CN100423778C

CN100423778C - 用于上载抗肿瘤药物的脂质体载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN100423778C
Application number: CNB2003101088505A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·李; 赵孝斌; 杨正茂
Original assignee: FUDAN ZHANGJIANG BIOLOGICAL MEDICINE Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: Zhejiang Anglikang Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang Haichang Bio Tech Co ltd
Priority date: 2003-11-25
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2008-10-08
Anticipated expiration: 2023-11-25
Also published as: CN1621092A

Abstract

本发明公开了一种用于上载抗肿瘤药物的脂质体载体及其制备方法和应用。组分包括高相变温度合成磷脂、胆固醇、叶酸受体靶向锚点和聚乙二醇水化锚点。本发明的制备方法不需要复杂、昂贵的仪器设备，能在大规模生产粒径小于200nm的脂质体，能把许多脂质体上载的弱碱性药物，包括阿霉素、长春新碱等，制备成冻干粉的形式，在使用前用无菌水或盐水方便的重建，极大的提高了使用的方便程度和稳定性。在脂质体药物的冻干-复水过程中药物渗漏率低于10%。

Description

用于上载抗肿瘤药物的脂质体载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于上载药物的脂质体载体，具体地说涉及一种靶向脂质体，尤其涉及适合医药工业的叶酸受体靶向脂质体制剂及其制造方法。

背景技术

脂质体是一种前景广阔的抗癌药物载体。美国ALZA公司商品名为Doxil^TM的盐酸阿霉素脂质体，以及Nexstar公司商品名为Daunoxome^TM的柔红霉素柠檬酸脂质体等产品已经用于临床。脂质体制剂的优势在避免从肾小球过滤，使其中的药物逐渐释放到血液循环中，从而降低血浆峰药浓度、降低毒性。

脂质体为磷脂双层微囊，可以将治疗药物包裹在其亲水内核。由高相变温度合成磷脂，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidyl-choline)和胆固醇(cholesterol)(DSPC/Chol摩尔比为60∶40，)组成的平均直径为100-200nm的大单室脂质体，在血浆中稳定，被设计用于全身给药。美国专利US4837028公开了聚乙二醇化(pegylated，PEG化)脂质如甲基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)可以4-10％摩尔比插入脂质体双层膜中，可以避免血清蛋白调理作用引起的网状内皮系统(RES)、单核巨嗜细胞对脂质体的清除，相对于裸露脂质体，表现出了更长的全身循环时间，在药代动力学方面具有更大的优越性，称为长循环脂质体或隐形脂质体(Stealth liposome)。ALZA公司的Doxil^TM就是以此技术开发的盐酸阿霉素脂质体制剂。尽管Doxil^TM改善了游离阿霉素的心脏毒性，然而，最近的临床试验表明，与预期相反，Doxil^TM的最大耐受剂量比游离阿霉素更小，并且在某些试验中，疗效比游离阿霉素低。毒性增加可能与脂质体的循环时间长以及毒性谱改变有关。比如，阿霉素脂质体的限制性毒性为粘膜毒性，而非心脏毒性。至于治疗效果降低，可能是由于阿霉素隐蔽于脂质体中，药物从脂质体释放速率不合理，造成血浆中的药物浓度低于最小有效药物浓度所致。因此，设计和优化一种具有合适的药物代谢动力学特征，可以获得更佳治疗效果的脂质体载体非常重要。

在人体中，叶酸受体(包括α和β型)是一种在各类肿瘤细胞上过量表达的高亲和力叶酸结合蛋白，其表达在正常组织中受到严格控制，只在肺、肾、脉络膜、胎盘中有低水平表达。如在卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌中叶酸受体均高度表达.已经证明，叶酸受体靶向可以提高许多治疗药物给药的肿瘤细胞选择性，这些药物包括化疗药物、脱氧核苷酸、前体药物转化酶、抗T细胞抗体、核磁共振和光学对照剂、硼中子俘获治疗剂、免疫原性半抗原、转基因载体、纳米粒，以及脂质体药物载体。Robert J Lee等在Addvanced drug delivery reviews，41：147-162，2000中对此作了综述。Robert J Lee等在Biochim Biophys.Acta.，1312：237-242，1996以及.J Biol Chem 271：8481-8487，1996中报道了通过混入与疏水锚点交联的叶酸，脂质体可以靶向叶酸受体。

常见的脂质体制备方法，包括薄膜水化法、有机溶剂置换、去垢剂去除法、超声法、高压挤出法、乙醇注射法以及匀浆法等等。有些方法已用于工业化生产。但这些方法生产的脂质体大部分有不适合过滤、不稳定、不能去除残留有机溶剂等缺点，同时利用这些方法也难以获得小粒径脂质体。因此迫切需要建立可放大、稳定、便于进行无菌处理同时费用低廉的脂质体制备方法。

脂质体制剂的稳定性是影响到保质期的制约因素。目前脂质体制剂都是液体制剂，普遍存在保质期短的问题。其原因是组成脂质体双层膜的脂质和脂质体包裹的药物都对水解敏感。

对于阿霉素脂质体而言，远程包封进入脂质体内部阿霉素与柠檬酸形成柠檬酸盐沉淀，一定程度上缓解了这一矛盾。对于其他药物，如长春新碱，通过远程上载后药物以可溶性状态存在于脂质体内部，而远程上载要求的脂质体内部的酸性pH条件更加剧了药物、脂质水解，造成脂质体的不稳定。因此，目前开发的长春新碱脂质体制剂，只能采用以空白脂质体、药物溶液、缓冲液分开的形式保存，病人服用前即时制备的方式给药，给治疗人员和患者造成了很大的不便。

冻干制剂是制药领域广泛采用的一种增加稳定性的制剂形式，但脂质体冻干制剂的主要困难在于脱水、复水过程中脂双层的破坏，从而造成药物的渗漏，通常渗漏率可达40-50％。普通冻干制剂中采用的蔗糖、乳糖等冷冻保护剂，能够部分缓解脱水、复水过程对脂双层的破坏，但仍然不能将渗漏率降低到药剂学上可接受的程度。解决脂质体冻干制剂的工艺问题，是制药领域迫切需要的。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是公开一种叶酸受体靶向脂质体药物载体，以克服现有技术存在的不足，以满足医疗领域的需要；

本发明需要解决的技术问题之二是提供一种含有弱碱性药物的上述脂质体的药物组合物制剂；

本发明需要解决的再一个技术问题是提供一种含有弱碱性药物上述脂质体的药物组合物的冻干制剂；

本发明另一个需要解决的技术问题是提供所述及的脂质体药物载体、药物组合物及其冻干制剂的制备方法。

本发明的脂质体药物载体，组分和摩尔含量包括：

高相变温度合成磷脂 55～70％

胆固醇 30～45％。

按照本发明，所说的脂质体药物载体为一种长循环叶酸受体靶向脂质体，其组分和摩尔含量包括：

高相变温度合成磷脂 55～70％

胆固醇 10～30％

叶酸受体靶向锚点 10～20％

聚乙二醇水化锚点 1～3％。

所说的高相变温度合成磷脂为氢化大豆卵磷脂，是一种人工饱和的大豆提取的卵磷脂，(简称HSPC，下同)，可采用Lipoid公司的产品；

所说的胆固醇(简称Chol，下同)，可采用SIGMA公司的产品；

所说的聚乙二醇水化锚点结构通式为mPEG-X-Chol或为mPEG-Chol，

mPEG为单甲基聚乙二醇，Chol为胆固醇，X包括胱氨酸、天冬氨酸或苯苯丙氨酸。

单甲基聚乙二醇-胆固醇(简称mPEG-Chol，下同)，为一种由单甲基聚乙二醇(monomethoxy-PEG)和氯甲酸胆固醇脂(cholesterylchloroformate)合成的直链聚合物，可采用Ishiwata，H；Sato，S B；Kobayashi，S；等在Chemical and pharmaceutical bulletin.vol.46，no.12(1998Dec)：1907-13.文献报道的方法进行制备，mPEG-Chol的结构通式为：

其中：n＝20～250；

本发明优选mPEG与氯甲酸胆固醇脂合成没有连接基团的聚乙二醇-胆固醇。mPEG的分子量为1000～10000，更佳的mPEG的分子量为2000～5000。

所说的叶酸受体靶向锚点结构通式为：F-Y-PEG-X-Chol或为F-PEG-Chol，其中，F代表叶酸，PEG代表聚乙二醇，Chol胆固醇，X，Y代表氨基酸或多肽。

所说的叶酸受体靶向锚点是一种由N-羟基丁二酰亚胺-叶酸(N-hyroxysuccinimide folate，NHS-Folate)，二氨基聚乙二醇(PEG-bis-amine)和氯甲酸胆固醇脂(cholesteryl chloroformate)合成的直链聚合物，其结构通式为：

其中：n＝20～250；

本发明采用下述方法合成叶酸-聚乙二醇-胆固醇：

叶酸衍生物N-羟基丁二酰亚胺-叶酸(NHS-Folate)先用N-羟基-琥珀酰亚胺活化，再与二氨基聚乙二醇反应，分离得到叶酸-聚乙二醇单氨，与氯甲酸胆固醇脂反应，得到最终产物叶酸-聚乙二醇-胆固醇。叶酸、PEG、胆固醇之间没有连接基团。

所述及的二氨基聚乙二醇的分子量为1000～10000，更佳的分子量为2000～5000。

叶酸-聚乙二醇-胆固醇和聚乙二醇-胆固醇中聚乙二醇的分子量有一定的关系。一般的，叶酸-聚乙二醇-胆固醇中聚乙二醇臂的分子量要大于聚乙二醇-胆固醇中聚乙二醇的分子量。本发明优选叶酸-聚乙二醇-胆固醇中聚乙二醇的分子量为3350，聚乙二醇-胆固醇中聚乙二醇的分子量为2000。

本发明的叶酸受体靶向脂质体为一种包含PEG-胆固醇、用于有效靶向缓慢释放叶酸受体脂质体药物中抗肿瘤药物的脂质体，其中包括了加入用作叶酸受体靶向锚点和PEG水化锚点的胆固醇衍生物。

本发明还涉及一种上载了治疗有效量的弱碱性药物如阿霉素、柔红霉素或长春新碱的上述脂质体的药物组合物，优选的上载量以脂质体的重量计为9.1～16.7％，即药脂比为1～5∶10。

起治疗作用的弱碱性药物如阿霉素直接与脂质体的清除相关。换句话说，由于吞噬后被脂肪酶破坏，被吞噬细胞摄取的脂质体释放药物。与Gabizon，Alberto；Shmeeda，Hilary；Barenholz，Yechezkel等在Clinicalpharmacokinetics.2003，42(5)：419-36.中报道，现有的基于甲基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)的长循环脂质体相比，包含PEG-胆固醇的脂质体的全身循环时间稍短，介于包含PEG-DSPE脂质体和非PEG化脂质体之间。更特殊的是，PEG-胆固醇脂质体在最初24小时的清除率与PEG-DSPE脂质体相仿。然而，在更长的时间点，清除加速，其机制为PEG-胆固醇逐渐逐渐从脂质体释放，脂质体的清除增加。这种清除模式可以同时获得所需的持续释放和更加稳定的血浆游离药物浓度。尤其是，PEG-胆固醇脂质体具有以下优势：

1.比非PEG化脂质体具有更长的循环时间，这就增加了药物在实体瘤累积，降低血浆游离药物浓度和急性心脏毒性；

2.由于游离药物浓度不会逐渐变小，释放比甲基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺脂质体更多的药物；

3.增加肿瘤细胞的靶向性，这是因为脂质体表面的PEG空间位阻阻碍其与靶细胞的结合，PEG逐渐丢失使其更加容易接近细胞靶位。

这些关键的优点可以产生更好的治疗效果，尤其是与肿瘤细胞靶向脂质体结合时，比如包含叶酸-PEG-胆固醇的脂质体可以靶向在卵巢癌和其他类型肿瘤高度增加的细胞标记物叶酸受体。

上述脂质体可采用溶剂交换法进行制备，包括如下步骤：

将溶解于水性溶剂中的四种脂质成分HSPC，mPEG-Chol，F-PEG-Chol和Chol与pH值为2～6的柠檬酸缓冲液转移至容器中搅拌混匀，四种脂质成分即在水性溶剂中自发形成磷脂双层微囊——空白脂质体悬浮液。

所说的水性溶剂为C₁～C₄的单元醇，优选乙醇；

四种脂质成分在水性溶剂中浓度为6～30g/L；

柠檬酸缓冲液的加入量以使水性溶剂的pH值为2～6；

形成脂质体的平均粒径与溶液的转移速度、搅拌的速度等有关，含有四种脂质成分的水性溶剂的转移速度为0.5-5ml/min，柠檬酸缓冲液的转移速度为0.6-36ml/min；搅拌转速为100-1500rpm。

得到的脂质体最终脂浓度为0.5-6mg/ml，平均粒径为80-150纳米，pH4.1。

本方法制备的空白脂质体悬浮液，经超滤和上载即可得到质量均一的脂质体药物制剂。

本方法还可用于制备亲脂性药物纳米颗粒。其中亲脂性药物与HSPC，mPEG-Chol，F-PEG-Chol，和Chol四种脂质成分共溶于水性溶剂制成脂质-药物溶液，称为溶液I。同样与溶液II分别由蠕动泵输送至一个带磁力搅拌器的容器中混匀，得到亲脂性药物纳米颗粒。

这一技术的创新点在于(1)小体积脂质体或纳米颗粒(平均粒径为100nm)只能在非常低的脂质浓度下产生(2)利用切向流技术，脂质体或纳米颗粒可被有效的浓缩(3)温度和搅拌速率是溶剂稀释过程中的关键参数，决定最终产物的粒径分布。这一方法不包括复杂、昂贵的仪器设备，能在大规模生产粒径小于200nm的脂质体。

本发明改进了常规的pH梯度远程上载技术，用超滤法替换脂质体介质、应用组氨酸缓冲液为上载缓冲液，新改进的pH梯度远程上载技术显著提高对弱碱性药物如阿霉素、柔红霉素和长春新碱等的上载率。具体地说包括如下步骤：

将上述用溶剂切换法制备得到空白脂质体悬浮液，在膜截留分子量5-40万，压力1-10psi，流速10-120毫升每分钟条件下，超滤置换脂质体悬浮液的缓冲体系，置换比例为1∶6～15，体积比，脂质体外酸性的柠檬酸缓冲液被组氨酸置换为pH7.0的溶液组份，同时超滤浓缩脂质体悬浮液，使脂质浓度变为10-20mg/ml，获得中性脂质体浓缩液(I)；

将中性脂质体浓缩液(I)、浓度为10-40mg/ml的弱碱性药物浓缩液(II)和浓度为150-400mM的组氨酸缓冲液(III)搅拌混合，50-60℃保温1-30分钟，即可将弱碱性药物如阿霉素、柔红霉素或长春新碱上载到脂质体内部，优选的中性脂质体浓缩液(I)、弱碱性药物浓缩液(II)和组氨酸缓冲液(III)的体积比为：(I)∶(II)∶(III)＝7∶1～3∶0.5～2.0，其原理如下：

脂质体内部为pH4.1，外部为pH7.0，弱碱性药物在pH7.0中性缓冲液中带负电荷，在脂质体内外的pH梯度驱动下跨膜转移到脂质体内部，实现药物上载。

采用凝胶柱层析法检测上载效率。具体的说，将1ml的载药脂质体样品上样至10cm Sepharose CL-4B柱在室温下用生理盐水进行洗脱，洗脱液按每ml收集洗脱液与0.1％Triton-100混合后测定所含药物的浓度。以阿霉素为例，可用O.D.480分析弱碱性药物如阿霉素浓度第一个洗脱峰表示上载的阿霉素，第二个洗脱峰为未上载游离的弱碱性药物如阿霉素。上载效率(LE)按以下方程计算：

LE＝A1*V1/(A1*V1+A2*V2)*100％

其中A1为第一个峰的吸光值，V1为第一个峰总体积，A2为第二个峰的吸光值，V2为第二个峰体积。

本发明改进的pH梯度远程上载技术的上载效率可以达到95％以上，而且重复性好。

本发明同时提供了一种脂质体冻干制剂的制备方法，该方法是以一种高分子的阴离子多聚物——磺酸葡聚糖，替代常规远程上载中的柠檬酸和/或硫酸铵。磺酸葡聚糖作为一种负电荷组份加入脂质体内水性核内，与带正电荷的弱碱性药物如阿霉素、柔红霉素、长春新碱等药物分子相结合，而将药物上载在脂质体膜内。以柠檬酸、硫酸铵等盐类作为上载剂，在冷冻干燥过程中温度降低和水分减少引起晶体形状的改变，从而引起脂质体破裂，造成药物漏出。磺酸葡聚糖多聚物与药物形成的共聚物在冷冻干燥过程没有明显变化，可以避免脂质体破裂，降低渗漏率。

具体的说，包括如下步骤：

将含有F-PEG-Chol，mPEG-Chol，HSPC，Chol脂质混合物的醇溶液在5～80℃的真空条件下蒸干，并溶解于浓度为30-300mM的磺酸葡聚糖和浓度为10-200mg/ml的蔗糖水溶液，在压力为10000～20000psi，流速为10～80ml/min，温度为1～20℃的条件下在高压匀浆机内进行匀浆处理，获得双层小脂质体混悬液，平均粒度为120nm；

在膜截留分子量5-40万，压力1-10psi，流速10-120毫升每分钟条件下，超滤置换脂质体悬浮液的缓冲体系，置换比例为1∶6～15，体积比，脂质体外酸性的磺酸葡聚糖被去离子水置换为pH7.0的溶液组份，同时超滤浓缩脂质体悬浮液，使脂质浓度变为10-20mg/ml，获得中性脂质体浓缩液(I)；

将浓度为5～100mg/ml的弱碱性药物溶液与所述及的中性脂质体浓缩液(I)搅拌混合，采用碱性物质如1M的碳酸钠在10～80℃搅拌条件下调节pH为7.1～8.5，获得上载了弱碱性药物的脂质体，然后在-40～-5℃的条件下冷冻干燥5～48小时，即获得上载了弱碱性药物的脂质体冻干制剂。

蔗糖∶脂质的摩尔比为1～10∶1；

优选的中性脂质体浓缩液(I)、弱碱性药物浓缩液(II)的体积比为：(I)∶(II)＝1～10∶1。

所说的弱碱性药物包括阿霉素、柔红霉素或长春新碱中的一种，优选阿霉素。

本发明还涉及另一种脂质体冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：

将包括HSPC，Chol脂质混合物的醇溶液蒸干，并溶解于阴离子多聚物和抗冷冻剂水溶液，高压匀浆处理，获得双层小脂质体混悬液；

超滤置换脂质体悬浮液的缓冲体系，获得中性脂质体浓缩液(I)，然后采用常规的方法上载弱碱性药物，并冷冻干燥，所说的弱碱性药物包括阿霉素、柔红霉素或长春新碱中的一种。

阴离子多聚物为磺酸葡聚糖，抗冷冻剂为蔗糖。

在-5～-40℃的条件下冷冻干燥，其他工艺条件与前述的方法相同。

取样10毫克干燥后的脂质体药物粉末，以1毫升生理盐水重新溶解，凝胶柱测定上载率为95％以上。

该制剂的优点在于，新方法使用磺酸葡聚糖作为上载剂，配以冷冻保护剂，例如蔗糖，在脂质体药物的冻干-复水过程中药物渗漏率低于10％。

这种新的方法能把许多脂质体上载的弱碱性药物，包括长春新碱等，制备成冻干粉的形式，在使用前用无菌水或盐水方便的重建，极大的提高了使用的方便程度和稳定性。

附图说明

图1为搅拌速度对平均粒径的影响。

图2为Sepharose CL-4B凝胶层析法测定上载效率。

图3为FLD在BALB/C小鼠上进行的药代动力学曲线。

具体实施方式

实施例1

mPEG-Chol的合成：

在磁力搅拌器搅拌下，将2.5mmol溶解于10ml二氯甲烷中的单甲基聚乙二醇逐滴加至含有2.5mmol氯甲酸胆固醇脂的二氯甲烷溶液和3.75mmol NaOH水溶液(33％)的容器。反应在室温、氮气保护、持续搅拌下进行，反应7日后终止。整个反应过程中用薄层层析(RP-18，板，Merk，乙醇-二氯乙烷，88∶12，v/v)和红外光谱(Perkin-Elmer 782，溶于二氯乙烷)跟踪M-PEG胆固醇衍生物的生成。用过滤法除去混合物中的氯化钠，用减压蒸馏去除二氯乙烷，固体残留物重悬于3ml乙酸乙脂，上样至3*40cm的硅胶柱的顶部。首先用乙酸乙脂洗脱将未反应的氯甲酸胆固醇脂及少部分氯甲酸胆固醇脂水解形成的胆固醇分离，然后用9∶91的乙醇-二氯乙烷回收mPEG-Chol和剩余的mPEG。

以单甲基聚乙二醇的回收计算产率.实施过程中，投料单甲基聚乙二醇2.5mmol，为5.0克固体，至反应完成上柱纯化后干燥得到白色固体物4.54克.该产物以薄层层析分析主要Rf值为0.15，为mPEG-Chol，纯度94％.回收率为76％左右。

合成的工艺路线如下：

实施例2

F-PEG-Chol的合成：

A.NHS-F的合成：

将500mg叶酸与1.1mol过量N-羟基丁二酰亚胺(NHS)一同溶于10ml二甲亚砜(DMSO)然后加入1.1mol过量二环己基碳二亚胺。然后将反应混合物在室温、暗处搅拌过夜。用羊毛脂过滤除去不溶性副产物二环己脲。将含有的NHS-叶酸DMSO滤液9.8ml保存于-20℃备用。

B.叶酸-聚乙二醇-胺的合成

将500mg二氨基聚乙二醇溶于2ml DMSO中。加至1.4ml前面合成的叶酸-NHS中。反应混合物在室温下、暗处保温过夜。

用去离子水平衡好的Sephadex G-25凝胶柱将DMSO和小分子副产物从混合物中去除。将含有少量叶酸-聚乙二醇-叶酸和二氨基聚乙二醇的二氨基聚乙二醇上样至DEAE-trisacryl阴离子交换树脂，用NH₄HCO₃进行梯度洗脱。叶酸-聚乙二醇-胺在大约20mM的NH₄HCO₃被洗脱。产品冷冻干燥，获得420mg，保存于-20℃。

C.F-PEG-Chol的合成：

将0.17mmol的过量氯甲酸胆固醇脂加入F-PEG-胺氯仿溶液，室温下反应过夜，用茚三酮分析跟踪游离氨基消失，监测反应真空干燥F-PEG-Chol产物，用醚洗涤两次去除残留氯甲酸胆固醇脂，得到430mg产物。合成的工艺路线如下：

D.含量、纯度检测

1.用硅胶薄层层析分析叶酸-聚乙二醇-胆固醇纯度，溶剂系统为加有痕量乙酸的二氯乙烷/甲醇((7/3，v/v)。

2.用363nm的紫外消光测定叶酸含量测定F-PEG-Chol浓度(摩尔消光系数6500)

3.用茚三酮分析法检测伯胺

本次制备的F-PEG-Chol纯度为83％.

实施例3

基于胆固醇锚点的叶酸受体靶向脂质体的制备

分别称取购于Sigma的分析纯HSPC、Chol 10.48克、2.75克，2.47克实施例1制备的mPEG-Chol，0.31克实施例2制备的F-PEG-Chol，溶解于1升的的乙醇。

用0.22微米膜过滤溶液I后，得到1升的澄清溶液，称为溶液1，转移于容器1(容积为5升的聚酯容器)，加温至40℃。0.22微米膜过滤总浓度为300mM柠檬酸缓冲液4.5升，称溶液II，转移至容器2(容积为10升的聚酯容器)。容器2同样加温至40℃。用两个蠕动泵分别将溶液I和II输送至一个带磁力搅拌器的微量体积混合仪中，流速分别为0.4ml/min和1.8ml/min，磁力搅拌器转速设置为1000rpm，在搅拌条件下通过压力差收集最终脂质体混悬液。混悬液最终体积为5升，最终脂浓度为3.2mg/ml，pH4.1。取0.7ml制备的脂质体混悬液，在激光粒度检测仪上检测脂质体粒径及分布，平均粒径为90-150nm。

实施例4

用pH梯度的远程包封技术包封盐酸阿霉素

包封

实施例3制备的空白脂质体混悬液5升，在膜截留分子量10万，压力5psi，流速60毫升每分钟条件下超滤，用去离子水置换脂质体悬浮液中的柠檬酸缓冲液置换比例为1∶9。在同样条件下进行超滤浓缩，收取脂质体混悬液0.73升，脂类浓度变为22mg/ml。该中性脂质体浓缩液称为浓缩液I.溶解、过滤20mg/ml阿霉素浓缩液II。溶解、过滤50mM组氨酸缓冲液III。取浓缩液I0.73升，浓缩液II0.11升，缓冲液III0.22升，在磁力搅拌下60℃加温混合三种浓缩液，保温5分钟。

检测：

取0.1ml阿霉素脂质体样品上样至10cm Sepharose CL-4B柱，在室温下用生理盐水进行洗脱，洗脱液按每ml收集，洗脱液与0.1％Triton-100混合后测定O.D.480分析阿霉素浓度，第一个洗脱峰表示包封的阿霉素，第二个洗脱峰为未包封游离的阿霉素。

包封率(上载效率)(LE)按以下方程计算：

LE＝A1*V1/(A1*V1+A2*V2)*100％

其中A1为第一个峰的平均吸光值，V1为第一个峰总体积，A2为第二个峰的平均吸光值，V2为第二个峰总体积。

经测定，A1为1.142，V1为3ml；A2为0.041，V2为4ml。LE等于95.3％。具体见图2。

实施例6

冷冻干燥脂质体制剂的制备方法

溶解20g的F-PEG-Chol，mPEG-Chol，HSPC，Chol脂类混合物50/50比例的乙醇溶液100毫升于圆底烧瓶。该混合溶液在旋转蒸发器上40℃蒸干。附有脂类混合物薄膜的圆底烧瓶置于真空泵内隔夜继续抽干。配备150mM的磺酸葡聚糖和200mg/ml的蔗糖溶解于1升去离子水中，并过滤，称溶液I。该溶液I加入上述圆底烧瓶内，震荡搅拌使脂类充分溶解。制备得到的多层大脂质体混悬液转移到Emulsiflex c-5高压匀浆机内进行匀浆处理，压力15,000psi，流速40ml/min，温度以水浴固定于4℃。三个循环后收集粒度均匀的双层小脂质体混悬液。采样20微升样品，以生理盐水分散进行粒度检测。NICOMP激光粒度检测仪测得的平均粒度为120nm。加入125毫升20mg/ml的盐酸阿霉素溶液。以1M碳酸钠在加热60℃搅拌条件下调节pH为8.0.调节终体积为1.25升。该包药后脂质体悬浮液以-10℃，冷冻干燥24小时。

取样10毫克冻干的脂质体药物粉末，以1毫升生理盐水重新溶解，溶解后上样至10cm Sepharose CL-4B柱，用实施例4相同的方法检测，计算包封率，测得的包封率为93.4％

实施例7

体内动力学研究

取雄性BALB/C小鼠30只，平均体重20-25克，随机分成5组？每组6只.每只小鼠均通过尾静脉注射，以6mg/kg的剂量，各组分别注射普通脂质体包封的阿霉素，PEG-Chol制备的非靶向脂质体阿霉素，PEG-DSPE制备的非靶向脂质体阿霉素，Folate-PEG-DSPE制备的靶向脂质体阿霉素，实施例4制备的靶向脂质体阿霉素。分别在经脉注射后10min，1hr，5hr，8hr，24hr，48hr，and 72hr取血样(0.05ml)。血样在去除血细胞后，用2.5ml酸化异丙醇抽提，用分光光度法测定阿霉素浓度。

试验结果详见附图3；图中，各个曲线的制剂配方(摩尔比)为：

(I)HSPC∶Chol＝61.68∶38.32；

(II)HSPC∶Chol∶mPEG-DSPE＝56.37∶38.32∶5.31；

(III)HSPC∶Chol∶mPEG-Chol＝61.68∶33.01∶5.31；

(IV)HSPC∶Chol∶mPEG-DSPE∶F-PEG-DSPE＝56.37∶38.32∶4.81∶0.5；

(V)HSPC∶Chol∶mPEG-Chol∶F-PEG-Chol＝61.68∶33.01∶4.81∶0.5。

药代动力学数据显示，以胆固醇为锚点的叶酸受体靶向脂质体阿霉素制剂在小鼠的分布呈二室模型，其体内半衰期t_1/2为3.2小时，其在快速分布期的分布比以PEG-DSPE制备的靶向和非靶向脂质体阿霉素匀要快，而在慢速分布期其释放较其他剂型更为缓慢.这以释放模式确保了治疗药物在初期迅速分布到肿瘤组织内发挥化疗效果但不超过最低毒性浓度(MTC)，而在给药后的间期内持续保持药物浓度在最小有效浓度(MEC)之上。

Claims

1. 一种叶酸受体靶向脂质体药物载体，其特征在于，组分包括高相变温度合成磷脂、胆固醇、叶酸受体靶向锚点和聚乙二醇水化锚点；所述的高相变温度合成磷脂指氢化大豆卵磷脂或二硬脂酰磷脂酰胆碱；所述的叶酸受体靶向锚点具有如下结构通式F-Y-PEG-X₁-Chol或F-PEG-Chol，其中F代表叶酸，PEG代表聚乙二醇，Chol代表胆固醇，X₁、Y代表氨基酸或多肽；所述的聚乙二醇水化锚点具有如下结构通式mPEG-X₂-Chol或mPEG-Chol，其中mPEG为单甲基聚乙二醇，Chol为胆固醇，X₂是胱氨酸、天冬氨酸或苯丙氨酸。

2. 根据权利要求1所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体，其特征在于，各组分的摩尔含量为：

高相变温度合成磷脂 55～70％

胆固醇 10～30％

叶酸受体靶向锚点 10～20％

聚乙二醇水化锚点 1～3％。

3. 根据权利要求1所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体，其特征在于，PEG的分子量为1000～10000。

4. 根据权利要求3所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体，其特征在于，PEG的分子量为2000～5000。

5. 根据权利要求1所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体，其特征在于，mPEG的分子量为1000～10000。

6. 根据权利要求5所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体，其特征在于，mPEG的分子量为2000～5000。

7. 一种上载了治疗有效量的弱碱性药物的权利要求1～6任一项所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体的药物组合物。

8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，弱碱性药物为阿霉素、柔红霉素或长春新碱中的一种。

9. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，上载量以脂质体的重量计为9.1～16.7％。

10. 根据权利要求1～6任一项所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将溶解于水性溶剂中的四种脂质成分氢化大豆卵磷脂，mPEG-Chol，F-PEG-Chol和Chol与pH值为2～6的柠檬酸缓冲液转移至容器中搅拌混匀，即获得空白脂质体悬浮液。

11. 根据权利要求10所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体的制备方法，其特征在于，含有四种脂质成分的水性溶剂的转移速度为0.5-5ml/min，柠檬酸缓冲液的转移速度为0.6-36ml/min；搅拌转速为100-1500rpm。

12. 根据权利要求10所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体的制备方法，其特征在于，所说的水性溶剂包括C₁～C₄的单元醇。

13. 根据权利要求10所述的叶酸受体靶向脂质体药物载体的制备方法，其特征在于，四种脂质成分在水性溶剂中的浓度为6～30g/L。

14. 一种pH梯度远程上载方法，其特征在于，包括如下步骤：

超滤置换权利要求10所述方法获得的空白脂质体悬浮液的缓冲液，其中脂质体外酸性的柠檬酸缓冲液被组氨酸缓冲液置换，获得中性脂质体浓缩液(I)；

将中性脂质体浓缩液(I)、弱碱性药物浓缩液(II)和组氨酸缓冲液(III)搅拌混合，保温，即可将弱碱性药物上载到脂质体内部，所说的弱碱性药物为阿霉素、柔红霉素或长春新碱中的一种。

15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于，中性脂质体浓缩液(I)、弱碱性药物浓缩液(II)和组氨酸缓冲液(III)的体积比为：(I)∶(II)∶(III)＝7∶1～3∶0.5～2。