CN115212185A - pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及pH敏感型阿霉素‑脂肪酸前药的白蛋白纳米粒，及其在制备药物递送系统中的应用。本发明所述的白蛋白纳米粒包含pH敏感型阿霉素‑脂肪酸前药和血清白蛋白，pH敏感型阿霉素‑脂肪酸前药与血清白蛋白的质量比为1:0.1‑10。并通过如下方法制备：称取pH敏感型阿霉素‑脂肪酸前药，用有机溶剂将其溶解，搅拌下，将所得溶液缓缓滴加到血清白蛋白水溶液中，再超声形成均匀的白蛋白纳米粒。在25‑30℃的条件下减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂。本发明的阿霉素‑脂肪酸前药白蛋白纳米粒的制备方法简单易行，具有较高的载药量，且具有明显的提高阿霉素疗效和降低毒性的作用，为开发高效‑低毒化疗制剂提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒，及其在制备药物递送系统中的应用。
背景技术
化疗是肿瘤治疗的最常用方式，尤其是对于那些不能通过手术切除和转移扩散的肿瘤。阿霉素是一种广谱抗肿瘤抗生素，细胞毒性较强，对多种肿瘤均有作用。但是，阿霉素毒副作用较强，尤其是其心脏毒性。因此，临床应用的阿霉素剂量受到严格限制，影响其药效的发挥。如何改善阿霉素的不良性质，提高治疗效果并减轻化疗引起的毒副作用是当今肿瘤研究中亟待解决的难题。
为了降低阿霉素的毒副作用，近年来，研究者开发了不同功能的阿霉素药物递送系统，其中最成功的代表是阿霉素脂质体。相较于阿霉素溶液剂，阿霉素脂质体可以改善其药代动力学和体内分布，并且能降低其心脏毒性。但阿霉素脂质体即使采用主动载药的方式，载药量也仅有11％，且给药后发生肢端红斑的风险显著提高，严重影响治疗效果和患者生活质量。因此，亟需构建新型高效低毒的阿霉素纳米制剂。
在众多的血清蛋白中，白蛋白占总蛋白含量的50％，其在血液中的浓度约为40mg/mL，半衰期为15-19天，是药物的理想载体。由于肿瘤血管的完整性并不佳，普通的纳米制剂易于从肿瘤血管中渗透出来，同时也难以通过淋巴途径重回体循环，这种增强的渗透性和保留效应即为高渗透长滞留效应。此外，肿瘤细胞的快速代谢和生长需要主动摄取大量的细胞外蛋白(包括白蛋白)作为氨基酸的来源，这能增加白蛋白和所包载的药物在肿瘤组织中的分布。但是，阿霉素与白蛋白结合能力较差，形成的纳米粒子载药量和包封率较低，粒径大小不均匀。前药策略可以通过巧妙的结构修饰来改善化疗药物的不良性质，如溶解度低、稳定性差、毒副作用大等。白蛋白具有7个脂肪酸结合位点，因此，将阿霉素制备成脂肪酸前药，有望提高阿霉素与白蛋白的亲和力。
现有技术中没有将阿霉素制备成前药后制备白蛋白纳米粒，从而提高其抗肿瘤活性并降低阿霉素毒性的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明所解决的技术问题是提供一种pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒，该纳米粒具有载药量高、包封率高、稳定性好、毒副作用低和细胞内智能释药的效果，进而提高了阿霉素的抗肿瘤活性，并降低毒副作用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒，所述的白蛋白纳米粒包含pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药和血清白蛋白，pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与血清白蛋白的质量比为1:0.1-10，优选为1:1-3。
所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的结构如通式(I)所示：
其中，R为C18饱和或不饱和脂肪酸不含羧羟基的部分，如：硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、梓树酸，优选为硬脂酸、油酸、亚油酸的不含羧羟基的部分。
具体地，所述pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药可以为：
其中，所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的合成方法，包括如下步骤：脂肪酸在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及N,N-二异丙基乙胺的催化下，与叔丁氧羰基肼反应，得叔丁氧羰基保护的酰肼；随后脱去叔丁氧羰基保护剂生成脂肪酸酰肼中间产物；将中间产物引入阿霉素羰基反应，分离纯化即得。
进一步地，包括如下步骤：
(1)合成叔丁氧羰基保护的脂肪酸酰肼：将脂肪酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴至0℃，搅拌1-2小时，然后缓慢加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺中的叔丁氧羰基肼与N,N-二异丙基乙胺，室温条件下反应24-48小时，所得产物经色谱柱分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
其中，上述方法中叔丁氧羰基肼：脂肪酸的摩尔比为1:1-5；催化剂与脂肪酸的摩尔比为1:1-5。
(2)合成脱保护后的脂肪酸酰肼：将上述产物溶解于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室温条件下反应2-6小时，取反应所得物料，加入冰乙醚，沉淀即得脂肪酸酰肼中间产物。
其中，上述方法中产物与三氟乙酸的摩尔比为1:1-5。
(3)合成脱盐阿霉素：将盐酸阿霉素和三乙胺溶解于无水甲醇中，室温避光反应12-24小时。所得产物旋干，上述反应在N2保护下进行。
其中，上述方法中盐酸阿霉素：三乙胺的摩尔比为1:1-3。
(4)将脱盐阿霉素、冰醋酸和脂肪酸酰肼中间产物溶解于无水甲醇中，50℃冷凝回流反应12-24小时，所得产物经制备液相法分离纯化，上述反应全程都在N2保护下进行。
其中，上述方法中脱盐阿霉素：脂肪酸酰肼中间产物的摩尔比为1:1-5。
进一步地，本发明还提供了所述的系列pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒的制备方法，所述的白蛋白纳米粒采用超声法制备。
具体地，本发明提供的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的制备方法如下：
称取pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药，用有机溶剂将其溶解，搅拌下，将所得溶液缓缓滴加到血清白蛋白水溶液中，再超声形成均匀的白蛋白纳米粒。在25-30℃的条件下减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂。
所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷中的一种或几种混合，优选为甲醇或四氢呋喃。
所述的血清白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
所述的血清白蛋白水溶液的浓度为0.1mg/mL-100mg/mL，优选为1mg/mL-5mg/mL。
所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与血清白蛋白的质量比为1:0.1-10，优选为1:0.2-3，更优选为1:1-3。
所述超声方法中，超声的功率为30-100W，优选为60-80W。
所述超声的时间为1-5分钟，优选为2-3分钟。
本发明所制备的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒，当pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比为1:0.1-10时，pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药可以与白蛋白形成稳定的白蛋白纳米粒，其粒径在100-1000nm，包封率在10％以上，成球率在10％以上；当pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比为1:0.2-3时，其粒径在100-200nm，包封率在20％以上，成球率在30％以上，载药量达11％以上；当pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比为1:1-3时，其粒径在100-200nm，其包封率在80％以上，成球率在90％以上，尤其当pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与血清白蛋白的质量比为1:1时，其包封率在95％以上，甚至可以达到99％，成球率在95％以上，载药量在35％以上。
本发明中，由于前药在体内必须转化成母药才能发挥药效功能，因此我们构建了腙键桥连的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药及其白蛋白纳米粒，纳米粒被肿瘤细胞摄取后，会首先进入内涵体和溶酶体，前药分子在内涵体和溶酶体的低pH条件下，腙键发生断裂，转化为母药，发挥其抗肿瘤作用，为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效-低毒化疗制剂的迫切需求。
本发明具有以下有益效果：(1)设计合成了含有不同不饱和度侧链的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药，合成方法简单易行；并制备了均匀的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒，制备方法简单易行，具有较高的载药量；(2)考察了三种阿霉素-脂肪酸前药在酸敏感响应能力以及抗肿瘤活性等方面的差异，以及对前药白蛋白纳米粒药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响。试验结果表明，pH敏感型阿霉素-油酸白蛋白纳米粒、pH敏感型阿霉素-亚油酸白蛋白纳米粒和pH敏感型阿霉素-硬脂酸白蛋白纳米粒均具有不同程度的提高阿霉素疗效和降低毒性的作用，尤其pH敏感型阿霉素-硬脂酸白蛋白纳米粒作用最为明显，为开发高效-低毒化疗制剂提供了新的策略。
附图说明
图1为本发明实施例5的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的透射电子显微镜图。
图2为本发明实施例6的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒在pH 5.0条件下的体外释放试验图。
图3为本发明实施例6的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒在pH 7.4条件下的体外释放试验图。
图4为本发明实施例7的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的4T1细胞毒性图。
图5为本发明实施例7的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的Hepa1-6细胞毒性图。
图6为本发明实施例7的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的KB细胞毒性图。
图7为本发明实施例8的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的前药血药浓度-时间曲线图。
图8为本发明实施例8的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的母药血药浓度-时间曲线图。
图9为本发明实施例8的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的前药母药加和的血药浓度-时间曲线图。
图10为本发明实施例9的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中小鼠肿瘤体积变化图。
图11为本发明实施例9的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中小鼠肿瘤对比图。
图12为本发明实施例9的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中小鼠体重变化图。
图13为本发明实施例9的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中肿瘤负荷图。
图14为本发明实施例10的阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中小鼠肿瘤体积变化图。
图15为本发明实施例10的阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中肿瘤负荷图。
图16为本发明实施例10的阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中小鼠体重变化图。
图17为本发明实施例10的阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒的在体抗肿瘤实验中小鼠肿瘤对比图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：阿霉素-硬脂酸前药的合成
将适量硬脂酸酰肼加入到100mL圆底烧瓶中，并用5mL甲醇溶解，并加入适量的冰醋酸和脱盐阿霉素，在50℃下冷凝回流反应12小时。目标产物通过制备液相色谱分离纯化。上述反应全程都在N2保护、避光下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，波谱解析结果如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm):δ10.31(s,1H,NH),7.89(dd,J＝9.1Hz,5.1Hz,2H,Ph-H),7.65(ddd,J＝9.6Hz,6.2Hz and 3.2Hz,1H，Ph-H),5.63(s,1H，9-OH),5.58(s,1H,4’-OH),5.51-5.28(s,1H,14-OH),5.28(s,1H,1’-H),4.90(t,J＝6.9Hz,1H,7-H),4.41(q,J＝14.4Hz,2H,14-H),4.06-3.99(m,1H,5’-H),3.97(d,J＝9.8Hz,3H,4-OCH3),3.54(s,1H,4’-H),3.32(s,1H,3’-H),2.73(d,J＝17.2Hz,1H,10-H),2.16(ddd,J＝23.3Hz,15.6Hz and7.5Hz,2H,2”-H),2.06(dd,J＝15.3Hz and7.9Hz,1H,8-H),2.03-1.88(m,1H,8-H),1.84(d,J＝12.7Hz,1H,2’-H),1.68-1.57(m,1H，2’-H),1.33-0.97(m,33H),0.84(t,J＝7.0Hz,3H，18”-CH3).MS(ESI)m/zfor C45H65N3O11H[M+H]+:824.4696.
实施例2：阿霉素-油酸前药的合成
将适量油酸酰肼加入到100mL圆底烧瓶中，并用5mL甲醇溶解，并加入适量的冰醋酸和脱盐阿霉素，在50℃下冷凝回流反应12小时。目标产物通过制备液相色谱分离纯化。上述反应全程都在N2保护、避光下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例2中前药的结构，波谱解析结果如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.32(s,1H,NH),7.92(d,J＝7.3Hz,2H,Ph-H),7.67(d,J＝5.4Hz,1H,Ph-H),5.89(s,1H,9-OH),5.61(s,1H,4’-OH),5.43(s,1H,14-OH),5.35-5.27(m,3H,1’-H,9”-H and 10”-H),4.91(t,J＝7.0Hz,1H,7-H),4.42(q,J＝14.4Hz,2H,14-H),4.03(d,J＝6.5Hz,1H,5’-H),3.99(s,3H,4-OCH3),3.61(s,2H,4’-H and 3’-H),2.75(d,J＝16.9Hz,2H,10-H),2.17(dt,J＝22.5Hz,7.4Hz,2H,8-H),2.09-2.01(m,1H,2’-H),1.96(dd,J＝17.1Hz,10.3Hz,2H,2”-H),1.89(dt,J＝13.5Hz,7.2Hz,4H,8”-H and 11”-H),1.74(d,J＝8.7Hz,1H,2’-H),1.20(dd,J＝28.2Hz,13.7Hz,25H),0.84(t,J＝7.0Hz,3H,18”-CH3).MS(ESI)m/z for C45H63N3O11H[M+H]+:822.4650.
实施例3：阿霉素-亚油酸前药的合成
将适量亚油酸酰肼加入到100mL圆底烧瓶中，并用5mL甲醇溶解，并加入适量的冰醋酸和脱盐阿霉素，在50℃下冷凝回流反应12小时。目标产物通过制备液相色谱分离纯化。上述反应全程都在N2保护、避光下进行。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例3中前药的结构，波谱解析结果如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6,ppm):δ10.30(s,1H,NH),7.88(dd,J＝8.5Hz,5.4Hz,2H,Ph-H),7.64(dd,J＝6.4Hz,3.3Hz,1H,Ph-H),5.84(s,1H,9-OH),5.56(s,1H,4’-OH),5.36-5.32(s,1H,14-OH),5.32-5.23(m,5H,1’-H,9’-H,10’-H,12’-H and 13’-H),4.90(t,J＝7.0Hz,1H,7-H),4.41(q,J＝14.4Hz,2H,14-H),4.02(q,J＝6.6Hz,1H,5’-H),3.97(d,J＝8.9Hz,3H,4-OCH3),3.58(s,1H,4’-H),3.29(s,1H,3’-H),2.79-2.69(m,2H,10-H),2.69(t,J＝5.8Hz,2H,CH＝CH-CH2-CH＝CH),2.16(ddd,J＝21.8Hz,14.8Hz,7.1Hz,2H,8-H),2.11-2.03(m,1H,2’-H),2.02-1.97(m,2H,CH2CH＝CH-CH2-CH＝CHCH2),1.97-1.89(m,2H,CH2CH＝CH-CH2-CH＝CHCH2),1.87(dd,J＝14.3Hz,8.3Hz,2H,CH2CH2CONH),1.77-1.69(m,1H,2’-H),1.32-1.20(m,10H),1.16(t,J＝8.6Hz,3H),1.11(s,2H),1.00(d,J＝3.1Hz,4H),0.83(dt,J＝13.9Hz,7.0Hz,3H,18’-CH3).MS(ESI)m/z for C45H61N3O11H[M+H]+:820.4379.
实施例4：pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的影响因素考察
4.1有机溶剂的选择
称取pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药4mg，用有机溶剂将其溶解，搅拌下，将所得溶液缓缓滴加到浓度为1mg/mL的血清白蛋白水溶液中，使pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比为1:1，超声形成均匀的白蛋白纳米粒，超声功率为60W，超声时间2分钟，在25-30℃的条件下减压蒸馏除去纳米制剂中的有机溶剂。
表1有机溶剂对pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的影响
结果表明，当有机溶剂为甲醇、四氢呋喃时，粒径在135.0-179.8nm范围内，且粒径分布均匀，且具有最佳的包封率，其包封率均在90％以上。因此，有机溶剂优选为甲醇或四氢呋喃。
4.2超声功率和时间的选择
表2超声条件对pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的影响
以甲醇作为有机溶剂，pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比为1:1，超声功率分别为30、60、80、100W，超声时间分别为1、2、3、5、10分钟，制备阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒。结果如表2所示。
试验结果表明，当超声功率为30-100W，超声时间为1-5分钟时，具有较好的粒径分布和包封率，其包封率可达80％以上；当超声功率为60-80W，超声时间为2-3分钟时，其粒径分布和包封率达到最佳，其包封率均在90％以上。
4.3阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比的选择
以甲醇作为有机溶剂，固定超声时间为2min，超声功率为60W，改变阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比，结果如表3所示。
表3阿霉素-脂肪酸前药和白蛋白在不同质量比下的粒径、粒径分布和包封率
实验结果表明，当前药和白蛋白的质量比为1:0.2-3时，阿霉素的载药量可达11％以上，优于阿霉素脂质体的载药量。当前药和白蛋白的质量比为1:1-3时，阿霉素白蛋白纳米粒的粒径在100-200nm之间，粒径分布均匀，且包封率在75％以上，其中，DOX-LA和DOX-OA纳米粒包封率可达85％以上。当质量比为1:1时，DOX-LA、DOX-OA和DOX-SA三种纳米粒的包封率均可达95％以上，甚至达到99％，载药量均在35％以上。
以甲醇为有机溶剂，固定超声时间为3min，超声功率为60W，或超声时间为3min，超声功率为80W时，各指标没有明显变化。
实施例5：pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的制备
精密称取pH敏感型阿霉素前药4mg，用1mL的甲醇将其溶解，搅拌下，将该甲醇溶液缓缓滴加到4mL浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中，使前药与白蛋白的质量比为1:1，再用超声波细胞破碎仪超声形成均匀的白蛋白纳米粒(DOX-LA纳米粒，DOX-OA纳米粒和DOX-SA纳米粒)，超声时间2min，超声功率60W。在25℃的条件下用旋转蒸发仪除去纳米制剂中的有机溶剂。
表4.pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的表征
如表4所示，三种阿霉素-脂肪酸前药纳米粒的粒径都在150nm左右，粒径分布小于0.2，表面电荷在30mV左右，包封率都在99％以上。通过透射电子显微镜测定实施例5中制备的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的粒径和形态，结果如图1，透射电镜图表明前药纳米粒为均一的球形，粒径在150nm左右。
实施例6：pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的体外释放试验。
以含乙醇的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)和pH 5.0的磷酸盐缓冲液为释放介质，分别模拟体液和内涵体-溶酶体的环境，考察前药纳米粒的体外释放行为。将1mL实施例5中制备的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒(阿霉素含量为660μg/mL)加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的阿霉素浓度。结果如图2、3所示，三种阿霉素-脂肪酸前药在pH 5.0的磷酸盐缓冲液介质中，24小时累计释放60％以上的阿霉素。相比之下，三种前药纳米粒在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，24小时累计释放阿霉素不足15％。这证明三种阿霉素-脂肪酸前药在肿瘤细胞内涵体和溶酶体(pH4-5)中具有pH敏感释药的性能。三种前药的pH敏感响应释药速率基本相同。
实施例7：pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的细胞毒性实验
采用MTT法考察三种阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒对人口腔上皮癌(KB)细胞、小鼠乳腺癌(4T1)细胞、小鼠肝癌(Hepa1-6)细胞的毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至5000cells/mL，细胞吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24小时使其贴壁。待细胞贴壁后加入阿霉素溶液剂或实施例5中制备的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒，并进一步孵育48小时，用未处理的细胞作为对照。孵育结束时，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，在37℃的条件下孵育4小时。弃去培养基，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min。使用酶标仪在570nm处测定吸光度。
细胞毒性结果如图4-6所示，与阿霉素溶液剂组相比，前药纳米粒的细胞毒性降低。这是因为阿霉素需要一定时间从前药纳米粒中释放出来，限制了阿霉素药效的发挥。由体外释放结果可知，三种前药纳米粒在pH 5.0的磷酸盐缓冲介质中的释药速率基本相同，所以三种阿霉素-脂肪酸前药纳米粒对三种肿瘤细胞具有相似的细胞毒性。
实施例8：pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的药代动力学研究
使用SD大鼠(200-250g)进行药代动力学研究。将大鼠随机分组，给药前禁食12小时，自由饮水。分别静脉注射阿霉素溶液剂以及实施例5中制备的三种阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒。阿霉素的剂量为4mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
表5.pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒药动学参数
a)药时曲线下面积(nmol/mL*h).b)半衰期(h).c)平均滞留时间(h).d)最大血药浓度(nmol/mL)
实验结果如图7-9所示，与阿霉素溶液剂组相比，前药纳米粒在血液中的滞留时间明显延长，前药纳米粒显著提高了阿霉素的药-时曲线下面积(AUC0-24h)，为阿霉素的肿瘤靶向积蓄提供了保障。同时，脂肪酸的不饱和度对前药纳米粒的药代动力学行为有显著的影响，DOX-SA纳米粒、DOX-LA纳米粒和DOX-OA纳米粒的总体AUC0-24h(前药和母药的加和)分别为阿霉素溶液剂的14.7倍、7.1倍和4.5倍。DOX-SA纳米粒具有更高的AUC和更长的循环时间。药动学参数如表5，其中，DOX-SA纳米粒释放出的阿霉素的AUC值最小，说明DOX-SA纳米粒在血液循环中最稳定。
实施例9：pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒的抗肿瘤实验
建立4T1细胞荷瘤小鼠模型，将4T1细胞(100μL中含5×106个细胞)皮下接种至BALB/c小鼠。当肿瘤体积长至100-150mm3左右时，将其随机分为5组(每组5只小鼠)。每隔一天尾静脉给药实施例5的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒，设置阿霉素溶液剂和生理盐水为对照组，总计注射5次，剂量为4mg/kg(等效阿霉素4mg/kg)，每天测量肿瘤体积及小鼠体重。
结果如图10-13所示，阿霉素组与生理盐水组相比，具有显著的抑瘤作用。但是阿霉素溶液剂具有严重的副作用，小鼠体重与生理盐水组相比下降明显。DOX-LA纳米粒和DOX-OA纳米粒表现出了较强的抑瘤作用，肿瘤体积和肿瘤负荷与阿霉素组相比有显著性差别，同时降低了毒性，小鼠体重与生理盐水组相比没有明显变化。值得注意的是，DOX-SA纳米粒表现出最强的抗肿瘤效果，强于阿霉素、DOX-LA纳米粒和DOX-OA纳米粒。这是由于DOX-SA纳米粒提高了其药动学行为，具有较高的AUC。这提示我们，药动学行为对于良好的抗肿瘤效果很重要。此外，DOX-SA纳米粒组小鼠体重没有明显变化，表明其良好的安全性。
实施例10：pH敏感型阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒的抗肿瘤实验
建立4T1细胞荷瘤小鼠模型，将4T1细胞(100μL中含5×106个细胞)皮下接种至BALB/c小鼠。当肿瘤体积长至100-150mm3左右时，将其随机分为5组(每组5只小鼠)；每隔一天尾静脉给药阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒，设置阿霉素溶液剂、市售盐酸阿霉素脂质体(Doxil)、阿霉素-硬脂酸前药溶液剂、生理盐水为对照组，总计注射5次，剂量为10mg/kg(等效阿霉素10mg/kg)，每天测量肿瘤体积及小鼠体重。
结果如图14-17所示，在给药后第七天，阿霉素溶液剂组出现死亡，在给药后第九天阿霉素溶液剂组全部死亡。这表明随着给药浓度的提高，阿霉素溶液剂的毒副作用愈加严重。且与生理盐水组相比，市售盐酸阿霉素脂质体(Doxil)组具有显著的抑瘤作用，但同时表现出了严重的副作用，小鼠体重下降明显。阿霉素-硬脂酸前药纳米粒与前药溶液剂的抑瘤作用虽然弱于阿霉素溶液剂及市售盐酸阿霉素脂质体(Doxil)，但毒性更小，小鼠体重与生理盐水组相比没有明显变化。与前药溶液剂相比，前药白蛋白纳米粒安全性更好。由于前药在水中溶解度较差，一旦前药不能充分溶解，会存在很大的安全性问题。结果表明，阿霉素-硬脂酸前药白蛋白纳米粒在具有明显抗肿瘤效果的同时，是安全有效的抗癌药物传递系统。
Claims (10)
1.pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的白蛋白纳米粒包含pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药和血清白蛋白，pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与血清白蛋白的质量比为1:0.1-10，优选为1:1-3；所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的结构如通式(I)所示，
其中，R为C18饱和或不饱和脂肪酸不含羧羟基的部分。
2.如权利要求1所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的R为硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、梓树酸不含羧羟基的部分。
3.如权利要求1或2所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒，其特征在于，所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的结构如下：
4.如权利要求1所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药采用如下步骤制备：
脂肪酸在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及N,N-二异丙基乙胺的催化下，与叔丁氧羰基肼反应，得叔丁氧羰基保护的酰肼；随后脱去叔丁氧羰基保护剂生成脂肪酸酰肼中间产物；将中间产物与阿霉素的羰基反应，分离纯化即得。
5.如权利要求1所述的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药的白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，称取pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药，用有机溶剂将其溶解，搅拌下，将所得溶液缓缓滴加到血清白蛋白水溶液中，再超声形成均匀的白蛋白纳米粒。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷中的一种或几种混合；pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药与白蛋白的质量比为1:0.1-10；所述的血清白蛋白的浓度为0.1mg/mL-100mg/mL。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超声的功率为30-100W，超声的时间为1-5分钟。
8.如下的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药或权利要求1-3任何一项所述的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒在制备药物传递系统中的应用：
其中，R为C18饱和或不饱和脂肪酸不含羧羟基的部分，优选为硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、梓树酸不含羧羟基的部分。
9.如下的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药或权利要求1-3任何一项所述的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用：
其中，R为C18饱和或不饱和脂肪酸不含羧羟基的部分，优选为硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、梓树酸不含羧羟基的部分。
10.如下的pH敏感型阿霉素-脂肪酸前药或权利要求1-3任何一项所述的阿霉素-脂肪酸前药白蛋白纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
其中，R为C18饱和或不饱和脂肪酸不含羧羟基的部分，优选为硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、梓树酸不含羧羟基的部分。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113713117A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-30 | 山东大学 | 一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用 |
| CN113713117B (zh) * | 2021-09-10 | 2024-01-19 | 山东大学 | 一种白蛋白结合型肿瘤环境响应型抗肿瘤前体药物及其制备方法和应用 |
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