CN116120333B - 一种鬼臼毒素纳米前药及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及鬼臼毒素‑芴甲醇前药及其制备方法和应用。通过将亚二硫基二乙酸，3,3'‑二硫代二丙酸或4,4'‑二硫代二丁酸成酸酐，然后与9‑芴甲醇成酯得到中间产物，然后中间产物再与鬼臼毒素发生成酯反应即得鬼臼毒素‑芴甲醇前药。通过一步纳米沉淀法得到PEG化的前药自组装纳米粒。所述的前药是将鬼臼毒素与9‑芴甲醇通过还原响应断裂的二硫键连接，在血液循环以及在正常的组织中能够以前药的形式稳定存在，而在肿瘤细胞内高还原条件下二硫键快速断裂，从而实现肿瘤细胞内特异性释放母药鬼臼毒素，发挥强效的抗肿瘤活性的同时降低抗肿瘤药物的全身毒性。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，涉及鬼臼毒素-芴甲醇前药及其自组装纳米粒的构建，具体涉及具有肿瘤还原响应特性的鬼臼毒素-芴甲醇前药及其自组装纳米粒在制备药物递送系统中的应用。
背景技术
鬼臼毒素(Podophyllotoxin，PPT)是小蘖科鬼臼属植物华鬼臼的根和茎中提取得到的一种木酚素，又称鬼臼素、鬼臼毒、鬼臼脂素等。具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、增强免疫力等多种生物活性，其抗肿瘤活性最为显著，研究表明鬼臼毒素对多种肿瘤均有较为理想的抑制效果。
虽然鬼臼毒素具有非常可观的抗肿瘤潜力，但截至目前尚未能在临床抗肿瘤治疗中得到应用。究其原因，一方面是由于鬼臼毒素水溶性极差，使其溶液很难达到预期的最佳治疗浓度。另一方面，由于其作用机制多样且复杂，非常容易出现严重的全身毒副作用。这两方面的障碍严重限制着鬼臼毒素的应用。目前，它在临床中仅被制成酊剂用于治疗由人类乳头瘤病毒引起的尖锐湿疣。因此，如果鬼臼毒素的不良性质能够被有效缓解，那它无疑将是一种极具潜力的抗肿瘤候选药物，可以为抗肿瘤治疗提供更多的选择。
随着制药技术的发展，近年来，纳米技术在药物递送领域的广泛应用极大地改善了药物递送效率。相比于传统的溶液剂，纳米制剂具有延长药物的血液循环时间、通过EPR效应提高肿瘤蓄积、提高细胞摄取效率等显著的优势。此外，前药策略可以通过化学结构修饰来改善药物的不良性质，降低药物的非特异性细胞毒性，目前已经有多种基于前药策略的药物成功上市。
然而，纳米制剂可能存在载药量低、制备工艺复杂、存在载体相关毒性等缺点，而前药也存在母药释放难以控制等问题，这极大地限制了其临床应用。基于这些原因，肿瘤响应性释放的小分子前药自组装纳米药物递送系统由于其无需载体、载药量高、稳定性好、毒副作用低肿瘤部位快速释放母药等优势，已成为近几年化疗药物递送研究的热点。但是现有技术表明，进行不同结构修饰的前药，其对于药物性质的改变不同，得到的前药在体内的效果也不同。因此，为了获得具有最佳性质的前药，并使其自组装成纳米粒，从而提高疗效、降低毒性，是医药技术人员正在努力研究的方向。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药及其制备方法与应用，所述的前药是将鬼臼毒素与具有π电子共轭结构的9-芴甲醇通过还原响应断裂的二硫键连接，在血液循环以及在正常的组织中能够以前药的形式稳定存在，而在肿瘤细胞内异常高还原环境下快速断裂，从而实现肿瘤细胞内特异性释放母药的特点，发挥强效的抗肿瘤活性。进一步将所合成的前药通过一步纳米沉淀法制备成前药自组装纳米粒。制备工艺及其简单，所制备的纳米制剂载药量高(>40％)，粒径较小且均一，稳定性良好，能够在还原环境中快速释放母药，并且能明显降低鬼臼毒素的毒性，为鬼臼毒素的临床应用提供了可能。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供一种抗肿瘤治疗剂-具有π电子共轭结构的化合物小分子前药，其特征在于，以抗肿瘤治疗剂和具有π电子共轭结构的化合物通过肿瘤特异性响应的连接键相连；所述的抗肿瘤治疗剂为含有活性羟基的抗癌治疗剂，选自鬼臼毒素及其衍生物、紫杉烷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物，所述的肿瘤特异性响应的连接键包括二硫键、单硫键、三硫键、单硒键、二硒键、酯键或酰胺键，所述的具有π电子共轭结构的化合物为9-芴甲醇、2-(9-芴基)乙醇、9-芴乙酸、联苯醇、双酚芴、1-芘甲胺或1-芘甲醇。
进一步地，本发明提供一种具有肿瘤还原响应特性的鬼臼毒素-芴甲醇前药，其结构式为：
R为SS，CH2SSCH2或CH2CH2SSCH2CH2。
具体地，选择鬼臼毒素与9-芴甲醇作为模型，分别通过(a)二硫代二乙酸，(b)3,3'-二硫代二丙酸，(c)4,4'-二硫代二丁酸相连，其结构式如下：
进一步地，本发明提供所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的合成方法，包括如下步骤：
(1)将含二硫键的二酸化合物Ⅱ发生脱水反应成酸酐，得到酸酐化合物Ⅲ；
(2)在催化剂作用下，酸酐化合物Ⅲ与9-芴甲醇发生酯化(成酯)反应，得到中间产物Ⅳ；
(3)在催化剂作用下，中间产物Ⅳ与鬼臼毒素发生酯化(成酯)反应，得到终产物鬼臼毒素-芴甲醇前药Ⅰ；
反应式如下：
进一步地，所述含二硫键的二酸化合物Ⅱ为二硫代二乙酸、3,3’-二硫代二丙酸或4,4’-二硫代二丁酸。
进一步地，步骤(1)中，反应温度为20-35℃，时间为1-8h；
步骤(2)中，酸酐化合物Ⅲ与9-芴甲醇的摩尔比为1：1-3：1，优选为1:1；催化剂为4-二甲氨基吡啶，酸酐化合物Ⅲ与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：0.05-0.3，优选为1：0.2；反应温度为20-40℃，时间为8-48h；
步骤(3)中，中间产物Ⅳ与鬼臼毒素的摩尔比为5：1-1：5，优选为1：1；催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶，中间产物Ⅳ、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1-3：1-3：0.05-0.3，优选为1：3：2：0.1；反应温度为20-40℃，时间为12-60h。
具体地，所述鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的合成方法，包括如下步骤：
(1)将二硫代二乙酸、3,3’-二硫代二丙酸或4,4’-二硫代二丁酸溶解于过量乙酸酐中，氮气保护，室温下反应2-4小时，后除去多余的乙酸酐；
(2)将步骤(1)所得产物溶于二氯甲烷中，并加入9-芴甲醇，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂，室温条件下搅拌过夜，反应完毕后采用二氯甲烷-丙酮洗脱体系利用柱层析分离得到中间产物；
(3)将中间产物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，溶于无水二氯甲烷中，在冰浴下活化2-4小时，然后加入鬼臼毒素，氮气保护，在25℃条件下反应48-60小时，所得产物经制备液相分离纯化。
本发明还提供了所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的自组装纳米粒，所述的小分子前药纳米粒可以是非聚乙二醇(PEG)化的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药纳米粒、聚乙二醇(PEG)修饰剂修饰的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药纳米粒或包载荧光物质或疏水性药物的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒；所述的聚乙二醇(PEG)修饰剂为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(PLGA-PEG)、聚乙烯-聚乙二醇(PE-PEG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-花生四烯酸(DSPE-PEG-AA)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药与PEG修饰剂的重量比为：20：1～2：1，优选为90:10～70:30；荧光物质占鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的重量分数为0-40％。
进一步地，所述PEG修饰剂中PEG的分子量为50-400k。
本发明还提供了鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
将一定量的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药、或鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药和PEG修饰剂的混合物、或鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药与PEG修饰剂、荧光物质的混合物溶解到适量四氢呋喃或乙醇中，得到四氢呋喃或乙醇溶液；在磁力搅拌器的搅拌下，将该四氢呋喃或乙醇溶液缓慢滴加到水中，前药可以自发地组装成粒径均匀的纳米粒。最后，采用透析法除去制剂中的四氢呋喃或乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米制剂。具体地，
(1)非PEG化的纳米粒的制备方法：将一定量的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药溶解到适量四氢呋喃中，得到四氢呋喃溶液；在磁力搅拌器的搅拌下，将该四氢呋喃溶液缓慢滴加到去离子水中，前药可以自发地组装成粒径均匀的纳米粒，采用减压旋转蒸发法除去制剂中的四氢呋喃，得到不含有机溶剂的纳米制剂。
(2)PEG化的纳米粒的制备方法：将一定量的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药和PEG修饰剂溶解到适量四氢呋喃中，得到四氢呋喃溶液；在磁力搅拌器的搅拌下，将该四氢呋喃溶液缓慢滴加到去离子水中，前药可以组装成粒径均匀的PEG修饰的纳米粒，采用减压旋转蒸发法除去制剂中的四氢呋喃，得到不含有机溶剂的PEG化的纳米粒，所述的PEG修饰剂为TPGS、PLGA-PEG、PE-PEG、DSPE-PEG-AA或DSPE-PEG。
(3)包载荧光物质的小分子前药自组装纳米粒的制备方法：将一定量的荧光物质(香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy-5或Cy-7)、前药和PEG修饰剂溶解到适量的四氢呋喃或乙醇中，得到四氢呋喃或乙醇溶液；搅拌下，将该四氢呋喃或乙醇溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。采用透析法除去制剂中的四氢呋喃或乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
本发明制备的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的自组装纳米粒的粒径在100nm左右。
本发明还提供所述的抗肿瘤治疗剂-具有π电子共轭结构的化合物小分子前药、所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药或所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
本发明还提供所述的抗肿瘤治疗剂-具有π电子共轭结构的化合物小分子前药、所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药或所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供所述的抗肿瘤治疗剂-具有π电子共轭结构的化合物小分子前药、所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药或所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
本发明所述的前药是将鬼臼毒素与9-芴甲醇通过还原响应断裂的二硫键连接，在血液循环以及在正常的组织中能够以前药的形式稳定存在，而在肿瘤细胞内高还原条件下二硫键快速断裂，从而实现肿瘤细胞内特异性释放母药鬼臼毒素，发挥强效的抗肿瘤活性的同时降低抗肿瘤药物的全身毒性。
本发明的有益效果在于：
(1)将鬼臼毒素制备成二硫键连接的前药，并将其制备成纳米粒不仅提高了鬼臼毒素的疗效，同时有效地缓解了鬼臼毒素毒副作用；(2)所述的纳米粒通过一步纳米沉淀法制备，制备工艺极其简单，易于制剂的规模化生产；(3)无需载体材料，载药量高，且避免了毒性较大的增溶剂的使用，有望提高患者的耐受性和依从性；(4)纳米粒粒径小且均匀，通过PEG修饰能够延长药物在血液中的循环时间，易于通过EPR效应富集于肿瘤部位；(5)采用二硫键桥连，能够在肿瘤细胞内高还原环境中实现特异性快速释放母药。
附图说明
图1为本发明实施例1中的鬼臼毒素前药α-Fmoc-SS-PPT质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图2为本发明实施例1中的鬼臼毒素前药β-Fmoc-SS-PPT质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图3为本发明实施例1的鬼臼毒素前药γ-Fmoc-SS-PPT的质谱图及1HNMR谱图，其中A为质谱图，B为1HNMR谱图。
图4为本发明实施例2的PEG修饰的前药自组装纳米粒的外观照片。
图5为本发明实施例2的PEG修饰的前药自组装纳米粒的透射电镜照片。
图6为本发明实施例2的PEG修饰的前药自组装纳米粒的粒径分布。
图7为本发明实施例3的PEG修饰的前药自组装纳米粒的胶体稳定性考察。
图8为本发明实施例4的PEG修饰的前药自组装纳米粒的体外释放实验。
图9为本发明实施例6的香豆素-6标记的PEG修饰的前药自组装纳米粒的细胞摄取情况。
图10为本发明实施例7的PEG修饰的前药自组装纳米粒的细胞毒性实验。
图11为本发明实施例8的PEG修饰的前药自组装纳米粒的药代动力学研究。
图12为本发明实施例9的PEG修饰的前药自组装纳米粒的最大耐受剂量考察，其中A：给药剂量为10mg/kg时的生存曲线；B：给药剂量为20mg/kg时的生存曲线；C：给药剂量为30mg/kg时的生存曲线；D：给药剂量为10mg/kg时的体重变化；E：给药剂量为20mg/kg时的体重变化；F：给药剂量为30mg/kg时的体重变化。
图13为本发明实施例10的PEG修饰的前药自组装纳米粒的体内抗肿瘤活性考察。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1：二硫键桥连的鬼臼毒素-芴甲醇前药(α-Fmoc-SS-PPT，β-Fmoc-SS-PPT、γ-Fmoc-SS-PPT))的合成
(1)α-Fmoc-SS-PPT的合成
将2mmol亚二硫基二乙酸加入到50mL茄形瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，在氮气保护下室温反应2小时，进行减压蒸馏干燥除去多余的乙酸酐。将2mmol所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入2mmol 9-芴甲醇和0.4mmol DMAP，25℃条件下搅拌过夜，用硅胶柱色谱法(体积比二氯甲烷/丙酮＝100：0.5)纯化得到中间产物，产率为71.0％。最后将1mmol中间产物、3mmol EDCI、2mmol HOBt和0.1mmol DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴2小时，然后加入1mmol鬼臼毒素，氮气保护的条件下在室温下反应48小时，终产物通过制备液相色谱(流动相为体积比乙腈/水＝80:20)分离纯化既得，产率为61.8％。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为氘代CDCl3，波谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.77(dt,J＝7.6,0.9Hz,2H,6,12),7.61(tq,J＝7.5,0.9Hz,2H,1,11),7.41(tq,J＝7.5,0.9Hz,2H,2,10),7.31(tt,J＝7.4,0.9Hz,2H,3,9,34),6.84(d,J＝0.7Hz,1H,37),6.53(s,1H,29),6.38(s,2H,45,49),5.95(d,J＝1.4Hz,1H,13),5.94–5.88(m,2H,39),5.30(s,0H),4.60(d,J＝4.0Hz,1H,26),4.48(dd,J＝7.2,1.1Hz,2H,14),4.41(dd,J＝9.2,6.4Hz,1H,42),4.25(t,J＝7.1Hz,1H,30'),4.21–4.15(m,1H,30”),3.80(s,2H,17),3.75(s,6H,53,55),3.70–3.59(m,4H,20',54),2.94–2.82(m,2H,20”,41).
(2)β-Fmoc-SS-PPT的合成
将2mmol 3,3’-二硫代二丙酸加入到50mL茄形瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，在氮气保护下室温反应2小时，进行减压蒸馏干燥除去多余的乙酸酐。将2mmol所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入2mmol 9-芴甲醇和0.4mmol DMAP，25℃条件下搅拌过夜，用硅胶柱色谱法(体积比二氯甲烷/丙酮＝100：0.5)纯化得到中间产物，产率为56.2％。最后将1mmol中间产物、3mmol EDCI、2mmol HOBt和0.1mmol DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴2小时，然后加入1mmol鬼臼毒素，氮气保护的条件下在室温下反应48小时，终产物通过制备液相色谱(流动相为体积比乙腈/水＝80:20)分离纯化既得，产率为47.7％。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为氘代CDCl3，波谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.77(dt,J＝7.6,0.9Hz,2H,3,9),7.59(dd,J＝7.5,1.1Hz,2H,6,12),7.41(t,J＝7.5Hz,2H,1,11),7.32(tt,J＝7.4,1.0Hz,2H,2,10),6.79(s,1H,35),6.54(s,1H,32),6.39(s,2H,37',43,47),5.96(dd,J＝9.5,1.4Hz,2H,13,27,37”),5.92(d,J＝9.1Hz,1H,27),4.60(d,J＝4.4Hz,1H,24),4.44(d,J＝7.1Hz,2H,14),4.39(dd,J＝9.3,6.9Hz,1H,40),4.25–4.16(m,2H,28),3.81(s,3H,52),3.76(s,6H,51,53),3.00–2.79(m,10H,39,54,55,56,57).
(3)γ-Fmoc-SS-PPT的合成
将2mmol 4,4’-二硫代二丁酸加入到50mL茄形瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，在氮气保护下室温反应2小时，进行减压蒸馏干燥除去多余的乙酸酐。将2mmol所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入2mmol 9-芴甲醇和0.4mmol DMAP，25℃条件下搅拌过夜，用硅胶柱色谱法(体积比二氯甲烷/丙酮＝100：0.5)纯化得到中间产物，产率为47.2％。最后将1mmol中间产物、3mmol EDCI、2mmol HOBt和0.1mmol DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴2小时，然后加入1mmol鬼臼毒素，氮气保护的条件下在室温下反应48小时，终产物通过制备液相色谱(流动相为体积比乙腈/水＝80:20)分离纯化既得，产率为58.2％。
采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图3所示。核磁共振选用的溶剂为氘代CDCl3，波谱解析结果分别如下：
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.77(d,J＝7.5Hz,2H,6,12),7.59(ddq,J＝7.5,1.8,0.9Hz,2H,3,9),7.41(tt,J＝7.5,0.9Hz,2H,1,11),7.32(tt,J＝7.5,0.8Hz,2H,2,10),6.75(s,1H,37),6.53(s,1H,34),6.38(s,2H,45,49),5.97(dd,J＝10.9,1.4Hz,3H,13,39),5.87(d,J＝9.1Hz,1H,29),4.59(d,J＝4.4Hz,1H,26),4.42(d,J＝7.0Hz,2H,14),4.36(dd,J＝9.3,6.9Hz,1H,42),4.23–4.15(m,2H,30),3.81(s,3H,54),3.76(s,6H,53,55),2.89(dd,J＝14.5,4.4Hz,2H,58',58”),2.86–2.76(m,1H,41),2.74(td,J＝6.9,2.1Hz,2H,41,58”),2.67(t,J＝7.1Hz,2H,56),2.60(dt,J＝16.5,7.3Hz,2H,17),2.53(dt,J＝22.9,7.2Hz,3H,17,20'),2.09(pd,J＝7.1,2.6Hz,2H,59),2.02(p,J＝7.2Hz,2H,57).
实施例2：DSPE-PEG2k修饰的Fmoc-SS-PPT前药自组装纳米粒的制备
称取DSPE-PEG2k(艾伟拓医药科技有限公司)0.4mg和Fmoc-SS-PPT(分别为实施例1中制备的α-Fmoc-SS-PPT、β-Fmoc-SS-PPT和γ-Fmoc-SS-PPT)2。0mg，用0.8mL四氢呋喃将其溶解，搅拌下，将该四氢呋喃溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒。随后通过减压蒸馏除去四氢呋喃，得到不含有机溶剂的纳米制剂，外观如图4所示。
通过透射电子显微镜观察所制备的纳米粒的形态，结果如图5所示，前药纳米粒为均匀的球形颗粒。
通过马尔文粒径仪测定所制备的纳米粒的粒径分布，结果如图6及表1(PEG修饰的α-Fmoc-SS-PPT纳米粒记作FAP NPs、PEG修饰的β-Fmoc-SS-PPT纳米粒记作FBP NPs、PEG修饰的γ-Fmoc-SS-PPT的纳米粒记作FGP NPs)所示，前药纳米粒的粒径为100nm左右、粒径分布PDI<0.2，zeta电位约为-30mV，纳米粒粒径适中利于血液循环及肿瘤蓄积。
表1.PEG修饰的二聚体前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布、表面电荷和载药量
实施例3：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的胶体稳定性实验
将实施例2中制备的PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒取出1mL，加入到20mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育12小时，并且在预定的时间点(0,1,2,4,6,8,12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图7所示，在12小时内粒径没有发生显著的变化。
将实施例2中制备的PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒取出1mL，加入到20mL含有10％FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃的条件下孵育12小时，并且在预定的时间点(0,1，2,4,6,8,12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图7所示，在12小时内粒径没有发生显著的变化。
以上实验结果表明，无论是在无机盐存在的情况，还是在模拟组织液的环境中，构建的鬼臼毒素前药纳米粒均能够以较为稳定的形态存在，有利于更多的药物随血液循环富集于肿瘤部位，实现更佳的治疗效果。
实施例4：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的体外释放实验
以含30％乙醇的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察鬼臼毒素-芴甲醇前药自组装纳米粒的体外释放情况。将1mL实施例2中制备的PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒(鬼臼毒素含量为200μg/mL)加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点(0,1,2,4,6,8,12小时)取样，通过高效液相色谱测定释放出的鬼臼毒素浓度。向释放介质中加入一定浓度的二硫苏糖醇(DTT,分别为1mM,5mM,10mM)，以考察纳米粒在还原条件下的释放情况。结果如图8所示，前药中的二硫键具有还原敏感性，能够在DTT的作用下断裂释放出鬼臼毒素。其中，母药鬼臼毒素的释放速率为：α-Fmoc-SS-PPT>γ-Fmoc-SS-PPT>β-Fmoc-SS-PPT。
实施例5：香豆素-6标记的PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的制备
称取0.4mgDSPE-PEG2k(艾伟拓医药科技有限公司)、2.0mgFmoc-SS-PPT(分别为实施例1中制备的α-Fmoc-SS-PPT、β-Fmoc-SS-PPT和γ-Fmoc-SS-PPT)和0.1mg香豆素-6，用0.8mL四氢呋喃将其溶解，搅拌下，将该四氢呋喃溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒。随后通过减压蒸馏除去四氢呋喃，得到香豆素-6标记的PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒(香豆素-6浓度为25μg/mL)。
实施例6：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的细胞摄取情况
将接近长满的4T1细胞使用胰酶消化后铺至12孔板中(1×105cells/孔)，放置于培养箱中培养过夜后，分别给予用培养基稀释100倍后的实施例5制备的香豆素-6标记的3种PEG化的前药纳米粒与香豆素-6溶液剂(C-6)(此时香豆素-6浓度为250ng/mL)，给药后0.5小时和2小时后，使用流式细胞计数仪进行荧光强度检测，记录FLH-1通道荧光强度，结果如图9所示，发现4T1细胞对3种前药纳米粒的摄取效率远高于溶液剂，且呈时间依赖性。说明相较于溶液剂，经过PEG修饰后的前药纳米粒具有更高的细胞摄取能力，有利于肿瘤细胞对前药纳米粒的摄取，继而产生更佳的肿瘤抑制效果。
实施例7：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的细胞毒性实验
采用MTT法考察PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒对小鼠乳腺癌细胞(4T1)，小鼠成纤维细胞(3T3)的毒性。首先将态良好的细胞消化，用培养液稀释至20000cells/mL细胞吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加鬼臼毒素溶液剂或实施例2中制备的三种鬼臼毒素前药纳米粒(给药浓度分别为0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL以及500ng/mL，鬼臼毒素前药纳米粒中的给药浓度为鬼臼毒素等效浓度)。本实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用相应的培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入200μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加200μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48h或72h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液25μL，置培养箱中孵育4h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。使用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度值。计算细胞生存率如图10所示。
对于4T1细胞，在3种前药纳米粒中，α-Fmoc-SS-PPT前药纳米粒显示出最佳的抗增殖活性，其次是γ-Fmoc-SS-PPT前药纳米粒，β-Fmoc-SS-PPT前药纳米粒最弱，这与体外释放实验结果吻合，说明α-Fmoc-SS-PPT前药纳米粒的超敏感还原响应性使其迅速释放出母药鬼臼毒素，实现最佳的肿瘤细胞抑制效果。
对于3T3细胞，可以看到3种前药纳米粒的细胞毒性均明显低于鬼臼毒素溶液剂，证明构建的前药自组装纳米粒具有一定肿瘤细胞特异性的细胞毒性，对小鼠成纤维细胞的杀伤效果明显低于肿瘤细胞，这对缓解鬼臼毒素的全身毒副作用有着重要意义。
实施例8：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的药代动力学研究
将体重为180～220g的SD大鼠，随机分成4组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射鬼臼毒素溶液剂或实施例2中制备的三种PEG化的前药自组装纳米粒。鬼臼毒素等效剂量为5mg/kg。分别于0.033、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24h眼眶取血0.5mL，离心分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。
实验结果如图11所示，可以发现，鬼臼毒素溶液剂在血液中的浓度在给药后很快降低。相比之下，3种鬼臼毒素前药自组装纳米粒组在则显示出更高的血药浓度，具有更大的药-时曲线下面积(AUC)，说明药物更多地表现出更加持久的体内循环时间，利于药物向肿瘤部位蓄积，进而充分发挥药效。
实施例9：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的最大耐受剂量考察
将健康Balb/c小鼠随机分成12组，每组8只，分别通过尾静脉注射给予鬼臼毒素溶液剂10mg/kg、20mg/kg以及30mg/kg和实施例2中制备的三种PEG化前药纳米粒10mg/kg、20mg/kg以及30mg/kg(鬼臼毒素等效浓度)。每隔2天给药1次，连续给药4次。给药后，每天观察小鼠的存活状态，称体重，绘制生存曲线。
如图12所示，当给药剂量为10mg/kg时，各个组别均未出现死亡情况；当给药剂量为20mg/kg时，鬼臼毒素溶液剂组从给药后第6天开始出现死亡情况，在给药结束后第11天，生存率仅为12.5％，此外，存活的个体体重较前药纳米粒组别相比也明显降低；当给药剂量为30mg/kg时，鬼臼毒素溶液剂组给药后即无法存活，而前药纳米粒组的生存曲线优于鬼臼毒素组，但此剂量不能作为前药纳米粒组的最大耐受剂量，故对于本专利构建的鬼臼毒素前药自组装纳米粒而言，最大耐受剂量应为20mg/kg。
实施例10：PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒的体内抗肿瘤活性考察
将4T1细胞贴壁细胞消化，使用PBS溶液重悬制备成细胞悬液(5×106cells/100μL)，接种于Balb/c小鼠腹侧皮下。待肿瘤体积生长至100mm3时，将荷瘤小鼠随机分成5组，每组5只，分别给生理盐水、鬼臼毒素溶液剂10mg/kg和实施例2中制备的PEG化前药纳米粒20mg/kg(鬼臼毒素等效浓度)。每隔2天给药1次，连续给药4次。给药后，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积，计算荷瘤率。
实验结果如图13所示，与生理盐水相比，鬼臼毒素溶液剂和前药纳米粒组均显示出强效的抗肿瘤活性。其中，α-Fmoc-SS-PPT前药自组装纳米粒显示出最强的抗肿瘤活性，肿瘤体积几乎没有增长，荷瘤率结果同样证明了这个结论。此外，通过小鼠的体重变化可以判断，在给药治疗结束后，各个组别均未造成小鼠体重的明显下降。
以上结果表明，本发明所制备的α-Fmoc-SS-PPT前药纳米粒能够在有效缓解鬼臼毒素的全身毒性的同时提高给药剂量，并且增强抗肿瘤效果。
Claims (6)
1.鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述的自组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药纳米粒；
其中，鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的结构式为：
R为SS或CH2CH2SSCH2CH2。
2.如权利要求1式Ⅰ所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含二硫键的二酸化合物Ⅱ发生脱水反应，得到酸酐化合物Ⅲ；
(2)在催化剂作用下，酸酐化合物Ⅲ与9-芴甲醇发生酯化反应，得到中间产物Ⅳ；
(3)在催化剂作用下，中间产物Ⅳ与鬼臼毒素发生酯化反应，得到鬼臼毒素-芴甲醇前药Ⅰ；
反应式如下：
R的定义同权利要求1。
3.根据权利要求2式Ⅰ所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，反应温度为20-35℃，时间为1-8h；
步骤(2)中，酸酐化合物Ⅲ与9-芴甲醇的摩尔比为1：1-3：1；催化剂为4-二甲氨基吡啶，酸酐化合物Ⅲ与催化剂的摩尔比为1：0.05-0.3；反应温度为20-40℃，时间为8-48h；
步骤(3)中，中间产物Ⅳ与鬼臼毒素的摩尔比为5：1-1：5；催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶，中间产物Ⅳ、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1-3：1-3：0.05-0.3；反应温度为20-40℃，时间为12-60h。
4.如权利要求1所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，其制备过程如下：
将式Ⅰ所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂溶解到四氢呋喃或乙醇中，得到四氢呋喃或乙醇溶液；再将四氢呋喃或乙醇溶液滴加到水中，鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自发形成均匀纳米粒；最后，采用透析法除去制剂中的四氢呋喃或乙醇，得到不含任何有机溶剂的纳米制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰剂为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇、聚乙烯-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-花生四烯酸或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种，鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂的重量比为20：1～2：1。
6.权利要求1所述的鬼臼毒素-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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