CN113461754B - 一种碱基修饰的阿霉素前药及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种碱基修饰的阿霉素前药及其制备方法和应用，属于药物制剂新辅料和新剂型领域，具体提供一种碱基修饰的阿霉素前药，并将该前药与核苷类似物共组装制备成纳米粒。通过氢键作用力结合的方式实现碱基修饰的阿霉素前药与核苷类似物的高效共载和共同递送。本发明方法还原敏感前药的设计降低了阿霉素的心脏毒性，能有效应对肿瘤细胞微环境的氧化还原异质性，制得的纳米粒子粒径小而均一，有利于纳米粒通过渗透与滞留增强效应富集于肿瘤部位，更易于表面修饰，可通过PEG修饰以延长纳米粒在血液中的循环时间，超高的载药量，有利于减小辅料相关的不良反应和毒性。本发明方法制备工艺简单，易于放大生产。

Description

一种碱基修饰的阿霉素前药及其制备方法和应用
技术领域
本发明属药物制剂新辅料和新剂型领域，具体涉及一种碱基修饰的阿霉素前药及其制备方法和应用。
背景技术
随着纳米技术的快速发展，纳米给药系统以其独特的治疗优势得到了广泛的关注，特别是在治疗癌症领域。为了提高化疗药物的安全性和有效性，人们开发了多种纳米载体，如脂质体、囊泡、聚合物胶束、纳米乳剂和无机纳米粒子。然而，这些传统的纳米系统在临床应用中仍有许多局限性：(1)药物过早在血液中泄漏；(2)潜在的赋形剂相关毒性，由于大量使用载体材料以最大限度地装载药物；重现性差的复杂制备方法。因此，迫切需要开发新型高效的抗癌药物载体。
疏水药物比亲水性药物更容易封装成纳米载体，因为大多数纳米载体在水环境中有很高的亲水性分子过早泄漏的风险。而将疏水药物和亲水药物封装在一个纳米系统中则更具挑战性，因为它们在物理化学性质上存在显著差异。阿霉素是一种抗生素类抗癌药物，抗癌谱较广，进入细胞后会扩散到细胞核，将蒽环插入DNA碱基对，破坏DNA的双螺旋结构，引发一系列信号事件，最终导致细胞凋亡。值得注意的是，有些亲水药物与阿霉素之间存在协同作用。然而，目前还没有切实可行的策略来实现亲水药物和疏水性阿霉素的高效共载和共递送。
值得注意的是，核苷类似物之间能够形成分子间氢键。超分子通常是指由两个或多个分子在特定的分子间相互作用驱动下形成的复合物。具有肿瘤刺激应答激活的前药是可在肿瘤部位被激活以释放母药的非活性偶联物。具有肿瘤刺激应答激活的前药是可在肿瘤部位被激活以释放母药的非活性偶联物。一个成功的前药策略可以克服许多药物传递障碍，如低水或脂溶性、低稳定性、缺乏位点特异性、低效的细胞摄取和严重的不良反应。超分子纳米组装一方面能够保留基于前药的纳米组装的多种给药优势，如制备方便、载药能力高、体循环时间长、肿瘤靶向聚集以及肿瘤刺激应答前药激活等。另一方面，在前药中引入核酸样基团，通过特定的分子间氢键核苷类似物进行分子识别，能够进一步提高超分子纳米组装在微酸性肿瘤微环境中的敏感性。
发明内容
为了克服现有的阿霉素注射剂存在的不足之处，本发明设计了一种碱基修饰的阿霉素前药，并将该前药与核苷类似物阿糖胞苷共组装制备成纳米粒。通过氢键作用力结合的方式实现碱基修饰的阿霉素前药与核苷类似物阿糖胞苷的高效共载和共同递送。
本发明对阿霉素进行碱基化修饰，得到的碱基修饰的阿霉素模拟DNA碱基互补配对原则，与核苷类似物阿糖胞苷进行配对，制备成共组装纳米药物，赋予该纳米药物在血液中的长循环特性，以进行抗肿瘤研究。共组装纳米无需使用纳米载体，避免了与辅料有关的毒性问题，且具有较高的载药量。两种药物通过不同的作用机制作用于DNA，阿霉素通过将蒽环插入DNA碱基对中，破坏DNA的双螺旋结构来发挥抗肿瘤作用，阿糖胞苷通过细胞脱氧胞嘧啶激酶代谢产生三磷酸阿糖胞苷(阿糖胞苷的活性形式)，三磷酸阿糖胞苷能有效抑制DNA聚合酶的活性，阻止DNA合成。协同发挥抗肿瘤作用。本发明将为化疗药物协同治疗提供一种新型、安全、有效的药物传递策略。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明所述的碱基修饰的阿霉素前药是将阿霉素与碱基修饰剂以敏感键为桥连分别通过酰胺键和酯键连接，敏感键具有非常好的还原敏感响应能力，使得阿霉素能在还原条件下从前药中迅速被水解释放出来。
Figure BDA0003140349360000021
其中：
敏感键为单硫键、二硫键、酮缩硫醇键或腙键；
[N]表示碱基修饰剂，为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
如尿嘧啶修饰的阿霉素前药是将阿霉素与尿嘧啶以二硫键为桥连分别通过酰胺键和酯键连接，其结构如下：
Figure BDA0003140349360000022
本发明还提供所述的碱基修饰的阿霉素前药的制备方法，步骤如下：
(1)亚二硫基二乙酸在乙酸酐作用下脱水缩合制得亚二硫基二乙酸酐；
(2)在碱性条件下，碱基修饰剂与碳酸乙烯酯反应；所述的碱基修饰剂为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶；
(3)将步骤1中制得的亚二硫基二乙酸酐和步骤2中制得的产物混合，加入DIPEA，经酯化反应得到亚二硫基二乙酸桥连的碱基修饰剂；
(4)将步骤3中得到的产物，在HATU作用下，和阿霉素进行酰胺化反应得到终产物碱基修饰的阿霉素前药。
以阿霉素-尿嘧啶前药为例，其制备方法如下：
(1)亚二硫基二乙酸在乙酸酐作用下脱水缩合制得亚二硫基二乙酸酐；
(2)在碱性条件下，尿嘧啶与碳酸乙烯酯反应生成1-(2-羟乙基)嘧啶-2,4(1H,3H)酮；
(3)将步骤1中制得的亚二硫基二乙酸酐和步骤2中制得的1-(2-羟乙基)嘧啶-2,4(1H,3H)酮混合，加入DIPEA，经酯化反应得到亚二硫基二乙酸桥连的尿嘧啶；
(4)将步骤3中得到的产物，在HATU作用下，和阿霉素进行酰胺化反应得到终产物阿霉素-尿嘧啶前药。
所述的碱基修饰的阿霉素前药用于制备碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒。还用于制备治疗抗肿瘤的药物。
进一步地，本发明还提供一种碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒，是碱基修饰的阿霉素前药、核苷类似物和PEG，通过非共价作用力(氢键作用力为主，疏水作用力为辅)形成的共载纳米粒。
其中，碱基修饰的阿霉素前药与核苷类似物的摩尔比为(5～1):(1～5)；优选的碱基修饰的阿霉素前药为阿霉素-尿嘧啶前药，优选的核苷类似物为阿糖胞苷；优选的阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷的摩尔比为(5～1):1，进一步优选的阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷的摩尔比为2:1；PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的10-20wt％，优选PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的20％；形成的共组装纳米粒，其粒径小于120nm，多分散指数小于0.2。
本发明所述的碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将碱基修饰的阿霉素前药、核苷类似物与PEG加入到溶剂中溶解完全，在搅拌条件下，将该溶液缓慢滴加到碱性的去离子水中，自发形成均匀的纳米粒分散液；
其中，所述的碱基修饰的阿霉素前药浓度为1mg/mL～10mg/mL，核苷类似物浓度为1mg/mL～10mg/mL，PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的10-20wt％；所述的PEG为DSPE-PEG、TPGS、PLGA-PEG或PE-PEG，所述PEG的分子量为1000、2000或5000。
上述制备方法，优选的PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的20％。优选的PEG为DSPE-PEG，优选的PEG的分子量为2000。
所述的碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒应用于制备药物传递系统。
所述的碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒应用于制备抗肿瘤药物。
所述的碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒应用于制备注射给药、口服给药或局部给药系统。
本发明的有益效果：
本发明的阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷首次被发现可以共同自组装形成均匀的纳米粒。该纳米药物的优势在于：(1)还原敏感前药的设计降低了阿霉素的心脏毒性，能有效应对肿瘤细胞微环境的氧化还原异质性；(2)采用一步纳米沉淀的方法，制备工艺简单，易于放大生产；(3)纳米粒子粒径小而均一(小于120nm)，有利于纳米粒通过渗透与滞留增强(EPR)效应富集于肿瘤部位；(4)更易于表面修饰，可通过PEG修饰以延长纳米粒在血液中的循环时间；(5)超高的载药量，有利于减小辅料相关的不良反应和毒性。
附图说明
图1为本发明实施例1的阿霉素-尿嘧啶前药的结构图。
图2为本发明实施例1的阿霉素-尿嘧啶前药的1H-NMR谱图。
图3为本发明实施例2的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的粒径、多分散指数图。
图4为本发明实施例3的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的粒径分布图。
图5为本发明实施例3的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的透射电子显微镜图。
图6为本发明实施例4的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的紫外-可见吸收光谱图。
图7为本发明实施例5的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的体外释放实验图。
图8为本发明实施例6的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的细胞摄取图。
图9为本发明实施例7的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的细胞凋亡流式图。
图10为本发明实施例8的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒对MCF-7，4T1和L1210细胞的48h和72h体外细胞毒性图。
图11为本发明实施例8的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒对不同细胞的选择性细胞毒性图。
图12为本发明实施例8的阿霉素-尿嘧啶前药和阿糖胞苷混合溶液对不同细胞的选择性细胞毒性图。
图13为本发明实施例9的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的血液潴留图。图14为本发明实施例9的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的体内组织分布图。
图15为本发明实施例10的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的在在体4T1肿瘤模型的体积变化图。
图16为本发明实施例10的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的在在体4T1肿瘤模型的荷瘤率图。
图17为本发明实施例10的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的在体4T1抗肿瘤模型中小鼠体重变化图。
图18为本发明实施例11的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的在体L1210腹水瘤抗肿瘤实验中小鼠体重变化图。
图19为本发明实施例11的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的在体L1210腹水瘤抗肿瘤实验中小鼠生存周期图。
具体实施方式
通过以下具体实例，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但并不表示实施例对本发明的限制。
实施例1：阿霉素-尿嘧啶前药的合成
(1)将亚二硫基二乙酸和乙酸酐置于25mL茄形瓶中混合，反应3h后，旋干，得到亚二硫基二乙酸酐。
(2)将尿嘧啶，碳酸乙烯酯和氢氧化钠颗粒以物料比1:1.1:0.2，置于50mL茄形瓶中，反应12h，乙醇重结晶纯化得到1-(2-羟乙基)嘧啶-2,4(1H,3H)酮。
(3)将制得的亚二硫基二乙酸酐和1-(2-羟乙基)嘧啶-2,4(1H,3H)酮以物料比1.1:1混合，加入DIPEA，经酯化反应室温反应4h，得到亚二硫基二乙酸桥连的尿嘧啶。用半制备型高效液相色谱法纯化得到白色固体产物。
(4)在HATU作用下，将得到的亚二硫基二乙酸桥连的尿嘧啶和阿霉素以物料比1.2:1进行酰胺化反应2h，用半制备型高效液相色谱法纯化得到终产物阿霉素-尿嘧啶前药。结构式如图1。采用核磁共振氢谱来确定化合物的结构，结果如图2，波谱解析结果如下：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.01(s,1H),13.25(s,1H),11.23–11.20(m,1H),7.92–7.85(m,2H),7.84(d,J＝8.3Hz,1H),7.62(d、d,J＝6.9,2.9Hz,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),5.48(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),5.46–5.43(m,1H),5.24(d,J＝3.6Hz,1H),4.93(dd,J＝5.5,3.4Hz,1H),4.58(s,2H),4.25(t,J＝5.2Hz,2H),4.19(q,J＝6.6Hz,1H),4.02-3.99(m,1H),3.97(s,3H),3.86(td,J＝4.9,1.5Hz,2H),3.67(s,2H),3.52–3.41(m,2H),3.43–3.39(m,1H),3.03–2.89(m,2H),2.21(dt,J＝13.8,3.0Hz,1H),2.12(dd,J＝14.2,5.7Hz,1H),1.85(td,J＝12.9,4.0Hz,1H),1.48(dd,J＝12.5,4.6Hz,1H),1.29–1.24(m,1H),1.14(d,J＝6.5Hz,3H)
实施例2：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的处方筛选
将一定量的阿霉素-尿嘧啶前药，阿糖胞苷和DSPE-PEG2k分别溶解于DMSO中，配制成4mg/mL的阿霉素-尿嘧啶前药储备液，阿糖胞苷储备液4mg/mL和2mg/mL的DSPE-PEG2k储备液。
阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷的摩尔比为(5～1):(1～5)时，在搅拌速度800rpm条件下，将混合溶液滴加到2mL去离子水中。搅拌20min后，用超滤离心管在3000rpm下离心10min，除去游离药物。其中，阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷的摩尔比为5:1到1:1时，能够形成粒径均一且在100nm左右的纳米粒(如图3)。因此选用摩尔比为5:1到1:1的纳米粒进行进一步的研究。
接下来我们通过计算不同摩尔比例的阿霉素比阿糖胞苷的溶液剂在MCF-7，4T1和L1210细胞中的协同指数，研究了九种比例溶液剂对三种细胞的细胞毒性。其中，阿霉素比阿糖胞苷为4:1，3:1和2:1的溶液剂在4T1细胞中的联合指数分别为0.83，0.28和0.66(联合指数＜1，协同作用；联合指数＞1，拮抗作用)，表明这三种比例具有较强的协同作用。阿霉素比阿糖胞苷为5:1到1:1的溶液剂在MCF-7和L1210细胞中的联合指数均小于1。
因此，根据以上因素，选用摩尔比为3:1的纳米粒进行进一步的研究。所有比例均形成纳米粒，其粒径、多分散指数以及协同指数(半抑制率)如表1。
表1阿霉素和阿糖胞苷比例的处方优化
Figure BDA0003140349360000061
Figure BDA0003140349360000071
实施例3：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的制备
将阿霉素-尿嘧啶前药(6.875mg)、阿糖胞苷(1mg)和DSPE-PEG2k(20wt％)溶于DMSO(1mL)中。室温下超声溶解5min。将混合溶液(128μL)滴加到2mL含氢氧化钠(5mg/mL，50μL)的去离子水中，在800rpm下，搅拌20min，用超滤离心管在3000rpm下离心10min，除去游离药物。最后，得到了共组装的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷纳米粒。
用动态光散射法测定阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的粒径，粒径分布如图4。并使用透射电子显微镜观测制备的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的粒径和形态，如图5所示，透射电镜图表明共组装纳米粒为均一的球形，且粒径在120nm左右。
实施例4：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的紫外-可见吸收光谱
阿霉素-尿嘧啶前药的DMSO溶液(U-SS-DOX溶液)、阿糖胞苷的DMSO溶液(Ara-C溶液)、实施例3中制备的PEG化的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒(U:C纳米粒)分别加到比色皿中，使用紫外分光光度计在235-800nm波长范围内分别扫描上述溶液的紫外吸收光谱。如图6所示，阿霉素-尿嘧啶前药和阿糖胞苷在250-400nm波长范围内都有一个吸收峰，而阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒有两个吸收峰，说明阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒是成功制备的。此外，与游离的阿霉素-尿嘧啶前药和阿糖胞苷相比，阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的紫外-可见吸收光谱有明显的蓝移，进一步表明阿霉素-尿嘧啶前药，阿糖胞苷与水分子之间存在氢键作用力。
实施例5：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的体外释放实验
使用透析法评价纳米粒的体外释放行为。将1mL实施例3制备的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒密封于透析袋中，并浸入30mL的PBS释放介质(pH6.5含或不含二硫苏糖醇(DTT))中，使用高效液相色谱法(HPLC)分别在272nm和232nm的波长下测定阿糖胞苷和阿霉素的累积释放量。如图7所示，在不加DTT的释放介质中，12小时内阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒释放的阿霉素不到20％，而在DTT(10mM)存在的4小时内，几乎70％的阿霉素被释放。同样，约70％的阿糖胞苷在无DTT的释放介质中几乎在12小时内从阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒中完全释放。然而，在DTT(10mM)作用下，超过90％的阿糖胞苷在4h内被完全释放。
实施例6：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的细胞摄取实验
将4T1细胞以每孔1.0×105个细胞的密度接种到12孔板中，加入1mL 1640RPMI完全培养基，在37℃下孵育24h。然后将细胞膜荧光探针(DiR)溶液或溶解于新鲜无血清培养基中的DiR负载阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒以相同的DiR浓度(5μg/mL)加入不同孔中，分别孵育0.5、1、4h。取出培养液，用冷PBS冲洗4T1细胞，用胰蛋白酶处理，准备用于流式细胞术分析。采用FlowJo软件收集1.0×104门控的数据并进行分析。如图8所示，4T1细胞对DiR标记的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的摄取呈时间依赖性。更重要的是，在0.5、1和4h时，阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的细胞内荧光强度明显强于DiR溶液。
实施例7：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的细胞凋亡实验
将4T1细胞以每孔1.0×105个细胞的密度接种到6孔板中，加入2mL 1640RPMI完全培养基，在37℃下孵育24h。然后分别与PBS，阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒(U:C纳米粒)和阿霉素-尿嘧啶前药和阿糖胞苷混合溶液(U/C混合溶液)共孵育24h。为了定量测定细胞凋亡，收集漂浮和附着的细胞，用冷PBS冲洗三次，并用凋亡试剂盒染色。最后，用流式细胞仪分析。如图9所示，在相同条件下，阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒处理的细胞比U/C混合溶液处理的细胞更能诱导凋亡。
实施例8：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的细胞毒性实验
采用MTT法测定共组装纳米粒对MCF-7、4T1、L1210三种细胞的细胞毒性。将这上述肿瘤细胞以每孔2000个细胞的密度接种到96孔板中孵育12h后使其贴壁。带细胞贴壁后，加入系列浓度的阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒(U:C纳米粒)、阿霉素-尿嘧啶前药溶液(U-SS-DOX溶液)、阿糖胞苷溶液(Ara-C溶液)、阿霉素-尿嘧啶前药和阿糖胞苷混合溶液(U/C混合溶液)、阿霉素溶液(DOX溶液)、阿霉素和阿糖胞苷混合溶液(D/C混合溶液)，继续孵育48h或72h。孵育结束后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在37℃条件下孵育4h。弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶液，用酶标仪在波长为490nm处测定其吸光度。如图10所示，U:C纳米粒对三种细胞的细胞毒性均强于游离的U-SS-DOX溶液。与其他组相比，DOX溶液和D/C混合溶液对MCF-7细胞显示出更强的细胞毒性。而高浓度的U:C纳米粒在4T1细胞中表现出与DOX溶液和D/C混合溶液相似的细胞毒性。如图11，12所示在48h内，U:C纳米粒对L02细胞的毒性明显低于U/C混合溶液，说明了U:C纳米粒对正常细胞具有选择性。
实施例9：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的血液潴留和体内分布实验
用Sprague-Dawley大鼠评价DiR标记的U:C纳米粒和DiR溶液的体内血液潴留行为。如图13所示，载DiR的U:C纳米粒的血液中荧光强度在24h内保持较强。表明，超分子纳米组装显著延长了药物的体循环，具有促进肿瘤特异性积累的潜力。
在4T1荷瘤小鼠中检测了DiR标记的U:C纳米粒和DiR溶液在主要器官和肿瘤中的荧光强度。如图14所示，静脉注射后12h，DiR溶液在肺部的荧光强度最强，其次是肝脏、脾脏、肿瘤、肾脏和心脏。24h后，肺中DiR溶液的积累明显减少，肝脏和肾脏中仍有明显的信号。
实施例10：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的体内抗实体肿瘤和安全性评价
建立4T1细胞BALB/c模型。将4T1细胞(100μL中含5×106个细胞)皮下接种至雌性BALB/c小鼠。当肿瘤体积长至约150mm3时，将BALB/c随机分为7组(每组5只)：生理盐水组、Ara-C溶液组、U-SS-DOX溶液组、U/C混合溶液组、DOX溶液组、D/C混合溶液组、U:C纳米粒组。每隔一天静脉给药，Ara-C剂量3mg/kg，其余各组DOX等效剂量3mg/kg，共给药4次，每天测量小鼠肿瘤体积和体重。如图15，16所示，与生理盐水组相比，Ara-C溶液组、U-SS-DOX溶液组、U/C混合溶液组、DOX溶液组及D/C混合溶液组具有中度抗肿瘤作用，且肿瘤进展延迟。用U:C纳米粒处理的小鼠表现出明显的肿瘤抑制。如图17所示，所有小鼠的体重均无明显变化。
实施例11：阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒的体内抗非实体肿瘤评价
利用接种L1210细胞的DBA/2小鼠，研究阿霉素-尿嘧啶前药:阿糖胞苷共组装纳米粒对非实体肿瘤的抗肿瘤效果。
腹腔注射L1210细胞(3×106个细胞)，细胞接种1d后，DBA/2小鼠随机分为8组(每组6只)：生理盐水组、Ara-C溶液组(2.5mg/kg)、U-SS-DOX溶液组(17.5mg/kg)、DOX溶液组(5mg/kg)、U/C混合溶液组(2.5mg/kg Ara-C，17.5mg/kg U-SS-DOX)、D/C混合溶液组(2.5mg/kg Ara-C，11.25mg/kg DOX)、低剂量U:C纳米粒组(2.5mg/kg Ara-C，17.5mg/kg U-SS-DOX)、高剂量U:C纳米粒组(5mg/kg Ara-C，35mg/mL U-SS-DOX)。如图18所示，接受生理盐水的小鼠在7天内体重显著增加。D/C混合物的强烈毒性导致小鼠在第二次给药后体重持续下降。与低剂量U:C纳米粒组相比，高剂量U:C纳米粒组生存时间更长，体重变化更稳定。如图19所示，高剂量U:C纳米粒组和低剂量U:C纳米粒组均能延长小鼠的生存周期。

Claims (10)

1.一种碱基修饰的阿霉素前药，其特征在于，是将阿霉素与碱基修饰剂以敏感键为桥连分别通过酰胺键和酯键连接，其结构为：
Figure FDA0003590346470000011
其中：
敏感键为单硫键、二硫键、酮缩硫醇键或腙键；
[N]表示碱基修饰剂，为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
2.根据权利要求1所述的碱基修饰的阿霉素前药，其特征在于，所述的碱基修饰的阿霉素前药为采用尿嘧啶为碱基修饰剂，二硫键为敏感键的阿霉素-尿嘧啶前药，其结构为：
Figure FDA0003590346470000012
3.一种权利要求1所述的碱基修饰的阿霉素前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)亚二硫基二乙酸在乙酸酐作用下脱水缩合制得亚二硫基二乙酸酐；
(2)在碱性条件下，碱基修饰剂与碳酸乙烯酯反应；所述的碱基修饰剂为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶；
(3)将步骤1中制得的亚二硫基二乙酸酐和步骤2中制得的产物混合，加入DIPEA，经酯化反应得到亚二硫基二乙酸桥连的碱基修饰剂；
(4)将步骤3中得到的产物，在HATU作用下，和阿霉素进行酰胺化反应得到终产物碱基修饰的阿霉素前药。
4.一种权利要求1或2所述的碱基修饰的阿霉素前药的应用，其特征在于，用于制备碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒和/或应用于制备治疗抗肿瘤的药物。
5.一种碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒，其特征在于，采用权利要求1所述的碱基修饰的阿霉素前药、核苷类似物和PEG，通过氢键作用力为主，疏水作用力为辅的非共价作用力形成的共载纳米粒。
6.根据权利要求5所述的一种碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒，其特征在于，所述的碱基修饰的阿霉素前药与核苷类似物的摩尔比为(5～1):1；PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的10-20wt％；形成的共组装纳米粒，其粒径小于120nm，多分散指数小于0.2。
7.根据权利要求6所述的一种碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒，其特征在于，所述的碱基修饰的阿霉素前药为阿霉素-尿嘧啶前药，核苷类似物为阿糖胞苷；阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷的摩尔比为(5～1):1；PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的20％。
8.根据权利要求7所述的一种碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒，其特征在于，所述阿霉素-尿嘧啶前药与阿糖胞苷的摩尔比为2:1。
9.一种权利要求5～8任一项所述的碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将碱基修饰的阿霉素前药、核苷类似物与PEG加入到溶剂中溶解完全，在搅拌条件下，将该溶液缓慢滴加到碱性的去离子水中，自发形成均匀的纳米粒分散液；
其中，所述的碱基修饰的阿霉素前药浓度为1mg/mL～10mg/mL，核苷类似物浓度为1mg/mL～10mg/mL，PEG的质量比为(碱基修饰的阿霉素前药+核苷类似物+PEG)总质量的10-20wt％；所述的PEG为DSPE-PEG、TPGS、PLGA-PEG或PE-PEG，所述PEG的分子量为1000、2000或5000。
10.一种权利要求5～8任一项所述的碱基修饰的阿霉素前药-核苷类似物共组装纳米粒的应用，其特征在于，应用于制备药物传递系统、制备抗肿瘤药物和/或应用于制备注射给药、口服给药或局部给药系统。
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含核苷类似物药物的精准纳米输送系统的构建及其抗肿瘤研究;牟全兵;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 工程科技Ⅰ辑》;20200115(第01期);第B016-144页 *

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