CN111454257B - 基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药、制备方法 - Google Patents

基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药、制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药，所述小分子前药的分子结构式如下所示：
Figure DDA0002447663220000011
其中，R为烷基。本发明还公开制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法。本发明小分子具有精确的化学结构、较高的载药量和可控药物释放的优点。

Description

基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药、 制备方法
技术领域
本发明涉及小分子前药和药物控制释放技术领域，尤其涉及基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药、制备方法。
背景技术
癌症是人类最致命的杀手之一，化疗仍是临床的主要治疗手段。遗憾的是，传统上小分子化疗药物存在着生物利用度差、生物分布非特异性、肿瘤细胞内积累不足、副作用严重，效率低下等一系列缺点。基于生物材料和纳米技术的快速发展，各种纳米级药物传递系统(NDDS)，包括纳米颗粒、胶束和脂质体，已经被建立用于肿瘤特异性药物传递。这些辅助载体(NDDS)确实有效，并在增强通透性和阻滞效应(EPR效应)上显示出许多益处，包括延长药物循环时间、控制药物释放和改善肿瘤部位的积累。然而，这些NDDS的合成和纯化过程复杂，载药量相对较低，质量存在批对批的差异，其进一步的临床应用受到限制。此外，大多数载体无治疗效果，在循环和代谢过程中可能引起全身毒性和免疫原性。为了解决这些问题，一种有趣的策略是开发无载体的纳米药物或药物自传递系统(DSDS)，在没有额外纳米载体的情况下，活性药物自行表现出纳米级特征。DSDS通常分为纯药物纳米晶体、药物前自组装纳米颗粒和两亲性药物-药物结合纳米颗粒。其中，小分子前药自组装纳米颗粒被认为是一种很好的癌症治疗平台，具有以下优点:(1)合成工艺简单，化学结构明确；(2) 载药效率高；(3)规避无关物质和载体诱导毒性；(4)通过EPR效应提高在肿瘤组织内部的药物积累能力。
此外，这些以原药为基础的纳米药物可以智能地设计和合成，以应对肿瘤微环境或肿瘤细胞内的低pH、高氧化还原电位和过表达酶，从而实现对刺激敏感的药物释放。显然，小分子前药设计的关键是合成具有酸、氧化还原或酶敏感能力的易受影响的连接物来连接活性化疗药物。原酸酯作为一种pH-响应性连接物，在中性条件下具有良好的稳定性，在弱酸性环境下具有快速水解能力。根据本课题组前期工作，将原酸酯键引入纳米药物中，可以实现良好的循环稳定性和肿瘤特异性药物释放。因此，原酸酯键被认为是制备pH敏感性纳米前药的理想连接剂。另一方面，两种机制不同的药物协同递送被广泛用于增强抗肿瘤疗效，避免多药耐药(multidrug resistance,MDR)的出现。但由于两种药物的理化性质和药代动力学的不同，限制了它们的协同传递，可能导致药物积累不一致，影响协同效应。达沙替尼(Dasatinib, DAS)是一种小分子抑制剂，针对多种致癌酪氨酸激酶，包括BCR/ABL激酶和Src家族激酶 (SFK)。达沙替尼曾用于多种癌症的治疗，但全身给药可能导致不良的生物分布和严重的全身毒性。DAS也是与各种化疗药物(顺铂、紫杉醇和阿霉素)联合治疗的合适选择。
发明内容
本发明的主要目的是开发一种基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药、制备方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
1、首先，提供了这种基于达沙替尼经原酸酯(4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3- 二氧戊烷(OE))偶联制备的小分子前药(DAS-OE)的分子式,其结构如化学式I所示：
Figure BDA0002447663200000021
其中，R为-CH3；
上述DAS-OE的合成过程如下所示：
Figure BDA0002447663200000022
2、上述DAS-OE的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ、如上式I-2所示化合物的制备：
氮气条件下，使用丁二酸酐对达沙替尼(式I-1所示化合物)进行羧基化修饰(摩尔比＝1:1)，DMF作溶剂，TEA(除水)作催化剂，反应混合物在室温条件下搅拌，反应结束后用真空蒸馏除去溶剂。将白色产物用二氯甲烷、甲醇洗涤，真空干燥后得到白色粉末(式I-2所示化合物)。
Ⅱ、化合物式I-3(4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷))的制备：
真空条件下，4,4’-二亚甲基氧-二-(2-甲氧基-1,3-二氧戊烷)、N-(二羟基乙基)三氟乙酰胺经吡啶翁对甲苯磺酸盐以摩尔比(mol/mol/mol)＝1：2.5：0.02加入反应瓶中，剧烈反应，反应结束后使用碳酸氢钠水溶液萃取，然后加入浓度为3moL/L的NaOH溶液中搅拌 24h，使用二氯甲烷萃取两次，经无水硫酸镁干燥，抽油泵除去溶剂得到产物4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)(即OE二氨基原酸酯)。
Ⅲ、化合物式I(DAS-OE)的制备：
将DAS-COOH(式I-2所示化合物)、OE、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS按照摩尔比(2：1：1.5：1.5)加入到含有溶剂DMF的反应瓶中，滴加催化剂TEA(1.5×10-4mol)在室温下搅拌48h。反应结束后,我们把油状产品转移到透析袋(MWCO 1KDa)中，并使用去离子水透析24小时用于清除未反应完的残余单体和DMF溶剂等。透析后，油泵负压干燥得到目标产物(DAS-OE)。
优选地，在步骤Ⅲ)中，所述反应的溶剂与催化剂的体积比为250～500:1。
优选地，在步骤Ⅲ)中，所述反应使用EDC和NHS将羧基达沙替尼活化5小时以上。
优选地，在步骤Ⅲ)中，所述反应先活化羧基达沙替尼，后将溶在溶剂中的原酸酯滴加到活化后的羧基达沙替尼溶液中。
优选地，在步骤Ⅲ)中，所述反应可以在空气条件下反应，也可以通氮气反应，反应温度不高于25℃，不低于20℃。
3、如1-2所述的基于达沙替尼和原酸酯(OE)偶联的小分子前药(DAS-OE)与阿霉素(DOX)或不与阿霉素(DOX)自组装得到两个无载体的纳米颗粒(DOX/DAS-OE NPs或 DAS-OENPs)的制备方法如下：
通过透析法制备了达沙替尼小分子前药纳米颗粒(DAS-OE NPs)和负载阿霉素的小分子前药达沙替尼纳米颗粒(DOX/DAS-OE NPs)。将DAS-OE溶于DMSO中，或将DAS-OE 与DOX溶于DMSO中，缓慢加入PBS缓冲液中。然后将混合物加入透析袋，用去离子水透析48小时，每3小时更换一次去离子水。透析后，用超声细胞碎机超声分散后即制备纳米颗粒。
优选地，在步骤3)中，所述反应溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或者溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等极性大的溶剂。
优选地，在步骤3)中，所述方法需要将小分子前药溶液滴加到涡旋条件下的弱碱性PBS 缓冲液中(pH值：7.4-8.0，0.01M)。
优选地，在步骤3)中，所述方法滴加完毕后需使用细胞超声破碎仪超声分散小分子前药纳米粒子溶液。
4.如3所述包载药物可为抗肿瘤药。
优选地，所述抗肿瘤药可以为顺铂，卡铂，5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素、卡培他滨中的任一一种药物。
优选地，实例所述抗肿瘤药为阿霉素。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1)该小分子具有精确的化学结构、较高的载药量和可控的药物释放；
2)肿瘤组织的微酸性条件下，原药中的原酸酯键可被水解，导致DOX和DAS的快速释放；
3)避免了无关物质和载体潜在对机体的诱导毒性；
4)在达沙替尼小分子前药DAS-OE NPs的基础上，可以包埋一种或者多种的抗肿瘤试剂，这里我们选择具有广谱的抗肿瘤效果的阿霉素为模型药，通过静脉注射给药，从而达到更好的治疗肿瘤的效果。
附图说明
图1是本发明实施例2中聚合物DAS-OE的1H-NMR图。
图2是本发明实施例2中DAS-OE、DAS-COOH、OE和DAS的FT-IR检测谱图。
图3是本发明实施例2中选取的DAS-OE的分子量图。
图4是本发明实施例4中DAS-OE NPs和DOX/DAS-OE NPs的纳米粒子的平均粒径图与强度之间的关系图。
图5(a)是本发明实施例4中DAS-OE NPs的纳米粒子形貌图。
图5(b)是本发明实施例4中DOX/DAS-OE NPs的纳米粒子形貌图。
图6是本发明实施例5中选取的纳米粒子DAS-OE NPs在pH酸性条件下降解的粒径变化图；
其中，图6中的A和B分别为纳米粒子DAS-OE NPs在pH值为7.4和5.0时的粒径变化曲线图；
图6中的C和D分别为纳米粒子DOX/DAS-OE NPs在pH值为7.4和5.0时的粒径变化曲线图。
图7是本发明实施例7中纳米粒子DAS-OE NPs和DOX/DAS-OE NPs在体外条件下药物在不同pH缓冲液中，阿霉素和达沙替尼的药物释放数据图。
其中，图7中A为DAS-OE NPs在三种不同pH值条件下的DAS的药物释放曲线，图7 中B和C分别为DOX/DAS-OE NPs在三种不同pH值条件下的DAS和DOX的药物释放曲线。
图8是本发明实施例7纳米粒子DAS-OE NPs在体外条件下降解后的核磁结果及降解路径。
图9是本发明实施例8中的A、B分别为激光共聚焦拍摄HepG2和H22细胞对载药纳米粒子中阿霉素摄取的定性分析结果示意图。
图10是本发明实施例8中的A、B分别为流式细胞仪检测HepG2和H22细胞对载药纳米粒子中阿霉素摄取的定量分析结果示意图。
图11(a)是本发明实施例9中选取的药物对HepG2的细胞毒性的示意图。
图11(b)是本发明实施例9中选取的药物对H22的细胞毒性的示意图。
图12是本发明实施例10中选取的DOX/DAS-OE NPs以及其他各型药物对细胞杀伤后的定量的细胞凋亡情况示意图；
其中，图12中A和B分别为空白对照，DAS，FreeDOX，DAS-OE NPs和DOX/DAS-OE NPs在HepG2和H22细胞中凋亡的结果。
图13(a)是本发明实施例11中裸药阿霉素在小鼠主要器官及血液的药物分布结果柱状图。
图13(b)是本发明实施例11中DOX/DAS-OE NPs组阿霉素在小鼠主要器官及血液的药物分布结果柱状图。
图14是本发明实施例11中小鼠肿瘤内摄取阿霉素的AUC曲线图。
图15是本发明实施例12中选取的生理盐水，DAS，Free DOX，DAS-OE NPs和 DOX/DAS-OE NPs经静脉注射后在小鼠体内的抗肿瘤效果曲线图；
其中，图15中A为小鼠的体重变化曲线，图15中B为小鼠肿瘤体积的变化曲线。
图16是本发明实施例12中治疗结束后小鼠肿瘤组织的重量柱状图。
其中：*p<0.05,**p<0.01
图17是本发明实施例12中为各组肿瘤的成像图。
图18是本发明实施例12中选取的生理盐水，DAS，Free DOX，DAS-OE NPs和 DOX/DAS-OE NPs经静脉注射后各组小鼠的器官切片图
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，当元件被称为“固定于额”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
实施例1
本实施例公开一种基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的制备方法：
达沙替尼，其结构通式如I-1化合物所示，以达沙替尼作为起始原料，经多步反应制备得到如式I所示DAS-OE。
DAS-OE的合成过程如下：
Figure BDA0002447663200000061
S1、DAS-COOH的制备方法包括以下步骤：
将达沙替尼DAS(式I-1所示化合物)(337×10-3g,0.69×10-3mol)溶于DMF(5×10-3L)中，加入TEA(2×10-5L)，再加入相应的丁二酸酐(69.10×10-3g,0.69×10-3mol)；反应混合物在室温氮气条件下搅拌72h，反应结束后用真空蒸馏除去溶剂。将白色产物用二氯甲烷(5×10-3L)洗涤3次，用甲醇(3×10-3L)洗涤2次，真空干燥后得到白色粉末(式 I-2所示化合物)。
S2、化合物式(4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷))OE的制备：
真空条件下，4,4’-二亚甲基氧-二-(2-甲氧基-1,3-二氧戊烷)(式I-3)、N-(二羟基乙基)三氟乙酰胺经吡啶翁对甲苯磺酸盐以摩尔比(mol/mol/mol)＝1：2.5：0.02加入反应瓶中，剧烈反应，反应结束后使用碳酸氢钠水溶液萃取，然后加入浓度为3moL/L的NaOH溶液中搅拌24h，使用二氯甲烷萃取两次，经无水硫酸镁干燥，抽油泵除去溶剂得到产物4,4’ -二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)(OE)。
S3、式I所示DAS-OE的制备：
将DAS-COOH(式I-2所示化合物)(314.7×10-3g,0.54×10-3mol)、EDC(78.8×10- 3g, 0.41×10-3mol)、NHS(47.34×10-3g,0.41×10-3mol)溶于DMF(4×10-3L)中，与TEA(1 ×10-5L)在室温下搅拌6h，活化羧基。OE(式I-3所示化合物)(82.49×10-3g,0.27×10-3 mol)溶解在DMF(2×10-3L)中，再添加TEA(1×10-5L)一起搅拌48h，投料总的摩尔比为：1mol(OE):2mol(DAS-COOH):1.5mol(EDC):1.5mol(NHS)：1.5×10-4mol(TEA)，且TEA与DMF的体积比为1:300。反应结束后,把油状产品倒到透析袋(MWCO1KDa) 并使用去离子水透析24小时用于清除未反应完的残余单体和DMF。透析后，在-50℃,0Pa 条件下冷冻干燥得到目标产物(DAS-OE)。
实施例2
如图1所示，用1H-NMR表征实施例1中的DAS-OE结构。
如图2所示，FT-IR表征实施例1中的DAS-OE、DAS、DAS-COOH、OE等物质的红外结构。
1H-NMR检测方法如下：
称取7mg小分子前药加入到EP管中，用氘代试剂溶解，加入到备用的核磁中，在核磁共振波普仪下检测质子的特征峰。
FT-IR检测方法如下：
将1～2mg样品与200mg纯KBr研细均匀，置于磨具中，在油压机的作用下压成薄片，然后放到傅里叶红外光谱仪中进行检测。
用1H-NMR表征式I所示的DAS-OE结构，如图1所示。可以看出，特征峰a为原酸酯的特征峰，特征峰c、d、e为达沙替尼苯环上氢的特征峰。氢在这几处位置的积分面积大约是1。所以证明偶联是成功的。
FT-IR表征式I所示的DAS-OE、DAS、DAS-COOH、OE等物质的红外结构，如图2所示。DAS的羟基(-OH)在3460cm-1处出现，而在DAS-COOH的红外光谱中未发现该峰，在1741cm-1处发现了一个新的强峰，这是羧基峰作用的结果。因此，可以确定DAS的羧化反应是成功的。OE在1068cm-1处出现的峰可以归为乙醚基团的-COC-键。同时，我们也在 DAS-OE的光谱上发现了-COC-峰，但DAS的光谱上没有相应的峰。这些结果也证明了羧基和氨基的酰胺化反应是成功的。
实施例3
达沙替尼小分子前药分子量的确定表征
液相色谱质谱联用仪表征式I所示的DAS-OE的分子量，如图3所示。MS分析表明，DAS-OE的m/z比值为1448.51，与理论分子量的m/z比值(1448.45)接近。说明我们的达沙替尼小分子前药合成是成功的。
检测方法如下：
液相色谱质谱联用仪(LC-MS，LTQ Orbitrap XL/LTQ Orbitrap XL)用来检测合成的小分子前药的分子量。样品可以溶解在二氯甲烷和甲醇的混合液中(体积比为4:1)。该仪器可以将小分子前药样品先电离成离子，然后将不同质荷比的离子分离开从而检测出所需检测的样品的分子量。
实施例4
DOX/DAS-OE NPs或DAS-OE NPs的制备以及粒径和形貌测试：
DOX/DAS-OE NPs或DAS-OE NPs制备方法如下：
通过透析法制备了达沙替尼小分子前药纳米颗粒(DAS-OE NPs)和负载阿霉素的小分子前药达沙替尼纳米颗粒(DOX/DAS-OE NPs)。将实施例1的DAS-OE(20mg)溶于DMSO(2mL)中，或将实施例1的DAS-OE(20mg)与DOX(4mg)溶于DMSO(2mL)中，缓慢加入PBS缓冲液(pH＝7.4,0.01M)中。然后将混合物加入透析袋(MWCO 3.5KDa)，用去离子水透析48小时，每3小时更换一次去离子水。透析后，用超声细胞碎机(UP-250, NINGBO SCIENTZBIOTECHNOLOGY CO.，LTD)超声分散后即制备纳米颗粒 (DOX/DAS-OE NPs或DAS-OE NPs)。
纳米粒子的粒径和形貌测试方法如下：
取1mL制备成功的纳米粒子(DOX/DAS-OE NPs或DAS-OE NPs)加入到马尔文纳米粒度仪(DLS)中，每一测试运行三次。在通过扫描电镜成像观察纳米粒子的形貌，检测结果如图4、图5(a)和图5(b)所示。如图4所示，DAS-OE NPs的粒径为125.0nm，而负载 DOX的纳米颗粒(DOX/DAS-OE NPs)的粒径略有增加，为214.6nm。如图5(a)和图5 (b)所示，我们通过SEM观察并拍摄了两个纳米颗粒的形貌。可见，两种纳米粒子均呈球形，大小分布均匀。
实施例5
实施例4中的纳米粒子DAS-OE NPs和DOX/DAS-OE NPs酸降解探究：
试验方法如下：
取5mL不同pH值的PBS缓冲液(pH为5.0和7.4)分散纳米粒子DAS-OE NPs和 DOX/DAS-OE NPs，室温下孵育。在设定不同的时间点通过DLS检测其粒径和光散射强度的变化。如图6所示。用动态光散射法(DLS)测量了两种纳米粒子在不同pH值(pH值分别为5.0和7.4)下在PBS中的尺寸变化。图6显示了不同pH条件下DAS-OE NPs和 DOX/DAS-OE NPs在48h内的大小变化。当pH值为7.4(图6的A和图6的C)时，两种纳米粒子的尺寸基本没有变化，其强度只有轻微的波动，说明两种纳米粒子在中性条件下保持稳定。但是，在pH为5.0(图6的B和图6的D)时，两种纳米颗粒的粒径和强度均缓慢下降，这可能是由于在弱酸性条件下，纳米颗粒中的原酸酯缓慢水解所致。
实施例6
实施例4的纳米粒子DAS-OE NPs包载阿霉素载药率的计算：
计算方法如下：
依据已报道文献中的方法，建立盐酸阿霉素标准曲线。在481nm下用酶标仪测定吸光度，绘制pH＝7.4缓冲液的盐酸阿霉素的标准曲线。
分别称取100mg空纳米DAS-OE NPs，充分溶解pH＝7.4的缓冲液中，再称取20mg盐酸阿霉素加入，维持溶液pH为7.4-8，避光搅拌反应8h。结束后，将载药的纳米粒子离心，取上清，收集沉淀。在481nm下检测上清吸光度，以标准曲线为参照，分别计算两种载药纳米粒子的载药量和载药效率。其载药量和载药效率计算方法如下：
载药率(％)＝达沙替尼小分子前药内的阿霉素含量/达沙替尼小分子前药的总重量
包封率(％)＝达沙替尼小分子前药内的阿霉素含量/阿霉素的投药量
当DOX与DAS-OE的投料比为1:5时，DOX装载量(DLC)为21.9％，DOX装载效率 (DLE)为75.6％。可以直观的从计算结果发现，该小分子前药具有非常高的载药效率和载药量。
实施例7
纳米粒子体外药物释放的研究：
纳米粒子体外药物释放的研究方法如下：
达沙替尼纳米粒子(实施例4的DAS-OE NPs)以及载有阿霉素的达沙替尼纳米粒子(实施例4的DOX/DAS-OE NPs)的体外药物释放实验是在三种pH梯度下(pH值分别为5.0,6.5和7.4)进行的。具体如下,分别取2毫升的DAS-OE NPs溶液和DOX/DAS-OE NPs的溶液添加到透析袋中。分别沉浸没在5毫升的不同pH值(5.0,6.5和7.4)的PBS缓冲液中,并放置在摇床中(37℃,120rpm,ZWY-2102C,上海)孵育。在设定的时间点，收集PBS缓冲液，用5ml新鲜PBS缓冲液代替。和我们前面提到的一样，释放在PBS介质中DAS的含量是在315nm处用紫外分光光度法测定的，而释放在介质中的DOX的含量是在激发波长为480 nm，吸收波长为590nm处用荧光分光光度法测定的。所有样本重复三次或三次以上。结果如图7所示。体外条件下，DOX或DAS从DAS-OE NPs和DOX/DAS-OE NPs的释放曲线如图7所示。对于DAS-OE NPs,48h内DAS的累计释放量分别为43.2％(pH7.4)、54.8％(pH 6.5)和93.4％(pH5.0)(图7的A)。对于DOX/DAS-OE NPs(图7的B和图7的C)， 48h内DAS释放量分别为38.8％(pH7.4)、46.2％(pH6.5)和89.4％(pH5.0)，而相应 pH条件下DOX释放量分别为44.8％、85.2％和89.2％。可以发现，纳米粒子在弱碱性条件下药物释放率较低，而在酸性条件下可以实现快速释放，而且药物释放量随pH值的降低而增加。另外，PBS溶液与DAS-OE NPs共孵育(pH值分别为5.0、6.5和7.4)后收集滤液。将收集到的DAS-OE NPs在三种不同pH值条件下的降解液，冻干后进行核磁检测，检测方法和实施例2相同，结果如图8所示。可以看出，在弱碱性条件下，纳米粒子几乎不降解，原酸酯降解峰很小，而在酸性条件下，原酸酯的降解峰强度增强，且pH值越低，原酸酯降解峰强度越高。
实施例8
体外细胞摄取实验：
研究方法如下：
实施例4的DOX/DAS-OE NPs和裸药阿霉素在体外细胞的定性和定量摄取制备方法如下：将细胞HepG2和H22培养到对数生长期，稀释10倍，将细胞加入到无菌6孔板中，板内含有灭菌后的载玻片。待细胞培养24h后，更换1800μL的新鲜培养基(DMEM/HIGH Glucose)，再添加200μL的阿霉素或DOX/DAS-OE NPs溶液，培养4h。吸出培养基后，用PBS缓冲液清洗2-3次，加入100μL的4％多聚甲醛固定液(Beyotime P0099-100mL)，固定5min，用PBS缓冲液清洗2-3次，加入100μL的染核试剂Hoechst33258,避光下染核5 min。弃去染色液，用PBS缓冲液清洗2-3次，最后加入1mL的PBS，取出载玻片，激光共聚焦下观察成像，成像结果如图9的A(HepG2)和图9的B(H22)所示。可见，细胞与游离DOX和DOX/DAS-OE NPs孵育0.5h后，HepG2和H22细胞核中出现的DOX产生微弱的红色荧光信号，说明两种剂型均成功进入细胞。此外，由于红色荧光信号在两个核内的强度随时间的增加而明显增强，药物在细胞中的含量表现出随时间延长而增加的细胞摄取行为。定量摄取则在药品和细胞共培养4小时后，直接离心，使用PBS清洗3次后，使用0.5mL 复溶，吹打均匀后，直接使用流式细胞仪检测即可。结果如图10A(HepG2)和10B(H22) 所示。结果还是同样表明，细胞中DOX含量随时间增加而增加。值得注意的是，在共培养 4h后，DOX/DAS-OE NPs处理细胞中DOX含量明显高于裸药给药组细胞，这可能是由于两个样品进入细胞的机制不同。游离的DOX主要通过自有扩散进入细胞，而纳米颗粒通常通过内吞作用进入细胞。
实施例9
体外细胞毒性试验：
研究方法如下：
我们选择H22和HepG2细胞，通过MTT法评价不同药物组合的细胞毒性。
将浓度为4×103的细胞分别加入96孔板中。24h后,细胞用PBS(0.01M,pH值7.4)清洗后添加新鲜培养基(180μL,DMEM/高葡萄糖)。然后,各剂型20μL的药物(实施例 4的DOX,实施例1的DAS,实施例4的DAS-OE NPs和实施例4的DOX/DAS-OE NPs)分别被添加到96孔板和细胞共培养。48小时后,清洗细胞，添加新鲜培养基(180mLDMEM /高糖)和20μLMTT溶液。4h后,移除培养基,添加150mLDMSO,震荡细胞培养板10分钟。然后在570nm波长下使用酶标仪测量样品的吸光度。但是,H22细胞的样本组直接加入培养基,4h后,然后加上100μL三联甲瓒溶液(SDS10g,异丁烯5mL,0.1mL盐酸(10M), 双重蒸馏水(100mL)。最后震荡10分钟，用酶标仪在490nm处测量样品的吸光度。结果如图11(a)、11(b)所示。裸药给药的DAS最初溶解在浓度为20mM的DMSO中，DMSO 的最终浓度不超过1％(v/v)。达沙替尼的MTT试验用与对照组浓度相同的DMSO处理，其余各组细胞用空白培养基处理作为对照组。细胞与DAS、DOX、DAS-OE NPs和 DOX/DAS-OE NPs在104nM浓度下共培养48h后，HepG2的细胞存活率分别下降至46.9％、 38.7％、28.5％和20.0％。对于H22细胞，与每个样本共孵育48h后，相应的细胞存活率分别为53.8％、42.5％、37.6％和22.3％。这些药物对HepG2和H22细胞均表现出浓度依赖性的细胞毒性。显然，DOX/DAS-OE NPs表现出最高的细胞毒性，这表明前药基纳米颗粒可以通过原酸酯连接剂的水解而裂解并释放出抗癌药物，并对目标癌细胞进行杀伤。
因此，DAS和DOX的快速释放具有协同杀死癌细胞的作用。
实施例10
细胞凋亡实验探究：
我们使用流式细胞分析仪定量分析每组药物(空白组,实施例1的DAS,实施例4的DAS-OE NPs,实施例4的DOX,实施例4的DOX/DAS-OE NPs)对两种细胞(H22和HepG2) 在24h的杀伤作用。首先,我们添加了酶解后的单细胞分散溶液(4×103,2mL)到六孔板,细胞分布面积增长到板孔面积的90％,PBS清洗细胞3次,添加1.8mL新鲜培养基,并添加 200μL药物溶液(阿霉素最后的浓度为5mg/mL,DAS用量按纳米粒载药量等量添加)，对照组仅加2mL培养基。培养24小时后,清洗细胞两次，然后离心,丢弃的上层清液并添加细胞结合液400μL,混合,然后加入FITC 5μL(V-FITC),把它们在黑暗条件下混合的15分钟, 加入PI(5μL)混合均匀,并使用流式细胞分析仪进行检测和分析。结果如图12所示。对照组细胞凋亡率(早期和晚期凋亡)分别为4.89％(HepG2)和0.05％(H22)，说明细胞生长良好。DOX处理后细胞凋亡率分别为22.20％(HepG2)和20.00％(H22)，而DAS处理组细胞凋亡率分别为18.03％(HepG2)和15.34％(H22)。此外，经DAS-OE NPs处理后，HepG2 细胞的凋亡率为29.52％，H22细胞的凋亡率为25.48％。DOX/DAS-OE NPs处理细胞的细胞毒性最高，凋亡率分别为50.7％(HepG2)和56.3％(H22)。显然，前药基纳米颗粒比相应的游离药物(DOX或DAS)具有更高的生物活性，这与细胞摄取和MTT测定结果一致。这些结果进一步证明，DOX/DAS-OE NPs内部原酸酯连接剂可在酸性条件下水解，进而在肿瘤细胞中释放药物，两药且具有协同抗肿瘤作用。
实施例11
体内药物分布探究：
建立H22荷瘤小鼠，体内实验按照安徽大学实验动物保护中心批准的方案进行。小鼠腋窝肿瘤体积达到100mm3后，随机分为两组，通过尾静脉给药(游离实施例4的DOX或实施例4的DOX/DAS-OE NPs(5mg/kgDOX含量)。在不同时间点处死小鼠，采集主要器官和血液，并称量组织和器官的重量，以及从老鼠身上采集的血液，都被称重并记录下来。将各器官均置于含盐酸(0.3M)的75％乙醇溶液中，连续提取药物48h，离心20min(7000rmp)。用酶标仪(分子仪器，美国，EX480nm和EM590nm)测定上清液中阿霉素的含量。结果如图13(a)、图13(b)和14所示。DOX治疗小鼠心脏中DOX含量明显高于DOX/DAS-OE NPs治疗小鼠心脏中DOX含量。1h和24h时，小鼠心脏中DOX含量(游离DOX)分别为5.26％ID/g和1.75％ID/g，而DOX/DAS-OENPs中阿霉素含量分别为3.69％ID/g和0.78％ ID/g。而DOX/DAS-OE NPs组各时间点血中阿霉素水平均高于游离阿霉素组。给药24小时后，裸药DOX组和DOX/DAS-OE NPs组小鼠血液中DOX含量分别为0.75％ID/g和1.97％ ID/g。这些结果提示，DOX/DAS-OE NPs组与注射裸药DOX组相比，可以降低小鼠的心脏毒性，改善药物在血液中的循环时间，从而增加药物在肿瘤部位的积累。同时可以看出，随着时间的延长，各器官中DOX浓度逐渐降低。此外，我们还研究了DOX在不同时间点在肿瘤中的积累情况。如图14所示，DOX/DAS-OE NPs组肿瘤中DOX的含量在各时间点均高于裸药DOX组。裸药阿霉素在肿瘤的峰值浓度是2.62％的ID/g(2h),而DOX/DAS-OE NPs 组阿霉素的浓度峰值为4.33％ID/g(4h)。这可能是由于DOX/DAS-OENPs组存在纳米粒子的降解过程，从而导致药物在肿瘤积累达到最大值的时间点比裸药阿霉素组迟。24h时，肿瘤组织中DOX浓度分别为1.69％ID/g(游离DOX)和2.92％ID/g(DOX/DAS-OE NPs)。两组曲线下面积(AUC)分别为43.10(游离DOX)和77.28(DOX/DAS-OE NPs)。这些结果表明，DOX/DAS-OE NPs在体内的周期较长，且在肿瘤组织中的药物积累量高于游离DOX。
实施例12
体内抗肿瘤实验探究：
我们选择雄性ICR小鼠(22择雄性验作为体内抗肿瘤实验的研究对象。当小鼠肿瘤体积平均达到100mm3左右时，将小鼠分为5组(每组6只)，分别给予尾静脉注射(生理盐水、实施例4的游离DOX(5mg/kg)、实施例1的游离DAS(22.9mg/kg)、实施例4的DAS-OE NPs(22.9mg/kg)、实施例4的DOX/DAS-OE NPs(5mg/kgDOX含量)。各组小鼠分别于第1天和第4天给药一次，观察10天。记录小鼠肿瘤体积和体重。计算小鼠肿瘤体积V＝ds2×dl/2(ds为最短直径，dl为最长直径)。第10天处死小鼠，取出肿瘤组织及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，拍照肿瘤组织。各组器官切片用多聚甲醛浸泡，石蜡包埋，染色(H&E)，荧光显微镜下观察并拍照，观察药物毒性。如图15-18所示。从图15B可以看出，生理盐水组小鼠肿瘤体积持续增长，第10天肿瘤体积达到775mm3。DAS在此剂量下似乎没有明显的抗肿瘤作用，因为肿瘤体积达到686mm3，与对照组相似。而其他各组平均肿瘤体积分别为 587mm3(DOX)、456mm3(DAS-OENPs)和289mm3(DOX/DAS-OE NPs)。DOX/DAS-OE NPs体内抗肿瘤效果最好，与体外结果一致。图16为各组治疗后平均肿瘤重量。DAS、DOX、 DAS-OE NPs和DOX/DAS-OE NPs的肿瘤重量分别为0.80±0.05g、0.65±0.09g、0.34±0.11g 和0.17±0.08g。生理盐水组肿瘤重量(1.00±0.09g)，明显高于其他各组。而DOX/DAS-OE NPs组肿瘤重量明显低于其他各组。肿瘤生长抑制率分别为19.9％(DAS)、35.5％(DOX)、66.3％(DAS-OE NPs)和82.8％(DOX/DAS-OENPs)。从图17可以看出，生理盐水组的肿瘤大小明显大于其他组，而DOX/DAS-OE NPs组的肿瘤大小明显小于其他组。从16和17 也可以看出，DOX/DAS-OE NPs组具有最强的抗肿瘤作用。这些结果再次证实了DAS与DOX 具有良好的协同抗肿瘤作用。使用倒置显微镜观察小鼠主要器官及肿瘤组织的H&E染色切片，如图18所示，与生理盐水组相比，DOX/DAS-OE NPs组小鼠主要脏器未见明显损伤，而DOX组小鼠心脏组织有局部损伤。生理盐水组小鼠肿瘤组织排列紧密，而DOX/DAS-OE NPs组小鼠肿瘤组织广泛坏死，明显高于其他各组。这说明DOX/DAS-OE NPs具有良好的体内抗肿瘤效果。在治疗肿瘤领域有巨大应用前景。
需要说明的是，在本文中，如若存在第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药，其特征在于，所述小分子前药的分子结构式如下所示：
Figure FDA0003973034480000011
其中，R为甲基。
2.一种制备如权利要求1所述的基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，包括以下步骤：将4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)、羧基化的达沙替尼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、三乙胺混合反应，透析后，冷冻干燥得到产物；合成过程如下：
Figure FDA0003973034480000012
3.根据权利要求2所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述达沙替尼通过以下步骤改性得到羧基化的达沙替尼；
步骤一、将达沙替尼、丁二酸酐、无水三乙胺和DMF混合，反应；
步骤二、反应结束后，除去溶剂，得到白色产物；
步骤三、白色产物通过洗涤、干燥后，得到羧基化的达沙替尼。
4.根据权利要求3所述的基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述步骤一中，达沙替尼先溶于DMF，再滴加无水三乙胺后，加入丁二酸酐。
5.根据权利要求3所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述步骤一的反应在室温25℃下通氮气反应，反应时间为72h。
6.根据权利要求3所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述步骤二中采用真空蒸馏的方式除去溶剂。
7.根据权利要求3所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述步骤三中将白色产物用二氯甲烷超声条件下洗涤3次，用甲醇超声条件下洗涤2次，真空干燥后得到羧基化的达沙替尼。
8.根据权利要求3所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)、羧基化的达沙替尼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和催化剂三乙胺间的摩尔比为1mol:2mol:1.5mol:1.5mol:1.5×10-4mol。
9.根据权利要求3所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述混合反应的反应条件为氮气环境、37℃、反应至少48小时。
10.根据权利要求3所述的制备基于pH敏感的原酸酯和达沙替尼偶联物组成的小分子前药的方法，其特征在于，所述冷冻干燥在-50℃,0Pa条件下进行。
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