CN118001240A - 一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒及其制备方法、应用 - Google Patents

一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鬼臼毒素‑9‑芴甲醇小分子前药纳米粒及其制备方法、应用，鬼臼毒素‑9‑芴甲醇小分子前药共组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素‑9‑芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素‑9‑芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒；鬼臼毒素‑9‑芴甲醇小分子前药为将鬼臼毒素及其化合物和9‑芴甲醇通过二硫键相连。本发明首次构建棉酚和PPT氧化敏感前药的无载体杂化纳米组装体，棉酚介导的前药共组装纳米粒可用于肿瘤治疗的精准癌症化疗，精准实现PPT“增效”，提高PPT前药的治疗效率，为PPT打开了超低剂量的化疗窗口，解决前药激活延迟和不足的问题。

Description

一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒及其制备方法、 应用
技术领域
本发明属于肿瘤化疗的增敏药物技术领域，具体涉及一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒及其制备方法、应用。
背景技术
鬼臼毒素(Podophylotoxin,PPT)是一种从鬼臼属植物的根和根茎中提取的天然芳基木质素。PPT通过与微管蛋白结合，抑制细胞分裂过程中有丝分裂纺锤体的形成，显示出强大的抗肿瘤活性，研究表明鬼臼毒素对多种肿瘤均有较为理想的抑制效果。但PPT水溶性差，而且会产生严重的脱靶毒性，这两方面的障碍严重限制着鬼臼毒素的应用。正因如此，它尚未被用于癌症的临床治疗。
近年来，为了克服PPT的缺点，药物化学家尝试合成一系列类似化合物用于肺癌、乳腺癌和白血病等临床癌症的治疗，如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)，但仍因其疗效不佳和严重的毒副作用而受到限制。因此，如何设计一种高效低毒的药物传递系统用于鬼臼毒素的传递仍然是研究的热点。前药策略是提高抗癌药物递送效率的有效方法。通过前药策略对PPT进行结构修饰可以有效的改善PPT溶解性差、毒副作用大等问题。同时，纳米技术由于可以有效的延长药物在体内的循环时间，增强抗肿瘤效果，在药物递送领域也极大地改善了药物递送效率。因此，将前药策略和纳米技术整合到一个系统中，已成为促进更有效递送抗癌药物的一个显著趋势。
然而，前体药物激活至少需要达到游离药物的最低有效浓度，极大地限制了临床应用。因此，如何充分发挥PPT抗肿瘤潜能是构建基于前药的药物递送方式亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的是设计合成含有二硫键桥连的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药，制备前药自组装纳米药物传递系统以及前药与棉酚共组装纳米药物传递系统，以及其在药物传递中的应用。探讨前药自组装纳米粒以及棉酚与前药共组装纳米粒的稳定性、药物释放以及棉酚在细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学中对鬼臼毒素增敏作用的影响，提供一种全新、高效和安全的一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒及其制备方法、应用，用于肿瘤治疗的精准癌症化疗。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒，所述共组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒；所述鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药为将鬼臼毒素及其化合物和9-芴甲醇通过二硫键相连，其结构式为：
本发明还公开了一种如上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚和聚乙二醇修饰剂，或鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚与聚乙二醇修饰剂、疏水性荧光物质溶解于有机溶剂，再用乙醇进行稀释，得到混合溶液；
将所述混合溶液滴加到水中，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药和棉酚自发形成均匀纳米粒，然后采用旋蒸法除去制剂中的所述有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒。
本发明还公开了一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒，所述自组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒；所述鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药为将鬼臼毒素及其化合物和9-芴甲醇通过二硫键相连。
本发明还公开了一种如上所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂、或鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂、荧光物质溶解于有机溶剂中，得到混合溶液；
将所述混合溶液滴加到水中，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自发形成均匀纳米粒，并采用旋蒸法除去制剂中的所述有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒；
所述聚乙二醇修饰剂包括TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG中的一种或两种以上；所述聚乙二醇修饰剂的分子量为1000～5000；所述疏水性荧光物质包括香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy5和Cy7中的一种或两种以上；所述有机溶剂包括四氢呋喃、乙醇、甲醇和二甲基亚砜中的一种或两种以上；所述包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、疏水性荧光物质和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.02～0.06)：(0.1～0.3)；所述聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.1～0.3)。
本发明还公开了一种如上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
本发明还公开了一种如上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还公开了一种如上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或上述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
本发明将前药纳米组装与化疗增敏相结合开发一种新的化疗方案，以充分释放PPT的化疗潜力。实施本发明实施例，将具有如下有益效果：(1)设计合成含有二硫键桥连的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药，二硫键具有氧化还原双重敏感性，在肿瘤细胞内高还原条件下二硫键快速断裂，从而实现PPT的肿瘤响应释放，显著提高了PPT抗肿瘤效果的同时降低了毒副作用，实现“减毒”的效果。(2)首次构建棉酚和PPT氧化敏感前药的无载体杂化纳米组装体，具有π共轭Fmoc结构的PPT前药易与化学增敏剂棉酚共组装成稳定的纳米粒，所制备的棉酚介导的前药共组装纳米粒可用于肿瘤治疗的精准癌症化疗，精准实现PPT“增效”，提高PPT前药的治疗效率，为PPT打开了超低剂量的化疗窗口，解决前药激活延迟和不足的问题。(3)肿瘤特异性的前药设计和精确的杂交纳米组装很好地控制了PPT的脱靶毒性。(4)采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单、安全、无毒副作用，易于产业化，实现的PPT高效包载；所制备的纳米粒粒径均一，具有同步递药的特性，在通过EPR效应靶向肿瘤组织大量蓄积后，在肿瘤部位还原微环境条件下，特异性地释放出化疗药物，从而发挥协同增敏化疗的作用，在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的二硫键桥连鬼臼毒素-9-芴甲醇的1HNMR谱图。
图2为本发明实施例1的二硫键桥连鬼臼毒素-9-芴甲醇的质谱图。
图3为本发明实施例2的PSSF纳米粒的透射电子显微镜图。
图4为本发明实施例3的PSSF/GSP纳米粒的透射电子显微镜图。
图5为本发明实施例6的PEG修饰的小分子前药纳米粒的粒径-存储时间图。
图6为本发明实施例7的PSSF/GSP纳米粒的体外PPT释放试验图。
图7为本发明实施例7的PSSF/GSP纳米粒的体外棉酚释放试验图。
图8为本发明实施例8的GSP溶液剂、PPT溶液剂、PSSF/GSP溶液剂、实施例2的PSSF纳米粒和实施例3的PSSF/GSP纳米粒的4T1细胞毒性图。
图9为本发明实施例8的GSP溶液剂、PPT溶液剂、PSSF/GSP溶液剂、实施例2的PSSF纳米粒和实施例3的PSSF/GSP纳米粒的RM-1细胞毒性图。
图10本发明实施例8的PPT溶液剂、实施例2的PSSF纳米粒和实施例3的PSSF/GSP纳米粒的3T3细胞毒性图。
图11为本发明实施例9的含Cy7溶液剂、实施例4制备的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)和实施例5制备的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)的细胞摄取图。
图12为本发明实施例10的Cy7溶液剂、实施例4制备的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)和实施例5制备的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)的血药浓度-时间曲线图。
图13为本发明实施例11的Cy7溶液剂、实施例4制备的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)和实施例5制备的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)的组织分布图。
图14为本发明实施例12的纳米粒体内抗肿瘤实验图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
本发明公开了本发明人等发现在偶联物中插入肿瘤刺激敏感的化学连接子，如二硫键，可以通过肿瘤选择性前药激活来很好地管理抗癌药物的脱靶毒性。本发明人等还发现BCL2蛋白家族在细胞的抗凋亡过程中发挥着决定性的作用，该蛋白可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，BCL2的过度表达能增强肿瘤细胞对很多细胞毒素的抵抗性。而本发明人研究发现棉酚可以选择性的和BCL2家族抗凋亡蛋白结合来抑制其表达，同时棉酚还可显著增强PPT的抗肿瘤效应。
因此，本发明人等根据这些见解得到的本发明如下。
本发明首先设计一种含有二硫键桥连的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药为将鬼臼毒素及其化合物和9-芴甲醇通过二硫键相连，其结构式为：
具体的，本发明设计的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药是将鬼臼毒素与具有π电子共轭结构的9-芴甲醇通过还原响应断裂的二硫键连接，在血液循环以及在正常的组织中能够以前药的形式稳定存在，而在肿瘤细胞内异常高还原环境下快速断裂，从而实现PPT的肿瘤响应释放，显著提高了PPT抗肿瘤效果的同时降低了毒副作用，实现“减毒”的效果。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药的合成方法，包括以下步骤：
S1、将4,4'-二硫代二丁酸I发生脱水反应，得到酸酐化合物II。
在一具体实施例中，步骤S1具体包括以下步骤：将4,4'-二硫代二丁酸溶解于乙酸酐中，在20℃～25℃条件下进行脱水反应2h～4h，得到酸酐化合物II。
S2、在催化剂作用下，酸酐化合物II与9-芴甲醇发生酯化反应，得到中间产物III。
在一具体实施例中，酸酐化合物II与9-芴甲醇的摩尔比为(1～2)：(1～2)。
在一具体实施例中，催化剂为DMAP；酸酐化合物II与DMAP的摩尔比为1：(0.1～1)。
在一具体实施例中，步骤S2具体包括以下步骤：将酸酐化合物II溶于二氯甲烷中，并加入DMAP，在20℃～25℃条件下发生酯化反应搅拌12h～24h，通过柱层析分离得到中间产物III。
S3、在催化剂作用下，中间产物III与鬼臼毒素发生酯化反应，得到鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药IV。
在一具体实施例中，中间产物III与鬼臼毒素的摩尔比为(1～2)：(1～2)。
在一具体实施例中，催化剂为DMAP、EDCI和HOBt；中间产物III、DMAP、EDCI和HOBt的摩尔比为1：(0.1～1)：(1～2)：(1～2)。
在一具体实施例中，步骤S3具体包括以下步骤：将中间产物III、EDCI、HOBt和DMAP溶于二氯甲烷中，冰浴2h，然后加入鬼臼毒素在20℃～25℃条件下发生酯化反应24h～48h，所得产物经制备液相分离纯化，得到鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药IV。
在一具体实施例中，步骤S1-步骤S3均在氮气保护气氛下进行。
具体的，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药的合成反应式如下：
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒，自组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒。
进一步的，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂、或鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂、荧光物质溶解于有机溶剂中，得到混合溶液。
S2、将混合溶液滴加到水中，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自发形成均匀纳米粒，并采用旋蒸法除去制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒。
进一步的，聚乙二醇修饰剂包括TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG中的一种或两种以上。
进一步的，聚乙二醇修饰剂的分子量为1000～5000。优选的，聚乙烯醇的分子量为1000、2000和5000。更优选的，聚乙烯醇的分子量为2000。
进一步的，疏水性荧光物质包括香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy5和Cy7中的一种或两种以上。
进一步的，有机溶剂包括四氢呋喃、乙醇、甲醇和二甲基亚砜中的一种或两种以上。优选的，有机溶剂为四氢呋喃和乙醇的混合溶剂。
进一步的，包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、疏水性荧光物质和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.02～0.06)：(0.1～0.3)。
进一步的，聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.1～0.3)。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒，共组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒。具体的，本发明为了进一步提高PPT的抗肿瘤效果，棉酚被用作化学增敏剂首次与PPT氧化敏感前药构建一种无载体杂化纳米组装体。在这个组装过程中，具有π共轭Fmoc结构的PPT前药易与化学增敏剂棉酚共组装成稳定的纳米粒，所制备的棉酚介导的前药共组装纳米粒可用于肿瘤治疗的精准癌症化疗，精准实现PPT“增效”，提高PPT前药的治疗效率，为PPT打开了超低剂量的化疗窗口，解决前药激活延迟和不足的问题。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚和聚乙二醇修饰剂，或鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚与聚乙二醇修饰剂、疏水性荧光物质溶解于有机溶剂，再用乙醇进行稀释，得到混合溶液。
S2、将混合溶液滴加到水中，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药和棉酚自发形成均匀纳米粒，然后采用旋蒸法除去制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒。
在一具体实施例中，聚乙二醇修饰剂包括TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG中的一种或两种以上。
在一具体实施例中，聚乙二醇修饰剂的分子量为1000～5000。优选的，聚乙烯醇的分子量为1000、2000和5000。更优选的，聚乙烯醇的分子量为2000。
在一具体实施例中，疏水性荧光物质包括香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy5和Cy7中的一种或两种以上。
在一具体实施例中，有机溶剂包括四氢呋喃、乙醇、甲醇和二甲基亚砜中的一种或两种以上；优选的，有机溶剂为四氢呋喃和乙醇的混合溶剂。
在一具体实施例中，聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.1～10)：(0.1～0.3)。
在一具体实施例中，包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚、聚乙二醇修饰剂和疏水性荧光物质的质量比为1：(0.1～10)：(0.1～0.3)：(0.02～0.06)。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或本发明任意实施例的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
具体的，本发明将前药纳米组装与化疗增敏相结合开发一种新的化疗方案，以充分释放PPT的化疗潜力，将所合成的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药分别制备成前药自组装纳米粒以及与棉酚制备成前药共组装纳米粒，本发明通过肿瘤特异性的前药设计和精确的杂交纳米组装很好地控制了PPT的脱靶毒性；所制备的纳米粒粒径较小且均一稳定性良好，具有同步递药的特性，在通过EPR效应靶向肿瘤组织大量蓄积后，在肿瘤部位还原微环境条件下，特异性地释放出化疗药物，从而发挥协同增敏化疗的作用；同时制备工艺简单、安全、无毒副作用，易于产业化，实现PPT高效包载，在药物传递系统、肿瘤治疗、注射给药、口服给药或局部给药系统中具有较好的应用前景。
以下为具体实施例
实施例1鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药的合成
在氮气保护下，将2mmol的4,4'-二硫代二丁酸置于100mL茄形瓶中，并采用6mL的乙酸酐溶解，25℃磁力搅拌2h，加入30mmol的甲苯，减压蒸馏除去甲苯并带除多余的乙酸酐。将2mmol的所得产物溶于15mL二氯甲烷中，并加入2mmol的9-芴甲醇和0.2mmol的DMAP溶液，25℃磁力搅拌12h，采用二氯甲烷-甲醇洗脱体系进行分离提纯得到中间产物。最后将1mmol的中间产物、2mmol的EDCI和2mmol的HOBt在0℃条件下冰浴2h，然后加入1mmol的鬼臼毒素和0.2mmol的DMAP，25℃下反应48h，终产物通过制备液相色谱分离纯化既得，产率为61.2％
采用MS和1H-NMR对产物结构进行确证，结果如图1-图2所示。
实施例2PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备
精密称取DSPE-PEG2k 2mg和实施例1的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药8mg，用500μL的四氢呋喃将其溶解，再用500μL的无水乙醇稀释，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的PSSF纳米粒。在25℃的条件下用旋蒸法除去有机溶剂。通过透射电子显微镜测定制备的自组装纳米粒的粒径和形态，结果如图3，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在86nm左右。
实施例3PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒的制备
精密称取DSPE-PEG2k 2mg、实施例1的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药1.92mg以及棉酚6.08mg采用500μL四氢呋喃将其溶解，再用500μL无水乙醇稀释，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的PSSF/GSP纳米粒。在25℃的条件下用旋蒸法除去有机溶剂。通过透射电子显微镜测定制备的共组装纳米粒的粒径和形态，结果如图4，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在84nm左右。
实施例4Cy7-PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备
精密称取Cy7-DSPE-PEG2k 2mg和实施例1制备的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药8mg，用500μL四氢呋喃将其溶解，再用500μL无水乙醇稀释，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)。在25℃的条件下用旋蒸法除去有机溶剂。
实施例5Cy7-PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒的制备
精密称取Cy7-DSPE-PEG2k 2mg，实施例1制备的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药1.92mg和棉酚6.08mg采用500μL四氢呋喃将其溶解，再用500μL无水乙醇稀释，搅拌下，将该混合溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)。在25℃的条件下用旋蒸法除去有机溶剂。
实施例6PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒的胶体稳定性试验
将实施例2和实施例3制备的前药纳米粒各取出1mL，加入到20mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育24h，并且在预定的时间点(0h，2h，4h，6h，8h，12h和24h)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图5所示，纳米粒胶体稳定性良好，在24h内粒径没有发生显著的变化，即在无机盐存在的情况，构建的鬼臼毒素前药纳米粒能够以较为稳定的形态存在，有利于更多的药物随血液循环富集于肿瘤部位，实现更佳的治疗效果。
实施例7PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒的体外释放试验
(1)鬼臼毒素的释放
以含30％无水乙醇的pH 7.4的PBS缓冲液为释放介质，考察鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒中鬼臼毒素的体外释放情况。将0.82mL实施例3制备的PSSF/GSP纳米粒(鬼臼毒素含量为200μg/mL)加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的鬼臼毒素浓度。向释放介质中加入一定浓度的二硫苏糖醇(DTT，0mM，1mM，5mM，10mM)，以考察纳米粒在还原条件下的释放情况。结果如图6所示，以二硫键桥连的纳米粒具有还原响应性，能够在DTT的作用下快速释放出鬼臼毒素。
(2)棉酚的释放
以含20％四氢呋喃的pH 7.4的PBS缓冲液为释放介质，考察鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒中棉酚的体外释放情况。将125μL实施例3制备的PSSF/GSP纳米粒(棉酚含量为200μg/mL)加入到30mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的棉酚浓度。向释放介质中加入一定浓度的二硫苏糖醇(DTT，0mM，1mM，5mM，10mM)，以考察纳米粒在还原条件下的释放情况。结果如图7所示，以二硫键桥连的纳米粒具有还原响应性，能够在DTT的作用下快速释放出棉酚。
实施例8PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒的细胞毒性
采用MTT法考察PEG修饰的鬼臼毒素前药自组装纳米粒对小鼠乳腺癌细胞(4T1)、小鼠前列腺癌细胞(RM-1)以及小鼠成纤维细胞(3T3)的毒性。将4T1细胞、RM-1细胞以2×103个/孔的密度接种于96孔培养板，培养12h后，分别用不同浓度的GSP溶液剂、PPT溶液剂、PSSF/GSP溶液剂、实施例2制备的PSSF纳米粒和实施例3制备的PSSF/GSP纳米粒(相同浓度的PPT和/或GSP)处理细胞48h。然后加入5mg/mL的MTT(20μL/孔)，37℃孵育4h。将培养基替换为DMSO(200μL/孔)以溶解生成的甲瓒。最后用酶标仪测定490nm处的紫外吸光度。以3T3细胞为细胞模型，采用相同方法验证PPT溶液剂、实施例2制备的PSSF纳米粒和实施例3制备的PSSF/GSP纳米粒对正常细胞的细胞毒性。
结果如图8和图9所示，当与无毒浓度的GSP结合时，PSSF/GSP纳米粒处理组的细胞毒性明显高于PSSF纳米粒处理组，从而证实了GSP对PSSF纳米粒的增敏作用。值得注意的是，与PSSF/GSP溶液剂相比，PSSF纳米粒表现出更强的体外抗肿瘤活性，主要是由于其高效的细胞摄取和快速的细胞内药物释放。此外，如图10所示，PSSF纳米粒和PSSF/GSP纳米粒对3T3细胞显示出较小的细胞毒性，突出了它们良好的生物相容性。
实施例9PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒的细胞摄取
将4T1细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中，孵育24h。随后更换为含Cy7溶液剂、实施例4制备的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)和实施例5制备的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)的新鲜培养基(每种培养基的Cy7浓度均为250ng/mL)，分别继续孵育0.5h或2h。细胞洗涤固定或消化后，采用流式细胞仪(BD,EastRutherford,NJ,USA)分析。
如图11所示，发现4T1细胞对Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒和Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒的摄取效率远高于溶液剂，且呈时间依赖性。重要的是，Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒和Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒之间没有显著差异，表明纳米粒的共组装并不会阻碍细胞对纳米粒的摄取。纳米粒可通过非浓度依赖性内吞作用有效地内化到细胞内。因此，稳定性良好的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒和Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒表现出显著高于Cy7溶液剂的细胞摄取效率，有利于肿瘤细胞对前药纳米粒的摄取，继而产生更佳的肿瘤抑制效果。
实施例10PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒的药代动力学研究
将体重200g～220g的SD大鼠随机分为3组，每组6只，研究实施例4制备的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)和实施例5制备的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)在体内的药代动力学行为。通过大鼠尾分别静脉注射Cy7溶液剂、Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒和Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒，剂量均为Cy7等量2mg/kg。分别于注射后2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h采集大鼠眼静脉血样0.1mL。通过离心(8000rpm,3min)获得血浆，使用酶标仪在750nm激发和773nm发射定量Cy7的血浆浓度。
这些化合物的血浆药物浓度-时间曲线如图12所示，Cy7溶液剂在4h内迅速从体内清除。相比之下，Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒和Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒在血液中的循环时间更长，导致相较于Cy7溶液剂，在同等Cy7剂量下的AUC更高。此外，与Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒相比，Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒表现出更好的药代动力学行为，这可能与其增强的稳定性有关。说明，Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒可有效延长PPT在血液中的循环时间，表现出独特的体内给药优势，这可能有利于通过增强的通透性和滞留(EPR)效应介导的药物在肿瘤组织中的蓄积，进而充分发挥药效。
实施例11PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒的组织分布实验
将4T1细胞悬液接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到400mm3时，尾静脉注射Cy7溶液剂、实施例4制备的Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒(PSSF-Cy7纳米粒)和实施例5制备的Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒(PSSF/GSP-Cy7纳米粒)，剂量均为Cy7等量2mg/kg，分别于注射后4h、12h和12h处死小鼠，取肿瘤及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)。然后使用IVIS成像系统分析荧光强度。
如图13所示，Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒和Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒的荧光信号远强于Cy7溶液剂，且主要分布在肝脏、肾脏和肿瘤组织。值得注意的是，在等剂量的Cy7作用下，12h时，肿瘤部位Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒的荧光强度强于Cy7-PEG修饰的PSSF纳米粒。Cy7-PEG修饰的PSSF/GSP纳米粒具有较强的荧光强度，这可能与其具有较好的胶体稳定性和体内循环优势有关。说明延长循环时间可以通过EPR效应促进前药纳米组装体在肿瘤中的聚集。
实施例12PEG修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药纳米粒的在体抗肿瘤实验
将雌性BALB/c小鼠的4T1肿瘤作为体内模型来评估纳米粒的抗肿瘤效果。采用BALB/c小鼠右后肢皮下注射100μL的4T1细胞悬液(5×107/mL)建立荷瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分为6组，每组5只:对照组(PBS)、GSP溶液剂、PSSF/GSP溶液剂、PPT溶液剂、实施例2制备的PSSF纳米粒和实施例3制备的PSSF/GSP纳米粒。每隔一天给药一次，共给药5次，每次给药均含有同等浓度的PPT(4mg/kg)和/或GSP(25mg/kg)。每天监测肿瘤体积和体重，在最后一次治疗后处死小鼠，获得肿瘤组织。
如图14所示，与对照组相比，PSSF/GSP溶液剂和PPT溶液剂表现出相当的、中度的肿瘤生长延迟。PPT溶液剂在12天的生存率仅为40％，显示了明显的全身毒性。说明，前药策略可以很大程度上避免鬼臼毒素的脱靶毒性，而棉酚介导的化疗增敏有望提高鬼臼毒素前药的治疗效率。此外，与PSSF纳米粒相比，PSSF/GSP纳米粒对肿瘤生长有显著抑制作用。即PSSF/GSP纳米粒的最佳抗肿瘤疗效归因于GSP介导的增敏作用和前药纳米系统的多种治疗优势，包括延长血液循环时间、高效的细胞摄取和氧化还原敏感性药物释放。最后，对纳米粒的治疗安全性进行了初步探讨。与GSP溶液剂相比，通过小鼠的体重变化可以判断，在给药治疗结束后，PSSF纳米粒和PSSF/GSP纳米粒组别均未造成小鼠体重的明显下降，说明在治疗期间显示出良好的安全性。
以上结果表明，本发明的棉酚介导的前药纳米组装可以作为一种高效和安全的联合治疗模式，能够在有效缓解PPT的全身毒性的同时增强抗肿瘤效果，可用于肿瘤治疗的精准癌症化疗。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒，其特征在于，所述共组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒；
所述鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药为将鬼臼毒素及其化合物和9-芴甲醇通过二硫键相连，其结构式为：
2.一种如权利要求1所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚和聚乙二醇修饰剂，或鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、棉酚与聚乙二醇修饰剂、疏水性荧光物质溶解于有机溶剂，再用乙醇进行稀释，得到混合溶液；
将所述混合溶液滴加到水中，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药和棉酚自发形成均匀纳米粒，然后采用旋蒸法除去制剂中的所述有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂包括TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG中的一种或两种以上；
所述聚乙二醇修饰剂的分子量为1000～5000；
所述疏水性荧光物质包括香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy5和Cy7中的一种或两种以上；
所述有机溶剂包括四氢呋喃、乙醇、甲醇和二甲基亚砜中的一种或两种以上；
所述聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、所述棉酚和所述聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.1～10)：(0.1～0.3)；
所述包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与棉酚共组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、所述棉酚、所述聚乙二醇修饰剂和所述疏水性荧光物质的质量比为1：(0.1～10)：(0.1～0.3)：(0.02～0.06)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药的合成方法，包括以下步骤：
S1、将4,4'-二硫代二丁酸I发生脱水反应，得到酸酐化合物II；
S2、在催化剂作用下，所述酸酐化合物II与9-芴甲醇发生酯化反应，得到中间产物III；
S3、在催化剂作用下，所述中间产物III与鬼臼毒素发生酯化反应，得到鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药IV；反应式如下：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述脱水反应的温度为20℃～25℃；所述脱水反应的时间为2h～4h；
S2中，所述酸酐化合物II与所述9-芴甲醇的摩尔比为(1～2)：(1～2)；所述催化剂为DMAP；所述酸酐化合物II与DMAP的摩尔比为1：(0.1～1)；所述酯化反应的温度为20℃～25℃，所述酯化反应的时间为12h～24h；
S3中，所述中间产物III与鬼臼毒素的摩尔比为(1～2)：(1～2)；所述催化剂为DMAP、EDCI和HOBT；所述中间产物III、DMAP、EDCI和HOBT的摩尔比为1：(0.1～1)：(1～2)：(1～2)；所述酯化反应的温度为20℃～25℃，所述酯化反应的时间为24h～48h。
6.一种鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒，其特征在于，所述自组装纳米粒为聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒、或包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒；
所述鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药为将鬼臼毒素及其化合物和9-芴甲醇通过二硫键相连，其结构式为：
7.一种如权利要求6所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂、或鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药与聚乙二醇修饰剂、荧光物质溶解于有机溶剂中，得到混合溶液；
将所述混合溶液滴加到水中，鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自发形成均匀纳米粒，并采用旋蒸法除去制剂中的所述有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒；
所述聚乙二醇修饰剂包括TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG中的一种或两种以上；
所述聚乙二醇修饰剂的分子量为1000～5000；
所述疏水性荧光物质包括香豆素-6、罗丹明、DiR、DiI、Cy5和Cy7中的一种或两种以上；
所述有机溶剂包括四氢呋喃、乙醇、甲醇和二甲基亚砜中的一种或两种以上；
所述包载疏水性荧光物质的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药、疏水性荧光物质和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.02～0.06)：(0.1～0.3)；
所述聚乙二醇修饰剂修饰的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒中鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药和聚乙二醇修饰剂的质量比为1：(0.1～0.3)。
8.一种如权利要求1所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或权利要求6所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在药物传递系统中的应用。
9.一种如权利要求1所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或权利要求6所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种如权利要求1所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药共组装纳米粒、或权利要求6所述的鬼臼毒素-9-芴甲醇小分子前药自组装纳米粒在注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
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