚胺模拟体内血清白蛋白结合的特点在体外使抗肿瘤药物与血清白蛋白形成结合物，增加药物水溶性，并且不改变血清白蛋白的构象，更有利于发挥血清白蛋白的靶向作用。同时添加了肿瘤微环境刺激反应性化学键，有利于药物在靶部位的释放，注入体内后发挥更好的抗肿瘤效果。

Description

一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，癌症的发病率和死亡率不断上升，对人类的健康造成了极大的威胁。但是大多数抗肿瘤药物水溶性差，不良反应严重，极大地限制了在临床中的应用。因此，如何选择与构建具有高生物相容性的药物载体，实现抗肿瘤药物的靶向递送已成为现今肿瘤诊疗领域一项极具挑战的课题。血清白蛋白是血液里最主要的蛋白质，血清白蛋白共有585个氨基酸，晶体研究表明，这些氨基酸组成了三个立体结构类似的结构域，分别为Ⅰ型结构域、Ⅱ型结构域和Ⅲ型结构域，而每个结构域中又分别包含两个次级结构域，即结构域A和次结构域B。已经证明部分生理物质(脂肪酸、胆固醇、胆红素)、金属离子(如锌离子、铜离子)以及药物分子(如华法林、布洛芬、紫杉醇等)均能插入血清白蛋白不同结构域的腔体或通过疏水作用以及静电作用与蛋白非共价结合。另外有研究表明白蛋白中存在34位半胱氨酸的游离巯基且活性强，经特定基团修饰的药物能够与蛋白巯基共价结合，从而借助血清白蛋白在体内传递。
研究还发现，由于肿瘤细胞表面过表达血清白蛋白结合蛋白，如清蛋白激活蛋白/糖蛋白60(gp60)、酸性富含半胱氨酸分泌性蛋白(SPARC)、糖蛋白18/糖蛋白30(gp18/gp30)等，故血清白蛋白能够长期聚集于肿瘤间隙和进入肿瘤内部。血清白蛋白的结构学特点、超长半衰期、良好的生物相容性以及对肿瘤的靶向性使其成为构建药物载体的优异材料。但是血清白蛋白被作为一种生物载体应用于肿瘤临床治疗，仍存在一些未解决的问题。研究发现，白蛋白受体对天然血清白蛋白具有结合作用，且这种作用与蛋白的构象有关。然而药物在与蛋白结合的过程中，常常会导致蛋白的构象发生变化，使蛋白发生“变性”，影响其与受体的亲和性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用。本发明设计并合成了一系列白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，其是将抗肿瘤药物分别于胱胺、硬脂酸以及马来酰亚胺连接，通过特定的结构如胱胺铜离子络合物，硬脂酸，马来酰亚胺模拟体内血清白蛋白结合的特点在体外使抗肿瘤药物与血清白蛋白形成结合物，增加药物水溶性，并且不改变血清白蛋白的构象，更有利于发挥血清白蛋白的靶向作用。同时添加了肿瘤微环境刺激反应性化学键，有利于药物在靶部位的释放，注入体内后发挥更好的抗肿瘤效果。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种化合物，所述化合物为抗肿瘤药物与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺连接获得。
其中，所述抗肿瘤药物包括但不限于多烯紫杉醇类、紫衫烷类、蒽醌类或核苷类药物经化学修饰含有上述仿生基团的前药。
所述的脂肪酸包括任意能够与血清白蛋白结合的脂肪酸；如硬脂酸、油酸、亚油酸等。
所述连接方式具体包括：所述药物分别通过氧化还原敏感的二硫键或pH敏感的酰腙键分别与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺连接，从而实现药物肿瘤微环境敏感释放。
具体的，所述化合物具有如式5、9和13所示的结构式：
其中，紫杉醇-胱胺(目标化合物5)，其结构中含有胱胺结构，可以与铜离子形成络合物，进而在体外模拟铜离子生理状态下与白蛋白结合，胱胺中含有二硫键响应肿瘤微环境释放药物；
紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)，其结构中含有硬脂酸结构，体外模拟硬脂酸生理状态下与白蛋白结合，同时在连接臂二硫代二丙酸中引入二硫键响应肿瘤微环境释放药物；
紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)，其结构中含有马来酰亚胺基，在体外利用马来酰亚胺基与白蛋白的34位游离巯基结合，同时以乙酰丙酸为连接臂与6-马来酰亚胺己酰肼的肼键形成酰腙键具有肿瘤微环境响应释放药物的特点。
本发明的第二个方面，提供上述化合物的制备方法，所述制备方法包括：
将抗肿瘤药物分别与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺进行连接。
其中，所述抗肿瘤药物包括但不限于多烯紫杉醇类、紫衫烷类、蒽醌类或核苷类药物经化学修饰含有上述仿生基团的前药。
所述的脂肪酸包括任意能够与血清白蛋白结合的脂肪酸；如硬脂酸、油酸、亚油酸等。
所述连接方式具体包括：所述药物分别通过氧化还原敏感的二硫键或pH敏感的酰腙键分别与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺连接。
具体的，所述制备方法包括：
当合成目标化合物5时，所述合成路线包括：
具体的，紫杉醇2’端羟基与丁二酸酐在室温N2保护，DMAP的催化下发生酯化反应得到紫杉醇-丁二酸酐，后者再与一端氨基Boc保护的胱胺在HOBt，EDCI，和TEA的催化下发生酰胺反应，分离纯化即得含有二硫键和游离氨基的紫杉醇-胱胺。
当合成目标化合物9时，所述合成路线包括：
具体的，3，3-二硫代二丙酸在乙酰氯中加热回流反应，乙醚沉淀产物，干燥，获得二硫代二丙酸酐；紫杉醇与二硫代二丙酸酐在室温，N2保护，DMAP催化，吡啶溶液中反应，得到紫杉醇-二硫代二丙酸；紫杉醇-二硫代二丙酸与聚乙二醇单硬脂酸酯N2保护，DMAP和EDCI的催化下反应，分离纯化即得。
当合成目标化合物13时，所述合成路线包括：
具体的，紫杉醇与乙酰丙酸经DMAP和EDCI的催化作用发生酯化反应生成紫杉醇-乙酰丙酸，紫杉醇-乙酰丙酸的羰基与6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐的肼键在无水甲醇中经三氟乙酸(TFA)催化下形成腙键，分离纯化即得。
本发明的第三个方面，提供一种白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，所述药物包含上述化合物。本发明获得的前体药物通过特定的结构如胱胺铜离子、硬脂酸和马来酰亚胺模拟体内血清白蛋白结合的特点在体外与血清白蛋白形成结合物，并且不改变血清白蛋白的构象，增加药物水溶性，便于注射。同时，本发明设计的三种具体紫杉醇前药，其具有上述特定结构，能够与血清白蛋白结合，基于肿瘤细胞的特殊环境(高谷胱甘肽和酸性)，在前药的结构中引入了氧化还原敏感键(二硫键)、pH敏感键(腙键)以实现靶部位的药物释放。
本发明的第四个方面，提供上述第一方面化合物和/或第三方面前体药物在体外与血清白蛋白结合的方法，所述方法包括：将溶解于有机溶剂中的上述化合物和/或前体药物与含有白蛋白的水溶液混合，纯化后即得。
所述有机溶剂可以是乙醇或DMSO；
所述化合物和/或第三方面前体药物与血清白蛋白的摩尔比为1：1～1：8。
本发明的第五个方面，提供上述第四方面的方法获得的上述第一方面化合物和/或第三方面前体药物与血清白蛋白的结合物。通过在给药前将药物与白蛋白结合，减少了药物在血浆中过早裂解和不稳定，并且不改变血清白蛋白的构象，更有利于发挥血清白蛋白的作用，与原位白蛋白结合前药相比，确保了药物与白蛋白载体的完全结合，可能获得良好的抗肿瘤疗效。
本发明的第六个方面，提供上述第一方面化合物、第三方面前体药物和/或第五方面结合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第七个方面，提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明第一方面化合物、第三方面前体药物或第五方面结合物。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案设计的一系列肿瘤环境响应的pH敏感释放药物或氧化还原敏感释放药物的白蛋白结合型抗肿瘤药物前体药物。以抗肿瘤药物紫杉醇为模型药物，设计了3种紫杉醇前体药物。依据仿生的原理，紫杉醇分别与胱胺、硬脂酸和马来酰亚胺连接。体外状态下，模拟体内生理物质与血清白蛋白结合的特点，前药可通过特定的结构如胱胺铜离子络合物、硬脂酸、马来酰亚胺，分别与血清白蛋白形成结合物，改善了药物的水溶性，增强可注射性，并且不改变血清白蛋白的构象，更有利于发挥血清白蛋白的靶向转运作用。与原位白蛋白结合前药相比，减少了药物在血浆中过早裂解和不稳定，确保药物与白蛋白载体的完全结合，可能获得良好的抗肿瘤疗效。
另外基于肿瘤细胞的特殊环境(高谷胱甘肽和酸性)，前药紫杉醇-胱胺(目标化合物5)、紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)设计由氧化还原敏感键(二硫键)连接，前药紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)由pH敏感键(酰腙键)连接，有利于在肿瘤部位的快速释药，通过体内外实验证明结合物具有良好的抗肿瘤疗效，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明目标化合物5紫杉醇-胱胺1HNMR谱图；
图2为本发明目标化合物5紫杉醇-胱胺MS谱图；
图3为本发明目标化合物5紫杉醇-胱胺IR谱图；
图4为本发明目标化合物9紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯1HNMR谱图；
图5为本发明目标化合物13紫杉醇-马来酰亚胺1HNMR谱图；
图6为本发明目标化合物13紫杉醇-马来酰亚胺MS谱图；
图7为本发明中人血清白蛋白的圆二色谱图以及人血清白蛋白与目标化合物9不同比例结合后的圆二色谱对比图；
图8为本发明中目标化合物9与人血清白蛋白构成的结合物冲稀之后的粒径图；
图9为本发明中紫杉醇-乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物在含有DTT与不含有DTT的PBS缓冲液中紫杉醇随时间的累计释放曲线；
图10为本发明中紫杉醇-马来酰亚胺白蛋白结合物在PH7.4和PH5的PBS缓冲液中前药紫杉醇-乙酰丙酸随时间的累计释放曲线；
图11为本发明中MCF-7细胞的紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物对癌细胞抑制实验；
图12为本发明中MCF-7细胞的凋亡状态荧光显微镜结果图(药物浓度A-2.5/B-5/C-10/D-20μg/ml)；
图13为本发明中MCF-7细胞的凋亡状态流式结果图；
图14为本发明中荷瘤小鼠肿瘤体积随时间变化图；
图15为本发明中荷瘤小鼠体重随时间的变化图；
图16为本发明中给药治疗后小鼠主要器官和肿瘤组织的H&E染色实验结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
如前所述，白蛋白受体对天然血清白蛋白具有结合作用，且这种作用与蛋白的构象有关。然而药物在与蛋白结合的过程中，常常会导致蛋白的构象发生变化，使蛋白发生“变性”，影响其与受体的亲和性。
有鉴于此，本发明利生理物质衍生物片段对抗肿瘤药物进行结构修饰，引入与白蛋白结合的位点，使药物与血清白蛋白发生稳定的结合的同时不改变蛋白构象，增强其与受体的结合能力，促进其体内分布，提高药物疗效。
肿瘤微环境的酸性和高谷胱甘肽等特点已被广泛用于设计刺激-响应型药物递送系统。因此将肿瘤微环境敏感的化学键引入到药物与血清白蛋白的复合物中是一种有效的策略。含有酸敏感化学键(酰胺键，腙键，肟键)的前体药物到达肿瘤组织后，经肿瘤组织微环境(pH6.5)，肿瘤细胞核内体(pH6.0)进入溶酶体(pH5.0)，pH敏感型前体药物在该条件下母体药物快速释放，杀伤肿瘤细胞。与正常组织相比，肿瘤细胞内存在更高浓度的谷胱甘肽，因此具有氧化还原敏感型功能基(例如双硫键)的给药系统能快速释放药物，杀伤肿瘤细胞。基于肿瘤的这些特性，本发明在设计紫杉醇小分子前药的结构中引入了酸性敏感(腙键)和氧化还原敏感(双硫键)来提高药物在靶部位的释放。
基于以上原理，本发明设计了一类含有硬脂酸、金属离子以及马来酰亚胺基结构的白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，能够在体外与白蛋白仿生结合，增加药物水溶性，且不改变白蛋白构象。同时添加了肿瘤微环境刺激反应性化学键，有利于肿瘤环境的药物释放。具体的以紫杉醇为药物模型设计了3种紫杉醇小分子前体药物。
①合成得到紫杉醇-胱氨(目标化合物5)，利用胱胺的氨基与铜离子形成金属有机络合物，借助铜离子作为结合位点与血清白蛋白结合，构建紫杉醇白蛋白复合物，同时引入氧化还原敏感性二硫键响应肿瘤高谷胱甘肽微环境释放药物。②紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)，引入硬脂酸作为结合位点与血清白蛋白结合构建紫杉醇白蛋白复合物，同时也引入了氧化还原敏感性二硫键响应肿瘤高谷胱甘肽微环境释放药物。③合成了紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)，利用乙酰丙酸，将马来酰亚胺己酰肼通过pH敏感酰腙键与紫杉醇连接，进一步利用马来酰亚胺与白蛋白的34位半胱氨酸上的巯基进行精确共价交联，构建pH敏感紫杉醇血清白蛋白结合物。
同时，以紫杉醇-马来酰亚胺和紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯为模型，构建血浆白蛋白结合物，考察理化性质以及生物活性。证实形成结合物后白蛋白的构象没有改变，生物活性依然保留。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种化合物，所述化合物为抗肿瘤药物与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺连接获得。
其中，所述抗肿瘤药物包括但不限于多烯紫杉醇类、紫衫烷类、蒽醌类或核苷类药物经化学修饰含有上述仿生基团的前药。
所述的脂肪酸包括任意能够与血清白蛋白结合的脂肪酸；如硬脂酸、油酸、亚油酸等。
所述连接方式具体包括：所述药物分别通过氧化还原敏感的二硫键或pH敏感的酰腙键分别与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺连接，从而实现药物肿瘤微环境敏感释放。
具体的，所述化合物具有如式5、9和13所示的结构式：
其中，紫杉醇-胱胺(目标化合物5)，其结构中含有胱胺结构，可以与铜离子形成络合物，进而在体外模拟铜离子生理状态下与白蛋白结合，胱胺中含有二硫键响应肿瘤微环境释放药物；
紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)，其结构中含有硬脂酸结构，体外模拟硬脂酸生理状态下与白蛋白结合，同时在连接臂二硫代二丙酸中引入二硫键响应肿瘤微环境释放药物；
紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)，其结构中含有马来酰亚胺基，在体外利用马来酰亚胺基与白蛋白的34位游离巯基结合，同时以乙酰丙酸为连接臂与6-马来酰亚胺己酰肼的肼键形成酰腙键具有肿瘤微环境响应释放药物的特点。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物的制备方法，所述制备方法包括：
将抗肿瘤药物分别与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺进行连接。
其中，所述抗肿瘤药物包括但不限于多烯紫杉醇类、紫衫烷类、蒽醌类或核苷类药物经化学修饰含有上述仿生基团的前药。
所述的脂肪酸包括任意能够与血清白蛋白结合的脂肪酸；如硬脂酸、油酸、亚油酸等。
所述连接方式具体包括：所述药物分别通过氧化还原敏感的二硫键或pH敏感的酰腙键分别与脂肪酸、马来酰亚胺或胱胺连接。
具体的，所述制备方法包括：
当合成目标化合物5时，所述合成路线包括：
具体的，紫杉醇(简记为PTX)的活性基团2’端羟基与丁二酸酐(化合物1)在无水二氯甲烷(DCM)中反应，经4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化，室温下N2保护，发生酯化反应，经柱层析分离纯化得到白色粉末状化合物紫杉醇-丁二酸酐(化合物2)。胱胺二盐酸盐(化合物3)在甲醇溶剂中加入少量三乙胺(TEA)，冰浴下搅拌脱盐，随后加入(Boc)2O增加一端保护基，经冰乙醚沉淀，二氯甲烷萃取，真空干燥箱过夜得到一端Boc保护的胱胺(化合物4)。紫杉醇-丁二酸酐(化合物2)通过丁二酸酐的羧基与胱胺(一端Boc保护)(化合物4)的氨基在干燥的二氯甲烷(DCM)中发生酰胺反应，经1-羟基苯并三唑(HOBt)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，三乙胺(TEA)催化，室温下N2保护，反应完成时，加入三氟乙酸(TFA)和无水二氯甲烷(DCM)，冰浴条件下搅拌，脱Boc，调节pH，水洗，有机溶剂萃取，真空干燥，硅胶层析柱对获得的粗产物进行提纯，合成了含有氨基和二硫键的目标化合物紫杉醇-胱胺(目标化合物5)。
当合成目标化合物9时，所述合成路线包括：
具体的，3，3-二硫代二丙酸(化合物6)与乙酰氯在加热回流的条件下亲核加成生成二硫代二丙酸酐(化合物7)，旋蒸除去乙酰氯，乙醚沉淀获得淡黄色固体二硫代二丙酸酐(化合物7)。紫杉醇(PTX)与二硫代二丙酸酐(化合物7)在吡啶溶剂中4-二甲基吡啶(DMAP)的催化下发生酯化反应，N2保护下32℃水浴。旋蒸除去吡啶，使用pH约为3.0的稀盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液，以及饱和氯化钠溶液分别洗涤三次，随后使用二氯甲烷进行萃取，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析的方法分离获得产物(化合物8)。化合物8在二氯甲烷溶剂中4-二甲基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的催化下活化羧基后加入聚乙二醇单硬脂酸酯(PGM)，冰浴下N2保护，反应完成后旋转蒸发除去二氯甲烷，加入水溶液洗涤沉淀，过滤得到淡黄色固体，硅胶柱层析分离纯化产物，得前药紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)。
当合成目标化合物13时，所述合成路线包括：
具体的，紫杉醇(PTX)与乙酰丙酸(化合物10)在干燥的二氯甲烷中经4-二甲基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的催化作用发生酯化反应生成紫杉醇-乙酰丙酸(化合物11)，化合物11的羰基与6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐(化合物12)的肼键在无水甲醇中经三氟乙酸(TFA)催化下形成腙键，得到紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)。
进一步的，通过白蛋白上已有的巯基与马来酰亚胺连接形成紫杉醇-马来酰亚胺与人血清白蛋白的结合物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，所述药物包含上述化合物。本发明获得的前体药物通过特定的结构如胱胺铜离子、硬脂酸和马来酰亚胺模拟体内血清白蛋白结合的特点在体外与血清白蛋白形成结合物，并且不改变血清白蛋白的构象，增加药物水溶性，便于注射。同时，本发明设计的三种具体紫杉醇前药，其具有上述特定结构，能够与血清白蛋白结合，基于肿瘤细胞的特殊环境(高谷胱甘肽和酸性)，在前药的结构中引入了氧化还原敏感键(二硫键)、pH敏感键(腙键)以实现靶部位的药物释放。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述第一方面化合物和/或第三方面前体药物在体外与血清白蛋白结合的方法，所述方法包括：将溶解于有机溶剂中的上述化合物和/或前体药物与含有白蛋白的水溶液混合，纯化后即得。
所述有机溶剂可以是乙醇或DMSO；
所述化合物和/或前体药物与血清白蛋白的摩尔比为1：1～1：8。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法获得的上述第一方面化合物和/或第三方面前体药物与血清白蛋白的结合物。通过在给药前将药物与白蛋白结合，减少了药物在血浆中过早裂解和不稳定，并且不改变血清白蛋白的构象，更有利于发挥血清白蛋白的作用，与原位白蛋白结合前药相比，确保了药物与白蛋白载体的完全结合，可能获得良好的抗肿瘤疗效。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物、前体药物和/或结合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。实体瘤可以是乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(Wilmstumor)。此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。血液瘤可以是侵略性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓样白血病(CML/AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和T-细胞型淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及AIDS相关的恶性瘤。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明化合物、前体药物或结合物。
本发明所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
本发明所述治疗有效量是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药物制剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，所述响应包括减轻或部分减轻所述治疗疾病、综合征、病症或障碍的症状。
本领域的研究者、兽医、医生或其他医疗人员可根据临床试验或者本领域其他公知的手段获知可使用的治疗有效量的范围。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1目标化合物5的合成
合成得到的紫杉醇-胱氨(目标化合物5)，利用胱胺的氨基与铜离子形成金属有机络合物，借助铜离子作为结合位点与血清白蛋白结合，同时二硫键响应肿瘤微环境实现氧化还原敏感释药。
目标化合物5的合成步骤及结构式如下：
化合物2的合成：称取紫杉醇(PTX)200mg、丁二酸酐(化合物1)46.83mg、4-二甲氨基吡啶(DMAP)14.3mg于圆底烧瓶中，加入8mL干燥的二氯甲烷(DCM)，室温，N2保护，搅拌24h。反应完成时，采用薄层色谱(TLC)法监测反应情况(展开剂为DCM：CH3OH/25:1)，并用溴甲酚绿显色验证，通过减压旋转蒸发法除掉有机溶剂。硅胶柱梯度洗脱对混合物进行分离提纯，用DCM：CH3OH(30:1-10:1)梯度洗脱。减压旋转蒸发除掉有机溶剂得到产率为92％的白色固体产物紫杉醇-丁二酸酐(化合物2)。
化合物4的合成：称取胱胺二盐酸盐(化合物3)500mg于圆底烧瓶中，加入甲醇25mL和三乙胺0.92mL，在冰浴条件下搅拌30min。称取二碳酸二叔丁酯((Boc)2O)480mg逐滴加入上述反应液中，继续反应1h。然后通过减压旋转蒸发法除掉甲醇，冰乙醚洗3次后，用1MNaOH水溶液调pH至8，二氯甲烷萃取，有机层经水洗2次后收集并加入适量无水氯化钙，减压旋蒸，除去有机溶剂，置于真空干燥箱中过夜，得到胱胺-Boc。
目标化合物5的合成：称取紫杉醇-丁二酸酐(化合物2)200mg、胱胺-Boc(化合物4)94.4mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)57.6mg、1-羟基苯并三唑(HOBt)40.6mg、三乙胺(TEA)40μL于圆底烧瓶中，加入8mL干燥的二氯甲烷(DCM)，室温，N2保护下搅拌24h。反应完成时，加入三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(v:v/1:5)，冰浴条件下搅拌1h。用0.1MNaHCO3溶液调pH至8，水洗2遍，收集有机层并加入适量无水氯化钙，置于真空干燥箱中过夜。然后，经硅胶层析柱对获得的粗产物进行提纯，洗脱剂为DCM：CH3OH(50:1-10:1)，得到产率为51％的目标化合物紫杉醇-胱胺(目标化合物5)，上述合成得到的紫杉醇-胱氨(目标化合物5)，利用胱胺的氨基与铜离子形成金属有机络合物，借助铜离子作为结合位点与血清白蛋白结合，同时二硫键响应肿瘤微环境实现氧化还原敏感释药。
目标化合物的成功合成结构由1HNMR(溶剂：d6-CDCl3)谱，MS谱和IR谱图表征，结果分别如图1，图2，图3所示，波谱解释如下：
紫杉醇-胱胺(目标化合物5)前药的1HNMR(d6-CDCl3，ppm)谱图：6.46ppm处为新增加的胱胺酰胺键氮上的活泼氢。2.39ppm、1.99ppm、2.20ppm、3.33ppm分别为胱胺上的4个亚甲基氢峰。
质谱结果：紫杉醇-胱胺(目标化合物5)的分子离子峰为1087.24，1088.6为[M+H]+。
傅里叶红外结果：谱图上显现出了伯胺基的双吸收峰，分别为2850.38cm-1和2920.61cm-1。
实施例2目标化合物9的合成
合成得到的紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)引入聚乙二醇单硬脂酸酯(Polyethylene Glycol Monostearate，PGM，n＝4)的硬脂酸长链作为结合位点，能与血清白蛋白结合构建紫杉醇白蛋白结合物。同时3，3-二硫代二丙酸作为连接臂引入的二硫键响应肿瘤微环境实现氧化还原敏感释药。
目标化合物9的合成步骤及结构式如下：
化合物7的合成：称取3，3-二硫代二丙酸(化合物6)1g溶于约6ml乙酰氯中，于70℃下加热回流。反应4小时后，用旋转蒸发仪于70℃下除去乙酰氯。冷却之后向反应烧瓶中加入适量冰乙醚，沉淀产物。沉淀完全后，移去冰乙醚，将所得的沉淀置于真空干燥箱中过夜干燥，即得到脱水生成的二硫代二丙酸酐(化合物7)。
化合物8的合成：分别称取紫杉醇(PTX)120mg，二硫代二丙酸酐(化合物7)264mg和4-二甲基吡啶(DMAP)24mg于25ml容量瓶中，加入3ml吡啶，反应温度为室温，在氮气的保护下进行反应，反应时间36小时。反应结束后，旋干吡啶。加入pH4-5的盐酸溶液洗三次，去掉残留的吡啶。之后用二氯甲烷溶解沉淀，滤掉不溶物。将产物点板，进行薄层层析，发现PTX原料点消失。采用柱层析法纯化产物，得到的纯化后的产物(化合物8)。
目标化合物9的合成：称取上述合成的化合物8(40mg)于圆底烧瓶中，加入1.5ml二氯甲烷，称取4-二甲基吡啶(DMAP)8mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)12mg用1.5ml二氯甲烷溶解，冰浴下滴加至圆底烧瓶中，滴加完成后，氮气保护反应24h。另称取聚乙二醇单硬脂酸酯(PGM)150mg于圆底烧瓶中，加入2ml二氯甲烷，将上述活化的化合物8溶液滴加至聚乙二醇单硬脂酸酯(PGM)溶液中，滴加完成后N2保护反应48h，旋转蒸发除去二氯甲烷，加入水溶液15ml洗涤沉淀3次，过滤得到淡黄色固体，真空干燥过夜，硅胶柱层析分离纯化得到紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)，其成功合成通过1HNMR(溶剂：d6-CDCl3)来表征，结果如图4所示。
紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)的1HNMR(d6-CDCl3，ppm)谱图：聚乙二醇单硬脂酸酯(PGM)的核磁共振氢谱中，1.25ppm处的多重吸收峰为单硬脂酸中的长链脂肪烃，0.88ppm的三重峰为硬脂酸末端的甲基吸收峰，在目标化合物9的核磁氢谱中，同时具有紫杉醇(PTX)的7.0-8.0ppm的苯环氢吸收峰、以及聚乙二醇单硬脂酸酯(PGM)在1.2ppm和0.88ppm附近的特征吸收峰，表明了紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯(目标化合物9)的成功合成。
实施例3目标化合物13的合成
合成得到紫杉醇-马来酰亚胺，利用乙酰丙酸，将马来酰亚胺己酰肼通过pH敏感酰腙键与紫杉醇连接，能够利用马来酰亚胺与白蛋白的34位半胱氨酸上的巯基进行精确共价交联，构建pH敏感的紫杉醇血清白蛋白结合物。
目标化合物13的合成步骤及结构式如下：
化合物11的合成：称取紫杉醇(PTX)100mg，4-二甲基吡啶(DMAP)21.5mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)33.7mg溶于冷的无水二氯甲烷中，移液枪移取12微升乙酰丙酸(化合物10)加入到上述溶液中，N2保护下反应24小时，薄层色谱法(二氯甲烷：甲醇＝25：1)监测反应。反应完成后，旋转蒸发除去二氯甲烷，重新加入适量二氯甲烷，用pH2左右的酸水溶液洗涤三次，饱和食盐水洗涤三次，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去二氯甲烷，于真空干燥箱中干燥过夜，得到白色粉末状固体，产率较高，可直接用于下一步反应。
目标化合物13的合成：称取紫杉醇-乙酰丙酸(化合物11)100mg，6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐(化合物12)47.76mg，溶于15mL无水甲醇中，加入7μL的三氟乙酸(TFA)催化反应的进行，室温下反应12小时，薄层色谱法监测反应的发生。反应结束后，减压旋转蒸发除去甲醇，重新加入二氯甲烷，多次减压旋蒸，得到白色粉末状固体，经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50:1)
分离纯化产物紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)，其成功合成通过1HNMR(溶剂：d6-DMSO)，MS谱来表征，结果如图5，图6所示。解释如下：
紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)的核磁谱图中，7.0ppm处出现了马来酰亚胺中-COCH＝CHCO-的吸收峰，同时具有紫杉醇(PTX)7.0-8.0ppm的苯环氢特征吸收峰，表明了紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)的成功合成。
质谱结果：紫杉醇-马来酰亚胺(目标化合物13)的分子离子峰为1158.47，1159.19为[M+H]+峰，1181.39为[M+Na]+峰。
实施例4三种紫杉醇小分子前药与人血清白蛋白的结合
(1)紫杉醇-胱胺、紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯与人血清白蛋白结合的制备方法
人血清白蛋白与紫杉醇-胱胺结合物的制备方法。人血清白蛋白水溶液(5mg/ml)20ml转移到圆底烧瓶中，然后加入100μlNaOH溶液(1M)，搅拌15分钟后，加入500μl硝酸铜(100mM)和2.3ml的紫杉醇-胱胺乙腈溶液(50mM)。室温下搅拌5h，冻干所得产物，用于后继实验。
人血清白蛋白与紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯结合物的制备方法。人血清白蛋白水溶液与紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯的无水乙醇溶液(体积比10:1)，按照一定的摩尔比例快速混合，涡旋10s，37℃下孵育30min，得到的药物蛋白结合物溶液冻干，用于后续的实验。
(2)紫杉醇-马来酰亚胺与人血清白蛋白结合的制备方法
溶于pH7.4的PBS缓冲液中的血清白蛋白溶液与紫杉醇-马来酰亚胺的二甲基亚砜(DMSO)缓慢混合，冰浴状态下轻微搅拌1h，反应完成后将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中透析，将透析得到的反应液3000r离心15min，过0.45μm的滤膜，冻干。
以紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯为例通过圆二色谱法考察结合物中人血清白蛋白的构象的变化，以及结合物冲稀后粒径的分布。
结果如图7、8所示。解释如下：通过图七的圆二色谱结果显示白蛋白药物不同比例的结合物的构象与未结合药物的白蛋白构象基本保持一致，说明白蛋白与药物结合后不会对药物构象造成大的影响。图八为将结合物冲稀之后测得的粒径结果，结果表明药物蛋白结合物经过冲稀，模拟药物/白蛋白进入体内之后是以结合物的形式在体内运输的。
实施例5以紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物为例考察氧化还原条件下的体外释放，以紫杉醇-马来酰亚胺白蛋白结合为例考察酸敏感的体外释放
取适量的紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物于截留分子量为8000的透析袋中，将透析袋密封后，分别置于pH＝7.4的PBS溶液及含10mMDTT的PBS溶液中，37℃水浴恒温震荡。在预设时间点0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、60、72、84、96、120、144h取出释放介质1mL，同时补加1mL空白释放介质。样品通过高效液相测定，计算释放介质中的紫杉醇含量，进一步计算紫杉醇累计释放率。
结果如图9所示，由图中结果可知，在加入DTT的释放介质中，紫杉醇的累积释放量较未加DTT的明显增多，表明该结构中引入二硫键具有明显的氧化还原敏感性。
以PH5和PH7.4的PBS缓冲液作为释放介质，适量紫杉醇-马来酰亚胺白蛋白结合物于透析袋中，放入摇床中进行孵育，孵育条件为100r/min，37℃。于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96h取释放介质1mL，并补加1mL相应的等温介质。通过高效液相测前药紫杉醇-乙酰丙酸的浓度，并进一步计算累积释放量。
结果如图10所示，由图中结果可知，含有酸敏感键酰腙键的紫杉醇-马来酰亚胺具有酸敏感性，在PH5的PBS缓冲液中紫杉醇-乙酰丙酸释放量更多。
实施例6紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物对癌细胞抑制实验
以人乳腺癌细胞MCF-7为模型，采用MTT法考察了紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物对癌细胞抑制。MCF-7细胞的培养基为含10％的胎牛血清(FBS)、1％的青链霉素的1640培养基，培养条件为37℃，5％CO2。取对数生长期的细胞，胰酶消化离心后，用完全培养基稀释成浓度为5×105个/mL的细胞悬液，吸取100μl该细胞悬液于96孔板中，使每孔的细胞数为5000。将细胞放置于细胞培养箱中培养过夜后，分别加入100μl一系列不同药物浓度的游离紫杉醇溶液和紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物溶液，每个药物浓度设定5个复孔，并设置阳性对照组(含有培养基和细胞，无药物)和阴性对照组(只含有培养基，无细胞，无药物)，继续培养24h或48h后，每孔中加入20μlMTT溶液(5mg/mL)，继续置于培养箱中培养4h后，取出，除去上清液，每孔中加入200μlDMSO溶解生成的甲臜，以490nm为检测波长，酶标仪测量各孔的吸光度，计算细胞存活率。
结果如图11所示。由图可知，对于MCF-7细胞，紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物制剂以及紫杉醇原料药都具有剂量依赖性以及时间依赖性。与紫杉醇原料药组对比，发现在低浓度时，紫杉醇原料药的细胞抑制率明显较紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物制剂组好，但随着浓度的继续增大，紫杉醇原料药和紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物制剂组之间的肿瘤细胞抑制率差异性逐渐减小，分析原因可能是因为紫杉醇溶解度较低，当其浓度达到饱和溶解度之后，继续增加其浓度，肿瘤细胞抑制率也没有明显的变化。可见，所制备紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物制剂较好地解决了紫杉醇溶解度低而不能达到良好的抗肿瘤效果的问题。
实施例7以紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物为例通过荧光显微镜法和流式细胞法考察细胞凋亡情况
(1)将处于对数生长期的MCF-7细胞以1×105个/孔的密度接种到12孔培养板中，培养过夜后，加入药物总浓度为10ug/mL，并以加入空白完全培养基的细胞作为阴性对照组，作用24h后，除去孔中的液体并用预冷的PBS洗涤3次。然后每孔加入500μl4％的多聚甲醛固定液，室温固定15min后，除去固定液，用预冷的PBS洗涤3次，每孔中加入500μl的DAPI染色液，室温下培养15min后，除去染色液，PBS洗涤3次，将培养板置于荧光显微镜下观察。
结果如图12所示，当制剂与细胞共孵育24h后，细胞核存在一定程度的破裂，表明该制剂可以引起细胞的凋亡，从而杀死细胞。并且，细胞核破裂的程度随着制剂浓度加大(A-2.5/B-5/C-10/D-20μg/ml)而变得更加彻底。
(2)将处于对数生长期的MCF-7细胞以1×105个/孔的密度接种到12孔培养板中，培养过夜后，加入的药物总浓度为2.5ug/mL，并以加入空白完全培养基的细胞作为阴性对照组，作用24h后，吸掉培养液，用预冷PBS洗涤三次后，每孔加入100μl不含EDTA的胰酶进行消化，并重悬收集细胞于流式管中，并用少量PBS洗涤后合并于流式管中，加PBS配平后，450g，离心5min，弃上清。每孔加入1ml 1×Bindling Bruffer后，用手指轻弹重悬起细胞，300g，离心10min后弃上清。空白孔只含有细胞，不加药物以及标记物；单标管分别加单一PI或者AnnexinV-FITC；实验组先加2.5μlAnnexinV-FITC，混匀，避光条件下4℃孵育10min，然后加入2μlPI，混匀，避光条件下4℃孵育5min后进行流式检测。
结果如图13所示，对比图中市售Taxol组以及制剂组的凋亡图谱可以发现，制剂组处于晚凋的细胞比例为34.1％，较市售Taxol组的22.7％显著增高，表明该制剂具有较好的促进细胞凋亡的效果。
实施例8以紫杉醇-聚乙二醇单硬脂酸酯白蛋白结合物为例进行其体内抑瘤研究
以荷瘤的昆明小鼠为模型，各组小鼠肿瘤体积变化和体重变化为指标，考察了药物蛋白结合物和游离的PTX组的体内抑瘤效果和用药安全性。
(1)肿瘤模型的建立
18-22g的雌性昆明小鼠环境适应后，进行荷瘤小鼠模型的建立：对数生长期的B16细胞经胰酶消化离心后，计数，用PBS重悬稀释成浓度为1×107个/mL的细胞悬液，取0.1mL的该细胞悬液接种于小鼠的左侧腋下，观察肿瘤的生长情况，并用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。
肿瘤体积V＝1/2(L×W2)
其中，L为肿瘤长径，W为肿瘤短径。
(2)体内抗肿瘤效果评价
当肿瘤的大小约为150mm3时，挑选出肿瘤大小均匀的15只小鼠，随机分成3组，每组5只。分别尾静脉注射生理盐水(NS)，游离药物PTX和药物蛋白结合物，每3天给药1次，连续给药2周。其中生理盐水组给药体积为0.1mL，游离药物组及制剂组给药剂量为5mg/kg。实验过程中每隔一天称量各组小鼠的体重，游标卡尺测量肿瘤的大小，并绘制各组小鼠的体重变化曲线和肿瘤体积的变化曲线。实验结束后，脱颈处死小鼠，剥离各组小鼠的肿瘤，比较各组肿瘤的大小。
结果如图14、15所示，生理盐水NS组以及制剂组中小鼠体重在整个实验过程中变化不大，而Taxol组小鼠体重后期则显著下降，表明了泰素具有较大的毒副作用，而药物白蛋白结合物具有良好的安全性。同时，相较于原料药组，制剂组小鼠肿瘤体积增长缓慢，说明其具有良好的抗肿瘤效果。因此，药物白蛋白结合物是一种高效低毒的良好的抗肿瘤制剂。
(3)肿瘤组织和正常组织切片实验
体内药效学实验结束之后，处死小鼠，剥离各组小鼠的肿瘤以及心、肝、脾、肺、肾，放置于4％多聚甲醛溶液中固定，采用苏木精-伊红染色的方法(hematoxylin-eosinstaining，H&E)，观察各组小鼠的肿瘤及主要器官组织的生理变化。以生理盐水组为对照，评价共载药胶束组和游离药物组的体内抑瘤效果和对正常组织的毒副作用。
结果如图16所示，各组织均无明显的毒性。表现为无细胞浸润和细胞核皱缩。
本发明旨在开发一类白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，前体药物是由抗肿瘤药物分别于胱胺、硬脂酸以及马来酰亚胺连接，通过特定的结构如胱胺铜离子络合物，硬脂酸，马来酰亚胺模拟体内血清白蛋白结合的特点在体外与血清白蛋白形成结合物，增加药物水溶性，并且不改变血清白蛋白的构象。具体的以紫杉醇为模型药物设计了3种紫杉醇前药，这些紫杉醇小分子前药具有上述特定结构，能够与血清白蛋白结合，并且不改变蛋白活性，基于肿瘤细胞的特殊环境(高谷胱甘肽和酸性)，在前药的结构中引入了氧化还原敏感键(二硫键)、pH敏感键(腙键)以实现靶部位的药物释放。这些白蛋白-药物结合物能够使药物与血清白蛋白发生稳定的结合，改善药物的水溶性，白蛋白药物结合物向肿瘤组织聚集，在其到达肿瘤组织后利用肿瘤细胞内特殊的高氧化还原和弱酸特性实现快速释药，进而发挥疗效。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，其特征在于，包含化合物；所述化合物具有如式9所示的结构式：
2.权利要求1所述的一种白蛋白结合型抗肿瘤前体药物，其特征在于，所述化合物的制备方法包括：
当合成目标化合物9时，所述合成路线包括：
3.权利要求1所述前体药物在体外与血清白蛋白结合的方法，其特征在于，所述方法包括：将溶解于有机溶剂中的权利要求1所述前体药物与含有白蛋白的水溶液混合，纯化后即得。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，
所述有机溶剂是乙醇或DMSO；
所述化合物和/或所述前体药物与血清白蛋白的摩尔比为1：1～1：8。
5.一种结合物，其特征在于，所述结合物由权利要求3或4所述方法获得。
6.权利要求1所述前体药物和/或权利要求5所述结合物在制备抗肿瘤药物中的应用；
所述肿瘤包括子宫内膜肿瘤、淋巴瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤或膀胱肿瘤。
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